ES2314982T3 - Peptidos receptores de antigenio de celulas t. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PEPTIDOS QUE AFECTAN A LAS CELULAS T, PROBABLEMENTE MEDIANTE LA ACCION SOBRE EL RECEPTOR DE ANTIGENO DE LAS CELULAS T. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA TERAPIA DE VARIOS ESTADOS DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS Y AUTOINMUNES QUE IMPLIQUEN EL USO DE ESTOS PEPTIDOS. ESPECIFICAMENTE, ESTOS PEPTIDOS SON UTILES EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS EN LOS CUALES INTERVIENEN O SE RECLUTAN CELULAS T. EN UN MODO DE REALIZACION, LOS PEPTIDOS TIENEN LA FORMULA: R1 - A B - A - R2 DONDE A ES UN ACIDO AMINADO HIDROFOBO O UNA SECUENCIA PEPTIDICA HIDROFOBA QUE COMPRENDE DE 2 A 10 ACIDOS AMINADOS; B ES UN ACIDO AMINADO CARGADO; R1 ES NH2; Y R2 ES COOH. SEGUN OTRO MODO DE REALIZACION, LOS PEPTIDOS TIENEN LA FORMULA: R1 A - B -C - R2 DONDE A ES UNA SECUENCIA DE PEPTIDOS QUE COMPRENDEN DE 0 A 5 ACIDOS AMINADOS; B ES UNA CISTEINA; C ES UNA SECUENCIA DE PEPTIDOS DE 2 A 10 ACIDOS AMINADOS; R1 ES NH2; Y R2 ES COOH.

Description

Péptidos receptores de antígeno de células T.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos nuevos diseñados para interferir con la función de las células T, de manera que el péptido nuevo puede ser usado en el tratamiento de varios estados de enfermedades inflamatorias y autoinmunológicas. En particular, el péptido es útil en el tratamiento de trastornos donde las células T están implicadas o reclutadas.

Antecedentes e introducción a la invención Ensamblaje de receptor de células T

Las células T son un subgrupo de células que junto con otros tipos de células inmunes, (polimorfonucleares, eosinófilas, basófilas, mastocitos, B-, NK células), constituyen el componente celular del sistema inmunológico. Bajo condiciones fisiológicas, las células T funcionan en vigilancia inmunológica y en la eliminación de antígenos extraños. No obstante, bajo condiciones patológicas hay evidencia convincente de que las células T' juegan un papel más importante en la causalidad y propagación de la enfermedad. En estos trastornos, la descomposición de la tolerancia inmunológica de las células T, sea central o periférica es un proceso fundamental en la causalidad de la enfermedad autoinmunológica.

La tolerancia central implica deleción tímica de células autorreactivas (selección negativa) y selección positiva de células T con baja afinidad para autoantígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Por el contrario, hay cuatro hipótesis no exclusivas entre sí que han sido propuestas para explicar la tolerancia de las células T periféricas que están implicadas en la prevención de la enfermedad autoinmunológica específica del tejido. Éstas incluyen: anergia (pérdida de señales coestimuladoras, infrarregulación de receptores fundamentales para la activación de células T), deleción de células T reactivas, ignorancia del antígeno por el sistema inmunológico y supresión de células T autorreactivas. Una vez inducida, la tolerancia no necesariamente persiste indefinidamente. Una descomposición en cualquiera de estos mecanismos puede llevar a una enfermedad autoinmunológica.

La enfermedad autoinmunológica y otros trastornos mediados por células T están caracterizados por el reclutamiento de células T en los sitios de inflamación. Las células T en estos sitios, junto con su capacidad para producir y regular citoquinas e influenciar la función de células B, organiza la respuesta inmunitaria y forma el resultado clínico final. Una comprensión del proceso de reconocimiento de antígeno de células T y activación posterior de células T, conduciendo a proliferación de células T y diferenciación, es en consecuencia esencial tanto para la salud como para la enfermedad. Una alteración en esta relación compleja de función-estructura del receptor de antígeno de células T, armonizando el reconocimiento del antígeno con la activación de células T, puede proporcionar el medio terapéutico para tratar la inflamación y los trastornos mediados por células T.

El TCR está compuesto de al menos siete proteínas^{1} transmembranales. El heterodimero (\alpha\beta-Ti) enlazado por disulfuro forma la unidad de reconocimiento del antígeno clonotípico, mientras que las cadenas invariables de CD3, que consisten en cadenas \varepsilon, \gamma, \delta y \zeta son responsables del acoplamiento del ligando que está unido a vías de señalización que supone la activación de células T y la elaboración de las respuestas celulares inmunológicas. A pesar de la diversidad genética de las cadenas del TCR, dos características estructurales son comunes para todas las subunidades conocidas. En primer lugar, son proteínas transmembranales con un único dominio de extensión transmembranal - supuestamente alfa-helicoidal. En segundo lugar, todas las cadenas del TCR tienen la característica inusual de poseer un aminoácido cargado dentro del dominio transmembranal predicho. Las cadenas invariantes tienen una única carga negativa, conservada entre el ratón y el ser humano, y las cadenas variantes poseen una carga positiva (TCR-\beta) o dos cargas positivas (TCR-\alpha). En la tabla 1 está enumerada la secuencia transmembranal de TCR-\alpha en un número de especies que muestran que esta región está altamente conservada y que filogenéticamente puede cumplir un papel funcional importante. El octapéptido (negrita) conteniendo los aminoácidos hidrofílicos arginina y lisina es idéntico entre las especies. Las sustituciones de aminoácido detectadas en las partes restantes de la secuencia transmembranal son menores y conservadoras.

TABLA 1 Comparación de la secuencia de la región transmembranal de TCR-\alpha en diferentes especies

1

Los estudios sobre el ensamblaje del TCR multicomponente por Manolios et al^{2,3,4} han demostrado que la interacción estable entre TCR-\alpha y CD3-\delta y TCR-\alpha y CD3-\varepsilon fue localizada para ocho aminoácidos dentro del dominio transmembranal de TCT-\alpha y fueron los aminoácidos cargados arginina y lisina los que fueron fundamentales para este proceso. Este descubrimiento ejemplificó el hecho de que los aminoácidos dentro del dominio transmembranal no sólo funcionaron para anclar proteínas sino que fueron importantes en el ensamblaje de complejos de subunidades e interacciones de proteína-proteína. Por primera vez, se descubrió que el ensamblaje de este receptor complejo podría unirse sobre sólo ocho aminoácidos. El sistema anterior dependía de la modificación de la cadena de ADN complementaria (ADNc) para crear varios mutantes de proteínas. Las moléculas de ADNc quiméricas fueron modificadas en células COS para expresar la proteína requerida. La coexpresión de estas proteínas quiméricas fue usada para evaluar la región de interacción. La tecnología implicó la manipulación de ADNc, etiquetación metabólica, inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Los dominios transmembranales son pequeños en tamaño y las proteínas que cruzan esta región están forzadas a una configuración alfa-helicoidal. Estas características biofísicas junto con la capacidad para diseñar interacciones de proteína-proteína por medio de grupos de carga transmembranal sugirieron un nuevo enfoque posible para intervenir e interrumpir de forma potencial la función del TCR. El uso de péptidos como posibles inhibidores del ensamblaje, el reconocimiento y la aplicación de esta secuencia peptídica como un agente terapéutico posible para interferir con la función de las células T no fue una extensión normal u obvia.

En la publicación de patente divisionaria internacional No. WO 96/22306 el presente inventor desarrolló péptidos que interrumpen la función de TCR.

Jameson SC et al., (1993) J. Exp. Medicine, vol. 177, no. 6, 1541-1550, WO95/26980A (Immulogic Pharma Corp), WO94/20127A (Cytel Corp), Cole GA et al., (1995) J. Immunol. vol. 155, nº. 6, 2841-2848, WO96/03140A (Cytel Corp), Oldstone M et al., (1995) J. Virol. vol. 169, nº. 12 7423-7429, Ikagawa S et Al., (1996) J. Allergy and Clinical Immunol. vol. 97, no. 1 part 1 53-64, Livingston PG et al., (1995) J. Immunol. vol. 154, no. 3, 1287-1295, WO95/07707A (Cytel Corp), Shimizu NS et al., (1995) Antiviral Chem & Chemotherapy vol. 6, no. 1, 17-24, Mari B et al., (1996) Faseb J. vol. 10, no. 2, 309-316 y Gundlach BR et al., (1996) J. Immunol. Methods, vol. 192, nº. 1-2. 149-155 todos revelan varios péptidos de fórmula R, -A-B-A-R_{2} donde A es un aminoácido hidrofóbico o una secuencia peptídica hidrofóbica de 2-10 aminoácidos, incluyendo un aminoácido cargado; B es un aminoácido cargado, R_{1} es NH_{2}, y R_{2} es COOH.

Kuchroo et al, J. Immunol, 153(7): 3326-3336 (1994) describe, entre otros, el péptido de la fórmula HSLGKLLGRPDKF (tabla III/péptido L144/R147) que es un antagonista de TCR.

