JPH1132784A - 新規ヒト７−膜貫通レセプターをコードするｃＤＮＡクローンＨＭＴＭＦ８１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ヒト７−膜貫通レセプターのHMTMF８１
のポリペプチドおよびこれをコードするｃＤＮＡが望ま
れている。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のＨＭＴＭＦ８１
のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とその全
長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌクレ
オチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド、また
はその単離ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配
列を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、出典明
示によりその内容が本明細書に組み込まれる、１９９７
年４月２２日出願のＵＳＳＮ０８／８４４，７９５の一
部継続出願である。

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用およ
びその生成に関する。さらに詳しくは、本発明のポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは以下、ＨＭＴＭＦ８１
というＧ−タンパク質結合レセプターに関する。本発明
はまた、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
作用の阻害または活性化に関する。さらに、本発明はＬ
ＴＤ４およびＬＴＣ４の作用を阻害または活性化するこ
とに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】医学
的に重要な多くの生物学的プロセスが、Ｇタンパク質お
よび／またはセカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ
が関係しているシグナルトランスダクション経路に関係
するタンパク質によって媒介されることはよく確立され
ている（Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-354）。本
明細書中、これらのタンパク質は、Ｇタンパク質または
ＰＰＧタンパク質とともに経路に関係しているタンパク
質をいう。これらのタンパク質のいくつかの例は、アド
レナリン作動性因子およびドパミンのためのタンパク質
のごときＧＰＣレセプター（Kobilka, B. K. et al.,Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987, 84:46-50;Kobilka,
B. K. et al., Science, 1987, 238:650-656;Bunzow,
J. R., et al., Nature, 1988, 336:783-787）、Ｇタン
パク質そのもの、エフェクター・タンパク質、例えば、
ホスホリパーゼＣ、アデニルサイクラーゼおよびホスホ
ジエステラーゼ、および、アクチュエイター・タンパク
質、例えばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナ
ーゼＣ（Simon, M. I., et al., Science, 1991, 252:8
02-8）を包含する。

【０００３】例えば、シグナルトランスダクションの一
つの形態において、ホルモン結合の効果は、酵素である
アデニレートサイクラーゼの細胞内部での活性化であ
る。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドＧＴ
Ｐの存在に依存している。ＧＴＰはホルモン結合にも影
響する。Ｇタンパク質は、アデニレートサイクラーゼに
対するホルモンレセプターに結合する。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターによって活性化されると結合型
ＧＤＰをＧＴＰに交換するようにみえた。次いで、ＧＴ
Ｐ担持形態はアデニレートサイクラーゼに結合して活性
化する。Ｇタンパク質自体によって触媒されるＧＴＰの
ＧＤＰへの加水分解は、Ｇタンパク質をもとの不活性形
態に戻す。かくしてＧタンパク質は、レセプターからエ
フェクターへシグナルを伝達する媒体のごとき、およ
び、シグナルの持続期間を制御する時計のごとき２つの
役割を果たしている。

【０００４】Ｇタンパク質結合レセプターの膜タンパク
質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定膜貫通ドメ
インを有するものとして特徴づけられる。そのドメイン
は細胞外ループまたは細胞質ループによって連結される
膜貫通αヘリックスを表すと考えられている。Ｇタンパ
ク質結合レセプターは、ホルモンレセプター、ウイルス
レセプター、成長因子レセプターおよび神経レセプター
のごとき、広範囲の生物学的活性レセプターを包含す
る。

【０００５】Ｇタンパク質結合レセプター（もしくは７
ＴＭレセプターとして知られているもの）は、約２０な
いし３０個のアミノ酸のこれら７つの保存的疎水的スト
レッチを包含し、少なくとも８つの多様な親水性ループ
を連結するものとして特徴づけられる。レセプター結合
Ｇタンパク質ファミリーは、精神病および神経疾患を治
療するために使用される向精神薬に結合するドパミンレ
セプターを包含する。このファミリーのメンバーの他の
例は、カルシトニン、アドレナリン様物質、エンドセリ
ン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様物質、アセチ
ルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニ
ン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝子
-１、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウ
イルスレセプターを包含するが、これらに限定されな
い。

【０００６】ほとんどのＧタンパク質結合レセプター
は、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられてい
るジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ルー
プの各々において単一の保存的システイン残基を有す
る。７つの膜貫通領域を、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、Ｔ
４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と命名する。ＴＭ３は
シグナルトランスダクションに関係している。システイ
ン残基のリン酸化および脂質付加（パルミチル化または
ファルネシル化）は、いくつかのＧタンパク質結合レセ
プターのシグナルトランスダクションに影響し得る。ほ
とんどのＧタンパク質結合レセプターは、第３の細胞質
ループおよび／またはカルボキシ末端に潜在的リン酸化
部位を含有する。βアドレナリンレセプターのごときい
くつかのＧタンパク質結合レセプターについて、プロテ
インキナーゼＡおよび／または特異的レセプターキナー
ゼによるリン酸化がレセプターの脱感作を媒介する。

【０００７】いくつかのレセプターについては、Ｇタン
パク質結合レセプターのリガンド結合部位は、いくつか
のＧタンパク質結合レセプター膜貫通ドメインによって
形成される親水性ソケットを含んでなり、該ソケットは
Ｇタンパク質結合レセプターの疎水性残基によって取り
囲まれていると考えられている。各Ｇタンパク質結合レ
セプター膜貫通ヘリックスの親水性側は内向きになって
おり、極性のリガンド結合部位を形成すると仮定されて
いる。ＴＭ３は、いくつかのＧタンパク質結合レセプタ
ーにおいて、ＴＭ３アスパラギン酸残基のごときリガン
ド結合部位を有することにＴＭ３が関係している。複数
のＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギン、および、ＴＭ６
またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもリガ
ンド結合に関係している。

【０００８】Ｇタンパク質結合レセプターは、様々な細
胞内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターと
ヘテロ３量体Ｇタンパク質によって細胞内で結合してい
る可能性がある（Johnson et al., Endoc. Rev., 1989,
10:317-331参照）。異なるＧタンパク質αサブユニッ
トは、特定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内
の様々な生物学的機能をモジュレートする。Ｇタンパク
質結合レセプターの細胞質側残基のリン酸化は、いくつ
かのＧタンパク質結合レセプターのＧタンパク質結合調
節のための重要な機構として同定されている。Ｇタンパ
ク質結合レセプターは、哺乳動物宿主内の多数の部位に
おいて見いだされる。

【０００９】過去１５年間、７膜貫通（７ＴＭ）レセプ
ターを標的にした３５０個近くの治療薬が市場に導入さ
れ成功している。これは、これらレセプターが治療標的
として確立され、かつ立証された歴史を有することを示
している。限定するものではないが、細菌、真菌、原生
動物およびウイルス感染、特に、ＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２によって引き起こされる感染；痛み；癌；拒食
症；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安
症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵
遅れを含む精神病および神経学的疾患を含む精神病およ
び神経学的疾患、ならびに、ハンチントン病またはジル
・デラ・ツレット（Gilles dela Tourett's）症候群の
ごとき運動障害を含め、機能不全または疾患の予防、改
善または矯正において役割を果たしうる、さらなるレセ
プターを同定および特徴付ける必要があるのは明らかで
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明はＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドおよび組換え材料な
らびにその製法に関する。本発明の別の態様は、そのよ
うなＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドを用いる方法に関する。かかる使用は、とりわけ、
細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、特に、ＨＩ
Ｖ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染；
痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキンソン病；
急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心
症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥
大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、
痴呆、重度の知恵遅れを含む精神病および神経学的疾
患、ならびに、ハンチントン病またはジル・デラ・ツレ
ット（Gilles dela Tourett's）症候群のごとき運動障
害の治療を包含する。さらに別の態様において、本発明
は、該発明により得られる材料を用いてアゴニストおよ
びアンタゴニストを同定する方法、およびＨＭＴＭＦ８
１の平衡異常に付随する症状をその同定した化合物を用
いて治療することに関する。本発明のさらに別の態様は
不適当なＨＭＴＭＦ８１活性またはレベルに伴う疾患を
検出するための診断アッセイに関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】

定義 以下の定義は、本明細書で汎用する用語の理解を容易に
するためのものである。「ＨＭＴＭＦ８１」は、とりわ
け、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドまたはその対立遺伝子変種をいう。「レセプター
活性」または「レセプターの生物学的活性」とは、類似
の活性または改良された活性あるいは望ましくない副作
用の減じたこれらの活性を含め、該ＨＭＴＭＦ８１の代
謝的または生理学的機能をいう。該ＨＭＴＭＦ８１の抗
原的および免疫原的活性も含まれる。

【００１２】「ＨＭＴＭＦ８１遺伝子」とは、配列番号
１に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドまたはその対立遺伝子変種および／またはそれらの相
補物をいう。本明細書で用いる「抗体」は、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本鎖、およ
びヒト化抗体、ならびにＦａｂの産物または他の免疫グ
ロブリン発現ライブラリーを含め、Ｆａｂフラグメント
を包含する。「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変えられたことを意味する。「単離」された組
成物または物質が天然に存在する場合、その本来の環境
から変えられるかもしくは取り除かれ、またはその両方
がなされたことを意味する。例えば、天然の状態で生存
動物に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質
から分離されているその同一のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書に用いる用語である、「単
離」がなされている。

【００１３】「ポリヌクレオチド」とは、一般に、修飾
されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾された
ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれかのポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
いう。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖Ｄ
ＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分
子を包含するが、これに限定されるものではない。加え
て、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡま
たはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポ
リヌクレオチドなる用語はまた、一つまたはそれ以上の
修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならび
に安定性またはその他の理由で修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基
は、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなど
の通常でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよ
びＲＮＡに対してなされている。よって、「ポリヌクレ
オチド」は、典型的には天然において見いだされるよう
な化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリ
ヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な
化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また、
「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチド
と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００１４】「ポリペプチド」は、ペプチド結合により
互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を有
してなるペプチドまたはタンパク質あるいは修飾された
ペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ
以上のアミノ酸を有してなるペプチドまたはタンパク
質、すなわち、ペプチドアイソスターをいう。「ポリペ
プチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオ
リゴマーと称される短鎖、およびタンパク質と称される
長鎖の両方をいう。ポリペプチドは遺伝子によりコード
された２０種のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有して
もよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセッシングな
どの自然の工程により、または当業者に周知の化学修飾
技法により修飾されたアミノ酸配列を含有する。このよ
うな修飾は基本テキストにて、およびさらに詳細な研究
論文にて、ならびに膨大な研究文献において詳しく記載
されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のどこででも起こり得る。同一の型の修飾が所定のポリ
ペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度で存
在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドは多くの型の修飾を含んでいてもよい。ポリペプチド
はユビキチネーションの結果として分岐していてもよ
く、分岐しているかまたはしていない、環状であっても
よい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは翻
訳後の天然プロセスにより生じたものであってもよく、
または合成法により製造されたものであってもよい。修
飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、ア
ミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌ
クレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトー
ルの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形
成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形
成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カル
ボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキ
シル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、
タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル
化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化な
どのトランスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ
酸付加、ならびにユビキチネーションを包含する。例え
ば、PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、
第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、Ne
w York（1993）およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MOD
IFICATION OF PROTEINS、B.C.Johnson編、Academic Pre
ss、New York（1983）のWold,F.、Posttranslational P
rotein Modifications：Perspectives and Prospects、
1〜12頁；Seifterら、“Analysis for protein modific
ations and nonprotein cofactors”、Meth.Enzymol. 1
82：626-646（1990）およびRattanら、“Protein Synth
esis：Posttranslational Modifications and Aging"、
Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62（1992）を参照のこと。

