ES2314272T3 - Metodos para el diagnostico y el tratamiento del cancer. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto representado por la fórmula estructural: (Ver fórmula) o una sal o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, en la que: X es CH o N; Y es seleccionado del grupo que consta de C, CH o N, y cuando Y es CH o N, el enlace covalente opcional (representado por la línea de puntos entre los anillos II y IV) está ausente, y cuando Y es C, está presente ese enlace covalente opcional; G es (CHR 4 )n o C(=O); R es seleccionado del grupo que consta de alquilo no sustituido, alquilo sustituido con un heterociclilo, -N(R 4 )2 donde los dos restos R 4 pueden ser iguales o diferentes, y -OR 4 , donde dicho heterociclilo puede no estar sustituido o estar sustituido opcionalmente con uno o más restos que pueden ser iguales o diferentes, siendo cada uno de ellos seleccionado independientemente del grupo que consta de alquilo, arilo, -OR 4 , -N(R 4 )2 donde los dos restos R 4 pueden ser iguales o diferentes, -C(O)R 4 y -C(O)N(R 4 )2 donde los dos restos R 4 pueden ser iguales o diferentes; la posición a del anillo I es N o N + O-, y las posiciones b, c y d restantes representan C(R 1 ) o C(R 2 ); R 1 y R 2 pueden ser iguales o diferentes, siendo cada uno de ellos seleccionado independientemente del grupo que consta de: H, halo, -CF3, -OR 4 , -C(O)R 4 , -OCF 3 , -SR 4 , -S(O)nR 5 , benzotriazol-1-iloxi, tetrazol-5-iltio, alquinilo, alquenilo, donde dicho alquenilo puede estar sin sustituir o sustituido opcionalmente con halo, -OR 4 o -C (O)OR 4 , alquilo, donde dicho alquilo puede estar sin sustituir o sustituido opcionalmente con halo, -OR 4 o -C(O)OR 4 , -N(R 4 )2, donde los dos restos R 4 pueden ser iguales o diferentes, -NO2, -OC(O)R 5 , -C(O)OR 4 , -CN, -N(R 4 )C(O)OR 4 , -SR 5 C(O)OR 4 y -SR 5 N(R 4 )2 (siempre que R 5 en -SR 5 N(R 4 )2 no sea -CH2-), donde cada R 4 es seleccionado independientemente; la línea de puntos entre los átomos de carbono 5 y 6 representa un enlace opcional, de tal manera que cuando está presente un doble enlace, A y B pueden ser iguales o diferentes, siendo cada uno de ellos seleccionado independientemente del grupo que consta de -R 4 , halo, -OR 4 , -C(O)OR 4 , -OC(O)OR 4 o -OC(O)R 4 , y cuando no está presente un doble enlace entre los átomos de carbono 5 y 6, A y B pueden ser iguales o diferentes, siendo cada uno de ellos seleccionado independientemente del grupo que consta de (H2), -(OR 5 )2, (H y halo), (dihalo), (H y R 5 ), (R 5 )2, (H y -OC(O)R 4 ), (H y -OR 4 ), (=O) y (H, (=NOR 4 ) o (-O-(CH2)p-O-) donde p es 2, 3 ó 4); R 3 es seleccionado del grupo que consta de H, alquilo, alcoxi y alcoxialquilo; R 4 es seleccionado del grupo que consta de H, alquilo, arilo y aralquilo; R 5 es alquilo o arilo; R 6 es H o alquilo; n es un número de 1 a 4; q es un número de 1 a 8; y en la cual el alquilo contiene de 1 a 20 átomos de carbono en la cadena; el arilo contiene de 6 a 14 átomos de carbono; el heteroarilo contiene de 5 a 14 átomos en el anillo; el cicloalquilo contiene de 3 a 10 átomos de carbono y el heterociclilo contiene de 3 a 10 átomos en el anillo.
Description
Métodos para el diagnóstico y el tratamiento del
cáncer.
Ya se ha estudiado gran variedad de marcadores
moleculares y dependientes de la morfología en cuanto a su
capacidad para predecir el resultado de la enfermedad en casos de
cáncer de próstata (Isaacs y col. (1997) Am. J. Pathol. 150:
1511-1521; Koch y col. (2000) J. Urol. 164:
749-753; Alers y col. (2000) Lab. Invest.
80: 931-942). Las medidas dependientes de la
morfología tradicionales incluyen el grado del tumor, su volumen y
su etapa patológica. Se han propuesto numerosos marcadores
moleculares por su utilidad clínica potencial, incluyendo la
determinación de p21, p27, ciclina D1, p53, bcl-2,
E-cadherina, HER-2/neu,
metaloproteasas de matriz, telomerasa, GST-Tc
(Isaacs y col. (1997) supra; Koch y col. (2000) supra;
Alers y col. (2000) supra; Ross y col. (2002) Exp. Rev.
Mol. Diagn. 2: 129-142; Stattin y col. (1997)
Scand J Urol Nephrol Suppl. 185: 1-46). Sin
embargo, la amplia utilización de estos marcadores para la
individualización de la terapia se ha visto obstaculizada por
diversos factores, incluyendo una falta de aceptación general de la
relevancia de sus pronósticos, problemas referentes a la
especificidad y sensibilidad de las plataformas de ensayo
disponibles para cada marcador y el limitado tejido disponible.
El antígeno de membrana específico de la
próstata (PSMA) es una folato-hidrolasa
transmembrana consistente en 750 aminoácidos con un peso molecular
de 110 kDa (Israeli y col. (1994) Cancer Res. 54:
1807-1811; Murphy y col. (1998) J. Urol.
160:2396-2401; Tasch y col. (2001) Crit. Rev.
Immunol 21: 249-261). La expresión del PSMA ha
sido demostrada sistemáticamente mediante inmunohistoquímica (IHC) y
otras técnicas en tejidos prostáticos normales e hiperplásicos, en
neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y en carcinomas invasivos
(Silver y col. (1997) Clin Cancer Res.
3:81-85; Murphy y col. (1998) Cancer 83:
2259-2269; y Bostwick y col. (1998) Cancer 82:
2256-2261). La expresión de PSMA y la actividad
enzimática del PSMA es mayo en especímenes de cáncer de próstata
que en tejidos de próstata benignos (Bostwick y col. (1998)
supra; Lapidus y col. (2000) Prostate 45:
350-354). El descubrimiento de que en el cáncer de
próstata metastásico se expresa PSMA ha conducido al desarrollo
inicial de estrategias de procesamiento diagnóstico de imágenes
utilizando anticuerpos anti-PSMA y, posteriormente,
a ensayos clínicos de anticuerpos anti-PSMA
radioconjugados para el tratamiento de enfermedades metastásicas
(Gong y col. (1999) Cancer Metast Rev. 18:
483-490; Gong y col. (2000) Mol Urol. 4:
217-222; Holmes (2001) Expert Opin Investig
Drugs 10: 5111-519). La identificación de la
expresión de PSMA en la neovasculatura de cánceres no prostáticos
también ha fomentado el uso potencial de terapias con anticuerpos
anti-PSMA para pacientes con carcinomas de riñón,
pulmón, colon, mama y otros órganos (Liu y col. (1997) Clin
Cancer Res 5: 2674-2681; Chang y col. (1999)
Cancer Res. 59: 3192-3198).
El documento US 6,136,311 se refiere al uso de
agentes biológicos que reconocen el PSMA o se unen a él, y a su
utilización para detectar células epiteliales normales,
hiperplásicas benignas y prostáticas cancerosas.
El documento US 5,935,818 proporciona una
molécula de ácido nucleico de mamífero aislada que codifica un PSMA
de empalme alternativo y un método para detectar células tumorales
micrometastásicas hematogénicas y determinar la progresión del
cáncer de próstata en un sujeto.
El documento WO 02/098885 proporciona reactivos
y métodos de diagnóstico, detección y tratamiento de cánceres (por
ejemplo, cánceres de próstata). En particular, la invención
proporciona métodos para generar diversos ligandos de PSMA
funcionalizados y la utilización de los mismos en el diagnóstico, la
detección, el procesamiento de imágenes y el tratamiento de
cánceres de próstata, en particular de aquellos que muestran una
sobreexpresión de PSMA.
El documento de Okegawa y col. (2000), The
Prostate 44:210-218, describe en análisis mediante
RT-PCR de la presencia o ausencia de PSMA en
muestras de ganglios linfáticos o sangre periférica obtenidas de
pacientes con cáncer de próstata, para detectar signos de
recurrencia bioquímica del cáncer de próstata.
El documento de Chang y col. (2002), Urologic
Oncology 7:7-12 es una revisión de diversos estudios
realizados con PSMA y cáncer de próstata.
El documento de Okegawa y col. (2000), The
Journal of Urology 163:1183-1188, describe el
análisis de la presencia o ausencia de PSMA en muestras de ganglios
linfáticos o sangre periférica obtenidas de pacientes con cáncer de
próstata. Dicho documento revela que la detección del cáncer
micrometastásico fuera del tumor primario en el paciente puede
identificar a los pacientes con mayor riesgo de recurrencia.
El documento de Loric y col. (2001), European
Journal of Cancer 37: 1475-1481, revela que la
expresión de E-cadherina en tumores ha sido la
única variable ensayada que tiene una correlación independiente de
la diseminación de células prostáticas en la sangre.
El documento de Adsan y col. (2002), BJU
International 90:579-585, describe el uso de
RT-PCR para evaluar los niveles de PSMA y PSA en
circulación en la sangre, con el fin de calcular la etapa del cáncer
y establecer una correlación entre las células metastásicas en los
ganglios linfáticos y la sangre y la recurrencia.