Productos biológicos en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria

En la última década se ha desarrollado una nueva etapa de la terapéutica con los denominados "Biológicos", cuyo objetivo es enfocar las células individuales específicas, y moléculas dentro de las células, con el objetivo específico de interrumpir redes y cascadas inmunológicas para subyacer el proceso de la enfermedad. El modelo de enfermedad para artritis reumatoide ha sido ejemplar en el diseño de agentes biológicos y varios enfoques diferentes han sido concebidos y evaluados^{6}. El modelo predice que un péptido artritogénico inicial es presentado a las células T por una célula que presenta el antígeno (APC) que provoca la activación de células T y la liberación de citoquinas y proteasas que culminan en inflamación crónica y daños en las articulaciones (figura 1a). En base a este modelo un gran número de diferentes estrategias terapéuticas han sido concebidas y usadas de forma potencial para interferir con la interacción entre TCR, complejo principal de histocompatibilidad y antígeno (complejo trimolecular) y de ese modo influir en la respuesta inmunitaria. Intentos terapéuticos recientes para reducir los números de linfocitos circulantes, incluyeron irradiación^{7} nodal, drenaje^{8} del conducto torácico y linfocitaféresis^{9}. Sitios nuevos de intervención de linfocitos están numerados (1-5) en la figura 1a e incluyen el uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) bien para delecionar células T o para regular su función, las vacunas de células T contra las células T patógenas, la síntesis de péptidos análogos para concurrir con el péptido antigénico, y la inhibición de la acción de citoquina después de la activación de células T. Estos nuevos enfoques terapéuticos inmunomoduladores han sido aplicados en modelos animales, de enfermedad autoinmunológica inducida espontáneamente o experimentalmente, con resultados alentadores. Estos enfoques están siendo usados ahora en la enfermedad^{8} autoinmunológica humana. Enfoques más recientes se centran en eliminar o modular células T interfiriendo con el delicado complejo trimolecular entre el antígeno, células T y moléculas de MHC. Puesto que el antígeno es reconocido por células B y/o T y eventos posteriores están basados en esta interacción, hemos razonado que la interferencia con los eventos de reconocimiento de antígenos tempranos (complejo trimolecular) puede tener efectos profundos en el desarrollo de la enfermedad, sin tener en cuenta qué eventos celulares descendentes y de citoquina pueden ocurrir.

El complejo trimolecular como el sitio para la intervención terapéutica ha sido el objeto del enfoque desde los últimos avances en la caracterización molecular de sus constituyentes y ha proporcionado diferentes enfoques para la intervención inmunológica. El objetivo de la terapia es eliminar, prevenir o infrarregular la respuesta de células T por una variedad de medios (figura 1b).

(i)

MAbs a antígenos de células T. El uso de MAbs en el tratamiento de RA ha sido revisado por varios autores^{6,10,11} Los MAbs evaluados fueron dirigidos contra una variedad de antígenos que variaban de: (a) aquellos presentes en todas las células T maduras, y consideradas como interventoras en la patogénesis de RA (CD5, CDw52)^{12,13}; (b) MAbs específicos para subconjuntos de células T (CD4), teniendo la ventaja de efectos^{14,15} inmunosupresores limitados; y (c) para MAbs dirigidos contra antígenos de activación de células T (receptor IL-2) que puede específicamente suprimir células T activadas en respuesta al antígeno^{16,17}. Todos los MAbs usados son derivados de roedores y sólo CAMPATH-1 H ha sido "humanizado" por técnicas de ADNc recombinante. Estudios clínicos indican que estos MAbs son bien tolerados en pacientes y pueden inducir una respuesta clínica favorable. Efectos secundarios incluyen una reacción inmune a los anticuerpos de roedores que pueden restringir el uso repetitivo.

(ii)

Terapia anti-MHC. Estudios inmunogenéticos han demostrado que las moléculas de MHC (DR1, DR4, Dw4 y DR4 Dw14) son importantes en la susceptibilidad^{18} de RA. Puesto que las moléculas de MHC presentan péptidos antigénicos a las células T éstas proporcionan otro objetivo para la intervención inmunológica. La función de estas moléculas puede ser interferida bien usando MAbs (para los sitios de unión del antíge- no)^{19} o la unión de alta afinidad de péptidos competidores a la ranura de MHC (véase abajo). MAbs dirigidos contra moléculas de MHC interfieren con la iniciación de la enfermedad en diferentes modelos animales de autoinmunidad^{20,21} y humanos^{22}.

(iii)

Competición peptídica. El reconocimiento de células T de antígeno puede ser interrumpido usando péptidos de unión de MHC de alta afinidad que bloquean el sitio de unión del antígeno de moléculas de MHC e inhiben respuestas de las células T. Por sustitución de residuos aminoácidos particulares es posible generar péptidos "diseñadores", con alta afinidad a moléculas de MHC pero no activan células T^{23}. Esta terapia tiene la ventaja de la especificidad sin provocar una inmunosupresión generalizada.

(iv)

Vacunación de células T. Esta forma de terapia tiene potencial para aquellas enfermedades que muestran oligoclonalidad de células T. La idea es obtener clones de células T patógenas y vacunar contra estas células esperando eliminarlas del repertorio de células T disponibles. Otro método más refinado de vacunación ha sido sintetizar péptidos correspondientes a las secuencias receptoras de células T que están implicadas en el reconocimiento de antígenos. Los modelos de animales autoinmunológicos vacunados con tales péptidos soportan la consideración de que es posible bloquear clones de células T funcionales usando péptidos^{24,25} sintéticos. Si estas estrategias antiTCR son aplicables a la enfermedad reumatoide depende de la oligoclonalidad de las células autorreactivas y su uso de TCR limitado.

\quad

Aunque una evidencia controvertida de un repertorio limitado del uso de TCR ha seguido siendo proporcionada en RA^{26,27}.

(v)

Terapia de citoquina. Análisis del líquido sinovial de pacientes con RA ha mostrado la presencia de un gran número de citoquinas incluyendo el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), gamma-interferon (IFN-\gamma), interleuquina-1 (IL-1) y factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha)^{28}. Las citoquinas interactúan con las células para coordinar la respuesta inmunológica e inflamatoria. Pueden ser agrupadas bien como proinflamatorias o como antiinflamatorias. IL-1 y TNF-\alpha están en el último grupo y actúan sinergísticamente. TNF-\alpha es también una de las citoquinas más importantes que regulan la expresión de IL-1^{28}. Debido a su importancia central los intentos para interferir con su regulación o producción pueden tener un efecto positivo en los resultados^{29,30} de la enfermedad. La administración del antagonista del receptor de IL-1 a ratas y ratones con artritis ha reducido la gravedad de las lesiones de articulaciones y está en estudios de Fase II en enfermedad humana. El uso terapéutico de MAbs al receptor de IL-2 tiene efectos transitorios. Los receptores para un grupo grande de citoquinas han sido clonados y ordenados (revistos por Dower y Sims)^{32} y normalmente han estado bajo evaluación clínica. Puede ser que la forma soluble de los receptores de citoquina pueda ser usada para aislar las citoquinas por una interacción de tipo ligando y de ese modo reducir la inflamación. La ciclosporina A modula la producción de citoquina de las células T y cuando se ha dado en varios ensayos ha dado buena respuesta clínica. No obstante la nefrotoxicidad asociada limita su uso^{34}.

(vi)

la capacidad para interrumpir la función celular por el uso de péptidos derivados de secuencias proteínicas fundamentales para el ensamblaje del receptor, ha sido publicada^{35} recientemente y es un enfoque nuevo para el uso de productos biológicos, que podría ser incluido en el esquema de mecanismos de acción biológicos. Es decir, la interrupción de la función celular por "desorganización" del ensamblaje de receptores usando péptidos. Por diseño, el péptido elegido correspondía a una secuencia transmembranal común para ambas células CD4 y CD8 y normalmente otros sitios únicos de interacción de cadena de TCR están bajo investigación. En particular, las interacciones en el dominio extracelular entre las cadenas de reconocimiento del antígeno, pueden demostrarse útiles para proyectar péptidos para clones individuales patógenos de células T con el uso específico de V\alpha/V\beta.

Descripción de la invención

El presente inventor ha desarrollado ahora nuevos péptidos adicionales que interrumpen la función de TCR, supuestamente interfiriendo con el ensamblaje. Estos péptidos están basados en secuencias del péptido del núcleo. El presente inventor ha encontrado también que estos péptidos tienen un efecto en la inflamación mediada por células T. Las manifestaciones clínicas eficaces del péptido administrado serían una reducción en la inflamación, p. ej. como se ha demostrado por una reducción de la artritis en un modelo de adyuvante de artritis.

Por consiguiente, en un primer aspecto la presente invención proporciona un péptido que inhibe la función de TCR, seleccionado de

Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly-Phe

Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly, y

Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val

Por "secuencia peptídica hidrofóbica" nos referimos a una secuencia que incluye al menos 1 aminoácido hidrofóbico seleccionado de Ala, Val, Leu, Ile, pro, Phe, Tyr o Met y que no incluye un aminoácido cargado seleccionado de Lys, Arg, His, Asp o Glu.

Las modificaciones de los péptidos están contempladas aquí e incluyen, pero no se limitan a, modificaciones en las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos innaturales y/o sus derivados durante la síntesis peptídica y el uso de agentes reticulantes y otros métodos que imponen limitaciones conformacionales en los péptidos.

Ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tal como por alquilación reductiva por reacción con un aldehído seguido por reducción con NaBH_{4}; amidificación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5'-fosfato seguido de la reducción con NaBH_{4}.