【００１５】本明細書で用いる「変種」なる用語は、各
々、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異な
るが、本質的な特性は保持している、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチド
の変種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド
配列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化
は、対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列と変わっていてもよく、変わってい
なくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後記するよう
に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおいて
アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断をもた
らしうる。典型的なポリペプチドの変種は、別の対照ポ
リペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、差異
は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に極
めて類似しており、多くの領域で同一であるように限定
される。変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ
以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによ
り、アミノ酸配列にて異なっていてもよい。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされ
たものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変種は、対立遺伝子変種のような天然
物であってもよく、または天然に発生することが知られ
ていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの天然に生じない変種は、突然変異誘発技
術により、または直接的合成により製造できる。

【００１６】「同一性」とは、当該分野において知られ
るように、配列の比較により決定されるような、2種ま
たはそれ以上のポリペプチド配列または2種またはそれ
以上のポリヌクレオチド配列間の関係をいう。当該分野
において、「同一性」は、また、ある場合には、該配列
の鎖間の対合により決定される、ポリペプチドまたはポ
リヌクレオチド配列間の配列の関連性度合いを意味す
る。「同一性」および「類似性」は、限定されるもので
はないが、Computational Molecular Biology, Lesk,
A. M.編、Oxford University Press、New York、1988
年；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,
Smith,D.W.編、Academic Press、New York、1993年；C
omputer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffi
n,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jers
ey、1994年；Sequence Analysis in Molecular Biolog
y，von Heinje,G.、Academic Press、1987年；Sequence
Analysis Primer, Gribskov, M. およびDevereux, J.
編、M Stockton Press, New York, 1991年；およびCari
llo, H. およびLipman, D., SIAM J. Applied Math, 4
8:1073(1988）に記載される方法を含む公知の方法によ
り容易に計算することができる。同一性を決定する好ま
しい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるよ
うに設計される。同一性および類似性を決定するための
方法は公的に利用可能なコンピュータープログラムに集
成されている。二つの配列間の同一性および類似性を測
定するための好ましいコンピュータープログラム法は、
ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic
Acids Research 12（1）：387（1984））、BLASTP、BL
ASTN、FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol. 215：21
5-403（1990））を包含するが、これらに限定されるも
のではない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩお
よび他の供給源から公的に利用可能である（BLAST Manu
al,Altschul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda, MD 2089
4; Altschul, S.ら、J. Mol.Biol., 215:403-410(199
0))。周知の Smith Waterman アルゴニズムもまた、同
一性の決定に用いることができる。

【００１７】ポリペプチド配列比較のための好ましいパ
ラメーターは以下のものを含む： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. B
iol. 48:443-453(1970) 比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff, Proc,
Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919(1992)からBLOSSUM62 ギャップペナルティ：１２ ギャップ長さペナルティ：４ これらのパラメーターで有用なプログラムは、「ギャッ
プ」プログラムとしてGenetics Computer Group, Madis
on WI から、公的に利用可能である。上述したパラメー
ターは、ペプチド比較のためのデフォルトパラメーター
である（末端ギャップのペナルティを伴わない）。ポリ
ヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは以下
のものを含む： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. B
iol. 48:443-453(1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティ：５０ ギャップ長さペナルティ：３ 利用可能：「ギャップ」プログラムとして Genetics Co
mputer Group, MadisonWI から、利用可能。これらは核
酸比較ためのデフォルトパラメーターである。

【００１８】一例として、本発明のポリヌクレオチド配
列は、配列番号１の対照配列と同一、すなわち１００％
同一であるか、または対照配列と比較して特定の整数ま
での数のヌクレオチド変化を含んでいてもよい。該変化
は、少なくとも一つのヌクレオチドの欠失、トランジシ
ョンおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入
からなる群から選択され、該変化が対照ヌクレオチド配
列の５’または３’末端位置で、またはそれら末端位置
の間のどこで起こってもよく、対照配列中のヌクレオチ
ド間に個々に、または対照配列内の一またはそれ以上の
隣接する基において点在してもよい。ヌクレオチド変化
の数は、配列番号1中のヌクレオチドの総数に各々のパ
ーセント同一性（１００で割る）を掛け、その積を配列
番号１のヌクレオチドの総数から減じるか、または式： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） ここで、ｎ_nは、ヌクレオチド変化数、ｘ_nは、配列番号
1中のヌクレオチドの総数、ｙはたとえば、７０％の場
合０．７０、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．
８５、９０％の場合、０．９０、９５％の場合、０．９
５などであり、ｘ_nとｙの積が整数でない場合、その値
をｘ_nから引く前に端数を切り捨てもっとも近い整数す
る、によって決定する。配列番号2のポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコーディ
ング配列中にてナンセンス、ミスセンスまたはフレーム
シフトを引き起こし、それにより、そのように変化した
ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが変
化する。

【００１９】同様に、本発明のポリペプチド配列は、配
列番号2の対照配列と同一、すなわち１００％同一であ
るか、または、対照配列と比較してある整数までの数の
アミノ酸変化を含み、％同一性が１００％よりも小さい
ものであってもよい。該変化は、少なくとも一つのアミ
ノ酸の欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、ま
たは挿入からなる群から選択され、該変化が対照アミノ
酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、またはそ
れら末端位置の間のどこで起こってもよく、対照配列中
の残基間に個々に、または対照配列内の一またはそれ以
上の隣接する基において点在してもよい。％同一性とし
て与えられるアミノ酸変化の数は、配列番号２中のアミ
ノ酸の総数に各々のパーセント同一性（１００で割る）
を掛け、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から
減じるか、または式： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） ここで、ｎ_aは、アミノ酸変化数、ｘ_aは、配列番号２中
のアミノ酸の総数、ｙはたとえば、７０％の場合０．７
０、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５など
であり、ｘ_aとｙの積が整数でない場合、その値を、ｘ_a
から引く前に端数を切り捨てもっとも近い整数にする、
によって決定する。

【００２０】「ＬＴＤ４」またはロイコトリエンＤ
₄（ＬＴＤ₄）は、（５Ｓ，６Ｒ）−６−Ｓ−システイニ
ルグリシン−５−ヒドロキシ−（７Ｚ，９Ｚ，１１Ｅ，
１４Ｅ）−エイコサテトラエノイックアシッドの化学構
造を有し、たとえば、Brances NC, de Jong B, Miyamot
o T, in Chest 1997 Feb; 111(2 Suppl):52S-60S, Worl
dwide clinical experience with the first marketed
leukotriene reseptor antagonist. により、記載され
ている。「ＬＴＣ４」またはロイコトリエンＣ₄（ＬＴ
Ｃ₄）は、［５Ｓ，６Ｒ］−５−ヒドロキシ−６−（５
−グルタチオニル）−（７Ｅ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ）
エイコサテトラエノイックアシッドの構造を有する。Ｌ
ＴＣ４は、たとえば、McIntyre, T. M., Zimmerman, G.
A and Prescott, S. M. Leukotrienes C4 and D4stimu
late human endothelial cells to synthesize platele
t-activating factor and bind neutrophils. Proc. Na
tl. Acad. Sci(USA), 83, 2204-2208,1986;Tamura, N.,
Agrawal, D. K. and Townley, R. G. A specific assa
y for leukotriene C4 and the measurement of calciu
m ionophore-indused leukotrieneC4 production from
human leukocytes. J. Pharm. Methods 18, 327-333, 1
987; Owen, W. F., Soberman, R. J., Yoshimoto, T.,
Sheffer, A. L., Lewis, R.A. and Austen, K. F. Synt
hesis and release of leukotriene C4 by human eosin
ophils. J. Immunology 138, 532-538, 1987、中に記載
されている。

【００２１】本発明のポリペプチド 一の態様において、本発明はＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
チドに関する。ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドは、配列
番号２のポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸
配列を含むポリペプチド；および配列番号２のアミノ酸
配列とその全長にわたって少なくとも８０％の同一性、
より好ましくは配列番号２と少なくとも９０％の同一
性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を
有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。
さらには、少なくとも９７−９９％の同一性を有するポ
リペプチドが最も好ましい。ＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
チドはまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドとその全長にわたって少なくとも８０％の同一
性、より好ましくは配列番号２と少なくとも９０％の同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性
を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含す
る。さらには、少なくとも９７−９９％の同一性を有す
るポリペプチドが最も好ましい。好ましくは、ＨＭＴＭ
Ｆ８１のポリペプチドは少なくとも１つのレセプターの
生物学的活性を示す。

【００２２】ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドは「成熟」
タンパク質の形態であってもよく、あるいは融合タンパ
ク質などの大型のタンパク質の一部であってもよい。分
泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残
基のごとき精製を促進する配列、または組換え操作の間
の安定性のための付加的な配列を含む付加的なアミノ酸
配列を含んでいることがしばしば有利である。

【００２３】ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドのフラグメ
ントも本発明に含まれる。フラグメントは、前記のＨＭ
ＴＭＦ８１のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてでは
なく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドで
は、フラグメントは「自立している」であるか、または
フラグメントが一部分もしくは一領域を形成する大型の
ポリペプチド内に含まれていてもよく、最も好ましくは
単一の連続した領域として含まれる。本発明のポリペプ
チドフラグメントの代表例は、例えば、ＨＭＴＭＦ８１
のポリペプチドのアミノ酸番号約１〜２０、２１〜４
０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００および１０
１から末端までからなるフラグメントを包含する。この
意味において、「約」とは、片方または両端において、
特記された数よりも数個、５個、４個、３個、２個また
は１個だけ多いかまたは少ない範囲を含む。

【００２４】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む一連の残基が欠失、またはカルボキシル末端
を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がアミノ末端で
もう一方がカルボキシル末端を含む２つの一連の残基が
欠失していること以外は、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
ドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを包含す
る。また、アルファーヘリックスおよびアルファーヘリ
ックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成
領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイ
ル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親媒性
領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、
基質結合領域および高抗原性指標領域を有するフラグメ
ントなどの構造的または機能的属性により特徴付けられ
るフラグメントも好ましい。他の好ましいフラグメント
は生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活
性なフラグメントは、類似活性または改良された活性を
有する、あるいは望ましくない活性を減じたものを含
め、レセプター活性を媒介する、フラグメントである。
動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフ
ラグメントもまた含まれる。

【００２５】好ましくは、これらのポリペプチドフラグ
メントはすべて、抗原的活性を含め、レセプターの生物
学的活性を保持している。定義した配列の変種およびフ
ラグメントも本発明の一部を形成する。好ましい変種
は、同類アミノ酸置換により対照と異なるものであり、
すなわち、一の残基が同様の特徴を有する他の残基によ
り置換されているものである。典型的なかかる置換は、
Ala、Val、LeuおよびIleの間：SerおよびThrの間；酸性
残基AspおよびGluの間；AsnおよびGlnの間；ならびに塩
基性残基LysおよびArgの間；あるいは芳香族残基Pheお
よびTyrの間におけるものである。数個、５ないし１０
個、１ないし５個、または１ないし２個のアミノ酸がい
ずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されている
変種が特に好ましい。

