ES2315713T3 - Sondas fluorescentes para su utilizacion en un ensayo de union de inhibidores de quinasas de proteinas. - Google Patents

Sondas fluorescentes para su utilizacion en un ensayo de union de inhibidores de quinasas de proteinas. Download PDF

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Abstract

La sonda fluorescente con la siguiente fórmula general (I): R1 - L - X - Y (I) en la que R1 es un radical de un compuesto que se une al centro activo de una quinasa; L es un enlace directo o un grupo alquileno C1-C16 grupo, un grupo alquenileno C2-C16 o un grupo alquinileno C2-C16, en el que uno o más de los grupos -CH2- disponibles presentes en el grupo alquileno C1-C16, grupo alquenileno C2-C16 o grupo alquinileno C2-C16, están opcionalmente e independientemente reemplazados por -O-, -C(O)-, -S(O)p-, en el que p es de 0 a 2, o -N(R2)-; X se selecciona de entre el grupo que consiste en O, S, -N(R2)C(O)-, -C(O)N(R2)-, -N(R2)C(S)-, -C(S)N(R2)-, -N(R2)C(S)NH-, -NHC(S)N(R2)-, -N(R2)C(O)NH-, -NHC(O)N(R2), -SO2NR2-, -NR2SO2-, -CH2N(R2)-, -N(R2)CH2-, -CH2S-, -SCH2-, -C(O)CH2S-, -SC(O)CH2-, -NHCH2CH2S-, -SCH2CH2NH-, -NC(O)O-, -ONC(O)-, -C(O)O-, -OC (O)-, -NH-N=C(R2)-, -C(R2)=N-NH-, -NHCH(R2)- y -CH(R2)NH-; R2 es H o alquilo C1 - 3; e Y es un marcaje fluorescente; y en la que R1 es una nitropirimidina de fórmula (III) (Ver fórmula) en la que R4 se selecciona de entre fenilo y naftilo, y está opcionalmente sustituido con de uno a tres grupos seleccionados de entre Cl, F, Br, I, -CH3, -CN, -CO2CH3, -NO2, -OH, -NH2 y -CF3.

Description

Sondas fluorescentes para su utilización en un ensayo de unión de inhibidores de quinasas de proteínas.
Solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional con número U.S. 60/508.539, registrada el 3 de octubre de 2003.
Campo de la invención
Esta invención está relacionada en general con un nuevo formato de ensayo de cribado que puede aplicarse ampliamente con miembros de la familia de genes de quinasas de proteínas, y es útil en la detección y evaluación de inhibidores de quinasas. Esta invención también está relacionada con nuevas sondas fluorescentes utilizadas en el ensayo.
Antecedentes de la invención
Las quinasas de proteínas tienen un papel crítico en la regulación de virtualmente todos los aspectos de la regulación celular y comprenden una de las áreas de investigación más activas en la industria farmacéutica actualmente. Los 522 dominios quinasa de proteínas del genoma humano pueden proporcionar tremendas oportunidades de desarrollo de nuevos fármacos para enfermedades no tratadas, y el desarrollo de nuevos inhibidores de quinasas de proteínas se ha convertido en uno de los principales puntos de interés creciente de la industria farmacéutica. Se ha descrito que los inhibidores de las quinasas de proteínas son útiles en el tratamiento de numerosas enfermedades, lo que incluye el cáncer, enfermedades inflamatorias e inmunológicas. Véase por ejemplo I.K. Mellinghoff y C.L. Sawyers, Kinase Inhibitor Therapy in Cancer, 14(12):1-11, 2000; J. Dumas, Growth factor receptor quinase inhibitors: recent progress and clinical impact, Current Opinion in Drug Discovery & Development, 4(4):378-89, 2001; J. Dumas, Protein quinase inhibitors: emerging pharmacophores, 1997-2000, Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11(3):405-429, 2001; D.H. Williams y T. Mitchell, Latest developments in crystallography and structure-based design of protein quinase inhibitors as drug candidates, Current Opinion in Pharmacology, 2(5):567-73, 2002; S.B. Noonberg y C.C. Benz, Tyrosine quinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor receptor subfamily: role as anticancer agents, Drugs, 59(4):753-67, 2000; S. Brunelleschi, L. Penengo, M.M. Santoro y G. Gaudino, Receptor tyrosine kinases as target for anti-cancer therapy, Current Pharmaceutical Design. 8(22):1959-72, 2002; P.G. Goekjian y M.R. Jirousek, Protein quinase C in the treatment of disease: signal transduction pathways, inhibitors, and agents in development, Current Medicinal Chemistry. 6(9):877-903, 1999, A. Gordon, The increasing efficacy of breast cancer treatment, Clinical Oncology (Royal College of Radiologists), 9(5): 338-42, 1997.
Aunque esta gran familia de genes representa una rica fuente de nuevas dianas para los fármacos, los ensayos en desarrollo utilizados para determinar la afinidad del compuesto son altamente problemáticos. Los ensayos de cribado de inhibidores de quinasas de proteínas a gran escala actuales miden la incorporación de fosfato en un sustrato proteico o peptídico. El método mejor establecido para el ensayo de inhibidores de quinasas de proteínas es un ensayo radiométrico en el que el fosfato gamma del ATP se marca con ^{32}P o ^{33}P. Cuando la quinasa transfiere el fosfato gamma al hidroxilo del sustrato proteico durante la reacción de fosfotransferasa la proteína queda covalentemente marcada con el isótopo. La proteína se separa del ATP marcado y se determina la cantidad de proteína radiactiva. Este ensayo sigue siendo el principal de entre los ensayos cuantitativos para quinasas de proteínas. La adaptación de este ensayo a un formato a gran escala es problemática debido a los laboriosos pasos de separación y las grandes cantidades de radiactividad que se utilizan.
Un ensayo radiométrico alternativo con el que es posible un escalado mayor es el SPA o ensayo de proximidad de centelleo (Amersham International). En este ensayo, cuentas impregnadas con una sustancia de centelleo emiten luz cuando el sustrato marcado se une a la cuenta. Este ensayo está limitado por el nivel de radioactividad y la eficiencia del sustrato peptídico.