La invención se basa, en parte, en el
conocimiento de que un subconjunto de sujetos con cáncer de próstata
presenta una sobreexpresión de PSMA en comparación con los niveles
de PSMA en otros pacientes con cáncer de próstata y que esta
sobreexpresión de PSMA en dicho subconjunto puede ser utilizada para
predecir la recurrencia de la enfermedad. De acuerdo con la
American Cancer Society, casi el 40% de los hombres con cáncer de
próstata tiene una recurrencia local de la enfermedad después de la
cirugía, y aproximadamente un 11% presenta un alto riesgo de
propagación metastásica de la enfermedad. Se ha comprobado que puede
emplearse la sobreexpresión de PSMA en sujetos con cáncer de
próstata para determinar la probabilidad de recurrencia del cáncer
en el sujeto independientemente de otros factores, tales como el
grado de Gleason y/o la etapa del cáncer.
Por consiguiente, en otro aspecto, la invención
presenta un método para determinar si un sujeto presenta riesgo de
recurrencia del cáncer de próstata. El método incluye la toma de una
muestra de una lesión primaria de un sujeto al que se le ha
diagnosticado cáncer de próstata y la determinación de los niveles
de expresión de PSMA en dicho sujeto, donde la sobreexpresión de
PSMA en comparación con un patrón de referencia, es decir, un nivel
de expresión de PSMA estadísticamente significativo, distingue los
sujetos que tienen recurrencia y los sujetos que no tienen
recurrencia, por ejemplo los niveles en un sujeto control al que se
le ha diagnosticado el cáncer, indican un riesgo de recurrencia del
cáncer.
La muestra de tejido puede ser una muestra de
biopsia o una muestra obtenida de una prostatectomía parcial o
radical del sujeto. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el
riesgo de recurrencia puede ser evaluado durante el diagnóstico de
un sujeto con cáncer, por ejemplo en la muestra de biopsia, o la
evaluación se puede realizar después de los diagnósticos, por
ejemplo después de que un sujeto haya recibido un tratamiento
anticanceroso, por ejemplo después de una prostatectomía parcial o
radical. La muestra se puede obtener antes del tratamiento con una
terapia anticancerosa, simultáneamente con el tratamiento y/o
después del tratamiento.
En algunas realizaciones se puede determinar la
cantidad de proteína de PSMA utilizando cualquier ensayo adecuado,
por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-PSMA, por
ejemplo en un ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a
enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un Western blot
o un método inmunohistoquímico. Alternativamente, el nivel de
expresión de PSMA se puede determinar a través de la cantidad de
ácido nucleico de PSMA (por ejemplo RNAm) en la muestra biológica.
Por ejemplo, las cantidades de expresión de ácidos nucleicos de
PSMA (por ejemplo, niveles de RNAm) se pueden determinar fácilmente
utilizando cualquier ensayo adecuado, por ejemplo Northern
blotting, RT-PCR, o empleando biochips.
En algunas realizaciones, el riesgo de
recurrencia en un sujeto que presenta niveles de expresión de PSMA
elevados es superior al 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% o más.
La invención presenta un método para evaluar el
riesgo de recurrencia del cáncer de próstata. El método incluye la
toma de una muestra de una lesión primaria de un sujeto al que se le
ha diagnosticado cáncer de próstata; la detección del nivel de
expresión de PSMA, existiendo una correlación entre una
sobreexpresión de PSMA y el riesgo de recurrencia del cáncer de
próstata; y la asignación de un valor del riesgo de recurrencia para
el sujeto en cuestión.
En algunas realizaciones, a un sujeto que tiene
un nivel de expresión elevado se le asigna un valor de un 50%, 60%,
70%, 80% o más de riesgo de recurrencia. En otras realizaciones, a
un sujeto que no presenta un nivel elevado de expresión se le
asigna un valor de un 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o menos de
riesgo de recurrencia.
La muestra de tejido puede ser una muestra de
biopsia o una muestra obtenida de una prostatectomía parcial o
radical del sujeto. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el
riesgo de recurrencia puede ser evaluado durante el diagnóstico de
un sujeto con cáncer, por ejemplo en la muestra de biopsia, o la
evaluación se puede realizar después de los diagnósticos, por
ejemplo después de que un sujeto haya recibido un tratamiento
anticanceroso, por ejemplo después de una prostatectomía parcial o
radical.
En algunas realizaciones se pueden determinar
las cantidades de proteína de PSMA utilizando cualquier ensayo
adecuado, tal como utilizando un anticuerpo
anti-PSMA, por ejemplo en un ensayo con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo
(RIA), un Western blot o un método inmunohistoquímico.
Alternativamente, el nivel de expresión de PSMA se puede determinar
a través de la cantidad de ácido nucleico de PSMA (por ejemplo
RNAm) en la muestra biológica. Por ejemplo, las cantidades de
expresión de ácidos nucleicos de PSMA (por ejemplo, niveles de
RNAm) se pueden determinar fácilmente utilizando cualquier ensayo
adecuado, por ejemplo Northern blotting,
RT-PCR, o empleando biochips.
El método de las reivindicaciones adjuntas
también incluye la provisión de una base de datos útil para
establecer el valor de referencia aquí mencionado o para evaluar de
otro modo los niveles de PSMA en uno o más sujetos mediante la
generación o recepción de datos, por ejemplo el nivel de PSMA, o la
probabilidad o el riesgo de recurrencia del cáncer de próstata en
un paciente, generándose dichos datos mediante el método aquí
descrito; y la introducción de los datos en la base de datos.
En la base de datos se introduce un indicador
(por ejemplo un valor) del estado de la enfermedad de un paciente
y/o un identificador del paciente.
La base de datos prevista en el método de las
reivindicaciones adjuntas puede incluir varias entradas,
comprendiendo cada una de ellas uno o más de los siguientes
elementos: datos (por ejemplo niveles de expresión de PSMA) sobre
la probabilidad o el riesgo de recurrencia del cáncer de próstata en
un paciente, un indicador del estado de la enfermedad de un
paciente y un identificador del paciente.
Puede evaluarse la probabilidad o el riesgo de
recurrencia del cáncer de próstata en un paciente mediante
comparación de los datos del paciente (por ejemplo niveles de
expresión de PSMA), habiéndose generado dichos datos mediante el
método aquí descrito, con los datos de una base de datos aquí
descrita.
En el método se puede producir un patrón de
referencia, incluyendo en el patrón datos de una base de datos aquí
descrita. Por ejemplo, se pueden tomar valores de una base de datos,
realizar una operación matemática con los mismos y utilizar el
resultado como referencia para llevar a un patrón de referencia, por
ejemplo tomando un promedio de diversos valores seleccionados en la
base de datos y utilizando el promedio como patrón.
Figura
1A
Fotografía que muestra una inmunotinción de PSMA
relativamente débil en un hombre caucásico de 64 años de edad con
un cáncer de próstata extracapsular en etapa III Gleason 7 que no
había mostrado recurrencia a los 68 meses de observación
(anti-PSMA con anticuerpo 7E11,
peroxidasa-antiperoxidasa con colorante de contraste
de hematoxilina X 200).
Figura
1B
Fotografía que muestra una sobreexpresión
significativa de PSMA detectada mediante inmunohistoquímica en un
hombre caucásico de 61 años de edad con un tumor confinado en el
órgano etapa II Gleason 7, que mostró recurrencia a los 44 meses y
evolucionó a una enfermedad metastásica refractaria de la hormona
(anti-PSMA con anticuerpo 7E11,
peroxidasa-antiperoxidasa con colorante de contraste
de hematoxilina X 200).
Figura
2
Gráfico que muestra las curvas de supervivencia
de Kaplan-Meier correspondientes a la expresión de
PSMA en adenocarcinomas prostáticos. En comparación con pacientes
cuyos tumores presentaban un nivel de expresión de PSMA
correspondiente a la base de referencia, los pacientes con
adenocarcinomas prostáticos con una expresión relativamente elevada
de proteína de PSMA sufrieron una tasa de recurrencia
significativamente mayor (p = 0,001).
Figura
3
Gráfico que muestra los niveles de expresión
relativa de RNAm de PSMA obtenidos mediante perfiles de
transcripción de próstata normal y carcinomas de próstata. Los
tumores se clasificaron por la etapa y por el nivel de PSA en suero
medido en los pacientes. Los datos fueron normalizados para las
secuencias alu y diversos genes domésticos. Se obtuvieron datos de
expresión y valores de PSA en suero de 25 especímenes diferentes de
próstata normal y de 30 carcinomas de próstata diferentes en
diversas etapas.
Figura
4
Gráfico que muestra el análisis TaqMan^{TM}
tabulado de la expresión de PSMA en el Panel de Enumeración de
Células y Órganos Humanos de la Tabla 2. Los datos indican una
expresión predominante de PSMA en tumores de próstata, seguidos del
sistema nervioso, glándulas salivales, próstata normal e hígado.
Éstas son las abreviaturas clínicas utilizadas en los paneles: ACA
= adenocarcinoma; Arr = detenido; \beta2 =
beta-2-microglobulina;
BM-MNC = células mononucleares derivadas de médula
ósea; CHF = insuficiencia cardíaca congestiva; CNS = sistema
nervioso central; COPD = enfermedad pulmonar obstructiva crónica;
DRG = ganglio de la raíz dorsal; H = humano; HMVECs = células
endoteliales microvasculares humanas; HT = hipertensivo; HUVEC =
células endoteliales de vena umbilical humana; Hyper =
hipertensivo; IBD = enfermedad intestinal inflamatoria; Liv =
hígado; Met = metástasis; N = normal; PBMC = células mononucleares
de sangre periférica; Prol = proliferativo; PSMA = antígeno de
membrana específico de la próstata; Sm = pequeño; SMC = células de
músculo liso cultivadas; T = tumor.