【００２６】いずれか適当な方法にて本発明のＨＭＴＭ
Ｆ８１のポリペプチドを製造することができる。かかる
ポリペプチドは、単離された天然ポリペプチド、組換え
技法で産生されたポリペプチド、合成法により産生され
たポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせによ
り産生されたポリペプチドを包含する。かかるポリペプ
チドの製造手段は当該分野においてよく知られている。

【００２７】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つ別の態様はＨＭＴＭＦ８１のポリヌク
レオチドに関する。ＨＭＴＭＦ８１のポリヌクレオチド
は、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドをコードする単離ポ
リヌクレオチドおよびフラグメント、ならびにそのポリ
ヌクレオチドに密接に関連するポリヌクレオチドに関す
る。さらに詳細には、本発明のＨＭＴＭＦ８１のポリヌ
クレオチドは、配列番号2のＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
チドをコードする配列番号1に含まれるヌクレオチド配
列を有してなるポリヌクレオチド、および配列番号1の
特定の配列を有するポリヌクレオチドを包含する。ＨＭ
ＴＭＦ８１のポリヌクレオチドは、さらには、配列番号
２のＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列とその全長にわたって少なくとも８０％の同
一性を有するヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、
および配列番号１のヌクレオチド配列とその全長にわた
って少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを包含する。この点において、少
なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ま
しく、少なくとも９５％同一であるのがさらに好まし
い。さらには、少なくとも９７％同一であるのがより好
ましく、少なくとも９８−９９％の同一性を有するもの
がより一層好ましく、少なくとも９９％の同一性を有す
るものが最も好ましい。さらに、増幅させるのにあるい
はプローブまたはマーカーとしての用途に用いることの
できる条件下で、ハイブリッド形成するのに配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列と十分な同一性を有するヌ
クレオチド配列もＨＭＴＭＦ８１のポリヌクレオチドに
含められる。本発明はまた、かかるＨＭＴＭＦ８１のポ
リヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを提供す
る。

【００２８】ヒトＨＭＴＭＦ８１をコードするｃＤＮＡ
を配列決定した結果から示されるように、本発明のＨＭ
ＴＭＦ８１は、G−タンパク質結合レセプターの他のタ
ンパク質に構造的に関連付けられる。ｃＤＮＡ配列は、
３３７個のアミノ酸のポリペプチドをコードするオープ
ン・リーディング・フレームを含んでいる。表１（配列
番号２）のアミノ酸配列は、ラットＰ２Ｙプリノセプタ
ー（Accession No. P49651, Tokuyama, Y.ら、Biochem.
Biophys. Res. Commun. 211(1), 211-218, 1995）と、
３１８個のアミノ酸残基において、約３１．４％の同一
性（FASTAを使用）を有する。さらに、ＨＭＴＭＦ８１
（配列番号２）は２９３アミノ酸残基にわたりタンパク
質配列と３２．４％同一である（米国特許第５５０８３
８４）。さらに、ＨＭＴＭＦ８１（配列番号２）は、カ
ブポ（Cavpo）血小板活性化因子と２９８アミノ酸残基
にわたり３２．２％の同一性を有する（Accession No.
P21556, Honda, Z. I.ら、Nature, 349(6307), 342-34
6, 1991)。表１（配列番号１）のヌクレオチド配列は、
アンジオテンシンIIレセプターと３６８ヌクレオチド残
基において約５３．２６％の同一性を有する（BLAST使
用）（Accession No.S73388, Nishimatsu, S ら、Bioch
em. Biophys. Acta. 1218(3), 401-407, 1994)。さら
に、ＨＭＴＭＦ８１（配列番号１）は、１７９塩基対残
基にわたりポリヌクレオチド配列と５５％同一である
（米国特許第５５５６７８０号）。

【００２９】

【表１】 表１^a 1 CGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGGCTTTACGGCTGCGAGAAGACGACAG 60 61 AAGGGGGAGGAAGAAGAATCTGTATATCTGTATATATTGGCTAGCAAATGTGCCCTGCTC 120 121 TCTCCCCTCTTAAAAATAGCAGCAACCCATCTTTGCAAAGAAGCTTGCCTATAGAGCAGG 180 181 CACTCTGTGAATGGACTGTGCTTTTACGACCCTACAGGGTATCAAGATACTGTGCAGCTC 240 241 GCCAACAAGGATTAATTGCAAGGACTGGTAGATCGAATTTACTGAAGACTTGGAGCTTGC 300 301 TTCTGAGAACAAACGCAAAAGGACAGTAAACTGTGGACCTTGAAGTTAGCAGCGTGGGCT 360 361 TCCTCTAATATTACACCGTAAAAGGCATTGATCACCATAAGAAGGAACATTTGTGAAGGT 420 421 ACTCCAGTGCCAGAAAGAGGCACAAAGCAGACATTCGTAGAGAAACATGGATGAAACAGG 480 -14 M D E T G 5 481 AAATCTGACAGTATCTTCTGCCACATGCCATGACACTATTGATGACTTCCGCAATCAAGT 540 6 N L T V S S A T C H D T I D D F R N Q V 25 541 GTATTCCACCTTGTACTCTATGATCTCTGTTGTAGGCTTCTTTGGCAATGGCTTTGTGCT 600 26 Y S T L Y S M I S V V G F F G N G F V L 45 601 CTATGTCCTCATAAAAACCTATCACAAGAAGTCAGCCTTCCAAGTATACATGATTAATTT 660 46 Y V L I K T Y H K K S A F Q V Y M I N L 65 661 AGCAGTAGCAGATCTACTTTGTGTGTGCACACTGCCTCTCCGTGTGGTCTATTATGTCCA 720 66 A V A D L L C V C T L P L R V V Y Y V H 85 721 CAAAGGCATTTGGCTCTTTGGTGACTTCTTGTGCCGCCTCAGCACCTATGCTTTGTATGT 780 86 K G I W L F G D F L C R L S T Y A L Y V 105 781 CAACCTCTATTGTAGCATCTTCTTTATGACAGCCATGAGCTTTTTCCGGTGCATTGCAAT 840 106 N L Y C S I F F M T A M S F F R C I A I 125 841 TGTTTTTCCAGTCCAGAACATTAATTTGGTTACACAGAAAAAAGCCAGGTTTGTGTGTGT 900 126 V F P V Q N I N L V T Q K K A R F V C V 145 901 AGGTATTTGGATTTTTGTGATTTTGACCAGTTCTCCATTTCTAATGGCCAAACCACAAAA 960 146 G I W I F V I L T S S P F L M A K P Q K 165 961 AGATGGGAAAAATAATACCAAGTGCTTTGAGCCCCCACAAGACAATCAAACTAAAAATCA 1020 166 D G K N N T K C F E P P Q D N Q T K N H 185 1021 TGTTTTGGTCTTGCATTATGTGTCATTGTTTGTTGGCTTTATCATCCCTTTTGTTATTAT 1080 186 V L V L H Y V S L F V G F I I P F V I I 205 1081 AATTGTCTGTTACACAATGATCATTTTGACCTTACTAAAAAAATCAATGAAAAAAAATCT 1140 206 I V C Y T M I I L T L L K K S M K K N L 225 1141 GTCAAGTCATAAAAAGGCTATAGGAATGATCATGGTCGTGACCGCTGCCTTTTTAGTCAG 1200 226 S S H K K A I G M I M V V T A A F L V S 245 1201 TTTCATGCCATATCATATTCAACGTACCATTCACCTTCATTTTTTACACAATGAAACTAA 1260 246 F M P Y H I Q R T I H L H F L H N E T K 265 1261 ACCCTGTGATTCTGTCCTTAGAATGCAGAAGTCCGTGGTCATAACCTTGTCTCTGGCTGC 1320 266 P C D S V L R M Q K S V V I T L S L A A 285 1321 ATCCAATTGTTGCTTTGACCCTCTCCTATATTTCTTTTCTGGGGGTAACTTTAGGAAAAG 1380 286 S N C C F D P L L Y F F S G G N F R K R 305 1381 GCTGTCTACATTTAGAAAGCATTCTTTGTCCAGCGTGACTTATGTACCCAGAAAGAAGGC 1440 306 L S T F R K H S L S S V T Y V P R K K A 325 1441 CTCTTTGCCAGAAAAAGGAGAAGAAATATGTAAAGTATAGTTTAAACCATTTCCAGTCCA 1500 326 S L P E K G E E I C K V * 345 1501 AACCAATGAAAATAGTTTCCCAAATAAGTATTTTGTCAAATCATTTACAAAAAAAAAAAA 1560 1561 AAAAAAAAAAAAAAAAAA 1578^a ヒトＨＭＴＭＦ８１のヌクレオチドおよび推定アミノ
酸配列（それぞれ、配列番号１および２）

【００３０】ヒト白血球およびヒト脾臓の細胞中のｍＲ
ＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーより標準的クローニン
グおよびスクリーニングを用いて、ＨＭＴＭＦ８１をコ
ードする本発明の１つのポリヌクレオチドを得てもよい
（Adams,M.D.ら、Science,（1991） 252：1651-1656；A
dams,M.D.ら、Nature,（1992）355：632-634；Adams,M.
D.ら、Nature,（1995）377 Supp：3-174）。ゲノムＤＮ
Ａライブラリーのごとき天然源から本発明のポリヌクレ
オチドを得ることもでき、あるいはよく知られ、かつ商
業上利用可能な方法を用いて合成することもできる。配
列番号2のＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は、表１（配列番号１）に含まれるポ
リペプチドをコードする配列と同一であってもよく、ま
たは遺伝暗号の重複性（縮重性）の結果として、配列番
号２のポリペプチドをもコードする配列であってもよ
い。

【００３１】本発明のポリヌクレオチドをＨＭＴＭＦ８
１のポリペプチドの組換え生産に用いる場合、ポリヌク
レオチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそのフラ
グメントのコーディング配列を含むものであってもよ
く；読み枠中に、リーダーまたは分泌配列、プレ、プ
ロ、もしくはプレプロタンパク質配列をコードするコー
ディング配列、または他の融合ペプチド部分などの、他
のコーディング配列を伴った、成熟ポリペプチドまたは
フラグメントのコーディング配列を含むものであっても
よい。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマー
カー配列をコードすることもできる。本発明のこの態様
の特に好ましい具体例において、マーカー配列は、ｐＱ
Ｅベクター（Qiagen,Inc.）で得られ、Gentzら、Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載される
ような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、または
ＨＡタグである。ポリヌクレオチドはまた、非コーディ
ング５’および３’配列、例えば、転写された非翻訳配
列、スプライスおよびポリアデニル化シグナル、リボソ
ーム結合部位およびmＲＮＡを安定化する配列などを含
有していてもよい。