La mayoría de ensayos no radiactivos utilizan anticuerpos que reconocen el producto de la reacción quinasa, es decir un fosfopéptido. Los ensayos de unión utilizan anticuerpos que se detectan con una lectura de luminiscencia catalizada por una enzima. Estos métodos están limitados por la disponibilidad de reactivos, el recubrimiento de los pocillos y los múltiples pasos de lavado e incubación.
Las técnicas que utilizan la polarización de la fluorescencia para medir la actividad de la quinasa de proteínas o la unión del inhibidor se basan en un anticuerpo o sustrato peptídico marcado. En estos ensayos, la enzima transfiere el fosfato gamma del ATP a un sustrato proteico o peptídico. Esta actividad se monitoriza mediante la detección del fosfopéptido mediante métodos como los anticuerpos. La unión del anticuerpo al fosfopéptido retardará la rotación libre del péptido en solución y, por lo tanto, puede detectarse una señal de polarización del producto de la reacción catalítica. Ejemplos incluyen la patente de Burke et al. US 2001/0004522 A1 o T.C. Turek et al., Analytical Biochemistry, 2001, 299 (1), 25-53.
Cada uno de los ensayos descritos anteriormente determina la afinidad de un inhibidor basado en reducciones en la formación del producto de la enzima. A pesar de que existen muchas alternativas para medir el producto de la enzima, cada formato de ensayo requiere una enzima activa, un sustrato de alta afinidad y un anticuerpo especializado que se una al fosfopéptido. En la mayoría de casos, obtener una enzima activa involucra la fosforilación del bucle de activación que se sitúa a lo largo del sitio catalítico. Esta fosforilación puede ser altamente problemática cuando se desconoce la anterior quinasa que realiza esta función. Incluso si la quinasa activadora se conoce, es necesario el clonaje o coexpresión de múltiples quinasas. En algunos casos, deben añadirse cofactores adicionales como las ciclinas para activar totalmente la proteína.
Las quinasas de proteínas muestran una gran selección de sustrato específica de secuencia. Por lo tanto, deben encontrarse los sustratos específicos adecuados para cada quinasa. Además, si la diana en el sustrato es una serina o treonina deben obtenerse entonces anticuerpos especializados fosfoespecíficos para monitorizar la actividad en un formato de ensayo a gran escala. Estas necesidades añaden incertidumbre al diseño de nuevos ensayos quinasa, a la vez que costes añadidos.
En la WO 03/032977 A1 se describen compuestos orgánicos de bajo peso molecular que interaccionan con un número de quinasas de proteínas. Éstos pertenecen al grupo de las pirimidinas 2,4,5-trisustituidas de fórmula general A
1
De acuerdo con esta solicitud, éstos pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por una proliferación celular excesiva o anormal.
Un determinado derivado bis-indolilmalerimida (FIM-1) que se une al punto de unión del ATP en el dominio catalítico de la quinasa de proteínas C (PKC\alpha) se describe en Janoshazi y de Barry (1999), Biochemistry, vol. 38, págs. 13316-13327. En este estudio se muestra como este compuesto puede utilizarse en estudios cinéticos de esta enzima, por ejemplo mediante la valoración del cambio en la intensidad de la fluorescencia por longitud de onda durante la reacción de proteólisis.
En resumen, los problemas con el desarrollo de ensayos quinasa de proteínas se encuentran más frecuentemente en el paso de activación y en la selección de la proteína sustrato. El desarrollo de un ensayo de cribado a gran escala para nuevas quinasas de proteínas actualmente dura 6-12 meses. Además del clonaje y expresión de la proteína la enzima debe activarse, deben encontrarse los sustratos y deben generarse los reactivos para detectar el producto de la reacción enzimática. Este es un ensayo que requiere un gran consumo de tiempo y un esfuerzo intenso, y cada ensayo debe ser específico de una o de un pequeño subgrupo de quinasas de proteínas.
Cualquier ensayo que utilice métodos de unión de sustratos fosfopéptidos está limitado por la concentración de ATP utilizada en el ensayo. Esto es inevitable ya que tanto los aminoácidos fosforilados del sustrato peptídico como los fosfatos del ATP compiten entre ellos por el sitio de unión del reactivo añadido. Las quinasas con valores de K_{m} de medios a elevados que se analizan a valores por debajo de su K_{m} dan problemas de conversión del sustrato.
Finalmente, es deseable contra con un ensayo que exprese la afinidad del compuesto en K_{d} en lugar de como CI_{50}. Esto permite una comparación transparente de los inhibidores entre quinasas, crítica para determinar la selectividad del compuesto. No se pueden comparar las medidas de CI_{50} entre quinasas sin datos adicionales de la K_{m} del ATP.
Para superar estos problemas sería deseable contar con un ensayo para la medida de la afinidad de los inhibidores que sea compatible con un cribado a gran escala, sea homogéneo (sin pasos de lavado), no requiera proteína activada, no requiera una reacción catalítica, sea independiente de sustrato, sea independiente de las concentraciones de ATP y mida los valores de K_{d} del compuesto. Tal ensayo ahorraría a las instituciones y compañías involucradas en la investigación para el descubrimiento de fármacos millones de dólares al reducir el tiempo de desarrollo del ensayo y el coste en reactivos.
Resumen de la invención
Esta invención proporciona un ensayo de unión para medir la afinidad de los inhibidores a las quinasas de proteínas. El ensayo de unión se creó alrededor de una serie de sondas marcadas para el centro activo descritas a continuación que se utilizan y se detectan en un formato de polarización de la fluorescencia. El desplazamiento de la sonda marcada por el inhibidor puede utilizarse para generar una K_{d} del inhibidor a la enzima.
Esta invención también proporciona nuevas sondas para su utilización en un ensayo de unión de inhibidores a quinasas de proteínas.
