ES2314252T3 - Intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio. - Google Patents

Abstract

(1) Un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Description

Intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio.

Campo técnico

Esta invención se refiere a un intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio útil en el rastreo de un agente para tratar una lesión celular debido a una reperfusión postisquémica y/o a una enfermedad inflamatoria.

Antecedentes de la técnica

Durante una isquemia, un órgano pasa de una fase reversible a la fase irreversible de la lesión celular. Se considera que es posible evitar una lesión si se realiza una reperfusión al órgano durante el proceso, pero los exámenes experimentales y clínicos señalan que la reperfusión per se vuelve a dañar el órgano. Esto se denomina lesión por reperfusión. Se sabe que tanto los radicales libres generados durante la reperfusión como el exceso de calcio intracelular (sobrecarga de calcio) debido a la reperfusión desempeñan un papel importante en la generación de las lesiones por reperfusión (referencias no de patente 1 y 2). Hay varias hipótesis propuestas sobre el mecanismo de sobrecarga de calcio, tal y como se exponen a continuación (referencia no de patente 3):

(1)

Debido al fallo de un sistema de intercambio de calcio dependiente de la energía, el calcio fluye hacia el interior de las células según un gradiente de concentración del mismo.

(2)

Durante la isquemia, aumenta una concentración de iones de sodio intracelular y, por tanto, el calcio fluye hacia el interior de las células mediante un sistema de intercambio de sodio-calcio.

(3)

Un aumento de la densidad del receptor \alpha durante la isquemia promueve una sobrecarga de calcio tras la reperfusión.

(4)

Debido a un fallo grave de una membrana celular, el calcio extracelular fluye hacia el interior de las células según un gradiente de concentración del mismo.

Además, se considera que en la muerte celular neuronal retardada que se produce durante la reperfusión postisquémica en el cerebro, se activa un receptor de glutamato, el receptor NMDA (N-metil-D-aspartato), se abre un canal de calcio activado por el NMDA y, por tanto, el calcio fluye hacia el interior de las células (referencia no de patente 4).

Tras una isquemia transitoria en un animal experimental, se observa en el cerebro, el corazón y el riñón el fenómeno del no reflujo (cuando se vuelve a hacer fluir un flujo sanguíneo, se genera una región en la que el flujo sanguíneo no es refluido tópicamente). Como mecanismos principales del fenómeno de no reflujo, se sugieren la hemorragia y la destrucción de la construcción microvascular (por ejemplo, el émbolo capilar por los leucocitos o el hinchamiento de células endoteliales vasculares), la trombosis plaquetaria o similares (referencia no de patente 5). Se observan, como las células que bloquean los microvasos de un foco de la oclusión arterial cerebral media, los leucocitos polimorfonucleares, los monocitos o las plaquetas, además de los eritrocitos, y concretamente, se indica el émbolo capilar por neutrófilos clasificado dentro de los leucocitos como la causa del fenómeno del no reflujo (referencia no de patente 5). Al pasar a través de los microvasos, los leucocitos polimorfonucleares retrasan un flujo de eritrocitos. Además, durante la isquemia del cerebro, los leucocitos polimorfonucleares interactúan con las células endoteliales vasculares o las plaquetas, aumentándose las expresiones de los receptores de los factores de adhesión en las superficies de los leucocitos polinucleares. Además, los anticuerpos monoclonales frente a factores de adhesión tales como L-selección, CD11, CD18 o ICAM-1 atenuaron la acumulación de leucocitos y redujeron la superficie del infracción, sugiriendo así que la expresión de los factores de adhesión desempeña un papel importante en la acumulación de leucocitos durante la reperfusión postisquémica (referencias no de patente 6 y 7). Además, se ha informado que la expresión de los factores de adhesión en leucocitos se aumenta mediante el aumento de una concentración de calcio intracelular (referencia no de patente 8).

Se conocen numerosos canales iónicos que controlan un medio iónico intracelular. Como aquéllos que desempeñan un papel particularmente importante en la lesión por reperfusión postisquémica, se conocen, por ejemplo, un intercambiador de sodio-hidrógeno y un intercambiador de sodio-calcio. Durante el proceso de lesión por reperfusión postisquémica, hay dos etapas en el paso de la isquemia a la reperfusión. Una es la isquemia y la otra es la reperfusión. Durante la isquemia, no se suministra sangre y se produce una condición anaeróbica, y así se genera un agotamiento de la energía, una promoción del metabolismo anaeróbico, una acumulación de los metabolitos dañados y similares, produciéndose como resultado una acidosis. Durante la reperfusión, se suministra oxígeno, y así se atenúa la acidosis, junto con un suministro de energía, un reinicio del metabolismo aeróbico y una eliminación de los metabolitos acumulados, para volver a las condiciones fisiológicas. Sin embargo, como la lesión avanza rápidamente durante la reperfusión, parece que las condiciones neutralizadas por la reperfusión son peores que las de la acidosis provocada por la isquemia. Se sabe que el intercambiador de sodio-hidrógeno y el intercambiador de sodio-calcio están implicados en este fenómeno (referencia no de patente 9).

Se sabe que el intercambiador de sodio-hidrógeno existe sobre la membrana celular, que está implicado en un control del pH intracelular y que tiene la actividad de extrudir los iones de hidrógeno fuera de la célula conforme a un gradiente de concentración durante la acidosis, y simultáneamente, la de incorporar iones de sodio a la célula. Se ha informado que el mecanismo en el que se suprimen la expresión y la actividad del intercambiador de sodio-hidrógeno durante el pre-acondicionamiento isquémico está implicado en una acción protectora (referencia no de patente 10). Es más, se ha informado que la activación del intercambiador de sodio-hidrógeno activa los neutrófilos y promueve la adhesión de los neutrófilos mediante la expresión de CD11, CD18 o ICAM-1 (referencia no de patente 11).

Hay dos tipos de reacciones del intercambiador de sodio-calcio, i.e., la reacción de intercambio de sodio-calcio clásica y la reacción de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio (referencias no de patente 12 y 13). Se considera que los intercambiadores de sodio-calcio existen en todos los tejidos. La función fisiológica es una extrusión del calcio intracelular fuera de la célula acompañada por un influjo de sodio extracelular. Además, se ha comunicado que la reacción inversa en la que el sodio intracelular es extrudido y el calcio fluye hacia el interior de la célula puede ocurrir fisiológicamente.

Según un informe sobre la dinámica iónica durante la lesión por reperfusión postisquémica, no se suministra oxígeno y se promueve el metabolismo anaeróbico durante la isquemia, agotándose así el sustrato (ATP) de energía y avanzando la acidosis. Es decir, los iones de sodio no son extrudidos hacia fuera de la célula debido a la desactivación de las bombas de sodio, y los iones de sodio fluyen hacia el interior de la célula mediante la extrusión gradual de iones de hidrógeno fuera de la célula por medio del intercambiador de sodio-hidrógeno para un ajuste de la acidosis. La acumulación de iones de sodio intracelular da como resultado un aumento de los iones de calcio intracelular por medio del intercambiador de sodio-calcio. Además, debido a que el pH de alrededor de los tejidos se neutraliza rápidamente durante la reperfusión, aumenta un gradiente de concentración entre los iones de hidrógeno intracelular acumulados por el metabolismo anaeróbico y los iones de hidrógeno disminuidos alrededor de los mismos. Además, se activa el intercambiador de sodio-hidrógeno y luego se extruden hacia fuera de la célula los iones de hidrógeno, fluyendo los iones de sodio rápidamente hacia el interior de la célula. Tras el rápido influjo de los iones de sodio, se activa el intercambiador de sodio-calcio y entonces se extruden hacia fuera de la célula los iones de sodio, y los iones de calcio son transportados hacia el interior de la célula. Es decir, la concentración de calcio intracelular aumenta rápidamente para convertirse en una sobrecarga de calcio. Este rápido aumento del pH y del influjo de calcio hacia el interior de la célula se considera como un desencadenante de las acciones perjudiciales que se producen durante la reperfusión postisquémica (referencia no de patente 9). Como se describe anteriormente, la activación del intercambiador de sodio-hidrógeno como la primera etapa y la activación del intercambiador de sodio-calcio como la segunda etapa desempeñan un importante papel en una etapa relativamente temprana de la lesión por reperfusión postisquémica.

En relación con el aumento de concentración del calcio intracelular en los leucocitos durante la reperfusión postisquémica, se sabe que el influjo de calcio hacia el interior de las células es importante en el proceso de activación de los neutrófilos causado por los factores de movilización de leucocitos tales como la formilmetionil-leucinil-fenilalanina (fMLP), el ácido araquidónico o el leucotorieno B4, y que la activación de los neutrófilos es inhibida por la supresión del influjo (referencia no de patente 14). Además, se ha informado que el pH intracelular se ve aumentado por el tratamiento con fMLP y que los inhibidores del intercambiador de sodio-hidrógeno suprimen el aumento del pH intracelular y la migración leucocitaria (referencia no de patente 15).

Sin embargo, no se sabe si la inhibición del intercambiador de sodio-calcio en los leucocitos suprime la activación de los leucocitos, y hasta el momento, no se ha identificado ningún intercambiador de sodio-calcio que desencadene la activación leucocitaria que causa la lesión por reperfusión y/o inflamación.

