JPH06172312A - １級アミノ基を有する化合物の蛍光標識化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】微量物質の蛍光標識化に極めて有効なピリジル
アミノ基を、水又は極性有機溶媒、或はこれらの混合溶
媒中に於いて穏和な条件下で１級アミノ基を有する化合
物に容易に導入し得る蛍光標識化試薬と、該標識化試薬
を用いた１級アミノ基を有する化合物の蛍光標識化方法
を提供する。 【構成】下記式 Ｒ１−（ＣＨ_２）_ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ
Ｏ−Ｒ２ Ｒ１−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｍ
−ＣＯＯ−Ｒ２ Ｒ１−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ
Ｏ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は２−ピリジルアミノ基又は３−ピリジル
アミノ基を表わし、Ｒ２は活性エステル化剤に起因する
基を表わし、ｍ及びｎは夫々独立して１〜４の整数を表
わす。）で示される化合物の内の何れかと、１級アミノ
基を有する化合物とを水又は極性有機溶媒、或はこれら
の混合溶媒中で反応させることを特徴とする、１級アミ
ノ基を有する化合物の蛍光標識化方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】本発明は、１級アミノ基を有する化
合物の水溶性蛍光標識化試薬として有用な新規な化合物
と、該化合物を蛍光標識化試薬として用いた１級アミノ
基を有する化合物の蛍光標識化方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】測定対象物質を蛍光物質で標識した後、
その蛍光を利用して該物質を測定する方法は、試料中に
ナノモル〜ピコモル程度しか含まれていない微量物質の
測定方法として広く利用されている。

【０００３】しかしながら、従来から用いられている測
定対象物質を蛍光標識するための試薬、即ちフルオレッ
センイソチオシアネート（FITC）、エオシン、クマリン
イソチオシアネート等の蛍光標識化試薬は、それ自体の
水溶性が低いため種々の問題点を有していた。即ち、例
えば水溶液中に含まれている微量物質を蛍光標識化する
際には、上記した如き蛍光標識化試薬は一旦極性有機溶
媒に溶解して用いなければならないため、蛍光標識化操
作が煩雑であることや、上記した如き蛍光標識化試薬を
用いて調製された蛍光標識化物質はそれ自体の水溶性が
低下するため、例えば上記蛍光標識化試薬を用いて調製
された蛍光標識化抗体を利用して他の物質の検出を行う
場合に必要濃度の水溶液を調製することができない場合
があること、等である。

【０００４】これらの問題点を解決する目的で、例えば
スルホ基、カルボキシル基等の水溶性基を導入した、ダ
ンシルクロライド、ルシファーイエロー、o-フタルアル
デヒド等の水溶性蛍光標識化試薬が開発された。しかし
ながら、これらを用いて調製された蛍光標識化物質は、
水溶性という面では改善されたものの、それ自体の保存
安定性が悪いため、調製後の保存ができないという問題
点を有していた。

【０００５】一方、2-アミノピリジン、3-アミノピリジ
ン等のアミノピリジンは、それ自体水溶性で且つ非常に
安定な蛍光物質であり、これにより標識された物質も保
存安定性に優れ、且つ標識対象物質が水溶性のものの場
合には水溶性がそのまま維持されるため、糖質等への蛍
光標識物質として近時広く利用されている化合物である
（Biochemical and Biophysical Research Communicati
ons vol.85,257頁,1978等)。

【０００６】しかしながら、アミノピリジンそのもの
を、例えば抗体、酵素、ホルモン、各種因子類（例えば
成長因子、増殖因子等）、ハプテン等の生理活性物質の
標識物質として用いるには問題があった。即ち、アミノ
ピリジンを用いた蛍光標識化方法としては、標識対象物
質のアルデヒド基にシッフ塩基を介して結合させる方法
が一般的であるが、該方法を利用してアミノピリジンを
標識対象物質に高収率で且つ定量的に結合させるために
は、標識操作を非水条件下で、且つ90℃前後の高温で行
なわなければならないため（Agri. Biol. Chem.,vol.5
4,2169頁,1990）、標識された抗体等の生理活性物質の
例えば抗体活性、酵素活性、生理活性等が失活する場合
が多いという問題がそれである。

【０００７】そのため、ピリジルアミノ基を、穏和な条
件下で抗体、酵素、ホルモン、各種因子類、ハプテン等
の生理活性物質に導入し得る標識化試薬の開発が望まれ
ていた。

【０００８】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、ピリジルアミノ基を、水又は極性有機溶
媒、或はこれらの混合溶媒中に於いて穏和な条件下で１
級アミノ基を有する化合物に容易に導入し得る蛍光標識
化試薬と、該標識化試薬を用いた１級アミノ基を有する
化合物の蛍光標識化方法を提供することをその目的とす
る。