Una realización de la invención proporciona un ensayo para la identificación de un agente inhibidor de quinasas que comprende los pasos de:
a) establecer la K_{d} de una sonda del centro activo por un sitio de unión de ATP;
b) poner en contacto la sonda del centro activo con una proteína que comprende un dominio quinasa y medir una señal de dicha sonda para establecer un nivel de señal de línea base;
c) incubar el complejo de sonda del centro activo: quinasa con un agente inhibidor candidato y medir la señal de dicha sonda;
d) comparar la señal del paso b) con la señal del paso c);
e) derivar la K_{d} del agente inhibidor candidato en base a la K_{d} de la sonda por su lugar de unión a ATP y la respuesta a la dosis del agente inhibidor candidato; bajo condiciones en las que la sonda puede ser desplazada por el inhibidor candidato y en las que la sonda del centro activo se une al dominio de unión a ATP de dicha quinasa, y dicha sonda del centro activo es la sonda del centro activo descrita a continuación de acuerdo con la invención.
En otra realización de la invención la proteína que comprende el dominio quinasa es una quinasa completa.
En otra realización de la invención la sonda es una sonda fluorescente y la señal se mide como un cambio en la polarización de la fluorescencia de la sonda. Otra realización de la invención proporciona un ensayo en el que el dominio quinasa es STK 12.
Otra realización de la invención proporciona un ensayo que utiliza la sonda de fórmula general I descrita aquí.
En otra realización de la invención la sonda del centro activo es ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico con el dominio quinasa STK12.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de polarización de la fluorescencia obtenidos mediante titulación de la sonda fluorescente de ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilaminopirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico con el dominio quinasa STK12.
La Figura 2 muestra los resultados de polarización de la fluorescencia obtenidos durante el cribado con un compuesto de prueba de actividad inhibitoria del dominio quinasa STK12 a varias diluciones utilizando la sonda fluorescente con ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico en un ensayo de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se dirige a un ensayo quinasa para la detección y evaluación de inhibidores de miembros de la familia génica de quinasas de proteínas. El nuevo formato de ensayo utiliza sondas del centro activo para competir con los inhibidores de la enzima, eliminando así la necesidad de activación de la enzima y de sustratos. La utilización de este método de ensayo permite obtener datos de la unión del inhibidor independientemente de un ensayo catalítico, permitiendo así que los ensayos de HTS se puedan realizar sin una proteína activada y sin sustratos. El ensayo utiliza un conjunto definido de sondas marcadas, definidas a continuación, que pueden obtenerse con un coste nominal.
I. Las sondas fluorescentes
Las sondas fluorescentes de la presente invención se unen al centro activo de una quinasa y tienen la siguiente fórmula general (I):
(I)R_{1}-L-X-Y
en la que R_{1} es el radical del compuesto que se une al centro activo de la quinasa, Y es una marca fluorescente, L es un enlazante de uno o más átomos entre R_{1} y X, y X es el grupo funcional que une L y la marca fluorescente Y.
El ensayo de la presente invención se cree que será útil en la detección de inhibidores de miembros de la familia quinasa. De acuerdo con ello, la porción R_{1} de la la sonda fluorescente de la presente invención debería seleccionarse de forma que se una al centro activo (lugar del ATP) de una serie de quinasas de una forma específica de lugar. Por lo tanto, este radical tendría una estructura que se sabe se une a varias quinasas. R_{1} es la estructura 2,4-diamino-5-nitropirimidina de la fórmula (III) a continuación, en la que R_{3} y R_{4} se describen más adelante.
2
Los marcajes fluorescentes adecuados para su utilización en la invención como residuos Y incluyen cualquiera de los conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, los descritos en "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" de Richard P. Haugland, sexta edición (1996). La séptima edición está disponible en CD-ROM y una séptima edición actualizada está disponible en la página web www.sondas.com/handbook/. Hay disponibles a nivel comercial una variedad de marcajes fluorescentes adecuados en Molecular Probes Inc. Es preferible que la fluorescencia del marcaje fluorescente se emita a una longitud de onda relativamente elevada, es decir, superior a alrededor de 450 nm, para evitar la interferencia de la fluorescencia originada por la célula y la fluorescencia originada por los compuestos de prueba e impurezas presentes en el sistema o procedentes de los contenedores de vidrio y plástico. De acuerdo con esto, en una realización, el marcaje fluorescente de la invención emite fluorescencia a una longitud de onda superior a alrededor de 450 nm.
Ejemplos de marcajes fluorescentes útiles en la presente invención incluyen la rodamina y derivados de la rodamina como tetrametilrodamina, carboxitetrametilrodamina, Lissamine^{TM} rodamina B, Texas Red®, carboxi-X rodamina y rodamina Red^{TM}-X, y otros derivados de la rodamina conocidos en la materia, la fluoresceína y derivados de la fluoresceína como las fluoresceínas fluoradas como Oregon Green® y sus derivados, fluoresceinamina, carboxifluoresceína, alfa-yodoacetamidofluoresceína, 4'-aminometilfluoresceína, 4'-N-alquilaminometilfluoresceína, 5-aminometilfluoresceína, 6-aminometilfluoresceína, 2,4-dicloro-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína (DTAF), 4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína y fluoresceinisotiocianato, y otros derivados de la fluoresceína conocidos en la materia, 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno y sus derivados, los colorantes cianina y los colorantes Alexa Fluor®.
Los marcajes fluorescentes más preferibles incluyen la fluoresceína y los derivados de la fluoresceína como las fluoresceínas fluoradas como Oregon Green® y sus derivados, fluoresceinamina, carboxifluoresceína, alfa-yodo-aceta-midofluoresceína, 4'-aminometilfluoresceína, 4'-N-alquil-aminometilfluoresceína, 5-aminometilfluoresceína, 6-amino-metilfluoresceína, 2,4-dicloro-1,3,5-triazin-2-il-amino-fluoresceína (DTAF), 4-cloro-6-metoxi-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína y fluoresceinisotiocianato, y otros derivados de la fluoresceína conocidos en la materia.