Figura
5
Gráfico que muestra el análisis TaqMan^{TM}
del PSMA en el Panel de Tejido Prostático de la Tabla 3. Los datos
muestran la expresión relativa de RNAm de PSMA normalizado a
\beta2-microglobulina en diversos especímenes de
próstata normal/BPH, tumor primario y metástasis de hígado y
ganglios linfáticos, y tejidos control normales de hígado y
ganglios. Se detectaron transcripciones de PSMA en todos los
especímenes de próstata, con un aumento de éstas en un subgrupo de
tumores malignos. No se detectó ningún nivel de plasma bajo en
ganglios e hígado normales, respectivamente.
Figura
6
Gráfico que muestra el análisis TaqMan^{TM} de
PSMA en estroma y epitelio aislado por microdisección por captura
láser de próstata normal, y que muestra PCA. Los datos representan
la expresión relativa de RNAm de PSMA normalizado a
\beta2-microglobulina.
Figura
7
Microfotografías de la localización del RNAm de
PSMA mediante hibridación in situ y de la localización de la
proteína de PSMA mediante inmunohistoquímica en una próstata normal
(A y B), un adenocarcinoma primario de próstata (C y D) y una
metástasis de ganglios linfáticos (E y F).
A pesar del interés actual por el PSMA como
objetivo de la terapia para pacientes con HRPC, anteriormente no se
había evaluado la expresión del PSMA en el cáncer de próstata como
un marcador de pronóstico autónomo. Como muestran los ejemplos
descritos más abajo, puede emplearse el estado de la expresión de
PSMA para predecir el resultado de la enfermedad de cáncer de
próstata. Esto se ha llevado a cabo correlacionando la
inmunorreactividad citoplásmica para la proteína de PSMA con el
grado del tumor, su etapa, el estado de ploidía del DNA
(espectroscopía Feulgen) y la recurrencia bioquímica de la
enfermedad. Además, se han utilizado otras técnicas moleculares
(perfiles de transcripción (TP) utilizando biochips de DNAc sobre
membranas de nylon, RT-PCR (TaqMan), hibridación
in situ, microdisección mediante captura láser (LCM) y
Western blotting) para evaluar la regulación del RNA y la
proteína en diversas etapas de desarrollo y progresión del PCA.
Se ha comprobado que la expresión de RNAm de
PSMA y proteína está muy limitada a tejidos de próstata normal y
cáncer de próstata con niveles elevados de RNAm en un subconjunto de
PCAs y metástasis, y aumenta en proteína de PSMA inmunorreactiva a
medida que el tumor progresa desde una situación localizada hasta
una enfermedad metastásica. También se ha comprobado que la
sobreexpresión de proteína de PSMA en el tumor predice
independientemente el resultado de la enfermedad. Existe una serie
de importantes obstáculos que han de ser superados cuando se
considera una diana como candidata para la terapia con anticuerpos
monoclonales, incluyendo: relevancia clínica de la diana,
especificidad tumoral, heterogeneidad de la expresión,
interiorización, eliminación del antígeno y actividad biológica del
objetivo. Este estudio demuestra una especificidad epitelial y
restringida a la glándula prostática para el PSMA, con un aumento
adicional de PSMA a nivel de RNAm y proteína en una cantidad
significativa de lesiones malignas, y una asociación clínicamente
relevante de la sobreexpresión de la proteína de PSMA con una
enfermedad agresiva y un pronóstico relativamente malo.
Para que la presente invención se pueda
comprender más fácilmente, primeramente se definirán ciertos
términos. A lo largo de toda la descripción detallada se establecen
otras definiciones.
Tal como se utiliza aquí, el concepto proteína
de "PSMA" o "antígeno de membrana específico de la
próstata" se refiere a PSMA de mamífero, preferentemente
proteína de PSMA humano y dímeros de ésta. El PSMA humano incluye
dos productos proteínicos, PSMA y PSM', codificados por las dos
variantes de RNAm de empalme alternativo (conteniendo
aproximadamente 2.653 y 2.387 nucleótidos, respectivamente) del DNAc
de PSMA descritos en Israeli y col. (1993) Cancer
Res. 53: 227-230; Su y col. (1995)
Cancer Res. 55: 1441-1443; US 5,538,866, US
5,935,818 y WO 97/35616. La transcripción larga del PSMA codifica
un producto proteínico con un peso molecular de aproximadamente
100-120 kDa caracterizado como un receptor
transmembrana de tipo II, que tiene una homología de secuencia con
el receptor de transferrina y presenta actividad de NAALADasa
(Carter y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:
749-753). Por consiguiente, el término "PSMA
humano" se refiere al menos a dos productos proteínicos, PSMA y
PSM' humanos, que tienen o son homólogos (por ejemplo idénticos al
85%, 90%, 95%) a la secuencia de aminoácidos mostrada en Israeli
y col. (1993) Cancer Res. 53: 227-230;
Su y col. (1995) Cancer Res. 55:
1441-1443; US 5,538,866, US 5,935,818 y WO 97/35616;
o que son codificados por (a) una secuencia de ácidos nucleicos de
PSMA humano natural (por ejemplo Israeli y col. (1993)
Cancer Res. 53: 227-230 o US 5,538,866); (b)
una secuencia de ácidos nucleicos degenerada a una secuencia de PSMA
humano natural; (c) una secuencia de ácidos nucleicos homóloga (por
ejemplo idéntica como mínimo en aproximadamente un 85%, 90%, 95%) a
la secuencia de ácidos nucleicos de PSMA humano natural; o (d) una
secuencia de ácidos nucleicos que se híbrida en una de las
secuencias de ácidos nucleicos arriba mencionadas bajo condiciones
estrictas, por ejemplo condiciones altamente estrictas.
Tal como se utiliza aquí, el concepto
"esencialmente idéntico" (o "esencialmente homólogo") se
refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que
contiene una cantidad suficiente de residuos aminoácidos o
nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo con una cadena
lateral similar, por ejemplo sustituciones de aminoácidos
conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos,
de tal modo que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o
nucleótidos tienen actividades similares.
Los cálculos de "homología" entre dos
secuencias se pueden llevar a cabo de la siguiente manera. Las
secuencias se alinean para lograr una comparación óptima (por
ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de primera y
una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para una
alineación óptima, y se pueden ignorar secuencias no homólogas para
la comparación). En una realización preferente, la longitud de una
secuencia de referencia alineada para fines comparativos
corresponde como mínimo al 30%, preferentemente como mínimo el 40%,
de forma especialmente preferente como mínimo el 50%, en especial
como mínimo el 60% y en particular como mínimo el 70%, 80%, 90%,
100% de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se
comparan los residuos aminoácidos o los nucleótidos en las
posiciones de aminoácido o en las posiciones de los nucleótidos
correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está
ocupada por el mismo residuo aminoácido o nucleótido que la
posición correspondiente de la segunda secuencia, las moléculas son
idénticas en dicha posición (tal como se utiliza aquí, el término
"identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a
"homología" de aminoácido o ácido nucleico). La identidad
porcentual entre las dos secuencias es función de la cantidad de
posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en
cuenta la cantidad de huecos y la longitud de cada uno de los
huecos que han de ser introducidos para una alineación óptima de las
dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación
de la homología porcentual entre dos secuencias se puede llevar a
cabo utilizando un algoritmo matemático. En una realización
preferente, la homología porcentual entre dos secuencias de
aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y
Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444-453, que
ha sido incorporado en el programa GAP del paquete de
software GCG, utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz
PAM250, con un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso
de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización preferente,
la homología porcentual entre dos secuencias de nucleótidos se
determina utilizando el programa GAP del paquete de software
GCG, empleando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40,
50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un
conjunto de parámetros particularmente preferente (y que debería
ser utilizado cuando el médico no está seguro sobre los parámetros
que deberían ser aplicados para determinar si una molécula está
dentro de una limitación de homología de la invención) consiste en
una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de
12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización
de hueco de desplazamiento de marco de lectura de 5.
Tal como se utiliza aquí, la expresión
"hibridación bajo condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad
media, rigurosidad alta o rigurosidad muy alta" describe las
condiciones para la hibridación y el lavado. En Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.
(1989), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora aquí por
referencia, se puede encontrar orientación para la realización de
reacciones de hibridación. En dicha referencia se describen métodos
acuosos y no acuosos, y pueden emplearse ambos. Las condiciones de
hibridación específicas aquí mencionadas son las siguientes: 1)
condiciones de hibridación de rigurosidad baja en 6X cloruro
sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por dos
lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS como mínimo a 50ºC (la temperatura de
los lavados se puede aumentar a 55ºC para las condiciones de
rigurosidad baja); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad
media en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más
lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 60ºC; 3) condiciones de hibridación
de rigurosidad alta en 6X SSC a aproximadamente 45ºC, seguido por
uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65ºC; y preferentemente
4) las condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta son
fosfato sódico 0,5M, 7% SDS a 65ºC, seguido por uno o más lavados a
0,2X SSC, 1% SDS a 65ºC. Las condiciones de rigurosidad muy alta
(4) son las condiciones preferentes y las que se deberían utilizar,
a no ser que se especifique de otro modo.