【００３２】さらなる好ましい具体例は、表１（配列番
号２）のＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドのアミノ酸配列
を有し、数個、５ないし１０個、１ないし５個、１ない
し３個、１ないし２個または１個のアミノ酸残基がいず
れかの組み合わせで置換、欠失または付加されているＨ
ＭＴＭＦ８１の変種をコードするポリヌクレオチドであ
る。本発明は、さらには、本明細書において前記した配
列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドにも関す
る。この点において、本発明は、特に、本明細書におい
て前記したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件
下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる用語の「ストリンジェントな条
件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは９７
％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが
起こることを意味する。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列またはそのフラグメントに
対して同一または十分に同一であり、ｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして
用いてＨＭＴＭＦ８１をコードする全長のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離し、ＨＭＴＭＦ８１遺伝子に対
して高配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離することができる。かかるハイブ
リダイゼーション法は当業者に知られている。典型的に
は、これらのヌクレオチド配列は、対照配列と８０％同
一、好ましくは９０％同一、より好ましくは９５％同一
である。一般に、プローブは少なくとも１５個のヌクレ
オチドを含むであろう。好ましくは、かかるプローブは
少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、少なくとも５
０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましい
プローブは３０ないし５０個のヌクレオチドの範囲にあ
る。

【００３４】一の具体例において、ＨＭＴＭＦ８１のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るには、
適当なライブラリーをストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件下で配列番号１を有する標識したプロー
ブまたはそのフラグメントでスクリーニングし、該ポリ
ヌクレオチド配列を含有する完全長のｃＤＮＡおよびゲ
ノムクローンを単離する工程を含む。そのようなハイブ
リダイゼーション法は当業者に周知である。ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件は、前記されてい
るとおりであるか、あるいはまた５０％ホルムアミド、
５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ NaCl、１５ｍＭ クエン酸三ナ
トリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７.
６）、５ｘDenhardt's溶液、１０％硫酸デキストランお
よび２０マイクログラム／ｍｌの変性切断サケ精子ＤＮ
Ａを有してなる溶液中で一夜４２℃でインキュベート
し、つづいてそのフィルターを約６５℃で０.１ｘＳＳ
Ｃにて洗浄する条件である。研究試薬ならびに動物およ
びヒトの疾患の治療および診断を見いだすための材料と
して本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用
いてもよい。

【００３５】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（複数でも
可）を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作す
る宿主細胞および組換え技法による本発明のポリペプチ
ドの製造にも関する。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤ
ＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質を製
造できる。

【００３６】組換え体を製造するために、宿主細胞を遺
伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドについての発
現系もしくはそれらの一部を組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davisら、BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1986）；Sambrook
ら、MOLECUR CLONING：A LABORATORY MANUAL、第２版、
Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring H
arbor、N.Y.（1989）のような、多くの標準的な実験マ
ニュアルに記載される方法により行うことができ、例え
ばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベク
ション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介
トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラ
ンスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入
または感染等がある。

【００３７】適当な宿主の代表的なものとして、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtili
s）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギ
ルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソ
フィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ
９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞、例えばCHO、CO
S、HeLa、Ｃ１２７、３Ｔ３、BHK、HEK２９３およびボ
ウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられ
る。

【００３８】多種の発現系を用いることができる。この
ような系として、とりわけ、染色体、エピソームおよび
ウイルス由来系、例えば細菌プラスミドから、バクテリ
オファージから、トランスポゾンから、酵母エピソーム
から、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントか
ら、バキュロウイルス、パポバウイルスなどの、例えば
ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘
ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルス由来のベクター、ならびにその組み合わせ由
来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドなど
のプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子由来の
ベクターが挙げられる。発現系は発現を制御および引き
起こす調節領域を含有していてもよい。一般に、ポリヌ
クレオチドを保持、伸長または発現させ、宿主にてポリ
ペプチドを産生するのに適した系またはベクターを使用
できる。種々の周知かつ慣用的な技法、例えば、Sambro
okら、MOLECULAR CLONING、A LABORATORY MANUAL（前
掲）に記載されている技法により、適当なヌクレオチド
配列を発現系に挿入できる。

【００３９】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナ
ルを所望のポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに固有のシグナルであって
もよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。Ｈ
ＭＴＭＦ８１のポリペプチドをスクリーニングアッセイ
にて用いるために発現させる場合、一般に、そのポリペ
プチドを細胞表面で生成させることが好ましい。この場
合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集め
てもよい。ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドが培地中に分
泌されるならば、培地を回収してポリペプチドを回収し
精製することができる。細胞内に生成されるならば、ま
ず細胞を溶解し、次いで、ポリペプチドを回収しなけれ
ばならない。

【００４０】ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドは、硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンま
たは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含め、周知の方法により、組換え細胞培養
物から回収および精製できる。高性能液体クロマトグラ
フィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペプチド
が単離および／または精製中に変性する場合、タンパク
質を再生するための周知方法を用い、再び活性な立体配
座とすることができる。

【００４１】診断アッセイ 本発明はまた診断薬として用いるためのＨＭＴＭＦ８１
のポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関与
するＨＭＴＭＦ８１遺伝子の変異形の検出は、ＨＭＴＭ
Ｆ８１の過少発現、過剰発現または発現の変化よりもた
らされる疾患の診断または疾患の疑いを特定することの
できる診断手段を提供する。ＨＭＴＭＦ８１遺伝子に変
異のある個体は、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出
できる。

【００４２】診断に供する核酸は、対象の細胞、例え
ば、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは、検出するのに直接使用
してもよく、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅させてもよい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることがで
きる。正常な遺伝子型との比較における増幅産物の大き
さの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然
変異は、増幅ＤＮＡを標識化ＨＭＴＭＦ８１のヌクレオ
チド配列とハイブリッド形成させることにより同定でき
る。完全に対合した配列はＲＮase消化により、または
融解温度の違いにより、誤対合二重らせんから区別でき
る。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性物質と一緒にまたは
なしで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動
度の変化により、または直接的ＤＮＡ配列決定法により
検出できる。例えばMyersら、Science 230：1242（198
5）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はま
た、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRＮaseおよびＳ
１保護または化学的切断法によっても明らかにすること
ができる。Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA，8
5：4397-4401（1985）を参照のこと。もう１つの具体例
において、ＨＭＴＭＦ８１のヌクレオチド配列またはそ
のフラグメントからなるオリゴヌクレオチドプローブの
アレイ（array）を構築して、例えば遺伝的変異の効果
的なスクリーニングを行うことができる。アレイ法はよ
く知られており、適用範囲が広く、その方法を用いて、
遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変化を含め、分子
遺伝学における種々の問題と取り組むことができる（例
えば、M.Cheeら、Science, Vol 274, pp610-613（199
6）を参照のこと）。

【００４３】診断アッセイは、記載した方法によりＨＭ
ＴＭＦ８１遺伝子中の変異を検出することによる、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、特に、ＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染；痛
み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキンソン病；急
性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；
心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；
および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴
呆、重度の知恵遅れを含む精神病および神経学的疾患、
ならびに、ハンチントン病またはジル・デラ・ツレット
症候群のごとき運動障害への罹病し易さを診断または測
定する方法を提供する。

【００４４】加えて、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染、特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって
引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘
息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉
尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレル
ギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分裂症、
躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れを含む精神病
および神経学的疾患、ならびに、ハンチントン病または
ジル・デラ・ツレット症候群のごとき運動障害は、対象
から由来の試料より、異常に上昇または低下したＨＭＴ
ＭＦ８１のポリペプチドまたはＨＭＴＭＦ８１のｍＲＮ
Ａのレベルを測定することを含む方法によって診断する
ことができる。発現の増加または低下は、ポリヌクレオ
チドの定量法として当該分野で周知の方法、例えば、Ｐ
ＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティ
ングおよび他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮ
Ａレベルで測定できる。宿主から由来の試料中のＨＭＴ
ＭＦ８１などのタンパク質のレベルを決定するために用
いることができるアッセイ法は、当業者に周知である。
このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競
合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩ
ＳＡアッセイが挙げられる。

【００４５】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異
的に標的とし、これとハイブリッド形成しうる。本発明
に従って、関連する配列を染色体にマッピングする工程
は、それらの配列を遺伝子関連疾患と関連づける重要な
第１工程である。配列を正確な染色体位置にマッピング
したならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝地図の
データと関連づけることができる。かかるデータは、例
えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（J
ohns Hopkins University Welch Medical Libraryから
オンラインで利用できる）にて見られる。ついで、連鎖
分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）により、同
じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係
を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡま
たはゲノム配列の相違も測定することができる。いくつ
かまたはすべての罹病個体において変異が観察される
が、正常個体においては観察されない場合、その変異は
該疾患の原因である可能性がある。

【００４６】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらのフラグメントま
たはそのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞を免
疫原として用いて、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドに対
して免疫特異的な抗体を得ることもできる。「免疫特異
的」なる語は、抗体が先行技術における他の関連ポリペ
プチドに対するアフィニティーよりも、本発明のポリペ
プチドに対して実質的により大きなアフィニティーを有
することを意味する。

【００４７】ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドに拮抗して
生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ担持フラ
グメント、アナログまたは細胞を、動物、好ましくはヒ
ト以外の動物に、通常の実験法を用いて投与することに
より得ることができる。モノクローナル抗体の産生に
は、連続的セルライン培養により得られる抗体を提供す
るいずれの方法も用いることができる。例えば、ハイブ
リドーマ法（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature 25
6：495-497（1975）、トリオーマ法、ヒトB-細胞ハイブ
リドーマ法（Kozborら、Immunology Today 4：72（198
3）およびEBV-ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCLONAL
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY、７７−９６頁、Alan
R. Liss, Inc.,（1985））が挙げられる。

【００４８】一本鎖抗体を産生するのに記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）を適用して、本発明の
ポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生できる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含め、
他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発現するク
ローンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニ
ティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製し
てもよい。

【００４９】ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドに対する抗
体を用いて、とりわけ、細菌、真菌、原生動物およびウ
イルス感染、特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によっ
て引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；
喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；
閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレ
ルギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分裂
症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れを含む精
神病および神経学的疾患、ならびに、ハンチントン病ま
たはジル・デラ・ツレット（Gilles dela Tourett's）
症候群のごとき運動障害を治療してもよい。

【００５０】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的応答を
誘起する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を生じさせるに十分なＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
ドまたはそのフラグメントを哺乳動物に接種して、とり
わけ、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、特
に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされ
る感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキン
ソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆
症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性
前立腺肥大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精
神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れを含む精神病および神経
学的疾患、ならびに、ハンチントン病またはジル・デラ
・ツレット症候群のごとき運動障害から該動物を防御す
ることからなる方法に関する。本発明のもう１つ別の態
様は、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法で
あって、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドをベクターを介
してデリバリーし、かかる免疫学的応答を誘発させ、抗
体を産生し、該動物を疾患から保護するように、インビ
ボにてＨＭＴＭＦ８１のポリヌクレオチドの発現を指令
することからなる方法に関する。

【００５１】本発明のさらなる態様は免疫学的／ワクチ
ン処方（組成物）であって、哺乳動物宿主中に導入され
た場合、その哺乳動物にてＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を誘導する処方（該組成物はＨ
ＭＴＭＦ８１のポリペプチドまたはＨＭＴＭＦ８１遺伝
子を含んでなる）に関する。ワクチン処方は、さらに適
当な担体を含んでいてもよい。ＨＭＴＭＦ８１のポリペ
プチドは胃で分解されるかもしれないため、好ましくは
非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内注射等を包含す
る）に投与する。非経口投与に適した処方は、抗酸化
剤、バッファー、静菌剤および処方を患者の血液と等張
にする溶質を含有してもよい水性および非水性滅菌注射
用溶液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよ
い水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を１回
投与または複数回投与用容器、例えば、密封アンプルお
よびバイアルに入れて提供してもよく、使用直前に滅菌
液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態にて保存し
てもよい。またワクチン処方は、水中油系および当該分
野で知られた他の系などの処方の免疫原性を高めるため
のアジュバント系を含んでいてもよい。用量は、ワクチ
ンの個々の活性に依存しており、通常の実験により容易
に決定することができる。