La referencia de patente 1 revela una secuencia constituida por 603 aminoácidos como la de un intercambiador de sodio-calcio humano. La referencia no de patente 16 revela una secuencia del gen de intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio NCKX3 que codifica 644 aminoácidos y es más abundante en el cerebro, con niveles más elevados en el núcleo talámico, las neuronas CAI del hipocampo y la capa IV de la corteza cerebral. La referencia de patente 2 revela una secuencia de una proteína de diagnóstico humana constituida por 480 aminoácidos. La referencia de patente 3 revela secuencias de proteínas secretoras humanas constituidas por 235 y 169 aminoácidos.

La referencia no de patente 17 se dirige a la secuencia codificante completa del ARNm del intercambiador de Na/Ca dependiente del K de Homo sapiens NCKX4 (SLC24A4).

(Referencia no de patente 1):

"Circulation", (EE.UU.), 1990, 82, p. 723-738.

(Referencia no de patente 2):

"Annual Review of Physiology", (EE.UU.), 1992, 54, p. 243-256.

(Referencia no de patente 3):

"Kokyu To Junkan", 2001, 49(1), p. 5-11.

(Referencia no de patente 4):

"CLINICAL NEUROSCIENCE", (EE.UU.), 1999, 17(5), p. 567-569.

(Referencia no de patente 5):

"Kokyu To Junkan", 2001, 49(1), p. 13-20

(Referencia no de patente 6):

"Circulation", (EE.UU.), 1993, 88, p. 649-658.

(Referencia no de patente 7):

"American Journal of Pathology", (EE.UU.), 1993, 143, p. 410-418.

(Referencia no de patente 8):

"Cell Adhesion & Communication", (Suiza), 1993, 1, p. 21-32.

(Referencia no de patente 9):

Yasuo Morishita et al., "Zoki no Kyoketsu-saikanryu-shogai - Kiso to Rinsyo" ("Reperfusion Injury"), SHINDAN-TO-CHIRYOSHA, 2002, p. 1-225.

(Referencia no de patente 10):

"Circulation Research", (EE.UU.), 1999, 85, p. 723-730.

(Referencia no de patente 11):

"Journal of Cardiovascular Pharmacology", (EE.UU.), 2001, 37, p. 668-677.

(Referencia no de patente 12):

"Tanpakushitsu Kakusan Koso", 1998, 43(12), p. 1555-1560.

(Referencia no de patente 13):

"Journal of Biological Chemistry", (EE.UU.), 1993, 268, P. 6874-6877.

(Referencia no de patente 14):

"Biochemical & Biophysical Research Communications" J, (EE.UU.), 1981, 103, p. 227-232.

(Referencia no de patente 15):

"British Journal of Pharmacology", (Reino Unido), 1998, 124, p. 627-638.

(Referencia no de patente 16):

"Journal of Biological Chemistry", (EE.UU.), 2001, 276, p. 23161.

(Referencia no de patente 17):

BASE DE DATOS EMBL del 8 de julio de 2002 (08-07-2002). Secuencia codificante completa del "ARNm del intercambiador de Na/Ca dependiente del K NCKX4 (SLC24A4) de Homo Sapiens; CD completos; cortada y empalmada alternativamente". N.º de acceso de la base de datos AF520704.

(Referencia de patente 1):

WO 02/26980

(Referencia de patente 2):

WO 01/75067

(Referencia de patente 3):

WO 00/43495

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Revelación de la invención

Según lo descrito en el apartado de "Antecedentes de la técnica" con respecto a la activación leucocitaria, la reperfusión postisquémica y la inflamación tienen aspectos comunes, tales como un aumento del pH intracelular en los leucocitos y la activación del intercambiador de sodio-hidrógeno mediante el mismo, así como un aumento de la concentración del calcio intracelular mediante lo anterior. Se considera que el intercambiador de sodio-calcio de los leucocitos está implicado en la activación leucocitaria durante la lesión por reperfusión postisquémica y la inflamación. Es decir, se considera que una inhibición de la activación del intercambiador de sodio-calcio de los leucocitos suprime el aumento de la concentración de calcio intracelular de los leucocitos e inhibe la activación leucocitaria.

El objeto de la presente invención consiste en proporcionar un nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio en los leucocitos, y un nuevo polinucleótido codificante del polipéptido, y además en proporcionar un sistema de rastreo conveniente para obtener una sustancia útil como agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica o una enfermedad inflamatoria, del que se consigue el efecto terapéutico inhibiendo una activación de los leucocitos.

Los presentes inventores llevaron a cabo intensos estudios y, como resultado, obtuvieron polinucleótidos codificantes de intercambiadores de sodio-calcio dependientes del potasio constituidos por secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, y expresados abundantemente en los leucocitos; prepararon células que expresaban cada polipéptido; y proporcionaron herramientas de rastreo para obtener una sustancia útil como inhibidor de los intercambiadores de sodio-calcio, es decir, un agente terapéutico para lesión por reperfusión postisquémica o una enfermedad inflamatoria. Además, los presentes inventores construyeron sistemas para detectar la actividad de intercambio de sodio-calcio usando las células que expresaban cada intercambiador de sodio-calcio; y proporcionaron un procedimiento para rastrear una sustancia útil como agente terapéutico para la lesión por reperfusión postisquémica y una enfermedad inflamatoria en base a la inhibición de la actividad anterior. Además, los presentes inventores obtuvieron inhibidores de los intercambiadores de sodio-calcio mediante el anterior procedimiento de rastreo; confirmaron que los inhibidores inhibían la migración de leucocitos polimorfonucleares periféricos humanos, es decir, la activación de leucocitos; y proporcionaron nuevos agentes terapéuticos para la lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria que contenían cada inhibidor de la activación leucocitaria; completándose así la presente invención.

La presente invención se refiere a:

[1] (1) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4;

[2] el polipéptido de [1], que es (a) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

[3] el polipéptido de [1] o [2], en el que la actividad de intercambio de sodio-calcio es una actividad de intercambio de sodio-calcio inversa;

[4] un polinucleótido codificante del polipéptido de [1] a [3];

[5] un vector de expresión que comprende el polinucleótido de [4];

[6] una célula transfectada con el vector de expresión de [5];

[7] un procedimiento para producir el polipéptido de [1] a [3], caracterizado por usar la célula de [6];

[8] un procedimiento para rastrear un inhibidor del polipéptido de [1] a [3], que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula que expresa el polipéptido con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si se inhibe o no la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido, y

(3)

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido;

[9] un procedimiento para rastrear un inhibidor de la activación leucocitaria que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula que expresa el polipéptido de [1] a [3] con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si se inhibe o no la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido, y

(3)

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido;

[10] un procedimiento para rastrear un agente terapéutico para la lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula que expresa el polipéptido de [1] a [3] con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si se inhibe o no la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido, y

(3)

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido;

[11] un procedimiento para fabricar una composición farmacéutica para tratar la lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula que expresa el polipéptido de [1] a [3] con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si se inhibe o no la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido, y

(3)

preparar un medicamento que contenga la sustancia;

[12] una composición farmacéutica para inhibir la activación leucocitaria que comprende como ingrediente activo una sustancia obtenible mediante el procedimiento de [8];

[13] una composición farmacéutica para tratar una lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria que comprende como ingrediente activo una sustancia obtenible mediante el procedimiento de [8];

\newpage

[14] un procedimiento para inhibir la activación leucocitaria que comprende las etapas de:

administrar a un sujeto una sustancia obtenible mediante el procedimiento de [8];

[15] un procedimiento para tratar una lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria que comprende las etapas de:

administrar a un sujeto una sustancia obtenible mediante el procedimiento de [8];

[16] uso de una sustancia obtenible mediante el procedimiento de [8], en la fabricación de una composición farmacéutica para inhibir la actividad leucocitaria; y

[17] uso de una sustancia obtenible mediante el procedimiento de [8], en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria.

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La presente invención incluye el uso de la célula que expresa el polipéptido de [1] a [3] en el rastreo de un inhibidor de la activación leucocitaria o de un agente terapéutico para la lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria.

El término "agente terapéutico para una lesión por reperfusión postisquémica" o "composición farmacéutica para tratar una lesión por reperfusión postisquémica", como se usa en la presente memoria, incluye tanto un agente o una composición farmacéutica usados para tratar a un paciente que padece una lesión por reperfusión postisquémica como aquéllos usados con carácter preventivo para un sujeto que tenga el riesgo de padecer una lesión por reperfusión postisquémica. El término "agente terapéutico para una enfermedad inflamatoria" o "composición farmacéutica para tratar una enfermedad inflamatoria", como se usa en la presente memoria, incluye tanto un agente o una composición farmacéutica usados para tratar a un paciente que padece una enfermedad inflamatoria como aquéllos usados con carácter preventivo para un sujeto que tenga el riesgo de padecer una enfermedad inflamatoria.

