ES2314249T3 - Procedimiento de seleccion funcional que implica la translocacion/redistribucion de proteinas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para determinar la función o efecto de un elemento genético o un modulador químico procedentes de bibliotecas de dichos elementos genéticos y moduladores químicos de función conocida y desconocida en una población de células que comprende i) determinar la distribución de una marca detectable expresada a partir de una secuencia indicadora de ácido nucleico en dichas células en presencia y ausencia de un primer modulador químico, cuyo modulador afecta dicha distribución de dicho indicador, en el que las células coexpresan una biblioteca de secuencias efectoras de ácidos nucleicos y están en presencia de una biblioteca de segundos moduladores químicos; y ii) analizar los datos de distribución de todas las combinaciones de dicho efector, modulador e indicador para derivar relaciones funcionales y asignar la función al efector y dicho segundo modulador.

Description

Procedimiento de selección funcional que implica la translocación/redistribución de proteínas

Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos procedimientos genómicos funcionales de alto rendimiento para determinar la función génica y de proteínas en un contexto celular. El procedimiento tiene también utilidad en la identificación de nuevos moduladores químicos de la actividad génica y de la proteína/enzima.

Antecedentes de la invención

Las grandes cantidades de datos de secuencias génicas, expresión génica, y expresión de proteínas que surgen del Proyecto Genoma Humano y de los esfuerzos investigadores posteriores tienen el potencial de permitir la identificación de muchas dianas farmacológicas novedosas. La realización de este potencial requerirá esfuerzos significativos para la determinación de nuevos productos génicos y la validación de estas proteínas como dianas farmacológicas.

Obtener información funcional válida de la función génica y de proteínas requiere que la función se determine (o se confirme) en el contexto; es decir, la función del gen/proteína debería determinarse en presencia de otros genes/proteínas que probablemente interactúen con éste. En consecuencia, existe necesidad de soluciones basadas en células para una selección funcional que posibilite que la información funcional se derive in-situ en un entorno celular cuando las interacciones dinámicas entre los componentes puedan requerir otros componentes celulares no disponibles en un ensayo en solución.

La transformación de la biología de alto rendimiento en ensayos celulares puede basarse en trabajos previos paralelos de correlación y agrupamiento de datos de transcripción e interacción derivados de los estudios de interacción en micromatrices y proteína-proteína (Ge y col. (2001) Nature Genetics 29, 482-486). Ayudadas por las tecnologías de análisis de alto rendimiento, las soluciones basadas en la selección celular pueden comenzar a resolver la necesaria complejidad para desenredar las rutas y el control intracelular en células en mamíferos. (Giese y col. (2002) Drug Discovery Today 7, 179-185), con el objetivo último de elaborar una descripción suficientemente detallada que permita una representación de los procesos celulares en un nivel sistémico (Endy & Brent (2001) Nature 409, 391-395; Kitano (2002) Science 295, 1662-1664)

Para conseguir la selección funcional en un contexto celular se necesitan dos elementos;

a) efector(es) genético(s) o modulador(es) químico(s)

b) fenotipo(s) mensurable(s); es decir un resultado procedente de un ensayo en un sistema de prueba

para establecer una relación causa-efecto entre los genes y el fenotipo o entre los compuestos químicos y los fenotipos. Se pueden usar estos elementos en una variedad de procedimientos de selección que difieren únicamente en sus objetivos:

1) procedimientos genómicos funcionales; descubrimiento de la función génica en la biología normal

2) validación de la diana; descubrimiento de la función génica en la biología anormal

3) procedimientos genéticos químicos; descubrimiento de los compuestos químicos que modulan los fenotipos normales

4) descubrimiento de fármacos; descubrimiento de los compuestos químicos que modulan los fenotipos anormales

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En los procedimientos actuales se investiga un sistema de prueba acerca de los efectos de la divergencia genética o química (es decir, la expresión sobre o infrarregulada de un gen, o la presencia o ausencia de un fármaco candidato respectivamente), tanto sola como en combinación. En consecuencia, pueden medirse los efectos (y por inferencia la función) de un gen (efector) o un fármaco (modulador) sobre un resultado procedente de una célula de ensayo en aislamiento o en combinación mediante la observación del comportamiento del sistema de prueba. Usando combinaciones de efectores y moduladores de función conocida y desconocida es posible comenzar a derivar la relación funcional entre entidades conocidas y desconocidas y asignar por tanto la función.

El uso de ensayos basados en células para dichas selecciones (Croston (2002) Trends in Biotechnology 20, 110-5; Zheng & Chan 2002 Current Issues in Molecular Biology 4, 33-43) se está convirtiendo en el más ampliamente adoptado por razones de adquisición de información contextual tal como se describe anteriormente. Dichos ensayos emplean una amplia variedad de metodologías de ensayo, que incluyen ensayos con genes indicadores, de crecimiento celular, de incorporación de precursores, de transformación celular, de morfología celular, y ensayos con enzimas fluorescentes. Estos enfoques de selección funcional han usado normalmente ensayos e instrumentación preexistentes (por ejemplo, medida del gen indicador de la luciferasa en un luminómetro) que requieren el desarrollo del ensayo antes del procedimiento de selección y que dan como resultado datos promediados para una población celular bajo ensayo.

El documento US 6322973 (Iconix Pharmaceuticals) desvela medios subrogados para descubrir moduladores químicos de genes de función desconocida. Un gen heterólogo de función desconocida se expresa en una célula huésped (por ejemplo, expresión de un gen humano en una célula de levadura) y la célula huésped se evalúa para un cambio resultante en el fenotipo que se puede usar como base para un ensayo celular. La exposición consiguiente de la célula huésped que presenta un fenotipo alterado a la sustancia de ensayo y la evaluación para un efecto de la sustancia de ensayo en el ensayo celular identifica las sustancias de ensayo que son moduladores de la función del gen heterólogo.

El documento US 6340595 (Galapagos Genomics) desvela medios para identificar la función de los productos de una biblioteca de ácidos nucleicos muestra mediante la expresión de la librería de ácidos nucleicos en vectores adenovíricos. Los ácidos nucleicos muestra son oligonucleótidos sintéticos, ADN, o ADNc y codifican polipéptidos, ácidos nucleicos de sentido contrario, o elementos supresores genéticos. Los ácidos nucleicos muestra se expresan en un huésped y el fenotipo alterado resultante se usa para asignar una función biológica al producto codificado por el ácido nucleico muestra. El documento WO 020274 (Rosetta Inpharmatics) describe procedimientos y sistemas (por ejemplo, sistemas informáticos y productos de programas informáticos) para caracterizar constituyentes celulares, concretamente genes y productos génicos. La invención proporciona procedimientos para asignar o determinar la función biológica de genes y productos génicos sin caracterizar usando perfiles de respuesta derivados de medidas de pluralidades de constituyentes celulares en células que tienen un gen o producto génico modificado, como marcadores fenotípicos del producto génico. Se proporcionan procedimientos para agrupar dichos perfiles de respuesta de tal manera que los perfiles de respuesta similares o correlacionados se organicen en el mismo grupo. La invención proporciona también bases de datos de perfiles de respuesta para los que se comparan el perfil de respuesta de un gen o producto génico sin caracterizar.