【００５２】スクリーニングアッセイ 本発明は、ＬＴＤ４およびＬＴＣ４が低い効力とはいえ
ＨＭＴＭＦ８１ポリペプチドをそれらのレセプターとし
て用いるという新たな知見を包含する。本発明者らは、
ＬＴＤ４およびＬＴＣ４がＨＭＴＭＦ８１発現細胞系に
おいてカルシウム動員応答を引き起こすことを示す実験
を行うことにより、このレセプター／リガンド関係を見
出した。それゆえ、本発明の他の態様では、ヒトＨＭＴ
ＭＦ８１ポリペプチド（レセプター）および／またはそ
れらのリガンド、ＬＴＤ４またはＬＴＣ４、およびそれ
らの相互作用に結合し、活性を活性化（アゴニスト）ま
たは阻害する（アンタゴニスト）化合物についてのスク
リーニング法を提供する。

【００５３】特に、アゴニストまたはアンタゴニストを
同定するための好ましい方法は： （ａ）標識化または非標識化リガンドの存在下、ＨＭＴ
ＭＦ８１のポリペプチド（好ましくは配列番号２のも
の）（該ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドは、該リガンド
の結合に応答し検出可能なシグナルを生成する第２成分
と関連している）をその表面上に発現する細胞を、ヒト
ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドと結合可能な条件下で、
スクリーニングすべき化合物と接触させ；および（ｂ）
化合物とＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドとの相互作用に
より生成されるシグナルの有無を検出することにより、
化合物がＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドと結合し、その
ポリペプチドを活性化するかまたは阻害するかどうかを
測定する工程を含む。さらに好ましい具体例では、リガ
ンドは標識化または非標識化ＬＴＤ４またはＬＴＣ４で
ある。さらなる具体例では、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
チドを発現する細胞は、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド
を生成する能力を有する発現系で細胞をトランスフェク
トすることにより得られる。

【００５４】他の具体例では、アゴニストまたはアンタ
ゴニストを同定する方法は： （ａ）ポリペプチドに結合可能な条件下で、候補化合物
の存在下における、リガンドの、その表面上にＨＭＴＭ
Ｆ８１のポリペプチド（好ましくは配列番号２のもの）
を有する細胞または該ポリペプチドを含む細胞膜への結
合の阻害を測定し；および（ｂ）ポリペプチドに結合す
る該リガンドの量を測定する（リガンドの結合を減少さ
せることのできる化合物はアゴニストまたはアンタゴニ
ストである）工程を含む。好ましくは、リガンドは標識
化または非標識化ＬＴＤ４またはＬＴＣ４である。さら
なる具体例では、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドを有す
る細胞、または該ポリペプチドを含む細胞膜は、ＨＭＴ
ＭＦ８１のポリペプチドを生成する能力を有する発現系
で細胞をトランスフェクトすることにより得られる。

【００５５】より明確には、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
チド（本発明のレセプター）（好ましくは、配列番号２
のもの）は、レセプターと結合し、本発明のレセプター
ポリペプチドの活性を活性化（アゴニスト）または阻害
（アンタゴニスト）する化合物についてのスクリーニン
グ法にて用いてもよい。かくして、本発明のポリペプチ
ドを用いて、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラ
リーおよび天然物の混合物における小型分子基質および
リガンドの結合を評価してもよい。これらの基質および
リガンドは、天然の基質およびリガンドであってもよ
く、あるいは構造または機能を模倣したものであっても
よい。Coliganら、Current Protocols inImmunology 1
（2）：第5章（1991）を参照のこと。

【００５６】一般に、かかるスクリーニング操作は、本
発明のレセプターポリペプチドを細胞表面に発現する適
当な細胞を作り出すことを含む。かかる細胞は、哺乳動
物、酵母、DrosophilaまたはE.coli由来の細胞を包含す
る。特に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレ
オチドを細胞をトランスフェクトし、それによりＨＭＴ
ＭＦ８１のポリペプチドを発現させるのに用いる。つい
で、発現されたレセプターを、試験化合物と接触させて
結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。

【００５７】一つのスクリーニング方法は、本発明のレ
セプターを発現するようにトランスフェクトされた哺乳
動物細胞の使用を包含する。細胞をカルシウムと結合す
ると蛍光シグナルを生じる標示色素でロードし、細胞を
試験基質およびＬＴＤ４またはＬＴＣ４などのレセプタ
ーアゴニストと接触させる。決められた時間の間、たと
えば、蛍光スペクトロホトメーターまたは蛍光イメージ
ングプレートリーダーを用い、蛍光シグナルのいかなる
変化をも測定する。リガンドにより生成される蛍光シグ
ナルパターンの変化は、化合物がレセプターに対する有
効なアンタゴニスト（またはアゴニスト）であることを
示す。

【００５８】他のスクリーニング方法は、ＨＭＴＭＦ８
１のポリペプチド（好ましくは配列番号２のもの）を発
現するようにトランスフェクトされたメラノーマ細胞の
使用を包含する。該スクリーニング方法は、ＰＣＴ／Ｗ
Ｏ９２／０１８１０（１９９２年２月６日公開）に記載
されている。該アッセイを用い、レセプターをコードす
るメラノーマ細胞をＬＴＤ４またはＬＴＣ４などのレセ
プターリガンドおよびスクリーニングすべき化合物の両
方と接触させることにより、本発明のレセプターの活性
を阻害する化合物についてスクリーンすることができ
る。リガンドにより生成されるシグナルの阻害は、化合
物がレセプターの有効なアンタゴニスト、すなわち、レ
セプターの活性を阻害することを示す。

【００５９】該方法を用い、該細胞とスクリーニングす
べき化合物を接触させることにより本発明のレセプター
を活性化する化合物をスクリーンし、および、該化合物
がシグナルを生成するかどうか、すなわちレセプターを
活性化するかどうかを決定することができる。他のスク
リーニング方法には、レセプター活性化によって引き起
こされる細胞外ｐＨ変化を測定する系における、ＨＭＴ
ＭＦ８１のポリペプチドを発現する細胞（例えば、トラ
ンスフェクトされたＣＨＯ、ＣＯＳまたはＨＥＫ細胞）
（好ましくは配列番号２のもの）の使用を包含する。こ
の方法において、化合物を本発明レセプターポリペプチ
ドを発現する細胞に接触させてもよい。ついで、潜在的
化合物がレセプターを活性化または阻害するかどうかを
決定するために、セカンドメッセンジャー応答、例え
ば、シグナルトランスダクション、ｐＨ変化を測定す
る。

【００６０】他のスクリーニング方法には、レセプター
がホスホリパーゼＣまたはＤに結合する、ＨＭＴＭＦ８
１のポリペプチド（好ましくは配列番号２のもの）の発
現が含まれる。該細胞の代表例には、これに限定される
ものではないが、内皮細胞、平滑筋細胞および胎児腎細
胞が含まれる。スクリーニングは、上述したようにホス
ホリパーゼセカンドシグナルからのレセプターの活性化
またはレセプターの活性の阻害を検出することによりな
される。

【００６１】他の方法は、ＬＴＤ４またはＬＴＣ４など
の標識化リガンドのその表面上にレセプターを有する細
胞またはレセプターを含む細胞膜への結合の阻害を決定
することにより、アンタゴニスト、本発明のレセプター
ポリペプチドの活性を阻害する化合物についてのスクリ
ーニングを含む。該方法は、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
チドをコードするＤＮＡでＣＯＳ、ＣＨＯまたはＨＥＫ
２９３などの真核細胞をトランスフェクトし、細胞表面
にレセプターを発現させることを包含する。次いで、Ｌ
ＴＤ４またはＬＴＣ４などの標識化リガンドの存在下、
細胞を潜在的アンタゴニストに接触させる。リガンド
は、たとえば、放射活性などで標識化できる。レセプタ
ーに結合した標識化リガンドの量を、たとえばトランス
フェクトされた細胞またはこれらの細胞由来の膜と関連
する放射活性を測定することにより、測定する。化合物
がレセプターに結合するならば、標識化リガンドのレセ
プターへの結合が、レセプターに結合する標識化リガン
ドの減少により決定されるように、阻害される。この方
法は、結合アッセイと呼ばれる。

【００６２】他のスクリーニング方法には、本発明のレ
セプターを発現するようにトランスフェクトされ、ま
た、レセプターの活性化と関連するレセプター遺伝子構
築物（たとえば、適当なプロモーターの後ろのルシフェ
ラーゼまたはベータガラクトシダーゼ）でもトランスフ
ェクトされた哺乳動物細胞の使用を包含する。細胞を試
験基質およびＬＴＤ４またはＬＴＣ４などのレセプター
アゴニストと接触させ、レセプター遺伝子により生成さ
れたシグナルを特定の時間経過後に測定する。シグナル
は、ルミノメーター、スペクトロメーター、フルオリメ
ーター、または用いた特異的レセプター構築物に対し適
当な他のそのような装置を用いて測定できる。リガンド
により生じるシグナルの阻害は、化合物がレセプターに
対する有効なアンタゴニストであることを示す。

【００６３】他のアンタゴニストまたはアゴニストをス
クリーニングする方法は、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
ドをコードするＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞へ
一次的にまたは安定にレセプターを発現するように導入
することを含む。ついで、レセプター卵母細胞をＬＴＤ
４またはＬＴＣ４などのレセプターリガンド、および、
スクリーニングすべき化合物と接触させる。ついで、レ
セプターの阻害または活性化をｃＡＭＰ、カルシウム、
プロトン、または他のイオンなどのシグナルの検出によ
り測定する。

【００６４】他の方法は、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
ドが媒介するｃＡＭＰおよび／またはアデニレートサイ
クラーゼの蓄積または減少の阻害または促進を測定する
ことによる、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドの阻害剤を
スクリーニングすることを包含する。かかる方法は、Ｈ
ＭＴＭＦ８１のポリペプチドで真核細胞を一次的または
安定にトランスフェクトし、細胞表面にレセプターを発
現させることを包含する。次いで、ＬＴＤ４またはＬＴ
Ｃ４などのＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドリガンドの存
在下、細胞を潜在的アンタゴニストに曝露する。次い
で、ｃＡＭＰの蓄積量を、たとえば、放射−免疫アッセ
イまたはタンパク質結合アッセイ（たとえば、フラッシ
ュプレートまたはシンチレーションプロキシミティアッ
セイを用いて）により測定する。ｃＡＭＰレベルの変化
はまた、破壊細胞調製物中の酵素、アデニリルシクラー
ゼの活性を直接的に測定することによっても決定でき
る。潜在的アンタゴニストがレセプターに結合し、ＨＭ
ＴＭＦ８１のポリペプチド結合を阻害するならば、ＨＭ
ＴＭＦ８１のポリペプチドが媒介するｃＡＭＰまたはア
デニレートサイクラーゼ活性のレベルは減少または増加
するであろう。