Tal como se utiliza aquí, el término
"recurrencia" se refiere a un aumento de los niveles de PSA
después de un tratamiento anticanceroso (por ejemplo prostatectomía
o radiación) a un valor superior a 0,4 ng/dl en dos análisis
consecutivos separados por un período de un mes. Después de un
tratamiento anticanceroso, por ejemplo una prostatectomía o
radiación, los niveles de PSA caen a un valor bajo y, en algunos
casos, a niveles indetectables en sangre. Esta caída de los niveles
de PSA por debajo de 0,4 ng/dl permite efectuar un seguimiento de
los niveles de PSA para determinar si se ha producido una
recurrencia del cáncer en un sujeto. La recurrencia del cáncer se
puede producir en un período de tiempo corto desde el tratamiento
anticanceroso, por ejemplo unos meses después del tratamiento, o
puede tener lugar varios años después de un tratamiento
anticanceroso. Por ejemplo, en pacientes con cáncer de próstata, la
recurrencia se puede producir varios años después de un tratamiento
anticanceroso, por ejemplo hasta 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 15
años después del tratamiento. La recurrencia se puede clasificar
como "recurrencia local" o "recurrencia distante". La
"recurrencia local" se refiere a cánceres que recurren en
tejidos u órganos adyacentes o próximos al tejido u órgano
canceroso. Por ejemplo, en sujetos con cáncer de próstata, la
recurrencia local se puede producir en tejidos cercanos a la
próstata, en las vesículas seminales, en los ganglios linfáticos
circundantes de la pelvis, en los músculos cercanos a la próstata,
y en el recto y/o en las paredes de la pelvis. La "recurrencia
distante" se refiere a cánceres que recurren alejados del tejido
u órgano canceroso. Por ejemplo, en sujetos con cáncer de próstata,
la recurrencia distante incluye cánceres que se propagan a los
huesos u otros órganos.
También se conocen otros métodos para evaluar el
riesgo de recurrencia. Por ejemplo, en sujetos con cáncer de
próstata, el riesgo se puede evaluar mediante varios métodos
diferentes, incluyendo uno o más de los siguientes: determinación
del grado del cáncer; determinación de la etapa del cáncer; y
determinación del estado de ploidía del DNA (por ejemplo,
determinación del índice de DNA).
Tal como se utiliza aquí, el término
"grado" del cáncer o "grado de Gleason" se refiere a un
análisis patológico de una muestra, por ejemplo una muestra de
biopsia, obtenida de un sujeto. Por ejemplo, en Gleason (1992)
Hum Pathol. 23:273-279 se describen métodos
para determinar el grado de Gleason. En pocas palabras: el aspecto
de células cancerosas se compara con el aspecto de tejido prostático
normal y se asigna un grado a las células cancerosas de 1 a 5. El
grado 1 representa células que son casi normales en comparación con
el tejido prostático normal. El grado 5 es el peor e indica que las
células tienen una patología muy anormal en comparación con el
tejido prostático normal. Los resultados de las dos áreas de cáncer
más grandes de la muestra, por ejemplo la muestra de biopsia, se
suman para obtener el grado de Gleason. Por ello, las muestras
positivas pueden tener un grado de Gleason entre grado 2 y grado 10.
un grado de Gleason 6 ó 7 se considera moderado.
Tal como se utiliza aquí, la "etapa" de un
cáncer se refiere a cuánto ha avanzado el cáncer. Por ejemplo, en
Ohori y col. (1994) Cancer 74:104-114 se
describen métodos para determinar la etapa de un cáncer. Los
sistemas de determinación de etapas más comunes asignan las etapas
I, II, III y IV a un cáncer. En el caso del cáncer de próstata, la
"etapa I" se refiere a un cáncer que sólo se detecta por un PSA
elevado y por biopsia, o en una cirugía por una obstrucción. Los
cánceres de la etapa I están localizados en la próstata. La "etapa
II" se refiere a un cáncer que se puede palpar en un examen
rectal y está limitado a la próstata. Los cánceres de la etapa II
también se pueden evaluar por ejemplo mediante gammagrafía ósea y/o
exploración por CT/MRI. La "etapa III" se refiere a un cáncer
que se ha propagado más allá de la cápsula de la próstata hasta los
órganos y/o tejidos locales, pero que todavía no ha metastatizado.
Los cánceres de la etapa III se pueden diagnosticar por ejemplo
utilizando exámenes rectales digitales, exploraciones por CT/MRI y/o
ecografías. La "etapa IV" se refiere a un cáncer que se ha
propagado, normalmente hasta ganglios linfáticos distantes, huesos
u otros lugares. Los cánceres de la etapa IV se pueden diagnosticar
por ejemplo mediante una gammagrafía ósea y/o por exploración con
Prostascint.
Se evalúan métodos para determinar el índice de
DNA, por ejemplo determinando si el tumor es diploide o no
diploide. Por ejemplo, en el Ejemplo 1 se proporciona un método para
determinar el índice de DNA.
La invención se refiere a la medicina de
predicción utilizando la expresión de PSMA como determinante del
riesgo de recurrencia del cáncer. Dentro del alcance de esta
invención se contempla la aplicación de un análisis de expresión de
PSMA como parte de un protocolo farmacogenético (por ejemplo
mediante el uso de biochips) para evaluar el estado y el pronóstico
de los pacientes.
El nivel de RNAm correspondiente al gen de PSMA
en una célula se puede determinar por ejemplo mediante formatos
in situ o in vitro.
Las sondas de RNAm de PSMA se pueden utilizar en
ensayos de hibridación o amplificación, que incluyen, pero no de
forma exclusiva, análisis Southern o Northern,
análisis de reacción en cadena de la polimerasa y disposiciones de
sondas. Un método para detectar niveles de RNAm consiste en poner en
contacto el RNAm con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se
puede hibridar en el RNAm codificado por el gen detectado. La sonda
de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de PSMA
completo o una porción de éste, como un oligonucleótido de como
mínimo 7, 10, 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y
suficiente para hibridarse bajo condiciones rigurosas en RNAm de
PSMA, DNAc o partes de éstos. Las sondas de pueden marcar con un
reactivo detectable para facilitar la identificación de la sonda.
Los reactivos útiles incluyen, pero no de forma exclusiva,
colorantes radiactivos, tintes fluorescentes o enzimas capaces de
catalizar un producto detectable.
En un formato, se inmoviliza RNAm (o DNAc) sobre
una superficie y se pone en contacto con las sondas, por ejemplo
pasando el RNAm aislado sobre gel de agarosa y transfiriendo el RNAm
desde el gel de agarosa hasta una membrana, por ejemplo de
nitrocelulosa. En un formato alternativo, las sondas se inmovilizan
sobre una superficie y el RNAm (o DNAc) se pone en contacto con las
sondas, por ejemplo en una disposición bidimensional de biochips.
Un especialista puede adaptar los métodos de detección de RNAm
conocidos para utilizarlos en la detección del nivel de RNAm
codificado por el gen de PSMA.
El nivel de RNAm en una muestra codificado por
un ácido nucleico de PSMA se puede evaluar por amplificación de
ácido nucleico, por ejemplo mediante RT-PCR (patente
US nº 4,683,202), reacción en cadena de ligasa (Barany, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88:189-193, 1991), replicación se
secuencia autosostenida (Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:1874-1878, 1990), sistema de amplificación de
transcripción (Kwoh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:1173-1177, 1989), Q-beta
replicasa (Lizardi y col., Bio/Technology 6:1197, 1988), replicación
en círculo rodante (patente US nº 5,854,033) o cualquier otro
método de amplificación de ácidos nucleicos, seguida de la
detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas
conocidas. Tal como se utiliza aquí, el concepto "cebadores de
amplificación" se define como un par de moléculas de ácido
nucleico que se puede reasociar con regiones 5' o 3' de un gen
(cadenas más y menos, respectivamente, o viceversa) y contener una
región corta en medio. En general, los cebadores de amplificación
tienen una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos y
flanquean una región con una longitud de aproximadamente 50 a 200
nucleótidos. Bajo condiciones apropiadas y con reactivos
apropiados, estos cebadores permiten la amplificación de una
molécula de ácido nucleico, incluyendo la secuencia de nucleótidos
flanqueada por los cebadores.
Para los métodos in situ se puede
preparar/procesar una muestra de tejido e inmovilizar ésta sobre un
soporte, típicamente un portaobjetos, y después ponerla en contacto
con una sonda que se puede hibridar en RNAm que codifica el gen de
PSMA analizado.
Para determinar el nivel de proteína codificado
por el gen de PSMA se pueden utilizar diversos métodos. En estos
métodos, generalmente un agente que se une de forma selectiva a la
proteína, tal como un anticuerpo, se pone en contacto con una
muestra para evaluar el nivel de proteína en la muestra. En una
realización, el anticuerpo incluye un marcador detectable. Los
anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Se puede
utilizar un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo
Fab o F(ab')_{2}). El término "marcado" con respecto
a la sonda o el anticuerpo incluye el marcado directo de la sonda o
anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, enlace físico) de una
sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, y también el marcado
indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con una
sustancia detectable. Ejemplos de anticuerpos que pueden ser
utilizados para detectar PSMA incluyen, por ejemplo, el 7E11 (que se
une al dominio intracelular del PSMA) y también cualquiera de los
anticuerpos descritos en las patentes US nº 6,150,508, 6,107,090 y
6,136,311, la publicación PCT WO 02/098897, la publicación PCT WO
97/35616 y la publicación PCT WO 01/09192, la publicación de la
solicitud de patente US 2003034903, Schülke y col., (2003) PNAS USA,
100(27):12590-12595; Graver y col., (1998)
Cancer Res. 58:4787-4789 (cuyos contenidos se
incorporan aquí por referencia).