El documento WO 02/26980 revela una secuencia de aminoácidos idéntica a la constituida por 603 aminoácidos de SEQ ID NO:4 de la presente solicitud, pero no revela que se obtuviera realmente un polipéptido constituido por la anterior secuencia de aminoácidos o un polipéptido codificante del polipéptido, ni tampoco revela un procedimiento específico para obtener el mismo. Por lo tanto, el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y el polinucleótido codificante del polipéptido fueron proporcionados por primera vez por los presentes inventores.

Además, el documento WO 01/75067 revela una proteína de diagnóstico humana (480 aminoácidos) en la que la secuencia de aminoácidos constituida por el tramo del aminoácido 35 al 480 de la misma tiene una homología del 82% con aquélla constituida por el tramo del aminoácido 257 al 622 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la presente solicitud, y tiene una homología del 77% con aquélla constituida por el tramo del aminoácido 257 al 603 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud. El documento WO 00/43495 revela una proteína secretora humana (235 aminoácidos) y una proteína secretora humana (169 aminoácidos) en las que las secuencias de aminoácidos constituidas por los tramos del aminoácido 33 al 235 y del 1 al 169 tienen una homología del 86% y del 97% con aquéllas constituidas por los tramos del aminoácido del 400 al 603 y del 435 al 603 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud, respectivamente. J. Biol. Chem., 276, 23161, 2001 revela NCKX3 (644 aminoácidos) en la que la secuencia de aminoácidos constituida por el tramo del aminoácido 17 al 641 de la misma tiene una homología del 58% con aquélla constituida por el tramo del aminoácido del 13 al 618 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de la presente solicitud y tiene una homología del 58% con aquélla constituida por el tramo del aminoácido del 13 al 599 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 de la presente solicitud. Sin embargo, para obtener un polipéptido útil en el rastreo de un agente terapéutico de la lesión celular debida a la reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria, no hay referencias que sugieran una obtención del polipéptido de la presente invención. Además, el polipéptido de la presente invención tiene un efecto ventajoso que no se puede esperar de los anteriores polipéptidos conocidos, es decir, una utilidad como herramienta de rastreo para obtener un inhibidor de la activación leucocitaria (particularmente, un agente terapéutico para la lesión celular debida a la reperfusión postisquémica y/o una enfermedad
inflamatoria).

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Mejor modo de llevar a cabo la invención

De aquí en adelante, se explicará la presente invención detalladamente.

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1. Polipéptido, polinucleótido, vector de expresión y célula de la presente invención

El polipéptido de la presente invención y/o usado en la presente invención incluye:

(1)

un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4; y

(2)

un polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados, y/o añadidos a una o más partes de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ó 4, y que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio (preferiblemente, un actividad de intercambio de sodio-calcio inversa) (denominada de aquí en adelante variación funcionalmente equivalente). Se prefiere como polipéptido de la presente invención y/o como el usado en la presente invención, el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4.

El término "que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio", como se usa en la presente memoria, significa que presenta una reacción de intercambio en la que el sodio intracelular es extrudido hacia fuera de la célula y el calcio extracelular fluye hacia el interior de la célula (sentido inverso), o que presenta una reacción de intercambio en la que el calcio intracelular es extrudido hacia fuera de la célula y el sodio extracelular fluye hacia el interior de la célula (sentido directo). Además, el término "que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio inversa", como se usa en la presente memoria, significa que presenta una reacción de intercambio en la que el sodio intracelular es extrudido hacia fuera de la célula y el calcio extracelular fluye hacia el interior de la célula (intercambio de
Na^{+} _{i}-Ca^{2+}_{o}; sentido inverso). El término "que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio directa", como se usa en la presente memoria, significa que presenta una reacción de intercambio en la que el calcio intracelular es extrudido hacia fuera de la célula y el sodio extracelular fluye hacia el interior de la célula (intercambio de
Na^{+} _{o}-Ca^{2+}_{i}; sentido directo).

El hecho de si un polipéptido (denominado de aquí en adelante polipéptido de análisis) "presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio" se puede confirmar mediante un procedimiento conocido por aquellos expertos en la técnica (Iwamoto T. et al., J. Biol. Chem., 271, 22391-22397; 19962). El procedimiento de confirmación no se especifica particularmente, pudiéndose usar, por ejemplo, el siguiente procedimiento.

Se transfectan células con un vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante del polipéptido de análisis. En el caso de confirmar la actividad de intercambio de sodio-calcio inversa, se puede usar preferiblemente un procedimiento descrito en el ejemplo 4. Más concretamente, se tratan las células resultantes con un ionóforo (tal como monensina) contra un catión univalente para incorporar el sodio en las células; se cambia la solución extracelular a una solución que contiene ^{45}Ca, para intercambiar el sodio intracelular por el calcio extracelular; y se mide una radiactividad del ^{45}Ca intracelular. En el caso de confirmar la actividad de intercambio de sodio-calcio directa, se cultivan las células resultantes en un medio que contiene cloruro de calcio (cloruro de ^{45}Ca) para incorporar los iones de calcio a las células; se lavan las células con una solución de lavado para eliminar los iones de calcio no incorporados; se cambia la solución extracelular por una solución extracelular para medir el contenido de iones de sodio; y se mide una radiactividad de ^{45}Ca contenida en la solución. Cuando se detecta la radiactividad, se puede confirmar que el polipéptido de análisis "muestra una actividad de intercambio de sodio-calcio".

Como polipéptido de la presente invención, se prefiere un polipéptido en el que se detecte una radiactividad de dos o más veces mayor que la obtenida en el caso de una solución extracelular que contiene 150 mmoles/l de NaCl cuando se usa el procedimiento del ejemplo 4.

Es posible confirmar si la actividad de intercambio de sodio-calcio del compuesto de análisis es "dependiente del potasio" mediante un procedimiento conocido por aquéllos expertos en la técnica (Kimura, M., J. Biol. Chem., 268, p. 6874-6877, 1993; Kraev A. et al., J. Biol. Chem., 276, 23161-23172, 2001). El procedimiento de confirmación no se especifica particularmente, pudiéndose usar, por ejemplo, el siguiente procedimiento (preferiblemente, un procedimiento descrito en el ejemplo 4). Más concretamente, se transfectan células con un vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante del polipéptido de análisis. Al medir la actividad de intercambio de sodio-calcio de las células resultantes, se varía una concentración de K^{+} en la solución extracelular, y se mide una radiactividad del ^{45}Ca intracelular en cada concentración de K^{+}. Cuando se detecta una actividad de intercambio de sodio-calcio mayor en presencia de K^{+}, se puede confirmar que la actividad de intercambio de sodio-calcio del compuesto de análisis es "dependiente del potasio".

Como polipéptido de la presente invención, se prefiere un polipéptido en el que se detecte una radiactividad de cinco o más veces mayor que la obtenida en el caso de la solución extracelular A descrita en el ejemplo 4 cuando se usa la solución extracelular C o D descritas en el ejemplo 4.

Los polipéptidos constituidos por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 4, que están incluidos en el polipéptido de la presente invención o el usado en la presente invención, son intercambiadores humanos de sodio-calcio dependientes del potasio constituidos por 622 y 603 residuos de aminoácido, respectivamente. Cada polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 ó 4 se expresa en leucocitos periféricos, como se muestra en el ejemplo 2.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención no está particularmente especificada, siempre y cuando sea un polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos, preferiblemente, de 1 a 3 aminoácidos en total estén sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias posiciones (por ejemplo, de 1 a 3 posiciones) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4, y presente una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio. Además, el origen de la variación funcionalmente equivalente no se limita a un ser humano.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención incluye, por ejemplo, no sólo variaciones humanas del polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 4, sino además variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos a un ser humano (tales como un ratón, un hámster o un perro). Además, incluye polipéptidos preparados usando polinucleótidos obtenidos mediante la modificación artificial de sus secuencias de aminoácidos codificadas por el mismo mediante técnicas de ingeniería genética, en base a los polinucleótidos codificantes de estos polipéptidos nativos (i.e., variaciones humanas o variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos al ser humano), o en base a polinucleótidos codificantes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. El término "variación", como se usa en la presente memoria, significa una diferencia individual entre los mismos polipéptidos de la misma especie o una diferencia entre polipéptidos homólogos de varias especies.

La variación funcionalmente equivalente derivada de un ser humano o de organismos distintos a un ser humano se puede obtener por aquéllos expertos en la técnica según la información de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 ó 3 (por ejemplo, la secuencia constituida por el tramo de la base 14 a la base 1882 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1, o la secuencia constituida por el tramo de la base 14 a la base 1825 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3). Por ejemplo, se diseña una sonda apropiada o cebadores apropiados según la información de la secuencia de bases. Se lleva a cabo un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. k., et al., Science, 239, 487-491, 1988) o un procedimiento de hibridación usando una muestra (por ejemplo, ARN total o una fracción de ARNm, una genoteca de ADNc o una genoteca de fagos) preparada a partir de un organismo (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, un ratón, un hámster o un perro) de interés y los cebadores o la sonda para obtener un polinucleótido codificante del polipéptido. Se puede obtener un polipéptido deseado expresando el polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado, y luego, por ejemplo, confirmando que el polipéptido expresado presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio mediante un procedimiento descrito en el ejemplo 4, y además confirmando que la actividad es dependiente de un ión de potasio mediante un procedimiento descrito en el ejemplo 4. A este respecto, se pueden desarrollar técnicas de ingeniería genética según procedimientos conocidos (por ejemplo, Maniatis T. et al., "Molecular Cloning- A laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982), a no ser que se especifique otra cosa.

