ES2315387T3 - Metodo para la oxidacion de compuestos aromaticos. - Google Patents
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Abstract
Método para la oxidación biocatalítica de una o varias etapas de compuestos aromáticos según el cual a) en un medio de cultivo de dos fases, acuoso-orgánico, el cual contiene un sustrato aromático de la fórmula II En la cual Ar-R 2 (II) Ar representa un anillo aromático mononuclear opcionalmente mono- o poli-sustituido; y R 2 representa -(CH2)n+1R 3 , donde n representa un valor de número entero de 0 hasta 15; y R 3 representa H; se cultiva un microorganismo en condiciones aeróbicas el cual expresa una enzima con actividad de xilenomonooxigenasa (XMO); y b) al menos un producto formado durante la reacción de oxidación, donde el residuo R 2 se oxidó hasta el residuo hidroxilo, carbonilo o carboxilo correspondiente, se aísla del medio de cultivo; y según el cual el grado de oxidación del sustrato empleado es controlable mediante el ajuste de la concentración de sustrato.
Description
Método para la oxidación de compuestos
aromáticos.
La invención se refiere a un método para la
oxidación bio-catalítica de compuestos
aromáticos.
Los compuestos aromáticos, tales como aldehídos,
son ingredientes importantes en perfumes y sustancias de fragancias
y aromas (Wittcoff und Reuben 1996). Así mismo, son válidas como
sustancias de partida para diferentes polímeros, fármacos y
productos químicos finos.
La ruta de síntesis química más importante para
la preparación de un aldehído aromático típico, a saber del
benzaldehído, se efectúa a partir de tolueno (Wittcoff y Reuben
1996). Mediante la dicloración de tolueno de genera el cloruro de
bencilideno, el cual se transforma en benzaldehído mediante
hidrólisis (esquema 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1
Preparación de banzaldehído a
partir de
tolueno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La oxidación específica de un solo grupo metilo
o el aislamiento a partir de mezclas de producto representan la
gran dificultad en síntesis química. Además, las reacciones deben
realizarse con mucha frecuencia con ayuda de sustancias
extremadamente venenosas o en condiciones extremas de reacción.
Además, los productos secundarios formados durante la síntesis
química representan un problema. Por las razones expuestas arriba,
la preparación de 3,4-dimetilbenzaldehido por medio
de síntesis química es muy difícil, por ejemplo.
La preparación biocatalítica de compuestos
aromáticos, tales como aldehídos, representa una alternativa a la
preparación química descrita arriba.
Para la producción de aldehídos aromáticos se
usan principalmente las clases de enzima de las transferasas,
liasas (Simmonds and Robinson 1997; Simmonds and Robinson 1998) y
oxidoreductasas (Legoy, Kim et al. 1985; Molinari, Villa
et al. 1995; Molinari, Aragozzini et al. 1997;
Molinari, Gandolfi et al. 1999). Las
oxido-reductasas son de interés especial ya que
están en la capacidad de oxidara solo un grupo metilo de manera
estéreo- o región-selectiva de xilenos, por
ejemplo. Los xilenos son válidos como sustratos económicos y pueden
convertirse en los respectivos aldehídos en una reacción de dos
pasos.
El TOL-plásmido pWWO de
pseudomonas putida mt-2 hace posible el catabolismo
de toluenos y xilenos. Las rutas catabólicas de degradación
superior y meta-degradación están codificadas en
dos operones separados en el plásmido. Las enzimas de la ruta
catabólica superior catalizan la oxidación de toluenos o xilenos
hasta los ácidos benzoicos respectivos y las enzimas de la ruta
catabólica de meta-degradación aquellas reacciones
que degradan el ácido benzoico hasta sustratos del ciclo de ácido
cítrico (Harayama, Rekik et al. 1989; Harayama, Kok et
al. 1992; Ramos, Marqués et al. 1997; Williams, Shaw
et al. 1997). La ruta catabólica superior para la
preparación es de interés particular para la preparación de
aldehídos aromáticos. El operón de la ruta catabólica superior
contiene 5 genes (Harayama, Leppik et al. 1986). Tal como
puede verse en el esquema 2, la primera enzima es la xileno
monooxigenasa (XMO), que transforma toluenos o xilenos en los
respectivos alcoholes bencílicos.
\newpage
Esquema
2
Ruta catabólica superior de
Pseudomonas
putida-mt2
XMO: Xilenomonooxigenasa
BADH: Dehidrogenasa de alcohol bencílico BZDH:
Dehidrogenasa de benzaldehído
BZDH:
Bensaldehído-dehidrogenasa
La segunda enzima es la dehidrogenasa de alcohol
bencílico (BADH), la cual es capaz de catalizar la reacción de
alcoholes bencílicos hasta benzaldehídos. En el caso de las
reacciones descritas, NADH se consume por la xileno monooxigenasa y
se re-sintetiza por la alcohol dehidrogenasa. Si se
usaran estas dos enzimas para la producción de benzaldehídos
resultaría un balance equilibrado de NADH.
Cuando se usaron conjuntamente XMO y BADH en la
E. coli recombinante para convertir tolueno hasta los
benzaldehídos correspondientes, los benzaldehídos se formaron solo
en cantidades pequeñas. Se observó más bien una
re-síntesis de los benzaldehídos hacia los
alcoholes bencílicos correspondientes (Bühler, Schmid et al.
2000). Se ha demostrado que el equilibrio de las reacciones
catalizadas por BADH se inclinaba predominantemente hacia los
alcoholes.
Según Bühler, Schmid et al. (2000), sin
embargo, la xileno-monooxigenasa por sí misma es
capaz de catalizar la oxidación de pasos múltiples de un grupo
metilo de toluenos o xilenos hasta un alcohol bencílico,
benzaldehído y ácido benzoico, incluso en ausencia de BADH. Esto se
efectúa introduciendo un átomo de alcohol de oxígeno molecular, es
decir mediante mono-oxigenaciones (Bühler, Schmid
et al. 2000). En el esquema 3 muestra las reacciones
catalizadas por XMO. Debe notarse que, en contraste con las
reacciones de dehidrogenación, las reacciones de
mono-oxigenación son irreversibles.
Esquema
3
Rutas de reacción catalizadas
por xileno monooxigenasa
(XMO)
Para controlar la expresión de XMO en E.
Coli recombinante, se usó el sistema de regulación alk el cual
puede inducirse mediante n-octano (Panke, Meyer
et al. 1999) (véase la figura 1).
La producción biotecnológica de aromáticos
oxidados selectivamente, tales como
3,4-dimetilbenzaldehído, a partir de sustratos
baratos, es de gran interés puesto que la oxidación regioespecífica
de un solo grupo metilo mediante síntesis química es muy difícil.
La baja solubilidad en agua y la toxicidad de los sustratos y los
productos para las células son de importancia crucial. Por ejemplo,
a una concentración de 1-4 mM los toluenos ya
tienen un efecto tóxico sobre E. coli (Schmid 1997). Esto
limita la aplicabilidad del sistema monofásico acuoso.
En la anterior solicitud alemana de patente
DE-A-199 51 768.1 se describe un
método para la producción biocatalítica de aldehídos aromáticos y/o
ácidos carboxílicos en un medio de reacción monofásico usando
organismos que expresan XMO.
Es un propósito de la presente invención
proporcionar un proceso biocatalítico mejorado para la oxidación de
compuestos aromáticos con la ayuda de microorganismos que producen
XMO. En particular, el método novedoso está dirigido a llevarse a
cabo a escala más grande, semi-industrial o
industrial.
Sorprendentemente pudo demostrarse por medio del
sistema modelo de la oxidación microbiológica de
pseudo-cumeno hasta los productos de oxidación
correspondientes (alcohol, aldehído, ácido carboxílico) que este
objeto se logra usando un medio de reacción bifásico
acuoso/orgánico. El sistema bifásico de acuerdo con la invención se
distingue frente a un sistema monofásico acuoso convencional por
varias ventajas importantes (tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- concentración elevada de sustratos/productos que son levemente solubles en agua;
- -
- procesamiento de producto facilitado en la fase de separación;
- -
- reducción de inhibiciones de sustratos o de producto;
- -
- desplazamiento del equilibrio de reacción hacia velocidades de conversión más altas mediante extracción de producto;
- -
- reversión de una reacción hidrolítica reduciendo la actividad de agua;
- -
- pequeños volúmenes de reactor y flujos de volumen
- -
- riesgo bajo de contaminación microbiana
- -
- riesgo bajo de escisión de sustratos o productos inestables.
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, la presente invención se refiere
a un proceso para la oxidación biocatalítica de compuestos
aromáticos el cual comprende
a) cultivar en condiciones aeróbicas un
microorganismo que expresa una enzima con actividad de xileno
monooxigenasa (XMO) en un medio de cultivo bifásico,
acuoso-orgánico el cual comprende un sustrato
aromático de la fórmula II
(II)Ar-R^{2}
en la
cual
Ar representa un anillo aromático mononuclear
insustituido o mono- o poli-sustituido; y
R^{2} representa
-(CH_{2})_{n+1}R^{3}, donde n es un problema entero de
0 hasta 15, como por ejemplo 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y
R^{3} representa H; y
b) aislar del medio de cultivo al menos un
producto formado en la reacción de oxidación catalizada por XMO, en
donde el residuo R^{2} ha sido oxidado hasta el residuo hidroxilo,
carbonilo o carboxilo correspondiente; y donde el grado de
oxidación del sustrato usado es controlable mediante el ajuste de la
concentración de sustrato.
Las reacciones según la invención pueden
efectuarse usando la misma enzima (XMO) en uno o más pasos. El
compuesto aromático alquilado, el alcohol correspondiente o el
aldehído correspondiente pueden emplearse como sustrato. El grado
deseado de oxidación del sustrato empleado puede controlarse tal
como será ilustrado en gran detalle de aquí en adelante.
El sistema de anillo aromático Ar en los
compuestos de las fórmulas I y II que se preparan de acuerdo con la
invención o se emplean como sustratos pueden ser mono- o
poli-sustituidos. La posición del/de los
sustituyente(s) del anillo puede seleccionarse como se desee.
Sin embargo, se prefiere la posición meta y/o para hacia el lado de
la cadena a oxidarse.
Sustituyentes adecuados en el compuesto
aromático comprenden alquilo de C_{1}-C_{4}, tal
como metilo, etilo, n- y i-propilo y
n-butilo, en especial metilo y etilo, alcoxi de
C_{1}-C_{4}, en especial metoxi y etoxi,
halógeno, tal como F, Cl, Br y I, en especial Cl, y nitro.
Ejemplos concretos no limitantes de los
sustratos de la fórmula II oxidables mediante XMO de acuerdo con la
invención son tolueno, xilenos, meta y/o para metil-, etil-,
metoxi-, nitro-, y cloro-toluenos sustituidos, así
como m-bromo tolueno sustituido y pseudocumeno (es
decir, trimetilbencenos).
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de la fase orgánica es importante
para el sistema bifásico usado de acuerdo con la invención y depende
de diversos parámetros:
- el efecto tóxico o inhibitorio de la fase
orgánica en las células
- la solubilidad de los sustratos y productos en
la fase orgánica
- los coeficientes de distribución de sustrato y
producto
- inflamabilidad y toxicidad de la fase
orgánica
- diferencia en la densidad de la fase orgánica
y agua
- el punto de ebullición de la fase orgánica
\vskip1.000000\baselineskip
Como fase orgánica del medio de reacción
bifásica se usa preferiblemente un compuesto orgánico apolar que
tiene un coeficiente de distribución de > 10^{4} en un sistema
bifásico n-octanol/agua.
Además se prefiere el uso de aquellas fases
orgánicas que tienen un punto de ebullición o rango de ebullición a
1 atmósfera que excede el punto de ebullición del(de los)
producto(s) de oxidación en aproximadamente 50 hasta 200ºC,
en particular del producto de oxidación a aislarse con el punto de
ebullición más alto. Una fase orgánica que se usa de manera
particularmente preferible es
di-(C_{5}-C_{12}-alquil)-ftalato
o una mezcla de tales ftalatos. De manera particularmente
preferible se usan dioctilo ftalatos
(bis-etil-hexil-ftalato)
y aquellos que pueden actuar simultáneamente como antiespumantes
durante la fermentación.
De acuerdo con una variante preferida del
proceso de acuerdo con la invención se obtiene el producto de
reacción separando la fase orgánica y retirando el/los
productos(s) de oxidación disueltos allí mediante
destilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos de acuerdo con la invención se
llevan a cabo preferiblemente usando XMO, codificado por los genes
xylA y xylB según el acceso a xylMA GENBANK No. M37480 y las
isoenzimas correspondientes. XMO proviene preferiblemente de
bacterias del tipo Pseudomonas, en especial de la especie
Pseudomonas putida, preferiblemente cepa mt-2 (ATCC
33015).
De acuerdo con la invención también se abarca el
uso de "equivalentes funcionales" de XMOs divulgadas
concretamente.
"Equivalentes funcionales" o análogos de
las monooxigenasas divulgadas concretamente son, para los propósitos
de la presente invención enzimas que difieren de ellas pero
continúan mostrando la reacción deseada y son útiles para la
preparación de alcoholes, aldehídos y/o ácidos carboxílicos de la
fórmula I de arriba.
\newpage
Por "equivalentes funcionales" se entienden
de acuerdo con la invención especialmente mutantes de enzima que en
al menos una posición de secuencia tienen un amino ácido distinto
del amino ácido original, pero aún cataliza una de las reacciones
de oxidación arriba mencionadas. De esta manera, "equivalentes
funcionales" abarcan los mutantes obtenibles mediante una o más
adiciones, sustituciones, de amino ácido, sustituciones, deleciones
y/o inversiones de amino ácido, y es posible que ocurran las
modificaciones arriba mencionadas en cualquier posición de
secuencia siempre que den origen a un mutante con la actividad
catalítica de acuerdo con la invención. La equivalencia funcional
existe también en particular cuando los patrones de reactividad
entre mutante y enzima inmodificada están de acuerdo en términos de
calidad; es decir, cuando, por ejemplo, se convierten sustratos
idénticos a velocidades diferentes.