Las sondas fluorescentes de la invención tienen la siguiente fórmula general (I):
(I)R_{1}-L-X-Y
en la que
R_{1} es un radical de un compuesto que se une al centro activo de una quinasa;
L es un enlace directo o un grupo alquileno C_{1}-C_{16} grupo, un grupo alquenileno C_{2}-C_{16} o un grupo alquinileno C_{2}-C_{16}, en el que uno o más de los grupos -CH_{2}- disponibles presentes en el grupo alquileno C_{1}-C_{16}, grupo alquenileno C_{2}-C_{16} o grupo alquinileno C_{2}-C_{16,} están opcionalmente e independientemente reemplazados por -O-, -C(O)-, -S(O)_{p}-, en el que p es de 0 a 2, o -N(R_{2})-;
X se selecciona de entre el grupo que consiste en O, S, -N(R_{2})C(O)-, -C(O)N(R_{2})-, -N(R_{2})C(S)-, -C(S)N(R_{2})-, -N(R_{2})C(S)NH-, -NHC(S)N(R_{2})-, -N(R_{2})C(O)NH-, -NHC(O)N(R_{2}), -SO_{2}NR_{2}-, -NR_{2}SO_{2}-, -CH_{2}N(R_{2})-, -N(R_{2})CH_{2}-, -CH_{2}S-, -SCH_{2}-, -C(O)CH_{2}S-, -SC(O)CH_{2}-, -NHCH_{2}CH_{2}S-, -SCH_{2}CH_{2}NH-, -NC(O)O-, -ONC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NH-N=C(R_{2})-, -C(R_{2})=N-NH-, -NHCH(R_{2})- y -CH(R_{2})NH-;
R_{2} es H o alquilo C_{1-3};
y Y es un marcaje fluorescente; y
en la que:
R_{1} es una nitropirimidina de fórmula (III)
3
R_{4} se selecciona de entre fenilo y naftilo, y está opcionalmente sustituido con entre uno y tres grupos seleccionados entre Cl, F, Br, I, -CH_{3}, -CN, -CO_{2}CH_{3}, -NO_{2}, -OH, -NH_{2} y -CF_{3}.
Los siguientes ejemplos son específicos de sondas fluorescentes dentro del alcance de la presente invención y no pretenden ser limitantes en modo alguno:
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Cualquier sonda fluorescente de esta invención que contenga uno o más átomos de carbono asimétrico pueden aparecer como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros sencillos, mezclas de diastereómeros y diastereómeros individuales. Todas las formas isoméricas de estos compuestos están expresamente incluidas en la presente invención. Cada carbono estereogénico puede estar en configuración R o S, o en una combinación de configuraciones.
Algunas de las sondas fluorescentes de la invención pueden existir en más de una forma tautomérica. La invención incluye todos los tautómeros.
Las sondas fluorescentes de la invención sólo son aquellas que se consideran "químicamente estables" como podrán apreciar los expertos en la materia. Por ejemplo, los compuestos que pueden tener una "valencia abierta" o un "carbanión" no son compuestos contemplados en la invención.
Los métodos para la síntesis de las sondas fluorescentes se proporcionan en la sección de Ejemplos sintéticos.
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II. El Ensayo de Polarización de la Fluorescencia
Los ensayos de polarización de la fluorescencia se basan en el principio de que la excitación de una solución de fluoróforos con luz polarizada en un plano fotoselecciona aquellos fluoróforos con momentos dipolo de excitación orientados en paralelo en relación a la luz de excitación. La emisión de fluorescencia de estos fluoróforos se depolarizará hasta un punto que viene determinado por varios factores, lo que incluye la tasa de difusión que aparece durante la vida media del estado excitado. Esta tasa, a su vez, es determinada por varios factores, lo que incluye el volumen de las especies en rotación. Por lo tanto, puede utilizarse la polarización de la fluorescencia a la medida de la interacción entre los fluoróforos y moléculas mayores.
Las nuevas sondas fluorescentes descritas aquí pueden utilizarse en un ensayo de polarización de la fluorescencia para detectar y evaluar los compuestos que se unen al lugar del ATP de las quinasas. También se entiende que el método de la invención puede utilizarse con quinasas completas así como con versiones truncadas de las quinasas y con quinasas híbridas que mantienen el dominio quinasa y la actividad quinasa. La invención incluye las sondas marcadas con fluorescencia que pueden utilizarse en ensayos de cribado a gran escala para la identificación de inhibidores candidatos de una serie de diferentes quinasas. En otras palabras, la misma sonda fluorescente puede utilizarse en diferentes ensayos a gran escala para la identificación de inhibidores candidatos de la quinasa A, quinasa B, etc. Las nuevas sondas fluorescentes están diseñadas para tener una reactividad cruzada a lo largo de la familia génica de las quinasas y ser específicas en su unión al lugar de unión del ATP de una quinasa seleccionada de entre las quinasas humanas. La polarización de la fluorescencia de la sonda cambia al unirse al dominio quinasa, de forma que cuando existe la competencia de un inhibidor, la polarización de la sonda disminuye de forma detectable. Este cambio en la polarización sirve como detección en este ensayo. A no ser que se especifique de otro modo, las condiciones que pueden utilizarse para realizar los ensayos de polarización de la fluorescencia de la presente invención (por ejemplo, presión, temperatura, pH, solventes, tiempo) pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia.
Puede diseñarse un ensayo que utiliza el método de la presente invención de la siguiente forma:
(a) seleccionar un par sonda del centro activo - quinasa adecuado determinando los calores de polarización de las sondas fluorescentes libres y la de las sondas fluorescentes unidas a una quinasa.
(b) determinar la K_{d} del par sonda fluorescente del centro activo - quinasa.
(c) demostrar que la sonda fluorescente puede establecer competencia en su unión al lugar de ATP, con ADP, estaurosporina o un inhibidor que sea muy parecido a la porción de unión a la quinasa (R_{1}) de la sonda.
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Como paso preliminar, se determinan los espectros de absorbancia, excitación de la fluorescencia y emisión de la fluorescencia de cada sonda fluorescente. El espectro de absorbancia se mide para evitar el efecto de filtro interno. Los espectros de excitación de la fluorescencia y emisión de fluorescencia se recogen para poder elegir las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas para la detección de la sonda. Estos espectros pueden determinarse utilizando cualquier espectrofotómetro y fluorímetro convencionales, con la sonda en un tampón de ensayo adecuado.
