ES2315327T3 - Procedimiento y composiciones para determinar los perfiles de respuesta celular. - Google Patents

Procedimiento y composiciones para determinar los perfiles de respuesta celular. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para determinar un perfil de respuesta celular para una diana, que comprende: i) introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de Beta-lactamasa sin promotor que codifica una Beta-lactamasa, ii) inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana, iii) separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de dicha Beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii), iv) identificar una pluralidad de polinucleótidos genómicos que presentan un incremento o una disminución en la expresión presente en dicha segunda pluralidad de células, en el que un incremento o una disminución en la expresión de cada uno de dichos polinucleótidos genómicos de dicha pluralidad de polinucleótidos proporciona un perfil de respuesta celular relacionado con dicha diana, en el que dicho polinucleótido de Beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector vírico.

Description

Procedimientos y composiciones para determinar los perfiles de respuesta celular.
Campo técnico
La presente solicitud se refiere en general a procedimientos y a composiciones para la identificación de porciones útiles y funcionales del genoma y de compuestos para modular dichas porciones del genoma, en particular la identificación de proteínas que son reguladas directamente o indirectamente de manera transposicional y de compuestos para regular dichas proteínas, ya sea directamente o indirectamente.
Antecedentes
La identificación y aislamiento de porciones útiles del genoma requiere un extenso gasto de tiempo y de recursos financieros. En la actualidad, muchos proyectos genómicos utilizan diversas estrategias para reducir los tiempos de clonación y secuenciación. Aunque los proyectos genómicos expanden rápidamente la base de datos de material genético, dichos proyectos carecen con frecuencia de la capacidad de integrar la información con la biología de la célula u organismo a partir del cual se aislaron los genes. En algunos casos, las regiones codificantes de genes recién aislados revelan una homología de secuencias con otros genes de función conocida. Este tipo de análisis puede proporcionar, en el mejor de los casos, claves en cuanto a la posible interrelación entre diferentes genes y proteínas. Los proyectos genómicos en general, sin embargo, adolecen de la incapacidad de aislar e identificar rápidamente y directamente genes específicos, todavía desconocidos, asociados con un proceso o con procesos biológicos particulares.
La evaluación de la función de genes identificados a partir de proyectos de secuenciación genómicos requiere la clonación del gen descubierto en un sistema de expresión adecuado para un rastreo funcional. La transferencia del gen descubierto a un sistema de rastreo funcional requiere un gasto adicional de tiempo y de recursos sin la garantía de que se seleccionó el sistema de rastreo correcto. Puesto que la función del gen descubierto es con frecuencia desconocido o únicamente se conjetura por deducción con respecto a genes estructuralmente relacionados, el sistema de rastreo seleccionado puede que no presente ninguna correlación con la función biológica del gen. Por ejemplo, un gen puede codificar una proteína que es estructuralmente homóloga al receptor beta-adrenérgico y presentar una función diferente. Además, si se obtienen resultados negativos en el rastreo, no se puede determinar fácilmente 1) si el gen o producto génico no está funcionando apropiadamente en el ensayo de rastreo o 2) si el gen o producto génico está implicado directamente o indirectamente en el proceso biológico que se está ensayando mediante el sistema de rastreo.
Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar procedimientos y composiciones para aislar rápidamente porciones de genomas asociadas con un proceso biológico conocido y de rastrear dichas porciones de genomas para determinar la actividad sin la necesidad de transferir el gen de interés a un sistema de rastreo adicional.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una comparación entre una aplicación de un gen informador de la técnica anterior con procedimientos que se describen en la presente memoria, y una forma de realización de la invención. La técnica anterior utiliza el informador b-gal y requiere el establecimiento de clones antes del análisis de expresión. Una forma de realización de la presente invención hace posible la identificación rápida de clones de células vivas a partir de grandes poblaciones multiclonales de células integradas en BLEC (construcciones de expresión de beta-lactamasa). Esto constituye un avance importante sobre la técnica anterior, que requiere el análisis de clones individuales seguido de la recuperación de un clon seleccionado a partir de una cepa clonal duplicada de células vivas.
La Figura 2 muestra una representación de la manera en que una forma de realización de la invención informa la expresión de una vía en el interior de una célula y se puede utilizar para un rastreo.
La Figura 3 muestra un mapa plasmídico esquemático de la BLEC-1.
La Figura 4 muestra el análisis FACS de una población de clones genómicamente integrados en BLEC. Se representan gráficamente células individualmente mediante propiedades de emisión fluorescente a una excitación de 400 nm. El eje x representa una emisión verde (530 nm). El eje y representa una emisión azul (465 nm). Las células con una alta relación azul/verde aparecerán de color azul y las células con una baja relación azul/verde aparecerán de color verde. A) Población multiclonal no seleccionada de clones de células RBL-1 integradas en BLEC. B) Población de clones seleccionados a partir de 3A (R1) que se cultivaron durante 7 días adicionales y se volvieron a seleccionar. C) Población procedente de 3B con adición de ionomicina luM durante 12 horas antes de la selección.
Sumario
La presente solicitud reconoce que se pueden utilizar eficazmente polinucleótidos de \beta-lactamasa en células eucarióticas vivas para identificar funcionalmente porciones activas de un genoma asociadas directamente o indirectamente con un proceso biológico. La presente solicitud reconoce asimismo por primera vez que se puede medir la actividad de \beta-lactamasa utilizando sustratos penetrantes de membranas en células vivas incubadas con un producto químico de ensayo que interacciona directamente o indirectamente con una porción del genoma que presenta un polinucleótido de \beta-lactamasa integrado. La presente solicitud, por tanto, hace posible la identificación y el aislamiento rápidos de polinucleótidos genómicos indirectamente o directamente asociados con un proceso biológico definido y la identificación de compuestos que modulan dichos procesos y regiones del genoma. Han sido asimismo descritos en el documento WO 97/06277 procedimientos y composiciones para estimar la especificidad fisiológica de los fármacos candidatos. Debido a que se hace posible la identificación de polinucleótidos genómicos activos en células vivas, se puede llevar a cabo una caracterización funcional adicional utilizando las mismas células, y opcionalmente, el mismo ensayo de rastreo. La capacidad de rastrear funcionalmente inmediatamente después de la rápida identificación de una porción funcionalmente activa de un genoma, sin necesidad de transferir la porción identificada del genoma a un sistema de rastreo secundario, representa, entre otras cosas, una ventaja clara sobre una aplicación de un gen informador de la técnica anterior con los procedimientos que se describen en la presente memoria, tal como se representa en la Figura 1.
La solicitud proporciona un procedimiento para identificar porciones de un genoma, por ejemplo, polinucleótidos genómicos, en una célula viva utilizando un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa que se puede detectar con un sustrato de \beta-lactamasa penetrante de membranas. El procedimiento consiste en insertar un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa en el genoma de un organismo utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que se desarrolle en el futuro o descrito en la presente memoria. Se utilizará habitualmente una construcción de expresión de \beta-lactamasa para integrar un nucleótido de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico, como se describe en la presente memoria. La célula, tal como una célula eucariótica, se pone en contacto usualmente con una concentración predeterminada de un modulador, ya sea antes o después de la integración del polinucleótido de \beta-lactamasa. La actividad de \beta-lactamasa se mide a continuación usualmente en el interior de la célula viva, preferentemente con sustratos fluorescentes de \beta-lactamasa penetrantes de membranas que son transformados por la célula en sustratos de \beta-lactamasa no penetrantes de membranas como se describe en la presente memoria.
La solicitud proporciona asimismo un procedimiento para identificar proteínas o compuestos que modulan directamente o indirectamente un polinucleótido genómico. Generalmente, el procedimiento comprende insertar una construcción de expresión de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico, habitualmente no de levadura, contenido en por lo menos una célula viva, poner en contacto la célula con una concentración predeterminada de un modulador, y detectar la actividad de \beta-lactamasa en la célula.
La solicitud proporciona asimismo un procedimiento para rastrear compuestos con un polinucleótido genómico activo que comprende: 1) poner en contacto opcionalmente una población multiclonal de células con un primer compuesto químico de ensayo antes de separar dichas células mediante un FACS, 2) separar mediante un FACS dicha población multiclonal de células, en células que expresan \beta-lactamasa y células que no expresan \beta-lactamasa, en que dichas células que expresan \beta-lactamasa presentan una diferencia detectable de propiedades de fluorescencia celular en comparación con células que no expresan \beta-lactamasa, 3) poner en contacto cualquier población de células con el mismo producto químico de ensayo o con un producto químico de ensayo diferente, y 4) repetir opcionalmente la etapa (2), en que dicha población multiclonal de células comprende células eucarióticas que presentan una construcción de expresión de \beta-lactamasa integrada en un genoma de dichas células eucarióticas y un sustrato de \beta-lactamasa penetrante de membranas transformado en el interior de dichas células en un sustrato de \beta-lactamasa no penetrante de membranas. Las etapas de este procedimiento se pueden repetir para hacer posible una caracterización adicional de clones identificados.
La solicitud incluye asimismo procedimientos poderosos y composiciones para identificar vías celulares fisiológicamente relevantes y proteínas de interés de función conocida, desconocida o parcialmente conocida. Como se muestra en la Figura 2, una vía puede presentar más de una señal intracelular importante. Se representan dos vías intracelulares importantes ("A" y "B"). Cada vía de señales intracelular puede presentar asimismo múltiples ramas. Se muestra cada brazo que presenta tres vías de señalización (A1, A2, y A3; y B1, B2 y B3). Mediante la generación de una biblioteca de clones con una construcción de expresión de \beta-lactamasa, se pueden identificar o informar polinucleótidos genómicos para cada vía de señales mediante la expresión de \beta-lactamasa. Las vías no afectadas por el modulador (mostradas como C1, C2 y C3) son identificadas también con una construcción de expresión de \beta-lactamasa. Debido a que el modulador modula únicamente la expresión de las vías A1, A2, A3, B1, B2 y B3, únicamente se identifican clones que corresponden a dichos sitios de integración genómicos que son sensibles al modulador. Los clones que corresponden a los sitios C1, C2 y C3 permanecen inalterados y no son sensibles al modulador. Cualquier clon modulado individual se puede aislar inmediatamente, si no está ya aislado, y se puede utilizar para una prueba de descubrimiento de fármacos con el fin de rastrear productos químicos de ensayo para determinar la actividad para modular la vía informada, como se describe en la presente memoria.
La solicitud comprende asimismo herramientas para la identificación de vías y el descubrimiento de fármacos que se pueden aplicar a cierto número de dianas de interés y a áreas terapéuticas que incluyen proteínas de interés, respuestas fisiológicas incluso en ausencia de un diana determinada (por ejemplo respuesta inmunitaria, transducción de señales, función neuronal y función endocrina), dianas víricas y proteínas huérfanas.
Descripción detallada de la invención Definiciones
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente memoria tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio en cultivo de células, genética molecular, y química de ácidos nucleicos e hibridación que se describen a continuación son aquéllos que son bien conocidos y que se emplean normalmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para procedimientos de ácidos nucleicos recombinantes, síntesis de polinucleótidos, y cultivo microbiano y transformación (por ejemplo, electroporación y lipofección). En general, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente según procedimientos convencionales de la técnica y diversas referencias generales (véase en general, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se proporcionan a lo largo de todo este documento. La nomenclatura que se utiliza en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio en química analítica, química de síntesis orgánica, y formulación farmacéutica que se describen a continuación son aquéllos que son bien conocidos y que se emplean normalmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, formulación farmacéutica y administración, y tratamiento de pacientes. Tal como se emplean a los largo de la descripción, se entenderá que los siguientes términos y expresiones, a menos que se indique otra cosa, tendrán los siguientes significados:
"Resto donador fluorescente" se refiere a un compuesto o parte de un compuesto fluorogénico (incluyendo un radical) que puede absorber energía y es capaz de transferir la energía a otra molécula o parte de un compuesto fluorogénico. Las moléculas fluorogénicas donadoras adecuadas incluyen, pero sin limitarse a ellas, cumarinas y colorantes relacionados, colorantes de xanteno tales como fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas, colorantes de cianina, bimanes, acridinas, isoindoles, colorantes de dansilo, hidrazidas aminoftálicas tales como derivados de isoluminol, aminoftalimidas, aminonaftalimidas, aminobenzofuranos, aminoquinolinas, dicianohidroquinonas y complejos de europio y terbio y compuestos relacionados.
"Extintor" se refiere a una molécula cromófora o parte de un compuesto cromóforo que es capaz de reducir la emisión procedente de un donador fluorescente cuando está unido al donador. La extinción puede tener lugar mediante cualquiera de los varios mecanismos que incluyen transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, transferencia de electrones fotoinducida, aumento paramagnético de cruzamiento entre sistemas, acoplamiento de intercambio Dexter y acoplamiento de excitones tal como la formación de complejos oscuros.
"Aceptor" se refiere a un extintor que opera por medio de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Muchos aceptores pueden reemitir la energía transferida en formas de fluorescencia. Entre los ejemplos se incluyen cumarinas y fluoróforos relacionados, xantenos tales como fluoresceínas, rodoles y rodaminas, resorufinas, cianinas, difluoroboradiazaindacenos y ftalocianinas. Otras clases de productos químicos de aceptores no reemiten generalmente la energía transferida. Entre los ejemplos se incluyen índigos, benzoquinonas, antraquinonas, compuestos azoicos, compuestos nitrados, indoanilinas, di y trifenilmetanos.
"Colorante" se refiere a una molécula o parte de un compuesto que absorbe frecuencias específicas de luz, que incluye, pero sin limitarse a ella, luz ultravioleta. Los términos "colorante" y "cromóforo" son sinónimos.
"Fluoróforo" se refiere a un cromóforo que fluoresce.
"Derivado penetrante de membranas" se refiere a un derivado químico de un compuesto que aumenta la permeabilidad de membrana del compuesto. A dichos derivados se les hace más capaces de atravesar las membranas celulares, es decir penetrantes de membranas, debido a que los grupos hidrófilos se enmascaran para proporcionar derivados más hidrófobos. Asimismo, los grupos enmascarantes están destinados a ser escindidos del sustrato fluorogénico dentro de la célula para generar el sustrato derivado en el interior de la célula. Debido a que el sustrato es más hidrófilo que el derivado penetrante de membranas, éste queda atrapado ahora dentro de las células.
"Polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con la célula en la que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, o (2) está unido de manera operable a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza.
"Proteína aislada" se refiere a una proteína de origen de ADNc, de ARN recombinante o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas con las que se encuentra en la naturaleza, o (2) está aislada de la célula en la se encuentra normalmente o (3) está aislada exenta de otras proteínas procedentes de la misma fuente celular, por ejemplo, exenta de proteínas humanas, o (4) es expresada por una célula procedente de una especie diferente, o (5) no se presenta en la naturaleza.
"Polipéptido" tal como se utiliza en la presente memoria como término genérico se refiere a una proteína nativa, a fragmentos, o a análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos de \beta-lactamasa preferidos incluyen aquéllos con la secuencia polipeptídica representada en la relación de SECUENCIAS ID. y cualquier otro polipéptido o proteína que presenta una actividad de \beta-lactamasa similar tal como se mide mediante uno o más de los ensayos que se describen en la presente memoria. Polipéptido o proteínas de \beta-lactamasa pueden incluir cualquier proteína que presente una actividad suficiente para la detección en los ensayos que se describen en la presente memoria.
"De origen natural" tal como se utiliza en la presente memoria, aplicada a un objeto, se refiere al hecho de que dicho objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o una secuencia polinucleotídica que está presente en un organismo (incluyendo los virus) que se puede aislar a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.
"Unido de manera operable" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Una secuencia de control "unida de manera operable" a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se puede conseguir en condiciones compatibles con las secuencias de control.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias polinucleotídicas que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificantes y no codificantes a las cuales están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control son diferentes dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control comprenden generalmente el promotor, el sitio de unión ribosómica, y la secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y una secuencia de terminación de transcripción. La expresión "secuencias de control" se pretende que incluya, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir sobre la expresión, y pueden incluir asimismo componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión.
"Polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos con una longitud de por lo menos 10 bases, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquiera de estos tipos de nucleótido. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN. "Polinucleótido genómico" se refiere a una porción de un genoma. "Polinucleótido genómico activo" o "porción activa de un genoma" se refiere a regiones de un genoma cuya regulación se puede aumentar, disminuir o ambas cosas, ya sea directamente o indirectamente mediante un proceso biológico. "Directamente", en el contexto de un proceso o procesos biológicos, se refiere a una causación directa de un proceso que no requiere etapas intermedias, causada normalmente por una molécula que se pone en contacto o se une a otra molécula (del mismo tipo o de diferente tipo de molécula). Por ejemplo, la molécula A se pone en contacto con la molécula B, lo cual hace que la molécula B ejerza un efecto X que forma parte de un proceso biológico. "Indirectamente", en el contexto de un proceso o procesos biológicos, se refiere a una causación indirecta que requiere etapas intermedias, causada normalmente por dos o más etapas directas. Por ejemplo, la molécula A se pone en contacto con la molécula B para ejercer un efecto X que a su vez causa un efecto Y.
"Polinucleótido de \beta-lactamasa" se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa. Preferentemente, la proteína con actividad de \beta-lactamasa se puede medir en un FACS a una temperatura de 22ºCelsius utilizando un sustrato de \beta-lactamasa CCF2-AM a un nivel de aproximadamente 1.000 moléculas de dicha proteína o menos por cada célula. Más preferentemente, la proteína con actividad de \beta-lactamasa se puede medir en un FACS a una temperatura de 22ºCelsius utilizando un sustrato de \beta-lactamasa CCF2-AM a un nivel de aproximadamente 300 a 1.000 moléculas de dicha proteína por cada célula. Más preferentemente, la proteína con actividad de \beta-lactamasa se puede medir en un FACS a una temperatura de 22ºCelsius utilizando un sustrato de \beta-lactamasa CCF2-AM a un nivel de aproximadamente 25 a 300 moléculas de dicha proteína por cada célula. Se pueden utilizar proteínas con actividad de \beta-lactamasa que requieren más de 1.000 moléculas de dicha proteína por cada célula para la detección con un FACS a una temperatura de 22ºCelsius utilizando un sustrato de \beta-lactamasa CCF2-AM y que presentan preferentemente por lo menos el 5% de la actividad de la proteína con la SEC. ID. nº 1.
"Homología de secuencias" se refiere a la proporción de coincidencias de bases entre dos secuencias de ácidos nucleicos o a la proporción de coincidencias de aminoácidos entre dos secuencias de aminoácidos. Cuando la homología de secuencias se expresa en forma de un porcentaje, por ejemplo, el 50%, el porcentaje designa la proporción de coincidencias a lo largo de la longitud de la secuencia de una secuencia deseada (por ejemplo, secuencias de \beta-lactamasa, tales como la SEC. ID. nº 1) que se compara con alguna otra secuencia. Se permiten lagunas (en cualquiera de las dos secuencias) para maximizar la coincidencia; se utilizan normalmente longitudes de lagunas de 15 bases o menos, se prefieren 6 bases o menos siendo más preferidas 2 bases o menos. Cuando se utilizan oligonucleótidos como sondas o tratamientos, la homología de secuencias entre el ácido nucleico diana y la secuencia oligonucleotídica es generalmente no inferior a 17 coincidencias de bases diana de 20 coincidencias de pares de bases oligonucleotídicas posibles (85%); preferentemente no inferior a 9 coincidencias de 10 coincidencias de pares de bases posibles (90%), y muy preferentemente no inferior a 19 coincidencias de 20 coincidencias de pares de pases posibles
(95%).
"Hibridar selectivamente" se refiere a unir de manera detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hibridan selectivamente con cadenas de ácidos nucleicos diana, en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones muy restrictivas para conseguir condiciones de hibridación selectivas tal como es conocido en la técnica y que se exponen en la presente memoria. Generalmente, la homología de secuencias de ácidos nucleicos entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos y la secuencia de ácido nucleico de interés será por lo menos del 30%, y más típicamente con homologías preferiblemente crecientes de por lo menos aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70% y 90%.