El grupo guanidina de residuos de arginina puede ser modificado por la formación de productos de condensación heterocíclica con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede ser modificado por activación de carbodiimida por la formación de O-acilisourea seguido de derivatización posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente.

Residuos de triptófano pueden ser modificados por, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-bitrobencilo o haluros de sulfenilo. Por otro lado, los residuos de tirosina, pueden ser alterados por nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

La modificación del anillo de imidazol de un residuo de histidina puede ser realizada por alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.

Ejemplos de incorporación de aminoácidos antinaturales y derivados durante la síntesis peptídica incluyen, pero no se limitan a, el uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, T-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico; 2-tienil alanina y/o D-isómeros de aminoácidos.

Los péptidos de la presente invención pueden ser sintetizados usando técnicas bien conocidas por los expertos en este campo. Por ejemplo, los péptidos pueden ser sintetizados usando una síntesis de solución o síntesis de fase sólida como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 9 titulado "Peptide Synthesis" por Atherton y Sheppard que está incluido en una publicación titulada "Synthetic Vaccines" editada por Nicholson y publicada por Blackwell Scientific Publications. Preferiblemente un soporte de fase sólida es utilizado que puede ser perlas de gel de poliestireno donde el poliestireno puede ser reticulado con una pequeña proporción de divinilbenceno (p. ej. 1%) que es posteriormente hinchado por solventes lipofílicos tales como diclorometano o solventes más polares tales como dimetilformamida (DMF). El poliestireno puede ser funcionalizado con grupos clorometilo o anionometilo. De forma alternativa, se usa el gel reticulado y functionalizado de polidimetil-acrilamida que puede ser altamente disuelto e hinchado por DMF y otros solventes dipolares aprólicos. Otros soportes pueden ser utilizados basados en polietilenglicol que es normalmente injertado o por el contrario fijado a la superficie de perlas de poliestireno inertes. En una forma preferida, se puede hacer uso de soportes o resinas sólidos comerciales que son seleccionados de PAL-PEG, PAK-PEG, KA, KR o TGR.

En la síntesis en estado sólido, se hace uso de grupos de bloqueo reversibles que tienen la función doble de enmascarar la reactividad indeseada en los grupos funcionales \alpha-amino, carboxi o de cadena lateral y de destruir el carácter bipolar de los aminoácidos y péptidos que los vuelven inactivos. Tales grupos funcionales pueden ser seleccionados de ésteres de t-butilo de la estructura RCO-OCMe_{3}-CO-NHR que es conocida como derivados de t-butoxi carboxilo o ROC. También se puede hacer uso de los ésteres de bencilo correspondientes que tienen la estructura RCO-OCH_{2}-C_{6}H_{5} y uretanos que tienen la estructura C_{6}H_{5}CH_{2}O CO-NHR que se conocen como los derivados de benciloxicarboniol o Z. También se puede hacer uso de derivados de fluorenil metanol y especialmente el fluorenil-metoxi carbonilo o grupo Fmoc. Cada uno de estos tipos de grupos de protección es capaz de hacer un seccionamiento independiente en presencia de otro de modo que se hace un uso frecuente, por ejemplo, de estrategias de protección de BOC-bencilo y Fmoc-terciario butilo.

Se debería hacer referencia también a un agente de condensación para la unión de los grupos amino y carboxi de aminoácidos o péptidos protegidos. Esto puede hacerse activando el grupo carboxi de modo que éste reaccione espontáneamente con una amina libre primaria o secundaria. Ésteres activados tales como aquellos derivados de p-nitrofenol y pentafluorofenilo pueden ser usados para este propósito. Su reactividad puede ser aumentada por adición de catalizadores tales como 1-hidroxibenzotriazol. También pueden ser usados ésteres de triazina DHBT (como se ha discutido en la página 215-216 de la referencia anteriormente mencionada Nicholson). Otras especies acilantes se forman in situ por el tratamiento del ácido carboxílico (es decir, el aminoácido o péptido protegido con Na) con un reactivo de condensación y son reaccionadas inmediatamente con el componente amino (el aminoácido o péptido protegido con carboxi o C). Diciclohexilcarbodiimida, el reactivo BOP (al que se hace referencia en la página 216 de la referencia Nicholson), O'Benzotriazol-N, N, N'N'-tetra metil-uronio hexaflurofosfato (HBTU) y su análogo tetrafiuroborato son agentes de condensación usados frecuentemente.

La fijación del primer aminoácido al soporte de fase sólida puede ser realizada usando BOC-amino ácidos de cualquier manera adecuada. En un método, los aminoácidos BOC son fijados a la resina de clorometilo por calentamiento de las sales de trietil amonio con la resina. Fmoc-amino ácidos pueden ser acoplados a la resina de alcohol p-alcoxibencílico de manera similar. De forma alternativa, se puede hacer uso de varios agentes de conexión o "asideros" para unir el primer aminoácido a la resina. A este respecto, ácido p-hidroximetil feniláctico enlazado a aminometil poliestireno puede ser usado para este propósito.

En otro aspecto la presente invención proporciona una composición terapéutica que incluye un péptido del primer, segundo o tercer aspecto de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto la presente invención proporciona un método de tratamiento de un sujeto que sufre de un trastorno en el que están implicadas o reclutadas las células T, el método incluyendo la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido del primer, segundo o tercer aspecto de la presente invención.

La composición terapéutica puede ser administrada por cualquier vía apropiada como será reconocido por los expertos en la técnica. Tales vías incluyen, oral, transdérmica, intranasal, parenteral, intraarticular e intraocular.

En otro aspecto la presente invención consiste en un método de entrega de una fracción química a una célula incluyendo la exposición de la célula a la fracción química conjugada a un péptido del primer, segundo o tercer aspecto de la invención.

En una forma de realización preferida la fracción química es conjugada al terminal carboxi del péptido.

Una lista no exhaustiva de trastornos donde están implicadas/reclutadas células T incluye:

-

diatésis alérgica que incluye hipersensibilidad de tipo retardado y dermatitis de contacto;

-

la enfermedad autoinmunológica incluyendo SLE, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto y anemia perniciosa;

-

condiciones gastroenterológicas incluyendo la enfermedad del intestino inflamatorio; enfermedad de Crohn, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa;

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problemas de la piel incluyendo psoriasis y pemphigus vulgaris;

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enfermedad infecciosa incluyendo el virus del SIDA y herpes simplex/zoster;

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condiciones respiratorias incluyendo alveolitis alérgica;

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problemas cardiovasculares incluyendo pericarditis autoinmunológica;

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Transplante de órganos;

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condiciones inflamatorias incluyendo miositis y espondilitis anquilosa; y

-

cualquier trastorno en el que estén implicadas/reclutadas las células T.

Como se utiliza en este caso, el término "sujeto" se refiere tanto a animales humanos como no humanos.

Está previsto que los péptidos de la presente invención sean capaces de introducir células. Por consiguiente está previsto que, aparte de sus demás usos, el péptido de la presente invención pueda ser usado como un "portador" para entregar otros agentes terapéuticos a las células. Esto podría ser conseguido, por ejemplo, conjugando el terapéutico para ser entregado en la célula al péptido de la presente invención.

Como será fácilmente entendido por los expertos en este campo los aminoácidos hidrofóbicos son Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr y Met; los aminoácidos cargados positivamente son Lys, Arg y His; y los aminoácidos cargados negativamente son Asp y Glu.

De manera que se comprenda más claramente la naturaleza de la presente invención, las formas preferidas de la misma serán ahora descritas con referencia a los ejemplos siguientes y figuras donde:

Figura 1(a) - Representación esquemática de reconocimiento de antígenos por células T y eventos posteriores de flujo descendente. Sitios posibles de intervención incluyen el complejo trimolecular, células T, moléculas de superficie de células T, citoquinas, reclutamiento de células, y enzimas catalíticas.

Figura 1(b) - Complejo trimolecular con sitios de intervención posibles.

Figura 2 - Efecto de los péptidos en células del ganglio linfático cebadas. Se muestran errores medios y estándar (n=4). Las concentraciones finales de péptidos fueron 100 \mug/ml y fueron entregadas a los pocillos en 20 \mul de ácido acético al 0,1%.

Figura 3 - Efecto del(los) péptido(s) en células del ganglio linfático cebadas. Se muestra el error medio y estándar de cuatro pocillos. El péptido del núcleo (CP) fue disuelto de forma reciente (fresco) o en solución durante al menos tres meses a 4ºC (viejo).

Figura 4 - Efecto de los péptidos en una línea de células T específicas para MTB. Se muestra el error medio y estándar de cuatro pocillos. Los péptidos fueron de 100 \muM en los pocillos y las soluciones concentradas fueron de 1 mM en 0,1% de ácido acético.

Figura 5 - Efecto de los péptidos en una línea de células T específica para MTB. Se muestran errores medios y estándar (n=4). Las concentraciones finales de péptidos fueron 100 \muM excepto si se especificaron de otro modo. Péptido del núcleo (CP) a 0,1 mg/ml es 87 \muM.

Figura 6 - Peso de ratas tratadas y no tratadas. Se muestran los errores medios y estándar de cinco ratas en cada grupo.

Figura 7(a) - Grosor de la pata en ratas no tratadas. Cada punto representa la media de ambas patas traseras de cada rata.

Figura 7(b) - Grosor de la pata en ratas tratadas con el péptido J. Cada punto representa la media de ambas patas traseras de cada rata.