El documento WO 0171023 (Genetrace) desvela procedimientos para descifrar la función genética. El procedimiento proporciona una matriz de líneas celulares en la que las líneas celulares diana específicas modificadas difieren de las células parentales en la actividad o concentración de una proteína o ácido nucleico seleccionado. La matriz de células se expone a uno o más estímulos o compuestos de ensayo y la matriz celular se perfila para la(s) respuesta(s) a los estímulos o compuestos de ensayo. El análisis de los perfiles resultantes da como resultado información sobre la función genética de los elementos que difieren en la actividad o concentración a través de la matriz de células.

El documento WO 0068661 (Gordon) desvela procedimientos de detección de la exposición celular a un fármaco adictivo y procedimientos para identificar una sustancia que pueda alterar o imitar los efectos celulares de un fármaco adictivo (por ejemplo, etanol). Un procedimiento implica determinar la función o efecto de un modulador químico procedente de una biblioteca de moduladores químicos de función conocida y desconocida sobre una población de células, que comprende determinar la distribución de un ácido nucleico indicador, midiendo por ejemplo la localización celular de una "proteína indicativa de etanol" tal como una proteína de fusión etiquetada con Proteína Fluorescente Verde, en presencia y ausencia de un primer y un segundo modulador químico.

Todos los anteriores procedimientos de la técnica anterior se caracterizan por uno o más de los siguientes;

a) medida de los efectos de los genes heterólogos (por ejemplo, genes humanos en levaduras)

b) una necesidad de desarrollo de ensayos adecuados antes de la selección

c) una necesidad de construir mediante ingeniería genética líneas celulares antes de la selección

Un problema significativo encontrado en los ensayos de la técnica anterior anteriormente descritos es que están basados en ensayos preexistentes y son por tanto, a priori, de alcance limitado, estando limitada la cobertura de los episodios biológicos por la disponibilidad de los ensayos conocidos. Esto conduce al problema adicional de que la asignación de la función se limita a aquellas entidades que interactúan con un proceso biológico relacionado con el resultado de un ensayo disponible. Además, debido a que estos ensayos en general informan sobre las relaciones causa-efecto promediadas a través de una población celular, no dan como resultado información sobre la distribución de la respuesta a través de una población celular (debida por ejemplo al estado del ciclo celular o debido a una población mixta de células que reaccionan y que no reaccionan). Un problema adicional con los procedimientos de la técnica anterior es que los ensayos pueden usarse únicamente sobre poblaciones estables de células y no son generalmente adecuados para el uso con poblaciones no homogéneas de células tales como las células transfectadas transitoriamente.

En consecuencia, lo que se requiere para aumentar la eficiencia de la selección funcional son procedimientos que no requieran ensayos preexistentes, tengan la cobertura más amplia posible de procesos celulares y proporcionen datos a nivel celular individual. La presente invención proporciona procedimientos para la selección funcional en cuyos ensayos se generan en armonía con la selección en un procedimiento iterativo que expande el alcance de la cobertura biológica con cada iteración y que usa análisis basado en imágenes para dar como resultado datos a resolución subcelular.

El procedimiento de la presente invención sortea al menos parte de las limitaciones de los procedimientos de la técnica anterior discutidos anteriormente proporcionando los medios para generar ensayos diagnósticos funcionales que se integran en un procedimiento de selección funcional. El procedimiento se aprovecha del hecho de que muchas proteínas celulares presentan una localización celular característica y, en muchos casos cambian su localización celular en respuesta a algunos estímulos. En consecuencia, dadas colecciones de secuencias que codifican ácidos nucleicos y de compuestos químicos, en las que ambas colecciones contienen miembros de función conocida y desconocida, es posible generar emparejamientos de una secuencia de ácido nucleico con un compuesto químico para producir una localización celular específica de un marcador acoplado con el producto de la secuencia de ácido nucleico. Dichos emparejamientos pueden usarse a continuación como ensayos diagnósticos para ensayar frente a otros miembros de la colección y de esta manera crear grupos y relaciones entre ellos. De esta manera, usando algunos miembros de cada colección que son de función conocida, es posible asignar funciones a elementos sin caracterizar anteriormente mediante la relación con elementos conocidos. De esta manera, el procedimiento de la presente invención permite asignar la función a un nivel molecular y temporal para cualquier componente celular, químico, fármaco u otro resto activo que induzca un cambio en el comportamiento de un componente celular endógeno o exógeno por referencia a los cambios inducidos por otros restos de función conocida. Se usan procedimientos analíticos no destructivos de célula única para analizar el comportamiento celular de los indicadores influenciados por los efectores genéticos y los moduladores químicos, en los que los indicadores y efectores pueden ser tanto endógenos como exógenos a la célula.

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la función o efecto de un elemento genético o un modulador químico procedente de las librerías de elementos genéticos y moduladores químicos de función conocida y desconocida sobre una población de células, comprendiendo el procedimiento

i)

determinar la distribución de una marca detectable expresada a partir de una secuencia indicadora de ácido nucleico en las células en presencia y ausencia de un primer modulador químico, cuyo modulador afecta la distribución del indicador, en el que las células a la vez están coexpresando una biblioteca de secuencias efectoras de ácido nucleico y están en presencia de una biblioteca de segundos moduladores químicos; y

ii)

analizar los datos de distribución de todas las combinaciones del efector, modulador e indicador para derivar relaciones funcionales y asignar la función al efector y al segundo modulador.

En el contexto de la presente invención, los siguientes términos se van a interpretar tal como se define a continuación:

"Efector" - una secuencia de ácido nucleico con función o actividad biológica que resulta de cualquiera de una proteína expresada con función o actividad biológica (por ejemplo, ADNc u otra secuencia de codificación de ácido nucleico) o que resulta de otro mecanismo de acción (por ejemplo, secuencias de sentido contrario y ARNi);

"Modulador" - un resto químico con función o actividad biológica;

"Indicador" - una secuencia de ácido nucleico que comprende una marca detectable, codifica una marca detectable o que puede opcionalmente fusionarse con una secuencia que codifica una marca de proteína detectable y expresada en una célula dando como resultado una localización característica de la proteína detectable;

"Ensayo celular" - un ensayo que proporciona un resultado de diagnóstico de la actividad biológica de un efector o modulador.