Además, es posible obtener el polipéptido modificado artificialmente anterior usando un polinucleótido modificado artificialmente mediante técnicas de ingeniería genética mediante, por ejemplo, el siguiente procedimiento. Con un procedimiento convencional tal como una mutagénesis específica del sitio (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81, 5662-5666, 1984), se puede obtener un polinucleótido codificante del polipéptido. Es posible obtener un polipéptido deseado expresando el polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado y luego, por ejemplo, confirmando que el polipéptido expresado presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio mediante un procedimiento descrito en el ejemplo 4, y confirmando además que la actividad es dependiente de un ión de potasio mediante un procedimiento descrito en el ejemplo 4.

El polinucleótido de la presente invención no está particularmente especificado, siempre y cuando codifique el polipéptido de la presente invención. Como polinucleótido de la presente invención o usado en la presente invención, cabe mencionar, por ejemplo, un polinucleótido que tiene la secuencia constituida por el tramo de la base 14 a la base 1882 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1, o la secuencia constituida por el tramo de la base 14 a la base 1825 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3. En cuanto a esto, el término "polinucleótido", como se usa en la presente memoria, incluye tanto ADN como ARN.

No se especifica particularmente ningún procedimiento para producir el polinucleótido de la presente invención, pero cabe mencionar, por ejemplo, (1) un procedimiento que use la PCR, (2) un procedimiento que use técnicas convencionales de ingeniería genética (i.e., un procedimiento para seleccionar un transformante que comprenda un ADNc deseado de cepas transformadas con una genoteca de ADNc) o (3) un procedimiento de síntesis química, según lo descrito en el documento WO 02/052000. Estos procedimientos se explicarán por este orden en lo que sigue.

En el procedimiento que usa la PCR, se puede producir el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se extrae ARNm de células humanas o de tejido humano capaz de producir el polipéptido de la presente invención. Se sintetiza un par de cebadores, entre los que se localiza ARNm de longitud completa correspondiente al polipéptido de la presente invención o una región parcial del ARNm en base a la secuencia de bases de un polinucleótido codificante del polipéptido de la presente invención. El ADNc de longitud completa codificante del polipéptido de la presente invención o una parte del ADNc se puede obtener realizando una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), usando ARNm extraído como molde. Además, se puede obtener un fragmento de ADN deseado digiriendo el ADN obtenido con una enzima de restricción o similar y realizando la unión, si se desea.

En el procedimiento que usa técnicas de ingeniería genética convencionales, se puede producir el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Primero, se sintetiza ADNc monocatenario usando transcriptasa inversa de ARNm preparado mediante el procedimiento de PCR anteriormente mencionado como molde, y luego se sintetiza ADNc bicatenario procedente del ADNc monocatenario.

A continuación, se prepara un plásmido recombinante que comprende el ADNc bicatenario y se introduce en una cepa de Escherichia coli, tal como DH 5\alpha, mediante lo cual se transforma la cepa. Se selecciona un transformante usando una resistencia farmacológica frente a, por ejemplo, tetraciclina o ampicilina como marcador. Como procedimiento para seleccionar un transformante que contiene el ADNc de interés de entre los transformantes resultantes, se pueden usar diversos procedimientos, tales como un procedimiento para rastrear un transformante usando una sonda de oligonucleótido sintética o un procedimiento para rastrear un transformante usando una sonda producida por PCR.

Se puede llevar a cabo un procedimiento para recoger el polinucleótido de la presente invención a partir del transformante resultante de interés según un procedimiento conocido (por ejemplo, Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982). Por ejemplo, se puede llevar a cabo separando una fracción correspondiente al ADN plasmídico de células y cortando la región de ADNc del ADN plasmídico.

En el procedimiento de síntesis química, se puede producir el polinucleótido de la presente invención, mediante, por ejemplo la unión de fragmentos de ADN producidos mediante un procedimiento de síntesis química. Cada fragmento de ADN se puede sintetizar usando un sintetizador de ADN [por ejemplo, Sintetizador de ADN Oligo 1000M (Beckman) o Sintetizador de ADN/ARN 394 (Applied Biosystems)].

A este respecto, se conocen codones de cada aminoácido, y se pueden seleccionar opcionalmente y determinar mediante el procedimiento convencional, por ejemplo, teniendo en consideración el uso de un codón de cada huésped por ser usado (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Además, se puede llevar a cabo una modificación parcial de los codones de estas secuencias de bases según un procedimiento convencional, tal como la mutagénesis específica de sitio usando un cebador que comprenda un oligonucleótido sintético codificante de una modificación deseada (Mark, D. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 81, 5662-5666, 1984).

La determinación de las secuencias de ADN obtenidas mediante los procedimientos anteriormente mencionados se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, un procedimiento de terminación de cadenas de didesoxinucleótidos (Messing, J. y Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982). Por ejemplo, se incorporan didesoxinucleótidos marcados con fluorescente en un fragmento de ADN mediante un procedimiento de PCR, usando una solución de reacción que contiene didesoxinucleótidos marcados con fluorescente. Se somete a electroforesis el fragmento de ADN amplificado en un secuenciador (por ejemplo, secuenciador 3700DNA; PE Biosystems) y se puede determinar la secuencia de bases del mismo mediante la detección de la fluorescencia.

Se vuelve a integrar el polinucleótido aislado de la presente invención en un ADN de vector apropiado y se puede transformar una célula huésped (incluyendo una célula huésped eucariota y una célula huésped procariota) mediante el vector de expresión resultante. Además, es posible expresar el polinucleótido en una célula huésped deseada introduciendo un promotor apropiado y una secuencia relacionada con la expresión génica en el vector.

El vector de expresión de la presente invención no está particularmente especificado, siempre y cuando comprenda el polinucleótido de la presente invención. Como vector de expresión, cabe mencionar, por ejemplo, un vector de expresión obtenido mediante la introducción del polinucleótido de la invención en un vector de expresión conocido seleccionado apropiadamente según una célula huésped por usar.

La célula de la presente invención no está particularmente especificada, siempre y cuando esté transfectada con el vector de expresión de la presente invención y comprenda el polinucleótido de la presente invención. La célula de la presente invención puede ser, por ejemplo, una célula en la que esté integrado el poinucleótido en un cromosoma de una célula huésped o una célula que contenga el polinucleótido como vector de expresión que comprenda el polinucleótido. Además, la célula de la presente invención puede ser una célula que exprese el polipéptido de la presente invención, o una célula que no exprese el polipéptido de la presente invención. La célula de la presente invención se puede obtener, mediante, por ejemplo, la transfección de una célula huésped deseada con el vector de expresión de la presente invención.

En las células huésped eucariotas, se incluyen, por ejemplo, células de vertebrados, insectos y levaduras. Como célula de vertebrado, caben mencionar, por ejemplo, célula COS de simio (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), una cepa defectuosa en dihidrofolato reductasa de una célula de ovario de hámster chino (célula CHO-dhfr^{-}) (Urlaub, G. y Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77, 4216-4220, 1980), un fibroblasto de pulmón de hámster chino (célula Dede, ATCC: CCL-39) usada en el ejemplo 4, una célula HEK293 derivada de riñón fetal humano (ATCC: CRL-1573) usada en el ejemplo 4, una célula 293-EBNA (Invitrogen) obtenida mediante la introducción de un gen EBNA-1 del Virus de Epstein Barr en célula HEK293 o célula L929 (ATCC: CRL-2148).

Como vector de expresión de una célula de vertebrado, se pueden usar en general un vector que contenga un promotor localizado secuencia arriba del gen por ser expresado, un sitio de corte y empalme de ARN, un sitio de poliadenilación, una secuencia de terminación de la transcripción y similares. El vector puede contener además un origen de replicación, si fuera necesario. Como vector de expresión, cabe mencionar, por ejemplo, pSV2dhfr que contiene un promotor temprano de SV40 (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS que contiene un promotor de factor de alargamiento humano (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), pCEP4 que contiene un promotor de citomegalovirus (Invitrogen), pIRESneo2 (CLONTECH) o pcDNA3.1 (Invitrogen).

Cuando se usa la célula COS como célula huésped, se puede usar como vector de expresión un vector que tenga un origen de replicación de SV40, que pueda realizar una replicación autónoma en la célula COS y que tenga un promotor de la transcripción, una señal de terminación de la transcripción, y un sitio de corte y empalme de ARN. Como vector, cabe mencionar, por ejemplo, pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) o pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987).

Es posible incorporar el vector de expresión en las células COS mediante, por ejemplo, un procedimiento con DEAE-dextrano (Luthman, H. y Magnusson, G., Nucleic Acids. Res., 11, 1295-1308, 1983), un procedimiento de co-precipitación de ADN con fosfato de calcio (Graham, F. L. y van der ED. A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), un procedimiento que usa un reactivo de transfección disponible comercialmente (por ejemplo, el reactivo de transfección FuGENE^{TM}6; Roche Diagnostics) o un procedimiento de electroporación (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982).