Para identificar una sonda apropiada para una quinasa o dominio quinasa de interés (paso (a)), se ha desarrollado un esquema inicial de titulación de 4 puntos. Cada quinasa se criba frente a un panel de sondas fluorescentes. Los criterios para una selección positiva en este paso del ensayo son:
i.) intensidad de la fluorescencia de la sonda aceptable;
ii.) cambio de la polarización tras la unión a la quinasa aceptable;
iii.) rango de concentración de quinasa en el que ocurre la unión de la sonda aceptable.
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La concentración de la sonda debe dar lugar a intensidades de fluorescencia aceptables que deben determinarse para cada sonda ya que el rendimiento cuántico de los diferentes fluoróforos varía. El tipo de placa de 96 o 384 pocillos debe determinarse cuidadosamente para minimizar la adsorción no específica de la sonda a las paredes de los pocillos. La adsorción de la sonda puede causar un aumento artificial en la polarización medida. Alternativamente, puede utilizarse una a cubeta. Las muestras se mezclan y se dejan en incubación durante un periodo predeterminado de tiempo previamente a la medida de la polarización. Los ajustes del instrumento vienen definidos por las características de fluorescencia de la sonda (espectro de excitación, espectro de emisión, rendimiento cuántico). El cambio de la polarización necesario viene definido por el instrumental a utilizar en el cribado. Se determinó que el cambio mínimo de la polarización en este paso es de 100 miliunidades de polarización (mP). La afinidad aproximada de la sonda por la quinasa necesaria viene definida por el suministro de proteína y el consumo esperado a lo largo del proceso de cribado. Cuando un par sonda/ quinasa se identifica mediante el proceso descrito en el paso (a), se realiza una titulación de la unión en equilibrio completa para determinar la constante de disociación en el equilibrio (K_{d}) que describe la interacción (paso (b)). La sonda se mantiene constante a la concentración predeterminada fijada para cada pocillo en una placa de 96 o 384 pocillos. Alternativamente puede utilizarse una cubeta. Se realiza una dilución seriada de la quinasa de interés para cubrir un rango de concentración amplio a lo largo de la placa. El rango de concentración debería cubrir la concentración en la que en el paso a se ha demostrado que la sonda se une a la quinasa. Además, varios pocillos deben contener sólo sonda o sonda con la concentración más elevada de quinasa. Esto se realiza para calcular la proporción Qb/ Qf del par sonda/ quinasa. Esto es una medida de la intensidad total de la sonda unida (Qb) dividido por la intensidad total de la sonda libre (Qf), que es necesaria para incluirla en el análisis de datos para luego determinar de forma precisa la K_{d}. La K_{d} puede obtenerse utilizando métodos convencionales (por ejemplo, análisis de la regresión).
Los criterios para una selección positiva en este paso del ensayo son:
i.) cambio de la polarización tras la unión a la quinasa aceptable;
ii.) rango de concentración de quinasa en el que ocurre la unión de la sonda aceptable
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De nuevo, estos valores se definen tanto por la instrumentación como por el suministro de proteína.
En el siguiente paso (c), es necesario determinar si la interacción es específica y aparece en el lugar de unión del ATP de la quinasa. Esto puede ocurrir sólo tras la determinación de la K_{d} (paso (b)) ya que la elección de la concentración de quinasa depende del cambio total de polarización que aparece tras la unión de la sonda. Para demostrar la unión específica al lugar de unión (lugar del ATP), se utilizan inhibidores que mimetizan muy bien la química del núcleo (porción de unión a la quinasa) de la sonda. Alternativamente, pueden utilizarse ADP o estaurosporina con esta aplicación. En este paso, se mezcla ADP, estaurosporina o inhibidor con la mezcla de complejo sonda fluorescente-quinasa obtenida en el paso (b), y la mezcla resultante de sonda fluorescente, quinasa y ADP se incuba para facilitar la competición u otra interacción. Si el compuesto de prueba es insoluble en agua, puede ser necesario disolver primero el compuesto de prueba en un solvente orgánico apropiado, por ejemplo DMSO, previamente a su dilución en la solución acuosa tamponada. Las condiciones de incubación de este paso pueden variar, pero generalmente la incubación se conduce a una temperatura entre alrededor de 25ºC y alrededor de 30 minutos. Cuando la diferencia en los valores de polarización de la fluorescencia obtenidas en el paso (c) es negativa, es decir, existe una disminución de la polarización en presencia de ADP, estaurosporina o compuesto de prueba, esto puede indicar que la sonda fluorescente se está uniendo al lugar de unión del ATP de la quinasa.
Cuando este paso de la invención se realiza utilizando múltiples diluciones de ADP, estaurosporina o a compuesto de prueba, el rango de los valores de polarización de la fluorescencia de prueba obtenidos pueden representarse en un gráfico adecuado. Si se desea, se pueden utilizar métodos convencionales (por ejemplo, análisis de regresión) para calcular la constante de disociación en el equilibrio de la unión del compuesto de prueba a la quinasa.
La invención también incluye un ensayo en el que puede evaluarse la capacidad de los compuestos de prueba de competir con el dominio del centro activo de la sonda fluorescente. Esto se describe en más detalle en el Ejemplo 3 a continuación.
A pesar de ello, el método preferible de la invención es utilizar una sonda fluorescente o una sonda fluorescente sensible al ambiente. Cuando se utiliza una sonda sensible al ambiente se medirá el cambio de intensidad fluorescente en lugar de la intensidad de la fluorescencia.
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Métodos Sintéticos Generales
Sólo algunos de los ejemplos se refieren a compuestos de acuerdo con la invención. El resto se proporcionan con un propósito meramente ilustrativo.
Las sondas fluorescentes de la invención pueden obtenerse como se describe a continuación. En cada uno de los métodos y esquemas descritos a continuación, los grupos R_{1}, L y X, cuando se muestran, son como se ha definido anteriormente para las fórmulas generales I, II y III excepto si se así se indica. Las condiciones de reacción y los tiempos de reacción óptimos pueden variar dependiendo de los reactivos particulares utilizados. A no ser que se especifique de otro modo, los solventes, temperaturas, presiones y otras condiciones de reacción pueden ser seleccionadas fácilmente por un experto en la materia. Los procedimientos específicos se proporcionan en la sección de Ejemplos sintéticos. Normalmente, el progreso de la reacción puede monitorizarse mediante cromatografía en capa fina (TLC) si se desea. Los intermediarios y productos pueden purificarse mediante cromatografía en gel de sílice y/o recristalización. Los materiales de partida y los reactivos están disponibles comercialmente o pueden ser preparados por un experto en la materia utilizando los métodos descritos en la literatura química.