【００６５】アゴニストおよびアンタゴニストについて
の他のスクリーニング方法は、酵母、サッカロマイセス
・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae)における
内在フェロモン応答経路による。酵母のヘテロタリック
株は、２種の分裂安定的なハプロイド接合型、ＭＡＴａ
およびＭＡＴａとして存在することができる。各々の細
胞型は、細胞融合の前兆としてＧ１阻止にいたるＭＡＰ
キナーゼカスケードを作動させる反対の接合型細胞上の
Ｇ−タンパク質結合レセプターと結合する、小さなペプ
チドホルモンを分泌する。フェロモン応答経路における
ある遺伝子の遺伝的変化は、フェロモンに対する正常な
応答を変化させ、内在フェロモンレセプターを欠く酵母
細胞中の異種発現およびヒトＧ−タンパク質結合レセプ
ターとヒト化Ｇ−プロテインサブユニットの結合を、下
流のシグナル化経路およびレセプター遺伝子に関連させ
ることができる（たとえば、米国特許第５，０３６，１
５４；５，４８２，８３５；５，６９１，１８８号）。
該遺伝的変化には、これに限定されるものではないが、
（ｉ）内在Ｇ−タンパク質結合フェロモンレセプターを
コードするＳＴＥ２またはＳＴＥ３遺伝子の欠失；(ii)
通常サイクリン（cyclin）依存性キナーゼと関連し細胞
サイクルをとめるタンパク質をコードするＦＡＲ１遺伝
子の欠失；および(iii)ＦＵＳ１遺伝子プロモーターに
融合するレセプター遺伝子の構築(ＦＵＳ１が細胞融合
に必要な膜−結合グリコプロテインをコードする場合)
が含まれる。下流のレセプター遺伝子は、正の生育選択
(たとえば、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３レセプターを用いるヒ
スチジンプロトトロピー）、または用いた個々のレセプ
ター構築物（たとえば、ＦＵＳ１−ＬａｃＺレセプター
を用いるｂ−ガラクトシダーゼ誘導)に応じ、色度的、
蛍光的、スペクトロ光度的な読み取りを可能とする。

【００６６】酵母細胞は、さらに、ランダムペプチドラ
イブラリー由来の、いくつかは、異種的に発現されたヒ
ト(または哺乳動物)Ｇ−タンパク質結合レセプターのオ
ートクライン活性化を可能とする、小さなペプチドを発
現し、分泌するように、操作することができる（Broac
h, J. R. and Thorner, J. Nature 384:14-16,1996; Ma
nfredi,ら, Mol. Cell. Biol. 16:4700-4709, 1996)。
これにより、特徴付けられたまたはオーファンレセプタ
ーを活性化する代替のペプチドアゴニストについての迅
速な直接生育選択(たとえば、ＦＵＳ１−ＨＩＳ３レセ
プターを用いて)が提供される。別に、レセプター遺伝
子読み取りに結合したヒト(または哺乳動物)Ｇ−タンパ
ク質結合レセプターを機能的に発現する酵母細胞を公知
のリガンド、生物学的抽出物のフラクションおよび天然
のまたは代替のリガンドに対する化学物質のライブラリ
の高処理スクリーニングのために用いることができる。
十分に有効な機能的アゴニスト(天然または代替の)を、
Ｇ−タンパク質結合レセプターアンタゴニストを同定す
るための酵母細胞基礎のアッセイにおいてスクリーニン
グ手段として用いることができる。この目的について、
その使用の容易さおよびしばしばアゴニストまたはアン
タゴニストを同定する能力を妨げるヌルレセプターバッ
クグランド（内在Ｇ−質結合レセプターの欠損）によ
り、酵母系は、哺乳動物発現系において有利性を提供す
る。

【００６７】本発明は、また、ＨＭＴＭＦ８１のポリペ
プチドに結合できることについて知られていないリガン
ドが該レセプターに結合できるかどうかを決定するため
の方法であって、候補リガンドがＨＭＴＭＦ８１ポリペ
プチドに結合することが可能な条件下で、ＨＭＴＭＦ８
１のポリペプチドを発現する哺乳動物細胞とＬＴＤ４ま
たはＬＴＣ４などのリガンドと接触させ、レセプターと
結合する候補リガンドの存在を検出し、それにより、リ
ガンドがＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドと結合するかど
うかを決定することを含む、方法を提供する。ここで上
記したアゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定
するためのシステムは、レセプターに結合するリガンド
の決定にも適用できる。

【００６８】潜在的なＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドア
ンタゴニストの例は、抗体、またはある場合には、レセ
プターの活性が妨げられるように、該レセプターに結合
するが、セカンドメッセンジャー応答を惹起しない、オ
リゴヌクレオチドを包含する。潜在的なアンタゴニスト
には、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドのリガンドと密接
に関連する化合物、すなわち生物学的機能を欠損してお
り、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドに結合すると何ら応
答を惹起しないリガンドのアナログ、が含まれる。

【００６９】他の潜在的なアゴニストは、ＨＭＴＭＦ８
１のポリペプチドと結合し、正常の生物学的活性が妨げ
られるようにＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド（レセプタ
ー）がリガンドと近づけないようにする、小型分子であ
る。また、潜在的なアゴニストには、ＨＭＴＭＦ８１の
ポリペプチドの可溶性型、たとえば、リガンドと結合
し、リガンドの膜結合ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドと
相互作用を妨げるポリペプチドのフラグメント、が含ま
れる。また、潜在的なアンタゴニストには、ＬＴＤ４ま
たはＬＴＣ４に結合し、リガンドのＨＭＴＭＦ８１レセ
プターとの結合または活性化を妨げる抗体が含まれる。

【００７０】それゆえ、他の態様において、本発明は、
ＨＭＴＭＦ８１、ＬＴＤ４およびＬＴＣ４のポリペプチ
ドについてのアゴニスト、アンタゴニスト、および／ま
たはリガンド、および、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド
ペプチドとＬＴＤ４またはＬＴＣ４との相互作用につい
てのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための
スクリーニング用キットであって、 （ａ）ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド、好ましくは配列
番号２のポリペプチドおよびさらに好ましくは標識化ま
たは非標識化ＬＴＤ４またはＬＴＣ４を含む； （ｂ）ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド、好ましくは配列
番号2のポリペプチドを発現する組換え細胞およびさら
に好ましくは標識化または非標識化ＬＴＤ４またはＬＴ
Ｃ４を含む； （ｃ）ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド、好ましくは配列
番号2のポリペプチドを発現する細胞膜およびさらに好
ましくは標識化または非標識化ＬＴＤ４またはＬＴＣ４
を含む；を有してなるスクリーニング用キットに関す
る。このようないずれのキットにおいても、（ａ）、
（ｂ）または（ｃ）が実質的な成分からなることは明ら
かであろう。

【００７１】予防および治療方法 本発明は、過剰および不十分な量の両方のＨＭＴＭＦ８
１活性に関連する、異常な症状の治療方法を提供する。
ＨＭＴＭＦ８１活性が過剰な場合、いくつかの方法を用
いることができる。１の方法は、リガンドのＨＭＴＭＦ
８１との結合を遮断することにより、または別のシグナ
ルを阻害することにより活性化を阻害するのに効果的な
量の前記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許
容される担体と共に対象に投与し、そのことにより異常
な症状を改善することからなる。もう１つ別の方法にお
いて、内在性ＨＭＴＭＦ８１と競争してリガンドとの結
合能を有する可溶形のＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドを
投与してもよい。かかる競争物質の典型例はＨＭＴＭＦ
８１のポリペプチドのフラグメントからなる。

【００７２】さらにもう１つ別の方法において、発現遮
断法を用いて内在性ＨＭＴＭＦ８１をコードする遺伝子
の発現を阻害してもよい。公知のかかる方法は、内部生
成した、あるいは別個に投与されたアンチセンス配列の
使用を含む。例えば、Oligodeoxynucleotides as Antis
ense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boc
a Raton, FL（1988）中、O'Connor、J.Neurochem 56：5
60（1991）を参照のこと。別法として、遺伝子と共に三
重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給すること
もできる。例えば、Leeら、Nucleic Acids Res 6：3073
（1979）；Cooneyら、Science 241：456（1988）；Derv
anら、Science 251：1360（1991）を参照のこと。これ
らのオリゴマーはそれ自体投与することができ、あるい
は関連するオリゴマーをインビボで発現させることもで
きる。

【００７３】ＨＭＴＭＦ８１およびその活性の過少発現
に関連する異常な症状を治療するのに、またいくつかの
方法が利用可能である。１の方法は、ＨＭＴＭＦ８１を
活性化する治療上有効量の化合物（すなわち、前記のア
ゴニスト）を医薬上許容される担体とともに対象に投与
し、そのことにより異常な状態を改善することからな
る。別法として、遺伝子治療を用いて、対象中の関連細
胞によるＨＭＴＭＦ８１の内因的生成を有効ならしめて
もよい。例えば、前記のごとく、複製欠損レトロウイル
スベクターにて発現するように、本発明のポリヌクレオ
チドを操作してもよい。ついで、該レトロウイルス発現
構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲ
ＮＡ含有のレトロウイルスプラスミドベクターでトラン
スダクションしたパッケージング細胞中に導入して、パ
ッケージング細胞が目的とする遺伝子を含む感染性ウイ
ルス粒子を生成するようにしてもよい。これらのプロデ
ューサー細胞を対象に投与して細胞をインビボで操作
し、インビボでポリペプチドを発現するようにしてもよ
い。遺伝子治療の概説としては、Human Molecular Gene
tics,T.Strachan and A. P. Read, BIOS Scientific Pu
blishers Ltd（1996）中、第２０章、Gene Therapy and
other Molecular Genetic-based Therapeutic Approac
hes（およびその中の引用文献）を参照のこと。

【００７４】処方および投与 可溶形のＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドのごときペプチ
ド（ポリペプチド）、ならびにアゴニストおよびアンタ
ゴニストペプチドを、適当な医薬担体と組み合わせて処
方してもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプ
チドまたは化合物、および医薬上許容される担体または
賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、食塩水、緩
衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびその組み合わせを包含するが、これらに限
定されない。処方は投与経路に適したものとすべきであ
り、当業者によく知られている。さらに本発明は、前記
した本発明の組成物の１種またはそれ以上の成分を充填
した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パッ
クおよびキットにも関する。

【００７５】本発明のポリペプチドおよび他の化合物は
単独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他
の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身系
投与の好ましい形態は、典型的には静脈注射による注射
を包含する。皮下、筋肉内または腹腔内などの他の注射
経路を用いることもできる。全身系投与のための別の手
段は、胆汁酸塩またはフシジン酸などの浸透剤または他
の界面活性剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含す
る。加えて、腸溶処方またはカプセル処方にうまく処方
されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物
の投与は、膏薬、パスタ、ゲル等の形態にて、局所的お
よび／または局在化であってもよい。