Típicamente, las condiciones de hibridación y lavado se realizan con una alta severidad según procedimientos de hibridación convencionales. Los clones positivos se aíslan y se secuencian. Para ilustración, y no para limitación, un polinucleótido de longitud completa que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de SEC. ID. nº 1 se puede marcar y utilizar como una sonda de hibridación para aislar clones genómicos procedentes de una biblioteca de dianas apropiada en \lambdaEMBL4 o \lambdaGEM11 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin); condiciones de hibridación típicas para rastrear levantamientos de placas (Benton y Davis (1978) Science 196: 180) pueden ser: formamida al 50%, 5 x SSC o SSPE, 1-5 x solución de Denhardt, SDS al 0,1-1%, 100-200 \mug de ADN o ARNt heterólogo sometido a cizallamiento, sulfato de dextrano al 0-10%, 1 x 10^{5} a 1 x 10^{7} cpm/ml de una sonda desnaturalizada con una actividad específica de aproximadamente 1 x 10^{8} cpm/\mug, e incubación a una temperatura de 42ºC durante aproximadamente 6-36 horas. Las condiciones de prehibridación son esencialmente idénticas, excepto en que la sonda no está incluida y el tiempo de incubación se reduce típicamente. Las condiciones de lavado son típicamente 1-3 x SSC, SDS al 0,1-1%, 50-70ºC con cambio de solución de lavado a aproximadamente 5-30 minutos. Se pueden obtener de esta manera secuencias cognadas, incluyendo secuencias alélicas.
Dos secuencias de aminoácidos son homólogas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para determinar la coincidencia máxima. Se permiten lagunas (en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando) para maximizar la coincidencia; se prefieren lagunas de 5 o menos, siendo más preferidas 2 o menos. Alternativamente y preferentemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias polipeptídicas derivadas de las mismas con una longitud de por lo menos 30 aminoácidos) son homólogas, tal como este término se utiliza en la presente memoria, si presentan una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalidad por lagunas de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, 1972, volumen 5, National Biomedical Research Foundation, páginas 101-110, y el Suplemento 2 a este volumen, páginas 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferentemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en una proporción igual o mayor que el 30% cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN.
"Corresponde a" se refiere a una secuencia polinucleotídica que es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada de manera evolutiva) a toda o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a toda o a una porción de la secuencia polipeptídica de referencia. A diferencia de ello, la expresión "complementario a" se utiliza en la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o a una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia. Para ilustración, la secuencia nucleotídica "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".
Los siguientes términos y expresiones se utilizan para describir las correlaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencias", "porcentaje de identidad de secuencias" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, tal como un segmento de una secuencia de ADNc o génica de longitud completa dada en una relación de secuencias tal como una SEC. ID. nº 1, o puede comprender una secuencia de ADNc o génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia presenta una longitud de por lo menos 20 nucleótidos, frecuentemente una longitud de por lo menos 25 nucleótidos, y con frecuencia unas longitud de por lo menos 50 nucleótidos. Puesto que dos polinucleótidos (1) pueden comprender cada uno una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 20 posiciones de nucleótidos contiguas en la que una secuencia polinucleotídica se puede comparar con una secuencia de referencia de por lo menos 20 nucleótidos contiguos y en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, lagunas) del 20 por ciento o inferior en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. Se puede llevar a cabo una alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443, mediante la búsqueda para el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante implementaciones informatizadas de dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release, 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección y se selecciona la mejor alineación (es decir, la que da como resultado el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada mediante los diversos procedimientos. La expresión "identidad de secuencias" significa que dos secuencias polinucleotídicas son idénticas (es decir, sobre una base de nucleótidos a nucleótido) sobre la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencias" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se encuentra la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencias. La expresión "identidad sustancial" tal como se utiliza en la presente memoria designa una característica de una secuencia polinucleotídica, en la que el polinucleótido comprende una secuencia que presenta una identidad de secuencias de por lo menos el 30 por ciento, preferentemente una identidad de secuencias de por lo menos del 50 al 60 por ciento, más usualmente una identidad de secuencias de por lo menos el 60 por ciento en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente sobre una ventana de por lo menos 25 a 50 nucleótidos, en el que el porcentaje de identidad de secuencias se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia polinucleotídica que puede incluir deleciones o adiciones que totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación.
Tal como se aplica para polipéptidos, la expresión "identidad sustancial" significa que las dos secuencias peptídicas, cuando son alineadas óptimamente, tal como mediante el programa GAP o BESTFIT utilizando falta de pesos por lagunas, comparten una identidad de secuencias de por lo menos el 30 por ciento, preferentemente una identidad de secuencias de por lo menos el 40 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de por lo menos el 50 por ciento, y muy preferentemente una identidad de secuencias de por lo menos el 60 por ciento. Preferentemente, las posiciones de restos, que no son idénticas, se diferencian por sustituciones de aminoácidos conservadores. La expresión sustituciones de aminoácidos conservadores se refiere a la intercambiabilidad de restos que presentan cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales alifáticas está constituido por glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales de hidroxilo alifático está constituido por serina y treonina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales que contienen amida está constituido por asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales aromáticas está constituido por fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales básicas está constituido por lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que presentan cadenas laterales que contienen azufre está constituido por cisteína y metionina. Los principales grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilanilina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutámico-ácidoaspártico y asparagina-glutamina.
"Fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido que presenta una deleción de terminal amino y/o de terminal carboxi, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es normalmente idéntica a las correspondientes posiciones en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa (por ejemplo, la secuencia mostrada en SEC. ID. nº 1). "Fragmento de polipéptidos de \beta-lactamasa" se refiere a un polipéptido que está constituido por un segmento de por lo menos 25 aminoácidos que presenta una identidad sustancial con una porción de la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la SEC. ID. nº 1 y que presenta por lo menos una de las siguiente propiedades: (1) unión específica a un sustrato de \beta-lactamasa, preferentemente cefalosporina, en condiciones de unión adecuadas, o (2) la capacidad de efectuar una actividad enzimática, preferentemente una actividad de escisión de la cadena principal de cefalosporina, cuando se expresa en una célula de mamífero. Típicamente, los polipéptidos análogos comprenden una sustitución de aminoácido conservador (o adición o deleción) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos presentan típicamente una longitud de por lo menos 300 aminoácidos, preferentemente una longitud de por lo menos 500 aminoácidos o superior, presentando muy usualmente una longitud tan grande como un polipéptido de origen natural de longitud completa.
"Modulación" se refiere a la capacidad para aumentar o inhibir una propiedad funcional de una actividad o proceso biológico (por ejemplo, actividad enzimática o unión a receptores). Dicho aumento o inhibición puede depender de la incidencia de un suceso específico, tal como la activación de una vía de transducción de señales, y/o se puede manifestar únicamente en tipos de células particulares.
El término "modulador" se refiere a un producto químico (de origen natural o de origen no natural), tal como una macromolécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico, proteína, un no péptido o una molécula orgánica), o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células o tejidos de animales (en particular de mamíferos). Los moduladores se evalúan típicamente para determinar su actividad potencial como inhibidores o activadores (directamente o indirectamente) de un proceso o procesos biológicos (por ejemplo, agonista, antagonista parcial, agonista parcial, antagonista, agente antineoplásico, agente citotóxico, inhibidores de transformación neoplásica o de proliferación celular, agentes promotores de proliferación celular y otros similares) mediante inclusión en ensayos que se describen en la presente memoria. La actividad de un modulador puede ser conocida, desconocida o parcialmente conocida.
La expresión "producto químico de ensayo" se refiere a un producto químico que se ha de ensayar mediante uno o más procedimientos de la invención como modulador supuesto. No es conocido normalmente que un producto químico de ensayo se una a una diana de interés. La expresión "producto químico de control" se refiere a un producto químico que es conocido que se une a la diana (por ejemplo, un conocido agonista, antagonista, agonista parcial o agonista inverso). Dichos productos químicos de control incluyen productos químicos que 1) disgregan no específicamente o sustancialmente la estructura de la proteína (por ejemplo, agentes desnaturalizantes (por ejemplo urea o guanidio), agentes carotrópicos, reactivos con sulfhidrilo (por ejemplo, ditiotritol y \beta-mecaptoetanol) y proteasas), 2) inhiben generalmente el metabolismo celular (por ejemplo, desacopladores mitocondriales) y 3) interrumpen no específicamente interacciones electrostáticas o hidrófobas de una proteína (por ejemplo, altas concentraciones salinas, o detergentes en concentraciones suficientes para interrumpir no específicamente interacciones hidrófobas). Preferentemente, un "producto químico de ensayo" no es un producto que es conocido que son inadecuados para un uso terapéutico para una indicación particular debido a la toxicidad al sujeto. Normalmente, se utilizan diversas concentraciones predeterminadas de productos químicos de ensayo para rastrear, tales como 0,01 \muM, 0,1 \muM, 1,0 \muM y 10,0 \muM.
El término "diana" se refiere a una entidad bioquímica implicada en un proceso biológico. Preferentemente, las dianas son proteínas que desempeñan un papel útil en la fisiología o biología de un organismo. Un producto químico terapéutico se une a la diana para modificar o modular su función. Tal como se utiliza en la presente memoria, las dianas pueden incluir receptores de superficies celulares, Proteínas G, quinasas, canales de iones, fosfolipasas y otras proteínas que se mencionan en la presente memoria.
El término "marca" o "marcado" se refiere a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilados que se pueden detectar mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o una actividad enzimática que se puede detectar por procedimientos ópticos o colorimétricos). Son conocidos en la técnica, y se pueden utilizar diversos procedimientos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero sin limitarse a ellos, los siguientes: radioisótopos (por ejemplo, ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina y luminóforos lantánidos), marcadores enzimáticos (o genes informadores) (por ejemplo, genes informadores enzimáticos, peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa y fosfatasa alcalina; y genes informadores no enzimáticos (por ejemplo, proteínas fluorescentes)), grupos biotinilados quimioluminiscentes, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera se leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, identificadores de epítopos). "Sustancialmente puro" se refiere a una especie objeto que es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende por lo menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá una proporción superior a aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente superior a aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99%. Muy preferentemente, la especie objeto se purifica hasta esencialmente homogeneidad (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición mediante procedimientos de detección convencionales) en que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
"Agente farmacéutico o fármaco" se refiere a un producto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseable cuando es administrado apropiadamente (por ejemplo, utilizando la cantidad y la modalidad de administración apropiadas) a un paciente.
Se utilizan en la presente memoria otros términos de química según la utilización convencional en la técnica, tal como se ejemplifica por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (compilado por Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco).
Introducción
La presente solicitud reconoce que se pueden utilizar eficazmente polinucleótidos de \beta-lactamasa en células eucarióticas no de levaduras para identificar funcionalmente porciones activas de un genoma asociadas directamente o indirectamente con un proceso biológico. La presente solicitud reconoce asimismo por primera vez que la actividad de \beta-lactamasa se puede medir utilizando sustratos penetrantes de membranas en células vivas incubadas con un producto químico de ensayo que interacciona directamente o indirectamente con una porción del genoma que presenta un polinucleótido de \beta-lactamasa integrado. La presente solicitud, por lo tanto, permite la identificación y el aislamiento rápidos de polinucleótidos genómicos asociados indirectamente o directamente con un proceso biológico definido y la identificación de compuestos que modulan dichos procesos y regiones del genoma. Debido a que se hace posible la identificación de polinucleótidos genómicos activos en células vivas, se puede llevar a cabo una caracterización funcional adicional utilizando las mismas células, y opcionalmente, el mismo ensayo de rastreo. La capacidad de rastrear funcionalmente inmediatamente después de la rápida identificación de una porción funcionalmente activa de un genoma, sin necesidad de transferir la porción identificada del genoma a un sistema de rastreo secundario, representa, entre otras cosas, una ventaja clara sobre una aplicación de un gen informador de la técnica anterior y procedimientos que se describen en la presente memoria, tal como se muestra en la Figura 1.
La solicitud comprende varios aspectos generales y útiles, que incluyen:
1)
un procedimiento para la identificación de genes o productos génicos asociados directamente o indirectamente (por ejemplo, regulados) con un proceso biológico de interés (que puede ser modulado mediante un compuesto) utilizando un polinucleótido genómico unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa,
2)
un procedimiento para la identificación de proteínas (por ejemplo, proteínas huérfanas o proteínas conocidas) o compuestos que modulan directamente o indirectamente (por ejemplo, activan o inhiben la transcripción) un polinucleótido unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa.
3)
un procedimiento de rastreo para un polinucleótido genómico activo (por ejemplo, un intensificador, promotor o región codificante en el genoma) que puede estar asociado directamente o indirectamente (por ejemplo regulado) con un proceso biológico de interés (que puede ser modulado por un compuesto) utilizando un polinucleótido genómico unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa que puede ser detectada por FACS utilizando un sustrato fluorescente de \beta-lactamasa penetrante de membranas,
4)
células eucarióticas con un polinucleótido genómico unido de manera operable a un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa, y
5)
polinucleótidos relacionados con los procedimientos y células anteriormente mencionados.
Estos aspectos, así como otros que se describen en la presente memoria, se pueden alcanzar utilizando los procedimientos y composiciones de materiales que se describen en la presente memoria. se reconocerá además que diversos aspectos se pueden combinar para preparar formas de realización deseables. Por ejemplo, un procedimiento para la identificación de compuestos que modulan polinucleótidos genómicos activos unidos de manera operable a una proteína con actividad de \beta-lactamasa que se puede detectar por FACS utilizando un sustrato fluorescente de \beta-lactamasa penetrante de membranas.
Procedimientos para identificar rápidamente porciones funcionales de un genoma
Está previsto un procedimiento para la identificación de porciones de un genoma, por ejemplo polinucleótidos genómicos, en una célula viva utilizando un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa que se puede detectar con un sustrato de \beta-lactamasa penetrante de membranas. típicamente, el procedimiento consiste en insertar un polinucleótido que codifica una proteína con actividad de \beta-lactamasa en el genoma de un organismo utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, desarrollado en el futuro o descrito en la presente memoria. Usualmente, se utilizará una construcción de expresión de \beta-lactamasa para integrar un polinucleótido de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico, tal como se describe en la presente memoria. La célula, tal como una célula eucariótica, se pone en contacto normalmente con una concentración predeterminada de un modulador, ya sea antes o después de la integración del polinucleótido de \beta-lactamasa. La actividad de \beta-lactamasa se mide a continuación usualmente en el interior de la célula viva, preferentemente con sustratos fluorescentes de \beta-lactamasa penetrantes de membranas que son transformados por la célula en sustratos de \beta-lactamasa no penetrantes de membranas tal como se describe en la presente memoria y en la publicación PCT nº WO96/30540 publicada el 3 de octubre de 1996, de Tsien et al.
Una vez que los polinucleótidos de \beta-lactamasa están integrados en el genoma de interés, éstos quedan bajo el control transcripcional del genoma de la célula huésped. La integración en el genoma es normalmente estable, tal como se describe en la presente memoria y es conocida en la técnica. El control transcripcional del genoma resulta con frecuencia de la activación de un receptor (por ejemplo, un receptor intracelular o de superficie celular), que puede regular sucesos transcripcionales y traduccionales para cambiar la cantidad de proteína presente en la célula. La cantidad de proteína presente con actividad de \beta-lactamasa se puede medir por medio de su acción enzimática sobre un sustrato. Normalmente, el sustrato es una molécula pequeña no cargada que, cuando se añade a la solución extracelular, puede penetrar la membrana plasmática para encontrar la enzima. Se puede emplear asimismo una molécula cargada, pero las cargas son enmascaradas generalmente por grupos que serán escindidos por enzimas o procesos celulares endógenos o heterólogos. (por ejemplo, ésteres escindidos por esterasas citoplasmáticas). Tal como se describe más completamente en la presente memoria y en la publicación PCT nº WO 96/30540 publicada el 3 de octubre de 1996, de Tsien et al., la utilización de sustratos que presentan cambios en sus espectros fluorescentes al efectuar interacción con una enzima, es particularmente deseable. En algunos ensayos, el sustrato fluorogénico se convierte en un producto fluorescente por la actividad de \beta-lactamasa. Alternativamente, el sustrato fluorescente cambia las propiedades de fluorescencia en la conversión por la actividad de \beta-lactamasa. Preferentemente, el producto deberá ser muy fluorescente para obtener una señal máxima, y muy polar, para permanecer atrapado en el interior de la célula.
Vectores e integración
Se pueden utilizar vectores, tales como vectores víricos y plasmídicos, para introducir genes o material genético de la invención en células, preferentemente mediante integración en el genoma de la célula huésped. Dichos vectores víricos pueden consistir en cualquiera de los virus apropiados, tales como retrovirus, adenovirus, virus asociados con adenovirus, papilomavirus, herpes virus, o cualquier virus ecotrópico o anfitrópico, preferentemente un retrovirus. Los virus pueden ser, por ejemplo, retrovirus o cualquier otro virus modificado para que sea replicativamente deficiente, citomegalovirus, virus de leucemia de Friend, VIS, VIH, virus de sarcoma de Rouse, o virus de Maloney, tal como virus de leucemia murina de Maloney.
Los vectores, tales como los vectores de retrovirus, pueden codificar una proteína selectiva operable de tal como que las células que han sido transformadas pueden ser seleccionadas positivamente. Dicha proteína selectiva puede consistir en factores de resistencia a antibióticos, tales como resistencia a neomicina, tales como NEO. Alternativamente, se pueden seleccionar negativamente células utilizando una enzima, tal como timidina quinasa de virus de herpes simplex (HSVTK) que transforma una protoxina en una toxina. Hay disponibles vectores víricos, tales como vectores retrovíricos que son adecuados para estos propósitos, tales como el vector PSIR (disponible en Clon Tech de California con células de empaquetado PT67) GgU3Hisen y hay disponibles variantes GgTNKneoU3 y GgTKNeoen de virus de leucemia murina de Maloney. Se pueden realizar modificaciones de vectores que hacen posible una integración más eficaz en el genoma de la célula huésped. Dichas modificaciones incluyen secuencias que favorecen la integración o procedimientos conocidos para promocionar el transporte de ácido nucleico dentro del núcleo de la célula huésped. Se pueden utilizar asimismo vectores víricos como los que se describen en la patente US nº 5.364.783 de Ruley y von Melchner para aumentar la eficacia de la transfección.
Se pueden utilizar asimismo vectores con liposomas u otras vesículas que pueden transportar material genético al interior de una célula. Las estructuras apropiadas son conocidas en la técnica. Los liposomas pueden incluir vectores tales como plásmidos o cromosomas artificiales de levaduras (YAC), que pueden incluir material genético para ser introducido en la célula. Se pueden introducir asimismo plásmidos en células mediante cualquiera de los procedimientos conocidos, tales como electroporación, fosfato de calcio o lipofección. Se pueden utilizar asimismo fragmentos de ADN, sin un plásmido o vector vírico.
En un aspecto de la presente invención, se utilizan vectores para introducir genes informadores en células. Cuando el gen informador se integra en el genoma de una célula diana de tal modo que el gen informador se expresa, dicho suceso se puede detectar detectando el gen informador. Se pueden utilizar clones que expresan el gen informador en una amplia diversidad de condiciones para una diversidad de propósitos, incluyendo el descubrimiento de genes y fármacos. Cromosomas identificados con construcciones de expresión de \beta-lactamasa se pueden transferir a células de recepción deseadas utilizando procedimientos establecidos en la técnica.
Los polinucleótidos de \beta-lactamasa se pueden disponer sobre una diversidad de plásmidos para la integración en un genoma y para identificar genes procedentes de una gran diversidad de organismos (Gorman, C.M. et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051 (1982); Alam, J. y Cook, J.L., Anal. Biochem. 188:245-254, (1990)). Se utilizan técnicas estándar para introducir estos polinucleótidos en una célula o un organismo entero (por ejemplo, tal como se describe por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis T. en Expression of cloned genes in cultured mammalian cells. En: Molecular Cloning, compilado por Nolan, C. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Se pueden utilizar marcadores de resistencia para seleccionar células satisfactoriamente transfectadas.
Si se selecciona una construcción de expresión de \beta-lactamasa para integrar un polinucleótido de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico, ésta contendrá normalmente por lo menos un polinucleótido \beta-lactamasa unido de manera operable a un aceptor de empalme y opcionalmente a un donador de empalme. Alternativamente, el polinucleótido de \beta-lactamasa puede estar unido de manera operable a cualquier medio para integrar un polinucleótido en un genoma, preferentemente para la integración en un intrón de un gen para producir un producto de traducción en el marco. La construcción de expresión de \beta-lactamasa puede comprender opcionalmente, dependiendo de la aplicación, un elemento de IRES, un donador de empalme, un sitio poli A, un sitio de partida traduccional (por ejemplo una secuencia Kozak) una LTR (repetición terminal larga) y un marcador seleccionable.