Figura 7(c) - Grosor de la pata en ratas tratadas con el péptido O. Cada punto representa la media de ambas patas traseras de cada rata.

Figura 7(d) - Grosor de la pata en ratas tratadas con el péptido K. Cada punto representa la media de ambas patas traseras de cada rata.

Figura 8 - Peso de las ratas no tratadas (MTB sólo) y tratadas (péptidos N,M,P). Se muestran los errores medios y estándar de cinco ratas en cada grupo.

Figura 9(a) - Grosor del tobillo de ratas no tratadas. Cada punto representa el grosor de las articulaciones del tobillo individuales.

Figura 9(b) - Grosor del tobillo de ratas tratadas con el péptido M. Cada punto representa el grosor de las articulaciones del tobillo individuales.

Figura 9(c) - Grosor del tobillo de ratas tratadas con el péptido N. Cada punto representa el grosor de las articulaciones del tobillo individuales.

Figura 9(d) - Grosor del tobillo de ratas tratadas con el péptido P. Cada punto representa el grosor de las articulaciones del tobillo individuales.

Figura 10 - Peso de ratas tratadas y no tratadas con el péptido L. Se muestran errores medios y estándar de cinco ratas en cada grupo.

Figura 11(a) - Grosor de la pata en ratas no tratadas. Cada punto representa el grosor de una pata trasera individual.

Figura 11(b) - Grosor de la pata en ratas tratadas con el péptido L. Cada punto representa el grosor de las patas traseras individuales.

Figura 11(c) - Grosor del tobillo de ratas no tratadas. Cada punto representa el grosor de las articulaciones del tobillo individuales.

Figura 11(d) - Grosor del tobillo de ratas tratadas con el péptido L. Cada punto representa el grosor de las articulaciones de tobillo individuales.

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Ejemplos Métodos experimentales

Síntesis de péptidos. Los péptidos fueron sintetizados por síntesis de fase sólida usando FMOC química en el modo manual. Los péptidos desprotegidos fueron comprados de Auspep (Melbourne, Australia) con más del 75% de pureza según fue evaluado por HPLC. Un ejemplo de una hoja de especificación incluida está anexo en el Apéndice. La concentración final de péptido disuelta en ácido acético al 0,1% usado en cultivo celular estaba entre 10 \muM-200 \muM. Para estudios in vivo, los péptidos fueron disueltos/suspendidos en aceite de esqualano (2-,6-,10-,15-,19-,23-hexametiltetracosano).

Células. Las líneas celulares siguientes fueron usadas: 2B4.11, un hibridoma de células T de murina que expresa un receptor de antígeno completo en la superficie de la célula y produce IL-2 después del reconocimiento del antígeno (citocromo c); una línea de células T dependiente de interleuquina-2 (CTLL) para ensayos de IL-2 biológicos convencionales; y la línea celular LK 35.2 (LK, llevando I-E^{k}) del hibridoma de linfocitos B que actúa como la célula que presenta el antígeno. Los hibridomas fueron crecidos en un medio de células T (medios RPMI-1640 conteniendo el 10% de suero de ternera fetal (FCS), gentamicina (80 \mug/ml), glutamina (2 mM) y mercaptoetanol (0,002%)). La línea celular del fibroblasto de riñón (COS) de mono verde africano fue crecida en medio Dulbecco's modificado con medio de Eagle (DMEM) suplementado con el 10% de FCS.

Ensayo^{36} de presentación con antígeno. El hibridoma (2x10^{4}) de células T 2B4.11 de ratón fue cultivado en pocillos de microtitulación con antígeno LK35.2 que presenta células B (2x10^{4}) y 50 \muM de citocromo c de pichón. Después de 16 hr, 50 microlitros de sobrenadante del ensayo fueron eliminados y evaluados para la presencia de IL-2. Diluciones dobles en serie del sobrenadante en los medios fueron cultivadas con la línea de células T CTLL dependiente de IL-2. Después de 16 hr, las células CTLL fueron impulsadas con ^{3}H-timidina durante 4 hr y se determinaron las mediciones con IL- 2 (IU/ml). Los péptidos examinados incluyeron: CP, A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, 0, y P (Tabla 2). El péptido L fue muy insoluble y no fue evaluado in vitro. Los péptidos fueron evaluados en el ensayo de presentación con antígeno a concentraciones finales entre 10 \muM y 200 \muM.

Células del ganglio linfático cebadas (PLNC). Ratas alistar macho fueron inyectadas intradérmicamente en la base de la cola con 1 mg de Mycobacterium tuberculosis matada con calor (MTB) suspendida en 0,2 ml de esqualano. Cuando la artritis aguda estaba bien desarrollada, después de 10 a 16 días, las ratas fueron matadas y los ganglios poplíteos hinchados fueron eliminados y se hizo una única suspensión celular presionando el tejido a través de una criba fina bajo condiciones asépticas. Las células fueron lavadas en medio completo, resuspendidas y contadas. Aproximadamente 3,5 x 10^{8} células viables fueron obtenidas de dos ratas. El medio usado fue RPMI 1640 suplementado con 25 mM de HEPES, penicilina (100 \mug/ml), estreptomicina (80 \mug/ml), 2,5 x 10^{-5} M de 2 mercaptoetanol y 2% de suero de rata normal agrupado. Las células fueron pipetadas en los pocillos de fondo plano, placas de microtitulación de 96 pocillos a 2x10^{5}/pocillo y una suspensión de MTB fue añadida a una concentración final de 100 \mug/ml. Los péptidos fueron entregados a los pocillos en un volumen de 20 \mul dando concentraciones finales de 100 \mug/ml de péptidos (o 100 \muM) y 0,01% de ácido acético, y un total de 200 \mul por pocillo. Las placas fueron incubadas a 37ºC en una incubadora humedecida al 5% de CO_{2} durante 3 días y luego fueron impulsadas con 1 \muCi por pocillo de ^{3}H-timidina en 25 ml de medio. Después de una incubación adicional durante toda la noche, los cultivos fueron cosechados usando una cosechadora automatizada celular, y contados en un espectrómetro de \beta-centelleo.

Líneas de células T. El método usado fue de Sedgwick et al (1989)^{37}. PLNCs de ratas inmunizadas con MTB fueron cultivadas en matraces de cultivo de 75 cm^{2} a 5 x 10^{6} por ml en un total de 50 ml conteniendo 100 \mug/ml de MTB. Después de tres días las células fueron centrifugadas y resuspendidas en 2 ml de medio en un tubo centrífugo de 15 ml y fueron puestas en una base con 3 ml de diatrizoato de Ficoll (9,9% de Ficoll 400. 9,6% de diatrizoato de sodio), y centrifugadas a 800 g durante 20 minutos. Los blastos de células T fueron recuperados de la interfaz, lavados dos veces y resuspendidos a 2 x 10^{5} por ml en medio suplementado con el 10% de FCS y el 15% de sobrenadante de células del bazo estimuladas por con A, como una fuente de IL-2. Después de cuatro días de cultivo en la fase de reposo, 2 x 10^{5} células T por ml fueron reestimuladas con antígeno y 10^{7} timocitos de rata singénica por ml para actuar como células que presentan antígenos. Éstas han sido inactivadas por incubación con 25 \mug/ml de mitomicina C durante 20 minutos a 37ºC y lavadas cuidadosamente tres veces. Los cultivos se hicieron en matraces de 75 cm^{2} que contenían 50 ml y el antígeno, MTB, fue añadido a 100 \mug/ml. Los matraces fueron puestos de pie verticalmente y cultivados durante 3 días. Nuevamente los blastos de células T fueron recuperados por separación en Ficoll/diatrizoato, y el ciclo fue repetido. Después de 2-4 ciclos, las células fueron dispuestas en placas de 96 pocillos a 10^{4} Células T/pocillo y 10^{6} timocitos inactivados por mitomicina C, en 200 ml de medio conteniendo 100 \mug/ml MTB y el 2% de suero de rata. Adiciones de 20 \mul fueron hechas a los pocillos que contenían péptidos en 0,1% de ácido acético. Los cultivos fueron incubados durante tres días, luego se añadió ^{3}H-timidina (1 \muCi en 25 ml de medio) y la incubación continuó durante toda la noche después de la cual fue cosechada y contada en el contador \beta. Los resultados están mostrados como incorporación de timidina tritiada en cuentas 2 por minuto (cpm). Los péptidos evaluados en estos ensayos por su capacidad para inhibir la proliferación de linfocitos T estimulada por antígenos están mostrados en la tabla 2.

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TABLA 2 Péptidos sintéticos y su secuencia

2

Artritis inducida por adyuvante en ratas. La artritis fue inducida en ratas por una única inyección intradérmica de MTB matada con calor en 200 \mul de esqualano (adyuvante) en la base de la cola. Los péptidos (35 mg) fueron suspendidos en un mililitro de esqualano conteniendo 5 mg de MTB. Es decir, 1 mg de MTB y 7 mg de péptido fueron inyectados intradérmicamente en 0,2 ml de esqualano. En intervalos regulares durante hasta 28 días, los animales fueron pesados y su condición artrítica fue evaluada por medición del grosor del tobillo y el grosor de la pata trasera (con un micrómetro) y registrando el número de articulaciones artríticas implicadas. Las ratas fueron alojadas en jaulas estándar después de la inyección en la cola inicial y permitieron el acceso ilimitado a agua y a alimentos granulados. Las ratas generalmente desarrollaron artritis 12-14 días después de la inyección. Consistente con los informes precedentes, no todas las ratas a las que se les dio MTB/esqualano desarrollaron artritis. En nuestro caso el índice de éxito fue superior al 80% de las ratas de control inyectadas con MTB que desarrollaron artritis. En el día 29, los animales fueron sacrificados.