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para determinar la función o el efecto de un elemento genético o un modulador químico procedentes de bibliotecas de dichos elementos genéticos y moduladores químicos de función conocida y desconocida en una población de células, comprendiendo el procedimiento

i)

Determinar la distribución de una marca detectable expresada a partir de una secuencia indicadora de ácido nucleico en dichas células en presencia de un primer modulador químico, cuyo modulador afecta la distribución del indicador, en el que las células están a la vez coexpresando una biblioteca de secuencias efectoras de ácidos nucleicos y están en presencia de una biblioteca de segundos moduladores químicos;

ii)

Comparar los datos de distribución de i) anteriores con los datos de distribución conocidos, almacenados en una base de datos electrónica u óptica, para la marca detectable expresada a partir de una secuencia indicadora de ácido nucleico en ausencia del primer modulador químico; y

iii)

Analizar los datos de distribución de todas las combinaciones del efector, modulador e indicador para derivar relaciones funcionales y asignar la función al efector y al segundo modulador.

Adecuadamente, la secuencia efectora de ácido nucleico codifica una proteína o péptido y se selecciona entre el grupo constituido por ADN, ADNc, ARN y Ácido Nucleico Proteínico. Preferiblemente, la secuencia efectora de ácido nucleico es un oligonucleótido de sentido contrario (véase Dean (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12, 622-625). Más preferiblemente, el ácido nucleico efector es un ARN interferente pequeño (ARNip) que produce el silenciamiento del gen (véase Elbashir y col. (2002) Methods, 26, 199-213). El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo muy conservado de silenciamiento del gen que usa ARN de doble cadena como señal para desencadenar la degradación del ARNm homólogo. Los mediadores de la degradación del ARNm específico de la secuencia son los ARNip pequeños de 21 a 23 nucleótidos generados por la rotura mediante la ribonucleasa III del ARN de doble cadena más largo. Preferiblemente se proporciona un vector de expresión que comprende las secuencias adecuadas de control de la expresión unidas de manera operable a una secuencia indicadora o efectora de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El constructo de ADN de la invención puede insertarse en un vector recombinante, que puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a los procedimientos del ADN recombinante. La elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir. De esta manera, el vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica conjuntamente con el(los) cromosoma(s) en los que se ha integrado.

El vector es preferiblemente un vector de expresión en el que la secuencia efectora o indicadora de ácido nucleico está unida de manera operable a los segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ácido nucleico. En general, el vector de expresión se deriva de ADN de plásmido o vírico, o puede contener elementos de ambos. Preferiblemente, el vector de expresión se selecciona entre el grupo constituido por plásmido, retrovirus y adenovirus. El término, "unido de manera operable" indica que los segmentos se disponen de tal manera que funcionan en armonía para sus objetivos pretendidos, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y procede a través de la síntesis de la proteína.

El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en una célula huésped adecuada de elección, (por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de levadura, o una célula de insecto) para la transcripción de la secuencia indicadora o efectora de ácido nucleico. El promotor puede derivarse de genes que codifican cualquier proteína homóloga o heteróloga en la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención en células de mamíferos son el promotor CMV (documentos US 5168062, US 5385839), promotor de la Ubiquitina C (Wulff y col. (1990) FEBS Lett. 261, 101-105), promotor SV40 (Subramani y col. (1981) Mol. Cell Biol. 1, 854-864) y promotor MT-1 (gen de la metalotioneína) (Palmiter y col. (1983) Science 222, 809-814). Un ejemplo de un promotor adecuado para uso en células de insecto es el promotor de la polihedrina (documento US 4745051; Vasuvedan y col. (1992) FEBS Lett. 311, 7-11. Los ejemplos de promotores adecuados para uso en células huésped de levaduras incluyen los promotores de los genes glicolíticos de las levaduras (Hitzeman y col. (1980) J. Biol. Chem. 255, 12073-12080; Alber y Kawasaki (1982) J. Mol. Appl. Gen, 1, 419-434) o los genes de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., en Genetic Engineering of Microorganism for Chemicals (Hollaender y col, eds.), Plenum Press, Nueva York, 1982), o los promotores TP11 (documento US 4599311) o ADH2-4c (Russell y col. (1983) Nature 304, 652-654).

Las secuencias efectoras e indicadoras de ácidos nucleicos de la presente invención pueden también, si es necesario, conectarse de manera operable con un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona de crecimiento humana, los terminadores TPI1 o ADH3. El vector puede comprender además elementos tales como señales de poliadenilación (por ejemplo, de SV40 o de la región 5 Elb de adenovirus), secuencias potenciadoras transcripcionales (por ejemplo, el mejorador de SV40) y secuencias potenciadoras traduccionales (por ejemplo, las que codifican los ARN del adenovirus VA).

El vector puede comprender además una secuencia de ADN que posibilita la entrada ribosómica interna y la expresión de dos proteínas de una molécula de ARNm trascripto bicistrónico. Por ejemplo, la secuencia de entrada ribosómica interna del virus de la encefalomiocarditis (Rees S, y col. (1996) BioTechniques, 20, 102-110 y el documento US 4937190).

El vector recombinante puede comprender además una secuencia de ADN que posibilite al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Un ejemplo de dicha secuencia (cuando la célula huésped es una célula de mamífero) es el origen de la replicación del SV40.

Cuando la célula huésped es una célula de levadura, los ejemplos de secuencias adecuadas que posibilitan al vector replicarse son los genes REP 1-3 de replicación del plásmido de 2 \mu de levadura y el origen de la replicación.

El vector puede comprender también marcadores seleccionables, tales como un gen que confiera resistencia a un fármaco, por ejemplo, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, cloramfenicol, puromicina, neomicina o higromicina.

Los procedimientos usados para ligar las secuencias efectoras e indicadoras de ácidos nucleicos de la invención, el promotor y opcionalmente el terminador y/o la secuencia diana, respectivamente, e insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (por ejemplo, Molecular Cloning, Sambrook & Russell, Cold Spring Harbour Press, 2001).

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Adecuadamente, la secuencia indicadora de ácido nucleico comprende una marca detectable o codifica una marca detectable. Preferiblemente, la secuencia indicadora de ácido nucleico se crea fusionando la secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica una marca detectable.

Adecuadamente, la marca detectable se selecciona entre el grupo constituido por proteína fluorescente, enzima, antígeno y anticuerpo.