Como se ha discutido anteriormente, la porción R_{1} de la fórmula I puede corresponder a una estructura que se une al centro activo de una quinasa, como las estructuras que se muestran en las fórmulas II y III. Por ejemplo, los compuestos de fórmula I con R_{1} = II pueden sintetizarse como se ilustra en el Esquema 1 a continuación:
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Esquema I
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Como se ha ilustrado anteriormente, el ácido 4-nitrobenzoico se acopla con una amina que posee L y X' para proporcionar el intermediario IV. Pueden utilizarse las condiciones de acoplamiento estándar conocidas en la materia, por ejemplo una reacción en un solvente adecuado como el cloruro de metileno en presencia de un agente de acoplamiento como 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) en un solvente adecuado como cloruro de metileno. El grupo nitro de IV entonces se reduce, por ejemplo mediante un tratamiento con hidrógeno o una fuente de hidrógeno como el formato de amonio en un solvente adecuado como etanol en presencia de un catalizador adecuado como el paladio sobre carbono. La reacción de V con el intermediario VI en un solvente como DMF mientras se calienta a alrededor de 75ºC y 120ºC proporciona el intermediario VII. El intermediario VI puede prepararse a partir de 1-acetil-2-indolinona opcionalmente sustituida a reflujo con trietilortobenzoato en anhídrido acético, seguido de hidrólisis del grupo acetilo como se describe en W. Grell et al., U.S. 6.043.254. La reacción de VII con Y', un marcaje fluorescente que posee un grupo funcional que reaccionará con X' proporciona el compuesto deseado de fórmula I. X' e Y', y la química para formar X-Y se describen en más detalle a continuación.
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Los compuestos de fórmula I con R_{1} = III pueden prepararse como se describe en el Esquema II.
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Esquema II
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Como se ha ilustrado anteriormente, la reacción del intermediario tiocianato VIII con H_{2}N-L-X' en un solvente adecuado como el cloruro de metileno proporciona el intermediario IX. El intermediario VIII puede prepararse a partir de 4,6-dicloro-5-nitropirimidina disponible comercialmente haciéndola reaccionar con una sal tiocianato, como el tiocianato de potasio, en un solvente adecuado, como EtOH seguido de la reacción del intermediario resultante con R_{4}NH_{2} en un solvente adecuado, como EtOH, y en presencia de una base, como trietilamina. La reacción de IX con Y' proporciona el compuesto deseado de fórmula I.
Una serie de marcajes fluorescentes adecuados como Y están disponibles comercialmente (véase por ejemplo Molecular Probes, Inc. en www.probes.com). Estos marcajes están disponibles con una serie de funcionalidades reactivas que pueden acoplarse a R_{1}-L-X' para producir el R_{1}-L-X-Y deseado. La porción de conexión X obtenida dependerá de la X' y la funcionalidad reactiva de Y elegidas. Por ejemplo, en el último paso del Esquema I anterior, puede hacerse reaccionar un marcaje fluorescente Y con un grupo CO_{2}H, es decir, el compuesto Y-CO_{2}H, (Y') con R_{1}-L-X' con una funcionalidad amina como X', es decir, el compuesto R_{1}-L-NH_{2}, para obtener un compuesto de fórmula (I), R_{1}-L-X-Y, en la que X es -NHC(O)-.
La Tabla 1 a continuación muestra ejemplos de otras funcionalidades reactivas en sondas fluorescentes que están disponibles comercialmente y el grupo X que puede formarse mediante la reacción con grupos X' funcionales. Las condiciones de reacción son conocidas para los expertos en la materia. Generalmente, esto involucra la combinación del marcaje fluorescente que contiene la funcionalidad reactiva (Y') con el R_{1}-L-X' deseado en un solvente adecuado, como cloruro de metileno, acetato de etilo, THF o DMF, opcionalmente en presencia de un catalizador adecuado, como se conoce en la materia, por ejemplo una base como trietilamina, o un reactivo de acoplamiento, a una temperatura adecuada de entre alrededor de -10ºC y la de temperatura de reflujo del solvente, preferiblemente entre alrededor de 0ºC y temperatura ambiente. Las condiciones de reacción particulares y los tiempos de reacción pueden variar dependiendo de la naturaleza de Y' y R_{1}-LX'. El progreso de la reacción se monitoriza fácilmente mediante métodos conocidos en la materia como la cromatografía en capa fina.
TABLA 1 
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Utilizando los métodos descritos anteriormente, un experto en la material podrá preparar fácilmente las diferentes sondas fluorescentes (I) dentro del alcance de la presente invención.
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Ejemplos Sintéticos
Los siguientes ejemplos ilustran métodos mediante los que pueden sintetizarse las sondas fluorescentes.
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Ejemplo 1
(No forma parte de la presente invención)
Síntesis de ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{6-[4-({[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzoilamino]-hexil}-isoftalámico (Método A)
Compuesto A:
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Se combinaron ácido p-nitrobenzoico (500 mg, 2,99 mmol), N-Boc-hexanodiano (834 mg, 3,3 mmol), clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) (699 mg, 3,65 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT) (493 mg, 3.65 mL) en diclorometano (15 mL) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La reacción se diluyó con EtOAc (50 mL), se lavó con agua, bicarbonato sódico saturado y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato magnésico y se filtró. La capa orgánica se concentró mediante evaporación en rotación para recoger 1,01 g de [6-(4-nitro-benzoilamino)-hexil]-carbamato de terc-butilo como un sólido blanco (rendimiento del 92%).