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Resultados (a)In vitro Efecto de péptido de receptor de células T y sus variantes en la proliferación estimulada con antígeno en células del ganglio linfático cebadas de rata (PLNC) y líneas de células T

Experimentos iniciales que intentaron demostrar un efecto del péptido en la función de las células T in vitro usaron un ensayo de presentación con antígeno. El hibridoma T 2B4 de ratón, específico para el citocromo c de proteína, fue presentado con antígeno por la línea celular LK, y el contenido de IL-2 en el sobrenadante fue bioevaluado midiendo la proliferación de la línea dependiente IL-2, CTLL^{5}. Como los hibridomas pueden ser fenotípicamente inestables, las células T primarias pueden ser un mejor modelo y se usaron células del ganglio linfático de ratas inmunizadas con MTB matado con calor.

Experimento 1 de PLNC. El ensayo mostró un fuerte efecto inhibitorio del péptido del núcleo en la proliferación de células T (Figura 2), reduciendo las cuentas hasta aproximadamente el 10% del control de vehículo. Allí hubo una proliferación insignificante en la ausencia de antígeno, confirmando que las cuentas reflejaban la respuesta de células T al antígeno, es decir, función de células T genuina. De manera interesante, algunos péptidos modificados también tienen actividad. El péptido H resultó reducir la proliferación de células T.

Experimento 2 de PLNC. En este experimento, las cuentas anteriores en pocillos sin antígeno fueron muy altas, superiores a 10000 cpm (figura 3). Aun así, el control de vehículo fue mucho más alto a 40000 cpm, así los resultados siguieron siendo interpretables. Los objetivos de este experimento fueron usar el modelo más robusto de los cultivos de PLNC para evaluar otra vez los péptidos por separado y en combinación. Como diferentes péptidos podrían trabajar hipotéticamente en las diferentes partes del receptor de células T de las que fueron derivados (tabla 2), péptidos de distintas cadenas usados de forma combinada pueden actuar sinergísticamente. Se puede observar en la Figura 3 que el péptido del núcleo redujo la proliferación de células T estimuladas por antígenos, si había sido disuelto o almacenado durante más de tres meses a 4ºC. El péptido P también mostró actividad. Péptidos M y N no redujeron la proliferación. Las combinaciones de péptidos M+CP, CP+P, CP+P+N y P+N+M resultaron en ^{3}H-timidina reducida aproximadamente igual al promedio de sus efectos individuales y ninguna acción sinergística de péptidos combinados fue observada.

Experimento 1 de línea de células T. El control, que contiene justo el vehículo (20 \mul de ácido acético al 0,1%) sólo redujo las cuentas considerablemente en comparación con el control positivo no tratado, de más de 50000 a aproximadamente 30000 (figura 4). Éste no fue el caso en los experimentos de PLNC donde el vehículo sólo no tuvo efectos. El péptido del núcleo a 100 \mug/ml redujo las cuentas adicionalmente hasta aproximadamente 18000 cpm, y 200 \mug/ml de péptido del núcleo redujo adicionalmente las cuentas hasta aproximadamente el 25% del nivel de control. Los péptidos H y P también disminuyeron la proliferación celular un 50% o más, en comparación con el control de vehículo. En ausencia de antígeno, hubo aproximadamente un historial de 4000 cpm en este
experimento.

Experimento 2 de línea de células T. Como en el experimento anterior, las células de línea de células T fueron afectadas adversamente por el vehículo sólo, con las cuentas reflejando la proliferación, reducidas hasta aproximadamente la mitad del valor de control positivo (Figura 5) no obstante la estimulación no específica de células T fue insignificante en la ausencia de antígeno. Péptido del núcleo a una concentración de 100 \muM redujo las cuentas adicionalmente hasta aproximadamente el 33% de su control de vehículo y a 200 \muM, 16% del control. El control de tampón para péptidos M y N, que fue 0,05M de carbonato sódico, pH 9.6 (5 mM en el pocillo), no fue tan perjudicial para el ensayo como 0,1% de ácido acético (1,75 mM en el pocillo), dando como resultado una reducción ligera en la incorporación de ^{3}H-timidina en comparación con el control positivo (datos no mostrados). No obstante los péptidos M y N (100 \muM) no mostraron efectos en la proliferación de células T. El péptido H redujo las cuentas al 66% de los controles y el péptido P tuvo un efecto marginal.

Discusión. Ha sido mostrado en estos experimentos que los péptidos receptores de células T pueden inhibir la proliferación de células T en respuesta al desafío con el antígeno específico al que las células han sido cebadas. Esto fue mostrado tanto para cultivos de ganglio linfático primarios, como para líneas de células T establecidas en cultivo. El resultado más profundo fue en el primer experimento por CP que redujo la proliferación un 90%. Los péptidos H también redujeron las cuentas consistentemente en comparación con el control de vehículo de ácido acético pero no a la misma extensión. El péptido P fue el más inhibitorio en la figura 2 y también eficaz en las Figuras
3 y 4.

La solubilidad de los péptidos fue variable. En la concentración de las soluciones concentradas, 1 mg/ml o 1 mM, muchas soluciones peptídicas parecieron claras. Excepciones fueron los péptidos H, I, O, P, que fueron turbios o tuvieron partículas no disueltas. En consecuencia, la concentración real de péptidos en solución en los pocillos de cultivo serían inferiores que aquellos designados en el caso de los péptidos parcialmente solubles. El péptido del núcleo podría ser disuelto a 2 mg/ml, pero no fue completamente soluble a 5 mg/ml. Cuando 20 \mul de estas soluciones concentradas fueron añadidos a los pocillos, 0,2 mg/ml de CP fue más inhibitorio que 0,1 mg/ml, no obstante, 0,5 mg/ml fue menos eficaz, como el péptido precipitado tras la adición al pocillo. El vehículo para los péptidos, excepto M y N, fue el 0,1% de ácido acético que dio 0,01%, es decir, 1,75 mM en los pocillos. El medio tamponado con HEPES tamponó eficazmente esta acidez, pero además de la concentración de acetato, el medio fue eficazmente reducido en concentración al 90%. Esto no afectó contrariamente a la proliferación estimulada por antígeno de cultivos de células de ganglios linfáticos primarios (datos no mostrados), pero tuvo un efecto marcado en cultivos de líneas de células T, reduciendo la incorporación de timidina tritiada un 50%. En estos experimentos, efectos de péptidos podrían además ser determinados por comparación con el control de vehículo. El tampón de carbonato sódico de 0,05M, usado para disolver péptidos M y N, no fue tan perjudicial para la línea de células T como el ácido acético. El péptido L no fue evaluado porque fue extremadamente insoluble. De manera interesante, el único péptido que redujo la proliferación de células T no fue un derivado de CP, fue el péptido P, y también se originó de la cadena TCR alfa. Los péptidos K, M y N, de las cadenas beta, delta y gamma, fueron solubles en sus tampones
respectivos.

En resumen el péptido del núcleo, representando el dominio transmembranal de TCR alfa, e incluyendo los dos aminoácidos cargados, fue eficaz en la inhibición de la proliferación de células T estimulada por antígenos de PLNCs y de líneas de células T, en cada experimento. El grado de inhibición varió entre el 50% y el 90% en los diferentes experimentos. Un péptido del dominio intracelular de la cadena TCR-\alpha, el péptido P, también mostró actividad, pero los péptidos de las otras cadenas de TCR no inhibieron abiertamente la proliferación de células T en estos
ensayos.

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(b)In-vivo Efectos de péptidos de receptor de células T en artritis inducida por adyuvante en ratas

Los péptidos fueron examinados en grupos en base a la disponibilidad. Como tales, los resultados están proporcionados en cuatro secciones.

(i) Examen de péptido A, B, H e I

Métodos. El primer experimento consistió en 12 ratas con un peso de aproximadamente 190-210 gramos que fueron compradas a Perth Animal Resource Centre (ARC) y mantenidas en la Instalación de Gore Hill Animal House. Se usó un péptido del núcleo (30 mg) suspendido en adyuvante (0,6 ml de esqualano conteniendo 7 mg de MTB), péptido del núcleo Tris-monopalmitato (15 mg) suspendido en 0,6 ml de adyuvante, péptido del núcleo Tris-tripalmitato 20 mg/0,6 ml de adyuvante. PCT/AU96/000185 describe un método de conjugación de péptido lipídico.