Se han aislado proteínas fluorescentes y derivados de proteínas fluorescentes de cromoproteínas procedentes de una amplia variedad de organismos, que incluyen Aequoria victoria, especies de Anemonia tales como A. majano y A. sulcata, especies de Renilla, especies de Ptilosarcus, especies de Discosoma, especies de Claularia, especies de Dendronephthyla, especies de Ricorda, especies de Scolymia, especies de Zoanthus, especies de Montastraea, especies de Heteractis, especies de Conylactis y especies de Goniopara.

El uso de Proteína Fluorescente Verde (GFP por sus siglas en inglés) derivada de Aequorea victoria ha revolucionado la investigación en muchos procesos biológicos celulares y moleculares. Sin embargo, las características de fluorescencia de GFP de tipo natural (nativo) (GFPwt) no son idealmente adecuadas para uso como indicador celular, se han dedicado esfuerzos significativos para producir formas mutadas variantes de GFP con propiedades más adecuadas para uso como indicador intracelular (Heim y col., (1994), Proceedings of the National Academy of Sciences (EE.UU), 91, 12501; Ehrig y col., 1995 FEBS Letters, 367, 163-6; documento WO 96/27675; Crameri, A. y col., (1996), Nature Biotechnology 14, 315-9; documento US 6172188; Cormack, B. P. y col., (1996) Gene 173, 33-38; documento US 6194548; US 6077707 y Patente británica Número 2374868 ("Amershan Biosciences UK Ltd"). Las formas de realización preferidas descritas en la Patente británica Nº 2374868 comprenden derivados de GFP seleccionados entre el grupo constituido por: F64L-V163A-E222G-GFP, F64L-S175G-E222G-GFP, F64L-S65T-S175G-GFP y F64L-S65T-V163A-GFP.

En una forma de realización preferida, la proteína fluorescente es una Proteína Fluorescente Verde (GFP) modificada que tiene una o más mutaciones seleccionadas entre el grupo constituido por Y66H, Y66W, Y66F, S65T, S65A, V68L, Q69K, Q69M, S72A, T2031, E222G, V163A, 1167T, S175G, F99S, M153T, V163A, F64L, Y145F, N149K, T203Y, T203Y, T203H, S202F y L236R.

Preferiblemente, la GFP modificada tiene tres mutaciones seleccionadas entre el grupo constituido por F64L-V163A-E222G, F64L-S175G-E222G, F64L-S65T-S175G y F64L-S65T-V163 tal como se desvela en la Patente británica Número 2374868.

Preferiblemente, el enzima se selecciona entre el grupo constituido por \beta-galactosidasa, nitroreductasa, fosfatasa alcalina y \beta-lactamasa. La secuencia indicadora de ácido nucleico puede detectarse de esta manera mediante la acción del enzima sobre un sustrato adecuado añadido a la célula. Los ejemplos de dichos sustratos incluyen CyDyes^{TM} nitrofijado (Amersham Biosciences, sustrato con nitroreductasa), ELF 97 (Molecular Probes, sustrato con fosfatasa alcalina) y CCF2 (Aurora Biosciences, sustrato con \beta-lactamasa).

Adecuadamente, el modulador se selecciona entre el grupo constituido por compuesto orgánico, compuesto inorgánico, péptido, polipéptido, proteína, carbohidrato, lípido, ácido nucleico, polinucleótido y ácido nucleico proteínico. Preferiblemente, el modulador se selecciona de una biblioteca combinatoria que comprende compuestos orgánicos similares tales como análogos o derivados.

Adecuadamente, la célula es una célula eucariota. Preferiblemente, la célula eucariota se selecciona entre el grupo constituido por mamífero, planta, ave, hongo, pez, insecto y nematodo, cuya célula puede o no estar genéticamente modificada. Más preferiblemente, la célula de mamífero es una célula humana, cuya célula puede o no estar genéticamente modificada.

Preferiblemente, la localización de la marca detectable se determina un sistema de formación de imagen. Un Sistema de Formación de Imagen adecuado es el In Cell Analyzer, tal como se desvela en el documento WO 99/47963 y en el documento PCT/GB03/01816.

Breve descripción de la invención

Figura 1; Esquema de generación de un ensayo de célula indicadora a partir de una colección de ADNc.

Figura 2; Esquema para establecer una relación funcional inferida entre un efector y un modulador en un ensayo celular.

Figura 3; Esquema de generación de un ensayo de indicador a partir de una colección de ADNc y una colección química y la aplicación posterior de ensayos de indicador seleccionados para establecer las relaciones funcionales entre los componentes de ambas colecciones.

Figura 4; a) Relación triplete funcional entre efector, modulador e indicador. b) variación en los tripletes derivados de las colecciones de efectores y moduladores que comprenden componentes de función conocida y desconocida y/o actividad biológica.

Figura 5; Esquema para establecer relaciones funcionales extendidas entre efectores y/o moduladores de función conocida y desconocida mediante la conexión de relaciones triplete funcionales a través de componentes comunes.

Figura 6; Medidas de la intensidad de la fluorescencia de la imagen de una cadena de ADN nuclear y expresión de la proteína de fusión EGFP para un intervalo de indicadores de ADNc transfectados en células HeLa.

Figura 7; Medidas de la intensidad de la fluorescencia de la imagen de una cadena de ADN nuclear y expresión de la proteína de fusión EGFP de un indicador de ADNc único transfectado en células HeLa.

Figura 8; Distribución del indicador nuclear citoplásmico en células HeLa expuestas a dexametasona y estaurosporina.

Figura 9; Gráfico de dispersión de la distribución del indicador en células HeLa expuestas a dexametasona y estaurosporina.

Figura 10; Respuesta de un intervalo de indicadores a la exposición a estaurosporina de células HeLa.

Figura 11; Efectos de la transfección transitoria de un intervalo de efectores de ADNc sobre la distribución de un indicador NF\kappaB p65-GFP en células CHO.

Figura 12; Efectos de la transfección transitoria de un intervalo de efectores de ADNc sobre la respuesta de un indicador NF\kappaB p65-GFP en células CHO tras estímulo con IL-1.

Figura 13; Efectos de la transfección transitoria de un intervalo de efectores de ADNc sobre la distribución de un indicador Rac1-GFP en células CHO.