Genes informadores de \beta-lactamasa
Preferentemente, los polinucleótidos de \beta-lactamasa codifican una forma citosólica de una proteína con actividad de \beta-lactamasa. Esto proporciona la ventaja de atrapar la proteína de \beta-lactamasa normalmente secretada en el interior de la célula, lo cual aumenta la relación de señal a ruido de la señal asociada con actividad de \beta-lactamasa. Normalmente, esto se efectúa eliminando o inhabilitando la secuencia de señal normalmente presente para la secreción. Tal como se utiliza en la presente memoria, "proteína citosólica con actividad de \beta-lactamasa" se refiere a una proteína con actividad de \beta-lactamasa que carece de las secuencias de aminoácidos apropiadas para la secreción a partir de la célula, por ejemplo, la secuencia de señal. Por ejemplo, en el polipéptido de la SEC. ID nº 1, la secuencia de señal ha sido sustituida con los aminoácidos Met-Ser. De acuerdo con ello, al efectuar la expresión, la actividad de \beta-lactamasa permanece en el interior de la célula. Para la expresión en células de mamíferos, es preferible utilizar polinucleótidos de \beta-lactamasa con secuencias nucleotídicas preferidas por células de mamíferos. En algunos casos, se puede utilizar una forma secretada de \beta-lactamasa con los procedimientos y composiciones de la invención. En particular, los genes que presentan secuencias que dirigen la selección se pueden identificar con un ensayo de \beta-lactamasa. Esto permite asimismo una multiplicación basada en la localización directa de \beta-lactamasa.
Las proteínas con actividad de \beta-lactamasa pueden ser cualesquiera de las conocidas en la técnica, que se desarrollen en el futuro o descritas en la presente memoria. Esto incluye, por ejemplo, las enzimas representadas por las SEC. ID. n^{os} descritas en la presente memoria. Los ácidos nucleicos que codifican proteínas con actividad de \beta-lactamasa se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante reacción de cadenas de polimerasa de ADNc utilizando cebadores basados en la secuencia de ADN en la SEC. ID. nº 1. Se describen procedimientos PCR, por ejemplo, en la patente US nº 4.683.195; Mullis et al., (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; y Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, N.Y. 1989).
Secuencias para ayudar a la integración
La construcción de expresión de \beta-lactamasa incluye típicamente secuencias para la integración, especialmente secuencias ideadas para dirigir o aumentar la integración en el genoma. El aceptor de sitio de empalme puede estar unido de manera operable al polinucleótido de \beta-lactamasa para facilitarla expresión al efectuar la integración en un intrón. Normalmente, se creará un ARN de fusión con la región codificante de una porción operable contigua del exón. Una secuencia de aceptor de empalme es una secuencia en el extremo 3' de un intrón en el que éste se une a un exón. Las secuencias de consenso para un aceptor de empalme están constituidas por NTN (TC) (TC) (TC) TTT (TC) (TC) (TC) (TC) (TC) (TC) NCAGgt. Las secuencias intrónicas están representadas por letras mayúsculas y la secuencia exónica por letras minúsculas. Estas secuencias representan las que se conservan de genomas víricos a genomas de primates.
El sitio donador de empalme puede estar unido de manera operable al polinucleótido de \beta-lactamasa para facilitar la integración en un intrón para promocionar la expresión que requiere una secuencia de poliadenilación. Normalmente, se crea un ARN de fusión con la región codificante o no traducida en el extremo 3' del polinucleótido de \beta-lactamasa. Esto se prefiere cuando se desea secuenciar la región codificante del gen identificado. Un donador de empalme es una secuencia en el extremo 5' de un intrón en el que éste se une con un exón. La secuencia de consenso para una secuencia de donador de empalme es naggt(ag)aGT. Las secuencias intrónicas están representadas con letras mayúsculas y las secuencias exónicas por letras minúsculas. Estas secuencias representan las que se conservan de genomas víricos a genomas de primates. Este donador de empalme hace posible la identificación del gen diana utilizando 3' RACE.
Como una alternativa al sitio donador de empalme, un sitio poli A puede estar unido de manera operable al polinucleótido de \beta-lactamasa. Las señales de poliadenilación, es decir los sitios poli A, incluyen sitios SV40 poli A, tales como los descritos en el Catálogo de Invitrogen de 1996 (California). En algunos casos, puede ser deseable incluir en la construcción de expresión de \beta-lactamasa un sitio de partida traduccional. Por ejemplo, un sitio de partida traduccional hace posible la expresión de \beta-lactamasa incluso si la integración tiene lugar en regiones no codificantes. Normalmente, dichas secuencias no reducirán la expresión de un gen altamente expresado. Los sitios de partida traduccionales incluyen una "secuencia Kozak" y son las secuencias preferidas para la expresión en células de mamíferos descritas por Kozak, M., en J. Cell Biol. 108: 229-241 (1989). La secuencia nucleotídica para una proteína citosólica con actividad de \beta-lactamasa en la SEC. ID. nº 3 contiene secuencias Kozak para los nucleótidos -9 a 4 (GGTACCACCATGA).
Es asimismo preferible, cuando se utilizan células de mamíferos, incluir un elemento de IRES ("sitio de unión de entrada de ribosoma interno") en la construcción de expresión de \beta-lactamasa. Típicamente, un elemento de IRES mejorará el rendimiento de los clones de expresión. Una advertencia de los vectores de integración es que únicamente uno en cada tres inserciones en un intrón estará en el marco y producirá una proteína informadora funcional. Esta limitación se puede reducir clonando una secuencia de IRES entre el sitio de aceptor de empalme y el gen informador (por ejemplo, un polinucleótido de \beta-lactamasa). Esto elimina restricciones del marco de lectura y una posible inactivación funcional de la proteína informadora por fusión con una proteína endógena. Los elementos de IRES incluyen los procedentes de picornavirus, virus relacionados con picornavirus, y de hepatitis A y C. Preferentemente, el elemento de IRES es de un poliovirus. Se pueden encontrar elementos de IRES específicos, por ejemplo, en el documento WO9611211 de Das y Coward publicado el 16/4/96, el documento EP 585983 de Zurr publicado el 7/3/96, el documento WO9601324 de Berlioz publicado el 18/1/96 y el documento WO9424301 de Smith publicado el 27 de octubre de 1994. Para mejorar la selección de polinucleótidos de \beta-lactamasa en un genoma, se puede utilizar un marcador seleccionable en la construcción de expresión de \beta-lactamasa. Los marcadores seleccionables para células de mamíferos son conocidos en la técnica, e incluyen por ejemplo, timidina quinasa, dihidrofolato reductasa (junto con metotrexato en forma de amplificador de DHFR), aminoglicósido fosfotransferasa, higromicina B fosfotransferasa, asparagina sintetasa, adenosina desaminasa, metalo tionieno, y genes resistentes a antibióticos tales como genes con resistencia a neomicina. Los marcadores seleccionables para células no de mamífero son conocidos en la técnica e incluyen genes que proporcionan resistencia a antibióticos, tales como canamicina, tetraciclina y ampicilina.
La solicitud se puede poner en práctica fácilmente en genomas que presentan estructuras intrón/exón. Dichos genomas incluyen los de mamíferos (por ejemplo, seres humanos, conejo, ratón, rata, mono, cerdo y vaca), vertebrados, insectos y levadura. Se utilizan más usualmente vectores dirigidos a intrones en células de mamíferos como intrones, o secuencias interpuestas, son considerablemente más grandes que los exones, o regiones codificantes de ARNm en mamíferos. La dirección a intrones se puede conseguir clonando un aceptor de empalme o secuencias intrónicas de 3' corriente arriba de un gen de nucleótido de \beta-lactamasa seguido de una señal de poliadenilación o un sitio donador de empalme de 5'. Cuando el vector se inserta en un intrón, el gen informador (por ejemplo, \beta-lactamasa) se expresa bajo el mismo control que el gen en el cual ha sido insertado el mismo.
La solicitud se puede poner en práctica asimismo en genomas que presentan números reducidos, o que carecen, de estructura intrón/exón. Para eucariotas inferiores, que presentan una organización genómica sencilla, es decir que contienen pocos y pequeños intrones, se puede utilizar vectores dirigidos a exones. Dichos vectores incluyen polinucleótidos de \beta-lactamasa unidos de manera operable a secuencias de poliadenilación y opcionalmente a un elemento de IRES. Hongos de eucariotas inferiores y los eucariotas patógenos (por ejemplo, parásitos y microorganismos). Para genomas que carecen de estructuras intrón/exón, se puede utilizar una integración de enzimas de restricción, una integración inducida por transposones o una integración de selección para la integración genómica. Dichos procedimientos incluyen los descritos por Kuspa y Loomis, PNAS 89: 8803:8807 (1992) y Derbyshire, K.M., Gene 7 noviembre: 143-144 (1995). Los procariotas pueden ser utilizados con la invención si la integración puede tener lugar en dichos genomas. Los vectores retrovíricos pueden ser asimismo utilizados para integrar los polinucleótidos de \beta-lactamasa en un genoma (por ejemplo, eucariótico), tal como los procedimientos y la composición descritos en la patente US nº 5.364.783.
Típicamente, la integración tendrá lugar en las regiones del genoma que son accesibles para el vector de integración. Dichas regiones son normalmente porciones activas del genoma en las que existe una actividad reguladora del genoma aumentada, por ejemplo, actividad de polimerasa aumentada o un cambio de la unión de ADN por proteínas que regulan la transcripción del genoma. Muchas formas de realización de la invención descritas en la presente memoria pueden dar como resultado una integración aleatoria, especialmente en regiones activamente transcritas.
Integración en porciones activas del genoma
La integración, sin embargo, puede ser dirigida a regiones del genoma activas durante tipos específicos de actividad del genoma. Por ejemplo, la integración en sitios en el genoma que son activos durante fases específicas del ciclo celular puede promocionarse sincronizando las células en una fase deseada del ciclo celular. Dichos procedimientos de ciclos celulares incluyen los conocidos en la técnica, tales como privación de suero o los factores alfa (para la levadura). La integración se puede dirigir asimismo a regiones del genoma activos durante la regulación celular mediante un producto químico, tal como un antagonista o agonista para un receptor o algún otros producto químico que aumente o disminuya o module de otro modo la actividad del genoma. Mediante la adición del producto químico de interés, se puede aumentar la actividad del genoma, con frecuencia en regiones especificas para promover la integración de un vector de integración (por ejemplo, tal como una construcción de gen informador), en dichas regiones del genoma.
Por ejemplo, se podría aplicar un activador de receptor nuclear (general o específico) para activarlas células antes o durante la integración con el fin de promover la integración de genes informadores en sitios el genoma que se vuelven más activos durante la activación de receptores nucleares. Dichas células se podrían rastrear a continuación con el mismo activador o con un activador de receptor nuclear diferente para identificar qué clones y qué porciones del genoma son activos durante la activación de receptores nucleares. Cualquiera de los agonistas, antagonistas y moduladores de los receptores descritos en la presente memoria se pueden utilizar de dicha manera, así como cualquier otro producto químico que aumente o disminuya la actividad del genoma.
Células para la integración en el genoma
Las células utilizadas corresponderán típicamente al genoma de interés. Por ejemplo, si se desea identificar regiones del genoma humano, se utilizarán entonces generalmente células humanas que contienen un complemento genético apropiado. Se podrían sesgar bibliotecas, sin embargo, utilizando células que contienen copias adicionales de ciertos cromosomas u otras porciones del genoma. Se pueden utilizar asimismo células que no corresponden al genoma de interés si el genoma de interés o porciones importantes del genoma de interés se pueden replicar en las células, tal como preparando un híbrido de ser humano-ratón.
Adicionalmente, mediante la apropiada selección de células y proteínas expresadas, se pueden construir ensayos de identificación y rastreo que detecten porciones activas del genoma asociadas con un proceso biológico que requiere, en todo o en parte, la presencia de una proteína particular (proteína de interés). Se pueden seleccionar células dependiendo del tipo de proteínas que son expresadas (de manera homóloga o heteróloga) o procedentes del tipo de tejido a partir del cual se generó originariamente la línea celular o explante. Si se desea la identificación de porciones del genoma activadas mediante un tipo particular de proteína, entonces la célula utilizada deberá expresar dicha proteína.
Las células pueden expresar la proteína de manera homóloga, es decir la expresión de la proteína deseada tiene lugar de modo normal o natural en las células. Alternativamente, las células se pueden dirigir para expresar una proteína de manera heteróloga, es decir la expresión de la proteína deseada que no tiene lugar de modo normal o natural en las células. Dicha expresión heteróloga se puede dirigir "dando entrada" al gen en la célula que codifica la proteína deseada o transfectando la célula con un polinucleótido que codifica la proteína deseada (ya sea por expresión constitutiva o por expresión inducible). Se prefiere una expresión inducible si se cree que la proteína de interés expresada puede ser tóxica para la células.
Se pueden utilizar muchas células. Dichas células comprenden, de manera no limitativa, las células embrionarias no humanas, o fetales o adultas. Estas células pueden ser obtenidas a partir del mesodermo, ectodermo, o endodermo y pueden ser células madre, tal como células madre adultas o embrionarias no humanas, o células precursoras adultas. Las células pueden ser de cualquier linaje, tal como vascular, neural, cardiaco, fibroblastos, linfocitos, hepatocitos, cardiaco, hematopoyético, pancreático, epidérmico, mioblastos o miocitos. Otras células incluyen células de riñón de cría de hámster (BHK) (ATTC nº CCL 10), células L de ratón (ATTC nº CCLI.3); células Jurkats (ATTC nº TIB 152) y células 153 DG44 (véase Chasin (1986) Cell. Molec. Genet. 12:555) células de riñón embriónico humano (HEK) (ATCC nº CRL 1573), células de ovario de hámster chino (CHO) (ATCC nº CRL9618, nº CCL61 y nº CRL9096), células PC12 (ATCC nº CRL 17.21) y células COS-7 (ATCC nº CRL 1651). Las células preferidas incluyen células Jurkat, células CHO, células de neuroblastomas, células P19, células F11, células NT-2 y células HEK 293, tales como las descritas en la patente US nº 5.024.939 y por Stillman et al., Mol. Cell. Biol, 5: 2051-2060 (1985). Las células preferidas para la expresión de proteínas heterólogas son las que se pueden transfectar fácilmente y eficazmente.
Las células utilizadas en la presente invención pueden ser procedentes de líneas celulares continuas o líneas celulares primarias obtenidas a partir de, por ejemplo, tejidos, órganos o fluidos de mamíferos. Se pueden utilizar en la presente invención secciones de tejidos así como células dispersas. Se pueden obtener asimismo células a partir de animales transgénicos que han sido manipulados genéticamente para expresar un gen informador. Se prefieren células obtenidas a partir de animales transgénicos o no transgénicos para células que son difíciles de cultivar in vitro, tales como células neurales y hepáticas. Las líneas celulares primarias se pueden convertir en continuas utilizando procedimientos conocidos, tales como fusionando células primarias con una línea celular continua o expresando proteínas de transformación. Las células de la invención se pueden almacenar o utilizar en procedimientos de la invención en forma de poblaciones clonales aisladas en placas tales como las que se describen en las solicitudes de patente de los Estados Unidos que pertenecen al mismo propietario, titulada "Low background multi-well plates and platforms for spectroscopic measurements" (Coassin et al., presentada el 2 de junio de 1997), y titulada "Low background multi-well plates with greater than 864 wells for spectroscopic measurements" Coassin et al., presentada el 2 de junio de 1997). Preferentemente, las células se almacenan o se utilizan en placas con 96, 384, 1.536 ó 3.456 pocillos por placa. Se puede disponer una única célula o una pluralidad de células en dichos pocillos. Dichas poblaciones clonales aisladas presentarán típicamente 1.000, 10.000 ó 100.000 o más de dichas poblaciones representativas de números sustancialmente equivalentes de sitios de integraciones independientes. Dichos paneles se pueden utilizar para el perfilado, identificación de vías, identificación de moduladores, caracterización de moduladores y para otros procedimientos de la invención.
Antes de ser transfectadas con un vector de atrapamiento de la presente invención, las células pueden ser transfectadas con un gen exógeno capaz de expresar una proteína exógena, tal como un receptor (por ejemplo, GPCR) o un gen asociado con la patología de un agente etiológico, tal como un virus, una bacteria o un parásito. Las células que expresan dichas proteínas exógenas se pueden transfectar a continuación con un vector de atrapamiento para formar una biblioteca de clones que se pueden rastrear. La solicitud da a conocer asimismo animales con construcciones de expresión de \beta-lactamasa integradas en el genoma de interés.
Muchas de las células utilizadas pueden informar la modulación de procesos biológicos mediante una diversidad de genes informadores adicionales o productos químicos o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la beta-lactamasa, una enzima, puede convertir sustratos no cromogénicos en productos cromogénicos o modificar las propiedades cromogénicas o fluorescentes de un sustrato tal como CCF2. Además, los informadores fluorescentes, tales como proteínas fluorescentes, tales como moléculas de proteína fluorescente verde (GFP), se pueden utilizar como informadores. Algunas moléculas GFP mutantes presentan diferentes propiedades fluorescentes en comparación con GFP de tipo salvaje. Dichas GFP se pueden utilizar como informadores y se pueden utilizar individualmente o en combinación en la presente invención. Por ejemplo, las células pueden presentar múltiples informadores que se pueden diferenciar para informar diferentes procesos biológicos, o diferentes etapas en un proceso biológico, tales como etapas en una vía de transducción de señales.
Dianas
Las proteínas de interés que se pueden expresar en las células de la invención incluyen: receptores de hormonas (por ejemplo receptores de mineral corticosteroides, glucocorticoides y hormonas tiroideas); receptores intracelulares (por ejemplo, receptores huérfanos, retinoides, de vitamina D3 y de vitamina A); moléculas de señalización (por ejemplo, quinasas, factores de transcripción o moléculas tales como transductores de señales y activadores de transcripción) (Science, volumen 264, 1994, páginas 1.415-1.421; Mol. Cell Biol., volumen 16, 1996, páginas 369-375); receptores de la superfamilia de citoquinas (por ejemplo eritropoyetina, hormona del crecimiento, interferones e interleuquinas (distintas de IL-8) y factores estimuladores de colonias); receptores acoplados a proteína G, véase la patente US nº 5.436.128 (por ejemplo, para hormonas, calcitonina, epinefrina, gastrina y mediadores de pancrina o autocrina, tales como estomatostatina o prostaglandinas) y receptores de neurotransmisores (norepinefrina, dopamina, serotonina o acetilcolina); receptores de tirosinaquinasa (tales como factor del crecimiento de insulina, factor del crecimiento nervioso (patente US nº 5.436.128)). A continuación se describen adicionalmente ejemplos de utilización de dichas proteínas.
Cualquier diana, tal como un receptor intracelular o extracelular implicado en una vía de transducción de señales, tal como las vías de leptina o GPCR, se puede utilizar en la presente invención. Además, los genes activados o reprimidos mediante una diana se pueden aislar, identificar, y los moduladores de dicho gen se pueden identificar utilizando la presente invención. Por ejemplo, la presente invención puede identificar una vía de receptor acoplado a Proteína G (GPCR), determinar su función, aislar los genes modulados por el GPCR, e identificar moduladores de dichas proteína moduladas con GPCR.
Como introducción a la biología celular de GPCR, la activación de G\alpha15 o G\alpha16, a través de una vía de señalización de proteína G, puede activar PLC\beta, que a su vez aumenta los niveles de calcio intracelular. Un aumento de los niveles de calcio puede conducir a la modulación del promotor "sensible al calcio" que forma parte de un sistema de detección de transducción de señales, es decir, un promotor que es activado (por ejemplo, un promotor de NFAT, AP-1) o inhibido por un cambio de los niveles de calcio. Se describe un ejemplo de un sitio de unión de ADN de NFAT por Shaw, et al., en Science: 291:202-205 (1988). De manera similar, un promotor que es sensible a cambios de los niveles de proteína quinasa C (por ejemplo, un "promotor sensible a proteína quinasa C") puede ser modulado por una proteína G\alpha activa a través de una vía de señalización de proteína G. Las células seleccionadas descritas en la presente memoria pueden incluir asimismo un receptor acoplado a proteína G. Se han clonado genes que codifican numerosos GPCR (Simon et al., Science 252: 802-808 (1991)) y se pueden utilizar técnicas de biología molecular convencional para expresar un GPCR sobre la superficie de una célula de la invención. Preferentemente, el promotor Sum sensible puede permitir únicamente un retardo relativamente corto (por ejemplo, menos de 90 minutos) entre la aplicación del GPCR y la activación transcripcional. Un promotor sensible preferido incluye el factor nuclear de un promotor de células T activado (Flanagan et al., Nature 352:803-807 (1991). Los polinucleótidos identificados mediante procedimientos de la invención se pueden utilizar como elementos de respuesta que son sensibles a señales intracelulares (elementos de respuesta a señales). Los elementos de respuesta se pueden utilizar en los ensayos que se describen en la presente memoria, tales como la identificación de productos químicos útiles. Dichos elementos de respuesta a señales pueden ser sensibles a señales intracelulares que incluyen voltaje, pH y niveles intracelulares de Ca^{++}, ATP, ADP, AMPc, GDT, GDP, K^{+}, Na^{+}, Zn^{++}, oxígeno, metabolitos e IP3.