Las ratas fueron divididas en cuatro grupos, cada grupo conteniendo tres ratas. El primer grupo recibió adyuvante sólo (control positivo), el segundo grupo recibió adyuvante con péptido del núcleo, tercer grupo el péptido del núcleo Tris-monopalmitato suspendido en adyuvante, y el último grupo péptido del núcleo Tris-tripalmitato en adyuvante. Ratas fueron inyectadas con los compuestos anteriores en un volumen de 0.1 ml en la base de la cola. Mediciones de referencia inicial de peso de rata, anchura de pata, y diámetro de cola fueron hechos en el día 0, y posteriormente en el día 4, 7, 9, 14, 16, 18, 21, 25 y 28. La artritis fue valorada y los animales fueron sacrificados si hubo hinchazón marcada, rojez e incomodidad obvia. No todas las ratas a las que se les dio MTB desarrollaron artritis. En general más del 80% de las ratas de control desarrollaron artritis. Resultados. Después de 18 días todos los animales de control a los que se les dio adyuvante sólo desarrollaron artritis y tuvieron que ser sacrificados. Dos de los tres animales tratados con péptido del núcleo (2/3) no tuvieron evidencia de artritis. De forma similar, dos de los tres animales a los que se les dio péptido del núcleo.Tris.tripalmitato no tuvieron evidencia de artritis. Animales a los que se les dio péptido del núcleo.Tris.monopalmitato y adyuvante desarrollaron todos artritis. No obstante, la aparición y desarrollo de artritis en este último grupo fue prolongado de 3-4 días y la gravedad clínica fue muy reducida (número de articulaciones, hinchazón de las patas, adelgazamiento) en comparación con los controles.

Experimentos que usan artritis inducida por adyuvante en ratas mostraron que el péptido y su lípido conjugado tuvieron un efecto protector en la inducción de artritis en este modelo de animal. Los resultados de experimentos repetidos y posteriores usando varios péptidos diferentes (7 mg/rata) y fármacos están resumidos en la Tabla 3.

TABLA 3 Efectos de diferentes péptidos en artritis inducida por adyuvante en ratas

3

Los resultados de los experimentos anteriores indicaron que el péptido del núcleo tuvo un efecto en la inflamación tanto para retrasar su aparición, reducir la gravedad, y prevenir la aparición de enfermedad. Estos efectos fueron similares a los obtenidos con la coadministración de ciclosporina y adyuvante. La ciclosporina es un agente inmunosupresor bien conocido y muy utilizado. No hubo un efecto indiscriminado de acción del péptido. Los mejores resultados fueron observados con el péptido del núcleo y el péptido B. Por el contrario no se observó ningún efecto con el péptido C o E que tuviera un grupo aminoácido sin carga o con carga negativa respectivamente. La extensión de los aminoácidos en dirección descendente hacia el término carboxi no tuvo ningún efecto negativo. Esta observación confirma que la modificación de carboxi puede ser realizada sin pérdida de actividad biológica. En consecuencia estos péptidos pueden ser usados como péptidos portadores para la entrega de otras fracciones químicas.

(ii) Examen del péptido J, K, O

Métodos. El peso de las ratas Wistar de un promedio de 165 gramos en el día de inyección (día 0). Cada rata fue inyectada intradérmicamente, en la base de la cola, usando una aguja de calibre 21, con 1 mg de MTB en 200 \mul de esqualano, con o sin 7 mg de uno de los péptidos de prueba suspendidos en este volumen. Una jeringa de vidrio fue usada.

Resultados. Síntomas tempranos fueron observados tan pronto como en el día 7 en dos de las ratas de control (MTB sólo), y éstas fueron matados por artritis severa en día 11. Dos controles más fueron matados en el día 13, y la quinta, en el día 17. Las cinco ratas de control no tratadas desarrollaron artritis aguda.

(1)

Peso. La Figura 6 resume el peso promedio de cinco ratas en cada grupo. De esta figura se puede inferir que los controles desarrollaron enfermedad más severa mientras que las ratas tratadas con el péptido desarrollaron menos enfermedades activas. De los grupos tratados con péptidos, el péptido O funcionó mejor mientras que el péptido K y J fueron protectores.

(2)

Grosor de la pata. La inflamación de las articulaciones evaluada como grosor de la pata en ratas tratadas y no tratadas está mostrada en las Figuras 7(a-d). Además del hinchazón de las patas, hinchazón de los tobillos y articulaciones individuales, las cuentas fueron realizadas en cada rata. Los resultados reflejan una tendencia similar destacada en el grosor de las patas. El experimento anterior fue repetido exactamente con resultados similares.

Discusión. Las secuencias del péptido J y K están derivadas del dominio extracelular de cadenas de TCR-\alpha y TCR-\beta, en la región de los enlaces de disulfuro, respectivamente. Fueron comparables en cuanto a la eficacia y a las expectativas teóricas de los complementos que deberían tener efectos similares (teniendo en cuenta niveles similares de absorción por células T, etc.).

El péptido O fue una extensión del péptido del núcleo e incluía secuencias del término carboxilo de la cadena TCR-\alpha en el dominio intracelular. El péptido O fue el más eficaz para la mejora del desarrollo de artritis inducida por MTB y sugiere que otras secuencias en dirección hacia abajo del péptido del núcleo pudieran ser importantes para influir en la función celular. El péptido del núcleo es el componente más pequeño de estas secuencias.

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(iii) Examen de péptidos N, M y P

Métodos. Las ratas recibieron 1 mg de MTB en 0,2 ml de esqualano con o sin péptidos (7 mg). Sitios individuales fueron usados como se ha indicado arriba. Dos de las ratas MTB de control desarrollaron artritis temprano, dos tarde, y una de las cinco se mantuvo bien. Esto es consistente con el modelo experimental del 80% de ratas tratadas con MTB que desarrollan artritis.

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Resultados

(1)

Peso. La Figura 8 muestra el peso medio de cada grupo.

(2)

Grosor del tobillo. La Figura 9 (a-d) demuestra la extensión de la involucración del tobillo en estos grupos. Los resultados del grosor de la pata fueron similares a aquellos del grosor del tobillo. Las cinco ratas que fueron tratadas con péptido N no mostraron síntomas de artritis en la duración del experimento (figura 9c). Las ratas que recibieron el péptido M finalmente tuvieron 2 del grupo matadas, en los días 19 y 21, es decir, hacia el final del experimento. Una rata se mantuvo sin síntomas. Otras dos ratas tuvieron una enfermedad moderada que se resolvió durante el experimento. De las 5 ratas tratadas con el péptido P, una no desarrolló ningún síntoma, mientras que las otras cuatro desarrollaron síntomas menores, algunos de los cuales no aparecieron hasta cerca del final del experimento. Los síntomas no constituyeron artritis aguda y los animales no fueron sacrificados. A partir de los gráficos resulta la sugerencia evidente del grosor de las patas y del tobillo que el desarrollo temprano de los síntomas fue prolongado y la gravedad disminuyó en los grupos tratados con péptido. Discusión. Los controles no tratados desarrollaron artritis activa y fueron claramente el peor grupo. Los péptidos M, P y N fueron protectores hasta una extensión variable.

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(iv) Experimento con el péptido L

Métodos. Los mismos que los anteriores. Cada rata fue inyectada intradérmicamente en la base de la cola, usando una aguja de calibre 21, con 1 mg de MTB en 200 \mul de esqualano, con o sin 7 mg de péptido L suspendido en este volumen. Se usó una jeringa de vidrio.

Resultados

(i)

Peso. Todo el grupo de control MTB desarrolló artritis y no tuvo que ser sacrificado en el día 18 (figura 10). Por el contrario, ninguna rata del grupo tratado con el péptido L perdió peso. La rata 12 murió por causa anestésica.

(ii)

Involucración de las articulaciones. Tanto el grosor de las patas y como del tobillo fue significativamente disminuido en comparación con la Figura 11 de control (a- d).

Resumen

Las células T primarias de ratas sensibilizadas con MTB fueron usadas para evaluar péptidos. Esto fue inmediatamente exitoso y el CP inhibió la absorción de ^{3}H-timidina. Los resultados fueron consistentes y repetibles, cuando se usó PLNC o líneas de células T propagadas in vitro. El CP fue el más eficaz seguido de los péptidos P y H. Debe ser recordado que los resultados in vitro son parciales a favor de los péptidos más solubles.

Modelo de artritis inducida por adyuvante. Tabla 4 resume experimentos in vivo que favorece la eficacia de los péptidos evaluados. Los péptidos J, O, N y L fueron muy eficaces en la inducción de la enfermedad. De forma similar, los péptidos K, M y P tienen una respuesta variable en el retraso de la inducción y gravedad de la enfer-
medad.

TABLA 4 Resumen de resultados de artritis inducida por adyuvante in vivo

5

Referencias

1. Clevers, H., Alarcon, B., Wileman, T. & Terhorst, C. The T cell receptor/CD3 complex:A dynamic protein ensemble. Ann Rev Immunol. 6, 629-662, (1988).

2. Manolios, N., Bonifacino, J.S., & Klausner, R.D. Transmembrane helical interactions and the assembly of the T cell antigen receptor complex. Science, 248, 274-277, (1990).

3. Manolios N., Letourner F., Bonifacino J.S., & Klausner R.D. Pairwise, cooperative, and inhibitory interactions describe the assembly and probable structure of the T-cell antigen receptor. EMBO J. 10, 1643-1651, (1991).

4. Manolios, N., Kemp, O. & Li. Z. G. The T-cell antigen receptor alpha and beta chains interact via distinct regions with CD3 chains. Eur. J. Immunol. 24, 84-89 (1994).

5. PCT/AU96/00018 (WO 96/22306) - "Novel peptide" (Northern Sydney Area Health Service).

6. McQueen F M. The use of biologics in the treatment of rheumatoid arthritis (RA)- the good news and the bad news. Aust NZ J Med 1997; 27, 175-184.