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Descripción detallada de la invención

Para conseguir el procedimiento de la presente invención, una o más de una colección de secuencias de ácidos nucleicos [10] (Figura 1) en un vector adecuado para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped se subclonan en un vector adicional [20] para proporcionar fusiones del producto de proteína de la(s) secuencia(s) de ácido(s)
nucleico(s) con una proteína detectable. La proteína detectable puede ser cualquier proteína que se pueda expresar en una célula de mamífero y detectarse usando la instrumentación apropiada. Las proteínas detectables adecuadas incluyen proteínas fluorescentes tales como la Expresión de la Proteína Fluorescente Verde de la proteína de fusión que se puede conseguir mediante el uso de procedimientos estándar que incluyen la transfección mediada químicamente (FuGENE, Roche; Lipofectin, Invitrogen), electroporación (Brunner y col. (2002) Molecular Therapy 5, 80-6) o liberación balística (Burkholder y col. (1993) J Immunol Methods 965, 149-56).

La expresión de la proteína de fusión detectable en una población de células huésped [30] da como resultado una distribución de la proteína detectable característica de la proteína codificada por la secuencia del ácido nucleico [10]. La expresión de la proteína de fusión en una segunda población de células huésped [50] en presencia de un compuesto de ensayo [40] dará como resultado en algunas circunstancias una distribución de la proteína de fusión [70] que difiere de la obtenida en ausencia del compuesto de ensayo [60]. En dichos casos de combinaciones de [20] y [40] que dan como resultado modelos de distribución en los que [60] difiere de [70], la combinación concreta de compuesto de ensayo y proteína de fusión detectable proporciona una base para investigaciones adicionales. Es un aspecto importante de este proceso el que no requiere el conocimiento de la identidad de la función biológica de cualquier componente [10] o [40], más allá de lo necesario para continuar el proceso tal como se describe; por ejemplo información suficiente de la secuencia de [10] para permitir el ensamblaje del constructo de fusión [20]. Este procedimiento establece combinaciones de las proteínas de fusión [20] y de los compuestos de ensayo [40] que diseñan conjuntamente un fenotipo celular definido y sensible, es decir, un ensayo basado en célula que puede usarse en la selección funcional adicional.

Una vez se han establecido las combinaciones clave de [20] y [40] en las que [40] presenta una actividad reproducible en la modulación de la distribución celular de [20], puede llevarse a cabo una segunda ronda de selección en la que las secuencias de ácidos nucleicos [10] se transfectan en células que expresan la proteína de fusión detectable en ausencia [60] y presencia [70] del compuesto de ensayo [40]. Las células se evalúan posteriormente para la modulación del fenotipo construido mediante ingeniería genética para identificar las secuencias de ácidos nucleicos [10] que modulan la distribución celular de la proteína de fusión detectable tanto sola [80], como en combinación [90] (antagonismo o sinergia) con el compuesto de ensayo.

La repetición del procedimiento de selección (Figura 2) usando bibliotecas de secuencias de ácidos nucleicos [110] y compuestos de ensayo [140] en el que ambas bibliotecas contienen elementos de función conocida (sombreados) [111] [141] y desconocida (sin sombrear) [112] [142], y la exposición de las células de fenotipo construido mediante ingeniería con elementos de estas bibliotecas solas [160] [162] y en combinación [165], permite que se investiguen las funciones e interacciones de las secuencias de ácidos nucleicos y los compuestos de ensayo. En el ejemplo de la Figura 2, la interacción de un componente de la secuencia de ácido nucleico [170, 166, 168] de la biblioteca [110] con células del fenotipo construido mediante ingeniería genética [160] produce un cambio en el fenotipo detectado [170]; la interacción de un componente químico de la colección de compuestos de ensayo [140] con células del mismo fenotipo construido mediante ingeniería genética [162] no cambia el fenotipo detectado [166]; la coexposición de células adicionales del mismo fenotipo construido mediante ingeniería genética [165] con los mismos elementos químicos y genéticos en combinación no conduce a un cambio en el fenotipo observado [168] indicando alguna forma de antagonismo entre las funciones del compuesto de ensayo y la secuencia expresada de ácido nucleico.

Puede por tanto llevarse a cabo la selección a gran escala usando una biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos de función conocida y desconocida en combinación con una colección de compuestos de ensayo de actividad biológica caracterizada y sin caracterizar para establecer combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos y entidades químicas que operan en armonía para modificar un fenotipo celular detectable medido mediante un ensayo celular. Debido a que el procedimiento genera inherentemente ensayos celulares, el procedimiento tiene las ventajas sobre las soluciones usadas anteriormente de que no requiere de conocimiento previo de las actividades celulares o de ensayos celulares preexistentes; aunque puede usarse el procedimiento en conjunción con ensayos basados en células preexistentes, donde esté disponible.

Numerosos grupos (Bejarano y col. (1999) J Cell Sci 112 (23), 4207-11; Misawa y col. (2000) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 97, 3062-6; González y col. (2000) Trends Cell Biol 10, 162-5; Rolls y col. (1999) J. Cell Biol. 146, 29-44; Simpson y col (2000) EMBO 1, 287-92) han informado el uso del etiquetado con GFP de genes desconocidos o motivos de secuencia procedentes de bibliotecas de ADNc u otras fuentes para identificar las secuencias asociadas con proteínas de localización subcelular definida. Ya existen desarrollos para la clonación automática (Rolls y col. (1999) J. Cell Biol. 146, 29-44 que permiten la generación de fusiones de alto rendimiento de GFP N y C terminales necesarias para la transfección.

El uso de análisis de alto rendimiento basado en imágenes usando instrumentos tales como el Analizador Celular IN de Amersham Biosciences (Goodyer y col. (2001), Society for Biomolecular Screening, 7th Annual Conference and Exhibition, Baltimore, EE.UU Screening and signaling events in live using novel GFP redistribution assays) permiten el uso de ensayos que miden la localización de la proteína etiquetada a realizar en células moduladas transitoriamente (por ejemplo, mediante transfección de ADNc transitorio) con recogida de datos sobre una base celular individual. Esta solución ofrece numerosos beneficios, que incluyen la eliminación de la necesidad de preestablecer líneas celulares indicadoras estables antes de la selección, dando como resultado resultados de ensayo que es menos probable que estén distorsionados por el "silenciamiento mediado por la sobreexpresión" y la distorsión del fenotipo que surge por la selección celular (Giese y col. Drug Discovery Today (2002) 7, 179-186) asociados con la generación de grandes cantidades de líneas celulares estables.