Por supuesto, "equivalentes funcionales"
comprenden también monooxigenasas que son accesibles de otros
organismos, por ejemplo otras bacterias diferentes de aquellas
mencionadas específicamente aquí, y variantes o isoenzimas que se
dan naturalmente. Por ejemplo, regiones de secuencias homólogas
pueden identificarse mediante una comparación de secuencia y pueden
determinarse enzimas equivalentes de conformidad con las tareas
específicas de la invención.
De acuerdo con la invención también se abarca el
uso de otras secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN
de una o dos cuerdas) diferentes de las nombradas concretamente, las
cuales codifican una de las monooxigenasas de arriba y sus
equivalentes funcionales. Otras secuencias de ácido nucleico útiles
de acuerdo con la invención se diferencian de las secuencias
empleadas concretamente por adición, sustitución, inserción o
deleción de uno o más nucleótidos, pero continúan codificando una
monooxigenasa con el perfil deseado de propiedades.
De acuerdo con la invención se abarca también el
uso de aquellas secuencias de ácido nucleico que comprenden lo que
se conoce como mutaciones silentes o que se modifican en comparación
con una secuencia mencionada específicamente de acuerdo con la
utilización de codón de un organismo u organismo huésped de fuente
específica tal como variantes que se dan naturalmente como, por
ejemplo, variantes de empalme de las mismas. La invención también se
refiere a secuencias que pueden obtenerse mediante sustituciones
nucleótidas de conservación (es decir, el aminoácido en cuestión se
reemplaza por un aminoácido de la misma carga, tamaño, polaridad y/o
solubilidad).
La secuencia de XMO que codifica es un
componente de constructos de expresión que comprende, bajo el
control genético de las secuencias regulatorias de ácido nucleico,
una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima
monooxigenasa que puede usarse de conformidad con la invención.
Tales constructos de acuerdo con la invención comprenden
preferiblemente un promotor corriente arriba 5' de la secuencia
codificante respectiva y una secuencia terminadora corriente abajo
3' y, opcionalmente, otros elementos reguladores, en cada caso
enlazados de manera operativa con la secuencia codificante. Por un
"enlace operativo" se entiende la disposición secuencial de
promotor, secuencia codificante, terminador y, opcionalmente, otros
elementos reguladores de tal manera que cada uno de los elementos
reguladores puede efectuar su función en la expresión de la
secuencia codificante. Ejemplos de secuencias que pueden enlazarse
de manera operativa son secuencias de focalización así como
reforzadores de translación, otros reforzadores, señales de
poliadenilación y similares. Otros elementos regulatorios
comprenden marcadores seleccionables, señales de amplificación,
orígenes de replicación y similares.
La secuencia regulatoria natural puede estar
presente aún antes del propio gene estructural, en adición a las
secuencias regulatorias artificiales. Mediante modificación genética
esta regulación natural puede eliminarse opcionalmente y la
expresión del gen puede elevarse o reducirse. Sin embargo, el
constructo génico puede ser simple en estructura, es decir no se
insertan señales regulatorias adicionales antes del gen estructural,
y no se retira el promotor natural junto con su regulación. En vez
de eso, la secuencia regulatoria natural se muta de tal manera que
la regulación ya no tiene lugar y la expresión del gen se incrementa
o se reduce.
En el constructo génico pueden estar presentes
las secuencias de ácido nucleico en una o varias copias.
Ejemplos de promotores útiles son: promotores
cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac,
lpp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6,
I-PR o I-PL, que se usan
ventajosamente en bacterias gram-negativas; así como
los promotores gram positivos amy y SPO2, los promotores de
levadura ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH o los
promotores de vegetales CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33,
not o el promotor ubiquitina o phaseolina. Se prefiere
particularmente el uso de promotores inducibles como, por ejemplo,
promotores inducibles por luz o temperatura, como el promotor
P_{r}P_{l}.
En principio pueden usarse todos los promotores
naturales junto con sus secuencias regulatorias. Adicionalmente
también pueden usarse de manera ventajosa los promotores
sintéticos.
Las secuencias regulatorias mencionadas deben
hacer posible la expresión dirigida de las secuencias de amino
ácidos. Dependiendo del organismo huésped esto puede significar, por
ejemplo, que el gen se expresa o se sobre-expresa
solo después de inducción, o que se expresa y/o sobre expresa
inmediatamente.
Estas secuencias o factores regulatorios pueden
tener preferiblemente un efecto positivo sobre la expresión, de tal
modo que lo aumente o lo disminuya. De esta manera los elementos
regulatorios pueden reforzarse ventajosamente al nivel de
transcripción usando fuertes señales de transcripción tales como
promotores y/o "reforzadores". Además, también es posible un
refuerzo de traslación, mejorando la estabilidad del mARN, por
ejemplo.
La preparación de un casete de expresión de
acuerdo con la invención se efectúa mediante fusión de un promotor
adecuado con una secuencia nucleótida-monooxigenasa
adecuada y con una señal de un terminador o de poliadenilación.
Para esto se usan técnicas habituales de recombinación y clonación,
tal como se describe en Sambrook et al, por ejemplo.
Para expresión en un organismo huésped adecuado,
el constructo recombinante de ácido nucleico o de gen se inserta
ventajosamente en un vector específico al huésped el cual hace
posible la expresión óptima de los genes en el huésped. Para el
técnico en la materia son bien conocidos los vectores y pueden
encontrarse, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P. H.
et al.).
Además de plásmidos, por vectores se entienden
todos los otros vectores conocidos para la persona técnica en la
materia tales como, por ejemplo, fagos, virus tales como SV40, CMV,
CaMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS,
fasmidas, cosmidas, y ADN lineales o circulares. Estos vectores
pueden replicarse autónomamente en el organismo huésped o se replica
cromosomalmente.
Con ayuda de tales vectores de acuerdo con la
invención pueden producirse microorganismos recombinantes que se
transforman por ejemplo con al menos un vector de acuerdo con la
invención y que puede emplearse en el proceso de acuerdo con la
invención. Los constructos recombinantes descritos arriba de acuerdo
con la invención se introducen a, y se expresan en, ventajosamente
un sistema huésped adecuado. Se prefiere usar métodos de clonación
y transfección, que son familiares para el técnico en la materia,
tales como por ejemplo coprecipitación, fusión de protoplasto,
electroporación, transfección retroviral y similares para expresar
los ácidos nucleicos mencionados en el sistema de expresión
respectivo. Se describen sistemas adecuados, por ejemplo, en Current
Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al.
Como organismos huésped son adecuados, en
principio, todos los organismos que hacen posible la expresión de
los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, o sus variantes
alélicas de sus equivalentes funcionales o sus derivados, y que
pueden emplearse para llevara a cabo la reacción de oxidación
microbiológica de acuerdo con la invención. Se entiende por
organismos huésped, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras,
células vegetales o células animales. Los organismos preferidos son
las bacterias.
Sin embargo, un microorganismo que expresa XMO
usado preferiblemente es uno que no tiene esencialmente actividad
de dehidrogenasa de alcohol bencílico (BADH) ni actividad de
dehidrogenasa de benzaldehído (BZDH). Se usa de manera especialmente
preferible un microorganismo transformado con el plásmido de
expresión pSPZ3.
Los microorganismos que se usan preferiblemente
de acuerdo con la invención son bacterias del tipo Escherichia, en
especial E. coli, como por ejemplo la cepa JM101.
La transformación de microorganismos con un
vector se lleva a cabo de acuerdo con la invención usando técnicas
estándares establecidas y por lo tanto no requiere una descripción
detallada.
La selección de organismos transformados
exitosamente puede efectuarse mediante genes marcadores que también
están presentes en el vector o en casete de expresión. Ejemplos de
tales genes marcadores son genes para resistencia a antibióticos y
genes para enzimas que catalizan una reacción de color que ocasiona
un tinturado de las células transformadas. Estas células pueden
seleccionarse entonces por medio de una selección automática de
células. Los microorganismos transformados exitosamente con un
vector que lleva un gen adecuado para resistencia a antibióticos
(por ejemplo G418 o higromicina) pueden seleccionarse mediante
mediaos líquidos o sólidos que comprenden antibióticos. Las
proteínas marcadores que se presentan en la superficie de la célula
pueden usarse para selección por cromatografía de afinidad.
La combinación de los organismos huésped y los
vectores que se ajustan a los organismos, tales como plásmidos,
virus o fagos, tales como por ejemplo plásmidos con el sistema
polimerasa de ARN/promotor, fagos \lambda o \mu u otros fagos
temperentes o transposones y/u otros secuencias regulatorias
ventajosas forma un sistema de expresión.
De acuerdo con una realización especialmente
preferida se usa un microorganismo recombinante que se transforma
con un vector de expresión que lleva los genes codificantes XMO xylM
y xylA, por ejemplo bajo el control genético del sistema regulatorio
alk de Pseudomonas oleovorans GPo1.
Se prefiere especialmente el microorganismo
transformado con el plásmido de expresión pSPZ3 que codifica
xylMA.
El sistema regulatorio alk de Pseudomonas
oleovorans GPo1 se conoce de por sí. La expresión del primero de
los dos clusters de gen alk mencionados arriba está bajo el control
de alkBp, el promotor alk, y comienza en la presencia de la
proteína regulatoria funcional alkS, la cual se codifica por el
segundo cluster de gen alk, y en la presencia de un inductor tal
como, por ejemplo, un alcano, por ejemplo n-octano,
o un compuesto que está relacionado íntimamente con éstos, tales
como, por ejemplo, diciclopopil cetona (DCPK) (8, 22, 23). El uso
del sistema regulatorio alk en E. coli tiene la ventaja de
que no tiene lugar una represión de catabolito.
El proceso de acuerdo con la invención puede
llevarse a cabo discontinuamente, semi-continuamente
o continuamente en bio-reactores convencionales. Se
prefiere especialmente hacer uso de un proceso
semi-continuo en cultivos. Una vez ha finalizado la
reacción se retira del reactor el medio de cultivo con excepción de
un pequeño residuo tal como, por ejemplo, de aproximadamente 1
hasta 5% en volumen. El residuo actúa luego como inóculo para el
cultivo que sigue.
La selección de la concentración óptima
parámetro de proceso, tal como la velocidad de aireación y entrada
de oxígeno, la concentración de materiales iniciales, el pH, la
temperatura, la composición del medio de reacción con respecto a la
fase orgánica y el medio nutriente, el tiempo de alimentación y la
velocidad de alimentación y similares puede realizarse por parte
del técnico en la materia sin esfuerzo indebido tomando en
consideración la revelación en la parte experimental que sigue.
Así, por ejemplo, el pH del medio de reacción puede usarse como un
parámetro para la productividad del biocatalizador.
En el proceso de acuerdo con la invención se
prefiere usar n-octano como inductor, especialmente
en una cantidad de 0,001 hasta 0,5% (v/v).
En otra variante preferida del proceso, la
reacción de acuerdo con la invención se lleva a cabo en un medio de
reacción esencialmente libre de antibiótico. Esto es
sorprendentemente ventajoso puesto que en las condiciones de
reacción imperantes en realidad debería esperarse que el
microorganismo recombinante usado perdiera el plásmido introducido.
El hecho de prescindir de antibióticos, posible de acuerdo con la
invención, significa un ahorro significativo en los costes, ya que
puede prescindirse de antibióticos y, además, no tienen que
retirarse antibióticos residuales del medio de reacción
procesado.
El grado de oxidación de los sustratos empleados
de acuerdo con la invención puede controlarse de diferentes
maneras. Por ejemplo, se toman muestras del medio de cultivo a
intervalos regulares y el contenido de los derivados
correspondientes de alcohol, aldehído y/o ácido carboxílico se
analiza mediante cromatografía de gases, cromatografía de gases
acoplada con espectrometría de masas (GC-MS) o
cromatografía líquida de alto desempeño. Dependiendo de cual
derivado oxidado se desea o de cuando se ha establecido una
proporción deseada de mezcla, se suspende la incubación. Esto puede
efectuarse, por ejemplo, retirando o matando los microorganismos,
por ejemplo por centrifugación y
decantación y/o mediante tratamiento con ácido, por ejemplo ácido tricloroacético, o mediante tratamiento con calor.
decantación y/o mediante tratamiento con ácido, por ejemplo ácido tricloroacético, o mediante tratamiento con calor.
El componente aromático oxidado puede entonces
aislarse del medio de cultivo, en particular la fase orgánica, con
la ayuda de métodos habituales de separación, por ejemplo mediante
destilación simple, destilación fraccionada, rectificación,
opcionalmente al vacío, o aplicando métodos cromatográficos
adecuados, pero preferiblemente mediante destilación.
Según una forma preferida de realización de la
invención se seleccionó
bis-(2-etilhexil)ftalato (dioctilftalato)
como fase orgánica de acuerdo con los criterios de arriba para la
fase orgánica para oxidación de compuestos aromáticos según la
invención, y en particular para la preparación de
3,4-dimetilbenzaldehído a partir de pseudocumeno en
un proceso bifásico de fed-batch. El sustrato y el
producto de disuelven muy bien en dioctilftalato. Además, esta
sustancia orgánica no costosa es altamente retardante de llama y es
una segunda fase no tóxica para E. coli. El alto punto de
ebullición
del dioctilftalato (380ºC a presión normal) permite la separación de los productos por medio de una destilación.
del dioctilftalato (380ºC a presión normal) permite la separación de los productos por medio de una destilación.