Los métodos de detección pueden ser utilizados
para detectar proteína de PSMA en una muestra biológica tanto in
vitro como in vivo. Las técnicas in vitro para
detección de proteína de PSMA incluyen ensayos con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación,
inmunofluorescencia, inmunoensayos enzimáticos (EIA),
radioinmunoensayos (RIA) y análisis Western blot. Las
técnicas in vivo para detección de proteína de PSMA incluyen
la introducción de un anticuerpo anti-PSMA marcado
en un sujeto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un
marcador radiactivo (por ejemplo un radioisótopo), cuya presencia y
localización en un sujeto se pueden detectar mediante técnicas
estándar de procesado de imágenes. Un radioisótopo puede ser un
emisor \alpha, \beta o \gamma, o un emisor \beta y \gamma.
Ejemplos de radioisótopos a utilizar incluyen, de forma no
exclusiva: itrio (^{90}Y), lutecio (^{177}Lu), actinio
(^{225}Ac), praseodimio, ástato (^{211}At), renio (^{186}Re),
bismuto (^{212}Bi o ^{213}Bi), y rodio (^{188}Rh). Los
radioisótopos útiles como marcadores, por ejemplo para ser
utilizados en diagnósticos, incluyen yodo (^{131}I o ^{125}I),
indio (^{111}In), tecnecio (^{99}mTc) fósforo (^{32}p),
carbono (^{14}C) y tritio (^{3}H).
En algunas realizaciones, los métodos incluyen
la comparación del nivel de expresión de PSMA con un patrón de
referencia. Tal como se utiliza aquí, la expresión "patrón de
referencia" se puede referir a un patrón que consiste en un
nivel estadísticamente significativo de expresión de PSMA que
distingue a los sujetos que presentan recurrencia de los sujetos
que no la presentan. El patrón puede consistir en un nivel
particular de expresión de PSMA. Un especialista puede establecer
un patrón de referencia tomando una medida de los niveles de
expresión de PSMA en sujetos que presentan recurrencia y en sujetos
que no la presentan para definir el patrón. Por ejemplo, tal como
se describe aquí en el Ejemplo 1, una determinación de la
sobreexpresión de PSMA se puede comparar con un patrón de
referencia utilizando análisis inmunohistoquímicos. En pocas
palabras: la tinción de una muestra, por ejemplo una muestra de
biopsia o una muestra de una prostatectomía, se puede evaluar en
cuanto a la intensidad de la tinción y la distribución de la tinción
citoplásmica a partir de los resultados inmunohistoquímicos. La
distribución de la tinción se clasificó como focal, regional o
difusa. La intensidad de la tinción se clasificó como débil,
moderada o intensa. Se consideró que los casos en los que el patrón
de tinción se clasificó como intensa difusa, intensa regional o
moderada difusa sobreexpresaban la proteína de PSMA. Métodos como
éste pueden ser utilizados para determinar si hay un aumento
estadísticamente significativo de la expresión de PSMA en los
sujetos que presentan recurrencia. En algunas realizaciones, el
aumento es de como mínimo un 100% del nivel del patrón de
referencia, es decir, el nivel de expresión en la muestra es dos
veces el nivel de expresión en el patrón de referencia, por ejemplo,
la expresión aumenta en un 150%, 200%, 250%, 300% o más.
La siguiente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, que no deben ser considerados como
limitativos.
Utilizando especímenes de prostatectomía se
realizó una tinción inmunohistoquímica (IHC) para PSMA (anticuerpo
7E11) en secciones de 136 casos de PCA insertadas en parafina y
fijadas con formalina. La inmunorreactividad citoplásmica se
clasificó en función de su intensidad y distribución y los
resultados se correlacionaron con el grado del tumor, la etapa, el
estado de ploidía del DNA (espectroscopía Feulgen) y recurrencia de
la enfermedad. También se llevó a cabo la validación del PSMA diana
en un grupo independiente de próstata normal congelada y
especímenes de PCA mediante perfiles de transcripción (TP)
utilizando biochips de DNAc, RT-PCR (TaqMan^{TM}),
hibridación in situ, RT-PCR después de
microdisección por captura láser (LCM), Western blotting e
IHC.
Se seleccionaron aleatoriamente 136 pacientes
que habían sido sometidos a prostatectomía radical por
adenocarcinoma de próstata (PAC) demostrado por biopsia entre 1987
y 1997 en el Albany Medical Center Hospital. Se revisaron los
portaobjetos de cada espécimen de prostatectomía radical teñidos con
hematoxilina y eosina y se les asignó un grado de Gleason (Gleason
(1992) Human Pathol. 23: 273-279) y una etapa
patológica (Ohori y col. (1994) Cancer 74:
104-114). Durante la revisión se identificaron
múltiples bloques en base a la presencia del tumor adecuado y a la
naturaleza representativa del grado del tumor general. Los tumores
se clasificaron como de alto grado cuando la clasificación de
Gleason combinada era igual a 7 o más y de bajo grado cuando la
clasificación combinada era igual a 6 o menos. Los niveles de
antígeno específico de próstata (PSA) en suero se obtuvieron, en
cada caso, de la historia clínica del paciente. El PSA en suero se
midió mediante el método de tándem Hybritech® (Beckman Coulter,
Inc., Brea, CA). Un aumento postoperatorio del nivel de PSA de un
nivel de base de referencia de 0 ng/ml a más de 0,4 ng/ml en dos
ocasiones consecutivas se consideraba como una evidencia biológica
de recurrencia de la enfermedad. La información de seguimiento se
obtuvo a partir de la revisión de las historias clínicas de los
pacientes.
\vskip1.000000\baselineskip
La tinción inmunohistoquímica para PSMA se llevó
a cabo mediante un método automático en el instrumento
inmunohistoquímico Ventana ES (Ventana Medical Systems, Inc.,
Tucson, AZ) utilizando un sistema de detección indirecta de biotin
avidin diaminobenzidina (DAB) en secciones de 4 micras de un bloque
representativo, en cada caso insertadas en parafina y fijadas con
formalina (FFPE). Después de la desparafinización en agua, los
sitios determinantes antigénicos se desenmascararon en Citra con
vapor durante 60 minutos para la detección del PSMA. El anticuerpo
primario, (clon 7E11) PSMA antihumano de ratón, consistía en un
anticuerpo monoclonal de ratón de la clase IgG1 dirigido contra el
dominio interno de la proteína de PSMA (anticuerpo proporcionado por
Millennium Pharmaceuticals, Inc.). El anticuerpo secundario
consistía en inmunoglobulinas antirratón de cabra biotiniladas (DAKO
Carpenteria, CA) en una dilución 1:250. Después del desarrollo del
color con DAB, los portaobjetos se sometieron a tinción de
contraste con hematoxilina. En todos los casos se utilizaron
elementos benignos como controles positivos internos. Para
confirmar la especificidad del anticuerpo primario, en cada lote se
procesaron los portaobjetos de control negativo, una
inmunoglobulina emparejada con isotipo (Sigma, St. Louis, MO) en la
misma concentración que la del anticuerpo primario.
\vskip1.000000\baselineskip
La inmunorreactividad por PSMA se interpretó sin
conocimiento previo de ninguno de los parámetros clinicopatológicos.
En la evaluación semicuantitativa de los resultados
inmunohistoquímicos para los dos anticuerpos se tuvieron en cuenta
la intensidad de la tinción y la distribución de los resultados
citoplásmicos positivos. La distribución de la tinción en las
células tumorales se clasificó como focal (\leq 10%), regional
(11-50%) o difusa (> 50%). La intensidad de la
tinción citoplasmática se clasificó subjetivamente como débil,
moderada o intensa. Los casos en los que los patrones de tinción se
clasificaron como intensa difusa, intensa regional, moderada difusa
y moderada regional se consideraron positivos para la expresión de
las dos proteínas. También se consideró que los casos en los que
los patrones de tinción se clasificaron como intensa difusa, intensa
regional y moderada difusa sobreexpresaban proteína de PSMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tiñeron secciones FFPE de cinco micras según
el método de Feulgen y se analizaron en cuanto al contenido de DNA
con un CAS 200 Image Analyzer (Cell Analysis Systems, Lombard, IL).
Después de calibrar el instrumento con hepatocitos de rata
tetraploides teñidos de forma similar, se midió el contenido de DNA
de los PAC en un mínimo de 100 células tumorales y se determinó el
índice de DNA tumoral por comparación con las células diploides
control de epitelio prostático benigno. Todos los histogramas de las
células tumorales se revisaron sin tener conocimiento del grado del
tumor, la etapa, el estado de recurrencia o los resultados
inmunohistoquímicos. Se consideró que un índice de DNA de
0,77-1,22 era diploide. Los picos en la región
tetraploide que contenían menos de un 15% de la población celular
total se consideraron como componentes G_{2}M de poblaciones
celulares diploides. Los tumores con picos tetraploides superiores
al 15% y picos hiperdiploides no tetraploides se consideraron no
diploides (aneuploides) (Smith-Jones y col. (2000)
Cancer Res 60:5237-5243).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo comparaciones estadísticas
con el software STATA (Stata Corporation, College Station,
TX). Para determinar la importancia de las asociaciones entre la
expresión de PSMA y las variables patológicas se utilizó el test
ji-cuadrado. El test t se utilizó para probar la
igualdad de los medios entre grupos con sobreexpresión y grupos sin
sobreexpresión. El análisis de recurrencia de la enfermedad se llevó
a cabo con modelos univariantes y el método de
Kaplan-Meier. Se llevó a cabo un análisis
multivariante incluyendo parámetros clinicopatológicos y la
expresión de PSMA utilizando el modelo de peligros proporcionales de
Cox. El nivel de significación se estableció en p < 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Los especímenes utilizados para el estudio de
los resultados clínicos basado en IHC de tejido con parafina
procedían de 136 pacientes con una edad media de 66 años (intervalo
de 49-94) y el nivel medio de PSA preoperatorio era
de 12,4 ng/ml (intervalo de 1,6-87,8 ng/ml). De los
136 PAC, 76 (56%) eran tumores de bajo grado (clasificación de
Gleason \leq 67) y 60 (44%) eran tumores de alto grado
(clasificación Gleason > 7). En la prostatectomía, 83 (61%) eran
tumores confinados en el órgano (etapas I y II) y 53 (39%) eran
tumores de etapa avanzada (III y IV). De los 96 casos previamente
analizados en cuanto al contenido total de DNA, 68 (71%) eran
diploides y 28 (29%) no eran diploides. Se disponía de información
de seguimiento de todos los pacientes, de los cuales 52 (38%)
presentaban recurrencia postoperatoria bioquímica de la enfermedad.