Cuando se usa la célula CHO como célula huésped, se puede obtener un transformante capaz de producir establemente el polipéptido de la presente invención llevando a cabo una co-transfección de un vector de expresión que comprenda el polinucleótido de la presente invención, junto con un vector capaz de expresar un gen neo que funcione como un marcador de la resistencia a G418, tal como pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) o pSV2-neo (Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982) y seleccionar una colonia resistente a G418.

Cuando se usa una célula 293-EBNA como célula huésped, se puede usar como vector de expresión, por ejemplo, pCEP4 (Invitrogen) que contenga un origen de replicación del Virus de Epstein Barr y sea capaz de realizar una replicación autónoma en la célula 293-EBNA.

La célula de la presente invención se puede cultivar según el procedimiento convencional, y el polipéptido de la presente invención se produce en la superficie de la célula. Como medio por usar en el cultivo, se puede seleccionar apropiadamente un medio comúnmente usado en una célula huésped deseada. En el caso de la célula COS o la célula Dede, por ejemplo, se puede usar un medio tal como un medio RPMI-1640 o un medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), complementándolo con un componente sérico tal como suero bovino fetal (SBF) si fuera necesario. En el caso de la célula 293-EBNA, se puede usar un medio tal como un medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con un componente sérico tal como suero bovino fetal (SBF) y G418.

El polipéptido de la persote invención producido en la superficie celular cultivando la célula de la presente invención se puede separar y purificar de la misma mediante diversas técnicas de separación conocidas, haciendo uso de propiedades físicas, propiedades químicas y similares del polipéptido. Más concretamente, se puede obtener una fracción de membrana celular que contenga el polipéptido de la presente invención cultivando células que expresen el polipéptido de la presente invención, suspendiéndolas en un tampón, homogeneizándolas y centrifugando el producto homogéneo resultante. Una vez disuelta la membrana celular obtenida, se puede purificar el polipéptido de la presente invención mediante un tratamiento comúnmente usado, por ejemplo, un tratamiento con un precipitante proteínico, una ultra-filtración, diversas técnicas de cromatografía en fase líquida tales como una cromatografía sobre tamiz molecular (filtración sobre gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía en fase líquida de alta resolución (CLAR) o diálisis, o una combinación de las mismas.

2. Rastreo de los agentes terapéuticos para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y a una enfermedad inflamatoria

Se puede rastrear una sustancia que inhiba el polipéptido de la presente invención usando la célula que expresa el polipéptido de la presente invención para que presente la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio.

Según lo descrito en el apartado de Antecedentes de la técnica, se sabe que la sobrecarga de calcio intracelular debida a una reperfusión desempeña un importante papel en la generación de una lesión por reperfusión y que el intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio está implicado en el influjo de calcio hacia el interior de la célula acompañado por la extrusión del sodio intracelular (sentido inverso). Además, se sabe que el intercambiador de sodio-calcio extrude el sodio intracelular hacia fuera de la célula e incorpora calcio en la célula durante la reperfusión postisquémica, para devolver la sobrecarga de sodio intracelular causada por la reperfusión a su estado original. Además, se sabe que se aumentó una expresión de factores adhesivos en leucocitos mediante el aumento de la concentración del calcio intracelular, y que los anticuerpos monoclonales contra los factores adhesivos suprimieron la acumulación de leucocitos y redujeron la superficie de la infracción. De este modo, se considera que una inhibición de una sobrecarga del calcio intracelular en leucocitos suprime la acumulación de leucocitos y la activación de los leucocitos por parte de los factores adhesivos debido a la sobrecarga, y tiene una actividad de evitar la lesión celular causada por el fenómeno de no reflujo.

El polipéptido de la presente invención que está constituido por la secuencia de SEQ ID NO: 2 ó 4 es un intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio que se expresa abundantemente en los leucocitos periféricos. Por lo tanto, se considera que un agente que inhiba o suprima el intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio (sentido inverso) en el polipéptido de la presente invención suprime el influjo de calcio hacia el interior de la célula e inhibe la activación o la adhesión leucocitaria, y que por tanto es útil en el tratamiento de una lesión celular debida a una reperfusión postisquémica.

Además, con respecto a la activación leucocitaria, la reperfusión postisquémica y la inflamación tienen aspectos comunes, tales como un aumento del pH intracelular en leucocitos y la activación del intercambiador de sodio-hidrógeno mediante el mismo, así como un aumento de la concentración del calcio intracelular mediante lo anterior y, por tanto, se considera que el intercambiador de sodio-calcio de los leucocitos está implicado en una activación leucocitaria durante la lesión por reperfusión postisquémica y la inflación. Es decir, se considera que una inhibición de la activación del intercambiador de sodio-calcio en los leucocitos suprime el aumento de la concentración de calcio intracelular en los leucocitos e inhibe la activación leucocitaria.

Por lo tanto, se puede usar la célula de la presente invención per se como herramienta de rastreo para un inhibidor del polipéptido de la presente invención y un inhibidor de la activación leucocitaria (particularmente, un agente terapéutico para la lesión celular debida a la reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria).

El término "que inhibe o suprime el polipéptido de la presente invención" significa que inhibe o suprime la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio, incluyendo el caso de inhibición o supresión de la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio mediante la inhibición o supresión de la expresión del polipéptido.

El procedimiento para rastrear un inhibidor del polipéptido de la presente invención y un inhibidor de la activación leucocitaria (particularmente, un agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria) comprende las etapas de:

-

poner en contacto la célula de la presente invención con una sustancia por ser analizada,

-

analizar si la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio está o no está inhibida en el polipéptido, y

-

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido.

Las sustancias por ser analizadas que pueden ser aplicadas en el procedimiento de rastreo de la presente invención no están particularmente especificadas, pero cabe mencionar, por ejemplo, diversos compuestos conocidos (incluyendo péptidos) registrados en archivos químicos, compuestos obtenidos mediante técnicas de Química Combinatoria (Terrett, N. K., et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) o péptidos aleatorios preparados mediante el empleo de un procedimiento de visualización de fagos (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) y similares. Además, se pueden usar sobrenadantes tisulares de microorganismos, componentes naturales derivados de plantas u organismos marinos o extractos de tejidos animales como sustancias de análisis para el rastreo. Además, se pueden usar compuestos (incluyendo péptidos) obtenidos mediante la modificación química o biológica de compuestos (incluyendo péptidos) seleccionados mediante el procedimiento de rastreo de la presente invención.

El procedimiento de rastreo de la presente invención no está particularmente especificado, siempre y cuando comprenda las etapas de:

(1) poner en contacto una célula que exprese el polipéptido de la presente invención para que funcione como el intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio (i.e., incluyendo una célula que fue transfectada con un vector de expresión que comprendía un polinucleótido codificante del polipéptido de la presente invención y que expresa el polipéptido para que funcione como un intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio, y una célula natural que exprese el polipéptido de la presente invención para que funcione como un intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio) con una sustancia por ser analizada,

(2) analizar si está inhibida o no la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido y

(3) seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido. Cabe mencionar, en base a las diferencias en los procedimientos usados para analizar la inhibición del polipéptido de la presente invención, por ejemplo:

[1]

un procedimiento de rastreo que utiliza la absorción de iones de radioisótopo ^{45}Ca^{2+} o

[2]

un procedimiento de rastreo que utiliza un tinte sensible al calcio. Entre estos procedimientos, se prefiere el procedimiento de rastreo que utiliza la absorción iones de radioisótopo ^{45}Ca^{2+}. Como célula usada en el rastreo, es preferible la célula de la presente invención preparada mediante su transfección con un vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante del polipéptido de la presente invención.

Según el procedimiento anterior [1], es posible rastrear una sustancia que inhiba el polipéptido de la presente invención y sea útil en el tratamiento de la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria mediante, por ejemplo, el siguiente procedimiento. Se incorpora sodio en las células que expresan el polipéptido de la presente invención en la superficie celular usando un ionóforo (tal como monensina) frente a un catión univalente; se cambia la solución extracelular a una solución extracelular que contiene iones de radioisótopo ^{45}Ca^{2+} con o sin un compuesto de prueba; y se mide una radiactividad del ^{45}Ca^{2+} intracelular. Luego, se analiza si el polipéptido de la presente invención está inhibido o no en base a la diferencia en las cantidades de radiactividad incorporadas en las células en presencia o en ausencia de la sustancia de análisis. Es decir, el procedimiento de rastreo [1] de la presente invención comprende las etapas de:

Incorporar iones de radioisótopo ^{45}Ca^{2+} en la célula que expresa el polipéptido de la presente invención en la superficie celular y, simultáneamente, poner en contacto la célula con una sustancia por ser analizada y detectar una cantidad de radiactividad incorporada en la célula.