En la tabla 2 pueden verse los coeficientes de
distribución de pseudocumeno,
3,4-dimetilbencilalcohol,
3,4-dimetilbenzaldehído y ácido
3,4-dimetilbenzoico entre dioctilftalato y medio M9
como fase acuosa.
La cinética de este proceso de múltiples etapas
desempeña un papel decisivo en el proceso bifásico de
fed-batch, preferido de acuerdo con la invención
para la preparación de 3,4-dimetilbenzaldehído por
medio de E. coli recombinante que expresa XMO. De este modo,
se ha observado que el ácido 3,4-dimetilbenzoico
(DBA) se forma solo cuando la concentración del sustrato remanente
es muy baja (< 90 mM en la fase orgánica; corresponde a
aproximadamente 3,7 \muM en la fase acuosa). Además de la mayor
afinidad de la xilenomonooxigenasa por pseudocumeno que por el
aldehído correspondiente, un factor que probablemente también
contribuye con este fenómeno es la inhibición no competitiva del
tercer paso de oxidación por parte del pseudocumeno. En el caso de
concentraciones de pseudocumeno por encima de 150 mM en la fase
orgánica (correspondiente a aproximadamente 6.2 \muM en la fase
acuosa) pudo observarse simultáneamente una formación de alcohol
3,4-dimetilbencílico y una de
3,4-dimetilbenzaldehído. Sin embargo, a una
concentración de pseudocumeno de 150 se forma ante todo
3,4-dimetilbenzaldehído. La formación de ácido
3,4-dimetilbenzoico también se inhibe cuando la
concentración del alcohol en la fase acuosa excede la concentración
del aldehído.
Cuando E coli recombinante carecía de
actividad XMO se observó la reacción inversa de
3,4-dimetilbenzaldehído hasta alcohol
3,4-dimetilbencílico. Esto puede atribuirse a
actividades de dehidrogenasa no específicas para alcohol en la cepa
usada de E. coli. Tal como en el caso de BADH, en esta
reacción el equilibrio también está del lado del alcohol (Bühler,
Schmid et al. 2000).
La actividad enzimática depende también de la
concentración de glucosa en el medio. De esta manera, no solo las
altas concentraciones de glucosa en el medio sino también la
limitación de glucosa y la limitación de oxígeno tienen un efecto
inhibidor sobre la actividad enzimática.
Según una forma preferida de realización de la
invención, la cual se describe más detalladamente en los siguientes
ejemplos, se produjo 3,4-dimetilbenzaldehído a
partir de pseudocumeno en una reacción de múltiples etapas,
controlada cinéticamente, usando E. coli, en la que se usaron
recombinantemente los genes de la xilenomonooxigenasa de
pseudomonas putida mt-2. Esto se hace posible por la
habilidad de la xilenomonooxigenasa para catalizar la oxidación de
los xilenos hasta los ácidos correspondientes pasando por los
alcoholes y aldehídos correspondientes. La cinética de esta
reacción de varios pasos pudo utilizarse para concentrar el aldehído
específicamente. Usando un proceso bifásico de
fed-batch en el que el material de partida se
adiciona por una fase orgánica, se produjeron 484 ml (96,5%) de
3,4-dimetilbenzaldehído a partir de un cultivo de 30
litros a una escala piloto y se aislaron mediante centrifugación y
destilación.
Además, de acuerdo con la invención el medio de
cultivo usado para la conversión ha sido optimizado exitosamente
aún más y se han determinado y optimizado exitosamente parámetros
relevantes al proceso. También se demostró que el plásmido y los
genes de XMO quedaban estables por 60 horas y 14 generaciones son
presión de selección.
A partir de los resultados de arriba para la
conversión de pseudocumeno, el técnico en la materia puede, sin un
esfuerzo inaceptable, aplicar la enseñanza general de la invención a
la conversión biocatalítica de otros materiales de partida de la
fórmula I de arriba, usando opcionalmente otros microorganismos. En
este caso se toman en consideración especialmente modificaciones en
la calidad del medio de reacción (por ejemplo, búfer, nutrientes,
fase orgánica) y las condiciones de proceso (por ejemplo,
concentración de sustrato, condiciones de operación, tipo de
reactor, aireación, duración de la reacción), procesamiento de la
mezcla de reacción y similares.
La invención se ilustrará ahora por medio de los
siguientes ejemplos, no limitantes, de realización y haciendo
referencia a las figuras adjuntas. En ellas se muestra:
Figura 1: plásmido pSZP3, regulado por el
sistema regulatorio alk; alkBp, promotor del operón alk; alkS, gen
para el regulador positivo AlkS; xilM* y xilA, genes codificantes
para la xilenomonooxigenasa (* significa que se ha retirado un sitio
de corte Ndel en xilM); Km gen de resistencia contra kanamicina;
T4t, terminador transcripcional de fago T4.
Figura 2: peso seco de célula (CDW),
concentración de glucosa y de ácido acético en la fermentación con
solución de alimentación I con extracto de levadura.
Figura 3: concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación con solución de alimentación I con
extracto de levadura.
Figura 4: a) peso seco de célula, concentración
de glucosa y de ácido acético durante la fermentación con solución
de alimentación I sin extracto de levadura;
b) concentraciones de pseudocumeno, alcohol
3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación con solución de alimentación I sin
extracto de levadura.
Figura 5: peso seco de células, concentración de
glucosa y ácido acético durante la fermentación con concentración
elevada de sustrato.
Figura 6: Concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación con elevada concentración de
sustrato; la flecha indica la reducción simultánea en las ratas de
alimentación y aireación.
Figura 7: peso seco de células (CDW, por sus
siglas en inglés), concentración de glucosa y ácido acético durante
el registro de la curva de crecimiento de E. coli JM101 con
el medio de Riesenberg.
Figura 8: peso seco de células, concentración de
celulosa y ácido acético durante la fermentación con alta densidad
de células al iniciar el proceso de fed-batch.
Figura 9: Concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación con alta densidad de célula al
inicio del proceso de fed-batch; la flecha marca
adición de 1% (v/v) de pseudocumeno.
Figura 10: peso seco de células, concentración
de glucosa y ácido acético durante la fermentación con densidad
normal de células al inicio del proceso
fed-batch.
Figura 11: Concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación con densidad normal de células al
inicio del proceso de fed-batch.
Figura 12: peso seco de células, concentración
de glicerina y ácido acético durante la fermentación con glicerina
como fuente de carbono.
Figura 13: concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación con glicerina como fuente de
carbono.
Figura 14: Peso seco de células, concentraciones
de glicerina y ácido acético durante la fermentación con glicerina
como fuente de carbono y una mayor concentración de sustrato.
Figura 15: Concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico
y octano en la fase acuosa y orgánica durante la
fermentación con glicerina como fuente de carbono y mayor
concentración de pseudocumeno.
Figura 16: peso seco de células, concentración
de glucosa y ácido acético durante un cultivo repetitivo de
fed-batch, día 1.
Figura 17: concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante un cultivo repetitivo de fed-batch,
día 1.
Figura 18: peso seco de células, concenración de
glucosa y ácido acético durante un cultivo repetitivo de
fed-batch, día 2.
Figura 19: concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante el cultivo repetitivo de fed-batch,
día 2.
Figura 20: peso seco de células, concentración
de glucosa y ácido acético durante la fermentación a escala piloto a
pH 6.6; la flecha marca el ajuste del pH a 6.6.
Figura 21: concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación en la escala piloto.
Figura 22: peso seco de células, concentración
de glucosa y ácido acético durante la fermentación en la escala
piloto a pH 7.4.
Figura 23: Concentraciones de pseudocumeno,
alcohol 3,4-dimetilbenzílico,
3,4-dimetilbenzaldehído, ácido
3,4-dimetilbenzoico y octano en la fase acuosa y
orgánica durante la fermentación a escala piloto con pH 7.4.
Figura 24: Actividad específica y rata de
formación de aldehído durante la fermentación a escala pilo con pH
7.4; la flecha muestra la elevación del valor del pH a 7.4.
Figura 25: influencias de parámetros relevantes
para el proceso sobre el bioproceso P: pseudocumeno, DBAlk: alcohol
3,4-dimetilbenzílico, DBAld:
3,4-dimetilbenzaldehído, DBÁcido: ácido
3,4-dimetilbenzoico + efecto promotor; - efecto
inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
CDW Peso seco de células
DBAlk alcohol
3,4-dimetilbencílico
DBAld
3,4-dimetilbenzaldehído
DBÁcido ácido
3,4-dimetilbenzoico
DOP dioctilftalato
NAD+ \beta-nicotinamida
adeninadinucleotido, forma oxidada
NADH \beta-nicotinamida
adeninadinucleotido, forma reducida
P pseudocumeno (trimetilbenceno)
ppm partes por millón
rpm revoluciones por minuto
v/v volumen por volumen
w/v peso por volumen
XMO xilenomonooxigenasa
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- GC Fisons Instruments HRCG Mega 2 Series
- \quad
- Machery-Nagel, Önsingen, (CH)
- \quad
- Columna: columna capilar de silicona OPTIMA-5 (25 m; diámetro interno, 0,32 mm, espesor de película 0,25 \mum)
- \quad
- GC {}\hskip1cm HP 5890 Serie 2 GC Plus
- \quad
- Columna: columna capilar CARBOWAX 20M 25 m * 0.25 mm * 0.25 mm (Macherey-Nagel)
- \quad
- Espectrofotómetro {}\hskip0.5cm Novaspec II
- \quad
- Pharmacia LKB
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Reactor con agitación, de 3 litros Case, RU Groningen, (NL)
- \quad
- Reactor con agitación, de 42 litros New MBR, Zürich (CH)
- \quad
- Control: pH, temperatura, rata de agitación
- \quad
- Sistema operativo: OS/9
- \quad
- Registro de datos: Caroline II (PCS, Wetzikon CH)
\newpage
\global\parskip0.970000\baselineskip
- \quad
- Centrífugas {}\hskip0.5cm Cryofuge 8000
- \quad
- Heraeus Christ, Zürich (CH)
- \quad
- Bomba de vacío Typ D8B
- \quad
- Leybold-Heraeus, Zürich CH)
- \quad
- Aparatos refrigerantes 2219 Multitemp II Thermomatic Circulator
- \quad
- LKB Broma Multitemp 11
- \quad
- Aparato para vacío TypTR 216
- \quad
- Leybold Bakuum GmbH, Köln (De)
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos químicos usados para los
experimentos eran de grado analítico.