7. Gaston JSH, Strober S, Solovera JJ, et al: Dissection of mechanisms of immune injury in rheumatoid arthritis using total lymphoid irradiation. Arthritis and Rheum; 47: 127-33, (1988).

8. Paulus HE, Machieder HI, Levine S, Yu DTY, MacDonald NS: Lymphocyte involvement in rheumatoid arthritis- studies during thoracic duct drainage. Arthritis Rheum; 20: 1249-62, (1977).

9. Emery P, Smith GN, Panayi GS: Lymphocytapheresis- a feasible treatment for rheumatoid arthritis. Brit J Rheum; 25: 40-43, (1986).

10. Watts RA, Isaacs JD: Immunotherapy of rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis; 51: 577-579, (1992).

11. Lipsky PE: Immunopathogenesis and treatment of rheumatoid arthritis. J Rheumatol; 19: 92-94, (1992).

12. Olsen NJ, Cush JJ, Lipsky PE et al. Multicentre trial of an anti-CD5 immunoconjugate in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 37 (Sup):S295, (1994).

13. Matteson EL, Yocum DE, St Clair WE et al., Treatment of active refractory rheumatoid arthritis with humanised monoclonal antibody CAMPATH-1 H administered by daily subcutaneous injection. Arthritis Rheum; 38,1187-93, (1995).

14. Moreland LW, Bucy RP, Tilden A et al. Use of a chimeric monoclonal anti-CD4 antibody in patients with refractory rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum; 307-18, (1993).

15. Van der Lubbe PA, Dijkmans BAC, Markusse HM, Nassander U, Breedveld FC. A randomised, double-blind, placebo controlled study of CD4 monoclonal antibody therapy in early rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 38, 1097- 106, (1995).

16. Moreland LW, Sewell KL, Trentham DE et al. Interleukin-2 diptheria fusion protein (DAB486IL-2) in refractory rheumatoid arthritis. A double-blind placebo-controlled trial with open-label extension. Arthritis Rheum; 1176-86, (1995).

17. Sewell KL, Moreland LW, Cush JJ, Furst DE, Woodworth TF, Meehan RT. Phase I/II double blind dose response trial of a second fusion toxin DAB (389) IL-2 in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 36; S130, (1993).

18. Kingsley G, Pitzalis C, Panayi GS: Immunogenetic and cellular immune mechanisms in rheumatoid arthritis: Relevance to new therapeutic strategies. Brit J Rheum; 29: 58-64, (1990).

19. Altoroni R, Teitelbaum D, Arnon R, Puri J: Immunomodulation of experimental autoimmune encephalitis by antibodies to the antigen-la complex. Nature; 351: 147-150, (1991).

20. Rosenbaum JT, Adelman NE, McDevitt HO: In vivo effects of antibodies to immune response gene products. I. Haplotype-specific suppression of humoral responses with a monoclonal anti-la. J Exp Med; 154: 1694-98, (1981).

21. Steinman L, Rosenbaum JT, Srinam S, McDevitt HO: In vivo effects of antibodies to immune response gene products: Prevention of experimental allergic encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci USA; 78: 7111-14, (1981).

22. Quagliata F, Schenkelaars EJ, Ferrone S. Immunotherapeutic approach to rheumatoid arthritis with anti- idiotypic antibodies to HLA-DR4. Isr J Med Sci; 29, 154-9, (1993).

23. Magistris MT, Alexander J, Coggeshall M, Altman M, et al: Antigen analogmajor histocompatibility complexes act as antagonists of the T-cell receptor. Cell; 68: 625-634, (1992).

24. Howell MD, Winters ST, Olee T, Powell HC, Carlo DJ, et al: Vaccination against experimental allergic encephalomyelitis with T-cell receptor peptides. Science 1989; 246: 668-670.

25. Vanderbark AA, Hashim GA, Offner H: Immunization with a synthetic T-cell receptor V-region peptide protects against experimental autoimmune encephalomyelitis. Nature; 345: 541-544, (1989).

26. Stamenkovic I, Stegagno M, Wright KA, Krane SM, Amento EP, et al: Clonal dominance among T lymphocyte infiltrates in arthritis. Proc Natl Acad Sci USA; 85: 1179-1183, (1988).

27. Paliard X, West SG, Lafferty JA, Clements J.R, Kappler JW, et al: Evidence for the effects of a superantigen in rheumatoid arthritis. Science; 253; 325-329, (1991).

28. Feldmann M, Brennan FM, Chantry D, Haworth C, Turner M, et al: Cytokine production in the rheumatoid joint: implications for treatment. Ann Rheum Dis; 49: 480-486, (1990).

29. Elliott MJ, Maini RN, Feldmann M et al., Randomised double-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumour necrosis factor a(cA2) versus placebo in rheumatoid arthritis. Lancet; 344, 1105-1-, (1994).

30. Rankin ECC, Choy EHS, Kassirnos D et al. The therapeutic effects of an engineered human anti-tumour necrosis factor alpha antibody (CDP571) in rheumatoid arthritis. Br J Rheumatol; 34, 334-42, (1995).

31. Kyle V, Coughlan RJ, Tighe H, Waldmann H, Hazleman BL: Beneficial effect of monoclonal antibody to interleukin 2 receptor on activated T-cells in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis; 48:428-429, (1989).

32. Dower SK, Sims JE: Molecular characterisation of cytokine receptors. Ann Rheum Dis; 49: 452-459, (1990).

33. Moreland LW, Margolies GR, Heck LW et al. Soluble tumour necrosis factor receptor (sTNFR): Results of a phase I dose-escalation study in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum; (Suppl) 37. S295, (1994).

34. McCune WJ, Bayliss GE: Immunosupressive therapy for rheumatic disease. Curr Opin Rheumatol; 3: 355-362, (1991).

35. Manolios, N., Collier, S., Taylor, J., Pollard, J., Harrison, L., Bender, V. Immunomodulatory antigen receptor transmembrane peptides and their effect on T-cell mediated disease. Nature Medicine, 3, 84-87, (1997).

36. Samelson, L.E., O'Shea, J.J., Luong, H., Ross, P., Urdahl, K.B., Klausner, R.D., & Bluestone, J. T-cell antigen phosphorylation induced by an anti-receptor antibody. J. Immunol, 139, 2708-14 (1987).

37. Sedgwick J, McPhee IAM, Puklavec M. Isolation of encephalitogenic CD4+ T cell clones in the rat: Cloning methodology and IFN-g secretion. J. Immunol Methods, 121:185-196, (1989).

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet WO 9622306 A [0006] [0063]

\bullet WO 9526980 A [0007]

\bullet WO 9420127 A [0007]

\bullet WO 9603140 A [0007]

\bullet WO 9507707 A [0007]

\bullet AU 9600018 W [0050] [0063]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

\bulletJAMESON SC et al. J. Exp. Medicine, 1993, vol. 177, no. 6. 1541-1550 [0007]

\bulletCOLE GA et al. J. Immunol., 1995, vol. 155, no. 6. 2841-2848 [0007]

\bulletOLDSTONE M et al. J. Virol., 1995, vol. 169, no. 12. 7423-7429 [0007]

\bulletIKAGAWA S et al. J. Allergy and Clinical Immunol., 1996, vol. 97, no. 1. 53-64 [0007]

\bulletLIVINGSTON PG et al. J. Immunol., 1995, vol. 154, no. 3. 1287-1295 [0007]

\bulletSHIMIZU NS et al. Antiviral Chem & Chemotherapy, 1995, vol. 6, no. 1. 17-24 [0007]

\bulletMARI B et al. Faseb J., 1996, vol. 10, no. 2. 309-316 [0007]

\bulletGUNDLACH BR et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 192, no. 1-2. 149-155 [0007]

\bulletKUCHROO et al. J. Immunol, 1994, vol. 153, no. 7. 3326-3336 [0008]

\bullet Peptide Synthesis ATHERTON; SHEPPARD. Synthetic Vaccines Blackwell Scientific Publications [0021]

\bulletCLEVERS, H. ALARCON, B. WILEMAN, T. TERHORST, C. The T cell receptor/CD3 complex:A dynamic protein ensemble. Ann Rev Immunol., 1988, vol. 6, 629-662 [0063]

\bulletMANOLIOS, N.; BONIFACINO, J.S.; KLAUSNER, R.D. Transmembrane helical interactions and the assembly of the T cell antigen receptor complex Science, 1990, vol. 248, 274-277 [0063]

\bulletMANOLIOS N.; LETOURNER F.; BONIFACINO J.S.; KLAUSNER R.D. Pairwise, cooperative, and inhibitory interactions describe the assembly and probable structure of the T-cell antigen receptor. EMBO J., 1991, vol. 10, 1643-1651 [0063]

\bulletMANOLIOS, N.; KEMP, O.; LI. Z. G. The T-cell antigen receptor alpha and beta chains interact via distinct regions with CD3 chains. Eur. J. Immunol., 1994, vol. 24, 84-89 [0063]

\bulletMCQUEEN F M. The use of biologics in the treatment of rheumatoid arthritis (RA)- the good news and the bad news. Aust NZ J Med, 1997, vol. 27, 175-184 [0063]