El patrón de inmunotinción para PSMA era citoplásmico, mostrando
las células tumorales un valor positivo entre moderado e intenso, a
diferencia de la expresión relativamente más débil en elementos
benignos. Todos los casos de cáncer de próstata expresaban PSMA
(Figura 1A) con una tinción débil difusa o superior. Sesenta y cinco
de los 136 (48%) cánceres de próstata sobreexpresaban PSMA, lo que
se caracterizaba por la presencia de tinción intensa focal o difusa
(Figura 1B). La sobreexpresión de PSMA estaba asociada de forma
significativa con un grado de tumor alto (p = 0,04). La
clasificación media de Gleason de tumores con expresión de PSMA de
fondo era de 5,92 y la clasificación media de Gleason de los
tumores con sobreexpresión de PSMA era de 6,33. La sobreexpresión de
PSMA también estaba asociada con la presencia de tumores no
diploides (p = 0,010). El índice de DNA medio en el caso de los
tumores con sobreexpresión de PSMA era de 1,32, en comparación con
un índice de DNA medio de 1,03 en el caso de los tumores con
niveles de expresión de PSMA de fondo (p = 0,002). El estado de
expresión de PSMA también estaba asociado con una etapa tumoral
avanzada, con 33/57 (58%) tumores de la etapa III o IV que
sobreexpresaban PSMA en comparación con 31/79 (39%) de casos que no
sobreexpresaban PSMA (p = 0,029). El nivel medio de PSA en suero de
18,28 ng/ml en el momento del diagnóstico en el caso de los tumores
que sobreexpresaban PSMA era significativamente mayor que el nivel
medio de PSA en suero de 9,10 ng/ml en el caso del grupo que no
presentaba sobreexpresión (p = 0,006).
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis univariante de la recaída de la
enfermedad. En análisis univariantes en los que se utilizó el
seguimiento clínico disponible en los 136 casos, el estado de
expresión de PSMA presentaba una correlación significativa con la
recurrencia bioquímica de la enfermedad (p = 0,001) [Figura 2].
Análisis multivariante de la recurrencia de
la enfermedad. En análisis multivariantes, el estado de tumor
avanzado (p = 0,018) y la sobreexpresión de PSMA (p = 0,002) eran
sistemas de predicción de la recurrencia bioquímica
independientes.
En las prostatectomías insertadas en parafina,
el 100% de los PCA mostraban un incremento del nivel de expresión
de PSMA en comparación con elementos benignos adyacentes. En los
tumores primarios, la expresión de PSMA creciente por IHC estaba en
correlación con el grado del tumor (p = 0,030), la etapa (p =
0,029), la aneuploidía (p = 0,010) y la recurrencia bioquímica (p =
0,001). El nivel medio de PSA en suero de 18,28 ng/ml en el momento
del diagnóstico en el caso de los tumores que sobreexpresaban PSMA
era considerablemente mayor que el nivel medio de PSA en suero de
9,10 ng/ml en el caso del grupo que no presentaba sobreexpresión (p
= 0,006). En análisis multivariantes, el estado del tumor (p =
0,018) y la sobreexpresión de PSMA (p = 0,002) eran sistemas de
predicción de la recurrencia bioquímica independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron análisis Western blot
después de electroforesis de extractos de tejido
NP-40 en SDS-gel de poliacrilamida
y se transfirieron a membranas de nylon. Las líneas incluían PSMA en
especies de próstata humana normal/BPH, in situ y con
adenocarcinoma primario. También se procesaron como controles unos
extractos proteínicos del PSMA y la línea celular de tumor de
próstata LNCaP cultivado. Las transferencias se bloquearon e
incubaron con el anticuerpo monoclonal de ratón
anti-PSMA 7E11, seguido de lavado y detección
utilizando IgG anti-ratón de cabra conjugado con
peroxidasa de rábano, o con sustrato quimioluminiscente.
Los análisis Western blot utilizando el
anticuerpo monoclonal 7E11 confirmaron que los especímenes de
próstata neoplásica tenían mayores niveles de proteína de PSMA
inmunodetectables. En estos análisis se comprobó que todos los
tejidos clínicos de próstata tenían un cierto grado de proteína de
PSMA inmunodetectable, pero en un subconjunto de PCA y el espécimen
PIN eran evidentes unos niveles elevados.
Los resultados de los análisis Western
blot confirmaban los resultados de la IHC, que mostraban un
aumento del PSMA inmunotransferible asociado con el tumor en la
enfermedad maligna que migraba con el peso molecular apropiado.
Los perfiles de transcripción se llevaron a cabo
preparando sondas radiactivas de RNA total aislado de tejidos
clínicos congelados rápidamente e hibridándolas en biochips de
membrana de nylon que contenían DNA de aproximadamente 25.000 genes
humanos. Los datos de expresión se obtuvieron de 25 especímenes
diferentes de próstata normal y 30 carcinomas de próstata
diferentes en diversas etapas. Para cada espécimen de paciente se
establecieron valores de proteína en suero para el Antígeno
Específico de la Próstata (PSA) como un indicador del estado de la
enfermedad.
Los perfiles de transcripción de RNA aislado de
25 próstatas normales y 30 PCA de diferentes etapas en biochips de
25.000 genes revelaron que el RNAm de PSMA se expresaba de forma
prominente en la próstata normal, con un aumento significativo en
un subconjunto de carcinomas de próstata primarios (Figura 3). En
este subconjunto de perfiles de casos no había una asociación clara
entre el aumento de RNAm de PSMA del tumor de próstata y los
niveles de base de referencia de proteína de PSA en suero. Aunque
había una variabilidad considerable en la expresión de PSMA entre
los especímenes clínicos, se observaba claramente un aumento
evidente en un subconjunto de tumores de próstata en todas las
etapas de la enfermedad en comparación con los niveles medios
hallados en tejidos normales.
En los TP, la expresión de RNAm de PSMA se
limitaba predominantemente a la próstata normal y maligna con
niveles mayores de lo normal en un subconjunto de PCA.
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Los perfiles de RNAm de PSMA en tejidos humanos
se llevaron a cabo mediante la técnica de reacción en cadena de
polimerasa, transcripción inversa, en tiempo real, utilizando el
sistema TaqMan^{TM} (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
El diseño PSMA TaqMAN^{TM} Probe se basó en el número de acceso
M99487 del sitio web de NCBI. Este número de acceso se titula
"Human prostate-specific membrane antigen (PSM)
mRNA, complete cds" y está fechado el 01/08/1995. Las secuencias
se eligieron por el dominio común hallado en todas las variantes
notificadas para PSMA (PSM - largo y PSM' - corto). Los números de
nucleótidos utilizados corresponden con el número de acceso arriba
indicado:
(P1) Sonda:
5'-tggctcagcaccaccagatagcagc-'3 (abarca los
nucleótidos 1191-1215)
(F1) Cebador de avance:
5'-CTATGATGCACAGAAGCTCCTAGAA-3'
(R1) Cebador inverso:
5'-TGTAGGGCACTTTGAGACTTCCT-3'
\vskip1.000000\baselineskip
La prueba de calidad de los reactivos
TaqMan^{TM} diseñados se realizó utilizando un amplímero sintético
y la demostración de un rango lineal de 7 log y una inclinación de
3,3, que pasó el análisis de curva estándar.
Se preparó RNA y DNAc a partir de especímenes
clínicos humanos verificados por un patólogo y a partir de células
cultivadas apropiadas para establecer 3 paneles de DNAc diferentes
con los que evaluar tejidos, células y la expresión de PSMA
específica de la enfermedad mediante análisis TaqMan^{TM}. Los
paneles son: 1) Panel de Enumeración de Células y Órganos Humanos y
2) Panel de Tejido Prostático Humano. La composición de cada uno de
los paneles se describe en las secciones de Resultados y
Discusión.
Se aisló RNA total de tejidos y células de
acuerdo con el protocolo del fabricante (Tel-Test
Incorporation), pero con una extracción adicional con
fenol:cloroformo. La calidad del RNA se evaluó utilizando un Agilent
Bioanalyzer 2100 con el RNA 6000 Nano Labchip Kit. Se determinaron
las proporciones de RNAr 28S/18S y únicamente los especímenes con
proporciones superiores a 1 y sin ninguna degradación notable de RNA
eran aceptables para la preparación del DNAc. Se obtuvieron 100
\mul de DNAc a partir de 2 ug de RNA DNAsa utilizando el Reverse
Transcription Kit (Applied Biosystems) tanto con hexámeros
aleatorios como con oligo d(T) añadidos como cebadores.