Para la determinación de las concentraciones de
glucosa, de glicerina, y del ácido acético se emplearon los
siguientes kits enzimáticos de prueba y se aplicaron según
indicaciones del fabricante (Sigma Diagnostics, Boehringer
Mannheim):
Kit de glucosa Sigma Diagnostics Glucosa
(Methode 315)
Glicerina prueba UV Boehringer Mannheim
Glicerina (Art. Nr. 148270)
Ácido acético prueba UV Boehringer Mannheim
ácido acético (Art. Nr. 148 261)
Glucosa prueba UV Boehringer Mannheim
Lactosa/D-glucosa (Art. Nr. 986 119)
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente cepa de bacterias se usó para los
experimentos de acuerdo con la invención:
E. coli JM101 F, [traD26 proAB+ lacllq,
\Delta(lacZ)M 15] pro AB/s upE,
thi-1 , \Delta(lac proAB) (Sambrook,
Fritsch et al. 1989)
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente plásmido se usó para los
experimentos de acuerdo con la invención (Figura 1): pSPZ3 alkS,
AlkBp, xylMA, ori pMB1; Kmr (Panke 1999)
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro: ácido clorhídrico a 1 M
- \quad
- 1.5 g MnCl_{2}*4H_{2}O
-----------------------------------------------
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro: ácido clorhídrico a 1M
- \quad
- 1.05 g ZnSO_{4}
- \quad
- 0.3 g H_{3}BO_{3}
- \quad
- 0.25 g Na_{2}MoO_{4}*2H_{2}O
- \quad
- 0.15 g CuCl_{2}*2H_{2}O
- \quad
- 0.84 g Na_{2}EDTA*2H_{2}O
- \quad
- 4.12 g CaCl_{2}*H_{2}O
- \quad
- 4.87 g FeSO_{4}*7H_{2}O
-----------------------------------------------
(al usar medio Riesenberg 8.87 g de
FeSO_{4}*7H_{2}O)
-----------------------------------------------
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro: 10 g de triptona
- \quad
- 5 g de extracto de levadura
- \quad
- 5 g de NaCl
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro: 25.5 g Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O
- \quad
- 9 g KH_{2}PO_{4}
- \quad
- 1 g NH_{4}Cl
- \quad
- 1 g NaCl
- \quad
- El pH se ajustó con NaOH a 7.4
- \quad
- Completado con: 0.5% (w/v) de glucosa
- \quad
- 2 ml MgSO_{4} (1M)
- \quad
- 1 ml tiamina (1% w/v)
- \quad
- 1 ml kanamicina (50 mg/ml)
- \quad
- 1 ml solución de elementos de traza US*
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro: 8.82 g KH_{2}PO_{4}
- \quad
- 10.85 g K_{2}HPO_{4}
- \quad
- 8.82 g Na_{2}HPO_{4}
- \quad
- 11.06 g Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O
- \quad
- 1 g NH_{4}Cl
- \quad
- 0.5 g NaCl
- \quad
- El pH se ajustó con NaOH a 7,1
- \quad
- Completado con: 0.5% (v/v) glucosa
- \quad
- 2 ml MgSO4 (1M)
- \quad
- 1 ml tiamina (1% w/v)
- \quad
- 1 ml kanamicina (50 mg/ml)
- \quad
- 1 ml solución de elementos de traza
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro 13.3 g KH_{2}PO_{4}
- \quad
- 4.0 g (NH_{4})2HPO_{4}
- \quad
- 1.7 g ácido cítrico
- \quad
- El pH se ajustó con NH_{4}OH a 6,8 y con NaOH a 7,1
- \quad
- Completado con: 0.7-2.5% (v/v) glucosa
- \quad
- o 0.7% (v/v) glicerina
- \quad
- 5 ml MgSO_{4} (1M)
- \quad
- 1 ml kanamicina (50 mg/ml)
- \quad
- 1 ml tiamina (1% w/v)
- \quad
- 5 ml-10 ml solución de elementos de traza
Los medios, así como las soluciones stock de
sulfato de magnesio y glucosa se autoclavaron. Las soluciones stock
de kanamicina y tiamina se esterilizaron por filtración.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro glucosa al 45% (w/v)
- \quad
- 9 g MgSO_{4}*7H_{2}O
- \quad
- (50 g de extracto de levadura)
- \quad
- El pH se ajustó con HCl a 3. No se usó extracto de levadura en todos los ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro: glucosa al 73% (w/v)
- \quad
- 19.6 g MgSO_{4}*7H_{2}O
- \quad
- La solución de alimentación se esterilizó y se filtró
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 1 litro dioctilftalato
- \quad
- 20-40 ml pseudocumeno
- \quad
- 10 ml octano
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 100 ml {}\hskip0.5cm 333 \mul NaAc de 3 M pH 5,8
- \quad
- 2 ml MnCl_{2} de 2.5 M
- \quad
- 100 \mul NaCl de 5 M
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- En 50 ml {}\hskip0.6cm 167 \mul NaAc de 3 M pH 5,8
- \quad
- 8.3 ml glicerina al 30% (w/v)
- \quad
- 3.5 ml CaCl_{2} de 1 M
- \quad
- 200 \mul MnCl_{2} de 2,5 M
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un matraz de agitación que contenía 50 ml de
medio LB se inoculó con 500 \mul de precultivo y se incubó por
una noche. Después de que se ha alcanzado un OD_{450} de 0,4, el
líquido de cultivo se distribuyó en tubos SS34 (40M) y se
centrifugó por 8 minutos a 8000 rpm a 4ºC. Se descartó el
sobrenadante. Las células se re-suspendieron en 8
ml de la solución 1 de arriba y se incubó sobre hielo por 20
minutos. Luego, se separaron las células de la solución 1 mediante
centrifugación por 8 minutos a 8000 rpm. A continuación se
resuspendieron en 800 \mul de la solución 2 de arriba sobre hielo
y se dividieron en tubos Eppendorg de a 100 \mul. Se almacenaron a
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el aislamiento de plásmido se empleó el
E.Z.N.A.® Plásmido Miniprep Kit I (peQLab Biotechnologie GmbH). 20
ml de medio LB que contenía 1% (w/v) de glucosa y 20 \mul de
kanamicina (50 mg/ml) se inoculó con una colonia de E. coli
JM101 transformada y se incubó por una noche a 37ºC. Después de la
incubación, el líquido de cultivo se dividió en 4 tubos de 15 ml y
se centrifugó. Los siguientes pasos de proceso se llevaron a cabo
tal como se especifica en el protocolo del Miniprep Kit I. La
cantidad del plásmido obtenido se estimó cuantitativamente mediante
electroforesis de gel.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de E. coli JM101 con el
plásmido pSPZ3 se logró mediante un choque de calor. Se
descongelaron 100 \mul de células competentes congeladas por 20
minutos. Después de la adición de 3 \mul de plásmido se incubaron
las células sobre hielo por 10-20 minutos. Luego, se
sometieron a un choque de calor a 37ºC por 3 minutos y, una vez ha
transcurrido el tiempo, se devuelve inmediatamente al hielo por
5-10 minutos. Después de la adición de 1 ml de
medio LB, las células se incubaron por 1 hora a 37ºC. Finalmente,
las células se pusieron en placas de agar LB que contenían 20 \mul
de kanamicina (50 mg/ml) y se incubaron a 37ºC por una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
El reactor con agitador usado para la
biotransformación comprende un volumen de 3 litros. La temperatura,
el pH y la velocidad de agitación pueden controlarse
automáticamente. El oxígeno disuelto en el medio (DOT) se midió por
medio de un electrodo de oxígeno y se graficó en dependencia del
tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Pre-cultivo 1: 4 ml de medio LB,
el cual contenía 1% (w/v) de glucosa y 4 \mul de kanamicina (50
mg/ml), se inocularon con una colonia de E. coli JM101
(pSPZ3) recientemente transformada y se incubó por una noche a 30ºC
agitándose.
Pre-cultivo 2: Se adicionó el
precultivo 1 a 100 ml de medio M9* que contiene 0,5% (w/v) de
glucosa o glicerina, 200 \mul de sulfato de magnesio (1 M), 100
\mul de solución de elementos de traza US*, 100 \mul de tiamina
(1% w/v) y 100 \mul de kanamicina (50 mg/ml) y se incubó durante
10-12 horas a 30ºC agitándose.
\vskip1.000000\baselineskip
900 ml de medio (M9 o medio de Riesenberg), que
había sido esterilizado junto con el bioreactor y completado con
tiamina, elementos de traza, glucosa o glicerina, sulfato de
magnesio y, cuando se indique, con antibióticos, se inocularon con
100 ml de pre-cultivo. La rata de agitación fue de
1500 rpm. También se ajustó la temperatura a 30ºC y el pH a 7,1
mediante adición de NH_{4}OH al 25% y ácido fosfórico al 25%. La
rata de aireación fue de 1 l/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del consumo de la glucosa adicionada y
la utilización del ácido acético producido por el metabolismo
bacteriano (aproximadamente 9-12 horas), se adicionó
al medio una solución de glucosa/- o glicerina/sulfato de magnesio
a la que en algunos casos se había adicionado extracto de levadura.
En los diferentes experimentos la introducción de glucosa varió
entre 4.5 g/h hasta 11.25 g/h. También se adicionaron 4 ml de la
solución stock de tiamina y 4 ml de la solución de elementos de
traza US*.
\vskip1.000000\baselineskip
Una hora después de iniciar el
fed-batch (proceso semicontinuo) fue
adicionada la fase orgánica (que contenía 10 ml de
n-octano como inductor y 20-40 ml de
pseudocumeno). Simultáneamente, se elevó la velocidad de agitación
a 2000 rpm. La alimentación de aire se elevó a 1,7 litros/ minuto al
aparecer una limitación de oxígeno (DOT < 10%) de las bacterias.
De necesitarse se elevaba la velocidad de agitación a 2500 rpm. La
biotransformación duró cerca de 15-30 horas.
Después de iniciar el proceso semicontinuo (fedbatch) se
tomaron y se analizaron muestras periódicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación a escala piloto se empleó
el reactor con agitador de 42 litros que se había indicado arriba.
La velocidad de agitación, la temperatura, el valor de pH y la
sobre-presión en el reactor se controlaron
automáticamente en el reactor. El reactor se controló
automáticamente por el sistema de operación OS/9 con el programa
Caroline II (PCS, Wetzikon, Suiza).
\vskip1.000000\baselineskip
Precultivo 1: 4 ml de medio LB que contenía 1%
(w/v) de glucosa y 4 \mul de kanamicina (50 mg/ml) se inoculó con
una colonia E. coli JM101 (pSPZ3) recientemente transformada
y se incubó por una noche a 30ºC agitándose.
Precultivo 2: El precultivo 1 se incubó en 100
ml y durante 10-12 horas a 30ºC agitándose.
Precultivo 3: El precultivo 2 se adicionó a 2 l
de medio M9* que comprendía glucosa o glicerina al 0,5% (w/v), 200
\mul de sulfato de magnesio (1 M), 100 \mul de solución de
elemento de traza US*, 100 \mul de tiamina (1% w/v) y 100 \mul
de kanamicina ( 50 mg/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
14 litros de medio Riesenberg se esterilizaron
en un reactor. Después de la esterilización, el medio se complementó
con elementos de traza, sulfato de magnesio, tiamina y 0,7% (w/v)
de glucosa. Se prescindió de la adición de kanamicina. El reactor
con agitación se inoculó con 1-1,5 litros de
precultivo. La rata de agitación fue de 400-600 rpm.
La rata de aireación fue de 20 l/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del consumo de la glucosa adicionada y
del ácido acético producido por las bacterias, se introdujo la
solución de alimentación II. La rata de alimentación fue de 180 g/h
al inicio pero se incrementó cuando se limitó la glucosa. Además,
se adicionaron 60 ml de tiamina (1% w/v), 60 ml de solución de
elementos de traza US* y 15 ml de n-octano para
inducción de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de una hora se adicionaron 15 litros de
dioctilftalato que comprendía 4,3% (v/v) de pesudocumeno y 1% (v/v)
de n-octano como fase orgánica. La rata de agitación
se incrementó a 1000 rpm. Así mismo, la rata de aireación se
incrementó a 40 l/min. Se tomaron muestras periódicamente y se
analizaron en su contenido de sustrato, producto, producto
secundario y octano. Así mismo, se determinaron el peso seco de
célula, la concentración de glucosa y la concentración de ácido
acético. La figura 7 muestra el transcurso del proceso de manera
esquemática.
\vskip1.000000\baselineskip
El coeficiente de distribución se define como la
concentración de la sustancias en la fase orgánica relativa a la
concentración de la sustancia en la fase acuosa. Para determinar los
coeficientes de distribución del medio Riesenberg con glicerina y
dioctilftalato se adicionaron diversas concentraciones de
pseudocumeno, alcohol 3,4-dimetilbencílico,
3,4-dimetilbenzaldehído y ácido
3,4-dimetilbenzoico a mezclas 1 : 1 de
dioctilftalato y medio de Riesenberg. El equilibrio de distribución
se estableció mediante agitación vigorosa e incubación por una
noche.
Las fases acuosa y orgánica se separaron
mediante centrifugación. Las fases orgánicas se diluyeron con éter
y la fase acuosa se extrajo y se analizó mediante GC. La
concentración en las 2 fases se determinó sobre la base de las
mediciones y se calcularon los coeficientes de distribución. En cada
caso la determinación se llevó a cabo por triplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fases acuosa y orgánica se separaron
mediante centrifugación a 20ºC. Luego, a las muestras se adicionó
éter enfriado con hielo con dodecano al 0,1 mM en calidad de
estándar interno. Después de la adición de una concentración
saturante de cloruro de sodio, se extrajo la fase acuosa mediante
agitación vigorosa por 1 minuto y a continuación se separaron las
fases mediante centrifugación. La fase orgánica se seca mediante
adición de sulfato de sodio y se analizó. El contenido de sustrato,
producto, productos secundarios y octano se determinó mediante GC
(Nagel, Oensingen, Suiza). Las muestras se inyectaron sin división
de flujo. Se usó hidrógeno como el gas portador. Para la medición
se empleó el siguiente programa de temperatura: 2 min a 40ºC; de 40
a 70ºC en una rata de calentamiento de 15ºC/min; de 70 a 105ºC a una
rata de calentamiento de 5ºC/min y de 105ºC a 280ºC a una rata de
calentamiento de 20ºC/min; 5 min a 280ºC. Los compuestos químicos
se midieron usando un detector de ionización de llama. Los datos de
sustrato, producto y productos secundarios se representaron en un
diagrama. Así mismo, la actividad específica y la rata de formación
de aldehído se representaron en un diagrama. Para este fin se
llevaron a cabo los siguientes cálculos:
Actividad
específica = unidad/g de peso seco de
célula
Una unidad es la actividad producida por 1
\mumol del producto total (DBAlk, DBAld, DBÁcido) en 1 minuto.
Rata de formación de aldehído = 1 \mumol de
aldehído formado por minuto/g de peso seco de célula
\vskip1.000000\baselineskip
Las células se separaron mediante centrifugación
a 4ºC. El volumen de la fase acuosa se registró en el tubo de
muestra y a continuación se quitó y se descartó el sobrenadante. La
pastilla de células se llevó a un volumen del medio equivalente a la
fase acuosa y se resuspendió allí. La densidad óptica se midió a 450
nm con la ayuda de un espectrofotómetro.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Las concentraciones de glucosa, glicerina y
ácido acético en la fase acuosa se determinaron con la ayuda de los
kits de ensayo de enzima indicados arriba.
b) Determinación de ácido acético mediante
GC
50 \mul de fase acuosa se trataron con 350
\mul de agua, 50 \mul de H_{3}PO_{4} (85%) y 50 \mul de
butirato de sodio de 100 mM como estándar interno. Este último se
analizó usando un HP 5890 Series 2 GC. El programa de temperatura
usado fue como sigue: 0.5 min a 85ºC, de 85-100ºC a
una rata de calentamiento de 12ºC/min, de 110-200ºC
en una rata de calentamiento de 79ºC/min, 2.5 min a 200ºC. Como gas
portador se usó helio.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras se centrifugaron y la fase
intermedia de las fases acuosa y orgánica se marcó sobre el tubo.
Se descartó el sobrenadante y la pastilla de células se
re-suspendió en un volumen de medio que era
equivalente a la fase acuosa. La muestra se diluyó y la solución se
cultivó en placas de agar LB, placas de agar LB con 20 \mul de
kanamicina (50 mg/ml) y placas LB con 20 \mul kanamicina (50
mg/ml) y 20 \mul de indol. Si las células expresan los genes XMO,
las colonias en las placas de agar indol LB se vuelven azules. Esto
puede explicarse por el hecho de que los genes XMO catalizan la
oxidación de indol a índigo. Las placas se incubaron por una noche a
30ºC y luego se contaron. Se compararon los números de gérmenes
vivos unos con otros.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de cosechar el contenido de reactor, se
separaron la fase orgánica de la fase acuosa por 15 minutos a 5000
rpm y 4ºC usando una centrífuga Heraeus. La fase acuosa se descartó
mientras que la fase orgánica se secó con sulfato de sodio (1 kg/15
l de fase orgánica) y se almacenó a 5ºC. El sulfato de sodio se
filtró (con papel filtro) antes del paso de destilación.