【００７６】必要な用量範囲は、ペプチドの選択、投与
経路、処方の性質、対象の症状の性質、および顧問医の
判断に依存する。しかしながら、適当な用量は対象１ｋ
ｇ当たり０.１ないし１００μｇの範囲である。しか
し、使用可能な種々の化合物および種々の投与経路の効
力の違いを考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思
われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量
が必要であると考えられる。当該分野においてよく知ら
れた最適化のための標準的な経験的慣用操作を用いてこ
れらの用量の変更を行うことができる。しばしば「遺伝
子治療」と称される前記した治療方法において、治療に
用いられるポリペプチドを対象中において内在的に得る
こともできる。よって、例えば、レトロウイルスプラス
ミドベクターを用いて対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲ
ＮＡなどのポリヌクレオチドで操作し、ポリペプチドを
エクスビボでコードしてもよい。ついで、細胞を対象に
導入する。

【００７７】

【実施例】以下の実施例は、特記する場合を除き、当業
者に周知かつ慣用的な、標準方法を用いて行う。実施例
は例示であって、本発明を限定するものではない。

【００７８】実施例１ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる、７−ＴＭドメインを
コードするｃＤＮＡ配列を伴う発現配列タグ（ＥＳＴ）
として知られる短い配列からなるヒトゲノムサイエンス
由来のランダムｃＤＮＡ配列データベースのサーチは、
７−膜貫通レセプター様血小板活性化因子（ＰＡＦ）と
相同性を有するＥＳＴを示した。さらに、配列決定デー
タの解析から、Ｍｅｔおよび膜貫通ドメイン１、２、３
および４が続く上流のストップコドンの存在が示され
た。クローンは、３’ＤＮＡ配列を欠いていた（ＴＭ
５、６、７、カルボキシ末端およびストップコドン）。
完全な３’末端配列を得るために、３’ＲＡＣＥ ＰＣ
Ｒ（Life Technologies)を遺伝子特異的プライマーおよ
びヒト白血球プラスミドライブラリーを用いて行った。
ＰＣＲバンドをＰＣＲ２．１ベクター（Invitrogen)に
サブクローンし、配列決定した。ＤＮＡ配列のアセンブ
リーおよびさらなる解析から、完全長クローンが示唆さ
れた。ＧＣＧソフトウェアを用いるＤＮＡ配列のマップ
解析から、３３７アミノ酸残基を含むオープンリーディ
ングフレーム(ＯＲＦ）が示唆された。ＦＡＳＴＡおよ
びＢＬＡＳＴアルゴリズムによるさらなるＤＮＡ配列の
解析から、このポリペプチド配列と７−膜貫通様Ｇ−タ
ンパク質結合レセプターとの相同性が示された。加え
て、レーザージーン・プロテアン・ソフトウェア（lase
rgeneprotean software)を用いる疎水性プロット解析に
より、Ｇ−タンパク質結合レセプターと共通のいくつか
の特徴が示された。もっとも顕著には、レセプターのＧ
−タンパク質結合スーパーファミリー間で見られる７−
膜貫通構造トポロジーを提供する膜スパンニングドメイ
ンを表すであろう、各々、約２０−３０アミノ酸の疎水
性領域の存在である。クローンの同定をさらに確証する
ために、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）
を用いて遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを作成し、ＤＮ
Ａ配列を２種のライブラリー(ヒト白血球およびヒト脾
臓）から増幅した。正確な大きさのＰＣＲバンドがInvi
trogen（San Diego, CA)からのＰＣＲ２．１ベクターに
サブクローンされ、配列決定された。

【００７９】実施例２： 哺乳動物細胞発現 本発明レセプターを、ヒト・胎児腎２９３（ＨＥＫ２９
３）細胞または付着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞のいずれかで
発現させる。レセプター発現を最大にするために、典型
的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクター中に挿入
する前に、すべての５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ
ｓ）をレセプターｃＤＮＡから除去する。リポフェクチ
ンによって細胞を個々のレセプターｃＤＮＡでトランス
フェクションし、４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下
選択する。選択後３週間で、個々のクローンを拾い上
げ、さらなる解析を行う。ベクターのみでトランスフェ
クションしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞をネガティ
ブ対照として用いる。個々のレセプターを安定に発現す
る細胞系を単離するために、典型的に約２４個のクロー
ンを選択し、次いで、ノザンブロット解析によって解析
する。一般に、レセプターｍＲＮＡは、解析したＧ４１
８耐性クローンの約５０％において検出される。

【００８０】実施例３： 結合および機能アッセイのた
めのリガンドバンク 推定の２００を超えるレセプターリガンドのバンクをス
クリーニングのために作成した。そのバンクは、ヒト・
７膜貫通（７ＴＭ）レセプターを介して作用することが
知られているトランスミッター、ホルモンおよびケモカ
イン；ヒト・７ＴＭレセプターの推定アゴニストであっ
てもよい天然化合物、哺乳動物での対応物がまだ同定さ
れていない非哺乳動物の生物学的活性ペプチド；およ
び、天然には見いだされないが、未知の天然リガンドと
ともに７ＴＭレセプターを活性化する化合物を含んでな
る。最初に、このバンクを使用して、結合アッセイと同
様、２機能性（即ち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロ
フィジオメーター、卵母細胞電気生理学など以下参照）
を用いて、既知のリガンドのためのレセプターをスクリ
ーニングする。

【００８１】実施例４： リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、レセプター薬理学を確認する
ための直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適
合する。精製されたレセプターリガンドは、結合研究の
ために高比活性（５０-２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放
射性ラベルされる。ついで、放射性ラベルの工程がリガ
ンドのレセプターに対する活性を消失させないように測
定が行われる。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチ
ドのごとき他のモジュレーターに関するアッセイ条件が
最適化され、膜および全細胞レセプター供給源のいずれ
についても使用可能なシグナル対ノイズ比を確立する。
これらのアッセイについて、全結合放射活性から過剰の
非ラベル競合リガンドの存在下で測定された放射活性を
引いたものとして、特異的なレセプター結合が定義され
る。可能ならば、一つ以上のリガンドを使用して、残存
する非特異的結合を定義する。

【００８２】実施例５： アフリカツメガエル卵母細胞
での機能アッセイ 標準的方法に従って、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、本
発明レセプターｃＤＮＡをコードする直鎖状にされたプ
ラスミド鋳型からのキャップＲＮＡ転写物をインビトロ
で合成する。インビトロ転写物を最終濃度０.２ｍｇ／
ｍｌになるように水に懸濁する。成体メスのヒキガエル
から卵巣葉を取り出し、ステージＶの脱胞卵母細胞を得
て、マイクロインジェクション装置を用いて、ＲＮＡ転
写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５０ｎｌボウルス（bolu
s）で注入する。２つの電極電圧クランプを使用して、
アゴニスト曝露に応答した個々のアフリカツメガエル卵
母細胞からの電流を測定する。室温でＣａ２＋を含まな
いバース培地（Barth's medium）中で記録する。アフリ
カツメガエルの系は、既知のリガンドおよび活性化リガ
ンドについて組織／細胞抽出物をスクリーニングするた
めに使用することができる。

【００８３】実施例６： 微小生理機能測定アッセイ 非常に多様なセカンドメッセンジャー系の活性化によ
り、細胞から少量の酸の放出が起こる。生成した酸は、
主に、細胞内シグナル伝達工程にエネルギーを供給する
ために必要な代謝活性を増大させる。細胞の周りの培地
のｐＨ変化は非常に小さいが、CYTOSENSOR微小生理機能
測定器（Molecular Devices Ltd., MenloPark, CA）に
よって検出可能である。かくして、CYTOSENSORは、本発
明レセプターに共役したＧタンパク質のごとく、細胞内
シグナル伝達経路を使用するエネルギーに共役している
レセプターの活性化を検出することができる。

【００８４】実施例７： 抽出物／細胞上清スクリーニ
ング 多数の哺乳動物レセプターが存在し、それらについて未
だに同種の活性化リガンド（アゴニスト）は残っていな
い。かくして、これらのレセプターの活性リガンドは、
現在までに同定されたリガンドバンク中に包含されてい
なくてもよい。従って、天然のリガンドを同定するため
に組織抽出物に対して本発明７ＴＭレセプターを（カル
シウム、ｃＡＭＰ、微小生理機能測定器、卵母細胞電気
生理学など機能的スクリーニングを使用して）機能的に
もスクリーニングする。活性化リガンドが単離同定され
るまで、陽性の機能応答を生じる抽出物を連続して分画
することができる。

【００８５】実施例８： カルシウムおよびｃＡＭＰの
機能アッセイ ＨＥＫ２９３細胞において発現している７ＴＭレセプタ
ーは、ＰＬＣの活性化およびカルシウムの移動、および
／またはｃＡＭＰ刺激または阻害に機能的に共役してい
ることが示されている。レセプタートランスフェクショ
ンまたはベクター制御細胞におけるＨＥＫ２９３細胞の
基礎的カルシウムレベルは、正常には１００ｎＭないし
２００ｎＭの範囲内で観察された。組換えレセプターを
発現しているＨＥＫ２９３細胞をｆｕｒａ２で負荷し、
カルシウム移動を誘導するアゴニストについて、１日で
１５０を超えるリガンドを選択し、または組織／細胞抽
出物を評価する。同様に、組換えレセプターを発現して
いるＨＥＫ２９３細胞を、標準的ｃＡＭＰ定量アッセイ
を用いてｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について評価す
る。応答がレセプターを発現しているトランスフェクシ
ョンされた細胞でのみ起こっているのかどうかを調べる
ために、ベクター制御細胞において、カルシウムの一時
的変動またはｃＡＭＰ変動を引き起こすアゴニストを試
験する。

【００８６】

【配列表】（１）一般的情報 （ｉｉ）発明の名称：新規ヒト７−膜貫通レセプターを
コードするｃＤＮＡクローンＨＭＴＭＦ８１ （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）郵送先 （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 私
書箱１５３９ （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体形態：ディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ウィンドウズ用 Fast SEQ バー
ジョン２.０ （ｖ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類番号： （ｖｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・ティ （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＨ−７０００１−
１ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：