Por ejemplo, se tratan las células que expresan el polipéptido de la presente invención con una solución extracelular que contiene un compuesto de análisis y monensina para incorporar sodio a las células. Se cambia la solución extracelular a una solución extracelular que contiene el compuesto de análisis y ^{45}Ca^{2+} para incorporar ^{45}Ca^{2+} a las células mediante la actividad de intercambio de sodio-calcio. Se lavan las células con una solución que contiene lantano, un inhibidor de la actividad de intercambio de sodio-calcio para eliminar el ^{45}Ca^{2+} no incorporado. Cuando se inhibe la actividad de intercambio de sodio-calcio inversa, se disminuye una cantidad de influjo de ^{45}Ca^{2+} hacia el interior de las células y, por tanto, se puede analizar si el polipéptido de la presente invención está inhibido o no en base a la radiactividad en las células como un indicador de la actividad de intercambio de sodio-calcio. Más concretamente, es preferible detectar la actividad de intercambio de sodio-calcio inversa mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Se puede rastrear un inhibidor del polipéptido de la presente invención analizando un cambio de la radiactividad incorporada en las células mediante la adición de la sustancia de análisis.

Cuando se rastrea una sustancia que inhibe el polipéptido de la presente invención y es útil en el tratamiento de una lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria, mediante el procedimiento [2] anterior, por ejemplo, se incorpora un tinte sensible al calcio en las células que expresan el polipéptido de la presente invención en la superficie celular, y se analiza si el polipéptido de la presente invención está inhibido o no en base al cambio de una intensidad de fluorescencia del mismo en las células en presencia o en ausencia del compuesto de análisis. Es decir, en el procedimiento de rastreo [2] de la presente invención, se tratan las células que expresan el polipéptido de la presente invención en la superficie celular con una solución extracelular que contiene un ionóforo (tal como monensina) contra un catión univalente, para incorporar sodio a las células. Se cambia la solución extracelular a una solución extracelular que contiene un compuesto de análisis y un tinte sensible al calcio para incorporar el tinte sensible al calcio a las células mediante la actividad de intercambio de sodio-calcio. Se lavan las células con una solución que contiene un inhibidor de la actividad de intercambio de sodio-calcio tal como lantano, para eliminar el tinte sensible a calcio no incorporado. Cuando se inhibe la actividad de intercambio de sodio-calcio inversa, disminuye la intensidad de fluorescencia del tinte sensible al calcio en las células y así se puede analizar si el polipéptido de la presente invención está o no está inhibido, en base a la intensidad de fluorescencia de las células como un indicador de la actividad de intercambio de sodio-calcio inversa. Se puede rastrear un inhibidor del polipéptido de la presente invención detectando la intensidad de fluorescencia del tinte sensible al calcio en presencia del compuesto de análisis. El procedimiento de rastreo comprende las etapas de:

Incorporar un tinte sensible al calcio a la célula y luego poner en contacto la célula con una sustancia por ser analizada, y

detectar la intensidad de fluorescencia del tinte sensible al calcio en la célula, Este rastreo utiliza la característica de que los tintes sensibles al calcio pueden detectar ópticamente el influjo de calcio acompañado por una activación en modo inverso del intercambiador de sodio-calcio.

Más concretamente, es posible detectar la actividad del polipéptido de la presente invención usando, por ejemplo, Fura-2 o un derivado del mismo como tinte sensible al calcio. Se puede rastrear un inhibidor del polipéptido de la presente invención comparando un cambio de la intensidad de fluorescencia del tinte en presencia o en ausencia de la sustancia de análisis. Cuando se inhibe la actividad de intercambio de sodio-calcio inversa, disminuye la intensidad de fluorescencia.

Tal y como se describe anteriormente, según el procedimiento de rastreo de la presente invención, se puede rastrear una sustancia (particularmente, un compuesto) que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio del polipéptido de la presente invención, i.e., una sustancia (particularmente un compuesto) que tiene una actividad inhibidora. Un compuesto que tiene una actividad inhibidora por ser seleccionado en el procedimiento de rastreo de la presente invención se puede definir como un compuesto que inhibe una actividad del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. Como el compuesto, se prefiere un compuesto que tenga una CI_{50} de 100 \mumoles/l o menor. Por ejemplo, cuando se hace reaccionar un compuesto de análisis durante un período predeterminado en condiciones descritas en el ejemplo 6, se puede seleccionar un compuesto que tenga una CI_{50} de 100 \mumoles/l o menor como sustancia que tiene una actividad inhibidora. Usando un compuesto inhibidor aislado mediante el rastreo como componente principal, se puede obtener un medicamento que se dirige al nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. Por ejemplo, la CI_{50} del metanosulfonato de 2-[2-[4-(4-nitrobenciloxi)fenil]etil]isotiourea (denominado de aquí en adelante compuesto A) seleccionado en el ejemplo 6 fue de 15,8 \mumoles/l y de 35,0 \mumoles/l, con respecto al nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4, respectivamente. Además, la CI_{50} del 3'-4'-diclorobenzamilo (denominado de aquí en adelante compuesto B) fue de 20,2 \mumoles/l y de 58,9 \mumoles/l, con respecto a los nuevos intercambiadores de sodio-calcio dependientes del potasio constituidos por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente. A partir de los resultados, es evidente que se puede seleccionar un intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 mediante el procedimiento de rastreo de la presente invención.

3. Medicamento

El medicamento de la presente descripción que comprende, como ingrediente activo, un compuesto (preferiblemente, el compuesto A o B anterior) que modifica una actividad del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 se puede preparar usando vehículos, cargas u otros aditivos usados generalmente en la preparación de medicamentos conforme al ingrediente activo.

Los ejemplos de administración incluyen la administración oral mediante comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, gránulos finos, polvos, soluciones orales y similares, y la administración parenteral mediante inyecciones (p. ej., intravenosa, intramuscular o similares), supositorios, preparaciones transdérmicas, preparaciones de absorción transmucosal y similares. Particularmente, en el caso de péptidos que son digeridos en el estómago, se prefiere una administración parenteral tal como una inyección intravenosa o similar.

En la composición sólida para su uso en la administración oral, se pueden mezclar una o más sustancias activas con al menos un diluyente inerte tal como lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, pirrolidona polivinílica o silicato de aluminio y magnesio. En el modo habitual, la composición puede contener aditivos distintos del diluyente inerte tales como un lubricante, un agente desintegrante, un agente estabilizante o un agente potenciador de la disolución o la solubilización. Si fuera necesario, se pueden revestir los comprimidos o las píldoras con una cubierta de azúcar o una película de una sustancia gástrica o entérica.

La composición líquida para una administración oral puede incluir, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires, y puede contener un diluyente inerte usado generalmente tal como agua purificada o alcohol etílico. La composición puede contener aditivos distintos al diluyente inerte, tales como agentes humectantes, agentes de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y antisépticos.

Las inyecciones para una administración parenteral pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas asépticas. Los ejemplos del diluyente para su uso en las soluciones y las suspensiones acuosas incluyen agua destilada para su uso en inyección y solución salina fisiológica. Los ejemplos del diluyente para su uso en las soluciones y las suspensiones no acuosas incluyen alcoholes (p.ej., etanol), glicoles, (p.ej., propilenglicol o polietilenglicol), polysorbate 80 (nombre comercial) y similares. Tal composición puede contener además un agente humectante, un agente emulsionante, un agente de dispersión, un agente estabilizante, un agente potenciador de la disolución o la solubilización, un antiséptico y similares. Estas composiciones pueden ser esterilizadas mediante, por ejemplo, la filtración a través de un filtro de retención de bacterias, la mezcla de un germicida o la irradiación. Alternativamente, antes de su uso, se pueden convertir primero en composiciones sólidas estériles y disolverlas en agua estéril u otro disolvente estéril para un uso en inyección.

La dosis se decide opcionalmente teniendo en consideración la fuerza de cada ingrediente activo seleccionado mediante el anterior procedimiento de rastreo o los síntomas, la edad, el sexo o similares de cada paciente al que se le vaya a administrar. Por ejemplo, en el caso de la administración oral, la dosis habitual para un adulto (60 kg de peso) es de aproximadamente 0,1 a 100 mg, preferiblemente, de 0,1 a 50 mg al día. En el caso de la administración parenteral, la dosis habitual es de aproximadamente 0,01 a 50 mg, preferiblemente, de 0,01 a 10 mg al día en forma de inyección.

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Ejemplos

A continuación, se ilustrará la presente invención en mayor profundidad, pero de ningún modo quedará restringida, mediante los siguientes ejemplos. Los procedimientos fueron realizados según los procedimientos conocidos (por ejemplo, Maniatis, T., et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982; y Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2ª Ed., Sinauer Associates Inc., MA, 1992), a no ser que se especifique lo contrario.

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Ejemplo 1

Aislamiento de los genes codificantes de los nuevos intercambiadores de sodio-calcio dependientes del potasio y construcción de vectores de expresión

Se obtuvo un ADNc de longitud completa codificante de cada nuevo intercambiador de sodio-calcio de la presente invención que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 mediante el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa con la transcriptasa inversa (RT-PCR) usando ADNc de cerebro humano (ADNc de Marathon-Ready; Clontech) como molde mediante el siguiente procedimiento.