\vskip1.000000\baselineskip
La fase orgánica en el matraz se calentó a 200ºC
a un vació medio de entre 0.08 mbar y 0.15 mbar. El destilado se
dividió en tres fracciones; en una mezcla inicial
(110ºC-125ºC), una mezcla principal (120ºC -170ºC) y
una mezcla de cola (170ºC-200ºC). El vacío y la
temperatura se controlaron automáticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las biotransformaciones a escala de laboratorio
(ejemplos 1, 2 y 3) sirvieron por una parte para determinar y
optimizar los parámetros relevantes para el proceso y, por otra
parte, con el fin de optimizar el medio. El objetivo era
incrementar la cantidad de producción de
3,4-dimetilbenzaldehído (DBAld) durante la
biotransformación.
Además, se investigó la formación de ácido
acético que se produce por parte de las células como metabolito y
que se libera al medio. Esto inhibe el crecimiento de la biomasa en
el caso de una concentración demasiado alta. El uso de un nuevo
medio (medio de Riesenberg) estaba destinado para lograr mayor
densidad de células y de este modo una mayor actividad enzimática
por volumen. La variación de la solución de alimentación también
cuenta como una medida para optimizar el medio. Se emprendieron
biotransformaciones en las que no se adiciona extracto de levadura
a la solución de alimentación, puesto que éste contiene entre otros
ingredientes indefinidos que hacen difícil la reproducibilidad de
la biotransformación. Así mismo se ensayó el efecto de las dos
fuentes de carbono, glucosa y glicerina, en la actividad enzimática
y la formación de ácido acético.
Adicionalmente se investigó la estabilidad del
plásmido y del gene XMO sin presión de selección. De esa manera se
llevaron a cabo biotransformaciones sin kanamicina.
Para la producción de DBAld se ensayó un proceso
bifásico semicontinuo (fed-batch). Aquí el
proceso semicontinuo se inició después de un cultivo (batch),
seguido por la adición de la fase orgánica que comprendía el
sustrato y el inductor. Las figuras muestran los resultados
obtenidos desde el inicio del proceso semicontinuo. En las gráficas
que muestran las concentraciones de sustrato, producto, producto
secundario y octano, se adicionaron juntas las concentraciones de
las sustancias en las fases acuosa y orgánica. La actividad
específica se define como 1 \mumol del producto total formado
(DBAlk, DBAld y DBÁcido) en un minuto por gramo de peso seco de
célula.
Experimento
1.1
La biotransformación se llevó a cabo usando el
proceso de fermentación arriba descrito. Antes de la inoculación se
adicionó 0,5% (w/v) glucosa al medio. Después de cultivo (batch) la
biomasa alcanzó un peso seco de célula de 3.1 g/l. La rata de
alimentación fue de 10 g/h al comienzo del proceso semicontinuo,
correspondiente a una rata de alimentación de glucosa de 4,5 g/h.
Para prevenir una limitación de glucosa demasiado fuerte se
incrementó la rata de alimentación por pasos. La rata de aireación
se incrementó de 1 l/min hasta 1,7 l/ min después de 3 horas para
evitar una limitación de oxígeno.
En la figura 2 pueden verse los valores de
concentración de ácido acético y de glucosa y del peso seco de
células. El peso seco de células fue de 19 g/l después de alcanzar
la fase estacionaria. Para el momento cuando se detuvo el
crecimiento de bacterias, después de 8 horas, la concentración de
ácido acético fue de 10 g/l mientras que la concentración de glucosa
fue de 9 g/h.
En la figura 3 se muestran los cambios en las
concentraciones de pseudocumeno,
3,4-dimetilbenzaldehído (DBAlk), alcohol
3,4-dimetilbencílico (DBAlk), ácido
3,4-dimetilbenzoico (DBÁcido) y octano. La
concentración de pseudocumeno al adicionar la fase orgánica fue de
1.6% (v/v). Después de una fase de inducción de 1.5 horas se formó
ante todo 3,4-dimetilbenzaldehído. Al alcanzar una
concentración de sustrato de 90 mM comenzó a formarse DBÁcido.
Después de 10 horas se alcanzó una concentración de ácido de 22 mM
la cual permaneció constante por el resto de la biotransformación.
Sólo después de 10 horas se formó DBAlk. Al final de la
biotransformación después de 30 horas, la concentración de DBAld fue
de 43 mM y la de DBAlk fue de 20 mM.
Después de 4 horas la actividad específica así
como la rata de formación de aldehído alcanzaron valores máximos de
12.6 U/g CDW y 9.8 U/g CDW, respectivamente. Después, la rata de
formación de aldehído disminuyó fuertemente 5.5 horas después del
inicio del proceso semicontinuo; esto correspondió al punto en el
tiempo en el cual se inició la formación del ácido
3,4-dimetilbenzoico. Después de 8 horas la rata de
formación de aldehído volvió a aumentar.
Por medio de los resultados obtenidos puede
confirmarse que la formación de ácido
3,4-dimetilbenzoico seinicia a una concentración de
pseudocumeno de 90 mM.
Experimento
1.2
El objetivo de esta fermentación fue investigar
los efectos de la solución de alimentación I sin extracto de
levadura sobre la biotransformación.
En la figura 4a se representan los desarrollos
de la concentración de glucosa y de ácido acético y del peso seco
de células. La concentración de glucosa en el medio antes de la
inoculación fue de 0.5% (w/v). Al comienzo del proceso semicontinuo
el peso seco de células tenía una concentración de 3 g/l. La
solución de alimentación sin extracto de levadura se introdujo a
una rata constante de 10 g/h. Esto corresponde a una rata de
alimentación de glucosa de 4.5 g/h. Después de 7 horas la rata de
agitación se incrementó de 2000 rpm a 2500 rpm para evitar una
limitación de oxígeno (DOT >10%).
Incluso bajas concentraciones de glucosa
tuvieron como consecuencia una formación de ácido acético. De esta
manera, la concentración de ácido acético se mantuvo constante a un
valor de 1 g/l. Al elevar la concentración de glucosa en el medio,
la concentración de ácido acético aumentó continuamente hasta 26.6
g/l. Al final de la biotransformación, la concentración de biomasa
llegó a 12 g/l.
La concentración de sustrato en la fase orgánica
llegó a 1.6% (v/v) (figura 4b). 2 horas después de la adición de la
fase orgánica se inició la formación de
3,4-dimetilbenzaldehído. A partir de una
concentración de sustrato de 90 mM se formó principalmente DBÁcido,
mientra que la concentración de
3,4-dimetilbenzaldehído se mantuvo constante. Sólo
después detranscurridas 10 horas se inición la formación de DBAld y
alcanzó una concentración de 41 mM. Cuando la actividad enzimática
fue menor en la segunda parte de la biotransformación (desde las 15
horas) se formó DBAlk.
La actividad específica alcanzó 3 horas después
del inicio del proceso semicontinuo un valor máximo de 10 U/g CDW,
pero se derrumbó después de esto. Después de un aumento menor, la
actividad específica disminuyó continuamente después del inicio del
proceso semicontinuo de cultivo (fed-batch)
La rata de formación de aldehído alcanzó también un valor máximo de
7.1 U/g CDW después de 3 horas. Tal como en el experimento descrito
antes, se observó una caída en la formación de aldehído al inicio de
la formación de ácido 3,4-dimetilbenzoico.
Esta fermentación muestra que la omisión del
extracto de levadura tiene un efecto importante en el crecimiento
de la biomasa y la actividad enzimática. De esta manera, se logró
una concentración más baja de materia seca de célula durante el
proceso semicontinuo (fed-batch) que en el
experimento precedente. De manera similar se observaron una
actividad específica y una rata de formación de aldehído más bajas.
En comparación con el experimento precedente se observó una
disminución más lenta en la actividad específica. Así mismo, las
concentraciones de ácido acético en el medio fueron menores que en
el experimento precedente.
Experimento
1.3
En experimentos previos pudo establecerse que un
incremento en la concentración de sustrato tiene un efecto positivo
en la formación de 3,4-dimetilbenzaldehído. Así, la
concentración de sustrato se aumentó de 1.6% (v/v) a 3.1% (v/v).
Además, se ensayó mantener baja la concentración de glucosa y con
esto también la concentración de ácido acético en el medio. En la
segunda parte de la biotransformación, 15 horas después del inicio
del proceso semicontinuo de cultivo
(fed-batch) se investigó el efecto de una
fuerte limitación simultánea de glucosa y oxígeno. De esta manera se
redujeron simultáneamente el suministro de alimentación y la
aireación.
Antes de la inoculación se adicionó 0.5% (w/v)
de glucosa al medio. A partir de un peso seco de células de 3 g/l
la bio masa aumentó durante el proceso semicontinuo
(fed-batch) hasta una concentración de 27
g/l. ]Al comienzo del proceso semicontinuo
(fed-batch) la solución de alimentación con
extracto de levadura fue introducida a una rata de 10 g/h (rata de
introducción de glucosa 4.5 g/h). La rata de alimentación se
incrementó a continuación por etapas aunque se obtuvo limitación de
glucosa para prevenir una alta concentración de ácido acético en el
medio por un período prolongado. Esto incluso dio lugar a un
aprovechamiento del ácido acético (figura 5). Para prevenir
limitación de oxígeno se aumentó la rata de aireación desde 1
l(min hasta 1.5 l/min y la velocidad de agitación de 2000
rpm hasta 2500 rpm. Después de 16 horas se redujeron simultáneamente
la rata de alimentación y la rata de aireación lo que dio lugar a
una fuerte limitación de glucosa y oxígeno y a un aumento en la
concentración de ácido acético.
La biotransformación se inició con una
concentración de sustrato de 3.1% (v/v). Una hora después de la
inducción de las células se inició la formación de
3,4-dimetilbenzaldehído (BDAld) y alcohol
3,4-dimetilbenzílico (DBAlk). 16 horas después del
inicio del proceso semicontinuo (fed-batch),
después de la reducción de la rata de alimentación y de la rata de
aireación, pudo establecerse una formación inversa del DBAld a DBAlk
mediante alcoholdehidrogenasas no específicas de E. coli
(figura 6). La conzentración de DBAlk después de 30 horas fue de
130 mM mientras que la concentración de DBAld solo estuvo en 30 mM.
Durante la biotransformación pudo establecerse una formación baja de
ácido 3,4-dimetilbenzoico.
Después de alcanzar el valor máximo de la
actividad específica de 18.6 U/g CDW 8 horas después del inicio del
proceso semicontinuo, la actividad específica disminuyó. Esto puede
atribuirse en primer lugar a la detención del crecimiento de las
células en este punto de tiempo, por otra parte a la disminución en
la concentración de sustrato. La rata de formación de aldehído
alcanzó un valor máximo de 16 U/g CDW. Al contrario a la
fermentación con solución de alimentación I con extracto de
levadura y la fermentación en la que la solución de alimentación I
no se había complementado con extracto de levadura, no se observó
disminución en la actividad después de 5 horas.
La fermentación realizada ha demostrado que
concentraciones mayores de sustrato dan lugar a actividad enzimática
mayor. Puesto que fue posible mantener baja la formación de ácido
acético durante la biotransformación, se alcanzó una densidad mayor
de células durante el proceso semicontinuo (fedbatch). Debido
a los resultados obtenidos puede decirse que una limitación de
glucosa y oxígeno que ocurra simultáneamente da lugar a una pérdida
en la actividad de xileno monooxigenasa. Las
alcohol-dehidrogenasas no específicas de E.
coli convirtieron de vuelta el
3,4-dimetilbenzaldehído en alcohol
3,4-dimetilbencílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener una densidad mayor de células y con
esto una mayor actividad volumétrica se usó un nuevo medio
denominado en la literatura medio de alta densidad de células
(Riesenberg 1991). Este medio tiene menos sales de fosfato en
comparación con el medio M9 usado hasta ahora. Además, contiene más
nitrógeno ya que se usa amoníaco acuoso para ajustar el pH. La
solucion de alimentación II que se usó junto con el medio Riesenberg
no contenía extracto de levadura en comparación con la solución de
alimentación I.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
2.1
Para investigar la conducta de crecimiento de
E. coli JM101(pSZP3) y la formación del metabolito
ácido acético usando medio de Riesenberg se registró primero una
curva de crecimiento. La estabilidad del plásmido y de los genes de
XMO se verificó usando placas de agar indol y placas de agar
kanamicina. De este modo, es posible ensayar si el plásmido se pasa
a las siguientes generaciones y se expresa.
El medio de cultivo del lote (batch) contenía
2.5% (w/v) de glucosa. El cultivo duró 15 horas con la degradación
del ácido acético producido (figura 7). Después de la inoculación el
peso seco de células llegó a 0.18 g/l y se incrementó a 15 g/l a
una rata de crecimiento de 0.4 h^{-1}. Durante el cultivo del lote
se produjo 1 g/l de ácido acético.