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La amida anterior (265 mg, 0,750 mmol) se disolvió en EtOH (25 mL). Se introdujo en la mezcla de reacción formato de amonio (500 mg) y paladio sobre carbono al 10% (100 mg) y se agitó durante 4 días a temperatura ambiente. La reacción se filtró a través de tierra de diatomeas y se concentró para recuperar 265 mg de [6-(4-amino-benzoilamino)-hexil]-carbamato de terc-butilo como un sólido blanco cristalino (rendimiento cuantitativo).
Se combinaron 1-acetil-3-[1-etoxi-1-fenil-met-(Z)-iliden]-1,3-dihidro-indol-2-ona (50 mg, 0,163 mmol) y [6-(4-amino-benzoilamino)-hexil]-carbamato de terc-butilo (65 mg, 0,195 mmol) en DMF (1 mL) y se agitaron durante 24 horas a 110ºC. El DMF se eliminó mediante evaporación en rotación bajo un vacío elevado. El residuo se redisolvió en MeOH (1 mL), se añadió una solución de metóxido sódico 0,5 M (0,5 mL) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió HCl 4 N en dioxano (1 mL) y la reacción se agitó durante toda la noche. La reacción se concentró mediante evaporación en rotación. Una cromatografía rápida en un gradiente polar de [20%(hidróxido de amonio al 10% en MeOH) y 80% diclorometano] proporcionó 60 mg de N-(6-amino-hexil)-4-({[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzamida (rendimiento del 82%).
Se disolvieron N-(6-amino-hexil)-4-({[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzamida (5 mg, 0,01 mmol) y Oregon green 488 carboxilato de succinimidilo "isómero 5" (5 mg, 0,01 mmol) en DMF (1 mL) y se agitaron durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró mediante evaporación en rotación bajo un vacío elevado. Se introdujo el residuo en una placa de TLC preparativa y se eluyó con una fase móvil de [30%(hidróxido de amonio al 10% en MeOH) y 70% diclorometano]. El compuesto del título (2 mg) se obtuvo como un sólido naranja brillante (rendimiento del 20%).
Ejemplos de otras sondas preparadas mediante el método A pero que no forman parte de la presente invención se muestran a continuación:
Compuesto B: Ácido N-{6-[4-({[6-Cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenilmetil}-amino)-benzoilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
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Compuesto C: Ácido N-{6-[4-({[5-bencensulfonilamino-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-
amino)-benzoilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
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14 
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Compuesto D: Ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{6-[4-({[5-nitro-2-oxo-1,2-dihidro-
indol-(3Z)-iliden]-fenil-metil}-amino)-benzoilamino]-hexil}-iso-ftalámico
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Compuesto E: 3-[1-(4-{6-[3-carboxi-4-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-benzoilamino]-hexilcarba-moil}-fenilamino)-1-fenil-met-(Z)-iliden]-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxilato de metilo
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Compuesto F: Ácido N-{6-[4-({[6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden]-fenilmetil}-amino)-benzoil-
amino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-iso-ftalámico
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Ejemplo 2 Síntesis de ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico (Método B)
Compuesto G:
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Se disolvió (5-nitro-4-tiocianato-pirimidin-2-il)-fenil-amina (85 mg, 0,311 mmol) en diclorometano (3 mL). Se añadió hexanodiamina a la reacción y la mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. Se introdujo la mezcla de reacción directamente en una columna (gel de sílice) de cromatografía rápida y se eluyó con un gradiente de diclorometano, MeOH e hidróxido de amonio. Se aisló N4-(6-amino-hexil)-5-nitro-N2-fenil-pirimidin-2,4-diamina (80 mg, rendimiento del 78%) como un sólido amarillo. La anterior diamina (5 mg, 0,01 mmol) y Oregon green 488 carboxilato de succinimidilo "isómero 5" (5 mg, 0,01 mmol) se disolvieron en DMF (1 mL) y se agitaron durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se concentró mediante evaporación en rotación bajo un vacío elevado. Se introdujo el residuo en una placa de TLC preparativa y se eluyó con una fase móvil de [30% (hidróxido de amonio al 10% en MeOH) y 70% diclorometano]. El compuesto del título se recogió como un sólido anaranjado brillante (7 mg, rendimiento del 64%).
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Ejemplos de otras sondas preparadas mediante el método B se muestran a continuación:
Compuesto H: Ácido N-{6-[2-(4-cloro-fenilamino)-5-nitro-pirimidin-4-ilamino]-hexil}-6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-isoftalámico
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Compuesto I: Ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{6-[2-(naftalen-2-ilamino)-5-nitro-pirimidin-4-ilamino]-hexil}-isoftalámico
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Compuesto J: Ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-{2-[2-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-etilcarbamoil]-etil}-isoftalámico
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Compuesto K: Ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-(2-{2-[3-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-propionilamino]-etilcarbamoil-etil)-isoftalámico
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Ejemplo 3 Ensayo de unión de inhibidores del dominio quinasa STK12
Paso uno
Caracterización de la sonda fluorescente
Inicialmente se evalúa un espectro de absorbancia de cada sonda. Los espectros de excitación y emisión se miden entonces para identificar las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas para detectar la sonda. Un ejemplo de tal sonda es el ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico en el que la excitación y emisión máximas son 496 nm y 524 nm, respectivamente. Estos espectros de fluorescencia se midieron en un fluorímetro SLM-8100 con la sonda disuelta en un tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, glicerol al 5%, TCEP 200 mM y CHAPS 0,01% (p/v), DMSO al 2%). La afinidad de la sonda por el dominio quinasa STK12 se determinó entonces en un experimento de titulación. El ensayo de polarización se realizó en placas de fonda plano negras opacas de 96 pocillos Coming Costar NBS. En este ejemplo, se utilizó un LJL Analyst con los filtros apropiados para las características de excitación/ emisión de la sonda fluorescente. Se realizó una dilución seriada del dominio quinasa STK12 en los pocillos que contenían sonda 25 nM para cubrir un amplio rango de concentración a lo largo de la placa. Además, varios pocillos contienen tanto sonda sola como sonda con la mayor concentración de dominio quinasa STK12. Esto se realiza para calcular la proporción Qb/ Qf del par sonda/ dominio quinasa. Esto es una medida de la intensidad total de sonda unida (Qb) dividido por la intensidad total de sonda libre (Qf), que es necesaria para incluirla en el análisis de datos para la determinación precisa de la K_{d}. Se utilizó un análisis de la regresión de mínimos cuadrados no lineal para calcular la constante de disociación en el equilibrio de la sonda a partir de los valores de polarización obtenidos de la unión del dominio quinasa STK12 a la sonda. La Figura 1 muestra los resultados de este experimento de titulación.