Se llevó a cabo una PCR usando ADNc de cerebro humano (ADNc de Marathon-Ready; Clontech) como molde, un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de SEQ ID NO: 5 (que tiene la secuencia de reconocimiento de EcoRi añadida al terminal 5') como cebador directo, un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de SEQ ID NO: 6 (que tiene la secuencia de reconocimiento de KpnI añadida al terminal 5') como cebador inverso y una ADN polimerasa (Taq ADN polimerasa PLATINUM de alta fidelidad; GIBCO-BRL). En la PCR, se realizó primero una desnaturalización térmica a 95ºC durante 1 minuto y luego se repitió 40 veces un ciclo constituido por reacciones a 98ºC durante 10 segundos, a 60ºC durante 20 segundos y a 68ºC durante 3 minutos. Como resultado, se amplificaron dos bandas de ADN de aproximadamente 1,9 kpb. El fragmento de ADN más largo se denominó "622" y el más corto se denominó "603".

Se digirió cada fragmento de ADN con enzimas de restricción EcoRi y KpnI, y se clonaron en plásmido pcDNA3.1 (Invitrogen). Los clones resultantes fueron denominados pcDNA-622 y pcDNA-603. A este respecto, el plásmido pcDNA3.1 contiene una secuencia promotora de citomegalovirus y se puede usar para expresar un nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio en una célula animal.

Se analizaron las secuencias de bases de los clones pcDNA-622 y pcDNA-603 usando un secuenciador de ADN (secuenciador de ADN ABI377; Applied Biosystems) mediante un procedimiento con terminador didesoxi para obtener las secuencias de bases de SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente.

La secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 (pares de bases totales = 1.902 pb) contiene un marco de lectura abierto representado por la secuencia constituida por el tramo de la base 14 a la base 1.882. La secuencia de aminoácidos deducida del marco de lectura abierto y constituida por 622 residuos de aminoácido fue la de SEQ ID NO: 2.

La secuencia de bases de SEQ ID NO: 3 (pares de bases totales = 1.845 pb) contiene un marco de lectura abierto representado por la secuencia constituida por el tramo de la base 14 a la base 1825. La secuencia de aminoácidos deducida del marco de lectura abierto y constituida por 603 residuos de aminoácido fue la de SEQ ID NO: 4.

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Ejemplo 2

Análisis de la distribución de la expresión de los intercambiadores de sodio-calcio dependientes del potasio en tejidos humanos

Se analizó una distribución de expresión del gen (SEQ ID NO: 1) codificante del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio en tejidos humanos mediante el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa con la transcriptasa inversa (RT-PCR) con el siguiente procedimiento.

Se trató ARN poly A^{+} (5 ng, respectivamente; Clontech) de cada tejido humano con DNasa y entonces se sintetizó una primera cadena de ADNc llevando a cabo una transcripción inversa usando un equipo de RT-PCR (Sistema de síntesis de primeras cadenas SUPERSCRIPT para RT-PCR; GIBCO-BRL).

Se llevó a cabo una PCR usando el ADNc de primera cadena resultante como molde, un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de SEQ ID NO: 7 como cebador directo, un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de SEQ ID NO: 8 como cebador inverso y una ADN polimerasa (Taq ADN polimerasa PLATINUM de alta fidelidad; GIBCO-BRL). En la PCR, se realizó primero una desnaturalización térmica a 94ºC durante 1 minuto y luego se repitió 35 veces un ciclo constituido por reacciones a 98ºC durante 10 segundos, a 64ºC durante 20 segundos y a 68ºC durante 1 minuto y 30 segundos. A este respecto, las secuencias de bases de los cebadores son secuencias específicas contenidas comúnmente en ambos genes codificantes de los polipéptidos constituidos por las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y 4.

Cuando se llevó a cabo el análisis de RT-PCR de los leucocitos periféricos humanos, se amplificaron fragmentos de ADN de aproximadamente 750 pb y aproximadamente 700 pb. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 750 pb y aproximadamente 700 pb contenían "la secuencia constituida por el tramo de la base 348 a la base 1.101 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1" y "la secuencia constituida por el tramo de la base 348 a la base 1.044 de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3", respectivamente. De los resultados, se descubrió que el ARNm de cada intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio de la presente invención se expresaba en leucocitos periféricos humanos.

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Ejemplo 3

Expresión de intercambiadores de sodio-calcio dependientes del potasio en células animales HEK293, Dede y CHO

Se expresó cada polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 en células animales para detectar una nueva actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio del polipéptido. Como células animales, se usaron la célula HEK293 (ATCC: CRL-1573), una célula Dede (ATCC: CCL-39) y una célula CHO-dhfr^{-} (ATCC: CRL-9096). Se transfectaron las células HEK293, células Dede o células CHO-dhfr^{-} con el vector de expresión pcDNA-622 o pcDNA-603 preparado en el ejemplo 1 y un reactivo de transfección comercialmente disponible (LipofectAMINE2000; GIBCO-BRL) para expresar cada intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio en cada célula. A este respecto, el procedimiento concreto se llevó a cabo según el manual que acompañaba al reactivo de transfección. Además, se preparó una célula transfectada con el plásmido pcDNA3.1 como célula control de una manera similar. Las células transfectadas resultantes se usaron en los siguientes ejemplos
4 y 5.

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Ejemplo 4

Detección de la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio

Se midió la actividad de intercambio de sodio-calcio usando cada una de las células preparadas en el ejemplo 3.

Se incorporó sodio a las células cambiando el medio a una solución extracelular que contenía monensina [i.e., una solución que contenía 0,01 mmoles/l de monensina; 1 mmol/l de ouabaína; 146 mmoles/l de NaCl; 4 mmoles/l de KCl; 0,1 mmoles/l de MgCl_{2}; 10 mmoles/l de glucosa; albúmina de suero bovino al 0,1% y 10 mmoles/l de HEPES-Tris (pH = 7,4)] e incubando las células a 37ºC durante 30 minutos. Se cambió la solución a una solución extracelular que contenía cloruro de calcio (^{45}CaCl_{2}; 55,5 kBq/ml) [i.e., una solución que contenía 0,01 mmoles/l de verapamil; 1 mmol/l de ouabaína; 150 mmoles/l de NaCl; 0,1 mmoles/l de CaCl_{2}; 2 mmoles/l de MgCl_{2}; 10 mmoles/l de glucosa; albúmina de suero bovino al 0,1% y 10 mmoles/l de HEPES-Tris (pH = 7,4); solución extracelular A], y se dejaron reposar las células a temperatura ambiente durante 15 minutos para intercambiar los iones de sodio intracelular por los iones de calcio.

Además, se usó una solución extracelular en que la que se había sustituido el cloruro de colina por NaCl (solución extracelular B). Además, para examinar la dependencia de un ión de potasio, se usaron una solución extracelular que contenía cloruro de calcio (^{45}CaCl_{2}; 55,5 kBq/ml) y cloruro de potasio [i.e., una solución que contenía 0,01 mmoles/l de verapamil; 1 mmol/l de ouabaína; 4 mmoles/l de KCl; 146 mmoles/l de cloruro de colina; 0,1 mmoles/l de CaCl_{2}; 2 mmoles/l de MgCl_{2}; 10 mmoles/l de glucosa; albúmina de suero bovino al 0,1% y 10 mmoles/l de HEPES-Tris (pH = 7,4); solución extracelular C] y una solución extracelular que tenía una composición igual a la de la solución extracelular C, a excepción de que la cantidad de KCl era de 150 mmoles/l y que no contenía cloruro de colina (solución extracelular D).

Se lavaron las células tratadas con una solución de lavado que contenía 120 mmoles/l de cloruro de colina, 10 mmoles/l de LaCl_{3} y 10 mmoles/l de HEPES-Tris (pH = 7,4) para eliminar los iones de calcio no incorporados, y luego se midió una radiactividad de los iones de calcio intracelulares y se analizó mediante un contador de centelleo líquido. En las células HEC293, células Dede o células CHO-dhfr^{-} que expresaban el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4, se midió una radiactividad aproximadamente dos veces más elevada que la obtenida en el caso de la solución extracelular A cuando se usó la solución extracelular B (solución extracelular en la que el sodio fue reemplazado por colina). Además, se midieron radiactividades de aproximadamente cinco veces y aproximadamente 10 veces más elevadas que las obtenidas en el caso de la solución extracelular A cuando se usaron las soluciones C y D (solución extracelular que contiene potasio), respectivamente.

Según lo descrito anteriormente, se confirmó que, en las células que expresan el polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 de la presente invención, se pueden intercambiar los iones de sodio intracelular por iones de calcio extracelular más eficazmente en presencia de iones de potasio, y que el polipéptido de la presente invención constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio.

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Ejemplo 5

Construcción de cepa celular que expresa de forma estable el intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio

Para construir una cepa celular de expresión estable, se sub-cultivaron repetidas veces las células Dede preparadas en el ejemplo 3 en un medio DMEM que contenía G-418 (GIBCO-BRL) a una concentración final de 400 mg/l, y se sembraron las células en pozos de placas de 96 pozos (5.000 células/pozo). Se midió la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio de cada pozo según el procedimiento descrito en el ejemplo 4, para seleccionar células que tenían una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en la que una radiactividad en el caso de la solución extracelular C o D fuera de 5.000 cpm/pozo o mayor y una proporción de S/N de 10 o más. Las cepas celulares de expresión estable resultantes derivadas de una célula Dede se usaron en el siguiente
ejemplo 6.