El comportamiento de crecimiento de las células
al usar medio Riesenberg fue similar al caso cuando se usó medio
M9. Se observó una formación de ácido acético durante el cultivo del
lote. También, el período durante el cual el ácido acético fue
reutilizado por las bacterias fue relativamente corto. Por medio de
los números de colonias sobre las placas de agar LB, las placas de
agar LB con kanamicina y placas de agar LB con indol y kanamicina,
puede decirse que el plásmido y los genes de XMO permanecieron
estables. De este modo no se ha encontrado diferencia significativa
entre las colonias crecidas sobre diversas placas de agar LB. Así
mismo, fue positiva la reacción de color sobre placas de agar LB con
indol.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
2.2
Después del registro de la curva de crecimiento
se empleó medio Riesenberg en la biotransformación. Esto se hizo con
énfasis particular en el crecimiento de biomasa y en este contexto
también la formación de ácido acético.
El objetivo de la fermentación fue lograr una
mayor concentración de biomasa al final de la biotransformación
iniciando el cultivo en proceso semincontinuo
(fed-batch) con una densidad inicial alta de
células. Esto conduciría a un incremento en la actividad por volumen
durante la biotransformación.
Para lograr una densidad relativamente alta de
células después del lote de cultivo se complementó con 2.5%/w/v) en
lugar de 0.5% (w/v) de glucosa. Al inicio del cultivo semicontinuo
(fedbatch) la biomasa no continuó incrementándose de manera
fuerte y alcanzó una concentración máxima de 24.7 g/l.
Durante el cultivo semicontinuo
(fedbatch), se introdujeron constantemente 12.5 g/h de
solución de alimentación. Esto corresponde a una rata de
alimentación de glucosa de 9 g/h. Ya que las células ya se habían
sometido a limitación de oxígeno después de 2 horas y la velocidad
de agitación así como la rata de aireación ya se habían ajustado al
máximo, se aireó el reactor con oxígeno en lugar de aire. Con esta
medida fue posible mantener el oxígeno disuelto en el medio (DOT)
por encima de un valor de 10%. A partir de la hora 5 en adelante las
células ya no estuvieron sometidas a limitación de glucosa. La
concentración de glucosa permaneció constante a 2 g/l entre la hora
5 después del inicio del cultivo semi-continuo
(fedbatch) y la hora 15, pero aumentó después hasta 25 g/l.
Puesto que la concentración de glucosa en el medio era relativamente
alta, la concentración de ácido acético en el medio aumentó
continuamente y alcanzó un valor de 30 g/l al final del cultivo
semi-continuo (fedbatch).
Al comienzo del cultivo
semi-continuo al medio se adicionó 1 litro de fase
orgánica con una concentración de sustrato de 3.4% (v/v).
En la figura 9 puede verse que la formación de
alcohol 3,4-dimetilbenzílico inició inmediatamente.
La formación de 3,4-dimetilbenzaldehído inició
después de 2 horas. 11 horas después del inicio del cultivo
semi-continuo (fedbatch) se adicionó 1%
(v/v) más de pseudocumeno. Sin embargo, este pudo reaccionar solo
parcialmente. La concentración final de
3,4-dimetilbenzaldehído alcanzó 113 mM. El
pseudocumeno y el alcohol 3,4-dimetilbenzílico
tuvieron una concentración de 65 mM al suspenderse la
biotransformación. El ácido 3,4-dimetilbenzoico
apenas se formó.
3 horas después del inicio del cultivo
semi-continuo (fedbatch) se indujeron
completamente las células. La actividad específica (valor máximo 13
U/g CDW) y la rata de formación de aldehído (valor máximo 10 U/g
CDW) fueron bajas. La actividad específica disminuyó 4 horas después
del final del crecimiento de las células. Después de la adición de
sustrato se observó un aumento a 6 U/g CDW. La rata de formación de
aldehído también disminuyó fuertemente 4 horas después del final
del crecimiento y se mantuvo baja.
El inicio del cultivo semicontinuo
(fedbatch) con densidad inicial más alta de células no
condujo a densidad de células más alta en las condiciones
seleccionadas durante el cultivo semicontinuo. La biomasa solo
creció durante 3 horas. También pudo observarse una pérdida de
actividad enzimática. Durante el cultivo
semi-continuo (fedbatch) se formó mucho ácido
acético.
Experimento
2.3
En la fermentación precedente, a pesar de las
altas densidades de células al inicio del cultivo semicontinuo
(fedbatch), no pudo lograrse una densidad de células más
alta. La alta densidad inicial de células tuvo más bien influencia
negativa sobre la biotransformación. De esa manera la actividad
específica fue baja. También se registro un corto tiempo de
formación de aldehído. Por esta razón se inició el cultivo
semicontinuo (fedbatch) con pequeña densidad de células.
En lugar de 2.5% (w/v) de glucosa solo se
adicionaron 0.7% (w/v) de glucosa. A partir de una concentración de
biomasa de 4.1 g/l el peso seco de células alcanzó al final del
cultivo semi-continuo 22 g/l. La glucosa se
introdujo al bioreactor con una velocidad constante de 9 g/h. La
concentración de ácido acético llegó a cerca de 7 g/l después de 9
horas. A este punto de tiempo las bacterias se encontraron en la
fase estacionaria (figura 10).
Simultáneamente con el inicio del cultivo
semi-continuo (fedbatch) se adicionaron al
medio 0.1% (v/v) de octano. 1 hora más tarde se adicionó la fase
orgánica de con 4% (v/v) de pseudocumeno y 1% (v/v) de
n-octano. 2 horas después del inicio del cultivo
semi-continuo (fedbatch) las células se
indujeron completamente y comenzaron a acumularse alcohol
3,4-dimetilbenzílico- y
3,4-dimetilbenzaldehído en la fase orgánica.
Mientras que el alcohol se acumulaba inicialmente más rápido que el
aldehído, el 3,4-dimetilbenzaldehído se producía a
partir de una concentración de sustrato de 150 mM. A concentraciones
bajas de pseudocumeno el alcohol
3,4-dimetilbencílico se convertía en
3,4-dimetilbenzaldehído. La concentración final de
3,4-dimetilbenzaldehído llegó al final de la
biotransformación a 200 mM. A concentración más baja de pseudocumeno
y alcohol 3,4-dimetilbencílico se inició la
formación de ácido 3,4-dimetilbenzoico (figura
11).
La actividad específica llegó a 26 U/g CDW 3
horas después del inicio del cultivo semi-continuo.
Después descendió en paralelo con la concentración de sustrato.
Después de 5 horas la rata de formación de aldehído alcanzó el valor
máximo de 14 U/g CDW. Después disminuyó continuamente.
La concentración de sustrato y la densidad
inicial de células se seleccionaron de manera óptima para lograr
una conversión completa a 3,4-dimetilbenzaldehído.
Una densidad inicial de célula más baja dio lugar a una rata de
formación de aldehído de más tiempo. El medio Riesenberg, que no
contiene extracto de levadura en la solución de alimentación,
permite lograr la misma actividad específica y rata de formación de
aldehído que solo es posible al usar el medio M9 con extracto de
levadura en la solución de alimentación.
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Experimento
2.4
Es posible que el uso de glicerina como fuente
de carbono tenga algunas ventajas sobre la glucosa como fuente de
carbono. Así, puede esperarse una formación más baja de ácido
acético y una actividad enzimática mayor. Por esto es que se
investigó el efecto de glicerina como fuente de carbono en la
biotransformación.
Antes de la inoculación se adicionaron 0.7%
(v/v) de glicerina al medio. Al final del cultivo por lote la
biomasa tenía una concentración de 4.2 g/l. Tal como se esperaba se
observó un crecimiento más lento de la biomasa que al usar glucosa
como fuente de carbono. Después de que se haya alcanzado la fase
estacionaria el peso seco de célula fue de 19 g/l. Justo al
comienzo del cultivo semicontinuo (fedbatch) se adicionaron
0.1% (v/v) de octano al medio. Después de una rata de alimentación
inicial de 7.7 g/h (rata de alimentación de glicerina de 7.2 g/h),
la rata de alimentación se incrementó por pasos para prevenir
lalimitación de glicerina. La formación de ácido acético comenzó
solo durante la fase
estacionaria después de 9.5 horas y alcanzó un valor de 18 g/l al final del cultivo semi-continuo (fedbatch) (figura 12).
estacionaria después de 9.5 horas y alcanzó un valor de 18 g/l al final del cultivo semi-continuo (fedbatch) (figura 12).
La concentración de sustrato llegó a 4% (v/v) al
adicionar la fase orgánica. Se produjo alcohol
3,4-dimetilbencílico justo desde el comienzo. A
partir de una concentración de pseudocumeno de 240 mM se produjo
exclusivamente 3,4-dimetilbenzaldehído. El alcohol
3,4-dimetilbenzílico se convirtió directamente a
aldehído. La formación de ácido comenzó a una concentración de
sustrato alrededor de 150 mM. Como puede verse de la figura 13, la
concentración final de 3,4-dimetilbenzaldehído fue
de 144 mM.
La rata máxima de formación de
3,4-dimetilbenzaldehído fue muy alta (32.7 U/g CDW).
La actividad específica total alcanzó un valor de 33 U/g CDW. Sin
embargo, las altas actividades no se mantuvieron por mucho tiempo.
Ya después de 11 horas la rata específica de formación de aldehído
aún era de 2.5 U/g CDW.
De estos resultados se concluye que usar
glicerina como fuente de carbono dio como resultado que se lograron
actividades enzimáticas más altas desde 30 U/g CDW. No obstante, la
actividad se mantuvo solamente durante el crecimiento de la
biomasa.
Además de la actividad enzimática más alta se
observó otra cinética en comparación con el caso cuando se usó
glucosa como fuente de carbono. De este modo, la sola acumulación de
3,4-dimetilbenzaldehído en el medio se establece ya
a una concentración de pesudocumeno de 240 mM en contraposición a la
concentración de 150 mM al usar glucosa como fuente de carbono. La
formación de ácido 3,4-dimetilbenzoico comienza
también a una concentración de 150 mM, la cual comenzó solo a 90 mM
cuando se usó glucosa como fuente de carbono.
Experimento
2.5
En la fermentación de acuerdo con el experimento
2.4 pudo observarse que ya a una concentración de pesudocumeno de
240 mM se presentaba una detención en la acumulación de alcohol
3,4-dimetilbencílico en el líquido de cultivo. De
esta manera parecía posible iniciar la biotransformación a una
concentración de pseudocumeno más alta y alcanzar una concentración
final más alta de 3,4-dimetilbenzaldehído
(DBAld).
La concentración de glicerina al inicio del
cultivo de lote fue de 0.7% (v/v). Al inicio el peso seco de células
llegó a 4.4 g/l y al final del cultivo semicontinuo
(fedbatch) 25 g/l (figura 14). Se alimentó glicerina a una
rata de 3.7 g/l al inicio del cultivo semicontinuo
(fedbatch). La rata se elevó después por etapas. No se formó
ácido acético hasta la hora 10. Sin embargo, esta sustancia se
acumuló hasta el final del experimento hasta una concentración de
26.7 g/l en el medio.
La concentración de pseudocumeno (en la fase
orgánica) fue de 5.3% (v/v). Al principio se observó la formación
simultánea de alcohol 3,4-dimetilbenzílico (DBAlk) y
3,4-dimetilbenzaldehído (DBAld). A partir de una
concentración de pseudocumeno de 300 mM hasta 150 mM se formó y se
anuló ante todo DBAld. La formación de ácido
3,4-dimetilbenzoico (DBÁcido) comenzó a partir de
una concentración de pseudocumeno de 150 mM. La concentración final
de DBAlk fue de 80 mM mientras que la concentración final de DBAld
fue de 212 mM (figura 15).
Las actividades enzimáticas fueron altas como en
la primera fermentación con glicerina. La actividad específica (1
\mumol de producto total (DBAlk, DBAld y DBÁcido) que se forma en
1 minuto/g de CDW) alcanzó un valor de 46 U/g de CDW. La rata de
formación específica de 3,4-dimetilbenzaldehído fue,
después de 5 horas, de 22 U/g CDW. La actividad pudo mantenerse
también en esta fermentación solo durante el crecimiento de la
biomasa.
La elevación de la concentración de sustrato no
tiene ninguna influencia sobre la concentración final de
3,4-dimetilbenzaldehído ya que la duración de
actividad no puede mantenerse por tiempo prolongado. La
concentración de alcohol 3,4-dimetilbencílico fue
alta al final del cultivo semicontinuo (fedbatch).
Para vigilar la actividad de las células en
ausencia de kanamicina por un período prolongado se llevaron a cabo
dos experimentos de cultivo semi-continuos
(fedbatch) consecutivos; 10 ml del primer cultivo
semi-continuo actuaron como inóculo para el segundo
cultivo semi-continuo. El propósito era estudiar la
estabilidad del plásmido y de los genes XMO por varias generaciones
sin presión de selección. Se usó glucosa como fuente de carbono. Al
inicio de la alimentación se adicionaron 4 ml de la solución stock
de tiamina (1% w/v) y 4 ml de la solución de elemento de traza
US*.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Precultivo 1: se inoculan 4 ml de medio LB (1%
de glucosa (w/v), 4 \mul de kanamicina (50 mg/ml)) con células
recientemente transformadas y se incuban a 37ºC por una noche.
Precultivo 2: se inoculan 100 ml de medio M9*
(0.5% glucosa (w/v), 200 \mul de sulfato de magnesio, 100 \mul
de solución de elementos de traza US*, 100 \mul de tiamina (1%
w/v), 100 \mul de kanamicina (50 mg/ml)) con 4 ml de precultivo 1
y se incuban a 30ºC por 10-12 horas.
Se inoculan 900 ml de medio que están contenidos
en el bioreactor con 100 ml de precultivo. Después del cultivo de
lote (9-12 h) se inicia el cultivo semicontinuo
(fed-batch) introduciendo continuamente una
solución de alimentación. 1 hora más tarde se adiciona al
bio-reactor 1 l de fase orgánica (DOP), en la cual
está contenido el sustrato (P) y el inductor (octano). Después de
15 horas se recolecta el líquido de cultivo hasta un volumen de 10
ml, el cual sirve como inóculo para el segundo cultivo semicontinuo
(fedbatch). Se adicionan 900 ml de medio al
bio-reactor. De nuevo, se lleva a cabo una
biotransformación exactamente como se describió para el primer
cultivo semicontinuo (fedbatch).