Todas las muestras tenían un control de "transcriptasa no
inversa" para evaluar la contaminación de DNA residual. Las
muestras se sometieron a las siguientes condiciones secuenciales de
reacción de transcriptasa inversa: 25ºC durante 10 minutos, 42ºC
durante 60 minutos, 95ºC durante 5 minutos, y conservación a 4ºC
hasta el análisis de control de calidad. El control de calidad de
DNAc consistía en la cuantificación de dos genes domésticos (18S y
\beta2-microglobulina) utilizando TaqMan^{TM} en
el instrumento ABI 7700 con Universal PCR Master Mix y AmpliTaq
Gold DNA (Applied Biosystems). Las condiciones de reacción fueron
las siguientes: inicialmente 50ºC durante 2 minutos; mantenimiento
a 95ºC durante 10 minutos; y 40 ciclos a 95ºC durante 15 segundos y
60ºC durante 1 minuto. Los criterios de aprobación para el DNAc
fueron los siguientes: 18S (valor de control sin molde [NTC] Ct
\geq 35 y +RT \leq 15) y \beta2-microglobulina
(valor NTC Ct \geq 35 y +RT \leq 23). Para el almacenamiento a
largo plazo, los DNAc se guardaron a -20ºC y en formas alícuotas si
se habían generado grandes volúmenes de DNAc.
Los tejidos utilizados para generar RNA/DNAc y
las secciones congeladas para hibridación in situ y la
captura por láser se obtuvieron de depósitos públicos e
instituciones académicas de acuerdo con los diversos acuerdos
institucionales que aseguran el consentimiento del paciente y la
confidencialidad: BWH - Brigham and Women's Hospital; CHT -
Collaborative Human Tissue Network; CLN - Clinomics, Inc.; JHH -
Johns Hopkins Hospital; MPI - Millennium Pharmaceuticals, INC.; NDR
- National Disease Research Inc.; PIT - University of Pittsburgh; y
TEM - Temple University.
Después, los DNAc tisulares y celulares de
calidad controlada se depositaron con una pipeta en placas de
reacción de 96 pocillos. El control endógeno
(\beta2-microglobulina) y los cebadores y las
sondas específicos de PSMA se añadieron a los DNAc, se llevó a cabo
el TaqMan^{TM} y se realizó el análisis. Los datos de cada uno de
los paneles se presentan en forma de gráficos de barras de los
valores de expresión relativa derivados de los resultados del
TaqMan^{TM} tabulado. Debajo de los gráficos de barras se enumeran
los valores Ct medios obtenidos para el PSMA y el gen doméstico de
control endógeno, \beta2-microglobulina, las
diferencias normalizadas y calibradas, y los cálculos de expresión
relativa. Estos parámetros se definen de la siguiente manera: Ct =
un término de TaqMan^{TM} que representa el ciclo umbral, que es
el punto en el que la amplificación por PCR cruza el umbral de la
base de referencia; \deltaCt = un término de TaqMan^{TM} que
indica el ciclo de PCR umbral para un gen diana normalizado a los
valores Ct de un gen doméstico; \delta\deltaCt = un término de
TaqMan^{TM} que representa el ciclo de PCR calibrado y normalizado
para una diana; y Expresión = un término de TaqMan^{TM} que indica
la expresión relativa del gen diana obtenida calculando el valor
2^{- \delta \delta Ct}.
Se creó un Panel de DNAc de Enumeración de
Células y Órganos Humanos consistente en DNAc de poblaciones
celulares aisladas, líneas celulares cultivadas y depósitos de 3
especímenes, cada uno de ellos de una variedad de tejidos. Los
especímenes de este panel incluían: aorta enferma, vena, células
cultivadas de músculos lisos coronarios, células endoteliales
cultivadas de vena umbilical humana (HUVEC), hemangioma, corazón,
corazón enfermo (insuficiencia cardíaca congestiva), riñón, músculo
esquelético, tejido adiposo, páncreas, osteoblastos primarios
cultivados, osteoclastos diferenciados cultivados, piel, médula
espinal, corteza cerebral, hipotálamo, nervio, ganglios de la raíz
dorsal, mama, tumor de mama, ovario, tumor ovárico, próstata, tumor
prostático, glándula salival, colon, tumor de colon, pulmón, tumor
pulmonar, pulmón con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, colon
con enfermedad intestinal inflamatoria, hígado, hígado fibrótico,
bazo, amígdala, ganglio linfático, intestino delgado, macrófagos,
sinovio, células mononucleares de médula ósea, monocitos de sangre
periférica activados, neutrófilos, megacariocitos, células
eritroides y un control positivo consistente en depósitos de DNAc de
células RAJI, testículo, placenta y cerebro. Este panel de DNAc se
analizó en cuanto a la expresión de PSMA utilizando reactivos
TaqMan^{TM} que detectan la expresión tanto del dominio externo
como de formas citoplásmicas de PSMA. Los depósitos de especímenes
de tumor de próstata presentaban la mayor expresión de PSMA, con
aumentos relativos de más de 37 veces la expresión observada en los
depósitos de muestras de próstata normal no cancerosa y de BPH. Los
siguientes tejidos no prostáticos que mostraban la mayor expresión
se encontraron en el sistema nervioso central con el siguiente
orden de rango: corteza > hipotálamo > ganglios de la raíz
dorsal > médula espinal > nervio. Otros tejidos con niveles
de RNAm mensurables, pero bajos, fueron: glándula salival, fibrosis
de hígado, hígado, intestino delgado, HUVEC, tumor pulmonar, mama,
riñón y hemangioma (Tabla 2 y Figura 4).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Leyenda Tabla 2: Datos TaqMan^{TM} tabulados
correspondientes al Panel de Enumeración de Células y Órganos
Humanos en el que se enumeran los valores Ct medios obtenidos para
PSMA y el gen doméstico, \beta2-microglobulina,
las diferencias normalizadas y calibradas, y los cálculos de
expresión relativa. Los diferentes parámetros enumerados se definen
de la siguiente manera: Ct = un término de TaqMan^{TM} que
representa el ciclo umbral que es el punto en el que la
amplificación por PCR cruza el umbral de base de referencia;
\deltaCt = un término de TaqMan^{TM} que indica el ciclo de PCR
umbral para un gen diana normalizado a los valores Ct de un gen
doméstico; \delta\deltaCt = un término de TaqMan^{TM} que
representa el ciclo de PCR calibrado y normalizado para una diana;
y Expresión = un término de TaqMan^{TM} que indica la expresión
relativa del gen diana obtenida calculando el valor 2^{- \delta
\delta Ct}.
El Panel de DNAc de Tejido de Próstata Humana
consiste en DNAc derivado de: tejidos de próstata normal y BPH (5
muestras), tumores de próstata primarios (6 muestras con
clasificaciones de Gleason [GS] 5-9), metástasis de
próstata en hígado (6 muestras), metástasis de próstata en ganglio
linfático (4 muestras), hígado normal (3 muestras) y ganglios
linfáticos normales (2 muestras). Como se muestra en la Figura 5 y
en la Tabla 3, un subconjunto de tumores primarios y metástasis
mostraban una mayor expresión de PSMA en comparación con los
tejidos de próstata y BPH, hígado o ganglio linfático normales. En
hígados y ganglios linfáticos normales se detectaron niveles muy
bajos de transcripciones de PSMA y ninguna transcripción de PSMA,
respectivamente. En los especímenes malignos que presentaban una
expresión mayor que los valores medios de tejido normal/BPH, el
grado de aumento de PSMA variaba entre 1,1 y 20 veces dichos
valores. La cuantificación de RNAm de PSMA por TaqMan^{TM}
RT-PCR mostraba el mismo patrón de expresión que el
observado en los experimentos de transcripción, con un aumento de
PSMA en un subconjunto de tumores, una gran variabilidad en la
sobreexpresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Leyenda Tabla 3: Datos TaqMan^{TM} tabulados
correspondientes a tejidos de próstata y tejidos normales control,
se enumeran los valores Ct medios obtenidos para PSMA y el gen
doméstico, \beta2-microglobulina, las diferencias
normalizadas y calibradas (\deltaCt y \delta\deltaCt,
respectivamente), y los cálculos de expresión relativa (el valor
2^{- \delta \delta Ct}). Los tumores primarios tienen las
clasificaciones de Gleason (GS) indicadas. La
RT-PCR TaqMan^{TM} confirmó una expresión mayor de
RNAm de PSMA en un subconjunto de PCA y metástasis. En otros
órganos no se observó ninguna expresión de PSMA o sólo se vio una
baja expresión de PSMA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se separaron secciones de ocho \mum de
próstata normal y carcinoma de próstata congelados en elementos
epiteliales y estromales utilizando un instrumento de
microdisección por captura láser Pix Cell^{TM} (Arcturus
Engineering Inc. Mountain View, CA). Se tomaron típicamente de
1.000 a 3.000 disparos por tapón y se utilizaron tapones que
contenían células aisladas para sellar tubos Eppendorf que contenían
100 \mul de reactivo de aislamiento de RNA. Se preparó DNAc y se
realizó el TaqMan^{TM} tal como se describe más arriba.
El enriquecimiento por microdisección mediante
captura láser (LCM) de poblaciones celulares epiteliales y
estromales confirmó que la expresión de PSMA se limitaba
predominantemente al epitelio de los tejidos de próstata no
cancerosa, con un notable aumento en el epitelio maligno (Figura
6).
El enriquecimiento por LCM de estroma y epitelio
de próstata indicó que el RNAm de PSMA se expresa de forma
preferente en el epitelio y que dicha expresión aumenta en caso de
una transformación maligna.