En un aspecto de la presente invención, se pueden transformar células para que expresen un receptor exógeno, tal como GPCR. Dicha línea celular transducida se puede transducir entonces adicionalmente con un vector de atrapamiento para preparar una biblioteca de clones que se pueden utilizar para identificar células que informan la modulación del receptor exógeno. Preferentemente, la línea celular huésped no expresaría apreciablemente el receptor exógeno.
Sobre la base de la estructura singular de los GPCR, que presentan siete dominios, probablemente de transmembrana, (véase Watson y Arkinstall, The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, Nueva York (1944)) se pueden identificar GPCR huérfanos (GPCR que no presentan ninguna función conocida) investigando bases de datos de secuencias, tales como las proporcionadas por la National Library of Medicine (Bethesda, MD), para motivos y homologías similares. Se puede utilizar, naturalmente, esta misma estrategia para cualquier diana, especialmente cuando se ha determinado una secuencia o motivo paradigmático.
Descubrimiento de fármacos para virus y otros patógenos
La función de genes procedentes de virus u otros patógenos que efectúan la expresión de genes en células, tales como células de mamíferos, se puede determinar utilizando la presente invención. Además, se pueden identificar productos químicos que modulan dichos genes utilizando los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, muchos virus transformadores, después de infectar una célula, presentan el efecto de sobrerregular genes implicados en la proliferación celular, lo cual permite que las células infectadas con virus produzcan virus adicionales, que pueden infectar células adicionales. Dichos virus transformadores pueden actuar estimulando un receptor de la célula diana. Un ejemplo del mecanismo es el virus de eritroleucemia de Friend. Este virus utiliza el receptor de eritropoyetina para entrar en las células. Cuando el virus está unido al receptor, es activada una vía que causa una sobreproliferación de glóbulos rojos. Si se inhibe la activación del receptor de eritropoyetina, esto daría como resultado una reducción de la acumulación de glóbulos rojos que puede impedir o reducir la gravedad de la leucemia. El desarrollo de un ensayo que informa la activación de genes diana de mamíferos hace posible la identificación de moduladores o de otras vías dependientes de virus o patógenos. Estos moduladores se pueden utilizar como agentes terapéuticos.
Un procedimiento general para establecer este ensayo utiliza el virus o una proteína vírica aislada como el estímulo para modular una vía. En primer lugar, se prepara una biblioteca de atrapamiento de genes utilizando una línea celular que puede ser infectada por el virus o activada por la proteína vírica. El virus se añade a estas células, y se aíslan clones que responden específicamente a la infección vírica mediante la expresión de un gen informador.
Como ejemplo, es conocido que la porción de GP-120 de proteína del VIH presenta un efecto mitogénico en células expuestas a GP-120, lo cual indica que las vías de señalización corriente abajo que están siendo activadas pueden asociarse con la citotoxicidad del virus y permiten su proliferación. Se pueden aislar clones de células que son inducidos por esta activación que se puede utilizar para rastrear moduladores de este efecto citotóxico o proliferativo. Se pueden utilizar otras proteínas víricas, tales como NEF procedente de VIH. Los productos químicos que inhiben este efecto pueden presentar un valor terapéutico útil para tratar una infección o toxicidad vírica.
Este enfoque se puede aplicar a cualquier patógeno celular que presenta un efecto sobre células diana, tal como citotoxicidad, proliferación celular, inflamación u otras respuestas. Otras dianas etiológicas incluyen otros virus, tales como retrovirus, adenovirus, papilomavirus, herpes virus, citomegalovirus, virus asociados con adenovirus, hepatitis virus, y cualquier otro virus. Además de los virus, se puede utilizar cualquier otro patógeno tal como parásitos, bacterias y viroides, en la presente invención. Las dianas víricas particulares incluyen, pero sin limitarse a ellas, NEF, proteína de hepatitis X, y otras proteínas víricas, tales como las que pueden ser codificadas o llevadas por virus. Además, se pueden añadir dos o más componentes víricos para identificar componentes patógenos covíricos. Esto constituye una herramienta particularmente valiosa para identificar vías moduladas por dos o más virus simultáneamente, o en el transcurso del tiempo, como en afecciones víricas de activación lenta. Por ejemplo, se puede utilizar una cotransfección con VIH y CMV. Las dianas o componentes víricos no incluyen oncogenes o protooncogenes que se encuentran en genomas no infectados y productos génicos de los mismos.
Rastreo de productos químicos de ensayo utilizando porciones del genoma
Las células que comprenden polinucleótidos de \beta-lactamasa integrados en el genoma se pueden poner en contacto con productos químicos de ensayo o moduladores de un proceso biológico y ser rastreados para determinar la actividad. Normalmente, el producto químico de ensayo que se está rastreando presentará por lo menos una diana definida, usualmente una proteína. El producto químico de ensayo se aplica normalmente a las células para alcanzar una concentración final predeterminada en el medio que baña las células. Típicamente, los rastreos se llevan a cabo a concentraciones de 100 uM o inferiores, preferentemente 10 uM o inferior y preferentemente 1 uM o inferior para rastreos confirmatorios. Tal como se describe más completamente en la presente memoria, las células se pueden someter a múltiples ciclos de rastreo y selección utilizando el mismo producto químico en cada ciclo para asegurar la identificación de clones con la respuesta deseada a un producto químico, o con diferentes productos químicos para caracterizar cuál de los productos químicos produce una respuesta (ya sea un aumento o una reducción de la actividad de \beta-lactamasa) en las células. Dichos procedimientos se pueden aplicar a cualquier producto químico que modifique la función de cualquiera de las proteínas mencionadas en la presente memoria o conocidas en la técnica.
Pueden utilizarse asimismo, sin embargo productos químicos y procesos biológicos sin una diana definida y rastrearse con las células de la invención. Por ejemplo, una vez se ha identificado que un clon contiene un polinucleótido genómico activo que es activado por una señal celular particular (incluyendo señales extracelulares), por ejemplo por un neurotransmisor, ese mismo clon se puede rastrear con productos químicos que carecen de una diana definida para determinar si la activación por el neurotransmisores bloqueada o aumentada por el producto químico. Esto constituye un procedimiento particularmente útil para descubrir dianas terapéuticas corriente debajo de la activación del receptor (en este caso un neurotransmisor). Dichos procedimientos se pueden aplicar a cualquier producto químico que modifique la función de cualquiera de las proteínas mencionadas en la presente memoria o conocidas en la técnica. Este tipo de ensayo "sin diana" es particularmente útil como herramienta de rastreo para las condiciones mediales y las vías descritas en la presente memoria.
Los procedimientos y composiciones descritos en la presente memoria ofrecen cierto número de ventajas sobre la técnica anterior. Por ejemplo, el rastreo de bibliotecas de integración de genes basados en mamíferos está limitado por la utilización de sistemas informadores ya existentes. Muchos genes informadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina secretada, y luciferasa, no se pueden utilizar para ensayar células vivas individuales (incluyendo FACS) debido a que el ensayo requiere una lisis de células para determinar la actividad de genes informadores. Alternativamente, la \beta-galactosidasa puede detectarla expresión en células individuales, pero la carga de sustrato requiere la permeabilización de células, lo cual puede causar efectos perjudiciales sobre las funciones celulares normales. Adicionalmente, las propiedades de sustratos de \beta-galactosidasa fluorescentes, tales como fluorescein-di-\beta-D-galactopiranósido, y los productos hacen muy difícil rastrear grandes bibliotecas para células expresantes y no expresantes debido al sustrato y el producto no es bien retenido o no permite un análisis "ratiométrico" para determinar la cantidad de sustrato no escindido. Se podría utilizar proteína fluorescente verde (GFP), un informador no enzimático, para detectar la expresión en células vivas individuales, pero presenta una sensibilidad limitada. El nivel de expresión de GFP habría de ser por lo menos de 100.000 moléculas por cada célula para que fuese detectable en un formato de rastreo y no se podrían medir pequeños cambios o bajos niveles de la expresión de genes. Además, la GFP es relativamente estable y no sería adecuada para medir una infrarregulación de genes. Otras ventajas de la invención se describen en la presente memoria o serán reconocidas fácilmente por un experto en la materia al efectuar una revisión de la presente descripción.
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Procedimientos para identificar rápidamente moduladores de polinucleótidos genómicos
La invención proporciona un procedimiento para la identificación de proteínas o productos químicos que modulan directamente o indirectamente un polinucleótido genómico. Generalmente, el procedimiento comprende insertar una construcción de expresión de \beta-lactamasa en un genoma eucariótico no de levadura, contenido en por lo menos una célula viva, poner en contacto la célula con una concentración determinada de un modulador, y detectar la actividad de \beta-lactamasa en la célula. Preferentemente, se mide la escisión de un sustrato de \beta-lactamasa penetrante de membranas y el sustrato de \beta-lactamasa penetrante de membranas se transforma en la célula en un sustrato atrapado. Preferentemente, la construcción de expresión de \beta-lactamasa comprende un polinucleótido de \beta-lactamasa, un donador de empalme, un aceptor de empalme y un elemento de IRES. El procedimiento puede incluir asimismo determinar la secuencia de ácido nucleico codificantes de un polinucleótido unido de manera operable a la construcción de expresión de \beta-lactamasa utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como RACE.
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Identificación de moduladores
Los moduladores descritos en la presente memoria se pueden utilizar en este sistema para ensayar un aumento o una reducción de la actividad de \beta-lactamasa en clones suficientemente integrados. Dichas células pueden incluir opcionalmente proteínas específicas de interés tal como se expone en la presente memoria. Por ejemplo, la célula puede incluir una proteína o un receptor que es conocido que se une al modulador. (por ejemplo, un receptor nuclear o un receptor que presenta un dominio de transmembrana expresado de manera heteróloga u homóloga por la célula). Se puede añadir un segundo modulador ya sea simultáneamente o secuencialmente a la célula o células y la actividad de \beta-lactamasa se puede medir antes, durante o después de dichas adiciones. Las células se pueden separar sobre la base de su respuesta al modulador (por ejemplo, sensible o no sensible) y se pueden caracterizar con cierto número de diferentes moduladores para crear un perfil de activación o inhibición de las células.
La actividad de \beta-lactamasa se medirá con frecuencia en relación con una muestra de referencia, con frecuencia un testigo. Por ejemplo, la actividad de \beta-lactamasa se mide en presencia del modulador y se compara con la actividad de \beta-lactamasa en ausencia del modulador u opcionalmente un segundo modulador. Alternativamente, la actividad de \beta-lactamasa se mide en una célula que expresa una proteína de interés y en una célula que no expresa la proteína de interés (usualmente el mismo tipo de célula). Por ejemplo, puede ser conocido que un modulador se une a un receptor expresado por una célula y la actividad de \beta-lactamasa en la célula se aumenta en presencia del modulador en comparación con la actividad de \beta-lactamasa detectada en una correspondiente célula en presencia del modulador, en que la correspondiente célula no expresa el receptor.
Identificación y moduladores de vías
Cuando un gen informador se integra en el genoma de una célula huésped, de tal modo que el gen informador se expresa en una diversidad de circunstancias, estos clones se pueden utilizar para el descubrimiento de fármacos y de la genonomía funcional. Estos clones informan la modulación del gen informador en respuesta a una diversidad de estímulos, tales como hormonas y otras señales fisiológicas. Dichos estímulos pueden estar implicados en una diversidad de vías conocidas o desconocidas que son moduladas por moduladores o dianas conocidos o desconocidos. Por tanto, estos clones se pueden utilizar como herramienta para descubrir productos químicos que modulan una vía particular o para determinar una vía celular.
Dichas vías son muy variadas, y quedan comprendidas en clases generales, que presentan especies específicas, que pueden ser moduladas por moduladores conocidos o desconocidos o agonistas o antagonistas de los mismos. A título de ejemplo, la Tabla 1 ilustra diversas vías, especies de estas clases, y moduladores conocidos de estas especies. La invención se puede utilizar para identificar regiones del genoma que son moduladas por dichas vías, o un suceso fisiológico.
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TABLA 1
1
En una forma de realización, está previsto un sistema de ensayo genómico para identificar dianas transcripcionales corriente abajo para vías de señalización. Este procedimiento requiere que la diana de interés active la expresión génica al efectuar la adición de un producto químico o la expresión de la proteína diana. Se prefiere una línea celular que sea muy similar al tipo de tejido en el que la diana funciona, para generar una biblioteca de clones con diferentes sitios de integración con polinucleótidos de \beta-lactamasa u otros genes informadores. Puede conocerse que esta línea celular produce una respuesta celular, tal como una diferenciación al efectuar la adición de un modulador particular. Si este tipo de línea celular está disponible, es preferible para un rastreo, ya que representa el contexto nativo de la diana. Si no está disponible una línea celular que exprese homólogamente la diana, se puede generar una línea celular que exprese de manera heteróloga la diana en la línea celular más relevante. Por ejemplo, si la diana se expresa normalmente en las célula linfoides, entonces se utilizaría una línea celular linfoide para generar la biblioteca.
La biblioteca de clones, que se describe adicionalmente en la presente memoria, se puede separar en dos agrupaciones mediante FACS utilizando el sistema FRET que se describe en la presente memoria: una agrupación de expresión (por ejemplo células azules) y una agrupación de no expresión (por ejemplo células verdes). Estas dos agrupaciones se pueden tratar a continuación con un modulador seguido de FACS para aislar clones inducidos (por ejemplo, de verdes a azules) o clones reprimidos (por ejemplo, de azules a verdes). Se pueden realizar ciclos adicionales de estimulación seguidos de FACS para comprobar los resultados iniciales. La especificidad de la activación se puede ensayar añadiendo productos químicos adicionales que no activarían la diana definida. Esto haría posible la identificación de clones que presentan polinucleótidos de \beta-lactamasa integrados en genes activados mediante una diversidad de señales celulares.
Una vez se ha aislado una agrupación de células con las características deseadas, éstas se pueden expandir y sus correspondientes genes se clonan y se caracterizan. Las dianas que se podrían utilizaren este sistema de ensayo incluyen receptores, quinasas, interacciones de proteína/proteína o factores de transcripción y otras proteínas de interés expuestas en la presente memoria.
En otra forma de realización, está previsto un procedimiento para identificar genes expresados de forma experimental o específicos del tejido. Se pueden insertar nucleótidos de \beta-lactamasa, usualmente de manera aleatoria, en cualquier célula precursora tal como una célula madre embriónica o hematopoyética para crear una biblioteca de clones. Los clones de expresión constitutiva se pueden recoger seleccionando células azules y se pueden recoger células que no expresan seleccionando células verdes utilizando el sistema FRET descrito en la presente memoria. A continuación la biblioteca de clones se puede estimular o hacer que se diferencie, y se aíslan clones inducidos o reprimidos. Los marcadores de superficies celulares conjuntamente con anticuerpos identificados fluorescentes u otras moléculas detectoras se podrían utilizar para controlar la expresión de genes de referencia simultáneamente.
Adicionalmente, mediante estimulación y selección de células madre en diversas etapas de desarrollo, es posible identificar rápidamente genes responsables de la maduración y diferenciación de tejidos particulares. Adicionalmente, clones que presentan un polinucleótido de \beta-lactamasa integrado, ya sea aleatoriamente o mediante una recombinación homóloga, en genes expresados de forma experimental, se pueden utilizar con FACS para aislar poblaciones de células específicas para un estudio adicional, tal como un rastreo. Dichos procedimientos se pueden utilizar para la identificación de poblaciones de células que presentan propiedades celulares particulares, así como para proporcionar un informador intracelular que permita el aislamiento y el rastreo de dicha población de células.
La presente solicitud puede proporcionar líneas celulares de rastreo para una diversidad de dianas cuyos elementos de señalización corriente abajo ya son conocidos o postulados. Dichas líneas celulares de rastreo se pueden utilizar ya sea para rastrear moduladores de dianas transfectadas o como lecturas para una clonación de expresión o para análisis funcionales de dianas no caracterizadas. Se pueden preparar líneas celulares de rastreo para cualquier vía o cualquier modulador, tales como los que se describen en la Tabla 1.
En el caso de canales de iones, se generan líneas celulares en las que se utiliza la expresión de \beta-lactamasa para detectar un cambio de voltaje. Esto es posible debido a que la señalización intracelular es sensible al potencial de membrana y modulará la expresión de un subconjunto de genes. En un ejemplo, una biblioteca de células neuronales preparada siguiendo los procedimientos generales expuestos en los Ejemplos 1 a 13, tales como células de neuroblastoma de raíz dorsal, se rastrean para determinar la respuesta a una despolarización incubando células en un medio con alta concentración de potasio (alto K^{+}). Dependiendo de las características particulares de la biblioteca de células y del procedimiento utilizado, se identifican clones con una respuesta transcripcional a un tratamiento de despolarización seleccionando células que cambian de verde a azul o de azul a verde después de la despolarización. Estos clones se designan como clones sensibles al voltaje y se pueden utilizar como líneas celulares de rastreo para identificar productos químicos que modulan canales de iones (ya sea expresadas o transfectadas de manera endógena) que causan un cambio del voltaje al efectuar ya sea la activación o la inhibición (por ejemplo canales de K^{+} o de Na^{+}). Dichas células son asimismo útiles para una clonación de expresión de canales de iones. Por ejemplo, un clon sensible al voltaje se podría transfectar con una biblioteca de ADNc. Las células transfectadas con canales funcionales que cambian el potencial de membrana son detectadas por medio de beta-lactamasa y los productos génicos de ADNc se analizan para determinar su actividad como canales de iones.
Además, un gen que codifica un canal de iones conocido se puede aplicar por transfección a una línea celular sensible al voltaje y a continuación se utiliza como rastreo para determinar moduladores de canales. Por ejemplo, la expresión o activación farmacológica de un canal de Na^{+} puede causar una despolarización que puede ser informada por la línea celular. Esta línea celular se puede utilizar para rastrear agonistas o antagonistas, dependiendo del protocolo experimental de los moduladores de canales de iones. En una variación de este enfoque, una biblioteca genómica procedente de una línea celular que carece de canales de K^{+}, tal como células L929, se puede transfectar directamente con un gen de canal de K^{+}. La expresión del canal de K^{+} causa un cambio de voltaje, tal como una hiperpolarización, ocasionando un cambio de expresión de ciertos genes sensibles al voltaje. Los clones que expresan estos genes se pueden utilizar para rastrear reguladores del canal de iones.
Identificación de vías de señalización de proteínas huérfanas y moduladores de proteínas huérfanas
En otra forma de realización, está previsto un procedimiento para la identificación demoduladores de proteínas huérfanas o de polinucleótidos genómicos que son modulados directamente o indirectamente por una proteína huérfana. Los genes de enfermedades humanas se identifican con frecuencia y se encuentra que muestran poca o ninguna homología de secuencias con genes funcionalmente caracterizados. Dichos genes presentan con frecuencia una función desconocida y por tanto codifican una "proteína huérfana". Usualmente, dichas proteínas huérfanas comparten una proporción inferior al 25% de homología de secuencias de aminoácidos con otras proteínas conocidas o no se consideran como parte de una familia de genes. Con dicha moléculas, no existe normalmente ningún punto de partida terapéutico. Mediante la utilización de bibliotecas de los clones descritos en la presente memoria, se puede extraer una información funcional acerca de estos nuevos genes.
Las proteínas huérfanas se pueden expresar, preferentemente sobreexpresar, en células de mamíferos vivas. Al inducir una sobreexpresión del gen huérfano y controlando el efecto sobre clones específicos, se pueden identificar genes que son regulados transcripcionalmente por la proteína huérfana. Mediante la identificación de genes cuya expresión es influenciada por el nuevo gen de enfermedad u otra proteína huérfana, se pueden predecir las bases fisiológicas de la enfermedad o función de la molécula huérfana. La visión obtenida utilizando este procedimiento puede conducir a la identificación de una diana terapéutica para una intervención de la enfermedad.