Experimento
3.1
Antes de la inoculación la concentración de
glucosa fue de 0.7% (w/v). Al inicio del cultivo
semi-continuo (fedbatch) se adicionaron 0.1%
(v/v) de octano al medio para inducir las células. Al inicio del
cultivo semi-continuo se adicionaron 0.1% (v/v) de
octano al medio para la inducción de las células. Antes del inicio
del cultivo semicontinuo (fedbatch) la biomasa fue de 4.5 g/l
y creció durante el cultivo semicontinuo (fedbatch) hasta 28
g/l (figura 16). La rata de alimentación de glucosa al comienzo del
cultivo semi-continuo fue de 9 g/h y se elevó a
continuación por etapas. La concentración de ácido acético al final
del cultivo semicontinuo fue de 25 g/l.
La biotransformación se inició con una
concentración de sustrato de 4% (v/v). El desarrollo de
concentración de pseudocumeno, alcohol
3,4-dimetilbencílico (DBAlk),
3,4-dimetilbenzaldehído (DBAld), ácido
3,4-dimetilbenzoico (DBÁcido) y octano se
representan en la figura 17. Primero, se observó una formación de
3,4-dimetilbenzaldehído y una formación de alcohol
3,4-dimetilbencílico. Después de 6.5 horas después
del inicio del cultivo semi-continuo a una
concentración de sustrato de 150 mM se formó ante todo DBAld. La
formación de ácido empezó después de 12.5 horas. La concentración
de 3,4-dimetilbenzaldehido al final de la
biotransformación fue de 220 mM y la de DBAlk fue de 14 mM. Durante
el cultivo semi-continuo el pseudocumeno pudo
utilizarse hasta una concentración de 13 mM.
3 horas después del inicio del cultivo
semicontinuo la actividad específica llegó a 27 U/g CDW. La rata de
formación de aldehído después de 5 horas alcanzó un valor máximo de
16 U/g CDW. La actividad enzimática pudo mantenerse la misma por 15
horas.
Experimento
3.2
La concentración de glucosa antes de la
inoculación fue de 0.7% (v/v). Después del cultivo la biomasa fue
de 4.5 g/l y al final del cultivo semicontinuo alcanzó una
concentración de 28 g/l. La rata de alimentación de glucosa era al
inicio de 9 g/h, aunque se elevó en el caso de una limitación de
glucosa demasiado fuerte. La concentración de ácido acético al
final de la biotransformación fue de 44 g/l (figura 18).
1 hora después del inicio del cultivo
semi-continuo se adicionó al medio la fase orgánica
en la que había una concentración de sustrato de 4% (v/v). El
desarrollo de concentración de pseudocumeno, DBAld, DBAlk y DBÁcido
fue similar al del cultivo semicontinuo en el día 1 (experimento
3.1). Por encima de una concentración de pseudocumeno de 150 mM
pudo establecerse una formación simultánea de DBAld y DBAlk. Si las
concentraciones de sustrato estaban por debajo de un valor de 150
mM ante todo se formaba DBAld hasta una concentración final de 220
mM. La formación de DBÁcido se inició después de 12.5 horas. La
concentración final de DBAlk fue de 30 mM y la del DBÁcido 13 mM
(figura 19).
La actividad específica en el segundo cultivo
semi-continuo alcanzó un valor máximo idéntico al
del cultivo semi-continuo del día 1 (experimento
3.1) de 27 U/g CDW. Así mismo la rata de formación de aldehído
alcanzó un valor máximo idéntico de 16 U/g CDW. La actividad
enzimática pudo mantenerse por 15 horas.
Ambas biotransformaciones proporcionaron
resultados similares cuando no incluso idénticos. De este modo
pudieron establecerse actividades específicas y ratas de formación
de aldehído altas en ambos cultivos semicontinuos
(fedbatch). Así mismo, pudieron alcanzarse concentraciones
idénticas de 3,4-dimetilbenzaldehído al final de
ambas biotransformaciones. La actividad enzimática pudo mantenerse
igual en el caso de ambos cultivos semi-continuos
por 15 horas. La estabilidad del plásmido era muy alta. Así
permaneció por 60 horas y 14 generaciones también sin presión de
selección. No pudieron establecerse diferencias significativas del
número de colonias sobre las placas de agar LB y las placas de agar
LB con kanamicina.
La biotransformación se llevó a cabo a escala
piloto después de la finalización de los experimentos a escala de
laboratorio (ejemplos 4, 5). Para esto se empleó un reactor con
agitación de 42 litros. El volumen de la mezcla que estaba
compuesta de partes iguales del medio Riesenberg y de fase orgánica
con una concentración de sustrato de 4.3% (v/v) era de 30 litros.
Antes de la inoculación al medio se adicionaron 0.7% (w/v) de
glucosa. Se prescindió de la adición de kanamicina como ya se había
hecho en el cultivo semi-continuo (fedbatch)
repetitivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes del inicio del cultivo semicontinuo el
peso seco de células era de 4 g/l. La concentración final fue sin
embargo de solo 14.5 g/l. 2 horas después de la inducción tenía el
valor de pH era de solo 6.6 en lugar de 7.1, debido a un error en
el control de pH. En este punto de tiempo se observó que el
crecimiento de células se había detenido. La rata de alimentación
de glucosa fue de 135 g/h (w/v). Las células no se sometieron a
limitación de glucosa durante la biotransformación. La concentración
de ácido acético se incrementó constantemente hasta una
concentración final de 47 g/l (figura 20).
La concentración de sustrato en los 15 litros
de fase orgánica fue de 4.3% (v/v). La formación de alcohol
3,4-dimetilbencílico (DBAlk) se inició 2 horas
después de inducción de las células (figura 21). La formación de
3,4-dimetilbenzaldehído comenzó solo 4 horas después
de la inducción de las células. Después de 26 horas la
concentración de 3,4-dimetilbenzaldehído fue de 130
mM y la del alcohol 3,4-dimetilbenzílico fue de 100
mM. La formación de ácido 3,4-dimetilbenzoico fue
muy baja. De esta manera la concentración final fue solo de 2
mM.
El bajo valor de pH influyó no solo el
crecimiento de células sino también la actividad enzimática. Debido
a la reducción de pH la rata específica de formación de aldehído era
baja al principio de la biotransformación. Sin embargo, después de
4 horas a pH 7,1 se recuperó y alcanzó un valor de 12 U/g CDW. La
actividad total específica alcanzó el valor máximo de 32 U/g CDW
después de 7 horas después del inicio del cultivo semicontinuo.
La reducción temporal de pH tuvo un efecto
potente sobre el crecimiento de biomasa y actividad enzimática. En
comparación con las fermentaciones precedentes la biomasa alcanzó
una baja concentración. La actividad volumétrica (U/l) era
correspondientemente baja durante la biotransformación.
La cinética del proceso de múltiples etapas era
sin embargo la misma que en el caso de las biotransformaciones a
escala de laboratorio. De este modo, a una concentración de
pseudocumeno de 150 nM también se formó alcohol
3,4-dimetilbenzílico.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la fermentación precedente no produjo
el rendimiento esperado de 3,4-dimetilbenzaldehído
se repitió el experimento. Durante la biotransformación se elevó el
valor de pH a 7.4. Con esto también fue posible verificar la
influencia de un valor de pH elevado sobre la biotransformación.
Después del cultivo el peso seco de células fue
de 3.5 g/l. La densidad de células se incrementó durante el cultivo
semi-continuo (fedbatch) hasta un valor de 20
g/l. Puesto que la glucosa no fue nunca limitante en el medio, la
concentración de ácido acético aumentó continuamente en el medio
(figura 22). La concentración de ácido acético después de la
biotransformación fue de 45 g/l. Ya una hora después de la adición
de la fase orgánica se mezcló oxígeno al suministro de aire para
prevenir limitación de oxígeno. Hasta la hora 6 de
biotransformación, el DOT se mantuvo a un valor de entre 15% y 25%.
Después el contenido de oxígeno disuelto en el medio fue de entre
25% y 40%.
El desarrollo de la concentración de
pseudocumeno, alcohol 3,4-dimetilbencílico (DBAlk),
3,4-dimetilbenzaldehído (DBAld) y ácido
3,4-dimetilbenzoico (DBÁcido) durante la
biotransformación pueden compararse con el desarrollo los
desarrollos de las fermentaciones a escala de laboratorio. A una
concentración de pseudocumeno de 150 mM en el líquido de cultivo
ante todo se acumula 3,4-dimetilbenzaldehído. A
partir de una concentración de sustrato de 4.8% (v/v) la
concentración de pseudocumeno al final de la fermentación fue de 3
mM. La concentración final de DBAlk fue de 4 mM y la del DBÁcido
fue de 12 mM. La formación de ácido
3,4-dimetilbenzoico inicio apenas después de 9
horas. DBAld se produjo durante la biotransformación hasta una
concentración final de 275 mM. 78.6% del sustrato adicionado se
convirtió en DBAld (figura 23). Sin embargo, se registró una pérdida
de 16% de pseudocumeno durante el cultivo semicontinuo. De esta
manera, cuando se recolectaron finalmente los contenidos del reactor
los porcentajes mostrados en la tabla 3 estaban presentes en la fase
orgánica.
Los altos valores de la actividad específica (51
U/g CDW) así como la rata de formación de aldehído (30 U/g CDW)
fueron logrados aumentando el pH de 7.1 a 7.4 tres horas después de
la adición de la fase orgánica. La figura 24 es una representación
gráfica de los desarrollos de la actividad total específica y la
rata de formación de aldehído. Así, cuando el pH aumentó, después
de 3 horas se observó un incremento marcado en la actividad
específica y la formación específica de aldehído.
El sustrato adicionado se convirtió en un alto
porcentaje en 3,4-dimetilbenzaldehído mientras que
solo se formaban pequeñas cantidades de los productos secundarios
alcohol 3,4-dimetilbencílico y ácido
3,4-dimetilbenzoico. El aumento del valor pH tuvo
en efecto positivo en la actividad enzimática. De este modo, después
de aumentar el pH se alcanzaron valores de actividad específica y
de ratas de formación de aldehído marcadamente más altas.
El proceso bifásico semicontinuo
(fedbatch) desarrollado a escala de laboratorio se aplicó con
éxito a las condiciones a escala de piloto.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de finalizar la biotransformación a
escala piloto se recolectó el contenido del bioreactor. La fase
acuosa y la fase orgánica se separaron mediante centrifugación. A
continuación la fase orgánica se secó adicionando sulfato de sodio
y luego se separó. Para separar el
3,4-dimetilbenzaldehído del ftalato de dioctilo se
empleó destilación a medio vacío. El vacío se controló entre 0.08
mbar y 0.15 mbar. A una temperatura del ftalato de dioctilo de
110ºC-120ºC comenzó a destilarse el
3,4-dimetilbenzaldehído.
Pudieron obtenerse 484 ml del destilado durante
la destilación de 14 litros de ftalato de dioctilo. El destilado
estaba compuesto en su 96.5% de
3,4-dimetilbenzaldehído, 0.3% de alcohol
3,4-dimetilbencílico, 2.8% de ftalato de dioctilo,
0.3% de pseudocumeno y 0.04% de octano.
\vskip1.000000\baselineskip
Un parámetro importante en la producción de
3,4-dimetilbenzaldehído por medio de un proceso
biocatalítico es la actividad de la enzima. El nivel y la duración
de la actividad enzimática son de un significado decisivo en este
caso.
Como ya se mostró, la concentración de glucosa y
el suministro de oxígeno de las células tienen una influencia en la
actividad de la enzima. De este modo, una concentración de glucosa
por encima de 10 g/l en el medio tiene un efecto inhibitorio sobre
la actividad enzimática. Sin embargo, una limitación demasiado
fuerte de glucosa tiene un efecto negativo sobre la productividad
del catalizador.
En este trabajo se ha mostrado que en el caso de
una limitación simultánea de glucosa y oxígeno la xileno
monooxigenasa suspende la catálisis y
alcohol-dehidrogenasas no específicas de E.
coli hacen que el 3,4-dimetilbenzaldehído se
convierta de nuevo en alcohol 3,4-dimetilbencílico
(figura 6).
Cuando ocurrieron limitaciones de oxígeno o
glucosa individualmente y no fueron demasiado fuertes, no se
observaron influencias negativas en la actividad (figuras 16 y
18).
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de sustrato tiene también una
influencia en la actividad de la enzima y, a una concentración de
pseudocumeno por debajo de 150 mM en la fase orgánica, también sobre
la formación de 3,4-dimetilbenzaldehído. Así, una
baja concentración de pseudocumeno da lugar a una baja actividad
enzimática. A una concentración de pseudocumeno por encima de 150
mM, solo el primer paso del proceso de múltiples etapas, la
formación de alcohol 3,4-dimetilbencílico (DBAlk),
depende de la concentración de sustrato.
A una concentración inicial de pseudocumeno de
menos de 150 mM pudo observarse ante todo una formación de
3,4-dimetilbenzaldehído (DBAld). Esta es la razón
por la cual no se acumuló alcohol
3,4-dimetilbenzílico en el líquido de cultivo
(figura 3). Por esta razón se formó ácido
3,4-dimetilbenzoico (DBÁcido) de manera aumentada a
partir de una concentración de pseudocumeno de 90 mM. La formación
de alcohol 3,4-dimetilbenzílico que comenzó más
tarde puede atribuirse al hecho de que la actividad de la enzima era
muy baja en ese punto del tiempo.