Se puede usar el procedimiento de la invención para establecer relaciones funcionales entre elementos genéticos (efectores), elementos químicos (moduladores) y ensayos celulares (indicadores). Comenzando a partir de colecciones de efectores [210] (Figura 3) y moduladores [210] de función conocida o desconocida, se construyen mediante ingeniería genética efectores de ADNc como fusiones con proteínas marcadoras detectables [220] y se transfectan en células diana en presencia [270] y ausencia [260] de moduladores seleccionados [240]. Se seleccionan las combinaciones de efectores, moduladores y células diana que proporcionan una diferencia reproducible en la localización de la proteína de fusión detectable [S] para rondas adicionales de selección funcional en la que las combinaciones seleccionadas se estimulan con efectores [210] o moduladores [240]. Por este medio, se pueden ensayar muchas combinaciones de tres vías de efectores, moduladores e indicadores [290]. Pueden usarse combinaciones tripartitas [390] (Figura 4a) en las que la actividad [345] de un modulador químico [340] y la actividad [315] de un efector genético [310] o un ensayo basado en célula indicadora [360] se correlacionan y usan para inferir la presencia o ausencia de una relación funcional [301] entre efector y modulador, para establecer relaciones funcionales y grupos entre muchas entidades diferentes. Para cualquier colección de efectores y moduladores en los que la función o actividad biológica de los componentes de la colección sea conocida y desconocida, y en el que estas colecciones se ensayen en combinación con ensayos de células indicadoras de una significancia biológica conocida (es decir, ensayos preexistentes) o desconocida, son posibles ocho combinaciones posibles de tres vías (tripletes) [302]-[309], y se resumen en la Tabla 1.

En consecuencia, recogiendo datos de un gran número de tripletes en los que se ensayan elementos desconocidos en combinación con elementos conocidos y seleccionando tripletes en los que hay una interacción entre los tres componentes, es posible ensamblar redes de relaciones funcionales que dan como resultado información sobre la función biológica de elementos no caracterizados anteriormente. Por ejemplo, un triplete [400] (Figura 5), en el que se desconocen las actividades biológicas de los elementos tanto efectores como moduladores, puede unirse con un segundo triplete [401] en el que se conoce la actividad biológica del modulador y el efector, mediante un ensayo común compartido por ambos tripletes, y en consecuencia dar como resultado información sobre las posibles actividades biológicas del modulador y el efector del primer triplete [400]. Por extensión del mismo principio, el triplete [402] puede unirse al triplete [401] mediante un modulador común y establecerse uniones adicionales a los tripletes [403] mediante [408]. En la Figura 5, se representan dichas uniones en un plano bidimensional, en la práctica las uniones no se constriñen a una estructura en ramificación lineal y pueden comprender bucles [L1] haciendo conexiones adicionales, nudos (B) o nudos múltiples (por ejemplo, B1, B2) a partir del mismo triplete.

Ejemplos específicos Ejemplo 1

Se preparó una colección de ADNc (Invitrogen & Image Consortium, Tabla 2) para la expresión como proteínas de fusión ADNc-EGFP insertando secuencias de ADNc en el emplazamiento de clonación múltiple de los vectores de expresión pCORON1000-EGFP-N2 y pCORON1000-EGFP-C1 (Amersham Biosciences) usando técnicas estándar de clonación molecular (Molecular Cloning, Sambrook & Russell, Cold Spring Harbour Press 2001). Estos vectores dirigen la expresión de las proteínas de fusión que comprenden la proteína codificada por la secuencia de ADNc insertado fusionada en sus términos amino y carboxi con EGFP en células de mamífero bajo el control de un promotor CMV constitutivamente activo.

Se transfectaron transitoriamente los vectores de expresión que codificaban los indicadores ADNc-EGFP en células HeLa que crecían en pocillos de placas de microvaloración de 96 pocillos mediante transfección mediada químicamente (Fugene, Roche) y se incubaron las células en condiciones estándar de crecimiento durante 24 horas para permitir la síntesis de las proteínas de fusión indicadoras. Las células se tiñeron posteriormente con DRAQ 5, un finte de unión al ADN nuclear permeable en células (Biostatus), para marcar fluorescentemente los núcleos celulares, y se tomaron imágenes de todos los pocillos con un láser de doble excitación (EGFP 488 nm, DRAQ 5 633 nm) usando un Analizador Celular IN (Amersham Biosciences). Se recogieron los datos de la fluorescencia verde (EGFP) y roja (DRAQ 5) para todas las células (Figura 6) y se usaron para determinar los umbrales de separación de datos de las células transfectadas (fluorescencia EGFP por encima del umbral) de las células no transfectadas (fluorescencia EGFP por debajo del umbral). Se muestran en la Figura 7 los datos representativos de una proteína de fusión ADNc-EGFP única. Se expresó una proteína de fusión derivada del ADNc de longitud completa que codificaba el receptor glucocorticoide insertado en pCORON1000-EGFP-N2 en células HeLa y se analizó tal como se describe anteriormente. Para esta proteína indicadora se usó un umbral de 25 (línea de puntos horizontal en la Figura 7) para discriminar los datos de las células transfectadas (> 25) y no transfectadas (< 25).

La recogida de datos y el análisis tal como se describe anteriormente permiten que se usen las proteínas de fusión ADNc-EGFP como indicadores en poblaciones de células transfectadas transitoriamente usando datos de umbrales para distinguir células transfectadas de no transfectadas, evitando de esta manera la necesidad de construir mediante ingeniería genética las líneas celulares estables necesarias para los procedimientos de análisis que usan medidas promedio de la población.

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Ejemplo 2

Se transfectaron las proteínas indicadoras derivadas de un intervalo de ADNc tal como se describe para el Ejemplo 1 en células HeLa y se dejaron expresar durante 24 horas. Tras la expresión, se transfirieron las células en medio libre de suero durante 2 horas para permitir la desaparición de los efectos de los estímulos de los factores del suero tales como cortisol. Se tiñeron las células con DRAQ 5, se tomaron imágenes tal como se describe en el Ejemplo 1, se devolvieron al medio completo y a continuación se expusieron a 1 \muM de dexametasona (un agonista glucocorticoide sintético) o 1 \muM de estaurosporina (inhibidor de la quinasa e inductor de la apoptosis) durante 5 minutos tras de los cuales se repitió la toma de imágenes. Se analizaron los datos de imagen usando un algoritmo de tráfico nuclear (Amersham Biosciences; (véase Adie y col. (2001) "The pharmacological characterization of a GPCR using pH sensitive cyamine dyes on the LEADseeker Cell Analysis System" Poster, Society for Biomolecular Screening Conference 10-13 de Septiembre de 2001, Baltimore EE.UU; Goodyer y col. (2001) "Screening of signaling event in live cells using novel GFP redistribution assays" Poster, Society for Biomolecular Screening Conference 10-13 de Septiembre de 2001. El algoritmo devuelve una descripción numérica de distribución de la fluorescencia en núcleo y citoplasma como una relación (fluorescencia nuclear dividida por fluorescencia citoplásmica; N/C). Este algoritmo permite cuantificar la distribución espacial de las proteínas de fusión ADNc-EGFP en células expresantes: una relación N/C baja indica una localización citoplásmica de la proteína indicadora, una relación N/C alta indica una localización nuclear. En consecuencia, un cambio en la relación N/C de una proteína indicadora inducido por un modulador químico indica una translocación del indicador en respuesta al modulador. Esta forma de análisis permite seleccionar las combinaciones de indicadores/moduladores químicos por parejas en las que el indicador presenta translocación en respuesta al modulador, y puede servir como base para ensayar la acción de efectores o moduladores adicionales sobre la respuesta caracterizada.