Identificación de moduladores utilizando polinucleótidos genómicos activados por señales celulares
En otra forma de realización, está previsto un procedimiento para el rastreo de una diana o modulador definido utilizando polinucleótidos genómicos identificados con los procedimientos descritos en la presente memoria. El procedimiento de identificación de genes descrito en la presente memoria se puede utilizar asimismo conjuntamente con un sistema de rastreo para determinar cualquier diana que funcione (ya sea naturalmente o artificialmente) a través de una regulación transcripcional.
En muchos casos, son conocidos un receptor y su ligando, pero no los procesos biológicos corriente abajo requeridos para la señalización. Por ejemplo, un receptor de citoquina y citoquina pueden ser conocidos, pero el mecanismo de señalización corriente abajo no lo es. Una biblioteca de clones generados a partir de una línea celular que expresa el receptor de citoquina se puede rastrear para identificar clones que muestran cambios en la expresión génica cuando son estimulados por la citoquina. Los genes inducidos se podrían caracterizar para describir la vía de señalización. Utilizando los procedimientos de la invención, no se requiere la caracterización de genes para el desarrollo del rastreo, ya que la identificación de un clon celular que específicamente responde a la citoquina constituye un rastreo secundario que se puede utilizar. Por consiguiente, los clones que muestran una activación o desactivación al efectuar la adición de la citoquina se pueden expandir y utilizar para rastrear agonistas o antagonista del receptor de citoquina. La ventaja de este tipo de rastreo consiste en que no requiere una comprensión inicial de la vía de señalización y por tanto es capaz especialmente de identificar guías para nuevas vías.
En otra forma de realización, está previsto un procedimiento para caracterizar funcionalmente una diana utilizando un panel de clones que presentan polinucleótidos genómicos activos como se han identificados en la presente memoria. Como se generan grandes números de líneas celulares específicamente sensibles que contienen polinucleótidos genómicos activos identificados con un proceso biológico o modulador particular, se pueden utilizar paneles que contienen clones específicos para un análisis funcional de otros moduladores celulares potenciales. Dichos paneles de líneas celulares sensibles se pueden utilizar para perfilar rápidamente reguladores transcripcionales potenciales. Dichos paneles, además de contener clones con polinucleótidos genómicos activos identificados, que fueron generados por los paneles de la invención, pueden incluir clones generados por procedimientos más tradicionales. Se pueden generar clones que contienen tanto el polinucleótido genómico activo identificado con un polinucleótido de \beta-lactamasa, como elementos de respuesta específicos, tales como SRE, CRE, NFAT, TRE, IRE o informadores bajo el control de promotores específicos. Dichos paneles permitirían por tanto el análisis rápido de efectores potenciales y sus mecanismos de activación celular. Se puede utilizar asimismo un segundo gen informador (por ejemplo, gen \beta-galactosidasa) con este procedimiento, así como el otro procedimiento descritos en la presente memoria.
En otra forma de realización, está previsto un procedimiento de perfilado de productos químicos de ensayo utilizando un clon o un panel de clones que presentan polinucleótidos activos identificados. La caracterización de productos químicos de ensayo es similar a la caracterización de dianas, excepto en que la(s) diana(s) celular(es) no han de ser conocidas. Este procedimiento permite por consiguiente el análisis de los efectos de productos químicos de ensayo (por ejemplo fármacos punteros) sobre la función celular definiendo los genes afectados por el fármaco o precursor de fármaco.
Dicho procedimiento puede encontrar una aplicación en el área de descubrimiento de fármacos y de efectos secundarios (por ejemplo un efecto citotóxico) de fármacos. El fármaco potencial se añadiría a una biblioteca de clones genómicos y se aislarían o se identificarían los clones que fueron inducidos o reprimidos. Este procedimiento es análogo a la caracterización de dianas, excepto en que la diana de fármaco secundaria es desconocida. Además de proporcionar un rastreo para determinar los efectos secundarios, el ensayo proporciona información sobre el mecanismo de la toxicidad.
Procedimientos relacionados con FACS e identificación de polinucleótidos genómicos activos
Está previsto un procedimiento para la identificación de polinucleótidos genómicos activos utilizando clones que presentan polinucleótidos de \beta-lactamasa integrados, y FACS. Se pueden utilizar bibliotecas de integración de \beta-lactamasa en un formato de rastreo de alta capacidad, tal como FACS, para detectar la regulación transcripicional. La compatibilidad de los ensayos de \beta-lactamasa con FACS hace posible un procedimiento sistemático para definir patrones de regulación transcripcional mediada por una gama de factores. Este enfoque no ha sido factible o práctico utilizando sistemas informadores ya existentes. Este nuevo procedimiento permitirá la rápida identificación de genes que responden a una diversidad de señales, incluyendo la expresión específica de tejidos y durante la formación del patrón.
Por ejemplo, después de la integración de un polinucleótido de \beta-lactamasa, se pueden separar células expresantes y no expresantes mediante FACS. Estas dos poblaciones de células se pueden tratar con moduladores potenciales y se pueden controlar cambios de expresión génica utilizando una lectura fluorescente ratiométrica. Se aislarán agrupaciones de clones que muestran ya sea una sobrerregulación o una infrarregulación de expresión génica de informadores. Se pueden identificar a continuación genes diana procedentes de clones sensibles. Además, al poder separar células expresantes y no expresantes en diferentes momentos puntuales después de la adición del modulador, se pueden identificar genes que son regulados diferencialmente en función del tiempo. Este enfoque hace posible por tanto la elucidación de cascadas de transcripción mediadas por señalización celular. Específicamente, esto proporcionará un medio para identificar genes corriente abajo que son regulados transcripcionalmente por una diversidad de moléculas que incluyen receptores nucleares, receptores de citoquina o factores de transcripción.
Las aplicaciones de esta tecnología son casi ilimitadas en las áreas de descubrimiento de genes y de análisis funcional. Se podrían generar y utilizar bibliotecas de líneas celulares procedentes de diversos tipos de tejidos para identificar genes con patrones de expresión o mecanismos de regulación específicos. Dichas bibliotecas de clones representarían millones de sitios de integración que saturarían el genoma y pueden hacer posible la identificación de cualquier gen expresado basado en su regulación transcripcional. Los rasgos característicos del sistema informador de \beta-lactamasa, en parte, permite su utilización para este ensayo de integración genómica en un formato de alta capacidad.
Existe una diversidad de otros enfoques que se pueden utilizar con la invención, incluyendo enfoques similares a los propuestos para \beta-lactamasa. Los ejemplos incluirían epítopos de anticuerpos presentados sobre la superficie celular con anticuerpos fluorescentes para detectar genes positivos. Se podrían utilizar asimismo matrices de geles que retienen informadores secretados y que hacen posible la detección de células positivas. Estos enfoques, sin embargo, estarían limitados en cuanto a sensibilidad y no se serían ratiométricos en su detección. Estos permitirían, por tanto, únicamente la selección de células positivas sobre la base de la intensidad fluorescente.
Una vez se han identificado los polinucleótidos genómicos activos, se pueden secuenciar los mismos utilizando diversos procedimientos, incluyendo RACE (rápida amplificación de extremos de ADNc). RACE es un procedimiento para la identificación de secuencias de ARNm desconocidas que flanquean secuencias de ARNm conocidas. Se pueden identificar los dos extremos 5' y 3' dependiendo de las condiciones de RACE. Se realiza 5' RACE preparando en primer lugar ARN procedente de una línea celular o tejido de interés. Este ARN total o poli A se utiliza a continuación como un molde para reacciones de transcripción inversa que o se pueden cebar aleatoriamente o se pueden cebar con un cebador específico de genes. Se une a continuación un enlazador de polinucleótidos al extremo 3' del ADNc recién transcrito mediante transferasa terminal o ARN ligasa. Este ADNc se utiliza a continuación como el molde para PCR utilizando un cebador en el interior del gen informador y el otro cebador que corresponde a la secuencia que ha sido unida al extremo 3' del ADNc de la primera cadena. La presente solicitud es particularmente bien adecuada para dichas técnicas y no requiere la construcción de clones o construcciones adicionales una vez que se ha identificado el polinucleótido genómico.
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Sustratos para la medición de actividad de \beta-lactamasa
Cualquier sustrato de \beta-lactamasa penetrante de membranas susceptible de ser medido en el interior de la célula después de la escisión se puede utilizar en los procedimientos y las composiciones de la invención. Los sustratos de \beta-lactamasa penetrantes de membranas no requerirán permeabilizar células eucarióticas ya sea por choque hipotónico o por electroporación. Generalmente, dichos procedimientos formadores de poros no específicos no son deseables para utilizarlos en células eucarióticas debido a que dichos procedimientos dañan las células, con lo cual se disminuye la viabilidad y se introducen variables adicionales en el ensayo de rastreo (tal como una pérdida de los contenidos iónicos y biológicos de las células sometidas a choque o a poración). Dichos procedimientos se pueden utilizar en células con paredes celulares o membranas que impiden en gran medida o retardan la difusión de dichos sustratos. Preferentemente, los sustratos de \beta-lactamasa penetrantes de membranas se transforman en la célula en un sustrato de \beta-lactamasa con una penetrabilidad de membranas reducida (usualmente por lo menos cinco veces menos penetrantes) o sea, no penetrantes de membranas. Pueden tener lugar transformaciones en el interior de la célula por medio de enzimas intracelulares (por ejemplo, esterasas) o metabolitos intracelulares o moléculas orgánicas (por ejemplo grupos sulfhidrilo). Preferentemente, dichos sustratos son fluorescentes. Los sustratos fluorescentes incluyen los que son susceptibles de cambios, ya sea individualmente o en combinación, de la fluorescencia total, excitación o espectros de emisión o FRET.
Preferentemente, se emplean sustratos de tipo FRET con los procedimientos y composiciones de la invención. Incluyendo sustratos fluorogénicos de fórmula general I: D-S-A, en la que D es un donador de FRET y A es un aceptor de FRET y S es un sustrato para una proteína con actividad de \beta-lactamasa. La actividad de \beta-lactamasa escinde los enlaces, ya sea D-S o S-A con lo cual se libera D o A, respectivamente a partir de S. Dicha escisión que resulta de la actividad de \beta-lactamasa aumenta sorprendentemente la distancia entre D y A lo cual ocasiona normalmente una completa pérdida de la transferencia de energía entre D y A. Generalmente, las moléculas de estructura D-S-A se construyen para maximizar la transferencia de energía entre D y A. Preferentemente, la distancia entre D y A es generalmente igual o menor que el R_{0}.
Como se apreciaría fácilmente por los expertos en la materia, la eficacia de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia depende del rendimiento cuántico de fluorescencia del fluoróforo donador, la distancia de donador-aceptor y la integral de superposición de la emisión de fluorescencia del donador y la absorción del aceptor. La transferencia de energía es muy eficaz cuando un fluoróforo donador con alto rendimiento cuántico de fluorescencia (preferentemente, uno que se aproxima al 100%) está emparejado con un aceptor con gran coeficiente de extinción en longitudes de onda que coinciden con la emisión del donador. La dependencia de la transferencia de energía de fluorescencia, de los parámetros anteriormente mencionados ha sido expuesta por Forster, T. (1948) Ann. Physik 2: 55-75; Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Nueva York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, en: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, volumen 30, compilado por Taylor, D. L. y Wang, Y. L., San Diego: Academic Press (1989), páginas 219-243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Part: Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. (1978), páginas 296-361, y están disponibles tablas de integrales de superposición espectral para las personas que trabajan en este campo, por ejemplo, Berlman, I. B. Energy transfer parameters of aromatic compounds, Academic Press, Nueva York y Londres (1973). La distancia entre el fluoróforo donador y el colorante aceptor a la cual tiene lugar la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) con el 50% de eficacia se denomina R_{0} y se puede calcular a partir de las integrales de superposición espectrales. Para el par donador-aceptor, fluoresceína-tetrametil-rodamina, que se utiliza frecuentemente para la medición de distancias en proteínas, esta distancia R_{0} es de aproximadamente 50 a 70 A, dos Remedios, C. G. et al. (1987), J. Muscle Research and Cell Motility 8:97-117. La distancia a la cual la transferencia de energía en este par excede del 90% es de aproximadamente 45 A. Cuando se une a la cadena principal de cefalosporina, las distancias entre donadores y aceptores se encuentran en el intervalo de 10 A a 20 A, dependiendo de los enlazadores utilizados y del tamaño de los cromóforos. Para una distancia de 20 A, un par de cromóforos habrá de presentar un R_{0} calculado mayor que 30 A para el 90% de los donadores para transferir su energía al aceptor, lo cual da como resultado una extinción mejor que el 90% de la fluorescencia del donador. La escisión de dicha cefalosporina mediante \beta-lactamasa atenúa la extinción y produce un aumento de la eficacia de fluorescencia del donador que excede de diez veces. De acuerdo con ello, resulta evidente que la identificación de pares donador-aceptor apropiados para su utilización tal como se enseña en esta memoria según la presente invención, sería esencialmente rutinaria para un experto en la materia.
Se prefieren sustratos de genes informadores descritos por Tsien et al., en la Publicación PCT nº W096/30540 publicada el 3 de octubre de 1996 para \beta-lactamasa.
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Mediciones de fluorescencia
Cuando se utilizan sustratos fluorescentes, se reconocerá que se pueden utilizar diferentes tipos de sistemas de control fluorescentes para practicar la invención. Preferentemente, se utilizan sistemas FACS o sistemas destinados a un rastreo de alta capacidad, por ejemplo, placas de microtitulación de 96 pocillos o mayores. Los procedimientos para realizar ensayos en materiales fluorescentes son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, por Lakowicz, J. R., en Principles of Fluorescence Spectroscopy, Nueva York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, en: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, volumen 30, compilado por Taylor, D. L. y Wang, Y. L., San Diego: Academic Press (1989), páginas 219-243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col. Inc. (1978), páginas 296-361.
La fluorescencia en una muestra se puede medir utilizando un fluorímetro. En general, la radiación de excitación, procedente de una fuente de excitación que presenta una primera longitud de onda, se hace pasar a través de un sistema óptico de excitación. El sistema óptico de excitación produce la radiación de excitación para excitar la muestra. En respuesta a ello, las proteínas fluorescentes en la muestra emiten una radiación que presenta una longitud de onda que es diferente de la longitud de onda de excitación. Un sistema óptico de recogida recoge entonces la emisión procedente de la muestra. El dispositivo puede incluir un controlador de temperatura para mantener la muestra a una temperatura específica mientras que se está explorando por barrido. Según una forma de realización, una platina de translación multiaxial transporta una placa de microtitulación que mantiene una pluralidad de muestras con el fin de poner en posición diferentes pocillos para que queden expuestos. La platina de translación multiaxial, el controlador de temperatura, el dispositivo de auto-enfoque y el sistema electrónico asociados con la formación de imágenes y la recogida de datos se pueden gestionar mediante un ordenador digital apropiadamente programado. El ordenador puede transformar asimismo los datos recogidos durante el ensayo en otro formato para su presentación.
Preferentemente, se utiliza FRET como un modo de controlar la actividad de \beta-lactamasa en el interior de la célula. El grado de FRET se puede determinar mediante cualquier duración de vida espectral o de fluorescencia característica de la construcción excitada, por ejemplo, determinando la intensidad de la señal fluorescente procedente del donador, la intensidad de la señal fluorescente procedente del aceptor, la relación de las amplitudes de fluorescencia próximas a las máximas de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia próximas al máximo de la emisión del donador, o la duración de vida del estado excitado del donador. Por ejemplo, la escisión del enlazador aumenta la intensidad de fluorescencia procedente del donador, reduce la intensidad de fluorescencia procedente del aceptor, reduce la relación de amplitudes de fluorescencia procedente del aceptor a la procedente del donador, y aumenta la duración de vida del estado excitado del donador.
Preferentemente, se determinan los cambios del grado de FRET en función del cambio de la relación de la cantidad de fluorescencia procedente de los restos de donador y aceptor, un procedimiento denominado "ratioing". Los cambios de la cantidad absoluta de sustrato, la intensidad de excitación y la turbidez o de otras absorbancias de fondo en la muestra a la longitud de excitación afectan a las intensidades de fluorescencia procedentes tanto del donador como del aceptor aproximadamente en paralelo. Por tanto, la relación de las dos intensidades de emisión constituye una medida más sólida y preferida de la escisión que cualquier intensidad sola.
La duración de vida del estado de excitación del resto donador es, de manera similar, independiente de la cantidad absoluta de sustrato, la intensidad de excitación o la turbidez de otras absorbancias de fondo. Su medición requiere un equipo con una resolución de tiempos en nanosegundos, excepto en el caso especial de complejos de lantánidos en el cual caso es suficiente una resolución de microsegundos a milisegundos.
El sistema informador fluorescente ratiométrico descrito en la presente memoria presenta ventajas importantes sobre los informadores ya existentes para el análisis de integración de genes, ya que permite una detección y un aislamiento sensibles de células vivas individuales expresantes y no expresantes. Este sistema de ensayo utiliza un sustrato fluorescente, no polar, no tóxico que se carga fácilmente ya continuación queda atrapado intracelularmente. La escisión del sustrato fluorescente por \beta-lactamasa proporciona un cambio de emisión fluorescente a medida que el sustrato se convierte en producto. Debido a que la lectura del informador de \beta-lactamasa es ratiométrica, es única entre los ensayos de genes informadores en el sentido de que controla variables tales como la cantidad de sustrato cargado en células individuales. La lectura intracelular estable, fácilmente detectada, elimina la necesidad de establecer líneas celulares clonales antes del análisis de expresión. Con el sistema informador de \beta-lactamasa u otros sistemas análogos se puede utilizar una selección de flujos para aislar células expresantes y no expresantes procedentes de agrupamientos de millones de células viables. Esta selección positiva y negativa permite su utilización con procedimientos de identificación de genes para aislar clones deseados procedentes de grandes agrupaciones de clones que contienen millones de células que contienen cada una un sitio de integración único.
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Sistema de rastreo de alta capacidad
La presente solicitud se puede utilizar con sistemas y procedimientos que utilizan terminales de ordenador automatizados e integrables para identificar moduladores, vías, productos químicos que presentan una actividad útil y otros procedimientos descritos en la presente memoria. Dichos sistemas se describen en general en la técnica (véase las patentes US nº 4.000.976 a nombre de Kramer et al. (concedida el 4 de enero de 1977), nº 5.104.621 a nombre de Pfost et al. (concedida el 14 de abril de 1992), nº 5.125.748 a nombre de Bjornson et al. (concedida el 30 de junio de 1992), nº 5.139.744 a nombre de Kowalski (concedida el 18 de agosto de 1992) nº 5.206.568 a nombre de Bjomson et al. (concedida el 27 de abril de 1993) nº 5.350.564 a nombre de Mazza et al. (27 de septiembre de 1994), nº 5.589.351 a nombre de Harootunian (concedida el 31 de diciembre de 1996), y las solicitudes PCT nº WO 93/20612 a nombre de a Baxter Deutschland GmbH (publicada el 14 de octubre de 1993), nº WO 96/05488 a nombre de McNeil et al. (publicada el 22 de febrero de 1996) y nº WO 93/13423 a nombre de Agong et al. (publicada el 8 de julio de 1993).
Típicamente, dicho sistema incluye: A) un módulo de almacenamiento y recuperación que comprende localizaciones de almacenamiento para almacenar una pluralidad de productos químicos en solución en pocillos direccionables, un recuperador de pocillos y que presenta una selección y recuperación programables de los pocillos direccionables y que presenta una capacidad de almacenamiento de por lo menos 10.000 pocillos direccionables, B) un módulo de distribución de muestras que comprende un manipulador de líquidos para aspirar o administrar soluciones desde los pocillos seleccionados direccionables, presentando el módulo de distribución de productos químicos una selección y aspiración programables de los pocillos direccionables seleccionados y una administración programable a los pocillos direccionables (incluyendo una administración en series de pocillos direccionables con diferentes densidades de pocillos direccionables por centímetro cuadrado), C) un transportador de muestras para transportar los pocillos direccionables seleccionados al módulo de distribución de muestras y que presenta opcionalmente un control programable de transporte de los pocillos direccionables seleccionados (incluyendo una ruta adaptativa y un tratamiento paralelo), D) un módulo de reacción que comprende ya sea un administrador de reactivos para administrar reactivos a los pocillos direccionables seleccionados o un detector de fluorescencia para detectar reacciones químicas en los pocillos direccionables seleccionados y un módulo de proceso de datos e integración. Los pocillos direccionables deberán estar constituidos por materiales biocompatibles que son asimismo compatibles con el ensayo que se ha de realizar (véase la solicitud de patente US, "Systems and methods for rapidy identifying useful chemicals in liquid samples" (Stylli et al., solicitada el 16 de mayo de 1997).