Sin embargo, si la concentración inicial excedía
150 mM, al principio se podía observar la acumulación simultánea de
alcohol 3,4-dimetilbenzílico y de
3,4-dimetilbenzaldehído en la fase orgánica. Si la
concentración de pseudocumeno caía a 150 mM se formaba ante todo
DBAld. La formación de DBÁcido iniciaba al final de la
biotransformación cuando el DBAlk prácticamente ya se había
convertido completamente en DBAld (figuras 11, 23). Esto confirma el
efecto inhibitorio de DBAlk sobre la formación de ácido
3,4-dimetilbenzoico.
Concentraciones iniciales de pseudocumeno aún
más altas pueden conducir a una acumulación pronunciada de alcohol
3,4-dimetilbenzílico en la fase acuosa. Si la
concentración de alcohol 3,4-dimetilbenzílico en la
fase acuosa excede un valor de 100 mM, éste tiene una efecto tóxico
en las células.
Si bien al usar glicerina como fuente de carbono
las actividades fueron un poco más altas, no se formó más producto
al final (figura 12 y figura 15). Además, en la fase orgánica se
acumularon más altas de productos secundarios. Esto puede
atribuirse a la corta duración de la actividad, entre otras. De esta
manera, se observó actividad enzimática solo durante el crecimiento
de la biomasa. Cuando se alcanzó la fase estacionaria se observó
que la actividad se caía inmediatamente. Por el contrario, al usar
glucosa como fuente de carbono, se observó actividad de la enzima
hasta en la fase estacionaria. Además se observó que al usar
glicerina como fuente de carbono el alcohol
3,4-dimetilbencílico formado inhibe menos la
formación de ácido 3,4-dimetilbenzoico que en el
caso de usar glucosa como fuente de carbono (figura 15).
Un aumento del valor de pH tiene una influencia
positiva en la actividad enzimática. De esta manera se logró un
incremento marcado en la actividad específica y en la rata de
formación de aldehído al llevar a cabo la fermentación a un pH de
7.4 en lugar de 7.1 (figura 24). Cuando se ajustó el pH a 7.1 en las
fermentaciones en las que se usó glucosa como fuente de carbono, la
rata máxima de formación de aldehído fue de 16 U/g CDW. A un pH de
7.4 se logró una rata de formación de aldehído marcadamente superior
de 30 U/g CDW. Un pH de 6.6 tuvo un efecto marcadamente negativo
sobre la actividad (productividad) de la enzima.
3,4-dimetilbenzaldehído se
produce de acuerdo con la invención por E. coli JM101 (pSZP3)
recombinante. El plásmido pSZP3 se desarrolló por Panke (1999).
Para garantizar que el plásmido se mantenga en las bacterias éste
lleva un gen de resistencia que le confiere resistencia frente al
antibiótico kanamicina. La adición de antibiótico no es deseable en
los procesos a escala industrial por razones comerciales y
ambientales. Esta es la razón por la cual se llevaron a cabo
experimentos en los que la estabilidad de plásmido se verificaba sin
presión de selección por kanamicina. Tal como se ha demostrado por
el cultivo repetitivo, el plásmido y los genes XMO se mantienen
estables por 60 horas. Esto significa que el plásmido se mantiene y
los genes XMO se expresan por 14 generaciones.
Si un proceso biológico va a ser explotado
comercialmente, el medio debe cumplir con ciertos requisitos. De
esta manera, el medio debe ser lo más definido posible. Es decir, no
debe comprender componentes cuyas concentraciones no puedan
determinarse exactamente y que puedan constituir un riesgo para la
pureza del producto. Así, debe prescindirse en lo posible de
componentes indefinidos tales como extracto de levadura o
peptona.
La obtención de densidades altas de células en
bioprocesos tiene una gran influencia en la rentabilidad del
proceso. Así, un proceso con alta densidad de células puede tener
las siguientes ventajas: volumen menor del reactor, preparación y
procesamiento menos complicados, y una actividad volumétrica
considerablemente más alta. Sin embargo, un proceso que involucra
altas densidades de células también se ve afectado con problemas.
Deben adicionarse altas cantidades de nutrientes y el suministro de
oxígeno es difícil debido a la alta densidad de células. Además,
cultivos con alta densidad de células pueden inhibirse por parte de
productos secundarios metabólicos tales como etanol, acetato y
lactato, los cuales se forman en condiciones anaeróbicas, por
ejemplo. En condiciones de cultivo aeróbico también, E. coli
puede formar ácidos y otros productos secundarios metabólicos que
se acumulan en el edio. A un pH de 7, el ácido acético tiene u
efecto inhibitorio sobre el crecimiento de las células ya a una
concentración de 5 g/l. Esta es la razón por la que en un
bioprocesos debe evitarse una formación demasiado grande de
ácido.
Riesenberg (1991) desarrolló un medio definido
que no comprende glucosa ni sulfato de magnesio en una etapa
inicial. Se distingue por una baja formación de ácido acético en
condiciones ilimitadas de cultivo aeróbico. Usando este medio con
E. coli se alcanzaron densidades de células de 110 g/l
(Riesenberg 1991).
Puesto que al usar medio M9 solo se alcanzaron
densidades de célula de 20-27 g/l con extracto de
levadura en la solución de alimentación, la biotransformación se
llevó a cabo usando medio de Riesenberg. Tal como se muestra en la
figura 8, puede lograrse una alta densidad de célula en el cultivo
con una concentración adecuada de glucosa. La formación de ácido
acético era idéntica a concentraciones obtenidas por Riesenberg,
Schulz et al. (1991). De esta manera se formó aproximadamente
1 g/l de ácido acético. Se llevó a cabo una biotransformación a
partir de un peso seco de célula de 16 g/l. A pesar de la abundancia
de oxígeno se observó una pronunciada formación de ácido acético lo
que finalmente tuvo un efecto sobre el crecimiento de la biomasa.
Así, se obtuvo un peso seco de célula de sólo 24.7 g/l (figura 8).
Se observó formación de ácido acético incluso a bajas
concentraciones de glucosa (figura 4). Esto puede ser atribuible a
la formación de xileno monooxigenasa, la cual inhibe el crecimiento
de E. coli (Bühler, Schmid et al. 2000).
Al usar glicerina como fuente de carbono en
lugar de glucosa se acumuló menos ácido acético en la fase acuosa
(figuras 10 y 12).
El suministro de oxígeno de las células en un
cultivo con alta densidad de célula es problemático. A esto se le
suma el hecho de que la enzima usada para la biotransformación, es
decir la xileno monooxigenasa, requiere oxígeno para la catálisis
de las sustancias (Bühler, Schmid et al. 2000). El sistema de
reactor se usó a capacidad plena con respecto a la rata de
agitación y aireación incluso cuando en las fermentaciones se obtuvo
el peso seco de célula de menos de 30 g/l. Esta es la razón por la
que debió usarse una mezcla de oxígeno-aire para la
aireación a escala piloto para poder suministrar suficiente oxígeno
a las células.
El medio de Riesenberg se distingue del medio M9
por su composición menos costosa. Además, se prescindió del
extracto de levadura en la solución de alimentación y los problemas
relacionados con el mismo durante el proceso en el caso de la
purificación de producto (formación de espuma, separación de
fases).
Cuando se prescindió de extracto de levadura en
la solución de alimentación y se usó medio M9 se observaron efectos
adversos en la biomasa. Así, el peso seco de célula al final del
cultivo semicontinuo (fedbatch) fue solo de 12 g/l (figura
4). Por lo contrario, se lograron densidades de células de 25 -30
g/l con el medio Riesenberg. La rata más lenta de crecimiento de la
biomasa que se obtuvo al usar medio M9 puede atribuirse a la
concentración más naja de amonio en comparación con el medio de
Riesenberg.
En el marco de la invención se determinaron y se
mejoraron parámetros relevantes para el proceso. En la figura 25 se
encuentran representados esquemáticamente los diferentes parámetros
y sus influencias en el proceso total.
Como ya se ha descrito, el oxígeno disuelto y la
concentración de glucosa en el medio tienen un efecto sustancias
sobre el nivel y la duración de la actividad. Las concentraciones de
sustrato y producto tienen un efecto tóxico sobre la biomasa,
dependiendo de la sustancia. Así, el DBÁcido inhibe crecimiento de
biomasa ya a una concentración de 16 mM en la fase acuosa. La
concentración de DBAlk que inhibe el crecimiento de biomasa se
encuentra en una concentración de 100 mM en la fase acuosa y la de
DBAld a 1812 mM. Si la concentración de pseudocumeno excede de
15-25% en la fase acuosa actúa también de manera
tóxica para las células. Así mismo, la concentración de ácido
acético tienen un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de
biomasa.
El primer paso después de que el contenido del
reactor se ha recolectado es la separación de fases mediante
centrifugación. Como ya se ha mencionado, se ha encontrado que la
adición de extracto de levadura y glicerina al medio tuvo efectos
adversos en el proceso de separación. De este modo se ha formado una
fase intermedia que constituía hasta un tercio del volumen por
separarse. Un efecto comparable se observó cuando la rata de
agitación excedió de 2000 rpm. Este fenómeno puede atribuirse a las
proteínas presentes en el extracto de levadura o a la destrucción
de las células debido a una rata de agitación demasiado alta.
3,4-Dimetilbenzaldehído es una
sustancias con un alto punto de ebullición. El punto de ebullición a
presión atmosférica es de 220-223ºC. La fase
orgánica usada de acuerdo con la invención, ftalato de dioctilo,
tiene un punto de ebullición de 380ºC. Esta gran diferencia en los
puntos de ebullición de las dos sustancias hizo posible purificar
3,4-dimetilbenzaldehído mediante destilación.
Para retirar el
3,4-dimetilbenzaldehído de la fase orgánica mediante
destilación, la solución debería calentarse a sustancialmente más
arriba de 223ºC. Esta es la razón por la que el método adecuado
pareció ser destilación a vacío medio.
Tal como se ha demostrado de acuerdo con la
invención, el proceso bifásico semicontinuo (fedbatch)
desarrollado para la producción de
3,4-dimetilbenzaldehído puede escalarse sin mayores
problemas. Después de la optimización de los parámetros relevantes
al proceso y el medio a escala de laboratorio, el proceso fue
aplicado a escala piloto. El único aspecto que resultó ser un
problema durante la biotransformación fue el suministro de oxígeno
a las células. Así, el oxígeno tuvo que ser mezclado con el
suministro de aire ya a partir de 2 horas después de la inducción de
las células.
F. Ausubel et al.,(1997)
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New
York
Bühler, B., A. Schmid, et
al. (2000). "Xylene monooxygenase catalyzes the
multistep oxygenation of toluene and pseudocumene to corresponding
alcohols, aldehydes, and acids in Escherichia coli JM101".
(Xileno monooxigenasa cataliza la oxigenación de múltiples etapas de
tolueno y pseudocumeno hasta los alcoholes, aldehído y ácidos
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Claims (15)
1. Método para la oxidación biocatalítica de una
o varias etapas de compuestos aromáticos según el cual
a) en un medio de cultivo de dos fases,
acuoso-orgánico, el cual contiene un sustrato
aromático de la fórmula II
(II)Ar-R^{2}
En la cual
Ar representa un anillo aromático mononuclear
opcionalmente mono- o poli-sustituido; y
R^{2} representa
-(CH_{2})_{n+1}R^{3}, donde
n representa un valor de número entero de 0
hasta 15; y
R^{3} representa H;
se cultiva un microorganismo en condiciones
aeróbicas el cual expresa una enzima con actividad de
xilenomonooxigenasa (XMO); y
b) al menos un producto formado durante la
reacción de oxidación, donde el residuo R^{2} se oxidó hasta el
residuo hidroxilo, carbonilo o carboxilo correspondiente, se aísla
del medio de cultivo;
y según el cual el grado de oxidación del
sustrato empleado es controlable mediante el ajuste de la
concentración de sustrato.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque para la fase orgánica se usa un
compuesto orgánico apolar que tiene un coeficiente de distribución
>10^{4}en un sistema bifásico
n-octanol/agua.
3. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque a 1 atm la base orgánica
tiene un punto o rango de ebullición que se encuentra alrededor de
50 hasta 200ºC por encima del punto de ebullición del producto de
oxidación (de los productos de oxidación).
4. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque como fase orgánica se usa
ftalato de di-(alquilo de C_{5}-C_{12}) o una
mezcla de tales ftalatos.
5. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se separa la fase orgánica
y se destila(n) el o los producto(s) de oxidación
disuelto(s) en la misma.
6. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque el microorganismo que
expresa actividad XMO en esencia no posee actividad de dehidrogenasa
de alcohol bencílico (BADH) y/o dehidrogenasa de benzaldehído
(BZDH).
7. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se usa un microorganismo
recombinante que se transforma con un vector de expresión el cual
contiene en conexión operativa los genes xylM y xylA que codifican
para XMO bajo el control genético del alk-sistema de
pseudomonas olevorans GPo1.
8. Método según la reivindicación 7,
caracterizado porque el microorganismo se transforma con el
plásmido de expresión pSPZ3.
9. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque el microorganismo es una
bacteria del género Escherichia.
10. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se inicia la expresión de
la enzima mediante la adición de un inductor al medio de
cultivo.
11. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se expresa
xilenomonoxigenasa de pseudomonas putida mt-2.
12. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se usa un medio de reacción
que en esencia no contine antibiótico.
13. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la reacción se lleva a cabo
en un procedimiento semi-continuo de lotes.
\newpage
14. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se usa pseudocumeno como
material de partida.
15. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se utiliza el valor de pH
del medio de reacción como magnitud de control de la productividad
del biocatalizador.
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