【００８７】（２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５７８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： CGGCCGCCAG TGTGATGGAT ATCTGCAGAA TTCGGCTTTA CGGCTGCGAG AAGACGACAG 60 AAGGGGGAGG AAGAAGAATC TGTATATCTG TATATATTGG CTAGCAAATG TGCCCTGCTC 120 TCTCCCCTCT TAAAAATAGC AGCAACCCAT CTTTGCAAAG AAGCTTGCCT ATAGAGCAGG 180 CACTCTGTGA ATGGACTGTG CTTTTACGAC CCTACAGGGT ATCAAGATAC TGTGCAGCTC 240 GCCAACAAGG ATTAATTGCA AGGACTGGTA GATCGAATTT ACTGAAGACT TGGAGCTTGC 300 TTCTGAGAAC AAACGCAAAA GGACAGTAAA CTGTGGACCT TGAAGTTAGC AGCGTGGGCT 360 TCCTCTAATA TTACACCGTA AAAGGCATTG ATCACCATAA GAAGGAACAT TTGTGAAGGT 420 ACTCCAGTGC CAGAAAGAGG CACAAAGCAG ACATTCGTAG AGAAACATGG ATGAAACAGG 480 AAATCTGACA GTATCTTCTG CCACATGCCA TGACACTATT GATGACTTCC GCAATCAAGT 540 GTATTCCACC TTGTACTCTA TGATCTCTGT TGTAGGCTTC TTTGGCAATG GCTTTGTGCT 600 CTATGTCCTC ATAAAAACCT ATCACAAGAA GTCAGCCTTC CAAGTATACA TGATTAATTT 660 AGCAGTAGCA GATCTACTTT GTGTGTGCAC ACTGCCTCTC CGTGTGGTCT ATTATGTCCA 720 CAAAGGCATT TGGCTCTTTG GTGACTTCTT GTGCCGCCTC AGCACCTATG CTTTGTATGT 780 CAACCTCTAT TGTAGCATCT TCTTTATGAC AGCCATGAGC TTTTTCCGGT GCATTGCAAT 840 TGTTTTTCCA GTCCAGAACA TTAATTTGGT TACACAGAAA AAAGCCAGGT TTGTGTGTGT 900 AGGTATTTGG ATTTTTGTGA TTTTGACCAG TTCTCCATTT CTAATGGCCA AACCACAAAA 960 AGATGGGAAA AATAATACCA AGTGCTTTGA GCCCCCACAA GACAATCAAA CTAAAAATCA 1020 TGTTTTGGTC TTGCATTATG TGTCATTGTT TGTTGGCTTT ATCATCCCTT TTGTTATTAT 1080 AATTGTCTGT TACACAATGA TCATTTTGAC CTTACTAAAA AAATCAATGA AAAAAAATCT 1140 GTCAAGTCAT AAAAAGGCTA TAGGAATGAT CATGGTCGTG ACCGCTGCCT TTTTAGTCAG 1200 TTTCATGCCA TATCATATTC AACGTACCAT TCACCTTCAT TTTTTACACA ATGAAACTAA 1260 ACCCTGTGAT TCTGTCCTTA GAATGCAGAA GTCCGTGGTC ATAACCTTGT CTCTGGCTGC 1320 ATCCAATTGT TGCTTTGACC CTCTCCTATA TTTCTTTTCT GGGGGTAACT TTAGGAAAAG 1380 GCTGTCTACA TTTAGAAAGC ATTCTTTGTC CAGCGTGACT TATGTACCCA GAAAGAAGGC 1440 CTCTTTGCCA GAAAAAGGAG AAGAAATATG TAAAGTATAG TTTAAACCAT TTCCAGTCCA 1500 AACCAATGAA AATAGTTTCC CAAATAAGTA TTTTGTCAAA TCATTTACAA AAAAAAAAAA 1560 AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1578

【００８８】（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３３７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｐ １ ５
１０ １５ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ ２０ ２５
３０ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ ３５ ４０
４５ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ａｓｎ ５０ ５５
６０ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ ６５ ７０
７５ ８０ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｒｐ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ ８５
９０ ９５ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ １００ １０５
１１０ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ
Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｐｒｏ １１５ １２０
１２５ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ １３０ １３５
１４０ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｍｅｔ １４５ １５０
１５５ １６０ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ １６５
１７０ １７５ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｖａｌ １８０ １８５
１９０ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｃｙｓ １９５ ２００
２０５ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ ２１０ ２１５
２２０ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ ２４５
２５０ ２５５ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ ２６０ ２６５
２７０ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｃｙｓ ２７５ ２８０
２８５ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ ２９０ ２９５
３００ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｖａｌ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｌｙｓ ３２５
３３０ ３３５ Ｖａｌ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＡＭ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＡＭ ＡＡＮ ＡＡＮ ＡＢＪ ＡＢＪ ＡＢＮ ＡＢＮ ＡＢＳ ＡＢＳ ＡＢＵ ＡＢＵ ＡＢＶ ＡＢＶ ＡＣＤ ＡＣＤ ＡＣＬ ＡＣＬ ＡＣＮ ＡＣＮ ＡＣＸ ＡＣＸ ＡＤＦ ＡＤＦ ＡＤＴ ＡＤＴ ＡＤＵ ＡＤＵ ＡＤＹ ＡＤＹ ＡＤＺ ＡＤＺ ＡＥＢ ＡＥＢ 39/395 39/395 Ｍ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595047190 スミスクライン・ビーチャム・パブリッ ク・リミテッド・カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ. イギリス国ミドルセックス・ティーダブリ ュ８・９イーピー、ブレンフォード、ニュ ー・ホライズンズ・コート（番地の表示な し) (72)発明者 キャサリン・イー・エリス アメリカ合衆国08028ニュージャージー州 グラスボロー、フォーダム・プレイス831 番 (72)発明者 ウェンディ・ハルシー アメリカ合衆国19348ペンシルベニア州ケ ネット・スクエア、ベイヤード・ロード 435番 (72)発明者 ギャネシュ・エム・サザ アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、ハンターズ・ルー ン107番 (72)発明者 ロバート・エイムズ アメリカ合衆国19083ペンシルベニア州ハ ーバータウン、エリス・アベニュー276番 (72)発明者 ジョン・チェンバーズ イギリス、ケンブリッジ、ハスリングフィ ールド、バッドコック・ロード32番 (72)発明者 ジェイムズ・ジェイ・フォリー アメリカ合衆国19087ペンシルベニア州ラ ドナー、ティモシー・サークル117番 (72)発明者 ヘンリー・エム・サロー アメリカ合衆国19438ペンシルベニア州ハ ーリーズビル、メイプル・アベニュー348 番

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
   チドをコードするヌクレオチド配列とその全長にわたっ
   て少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列
   からなる単離されたポリヌクレオチド、またはその単離
   ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項1記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれ
   るヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一である請求
   項1記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列が配列番号1に含まれ
   るＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドをコードする配列を含
   む請求項3記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号１のポリヌクレオチドである請
   求項３記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 発現系を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ
   分子であって、該発現系が適合可能な宿主細胞中にある
   場合に、その発現系が配列番号2のポリペプチドと少な
   くとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してな
   るＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドを産生することができ
   るＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項６記載の発現系を有してなる宿主
   細胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載の宿主を、ポリペプチドを
   産生するのに十分な条件下で培養し、そのポリペプチド
   を培養物から回収することからなるＨＭＴＭＦ８１のポ
   リペプチドの産生法。
9. 【請求項９】 ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドを産生す
   る細胞の産生法であって、宿主細胞が、適当な培養条件
   下、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドを産生するように、
   該宿主細胞を請求項６記載の発現系で形質転換またはト
   ランスフェクションすることからなる方法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列とその全長
    にわたって少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を
    含むＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列を含む請求
    項１０記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載のＨＭＴＭＦ８１のポ
    リペプチドに免疫特異的な抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載のＨＭＴＭＦ８１のポ
    リペプチドの活性または発現を強化する必要性のある対
    象の治療法であって、 （ａ）該対象に治療上有効量の該レセプターに対するア
    ゴニストを投与し；および／または（ｂ）インビボにて
    該レセプター活性を生成するような形態にて請求項１記
    載のポリヌクレオチドを対象に付与することからなる方
    法。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載のＨＭＴＭＦ８１のポ
    リペプチドの活性または発現を阻害する必要性のある対
    象の治療法であって、 （ａ）該対象に治療上有効量の該レセプターに対するア
    ンタゴニストを投与し；および／または（ｂ）該対象に
    該レセプターをコードするヌクレオチド配列の発現を阻
    害する核酸分子を投与し；および／または（ｃ）該対象
    にそのリガンドについて該レセプターと競合する治療上
    有効量のポリペプチドを投与することからなる方法。
15. 【請求項１５】 対象での請求項１０記載のＨＭＴＭＦ
    ８１のポリペプチドの発現または活性に関連付けられる
    対象の疾患または疾患への罹病し易さの診断方法であっ
    て、 （ａ）該対象のゲノム中のＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
    ドをコードするヌクレオチド配列における変異の有無を
    測定し；および／または（ｂ）該対象由来の試料中のＨ
    ＭＴＭＦ８１のポリペプチドの発現の存在または量につ
    いて分析することからなる方法。
16. 【請求項１６】 ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド、ＬＴ
    Ｄ４リガンドまたはＬＴＣ４リガンド、またはＨＭＴＭ
    Ｆ８１のポリペプチドとＬＴＤ４リガンドまたはＬＴＣ
    ４リガンドとの相互作用のアゴニストまたはアンタゴニ
    ストの同定方法であって、 （ａ）標識化または非標識化ＬＴＤ４リガンドまたはＬ
    ＴＣ４リガンドの存在下、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチ
    ド（該ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドは、該リガンドと
    の結合に応答し検出可能なシグナルを生成する２番目の
    構成成分と結合している）をその表面上に発現する請求
    項７記載の宿主細胞を、該ＨＭＴＭＦ８１ポリペプチド
    と結合可能な条件下で、スクリーニングすべき化合物と
    接触させ、 （ｂ）該化合物とＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドとの相
    互作用により生成されるシグナルの有無を検出すること
    により、ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドと結合し、その
    ポリペプチドを活性化するかまたは阻害するかどうかを
    測定することからなる方法。
17. 【請求項１７】 ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド、ＬＴ
    Ｄ４リガンドまたはＬＴＣ４リガンド、またはＨＭＴＭ
    Ｆ８１ポリペプチドとＬＴＤ４リガンドまたはＬＴＣ4
    リガンドとの相互作用のアゴニストまたはアンタゴニス
    トの同定方法であって、 （ａ）ポリペプチドに結合可能な条件下でスクリーニン
    グすべき化合物の存在下にて、標識化または非標識化Ｌ
    ＴＤ４リガンドまたはＬＴＣ４リガンドの、その表面上
    にポリペプチドを有する請求項７記載の宿主細胞または
    該ポリペプチドを含む細胞膜への結合の阻害を測定し、 （ｂ）ポリペプチドに結合する該リガンドの量を測定す
    る（リガンドの結合を減少させることのできる化合物は
    アゴニストまたはアンタゴニストである）ことからなる
    方法。
18. 【請求項１８】 ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチド、ＬＴ
    Ｄ４およびＬＴＣ４に対するアゴニスト、アンタゴニス
    ト、および／またはリガンド、および、ＨＭＴＭＦ８１
    のポリペプチドとＬＴＤ４またはＬＴＣ４との相互作用
    に対するアゴニストまたはアンタゴニストを同定するた
    めのスクリーニングキットであって、（ａ）ＨＭＴＭＦ
    ８１のポリペプチド、および標識化または非標識化ＬＴ
    Ｄ４またはＬＴＣ４；（ｂ）ＨＭＴＭＦ８１のポリペプ
    チドを発現する組換え細胞、および標識化または非標識
    化ＬＴＤ４またはＬＴＣ４；または（ｃ）ＨＭＴＭＦ８
    １のポリペプチドを発現する細胞膜、および標識化また
    は非標識化ＬＴＤ４またはＬＴＣ４を含むスクリーニン
    グキット。
19. 【請求項１９】 ＨＭＴＭＦ８１のポリペプチドに対す
    るアゴニストの同定方法であって、（ａ）ＨＭＴＭＦ８
    １のポリペプチドを発現する請求項７記載の宿主細胞を
    候補化合物と接触させ、（ｂ）候補化合物がＨＭＴＭＦ
    ８１のポリペプチドの活性化により生成するシグナルに
    作用するかどうかを測定することからなる方法。
20. 【請求項２０】 請求項１６、１７または１９に記載の
    方法により同定されるアゴニスト。
21. 【請求項２１】 請求項１６、１７または１９に記載の
    方法により同定されるアンタゴニスト。