El módulo de almacenamiento y recuperación, el módulo de distribución de muestras y el módulo de reacción están integrados y controlados de forma programable por el módulo de tratamiento e integración. El módulo de almacenamiento y recuperación, el módulo de distribución de muestras, el transportador de muestras, el módulo de reacción y el módulo de tratamiento de datos e integración están unidos de manera operable para facilitar un tratamiento rápido de los pocillos de muestras direccionables. Típicamente, los dispositivos de la invención pueden tratar aproximadamente de 10.000 a 100.000 pocillos direccionables que pueden representar aproximadamente de 5.000 a 100.000 productos químicos en un periodo de tiempo de 24 horas. Los clones de células generados utilizando la presente invención se pueden depositar individualmente en pocillos de una plataforma de múltiples pocillos que presenta cualquier número de pocillos, tales como 96, 864, 3456 o más. Las células en los pocillos se pueden cultivar, almacenar, rastreare inventariar utilizando dicho sistema.
La presente solicitud se refiere asimismo a entidades químicas e información (por ejemplo, moduladores o productos químicos o bases de datos de actividades biológicas de productos químico o dianas) generadas o descubiertas mediante la operación de la presente solicitud, particularmente productos químicos e información generados utilizando dichos sistemas.
Farmacología y toxicidad de los moduladores candidatos
La estructura de un modulador candidato que puede ser identificado mediante la invención se puede determinar o confirmar mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como una espectrografía de masas. Para los moduladores supuestos almacenados durante periodos de tiempo prolongados, se puede confirmar la estructura, la actividad y la potencia del modulador supuesto.
Dependiendo del sistema utilizado para identificar un modulador candidato, el modulador candidato presentará una actividad farmacológica supuesta. Por ejemplo, si se ha encontrado que el modulador candidato inhibe la proliferación (activación) de células T in vitro, entonces el modulador candidato presentará propiedades farmacológicas probables como inmunosupresor o antiinflamatorio (véase, Suthanthiran et al., Am. J. Kidney Disease, 28: 159-172 (1996)). Dichos nexos son conocidos en la técnica para varios estados de enfermedad, y se espera que se descubran más con el transcurso del tiempo. Sobre la base de dichos nexos, se pueden seleccionar modelos confirmatorios apropiados in vitro e in vivo de la actividad farmacológica, así como la toxicología. Los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden utilizar asimismo para determinar la selectividad y especificidad farmacológica, y la toxicidad.
Una vez identificados, los moduladores candidato se pueden evaluar para determinar los efectos toxicológicos utilizando procedimientos conocidos (véase Lu, Basic Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment, Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985); la patente US nº 5.196.313 a nombre de Culbreth (concedida el 23 de marzo de 1993) y la patente US nº 5.567.952 a nombre de Benet (concedida el 22 de octubre de 1996). Por ejemplo, se puede establecer la toxicología de un modulador candidato determinando la toxicidad in vitro para una línea celular, tal como una línea celular, por ejemplo, de un ser humano. Los moduladores candidato se pueden tratar, por ejemplo, con extractos de tejidos, tales como preparaciones de hígado, tales como preparaciones microsómicas, para determinar el aumento o la reducción de propiedades toxicológicas del producto químico después de ser metabolizado por un organismo completo. Los resultados de estos tipos de estudios son predictivos con frecuencia de propiedades toxicológicas de productos químicos en animales, tales como mamíferos, incluyendo seres humanos.
Alternativamente, o además de estos estudios in vitro, las propiedades toxicológicas de un modulador candidato en un modelo animal, tal como ratones, ratas, conejos o monos, se pueden determinar utilizando procedimientos establecidos (véase Lu, supra (1985); y Creasey, Drug Disposition in Humans, The Basis of Clinical Pharmacology, Oxford University Press, Oxford (1979)). Dependiendo de la toxicidad, el órgano diana, el tejido, el lugar y el mecanismo supuesto del modulador candidato, al experto no le sería gravoso determinar la dosis apropiada, los valores de LD_{50}, las vías de administración y los regímenes que serían apropiados para determinar las propiedades toxicológicas del modulador candidato. Además de modelos animales, se pueden realizar pruebas clínicas en seres humanos siguiendo procedimientos establecidos, tales como los expuestos por la United States Food and Drug Administration (USFDA) o administraciones equivalentes de otros gobiernos. Estos estudios de toxicidad proporcionan la base para determinar la eficacia de un modulador candidato in vivo.
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Eficacia de los moduladores candidato
La eficacia de un modulador candidato se puede establecer utilizando varios procedimientos reconocidos en la técnica, tales como procedimientos in vitro, modelos animales o pruebas clínicas en seres humanos (véase Creasey, supra (1979)). Existen modelos in vitro reconocidos para varias enfermedades o afecciones. Por ejemplo, la capacidad de un producto químico para prolongar la duración de vida de células infectadas por VIH in vitro es reconocida como un modelo aceptable para identificar productos químicos que se espera que sean eficaces para tratar una infección por VIH o el SIDA (véase Daluge et al., Antimicro. Agents Chemother. 41: 1082-1093 (1995)): Además, La capacidad de la ciclosporina A (CsA) para impedir la proliferación de células T in vitro ha sido establecida como un modelo aceptable para identificar productos químicos que se espera que sean eficaces como inmunosupresores (véase Suthanthiran et al., supra, (1996)). Para casi todas las clases de terapéutica, enfermedad o afección, hay disponible un modelo in vitro o animal aceptable. Dichos modelos existen, por ejemplo, para trastornos gastrointestinales, cánceres, cardiología, neurobiología e inmunología. Además, dichos procedimientos in vitro pueden utilizar extractos de tejidos, tales como preparaciones de hígado, tales como preparaciones microsómicas, para proporcionar una indicación fiable de los efectos del metabolismo sobre el modulador candidato. De manera similar, se pueden utilizar modelos animales aceptables para establecer la eficacia de productos químicos para tratar enfermedades o afecciones. Por ejemplo, la rodilla de conejo es un modelo aceptable para ensayar productos químicos para determinar la eficacia en el tratamiento de la artritis (véase Shaw y Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br) 55:197-205 (1973)). La hidrocortisona, que está aprobada para su utilización en seres humanos para tratar la artritis, es eficaz en este modelo, lo cual confirma la validez de este modelo (véase McDonough, Phys. Ther. 62: 835-839 (1982)). Cuando se selecciona un modelo apropiado para determinar la eficacia de un modulador candidato, el experto puede ser guiado por el estado de la técnica para seleccionar un modelo apropiado, la dosis y la vía de administración, el régimen y el punto final y como tal, no le sería excesivamente gravoso.
Además de modelos animales, se pueden utilizar pruebas clínicas en seres humanos para determinarla eficacia de un modulador candidato en seres humanos. La USFDA, o agencias gubernamentales equivalentes, han establecido procedimientos para dichos estudios.
Selectividad de moduladores candidato
Los procedimientos in vitro e in vivo anteriormente descritos establecen asimismo la selectividad de un modulador candidato. Es reconocido que los productos químicos pueden modular una amplia variedad de procesos biológicos o que son selectivos. Se pueden utilizar paneles de células basados en la presente invención para determinar la especificidad del modulador candidato. La selectividad es evidente, por ejemplo, en el campo de la quimioterapia, en el que la selectividad de un producto químico que sea tóxico para las células cancerosas, pero no para las células cancerosas, es evidentemente deseable. Los moduladores selectivos son preferibles debido a que presentan menos efectos secundarios en la determinación clínica. La selectividad de un modulador candidato se puede establecer in vitro ensayando la toxicidad y el efecto de un modulador candidato sobre una pluralidad de líneas celulares que presentan una diversidad de vías y sensibilidades celulares. Los datos obtenidos a partir de estos estudios de toxicidad in vitro se pueden extender a estudios de modelos animales, incluyendo pruebas clínicas en seres humanos, para determinar la toxicidad, la eficacia y la selectividad del modulador candidato.
La selectividad, especificidad y toxicología, así como la farmacología general de un producto químico de ensayo se pueden mejorar con frecuencia generando productos químicos de ensayo adicionales basándose en las correlaciones de estructura/propiedad del producto químico de ensayo originalmente identificado que presenta actividad (un "Hit"). Los productos químicos de ensayo identificados que presentan actividad se pueden modificar para mejorar diversas propiedades, tales como la afinidad, duración de vida en la sangre, toxicología, especificidad y penetrabilidad de membranas. Dichos productos químicos de ensayo refinados se pueden someter a ensayos adicionales descritos en la presente memoria para un análisis de actividad. Los procedimientos para generar y analizar dichos productos químicos son conocidos en la técnica, tales como en la patente US nº 5.574.656 a nombre de Agrafiotis et al.
Composiciones
La presente solicitud puede incluir asimismo un modulador en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable preparado para el almacenamiento y posterior administración, que presenta una cantidad farmacéuticamente eficaz del modulador candidato en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los productos químicos identificados mediante los procedimientos descritos en la presente memoria no incluyen productos químicos públicamente disponibles en la fecha de presentación de la presente solicitud o en la técnica anterior. Los vehículos o diluyentes aceptables para utilización terapéutica son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mark Publishing Co. (A. R, Gennaro, compiladores, 1985). Se pueden proporcionar agentes de conservación, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saborizadores en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se pueden añadir benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico como agentes de conservación. Además, se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.
Las composiciones de la presente solicitud se pueden formular y utilizar en forma de tabletas, cápsulas o elixires para una administración oral; supositorios para una administración rectal; soluciones y suspensiones estériles para una administración inyectable; y otros similares. Se pueden preparar inyectables en formas convencionales ya sea en forma de soluciones o suspensiones, en formas sólidas adecuadas para una solución o suspensión en un líquido antes de la inyección, o en forma de emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, una solución salina, dextrosa, manitol, lactosa, lecitina, albúmina, glutamato de sodio, hidrocloruro de cisteína y otros similares. Además, si se desea, la composición farmacéutica inyectable puede contener cantidades secundarias de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes de humectación, agentes de tamponación de pH, y otros similares. Si se desea, se pueden utilizar preparaciones que favorecen la absorción (por ejemplo, liposomas).
La cantidad farmacéuticamente eficaz del modulador candidato requerida como una dosis dependerá de la vía de administración, del tipo de animal que se esté tratando y del las características físicas del animal específico bajo consideración. La dosis se puede adaptar para conseguir un efecto deseado, pero dependerá de tales factores como el peso, la dieta, la medicación simultánea y de otros factores que los expertos en las técnicas médicas reconocerán. En la práctica de los procedimientos de la invención, las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar solas o en combinación con otra, o en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Estos productos se pueden utilizar in vivo, normalmente en un mamífero, preferentemente un ser humano, o in vitro. Para una utilización in vivo, la composición farmacéutica se puede administrar al mamífero en una diversidad de maneras, que incluyen una administración por vía parenteral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, colónica, rectal, nasal o intraperitoneal, empleando una diversidad de formas de dosificación. Dichos procedimientos se pueden aplicar asimismo para ensayar la actividad de productos químicos in vivo.
Como resultará fácilmente evidente para un experto en la materia, la dosificación in vivo útil que se ha de administrar y el modo particular de administración variará dependiendo de la edad, el peso y la especie de mamífero tratado, de la composición farmacéutica particular empleada, y de la utilización específica para la cual se emplea la composición farmacéutica. La determinación de niveles de dosificación eficaces, es decir los nivel de dosificación para conseguir el resultado deseado, se puede efectuar por un experto en la materia utilizando los procedimientos rutinarios como los anteriormente expuestos. Típicamente, las aplicaciones químicas en seres humanos de los productos se comienzan a niveles de dosificación inferiores, aumentándose el nivel de dosificación hasta que se alcanza el efecto deseado. Alternativamente, se pueden utilizar estudios in vitro aceptables para establecer dosis y vías de administración útiles de las composiciones identificadas mediante los presentes procedimientos utilizando procedimientos farmacológicos establecidos.
En estudios en animales no humanos, las aplicaciones de las composiciones farmacéuticas potenciales se comienzan a niveles de dosificación superiores, reduciéndose la dosificación hasta que ya no se alcanza el efecto deseado o se reducen o desaparecen los efectos secundarios negativos. La dosificación para los productos de la presente invención puede variar ampliamente dependiendo de los efectos deseados y de la indicación terapéutica. Típicamente, las dosificaciones pueden estar comprendidas entre aproximadamente 10 ng/kg y 1 \mug/kg de peso corporal, preferentemente entre aproximadamente 100 \mug/kg y 10 mg/kg de peso corporal. La administración es preferentemente oral sobre una base diaria.
La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación se pueden seleccionar por el médico individual en vista de la afección del paciente. (véase por ejemplo, Fingl et al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975). Deberá observarse que el médico asistente conocería la manera y momento determinar, interrumpir o ajustar la administración debido a la toxicidad, disfunción orgánica u otros efectos negativos. A la inversa, el médico asistente conocería asimismo la manera de ajustar el tratamiento a niveles superiores si la respuesta clínica no fuese suficiente (evitando la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el tratamiento del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se ha de tratar y la vía de administración. La gravedad de la afección se puede evaluar en parte, por ejemplo, mediante procedimientos estándar de evaluación de pronósticos. Además, la dosis y quizás la frecuencia de la dosis, variará asimismo según la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual. Se puede utilizar un programa comparable al anteriormente expuesto en medicina veterinaria.
Dependiendo de las afecciones específicas que se estén tratando, dichas composiciones farmacéuticas se pueden formular y administrar por vía sistémica o local. Se pueden encontrar técnicas de formulación y administración en la publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^{a} edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Las vías adecuadas pueden incluir una administración oral, rectal, transdérmica, vaginal, transmucosa o intestinal; una administración parenteral, que incluye inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Para inyección, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en soluciones tampón fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o una solución tampón salina fisiológica. Para dicha administración intramucosa, se utilizan en la formulación agentes penetrantes apropiados a la barrera que se ha de penetrar. Dichos agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. La utilización de vehículos farmacéuticamente aceptables para formular las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria para la práctica de la invención en dosificaciones adecuadas para una administración sistémica se encuentran dentro del ámbito de la invención. Con una selección apropiada del vehículo y una práctica de preparación adecuada, las composiciones, en particular la formuladas en forma de soluciones, se pueden administrar por vía parenteral, tal como mediante una inyección intravenosa. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular fácilmente utilizando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para una administración oral. Dichos vehículos hacen posible que los productos químicos se formulen en forma de tabletas, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones densas, suspensiones y otras similares, para ingestión oral por un paciente que se ha de tratar.
Los agentes destinados a ser administrados por vía intracelular se pueden administrar utilizando técnicas bien conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, dichos agentes se pueden encapsular en liposomas, y administrar a continuación como se ha descrito anteriormente. Todas las moléculas presentes en una solución acuosa en el momento de la formación del liposoma se incorporan en el interior acuoso. El contenido liposómico queda protegido del microambiente externo y, debido a que los liposomas se funden con las membranas celulares, es administrado eficazmente en el citoplasma celular. Adicionalmente, debido a su hidrofobia, se pueden administrar directamente pequeñas moléculas orgánicas por vía intracelular.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su utilización incluyen composiciones en las que los componentes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito que se persigue. La determinación de la cantidad eficaz de una composición farmacéutica está comprendida en la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente memoria. Además de los componentes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el tratamiento de los productos químicos activos en preparaciones que se pueden utilizar en farmacia. Las preparaciones formuladas para una administración oral pueden encontrarse en forma de tabletas, grageas, cápsulas o soluciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar de una manera que es conocida por sí misma, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levitación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las formulaciones farmacéuticas para una administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los productos químicos en forma de una solución acuosa. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los productos químicos activos en forma de suspensiones de inyecciones aceitosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil-celulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los productos químicos para permitirla preparación de soluciones muy concentradas.
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Las composiciones farmacéuticas para utilización oral se pueden obtener combinando los productos químicos activos con excipientes sólidos, triturando opcionalmente la mezcla resultante y tratando la mezcla de gránulos, después de añadir los agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, materiales de carga tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones celulósicas tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metil-celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetil-celulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes de desintegración, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Se proporcionan núcleos de grageas con revestimientos adecuados. Para este propósito, se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas y solventes orgánicos adecuados o solventes mixtos. Se pueden añadir sustancias colorantes o pigmentos a las tabletas o a los revestimientos de las grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de productos químicos activos.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Construcciones de expresión sin promotor de \beta-lactamasa
Para investigar diversas construcciones de expresión de \beta-lactamasa (BLEC) se construyeron múltiples BLEC y se aplicaron por transfección a células de mamífero.
La primera de éstas, BLEC-1 se construyó clonando la forma citoplasmática de la SEC. ID nº 4 de \beta-lactamasa (véase la Tabla 2) de tal modo que se uniese funcionalmente a la secuencia del aceptor de empalme. En-2, tal como se muestra en la Figura 3. Este vector cuando se inserta en un intrón genómico dará como resultado la generación de un ARN de fusión entre un gen diana endógeno y \beta-lactamasa ("BL"). La BLEC-1 contiene asimismo una secuencia de poli-adenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH-poli A) corriente debajo de la beta-lactamasa citoplasmática.
La BLEC-2 se construyó de manera idéntica al BLEC-1, excepto en que se insertó una secuencia de sitio de entrada ribosómico interno (IRES) de polivirus entre el aceptor de empalme. En-2 y \beta-lactamasa ("BL"). Esto elimina las restricciones del marco de lectura y la posible inactivación de beta-lactamasa por fusión con una proteína endógena. Para hacer posible la selección de transfectantes estables para BLEC-1 y BLEC-2, una casete resistente a neomicina o a G418 se clonó corriente debajo de la secuencia de poli-adenilación de BGH. Esta casete consiste en un promotor, un gen resistente a neomicina y una secuencia de poli-adenilación de SV40, tal como se muestra en la Figura 3.
Se construyeron dos construcciones alternativas BLEC-3 y BLEC-4 similares a BLEC-1, y BLEC-2 respectivamente, excepto en que el SV40-poli A se sustituyó con una secuencia de donador de empalme. Esto deberá enriquecer la inserción en regiones transcritas, ya que ello requiere la presencia de un aceptor de empalme endógeno y una secuencia de poliadenilación corriente abajo del sitio de inserción del vector para generar clones resistentes a G418. Las BLEC-3 y BLEC-4 utilizan también el promotor PGK para impulsar el gen de resistencia a neomicina en lugar del promotor beta-actina humana.
La estructura de CCF2-AM (sustrato de BL) utilizada en los siguientes experimentos es:
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TABLA 2
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TABLA 3
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Ejemplo 2
Bibliotecas de clones de BLEC
Para investigar la función de cada uno de los vectores de BLEC, se aplicaron los mismos por transfección a células RBL-1 y se seleccionaron clones estables para cada uno de los cuatro plásmidos de BLEC (véase la Tabla 2). Medios selectivos contenían DMEM, suero bovino (FBS) al 10% y 400 \mug/ml de Gentamicina (G418). Se agruparon clones de células resistentes a G418 procedentes de múltiples transfecciones para generar una biblioteca de clones integrados estables en BLEC.
Esta biblioteca de clones integrados en BLEC-1 se cargó con el sustrato fluorescente de BL (CCF-2-AM) añadiendo CCF-2-AM 10 \muM en HBSS que contenía Hepes 10 \muM, 7,1 y glucosa al 1%. Después de 1 hora de incubación a una temperatura de 22ºC, se lavaron las células con HBSS y se examinaron después de la excitación con luz de 400 nm utilizando un filtro de emisión de paso largo de 435 nm. En estas condiciones de ensayo, el 10% de las células presentaron una fluorescencia azul lo cual indicaba que estaban expresando \beta-lactamasa. Este resultado sugiere que la construcción BLEC-1 está funcionando como un vector de integración génica.
Se generaron asimismo líneas celulares estables aplicando por transfección BLEC-1 a células CHO-K1 y Jurkat. Las poblaciones de clones integrados en BLEC-1 procedentes de células CHO y Jurkat mostraron resultados similares a los obtenidos con clones de RBL-1 expresando BL del 10 al 15% de los clones de células integrados es BLEC tal como se determina por su relación azul/verde después de cargarlos con CCF-2-AM. Este resultado muestra que las BLEC funcionan en una diversidad de tipos de células incluyendo células T humanas (Jurkat), leucocitos basófilos de rata (RBL) y células de ovarios de hámster chino (CHO).