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La hibridación in situ (ISH) se realizó
utilizando secciones de tejido congeladas, fijadas en formalina,
acetiladas, deshidratadas y deterioradas, con ribosondas marcadas
con ^{35}S. Se generaron sondas de ISH T3 sentido y T7
antisentido específicas del gen mediante PCR para el dominio
encontrado en todas las variantes de PSMA notificadas y que incluye
el dominio de amplificación de TaqMan^{TM}. Las sondas se marcaron
mediante transcripción inversa (Promega) siguiendo las
instrucciones del fabricante, en presencia de
^{35}S-UTP, ATP no marcado, GTP, CTP y de 200 a
500 ng de DNA molde, con purificación en columnas MicroSpin
G-25. Se hibridaron portaobjetos con un 50% de
formamida, Tris-HCl 10 mM, 0,2 mg/ml RNAt de
levadura, 1X Denhardt's, 10% sulfato de dextrano, NaCl 600 mM,
0,25% SDS y 2x10^{6} cpm/\mul de ribosonda. La hibridación de
llevó a cabo a 55ºC durante una noche y después se realizó el
lavado de los portaobjetos secuencialmente con rigurosidad baja y
alta con 2X SSC y 0,2X SCC a 60ºC, y luego con 20 \mug/ml de RNAsa
A, 37ºC. Los portaobjetos hibridados lavados se deshidrataron, se
sumergieron en la emulsión fotográfica NBT2 (VWR), se incubaron
durante 10 a 14 días a 4ºC, se revelaron con Kodak Dektol Developer
and Fixer y se sometieron a tinción de contraste con hematoxilina.
Los resultados se presentan como el rango de intensidades de
hibridación estimado según la cantidad de granos plateados sobre
las células epiteliales y el porcentaje aproximado de células
positivas.
Se realizó una hibridación in situ de una
cantidad limitada de secciones congeladas de tejidos de próstata
normal, PIN (neoplasia intraepitelial prostática), cánceres de
próstata primarios y lesiones metastásicas. El RNAm de PSMA se
expresaba de forma preferente en el epitelio de próstata normal,
benigna y maligna y se correlacionó con las mediciones de IHC de la
proteína de PSMA en las mismas muestras (Figura 7). Había una
heterogeneidad considerable de la expresión de RNAm de PSMA,
caracterizada por una variabilidad interglandular e intraglandular
de la intensidad de señal y del porcentaje de células positivas
(Tabla 4). Una señal ISH de PSMA fuerte también era una
característica de la mayoría de las metástasis óseas. Las metástasis
de hígado mostraron una hibridación de RNAm de PSMA más
heterogénea. En la Tabla 5 se enumeran las clasificaciones de
Gleason de los tumores sometidos a análisis por ISH y muestra que
los tumores de grado mayor tienden a tener una probabilidad mayor
de presentar áreas intensas de expresión de RNAm de PSMA. Seis de
los carcinomas primarios presentaban poblaciones de células con una
señal de ISH fuerte para el PSMA (2 tumores - GS9, 3 tumores - GS7
y 1 tumor - GS5), 4 tumores mostraban una hibridación moderada (1
tumor - GS7, 1 tumor - GS6 y 2 tumores GS5) y un tumor GS5 no
contenía ninguna célula marcada.
\vskip1.000000\baselineskip
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Leyenda Tabla 4: Resumen de hibridación in
situ para RNAm de PSMA en un panel de próstata normal/BPH, PIN,
carcinomas primarios de próstata, y metástasis de hígado y huesos.
Se indica la intensidad de hibridación, con clasificaciones de 3+ a
1+, y el porcentaje de células positivas.
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Leyenda Tabla 5: Asociación de la clasificación
de Gleason con la intensidad de hibridación in situ de RNAm
de PSMA. Se indica la intensidad de hibridación, con clasificaciones
de 3+ a 1+ y el porcentaje de células positivas.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación in situ demostró un
aumento de la expresión específica epitelial de RNAm de PSMA en PCA
primarios y metástasis.
Estos resultados parecen indicar que la
expresión de PSMA está limitada en gran medida a los tejidos de
próstata normal y PCA y, por primera vez, que la sobreexpresión de
proteína de PSMA inmunorreactiva en tumores primarios predice
independientemente la recurrencia bioquímica de la enfermedad. La
validación del PSMA como diana terapeútica en PCA ha sido
acompañada recientemente por los primeros resultados de ensayos
clínicos en los que se ha utilizado el anticuerpo
anti-PSMA radioconjugado, huJ591, que parecen
demostrar reducciones significativas en los niveles de PSA en suero
y un encogimiento de la masa tumoral de tejidos blandos.
Un descubrimiento consistió en que la
sobreexpresión de proteína de PSMA determinada mediante
inmunoquímica en especímenes de prostatectomía presentaba una
correlación significativa con niveles elevados de PSA en suero
preoperatorios, un alto grado del tumor, el contenido de DNA no
diploide y una etapa tumoral avanzada, y predecía de forma
independiente la recaída bioquímica de la enfermedad. Esto parece
ser el primer intento de relacionar los niveles de PSMA medidos en
especímenes de prostatectomía primaria con el resultado del cáncer
de próstata, aunque una expresión de PSMA elevada ha sido asociada
con un mayor grado tumoral y una enfermedad metastásica. En
comparación con los otros factores de pronóstico posibles arriba
descritos, la detección de los niveles de PSMA en el tumor primario
tiene la ventaja de estar relacionada con la selección específica de
una terapia con anti-PSMA como diana. En este
estudio se ha utilizado el anticuerpo anti-PSMA 7E11
para la IHC basada en parafina. Este anticuerpo fue el primer
anticuerpo de PSMA desarrollado y reconoce el dominio interno de la
molécula de PSMA. Posteriormente se desarrolló una serie de
anticuerpos que se unían al dominio externo de la molécula de PSMA.
El fundamento para el desarrollo de anticuerpos de PSMA que
reconocen el dominio externo consistía en la anticipación de una
terapia selectiva para el cáncer de próstata y la conjugación del
anticuerpo selectivo con radioisótopos, toxinas y quimioterapia.
El anticuerpo 7E11 se ha utilizado para
desarrollar un radioconjugado para el procesamiento de imágenes
diagnósticas. Se utiliza la inmunogammagrafía ^{111}In Capromab
Pendetide (Prosta-Scint^{R}) para la gestión del
cáncer de próstata, pero está limitada por la dependencia del
anticuerpo 7E11 de la exposición del dominio interno del PSMA, que
no tendrá lugar en células tumorales desprovistas de apoptosis o
necrosis. Recientemente se han presentado anticuerpos del dominio
externo del PSMA, como el anticuerpo J-591, para el
tratamiento del HRPC, y también son prometedores como reactivos
para el procesamiento de imágenes.
También se llevó a cabo una evaluación de la
regulación de la expresión de RNAm de PSMA utilizando perfiles de
transcripción con biochips de DNAc de más de 50 especímenes
clínicos, cuantificación por RT-PCR en tiempo real
con TaqMan^{TM} e hibridación in situ. Se comprobó que el
RNAm de PSMA es expresado en todos los especímenes de próstata
normales y malignos, con un aumento significativo en un subconjunto
de tumores primarios y metástasis. La LCM y estudios in situ
confirmaron que el PSMA es expresado de forma preferente por el
epitelio de próstata frente al estroma y, con frecuencia, esta
expresión aumenta en células malignas. Estos descubrimientos están
respaldados por un reciente estudio de perfiles de transcripción,
que comprobó que una expresión elevada de RNAm de PSMA sólo era
inferior a la proteasa de tipo hepsina en su asociación con un
cáncer de próstata de alto grado. En conjunto, estas técnicas
moleculares diversas no sólo demuestran que el PSMA está presente
en la mayoría de los especímenes de próstata, si no en todos ellos,
y muestra un aumento a nivel de RNA y proteína en un subconjunto de
PCA y lesiones metastásicas, sino que estos datos también sirven
para validar el PSMA como una diana terapéutica que puede beneficiar
a una cantidad considerable de pacientes de cáncer de próstata.
Se ha de entender que, aunque la invención se ha
descrito en relación con la descripción detallada de la misma, la
anterior descripción está prevista para ilustrar y no para limitar
el alcance de la invención, que está definido por el alcance de las
reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones
entran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (6)
1. Método para determinar si un sujeto presenta
un riesgo de recurrencia del cáncer de próstata caracterizado
porque incluye la determinación de los niveles de expresión de PSMA
(antígeno de membrana específico de la próstata) en una muestra
obtenida de una lesión primaria de un sujeto al que se le ha
diagnosticado cáncer de próstata, donde una sobreexpresión de PSMA
en relación con un patrón de referencia, que es un nivel de
expresión de PSMA estadísticamente significativo que distingue los
sujetos que tienen recurrencia y los sujetos que no la tienen,
indica un riesgo de recurrencia del cáncer.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el patrón de referencia consiste en los
niveles de expresión de PSMA en un sujeto de control al que se le
ha diagnosticado cáncer de próstata y que no presenta recurrencia de
dicho cáncer de próstata.
3. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra consiste en una muestra de
biopsia o una muestra obtenida de una prostatectomía parcial o
radical del sujeto.
4. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque el riesgo de recurrencia se determina en
base al diagnóstico de cáncer de próstata, o después de que al
sujeto se le haya diagnosticado cáncer de próstata, o después de
que el sujeto haya sido tratado con un tratamiento anticanceroso que
puede consistir en una prostatectomía radical o parcial.
5. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque los niveles de expresión de PSMA se
determinan determinando los niveles de proteína de PSMA en una
muestra, preferentemente mediante un método seleccionado entre un
ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA),
un radioinmunoensayo (RIA), un Western blot o un método
inmunohistoquímico, o determinando los niveles de ácido nucleico de
PSMA en una muestra, preferentemente mediante un método
seleccionado entre Northern blotting, RT-PCR
y métodos basados en biochips.
6. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque a un sujeto que no presenta un nivel de
expresión elevado se le asigna un valor de un 40% o menos de riesgo
de recurrencia, preferentemente un valor de un 30% o menos de
riesgo de recurrencia.
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