Se muestran en la Figura 8 los resultados de este análisis con las diferencias en las relaciones N/C en ausencia y presencia de dexametasona y estaurosporina, representadas gráficamente por un intervalo de proteínas de fusión indicadoras. Los resultados muestran una diversidad de respuestas a través de las proteínas indicadoras para los dos moduladores usados en este ejemplo. Una proteína indicadora (GR) construida mediante fusión del receptor glucocorticoide de EGFP mostró un incremento muy grande de la relación N/C indicativa de un cambio en la localización de la proteína indicadora entre el citoplasma y el núcleo. Este cambio en la localización es consistente con la respuesta de translocación bien caracterizada del receptor glucocorticoide tras exposición a agonistas glucocorticoides, incluyendo dexametasona (Htun y col. (1996) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93(10), 4845-50). Otras numerosas proteínas indicadoras mostraron un cambio significativo en la relación N/C cuando se expusieron a cualquiera de dexametasona o estaurosporina (por ejemplo, ATF1, YKT6).

Se muestran también en la Figura 9 los datos de este ejemplo en forma de un gráfico de dispersión de la respuesta de la dexametasona frente a la respuesta de la estaurosporina. Los datos de la representación gráfica en esta forma ponen de relieve las respuestas diferenciales de los indicadores respecto de los moduladores; la mayor parte de los indicadores bien no muestran una respuesta a cualquier modulador o bien muestran una respuesta equivalente a ambos tratamientos con modulador. Cuando se representan gráficamente de esta manera, los datos muestran claramente que los dos indicadores, GR (receptor glucocorticoide) y ATF1 (factor 1 que activa la transcripción) muestras respuestas específicas y diferenciales a los dos moduladores. Se ha descrito anteriormente la implicación de ATF1 en la respuesta celular al estrés (Wiggin y col. (2002) Mol Cell Biol Apr., 22(8), 2871-81) e indica que la pareja ATF1-estaurosporina podría servir como un sistema de prueba adecuado para estudiar la actividad de los efectores o moduladores sobre los mecanismos de respuesta al estrés celular. Los datos que se muestran en la Figura 9 también ponen de relieve aquellos indicadores que responden a dexametasona y estaurosporina. Estas respuestas son un resultado directo de la eliminación del suero y el régimen de sustitución requerido para medir la translocación de GR, cuando un grupo de proteínas indicadoras, que incluyen CREB1, p27-KIP y LMNA muestran un cambio en el valor N/C tras la restitución de las células al medio que contiene suero.

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Ejemplo 3

Se transfectó un grupo adicional de proteínas indicadoras en células HeLa y se tomaron imágenes de las células antes y después de la exposición a estaurosporina tal como se describe en el Ejemplo 2. Se analizaron las imágenes en un IN Cell Analyzer con dos algoritmos adicionales, Granularity y Membrane Spot (Amersham Biosciences) (véase Adie y col. (2001) "The pharmacological characterization of a GPCR using pH sensitive cyamine dyes on the LEADseeker Cell Analysis System" Poster, Society for Biomolecular Screening Conference 10-13 de Septiembre de 2001, Baltimore EE.UU; Goodyer y col. (2001) "Screening of signaling events in live cells using novel GFP redistribution assays" poster, Society for Biomolecular Screening Conference 10-13 de Septiembre de 2001). Estos algoritmos restituyen resultados que cuantifican la fluorescencia en grados de granularidad (es decir, un valor bajo indica distribución uniforme, un valor alto indica una distribución puntual) y en términos de localización de la membrana. En consecuencia estos algoritmos son adecuados para examinar indicadores que no presentan localización diferencial citoplásmica a nuclear y por tanto no son adecuados para el análisis mediante el algoritmo usado en el ejemplo anterior.

Se muestran en la Figura 10 los resultados del análisis con estos dos algoritmos en células tratadas con estaurosporina. Los datos restituidos por los algoritmos variaron significativamente a través del intervalo de indicadores, con algunas proteínas dando como resultado un valor elevado de granularidad y un valor bajo de punto luminoso en membrana, y viceversa. El examen de las relaciones de las respuestas de ambos algoritmos (recuadro de la Figura 10) reveló que el indicador, Cyt-C (EGFP-Citocromo C), mostró la restitución diferencial más elevada para los dos algoritmos. La liberación de Citocromo C de la mitocondria y la redistribución celular subsiguiente es un episodio temprano bien caracterizado al comienzo de la apoptosis celular (Gao y col. (2001) J Cell Sci., 114, 2855-62). En consecuencia, los datos de este ejemplo proporcionan evidencia adicional de que las proteínas indicadoras construidas mediante ingeniería genética a partir de ADNc que codifica proteínas celulares fusionadas con un marcador detectable y expresadas transitoriamente en células de mamífero proporcionan un medio para captar información funcional relevante sobre cómo el ADNc codifica la proteína; dichas parejas indicador-modulador son adecuadas para uso en la selección funcional adicional.

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Ejemplo 4

Se transfectó transitoriamente un intervalo de moduladores de ADNc en células CHO que expresaban una proteína de fusión NF\kappaB p65-GFP. Este indicador experimenta una translocación citoplásmica y nuclear bien caracterizada en respuesta a numerosos estímulos, que incluyen la exposición a Interleuquina-1 (IL-1). Se incubaron las células durante 24 horas después de la transfección, se tiñeron con DRAQ 5, se tomaron imágenes, y a continuación se estimularon con IL-1, tras repetir la toma de imágenes, se determinaron las relaciones N/C para todas las imágenes usando el algoritmo descrito en el Ejemplo 2, y se preparó una gráfica de dispersión (Figura 11) a partir de los datos.