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Ejemplo 3
Aislamiento de clones de BLEC que expresan \beta-lactamasa
Se utilizó una selección de células activadas fluorescentes de poblaciones multiclonales de clones integrados en genes de RBL-1 para identificar clones con expresión génica de BL regulada. Se aisló una población de células que no expresaba BL seleccionando una biblioteca de clones integrados en BLEC-1 generados por transfección de células RBL-1 tal como se describe en el Ejemplo 2. Se aislaron 180.000 clones que expresaban poco o nada de BL seleccionando clones con una baja relación azul/verde (población R1), tal como se muestra en la Figura 4A. Esta población de clones se cultivó durante siete días y se volvió a seleccionar por FACS para ensayar las propiedades fluorescentes de la población. Un análisis FACS de los clones de células seleccionados a partir de R1 muestra que la mayor parte de las células con una alta relación azul/verde \sim0,1% han sido eliminadas mediante un ciclo de selección para células verdes, tal como se muestra en la Figura 4B. Queda asimismo claro que la población total ha cambiado hacia más cantidad de células verdes en comparación con la población parental, tal como se muestra en la Figura 4A. Hay, sin embargo, células con una alta relación azul/verde que se muestran en la población verde seleccionada. éstas pueden representar clones en los que la BLEC se ha integrado en un gen diferencialmente regulado tal como un gen cuya expresión cambia a lo largo del ciclo celular.
La población de clones de RBL-1 mostrada en la Figura 4B se estimuló mediante la adición de ionomicina luM durante 6 horas y se volvió a seleccionar para identificar clones que presentaban la BLEC integrada en un gen que es inducible aumentando el calcio intracelular. La siguiente Tabla 4 expone los resultados de este experimento. Un mayor porcentaje de clones azules estaba presente en las tres sub-poblaciones azules (R4, R2, R5) en la población estimulada con ionomicina en comparación con la no estimulada. Esta población seleccionada representa las siguientes clases de células azules: R4 (la relación azul/verde más alta (azules brillantes)), R2 (azules multicolores), y R5 (relación azul/verde inferior (las menos azules). Adicionalmente, en la población estimulada con ionomicina hay una reducción del porcentaje de células verdes procedentes de la población no estimulada (R6). Este aumento de los clones azules en la población estimulada con ionomicina indica que una subpoblación de clones azules presentan la BLEC insertada en un gen que es inducido por ionomicina. Se seleccionaron clones azules individuales procedentes de la población estimulada con ionomicina y se analizan para determinar su perfil de expresión.
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TABLA 4
5
Además de hacer posible el aislamiento de clones de células con expresión de BL inducible procedentes de grandes poblaciones de células, se pueden aislar clones basados en su nivel de expresión de BL. Para aislar células con diferentes niveles de expresiones de BL se pueden seleccionar clones azules después de diferentes tiempos de exposición a un sustrato o por su relación azul/verde. Células con una relación azul/verde inferior o las que requieren tiempos de incubación más prolongados representarán clones que expresan niveles inferiores de BL. Esto se demuestra mediante la exploración por barrido FACS anteriormente mencionada ya que los clones seleccionados de la ventana R4 presentan una relación azul/verde superior lo cual indica que están expresando niveles superiores de BL, las células seleccionadas de la R5 presentan una relación azul/verde inferior (visualmente de color turquesa) lo cual indica una expresión de BL inferior. Células seleccionada de la ventana R3 que contiene todas las células azules muestran variaciones del color azul, del azul brillante (alta relación azul/verde) a azul turquesa (baja relación azul/verde).
Para demostrar que las construcciones de expresión son relativamente estables para clones seleccionados, se seleccionaron células de R3 (población azul) tal como se muestra en la Figura 4A y se cultivaron en ausencia de una presión selectiva durante varias semanas. Hubo un pequeño cambio del porcentaje de células azules en la población cultivada, manteniéndose el porcentaje azul a \sim90%. Este resultado representa un enriquecimiento de 10 veces para clones que expresan constitutivamente BL mediante un ciclo de selección por FACS.
Las células en la ventana R6 presentan la relación azul/verde más baja y aparecen visualmente de color verde. Las células R6 no están expresando por tanto BL o están expresando BL por debajo del límite de detección del ensayo de los solicitantes.
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Ejemplo 4
Estabilidad de clones de BLEC
Para investigar adicionalmente la estabilidad de las integraciones de genes informadores en genes constitutivamente activos, se seleccionaron clones azules individuales a partir de poblaciones de clones de células generadas transfectando RBL-1, y CHOK1 con BLEC-1. Después de la adición de CCF-2 a la población de células multiclonales, se seleccionaron clones azules individuales en placas de microtitulación de 96 pocillos. Estos clones se expandieron a platos de 24 pocillos lo cual duró de 7 a 10 días. La viabilidad de las células varió entre los dos tipos de células formando el 80% de los clones seleccionados colonias para las células CHO y el 36% para la células RBL-1. Después de la expansión en platos de 24 pocillos, se ensayaron 20 clones estables en BLEC-1 de CHO para determinar la expresión de BL mediante la adición de CCF-2-AM. 20/20 de estos clones expresaron BL variando el porcentaje de células azules en un clon del 70% al 99%. Este resultado es consistente con los datos anteriores presentados para RBL-1 en que la población azul seleccionada se ensayó para determinar la expresión de BL después de varias semanas de cultivo no selectivo. Hubo, sin embargo, diferencias importantes entre clones en su relación azul/verde y por lo tanto en su nivel de expresión de BL. Esto sugirió que los genes con diferentes niveles de expresión constitutiva habían sido identificadas con la BLEC. Aunque hubo diferencias importantes en el color azul entre clones independientes, la fluorescencia azul en un clon fue consistentemente similar tal como se esperaría en una población clonal. Hubo, sin embargo, células verdes en los clones azules seleccionados, lo cual puede indicar que hay alguna pérdida del sitio de integración del plásmido en BLEC-1 cuando los clones se hacen crecer a partir de una célula individual.
Se expandieron clones individuales y se utilizaron para preparar ARN para RACE para identificar el gen diana, y ADN para un análisis Southern.
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Ejemplo 5
Aislamiento de clones integrados en BLEC de Jurkat que expresan constitutivamente beta-lactamasa
Las células Jurkat constituyen una línea de células T derivadas de una leucemia de células T humana. Esta línea celular mantiene muchas de las capacidades de señalización de células T primarias y se pueden activar utilizando anticuerpos anti-CD3 o lectinas mitogénicas tales como fitohemaglutinina (PHA). Células Jurkat de tipo salvaje fueron transfectadas por electroporación con una construcción de atrapamiento de beta-lactamasa (BLEC-1, BLEC-1A, o BLEC-1B véase la Figura 3) ("construcciones BLEC") que contiene un gen que codifica un gen de beta-lactamasa que no está bajo el control de un promotor reconocido por las células Jurkat y un gen de resistencia a neomicina que puede ser expresado en células Jurkat. La BLEC-1 se expone en la Figura 3. La BLEC-1A presenta un sitio de Notl después del sitio de SV40 poli A. Esto permite el corte del inserto fuera de la cadena principal del plásmido. La BLEC-1B es igual que La BLEC-1A excepto en que el ATG en el comienzo de la traducción de betalactamasa se ha cambiado a ATC. Esto eliminó el sitio de comienzo de traducción y requiere la adición de un ATG de corriente arriba para producir beta-lactamasa. Se seleccionaron transformantes estables para determinar su resistencia a 800 \mug/ml de G418. Después de 400 experimentos independientes, se produjo un agrupamiento mayor que un millón de clones con inserciones de BLEC. Esta población de células constituye una biblioteca de clones de células en las que se insertó la construcción BLEC a lo largo del genoma ("biblioteca de BLEC de Jurkat"). Aproximadamente el diez por ciento de las células de esta biblioteca expresan beta-lactamasa en ausencia de estímulos añadidos. Se determinó la actividad de beta-lactamasa en las células poniendo en contacto las células con CCF2-AM y cargándolas en presencia de Pluronic 128 (de Sigma) a una concentración de aproximadamente 100 \mug/ml. Se pueden obtener clones individuales de poblaciones de células que expresan beta-lactamasa mediante selección por FACS.
El análisis genómico Southern de estos clones utilizando una sonda de ADN que codifica betalactamasa mostró el vector insertado en el genoma huésped entre una y tres veces por cada célula, presentando la mayor parte de los clones uno o dos sitios de inserción de vectores (para análisis genómico Southern, véase Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Un análisis Northern de estos clones utilizando una sonda de ADN que codifica betalactamasa mostró que el nivel de expresión y el tamaño de mensajes variaba de un clon a otro clon (para análisis Northern, véase Sambrook, supra, (1989)). Esto indicaba que los transcritos de fusión se estaban realizando con diferentes genes funcionalmente identificados con beta-lactamasa, lo cual permite que el gen informador se exprese en las mismas condiciones que el gen endógeno. Utilizando cebadores apropiados, se utilizó una RACE (Gibco BRL) para aislar los genes unidos al gen de beta-lactamasa expresado en un subconjunto de estos clones constitutivamente expresantes. Estos genes se clonaron y se secuenciaron utilizando procedimientos conocidos (véase Sambrook, supra, (1989)). Estas secuencias se compararon con secuencias conocidas utilizando técnicas de búsqueda BLAST establecidas. Las secuencias conocidas que se identificaron incluyeron: beta-catenina, moesina y \beta-adaptina. Adicionalmente, se identificaron varias secuencias nuevas que representan genes supuestos.
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Ejemplo 6
Aislamiento de clones integrados en BLEC de Jurkat que muestran una expresión inducida de betalactamasa al efectuar una activación
Se aislaron clones integrados en BLEC de Jurkat que presentan una expresión de beta-lactamasa al efectuar una activación de las células Jurkat mediante PHA (clones inducidos por PHA), seleccionando por FACS una biblioteca de BLEC de Jurkat. Estos clones representan células en las que la construcción de atrapamiento se había integrado en un gen sobrerregulado por activación con PHA (célula T). De este modo, estas células informan la activación transcripcional de un gen al efectuar una activación celular. Se identificaron y se aislaron clones individuales por FACS utilizando CCF2-AM para detectar actividad de beta-lactamasa. Este procedimiento de aislamiento de clones, el paradigma de selección inducida, utilizó tres protocolos de estimulación y selección secuenciales e independientes. Se utilizó como testigo una lectura de FACS para células Jurkat que no contienen una construcción BLEC puesta en contacto con CCF2-AM. Estas células testigo eran todas verdes.
El primer procedimiento de selección aisló una agrupación de clones azules (que expresan \beta-lactamasa, tal como se indicó poniendo en contacto las células con CCF2-AM) que se habían estimulado previamente durante 18 horas con
10 \mug/ml de PHA procedente de una biblioteca de BLEC de Jurkat no seleccionada. Esta agrupación representó el 2,83% de la población de células no seleccionadas originales. Esta agrupación seleccionada contenía clones que expresan constitutivamente beta-lactamasa y clones en los que la expresión de beta-lactamasa fue inducida por estimulación con PHA ("clones estimulables"). Después de la selección, esta agrupación de clones se cultivó en ausencia de PHA para permitir que las células, en el caso de clones estimulables, se expandieran y volvieran a un estado de reposo (es decir, que carecían de expresión génica inducida por PHA).
El segundo procedimiento de selección aisló una agrupación de clones de células verdes (que no expresan\beta-lactamasa, tal como se indicó poniendo en contacto las células con CCF2-AM) procedentes de la primera agrupación seleccionada que se habían cultivado, después de la selección, sin estimulación con PHA durante 7 días. El segundo procedimiento de selección separa clones que expresan constitutivamente beta-lactamasa de células que expresan beta-lactamasa al efectuar una estimulación. Esta segunda agrupación representó el 11,59% de la población de células antes de la segunda selección. Esta agrupación de células se cultivó en ausencia de PHA para multiplicar el número de células antes de una tercera selección.
El tercer procedimiento de selección utilizó el mismo procedimiento que el primer procedimiento de selección y se utilizó para aislar células individuales que expresan beta-lactamasa en respuesta al ser puestas en contacto con
10 \mug/ml de PHA durante 18 horas. Se seleccionaron clones azules particulares, individualmente en pocillos particulares de placas de microtitulación de 96 pocillos. Este procedimiento de selección por FACS de tres ciclos enriqueció clones inducibles por PHA en aproximadamente 10.030 veces.
Dichos clones aislados se expandieron y se ensayaron para determinar la inducibilidad por PHA mediante una inspección microscópica con y sin estimulación con PHA en presencia de CCF2-AM. Se identificó un total de cincuenta y cinco clones inducibles por PHA utilizando este procedimiento. La inducibilidad por PHA de estos clones varió de 1,5 a 40 veces el cambio en la relación 460/530 en comparación con células testigo no estimuladas. Un análisis genómico Southern utilizando una sonda de ADN que codifica beta-lactamasa estableció que estos clones representaban 34 sucesos de integración de vectores estables independientes. En las siguientes Tabla 6 y Tabla 7 se proporciona una relación de clones obtenidos mediante los procedimientos de la invención y sus características.
Además de clones inducibles por PHA, se aislaron clones inducibles por 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) (Calbiochem), tapsigargina (Thaps) (Calbiochem) y PMA + Thaps, utilizando el procedimiento general anteriormente expuesto utilizando el inductor indicado en lugar de PHA. El PMA es un activador específico de PKC (proteína quinasa C) y Thaps es un activador específico de liberación de ion calcio intracelular (Thaps). Estos clones se aislaron utilizando tres ciclos de FACS utilizando los procedimientos generales descritos para los clones inducibles por PHA en el Ejemplo 5. En tales casos, el PHA fue sustituido por otros estimuladores. El PMA se proporcionó a una concentración de 8 nM. La Thaps se proporcionó a una concentración de 1 \muM. Cuando estos dos estimulantes se combinaron, su concentración no cambió. Tal como se muestra en la Tabla 5, se seleccionaron clones sobre la base de su activación por PMA, Thaps, o PMA con Thaps después de tres o dieciocho horas de estimulación ("tiempo de estimulación"). Estos resultados demuestran que los criterios de selección de FACS se pueden variar dependiendo del tipo de clones modulados deseados. Utilizando condiciones de selección variadas, es posible aislar clones funcionalmente distintos corriente abajo de la diana de señalización deseada.
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Ejemplo 7
Aislamiento de clones integrados en BLEC de Jurkat que presentan una expresión reprimida de betalactamasa al efectuar una activación
Se aislaron mediante selección por FACS clones en BLEC de Jurkat que presentan una expresión de beta-lactamasa reducida al efectuar la activación de las células Jurkat mediante PHA. Estos clones representan células en las que la construcción de atrapamiento BLEC se había integrado en un gen infrarregulado por activación con PHA (célula T). De este modo, estas células informan la represión transcripcional de un gen al efectuar una activación celular. Se identificaron y se aislaron clones individuales mediante FACS utilizando CCF2-AM para detectar actividad de beta-lactamasa utilizando el siguiente paradigma de selección reprimido.
Se utilizó una primera selección para aislar una población de células que expresan constitutivamente beta-lactamasa identificando y aislando una población de células azules a partir de una población no estimulada de células Jurkat transfectadas con BLEC puestas en contacto con CCF2-AM. La población seleccionada de células representó el 2,89% de la población no seleccionada. Estas células se cultivaron, se dividieron en dos agrupaciones, y se estimularon con uno o dos estímulos diferentes, ya sea 10 \mug/ml de PHA durante 18 horas, o PMA 8 nM y Tapsigargina 1 \muM durante 18 horas. Estas células estimuladas se pusieron en contacto con CCF2 (cargándolas en presencia de 400 PET (4% en peso/volumen) y Pluronic® 128 (100 \mug/ml)) y las células verdes en la población se seleccionaron utilizando un FACS. La población seleccionada representó el 8,41% de la población de células antes de la segunda selección. El tercer ciclo de FACS fue para células individuales azules no estimuladas. La población de células obtenida representó el 18,2% de la población de células antes de la tercera selección.
El procedimiento de selección representa un enriquecimiento de 2.260 veces para clones reprimibles por PHA. Estos clones presentan el gen de beta-lactamasa integrado en un gen que es infrarregulado por estimulación con PHA de las células. Seis de 80 clones individuales ensayados fueron reprimidos por PHA o PMA + Tapsigargina. Se confirmó que todos estos clones constituían sucesos de integración independientes mediante un análisis genómico Southern utilizando una sonda de ADN que codifica betalactamasa. En la Tabla 5 están representados los resultados de estos estudios.
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TABLA 5
6 
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Ejemplo 8
Especificidad de clones modulados de células T
Los clones aislados a partir de procedimientos inducidos por PHA (Ejemplo 6) y reprimidos por PHA (Ejemplo 7) anteriormente descritos se caracterizaron para determinar la especificidad de su modulación y el tiempo requerido para la inducción o represión. Los clones fueron estimulados con múltiples activadores o inhibidores durante un intervalo de tiempo de una a veinticuatro horas. Como se muestra en la Tabla 6, cinco clones producidos mediante los paradigmas de selección inducido y reprimido utilizando una pluralidad de activadores se ensayaron para determinar su sensibilidad a una diversidad de activadores de células T, supresores, y combinaciones de los mismos.
7 
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En este estudio, el PMA, que es un activador de PKC, la tapsigargina, que aumenta el calcio intracelular, el PHA, que activa la vía de receptores de células T, y la ciclosporina A que es un inmunosupresor clínicamente aprobado que inhibe la calcineurina de fosfatos dependiente de Ca2^{+}, se investigaron para determinar su capacidad para modular la expresión de beta-lactamasa en clones de BLEC inducidos y reprimidos por PHA.
Los clones seleccionados muestran una dependencia variable para su activación e inhibición por estos activadores e inhibidores lo cual proporciona una indicación de los sucesos de señalización requeridos para su activación transcripcional. Cinco de los clones relacionados se generaron utilizando los enfoques anteriormente descritos en el Ejemplo 6. El clon C2 se generó utilizando un enfoque más clásico. Este clon se generó transfectando una construcción de plásmido en el que un elemento de respuesta 3X NFAT ha sido unido de manera operable a la expresión de beta-lactamasa. Este elemento 3XNFAT representa una secuencia de ADN que está presente en la región promotora de IL-2 y otros genes activados de células T. Además la línea celular C2 ha sido establemente transfectada con el receptor muscurínico M1. Esto permite la activación de la expresión de beta-lactamasa en este clon utilizando un agonista muscurínico de M1 tal como carbacol. Esta línea celular representa por tanto un buen testigo para los activadores e inhibidores celulares ensayados ya que están establecidos los sucesos de señalización requeridos para su activación.
Los resultados de estos estudios indican que las líneas celulares generadas varían en cuanto a su especificidad con respecto a la activación o represión mediante activadores. Así, dependiendo del tipo de sistema en que estas células han de utilizarse para investigar, mediante los presentes procedimientos se pone a disposición un panel de clones con una especificidad variable con respecto a una vía específica.
La Tabla 7 y la Tabla 8 proporcionan datos similares a los proporcionados en la Tabla 5 para todos los clones obtenidos mediante los procedimientos de los Ejemplos 5 a 7.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 7
8
TABLA 7 (continuación)
9 
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TABLA 8
10
Para confirmar que los cambios en la actividad de genes informadores reflejaban los cambios de la expresión de ARNm en estos clones, se realizó un análisis Northern sobre clones inducidos, constitutivos y reprimidos utilizando una sonda de ADN radiomarcada, dirigida hacia el gen de beta-lactamasa. Todos los clones que presentaron una inducibilidad de la enzima beta-lactamasa ensayados mostraron una inducibilidad de ARNm de beta-lactamasa. Todos los clones que presentaron una expresión constitutiva de beta-lactamasa mostraron una expresión constitutiva de ARNm de beta-lactamasa. Todos los clones que presentaron una expresión de beta-lactamasa reprimida mostraron un ARNm de beta-lactamasa reprimido. El tamaño del mensaje de ARNm de beta-lactamasa testigo fue de aproximadamente 800 pares de bases. Los tamaños de algunos de los clones de \beta-lactamasa del ARN fueron cambiados a superiores en el gel, lo cual indicaba que se había realizado un ARN de fusión entre el transcrito endógeno y beta-lactamasa. Se identificaron dos genes conocidos, CDK-6 (aislado a partir del clon J83-PTI15) y Erg-3 (aislado a partir del clon J89-PTI4), y dos genes desconocidos, que se aislaron a partir de los clones J83PI15 y J83PI2, respectivamente. Para el clon J389-PTI4, se realizó una transferencia Northern con una sonda de Erg-3 preparada utilizando cebadores de PCR apropiados determinados a partir de una secuencia publicada que se hibrida tanto con el ARN de fusión como con el ARN de tipo salvaje (para la secuencia de Erg-3 véase Stamminger et al., Int. immunol. 5: 63-70 (1993); para metodologías de PCR, véanse las patentes US nº 4.800.159, nº 4.683.195 y nº 4.683.202). La inducibilidad en las células Jurkat de tipo salvaje imitó la actividad de beta-lactamasa en este clon.
