ES2315215T1 - Secuencias nucleotidicas del genoma de retrovirus del tipo hiv-1, hiv-2, y siv y sus aplicaciones, en particular para la amplificacion de genomas de estos retrovirus y para el diagnostico in vitro de infecciones debidas a estos virus. - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia consiste en: i) una secuencia específica del gen gag, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC ñ 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac, o ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i.

Claims (11)

1. Oligonucleótido caracterizado porque su secuencia consiste en:

i)

una secuencia específica del gen gag, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60ºC \pm 1ºC con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac, o

ii)

una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un tamaño de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos.

3. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque su secuencia nucleotídica tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia del gen gag de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o SIV Mac y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac.

4. Oligonucleótido que comprende una conservación de al menos 5 bases de cada lado del cebador con respecto a la secuencia de un cebador oligonucleotídico tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 3, y que comprende en su parte media modificaciones con respecto a la secuencia de un cebador oligonucleotídico según las reivindicaciones 1 a 3 y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac.

5. Oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, susceptible de hibridar con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y SIV Mac en un tampón de composición Tris-HCl, pH 8,9: 50 mM; (NH_{4})_{2}SO_{4}: 15 mM; MgCl_{2}: 5 mM; \beta-mercaptoetanol: 10 mM; gelatina: 0,25 mg/ml.

6. Procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV, realizado a partir de una muestra biológica, comprendiendo este procedimiento principalmente las etapas siguientes:

a)

una etapa de extracción del ácido nucleico para detectar que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 o SIV eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente mencionada y, en su caso, una etapa de tratamiento con la ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN,

b)

un ciclo que comprende las etapas siguientes:

-

\vtcortauna desnaturalización del ácido nucleico bicatenario para detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario;

-

\vtcortauna hibridación de cada una de las cadenas del ácido nucleico, obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente, con al menos un cebador según una de las reivindicaciones 1 a 5, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente mencionadas con al menos una pareja de los cebadores anteriormente mencionados;

-

\vtcortauna formación a partir de los cebadores de ADN complementarios en las cadenas sobre las que se hibridan en presencia de una ADN polimerasa y de los cuatro nucleosidos trifosfato (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios a detectar que en la etapa de desnaturalización precedente;

\quad

repitiéndose este ciclo un número de veces determinado para obtener dicha secuencia nucleica a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección;

c)

una etapa de detección de la presencia eventual del ácido nucleico que pertenece al genoma de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV en la muestra biológica.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa de desnaturalización se realiza en presencia de al menos un cebador según una de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque se realiza en las condiciones siguientes:

a)

hibridación: los cebadores (1 \mul de una solución 40 \muM de cada cebador) se ponen en presencia del ADN-matriz (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación; se calienta durante 10 minutos a 100ºC, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de ADN-matriz y cebadores en agua que contiene hielo. Los cebadores deben utilizarse a una concentración final en la etapa de amplificación siguiente de 0,8 \muM cada uno,

b)

amplificación: se añaden al medio precedente los 4 dNTP, utilizado cada uno a 0,5 \muM en la solución final (50 \mul), y una unidad de polimerasa Taq para un medio de reacción de 50 \mul.

9. Aplicación del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 al diagnóstico in vitro de infección en un individuo por un virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, o en un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, SIV).

10. Kit para la puesta en práctica de un procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 8 que comprende:

i)

al menos un cebador oligonucleotídico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

ii)

reactivos apropiados para la puesta en práctica del ciclo de operaciones de amplificación, particularmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótido diferentes y el tampón 10 x tal como se describe en la reivindicación 5,

iii)

una (o más) sonda que puede estar marcada, capaz de hibridar con la (o las) secuencia(s) de ácido nucleico amplificada(s) a detectar.

11. Utilización de al menos un cebador según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o SIV.