En un experimento de este diseño en el que dos factores (estímulo y efector) pueden cambiar el comportamiento del indicador, pueden producirse numerosas posibilidades.

a)

el efector puede disminuir la relación N/C del indicador antes del estímulo en relación a un valor control (células en ausencia de efector)

b)

el efector puede aumentar la relación N/C del indicador antes del estímulo en relación a un valor control

c)

el efector puede disminuir la relación N/C del indicador tras un estímulo en relación al valor control

d)

el efector puede aumentar la relación N/C del indicador tras un estímulo en relación al valor control

todo lo anterior puede, dependiendo de su combinación, dar como resultado una modulación de la magnitud del cambio de la relación N/C del indicador inducida por el estímulo de IL-1. La gráfica de dispersión de la Figura 1 representa gráficamente estos escenarios separando los resultados en cuatro cuadrantes;

1

Adicionalmente, la línea de puntos diagonal de la Figura 11 indica los puntos de las relaciones N/C equivalentes, en consecuencia, la distancia entre la línea (a 90º de la línea) de cualquier valor proporciona una medida de la respuesta global de la proteína indicadora a la estimulación con IL-1 en presencia de un efector dado en relación con la ausencia del efector. Es evidente que los efectores usados en este experimento tienen un intervalo de efectos sobre la distribución de la proteína indicadora cambiando la relación N/C antes y después del estímulo con IL-1 y cambiando la respuesta global a la estimulación con IL-1.

La Figura 12 muestra un tratamiento simplificado de estos resultados en los que se muestran únicamente los datos de la respuesta a IL-1 (es decir, la diferencia entre N/C_{0} y N/C_{IL-1}). Estos datos indican un intervalo de respuestas a la transfección con efectores que oscila desde el antagonismo significativo de la estimulación con IL-1 (CCND3) al fuerte agonismo (por ejemplo, PRKCs A, Z & E y GSK3B). Estos agonistas han demostrado anteriormente modular la actividad de la ruta que señala NF\kappaB (La Porta y col. (1998) Anticancer Res. 18(4A): 2591-7; Hoeflich y col. (2000) Nature 406 (6791), 86-90) confirmando la validez de usar esta solución para la selección funcional de los efectores de ADNc frente a los indicadores expresados en células de mamífero.

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Ejemplo 5

Se repitió la selección funcional del Ejemplo 4 con un segundo indicador, RAC1 (T)-GFP, en presencia y ausencia de estimulación con insulina y se analizó usando el algoritmo de punto luminoso en membrana descrito en el Ejemplo 3. Tal como en el Ejemplo 4, es evidente que los efectores usados en este experimento tienen un intervalo de efectos sobre la distribución de la proteína indicadora cambiando la distribución celular del indicador antes y después del estímulo de insulina y cambiando la respuesta global a la estimulación con insulina (Figura 13).

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TABLA 1

2

TABLA 2

3

Claims (18)

1. Un procedimiento para determinar la función o efecto de un elemento genético o un modulador químico procedentes de bibliotecas de dichos elementos genéticos y moduladores químicos de función conocida y desconocida en una población de células que comprende

i)

determinar la distribución de una marca detectable expresada a partir de una secuencia indicadora de ácido nucleico en dichas células en presencia y ausencia de un primer modulador químico, cuyo modulador afecta dicha distribución de dicho indicador, en el que las células coexpresan una biblioteca de secuencias efectoras de ácidos nucleicos y están en presencia de una biblioteca de segundos moduladores químicos; y

ii)

analizar los datos de distribución de todas las combinaciones de dicho efector, modulador e indicador para derivar relaciones funcionales y asignar la función al efector y dicho segundo modulador.

2. Un procedimiento para determinar la función o el efecto de un elemento genético o un modulador químico a partir de las bibliotecas de dichos elementos genéticos y moduladores químicos de función conocida y desconocida sobre una población de células que comprende

i)

determinar la distribución de una marca detectable expresada a partir de una secuencia indicadora de ácido nucleico en dichas células en presencia de un primer modulador químico, cuyo modulador afecta dicha distribución de dicho indicador, en el que las células a la vez coexpresan una biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos y están en presencia de una biblioteca de segundos moduladores químicos;

ii)

comparar los datos de distribución de i) anteriores con datos de distribución conocidos, almacenados en una base de datos electrónica u óptica, para la marca detectable expresada a partir de dicha secuencia indicadora de ácido nucleico en ausencia de dicho primer modulador químico; y

iii)

analizar los datos de distribución de todas las combinaciones de dicho efector, modulador e indicador para derivar relaciones funcionales y asignar la función al efector y dicho segundo modulador.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia efectora de ácido nucleico codifica una proteína o péptido y se selecciona entre el grupo constituido por ADN, ADNc, ARN y Ácido Nucleico Proteínico.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido nucleico efector es un oligonucleótido de sentido contrario.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido nucleico efector es un ARN interferente pequeño (ARNip) que produce el silenciamiento del gen.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, en el que el ácido nucleico efector comprende una secuencia de ácido nucleico en un vector de expresión celular.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho vector de expresión se selecciona entre el grupo constituido por plásmido, retrovirus y adenovirus.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la secuencia indicadora de ácido nucleico se crea fusionando dicha secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica una marca detectable.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha marca detectable se selecciona entre el grupo constituido por proteína fluorescente, enzima, antígeno y anticuerpo.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha proteína fluorescente es una Proteína Fluorescente Verde modificada (GFP) que tiene una o más mutaciones seleccionadas entre el grupo constituido por Y66H, Y66W, Y66F, S65T, S65A, V68L, Q69K, Q69M, S72A, T2031, E222G, V163A, I167T, S175G, F99S, M153T, V163A, F64L, Y145F, N149K, T203Y, T203Y, T203H, S202F y L236R.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha GFP modificada tiene tres mutaciones seleccionadas entre el grupo constituido por F64L-V163A-E222G, F64L-S175G-E222G, F64L-S65T-S175G y F64L-S65T-V163.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho enzima se selecciona entre el grupo constituido por \beta-galactosidasa, nitroreductasa, fosfatasa alcalina y \beta-lactamasa.

13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el modulador se selecciona entre el grupo constituido por compuesto orgánico, compuesto inorgánico, péptido, proteína, carbohidrato, lípido, ácido nucleico, polinucleótido y ácido nucleico proteínico.

14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el modulador se selecciona de una biblioteca combinatoria que comprende compuestos orgánicos similares tales como análogos o derivados.

15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha célula es una célula eucariota.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha célula eucariota se selecciona entre el grupo constituido por mamífero, planta, ave, hongo, pez y nematodo, cuya célula puede estar o puede no estar modificada genéticamente.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha célula de mamífero es una célula humana, cuya célula puede estar o puede no estar modificada genéticamente.

18. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 1 a 17, en el que la distribución de la marca detectable se determina usando un sistema de formación de imagen.