\bulletGASTON JSH; STROBER S; SOLOVERA JJ et al. Dissection of mechanisms of immune injury in rheumatoid arthritis using total lymphoid irradiation. Arthritis and Rheum, 1988, vol. 47, 127-33 [0063]

\bulletPAULUS HE MACHLEDER HI LEVINE S YU DTY MACDONALD NS. Lymphocyte involvement in rheumatoid arthritis-studies during thoracic duct drainage. Arthritis Rheum, 1977, vol. 20, 1249-62 [0063]

\bulletEMERY P; SMITH GN; PANAYI GS. Lymphocytapheresis- a feasible treatment for rheumatoid arthritis. Brit J Rheum, 1986, vol. 25, 40-43 [0063]

\newpage

\bulletWATTS RA; ISAACS JD. Immunotherapy of rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 1992, vol. 51, 577-579 [0063]

\bulletLIPSKY PE. Immunopathogenesis and treatment of rheumatoid arthritis J Rheumatol, 1992, vol. 19, 92-94 [0063]

\bulletOLSEN NJ CUSH JJ LIPSKY PE et al. Multicentre trial of an anti-CD5 immunoconjugate in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 1994, vol. 37, S295- [0063]

\bulletMATTESON EL; YOCUM DE; ST CLAIR WE et al. Treatment of active refractory rheumatoid arthritis with humanised monoclonal antibody CAMPATH-1 H administered by daily subcutaneous injection. Arthritis Rheum, 1995, vol. 38, 1187-93 [0063]

\bulletMORELAND LW; BUCY RP; TILDEN A et al. Use of a chimeric monoclonal anti-CD4 antibody in patients with refractory rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1993, 307-18 [0063]

\bullet VAN DER LUBBE PA; DIJKMANS BAC; MARKUSSE HM; NASSANDER U; BREEDVELD FC. A randomised, double-blind, placebo controlled study of CD4 monoclonal antibody therapy in early rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1995, vol. 38, 1097-106 [0063]

\bulletMORELAND LW; SEWELL KL; TRENTHAM DE et al. Interleukin-2 diptheria fusion protein (DAB486IL-2) in refractory rheumatoid arthritis. A double-blind placebo-controlled trial with open-label extension. Arthritis Rheum, 1995, 1176-86 [0063]

\bulletSEWELL KL; MORELAND LW; CUSH JJ; FURST DE WOODWORTH TF; MEEHAN RT. Phase I/II double blind dose response trial of a second fusion toxin DAB (389) IL-2 in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 1993, vol. 36, S130- [0063]

\bulletKINGSLEY G; PITZALIS C; PANAYI GS, Immunogenetic and cellular immune mechanisms in rheumatoid arthritis: Relevance to new therapeutic strategies. Brit J Rheum, 1990, vol. 29, 58-64 [0063]

\bulletALTORONI R; TEITELBAUM D; ARNON R; PURI J. Immunomodulation of experimental autoimmune encephalitis by antibodies to the antigen-la complex. Nature, 1991, vol. 351, 147-150 [0063]

\bulletROSENBAUM JT; ADELMAN NE; MCDEVITT HO. In vivo effects of antibodies to immune response gene products. I. Haplotype-specific suppression of humoral responses with a monoclonal anti-la, J Exp Med, 1981, vol. 154, 1694-98 [0063]

\bulletSTEINMAN L; ROSENBAUM JT; SRINAM S; MCDEVITT HO. In vivo effects of antibodies to immune response gene products: Prevention of experimental allergic encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, vol. 78, 7111-14 [0063]

\bulletQUAGLIATA F; SCHENKELAARS EJ; FERRONE S. Immunotherapeutic approach to rheumatoid arthritis with anti-idiotypic antibodies to HLA-DR4 Isr. J Med Sci, 1993, vol. 29, 154-9 [0063]

\bulletMAGISTRIS MT; ALEXANDER J; COGGESHALL M; ALTMAN M et al. Antigen analogmajor histocompatibility complexes act as antagonists of the T-cell receptor. Cell, 1992, vol. 68, 625-634 [0063]

\bulletHOWELL MD; WINTERS ST; OLEE T; POWELL HC; CARLO DJ et al. Vaccination against experimental allergic encephalomyelitis with T-cell receptor peptides. Science, 1989, vol. 246, 668-670 [0063]

\bulletVANDERBARK AA; HASHIM GA; OFFNER H. Immunization with a synthetic T-cell receptor V-region peptide protects against experimental autoimmune encephalomyelitis. Nature, 1989, vol. 345, 541-544 [0063]

\bulletSTAMENKOVIC I; STEGAGNO M; WRIGHT KA; KRANE SM; AMENTO EP et al. Clonal dominance among T lymphocyte infiltrates in arthritis. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, vol. 85, 1179-1183 [0063]

\bulletPALIARD X; WEST SG; LAFFERTY JA; CLEMENTS J.R; KAPPLER JW et al. Evidence for the effects of a superantigen in rheumatoid arthritis. Science, 1991, vol. 253, 325-329 [0063]

\bulletFELDMANN M; BRENNAN FM; CHANTRY D; HAWORTH C; TURNER M et al. Cytokine production in the rheumatoid joint: implications for treatment. Ann Rheum Dis, 1990, vol. 49, 480-486 [0063]

\bulletELLIOTT MJ; MAINI RN; FELDMANN M et al. Randomised double-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumour necrosis factor a(cA2) versus placebo in rheumatoid arthritis. Lancet, 1994, vol. 344, 1105-1 [0063]

\newpage

\bulletRANKIN ECC; CHOY EHS; KASSIRNOS D et al. The therapeutic effects of an engineered human anti-tumour necrosis factor alpha antibody (CDP571) in rheumatoid arthritis. Br J Rheumatol, 1995, vol. 34, 334-42 [0063]

\bulletKYLE V; COUGHLAN RJ; TIGHE H; WALDMANN H; HAZLEMAN BL. Beneficial effect of monoclonal antibody to interleukin 2 receptor on activated T-cells in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 1989, vol. 48, 428-429 [0063]

\bulletDOWER SK; SIMS JE. Molecular characterisation of cytokine receptors. Ann Rheum Dis, 1990, vol. 49, 452-459 [0063]

\bulletMORELAND LW; MARGOLIES GR; HECK LW et al. Soluble tumour necrosis factor receptor (sTNFR): Results of a phase I dose-escalation study in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1994, vol. 37, S295-[0063]

\bulletMCCUNE WJ; BAYLISS GE. Immunosupressive therapy for rheumatic disease Curr Opin Rheumatol, 1991, vol. 3, 355-362 [0063]

\bulletMANOLIOS, N.; COLLIER, S.; TAYLOR, J.; POLLARD, J.; HARRISON, L.; BENDER, V. Immunomodulatory antigen receptor transmembrane peptides and their effect on T-cell mediated disease. Nature Medicine, 1997, vol. 3, 84-87 [0063]

\bulletSAMELSON, L.E.; O'SHEA, J.J.; LUONG, H.; ROSS, P.; URDAHL, K.B.; KLAUSNER, R.D.; BLUESTONE, J. T-cell antigen phosphorylation induced by an anti-receptor antibody. J. Immunol, 1987, vol. 139, 2708-14 [0063]

\bulletSEDGWICK J; MCPHEE IAM; PUKLAVEC M. Isolation of encephalitogenic CD4+ T cell clones in the rat: Cloning methodology and IFN-g secretion. J. Immunol Methods, 1989, vol. 121, 185-196 [0063]

Claims (10)

1. Péptido que inhibe la función de TCR, donde el péptido es seleccionado de:

Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly-Phe,

Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val-Ala-Gly; y

Leu-Gly-Ile-Leu-Leu-Leu-Lys-Val.

2. Composición terapéutica que comprende un péptido según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

3. Péptido según la reivindicación 1 para el uso en el tratamiento de un sujeto que sufre de un trastorno en el que están implicadas o reclutadas las células T.

4. Uso de un péptido según la reivindicación 1 en la producción de un medicamento para tratar un sujeto que sufre de un trastorno en el que están implicadas o reclutadas las células T.

5. Péptido según la reivindicación 3 o uso según la reivindicación 4 donde el trastorno es una enfermedad autoinmunológica.

6. Péptido según la reivindicación 3 o uso según la reivindicación 4 donde el trastorno es artritis reumatoide.

7. Péptido según la reivindicación 3 o uso según la reivindicación 4 donde el trastorno implica inflamación mediada por células T.

8. Péptido según la reivindicación 3 o uso según la reivindicación 4 donde el trastorno es:

-

diatésis alérgica que incluye hipersensibilidad de tipo retardado y dermatitis de contacto;

-

enfermedad autoinmunológica que incluye SLE, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto y anemia perniciosa;

-

Condiciones gastroenterológicas que incluyen enfermedad de intestino inflamatorio; enfermedad de Crohn, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa;

-

problemas de la piel que incluye psoriasis y pemphigus vulgaris;

-

enfermedad Infecciosa que incluye el virus de SIDA y el herpes simplex/zoster;

-

condiciones respiratorias que incluyen alveolitis alérgica;

-

problemas cardiovasculares que incluyen pericarditis autoinmunológica;

-

Transplante de organos; y

-

condiciones inflamatorias que incluyen miositis y espondilitis anquilosa.

9. Composición que comprende un péptido según la reivindicación 1 conjugado a una fracción química.

10. Uso de una composición según la reivindicación 9 para entregar la fracción química a una célula in vitro.