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Ejemplo 9
Rastreo de una biblioteca de moduladores farmacológicamente activos conocidos utilizando un clon deBLEC activado de células T
Se utilizó el clon J32-6D4 de células T para identificar inhibidores potenciales de la vía de receptores de células T. Este clon se seleccionó para un estudio adicional debido a que es difícil identificar productos químicos que inhiben una vía de receptores de células T específica. De este modo, este clon se utilizó para identificar compuestos químicos que inhiben esta vía de receptores de células T que es estimulada asimismo por el activador PMA de PKC.
Se realizó un primer rastreo utilizando un conjunto genérico de 480 productos químicos con propiedades conocidas. Era conocido que los productos químicos en este conjunto presentaban una actividad farmacológica. Aproximadamente el uno por ciento (7/480) de estos productos químicos mostró una proporción de inhibición mayor que el 50% de la activación por PHA de la expresión de beta-lactamasa en el clon J32-6D4 cuando se ensayó por duplicado a una concentración de 10 \muM del producto químico. Se activaron células con 1 \mug/ml de PHA durante 18 horas en presencia de los productos químicos para ensayar la actividad inhibitoria. En la Tabla 9 se muestran los siete productos químicos que inhibieron específicamente el clon J32-6D4. Dos de estos productos químicos inhibieron específicamente el clon J32-6DA y no la línea celular C2 testigo. Este ensayo para determinar la especificidad de inhibición incluyó el rastreo de 480 productos químicos para determinar la actividad inhibitoria utilizando el clon C2, en el que el receptor muscarínico M1 estaba unido a una lectura de gen informador de beta-lactamasa de NFAT (véase el Ejemplo 7). En estos experimentos, la inhibición medida fue la inhibición de la expresión inducida por carbacol de beta-lactamasa. Estos resultados, la inhibición específica de células J32-6D4 pero no de células C2, muestran que los productos químicos no son tóxicos, no inhiben la transcripción general y no inhiben el producto de gen informador.
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TABLA 9
11 
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Ejemplo 10
Rastreo de una biblioteca de productos químicos estructuralmente caracterizados que presentan propiedades farmacológicas desconocidas para modular la actividad de la vía de receptores de células T utilizando un clon de BLEC activado de células T
Habiendo demostrado en el Ejemplo 9 que el clon J32-6D4 se comporta sólidamente en un rastreo de productos químicos, dicho clon se utilizó para rastrear 7.500 productos químicos adicionales de una biblioteca de productos químicos patentada a una concentración de 10 \muM por cada producto químico. Esta colección de productos químicos, a diferencia de la colección de productos químicos utilizados en el Ejemplo 9, contiene productos químicos sin una actividad farmacológica conocida. Setenta y siete productos químicos mostraron una inhibición de por lo menos el 50% de la activación por PHA de la expresión de beta-lactamasa siguiendo los procedimientos generales expuestos en el Ejemplo 7. Dichos 77 productos químicos se volvieron a ensayar para determinar esta actividad utilizando el mismo procedimiento y se confirmó que 31 productos químicos presentaban actividad. Se determinaron los valores de IC50 de la inhibición de la activación por PHA de la expresión de beta-lactamasa para estos 31 productos químicos utilizando concentraciones del producto químico comprendidas entre aproximadamente 20 \muM y 2 nM. Los valores de IC50 reflejan la concentración de un producto químico necesaria para inhibir la activación por PHA del clon en el 50% y se determinaron utilizando procedimientos conocidos. Estos 31 productos químicos se ensayaron asimismo para determinar su inhibición cruzada de la activación inducida por carbacol de la expresión de beta-lactamasa del clon C2, tal como se describe en el Ejemplo 8.
Dos productos químicos, designados producto químico A y producto químico B, presentaron valores de IC50 de aproximadamente 200 \muM e inhibieron específicamente la activación por PHA de la expresión de beta-lactamasa del clon J32-6D4, pero no la activación por carbacol del clon C2 a la concentración ensayada. Todos los demás de los 31 compuestos químicos o bien inhibieron tanto el clon J32-6D4 como el clon C2, o presentaron valores de IC50 por encima de 1 \muM.
12
Los productos químicos A y B se ensayaron además para determinar su efecto anti-proliferativo sobre células Jurkat y sobre células L de ratón (línea celular de fibroblastos de ratón). El compuesto químico B no presentó ningún efecto anti-proliferativo tanto sobre células Jurkat como sobre células L a concentraciones hasta de 10 \muM. El producto químico A presentó un efecto antiproliferativo sobre las células Jurkats y las células L a una concentración de 100 nM. Los ensayos de proliferación se realizaron sembrando aproximadamente 20.000 células inactivadas por PHA en una placa de 24 pocillos. Dichas células se pusieron en contacto con productos químicos y se incubaron a continuación a una temperatura de 37ºC durante cinco días. Las células se pusieron en contacto con 10 \mug/ml de MTT (Sigma Chemical Co., MO) durante tres horas. Las células se recogieron seguidamente, se volvieron a suspender en isopropanol, y se leyó la absorbancia en un lector de placas a una longitud de onda de 570 nM con una sustracción de ruido de fondo en una lectura a una longitud de onda de 690 nm (véase Carmichael et al., Cancer Res. 47:936 (1987)).
Ejemplo 11
Efectos de productos químicos identificados sobre la proliferación de células T humanas primarias
Se desarrolló un ensayo para ensayar los compuestos químicos identificados en el Ejemplo 9 para determinar su capacidad para inhibir la activación y la proliferación de glóbulos blancos periféricos normales para confirmar su presunta actividad (véase en general, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1988)). Se extrajo sangre periférica procedente de seres humanos normales y se introdujo en tubos Vacutainer® heparinizados y se incubó con diversas concentraciones de enterotoxina estafilocócica B (superantígeno) (SEB, a una concentración de 0,001 a 10 ng/ml) durante 1 hora a una temperatura de 37ºC. Brefeldin A, el cual se añadió y las células se incubaron durante 5 horas adicionales. Se añadió EDTA para despegar las células, y se retiró una parte alícuota de 100 \mul, los glóbulos rojos se lisaron con cloruro de amonio, las células remanentes se contaron y su viabilidad se determinó utilizando una tinción de viabilidad utilizando procedimientos conocidos. Los glóbulos rojos que permanecían en la muestra original se lisaron con cloruro de amonio y las células remanentes (leucocitos) se permeabilizaron con una solución permeabilizante de FACS utilizando procedimientos establecidos. Dichos leucocitos se recogieron por centrifugación, se lavaron y se tiñeron con la combinación de anticuerpos CD69, IFN\gamma y CD3, que se marcaron de modo detectable. Las células testigo consistieron en células incubadas en ausencia de SEB y las células testigo de tinción consistieron en células teñidas con anticuerpos CD69/MslgG1 y CD3, que se marcaron de modo detectable. Cultivos similares se incubarán durante 71 horas, se someterán a impulsos con timidina tritiada durante 1 hora y se recogerán y la radiactividad incorporada se computará por centelleo para determinar un índice de estimulación utilizando procedimientos establecidos.
Utilizando concentraciones preferidas de SEB, se añadieron diversas concentraciones de ciclosporina A (CsA) para determinar las condiciones óptimas de CsA para el bloqueo de la estimulación por SEB de células T de sangre periférica para su utilización como testigo para células T no proliferativas. Los testigos consistieron en células incubadas con medios de cultivo en lugar de CsA. Los cultivos testigo incubados durante 1 hora fueron bloqueados con Brefeldin A durante 5 horas adicionales, se recogieron, y se tiñeron para determinar IFN\gamma intracelular o se cultivaron durante 71 horas adicionales, se sometieron a impulsos con timidina tritiada durante una hora, se recogieron y se computaron mediante centelleo líquido.
Utilizando concentraciones preferidas de SEB y de CsA, se estimuló sangre procedente de donadores normales en presencia y en ausencia de CsA. Esto estableció intervalos normales esperados para el grado de activación (% de IFN\gamma + CD3 activado + células durante 6 horas), para la proliferación (absorción de 3H-TdR a las 72 horas) y bloqueo por CsA en ambos momentos).
Utilizando condiciones preferidas, se incubó sangre humana con el Producto Químico A o con el Producto Químico B a concentraciones de 2, 20 y 200 nM. Se utilizó CsA como testigo positivo para la supresión de células T. Cultivos de una hora se bloquearon con Brefeldin A durante 5 horas adicionales, se recogieron y se computaron por centelleo líquido. Se presentaron los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad para cada condición de cultivo.
Los resultados de estos estudios deberán demostrar que por lo menos uno de los compuestos químicos identificados mediante los procedimientos de la presente invención presentan la actividad farmacológica prevista en células humanas.
Ejemplo 12
Identificación de genes expresados durante los programas de desarrollo
Otra utilización de este procedimiento consiste en la identificación de genes expresados durante diversos procesos celulares, tales como la biología de desarrollo y la apoptosis. Se pueden identificar genes implicados en programas de desarrollo específicos, tales como la diferenciación de pre-adipocitos para formar adipocitos maduros, utilizando este procedimiento.
Con el fin de practicar este procedimiento, se prepara una biblioteca de clones a partir de una línea celular de pre-adipocitos tal como 3T3-L1 utilizando los procedimientos descritos en general en los Ejemplos 10 a 12 anteriores. Naturalmente, se utilizan células de pre-adipocitos en lugar de células Jurkat. Esta línea celular se puede diferenciar de modo reversible para formar adipocitos maduros exponiéndola a dexametasona e indometasona (véase, Hunt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:3786-3789 (1986)). Estos adipocitos maduros se pueden diferenciar reversiblemente para formar pre-adipocitos con el factor de necrosis tumoral alfa TNFa (véase Torti et al., J. Cell. Biol. 108: 1105-1113 (1989)). De este modo, se puede preparar una biblioteca de células capaz de señalar la expresión de genes implicados en la diferenciación celular.
La biblioteca de atrapamiento de genes 3T3-L1 se selecciona por FACS para eliminar células azules que expresan constitutivamente beta-lactamasa. Las células verdes remanentes se diferencian a continuación para formar adipocitos maduros utilizando la dexametasona y la indometasona. Se aíslan células azules (que expresan beta-lactamasa) utilizando FACS. Estos clones representan células en las que la construcción de atrapamiento se integra en un gen que se expresa en adipocitos diferenciados, pero no en adipocitos no diferenciados. Este procedimiento se puede repetir múltiples veces para asegurar el enriquecimiento de células que expresan genes específicos de adipocitos.
Alternativamente, se pueden aislar clones de células que se diferencian durante un intervalo de tiempo específico. Por ejemplo, se seleccionan células azules y verdes diferenciadas durante 2 días con dexametasona e indametasona. Estas poblaciones de células representan células en las que la construcción de atrapamiento se integra en un gen que se expresa tempranamente en el proceso de diferenciación. Esto permite la identificación de genes que se expresan durante el programa de desarrollo, pero que no se expresan en pre-adipocitos o en adipocitos maduros. Este procedimiento se puede utilizar para aislar genes expresados durante una diversidad de programas de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a ellos células neuronales, cardiacas, musculares y cancerosas.
Estas líneas celulares se pueden utilizar para identificar genes implicados en el proceso de diferenciación, y se pueden asimismo utilizar para rastrear productos químicos que modulan el proceso de diferenciación utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos 8 a 10 anteriores. Los fármacos que se pueden identificar incluyen los que favorecen el crecimiento de células, tales como células neuronales, o deprimen el crecimiento o invierten la diferenciación de células, tales como células cancerosas.
Ejemplo 13
Ensayos para determinar moduladores de receptores acoplados con proteína G
Se pueden utilizar los procedimientos generales de los Ejemplos 8 a 10 de una manera análoga para identificar líneas celulares adecuadas para rastrear receptores acoplados con proteína G (GPCR). Es conocido que los GPCR proporcionan señales por medio de una entre varias vías intracelulares. Estas vías se pueden activar farmacológicamente en bibliotecas de células para proporcionar líneas celulares de rastreo potenciales. Por ejemplo, es conocido que los GPCR acoplados con Gq elevan la cantidad de calcio libre intracelular por medio de la activación de fosfolipasa Cb (PLCb). Aislando líneas celulares sensibles a un aumento del calcio de la biblioteca genómica (por ejemplo inducida por ionomicina o tapsigargina), se generan líneas celulares de rastreo.
Por ejemplo, un clon sensible al calcio se transfectó con un GPCR de tipo Gq por electroporación. Células del clon J389PTI4 se transfectaron por electroporación con un plásmido (pADNc3 (Invitrogen) o pADNc3-M1 (pADNc3 que puede expresar de manera operable el receptor M1) para preparar líneas celulares J389PTI4/pADNc3 y J389PTI4/
pADNc3-M1). La línea celular J389PTI4/pADNc3-M1 expresó el receptor M1, mientras que la línea celular J389PTI4/
pADNc3 no lo hizo. Por tanto, la célula J389PTI4/pADNc3 es una célula testigo. Dos días después de la transfección, se estimularon células con carbacol 20 \muM en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante 6 horas a una temperatura de 37ºC. Estas células se pusieron en contacto con colorante CCF-2 durante otros 90 minutos. Los cambios de la relación 460/530 se midieron en un lector de placas de fluorescencia Cytofluor (Modelo Serie 4000) (Perceptive Biosystems) y corresponden a la expresión de genes informadores. En la Tabla 10 se exponen estos resultados. La capacidad del clon transitoriamente transfectado para detectar un ligando para el GPCR demuestra el potencial para generar líneas celulares de rastreo utilizando clones preparados siguiendo los procedimientos de la presente invención. La estimulación por carbacol detectada en el ensayo de transfección transitoria representa una respuesta en aproximadamente el 20% de las células. Para desarrollar una línea celular de rastreo estable para el receptor M1, esta población se puede seleccionar para determinar clones individuales sensibles a carbacol y dichos clones se pueden expandir y rastrear para identificar los clones más sensibles.
Se pueden utilizar procedimientos similares para generar líneas celulares para receptores acoplados con Gs o Gi. En estos casos, se pueden aislar clones sensibles a aumentos o reducciones de AMPc. Se puede utilizar una diversidad de líneas celulares para estos procedimientos, tales como células CHO, HEK293, neuroblastomas, P19, F11 y NT-2.
13
Publicaciones Artículos
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Claims (18)

1. Procedimiento para determinar un perfil de respuesta celular para una diana, que comprende:
i)
introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor que codifica una \beta-lactamasa,
ii)
inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
iii)
separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de dicha \beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii),
iv)
identificar una pluralidad de polinucleótidos genómicos que presentan un incremento o una disminución en la expresión presente en dicha segunda pluralidad de células, en el que un incremento o una disminución en la expresión de cada uno de dichos polinucleótidos genómicos de dicha pluralidad de polinucleótidos proporciona un perfil de respuesta celular relacionado con dicha diana,
en el que dicho polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento para determinar un perfil de respuesta celular para un producto químico, que comprende:
i)
poner en contacto una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor, con dicho producto químico,
ii)
separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de la \beta-lactamasa en respuesta al contacto con dicho producto químico,
iii)
identificar una pluralidad de polinucleótidos genómicos que presentan un incremento o una disminución en la expresión presente en dicha segunda pluralidad de células, en el que un incremento o una disminución en la expresión de cada uno de dichos polinucleótidos genómicos de dicha pluralidad de polinucleótidos proporciona un perfil de respuesta celular relacionado con dicho producto químico,
en el que dicho polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento para cribar compuestos para su actividad como activador o inhibidor de una diana, que comprende:
i)
introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido sin promotor que codifica \beta-lactamasa,
ii)
inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
iii)
separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de la \beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii),
iv)
poner en contacto una célula obtenida a partir de dicha segunda pluralidad de células con un producto químico de ensayo,
v)
inducir opcionalmente la expresión de dicha diana en dicha célula o poner en contacto dicha célula con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
vi)
determinar si dicho producto químico de ensayo incrementa o disminuye la actividad de la \beta-lactamasa en comparación con una célula de control que no se puso en contacto con dicho producto químico de ensayo,
en el que dicho polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector vírico.
\newpage
4. Procedimiento para desarrollar un panel sensor celular, que comprende:
i)
introducir una diana en una primera pluralidad de células eucarióticas, en el que cada célula eucariótica comprende un polinucleótido genómico unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor que codifica una \beta-lactamasa,
ii)
inducir la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o poner en contacto dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana,
iii)
separar mediante FACS una segunda pluralidad de células que presentan un incremento o una disminución en la expresión de dicha \beta-lactamasa en respuesta a la etapa (ii),
iv)
seleccionar células para dicho panel sensor celular a partir de dicha segunda pluralidad de células que presentan una variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la fluorescencia medida en respuesta a la inducción de la expresión de dicha diana en dichas células clonales, o en respuesta a la exposición de dichas células clonales a un ligando, inhibidor o activador para dicha diana, y
en el que dicho polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dicha primera pluralidad de células eucarióticas mediante un vector vírico.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho vector vírico comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de aceptor de empalme, una secuencia de donador de empalme,
en el que dicha secuencia de aceptor de empalme flanquea a dicho polinucleótido que codifica dicha \beta-lactamasa, y dicha secuencia de donador de empalme flanquea a dicho polinucleótido que codifica dicha \beta-lactamasa.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho vector vírico comprende además una secuencia de inicio traduccional para dicha \beta-lactamasa.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha segunda pluralidad de células presenta una variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la fluorescencia medida en respuesta a la inducción de la expresión de dicha diana en dicha primera pluralidad de células eucarióticas o la puesta en contacto con dicha primera pluralidad de células eucarióticas con un ligando, inhibidor o activador de dicha diana.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha secuencia de inicio traduccional comprende una secuencia de Kozak.
9. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho vector vírico comprende además un sitio de entrada de ribosoma interno.
10. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho vector vírico comprende además un sitio de poliadenilación para dicha \beta-lactamasa.
11. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho vector vírico es un retrovirus.
12. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha primera pluralidad de células eucarióticas comprende poblaciones de por lo menos 10.000 células.
13. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha primera pluralidad de células eucarióticas comprende poblaciones de por lo menos 100.000 células.
14. Panel sensor celular, que comprende:
una pluralidad de células clonales, en el que cada célula clonal comprende un polinucleótido genómico distinto unido funcionalmente a un polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor que codifica una \beta-lactamasa, y
en el que dichas células clonales presentan una variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la fluorescencia medida en respuesta a la inducción de la expresión de dicha diana en dichas células clonales, o en respuesta a la exposición de dichas células clonales a un ligando, inhibidor o activador de dicha diana, y
en el que dicho polinucleótido de \beta-lactamasa sin promotor se introdujo en dichas células clonales mediante un vector vírico con la condición de que dichas células clonales no sean obtenidas mediante un procedimiento que comprende la etapa que consiste en utilizar embriones humanos para generar células madre embrionarias humanas.
\newpage
15. Panel sensor celular, que comprende:
una pluralidad de células clonales, en el que cada una de dichas células clonales comprende un polinucleótido genómico distinto unido funcionalmente con una construcción de expresión de \beta-lactamasa sin promotor, y
en el que dichas células clonales presentan una variación de 1,5 a 40 veces mayor en la proporción 460/530 de la fluorescencia medida en respuesta a la puesta en contacto de un producto químico de ensayo con dichas células clonales, y
en el que dichas células clonales fueron seleccionadas a partir de una población de células a la que se había introducido un vector vírico, y en el que dicho vector vírico carece de un promotor para expresar dicha \beta-lactamasa, con la condición de que dichas células clonales no sean obtenidas mediante un procedimiento que comprende la etapa que consiste en utilizar embriones humanos para generar células madre embrionarias humanas.
16. Panel sensor celular según la reivindicación 14 ó 15, en el que dicho panel comprende además por lo menos una línea celular en la que dicha expresión de \beta-lactamasa está bajo el control de un elemento de respuesta.
17. Panel sensor celular según la reivindicación 14 ó 15, en el que dicho panel es una placa multipocillo.
18. Panel sensor celular según la reivindicación 14 ó 15, en el que dichas células clonales se obtienen a partir de células madre hematopoyéticas o embrionarias, con la condición de que las células madre embrionarias no sean obtenidas mediante un procedimiento que comprende la etapa que consiste en utilizar embriones humanos para generar células madre embrionarias humanas.
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