Paso dos
Cribado de inhibidores de unión de la sonda
La placa se prepara creando un complejo inicial entre el dominio quinasa STK12 y la sonda fluorescente ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico que se une al centro activo del dominio quinasa STK12. En este ejemplo, el complejo entre sonda y STK12, se preformó en tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM, glicerol al 5%, TCEP 200 mM y CHAPS 0,01% (p/v), DMSO al 2%). Las concentraciones de dominio quinasa STK12 y sonda en esta solución se prepararon de forma que la concentración final en el ensayo fue del dominio quinasa STK12 200 nM y de sonda 25 nM. Entonces se realizó una dilución seriada del compuesto de prueba en tampón de ensayo, a lo largo de la placa. El complejo preformado dominio quinasa STK12-sonda se añadió entonces a todos los pocillos y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La polarización de la fluorescencia se midió entonces utilizando un lector en placas de la polarización de la fluorescencia fijado en las longitudes de onda apropiadas para la sonda fluorescente. En este ejemplo, se utilizó un LJL Analyst con filtros apropiados para las características de excitación/ emisión de la sonda fluorescente. Entonces se utilizó un análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal para calcular las constantes de disociación en equilibrio del compuesto de prueba, un derivado nitropirimidina, que se une al dominio quinasa STK12 a partir de los valores de polarización de la sonda unida al dominio quinasa STK12 en presencia del compuesto de prueba.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de competición con dominio quinasa STK12200 nM, sonda 25 nM y una molécula de competición a varias diluciones seriadas. Estos resultados muestran un descenso en la polarización de la fluorescencia del complejo sonda - dominio quinasa STK12 en presencia del compuesto de prueba, que es una evidencia de que este compuesto de prueba es un inhibidor competitivo del dominio quinasa STK12 que compite con la sonda fluorescente ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico por el centro activo del dominio quinasa STK12.

Claims (7)

1. La sonda fluorescente con la siguiente fórmula general (I):
(I)R_{1}-L-X-Y
en la que
R_{1} es un radical de un compuesto que se une al centro activo de una quinasa;
L es un enlace directo o un grupo alquileno C_{1}-C_{16} grupo, un grupo alquenileno C_{2}-C_{16} o un grupo alquinileno C_{2}-C_{16}, en el que uno o más de los grupos -CH_{2}- disponibles presentes en el grupo alquileno C_{1}-C_{16}, grupo alquenileno C_{2}-C_{16} o grupo alquinileno C_{2}-C_{16,} están opcionalmente e independientemente reemplazados por -O-, -C(O)-, -S(O)_{p}-, en el que p es de 0 a 2, o -N(R_{2})-;
X se selecciona de entre el grupo que consiste en O, S, -N(R_{2})C(O)-, -C(O)N(R_{2})-, -N(R_{2})C(S)-, -C(S)N(R_{2})-, -N(R_{2})C(S)NH-, -NHC(S)N(R_{2})-, -N(R_{2})C(O)NH-, -NHC(O)N(R_{2}), -SO_{2}NR_{2}-, -NR_{2}SO_{2}-, -CH_{2}N(R_{2})-, -N(R_{2})CH_{2}-, -CH_{2}S-, -SCH_{2}-, -C(O)CH_{2}S-, -SC(O)CH_{2}-, -NHCH_{2}CH_{2}S-, -SCH_{2}CH_{2}NH-, -NC(O)O-, -ONC(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NH-N=C(R_{2})-, -C(R_{2})=N-NH-, -NHCH(R_{2})- y -CH(R_{2})NH-;
R_{2} es H o alquilo C_{1-3};
e Y es un marcaje fluorescente;
y en la que R_{1} es una nitropirimidina de fórmula (III)
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en la que R4 se selecciona de entre fenilo y naftilo, y está opcionalmente sustituido con de uno a tres grupos seleccionados de entre Cl, F, Br, I, -CH_{3}, -CN, -CO_{2}CH_{3}, -NO_{2}, -OH, -NH_{2} y -CF_{3}.
2. La sonda fluorescente de la reivindicación 1 escogida de entre:
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26
27 
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28
3. Un ensayo para la identificación de un agente inhibidor de quinasas que comprende los pasos de:
a) establecer la K_{d} de una sonda del centro activo por el lugar de unión de ATP;
b) poner en contacto la sonda del centro activo con una proteína que comprende un dominio quinasa y medir una señal de dicha sonda para establecer el nivel de la señal de línea de base;
c) incubar el complejo sonda del centro activo: quinasa con un agente inhibidor candidato y medir la señal de dicha sonda;
d) comparar la señal del paso b) con la señal del paso c);
e) obtener la K_{d} del agente inhibidor candidato en base a la K_{id} de la sonda por su lugar de unión de ATP y la respuesta a la dosis del agente inhibidor candidato; bajo condiciones en las que la sonda puede ser desplazada por el inhibidor candidato y en las que la sonda del centro activo se une al dominio de unión de ATP de dicha quinasa y dicha sonda del centro activo es la sonda del centro activo de la reivindicación 1 y/o reivindicación 2.
4. El ensayo de la reivindicación 3 en el que la proteína que comprende el dominio quinasa es una quinasa completa.
5. El método de la reivindicación 3 en el que la sonda es una sonda fluorescente y la señal se mide como un cambio en la polarización de la fluorescencia de la sonda.
6. Los métodos de la reivindicación 3 en los que el dominio quinasa es STK12.
7. El método de la reivindicación 3 en el que la sonda del centro activo es ácido 6-(2,7-difluoro-6-hidroxi-3-oxi-3H-xanten-9-il)-N-[6-(5-nitro-2-fenilamino-pirimidin-4-ilamino)-hexil]-isoftalámico con el dominio quinasa STK12.
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