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Ejemplo 6

Sustancias de rastreo que inhiben la nueva actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio utilizando la liberación de iones de radioisótopo de calcio (^{45}Ca)

Se rastrearon, según el procedimiento descrito en el ejemplo 4, sustancias que inhiben la actividad del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente de potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 mediante la medición de una radiactividad de los iones de calcio.

Se sembraron células de expresión estable derivadas de una célula Dede, preparadas en el ejemplo 5, en cada pozo de placas de 96 pozos (5.000 células/pozo) y se determinó la actividad inhibidora midiendo una radiactividad de los iones de calcio según el procedimiento descrito en el ejemplo 4 para rastrear sustancias que inhiben la actividad del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente de potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4. Tras tratar las células con monensina, se añadió cada solución que contenía un compuesto de análisis [i.e., una solución de un compuesto de análisis disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO)] a la solución extracelular C o D que contenía cloruro de calcio (^{45}CaCl_{2}; 55,5 kBq/ml), y se midió para seleccionar sustancias que presentaran una actividad inhibidora del 30% o más.

Como resultado, se obtuvieron dos compuestos que presentaban una actividad del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente de potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4, i.e., metanosulfonato de 2-[2-[4-(4-nitrobenciloxi)fenil]etil]isotiourea [compuesto A; Publicación de patente japonesa sin examinar (Kokai) 9-67336 o J. Biol. Chem. 1996. 271(37): 22391-7] y 3',4'-diclorobenzamil [compuesto B; compuesto de catálogo N.º B-710, NIMH Chemical Inventory, EE.UU. o Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., mayo de 1984; 81(10):
3238-42].

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Ejemplo 7

Efecto de los inhibidores en leucocitos polimorfonucleares periféricos humanos

Se evaluaron los compuestos obtenidos en el ejemplo 6 usando leucocitos polimorfonucleares periféricos humanos (PMN). Se obtuvo una muestra de sangre extrayendo sangre de un adulto sano. Se vertió una solución de Ficoll para la separación (medio de resolución Mono-poly; Dainippon Pharmaceutical) en cada tubo de centrifugación, y se tendió sobre la solución de Ficoll un componente de sangre recién preparado. Se llevó a cabo la centrifugación a 400 xg a temperatura ambiente durante 30 minutos para separar la capa superior (monolitos), la capa intermedia (PMN) y el precipitado (eritrocitos). Se recogió cada capa de tal manera que no se mezclaron entre sí, se suspendieron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se volvieron a centrifugar. Se suspendió cada capa recogida en un medio de RPMI1640 que contenía albúmina de suero bovino al 0,2% (ASB), y se usaron en el siguiente experimento tras contar el número de células. Se tiñó una porción del componente de PMN resultante con un tinte de hematoxilina y eosina para confirmar que contenía neutrófilos (aproximadamente el 95%) y eosinófilos (aproximada-
mente 5%).

Se llevó a cabo un test de migración usando una cámara de quimiotaxis desechable de 24 pocillos Transwell 3 \mum; Corning). Se preparó cada solución de análisis que contenía compuesto A o B (concentración final = 10 \mumoles/l; 30 \mumoles/l y 100 \mumoles/l) en un medio (ASB al 0,2%, medio RPMI1640) que contenía 100 nmoles/l de formilmetionil-leucinil-fenilalanina (fMLP), y se añadió 1 ml de cada solución de análisis a cada uno de los pocos inferiores. Se añadieron los PMN recogidos a cada pozo superior (2,0 x 10^{6} células/pozo; 0,2 ml) y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se contaron los números de células que emigraron a los pozos inferiores con un hemacitómetro. Se repitió el análisis independientemente tres veces.

En la tabla 1, se muestran los resultados. Cada valor mostrado en la tabla 1 es un valor relativo considerando como 100 el valor obtenido en el caso de usar DMSO en lugar de los compuestos de análisis. Además, cada valor mostrado en la tabla 1, es una media y una desviación estándar (DE) en base a tres experimentos independientes. Los datos obtenidos en el caso en que los PMN no fueron estimulados con fMLP (BG) se muestran en la tabla 1.

Tal y como se muestra en la tabla 1, los compuestos A y B inhibieron la emigración de los PMN de manera dependiente de la dosis. A partir de los resultados, se descubrió que los compuestos que inhiben una actividad del nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 4 tienen un efecto capaz de inhibir la emigración de los PMN. Es decir, se descubrió que tales compuestos tienen un efecto ventajoso como agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria.

TABLA 1

1

Aplicabilidad industrial

El polipéptido de la presente invención es un intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio expresado en los leucocitos periféricos y, por tanto, está implicado en la activación leucocitaria, la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y la inflamación. Por lo tanto, una sustancia que inhiba el polipéptido de la presente invención es útil en la inhibición de la activación leucocitaria y el tratamiento de la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria.

Además, el polipéptido de la presente invención y la célula de la presente invención que expresa el polipéptido en su superficie son útiles para rastrear un inhibidor de la activación leucocitaria y un agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria. Se puede proporcionar un sistema de rastreo conveniente para obtener un inhibidor de la activación leucocitaria y un agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria. Además, el polinucleótido y el vector de expresión de la presente invención son útiles en la fabricación de una herramienta de rastreo de un inhibidor de la activación leucocitaria y un agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria.

Según la herramienta de rastreo o el procedimiento de rastreo de la presente invención, se puede rastrear una sustancia útil como un inhibidor de la activación leucocitaria y un agente terapéutico para la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y una enfermedad inflamatoria. La composición farmacéutica para inhibir la actividad leucocitaria es útil en la prevención de la lesión celular debida a una reperfusión postisquémica y en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad inflamatoria.

Texto libre del listado secuencial

Las características de "Secuencia artificial" se describen en el identificador numérico <223> del listado secuencial. Más concretamente, cada secuencia de bases de SEQ ID NO: 5 a 8 es una secuencia cebadora sintetizada artificialmente.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a realizaciones específicas, es posible realizar diversos cambios y modificaciones obvias para los expertos en la técnica sin alejarse del alcance de las reivindicaciones anexas.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

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<120> Nuevo intercambiador de sodio-calcio dependiente del potasio

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<130> Y0335PCT-693

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<150> JP 2002-225114

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<151> 01-08-2002

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<150> JP 2003-182989

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<151> 26-06-2003

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<160> 8

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 1902

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (14)..(1882)

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<223>

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<220>

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<223> Inventor: Nozawa, Katsura; Mochizuki, Shinobu

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<400> 1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 622

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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6

7

8

9

10

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<210> 3

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<211> 1845

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (14)..(1825)

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<223>

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<400> 3

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11

12

13

14

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<210> 4

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<211> 603

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

15

16

17

18

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<210> 5

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada artificialmente.

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<400> 5

\hskip1cm

19

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<210> 6

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada artificialmente.

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<400> 6

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20

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<210> 7

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada artificialmente.

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<400> 7

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21

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<210> 8

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: una secuencia cebadora sintetizada artificialmente.

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<400> 8

\hskip1cm

22

Claims (13)

1. (1) Un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

2. El polipéptido según la reivindicación 1, en el que la actividad de intercambio de sodio-calcio es una actividad de intercambio de sodio-calcio inversa.

3. Un polinucleótido codificante del polipéptido según la reivindicación 1 ó 2.

4. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 3.

5. Una célula transfectada con el vector de expresión según la reivindicación 4.

6. Un procedimiento para producir el polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por usar la célula según la reivindicación 5.

7. Un procedimiento para rastrear un inhibidor del polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula según la reivindicación 5 que expresa el polipéptido con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio está inhibida o no en el polipéptido, y

(3)

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido.

8. Un procedimiento para rastrear un inhibidor de la actividad leucocitaria que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula que expresa un polipéptido seleccionado entre 1) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y 2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 y transfectado con un vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante de dicho polipéptido en contacto con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio está inhibida o no en el polipéptido, y

(3)

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el polipéptido es (1) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

10. Un procedimiento para rastrear un agente terapéutico para la lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria que comprende las etapas de:

(1)

poner en contacto una célula que expresa un polipéptido seleccionado entre 1) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y 2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 y transfectado con un vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante de dicho polipéptido en contacto con una sustancia por ser analizada,

(2)

analizar si la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio está inhibida o no en el polipéptido, y

(3)

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio en el polipéptido.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el polipéptido es (1) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

12. Uso de una célula que expresa un polipéptido seleccionado entre:

(1)

un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, y

(2)

un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 y transfectado con un vector de expresión que comprende un polinucleótido codificante de dicho polipéptido en el rastreo de un inhibidor de la activación leucocitaria o un agente terapéutico para la lesión por reperfusión postisquémica y/o una enfermedad inflamatoria.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que el polipéptido es (1) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o (2) un polipéptido que presenta una actividad de intercambio de sodio-calcio dependiente del potasio y que está constituido por una secuencia de aminoácidos en la que de 1 a 5 aminoácidos en total están sustituidos, eliminados, insertados y/o añadidos a una o varias partes de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.