【０００９】

【発明の構成】本発明は、下記一般式(1)、(2)又は(3) Ｒ1ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (1) Ｒ1ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ2 (2) Ｒ1-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (3) （式中、Ｒ1は2-ピリジルアミノ基又は3-ピリジルアミ
ノ基を表わし、Ｒ2は活性エステル化剤に起因する基を
表わし、ｍ及びｎは夫々独立して１〜４の整数を表わ
す。）で示される化合物の内の何れかと、１級アミノ基
を有する化合物とを水又は極性有機溶媒、或はこれらの
混合溶媒中で反応させることを特徴とする、１級アミノ
基を有する化合物の蛍光標識化方法、及び上記一般式
(1)、一般式(2)又は一般式(3)で示される化合物の発明
である。

【００１０】本発明の一般式(1)〜(3)で示される化合物
に於けるＲ2の活性エステル化剤に起因する基として
は、カルボキシル基の活性化剤に起因する基であって１
級アミノ基に対して反応性を有するものであれば何れに
てもよいが、具体的には例えばコハク酸イミド基、フタ
ル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミ
ド基、p-ニトロフェニル基等が好ましく挙げられる。

【００１１】一般式(1)で示される本発明化合物は、例
えば下記の合成ルートに従って容易に合成し得る。

【式１】 （上記反応スキーム中、Ｘはハロゲン原子を表わし、
ｍ、ｎ及びＲ2は前記と同じ。）

【００１２】即ち、先ず例えば2-クロロピリジン，2-ブ
ロモピリジン，3-クロロピリジン，3-ブロモピリジン等
の2-又は3-ハロピリジンと、該2-又は3-ハロピリジンに
対して10〜20倍モルのアルキレンジアミン（例えばエチ
レンジアミン，1,3-プロパンジアミン，1,4-ブタンジア
ミン等）とを80〜120℃で８〜 24時間撹拌下に反応させ
る。反応後、反応液を減圧濃縮し、目的物をクロロホル
ム、ジクロロエタン等で抽出し、溶媒留去後、残渣を、
適当な溶媒（例えばベンゼン−石油エ−テル混合溶媒
等）を用いて結晶化して、上記一般式(1a)で示されるア
ミノアルキルアミノピリジンを得る。次いで、該アミノ
アルキルアミノピリジンとこれに対して１〜３倍モルの
ジカルボン酸無水物（例えば無水コハク酸，無水グルタ
−ル酸，無水マレイン酸等）又は、ジカルボン酸（例え
ばコハク酸，グルタ−ル酸，マレイン酸等）の２分子間
脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは
前記に同じ）とを、例えばメタノ−ル、エタノ−ル、イ
ソプロパノール等の溶媒中、０〜30℃で２〜６時間撹拌
下に反応させる。反応後、析出晶を濾取、乾燥させて、
上記一般式(1b)で示される化合物（以下、化合物(1b)と
略記する。）を得る。＄ 次いで、この化合物(1b)を、
該化合物に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤［例
えばN-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイ
ミド（以下、ＨＯＮＢと略記する。）、N-ヒドロキシコ
ハク酸イミド（以下、ＨＯＳｕと略記する。）等］と、
例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等の溶媒中、例えば、化
合物(1b)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィ
ンと、これと等モルのジスルフィド化合物［例えば2,2'
-ジチオジピリジン（以下、2-ＰＤＳと略記する。）、
2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等］と、０〜40℃
で２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液を減
圧濃縮し、得られた残渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エ
チル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を用いて結晶化す
る等により、一般式(1)で示される本発明 化合物が得ら
れる。尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフィ
ンとジスルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代り
に、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等の縮合試薬を用いても、同
様に一般式(1)で示される本発明の 化合物が得られる。

【００１３】また、一般式(2)で示される本発明化合物
は、例えば下記の如き合成ルートに従って容易に合成し
得る。

【式２】 （上記反応スキーム中、Ｒはアルキル基を表わし、ｍ、
ｎ及びＲ2は前記と同じ。）

【００１４】即ち、先ず例えば2-アミノピリジン，3-ア
ミノピリジン等のアミノピリジンと、該アミノピリジン
に対して１〜３倍モルのジカルボン酸無水物（例えば無
水コハク酸，無水グルタ−ル酸，無水マレイン酸等）又
はジカルボン酸（例えばコハク酸，グルタ−ル酸，マレ
イン酸等）の２分子間脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-
ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは前記に同じ）とを、例えばエタノ
−ル、ＴＨＦ、トルエン、ベンゼン等の溶媒中、60〜10
0℃で２〜４時間、次いで10〜30℃で２〜４時間撹拌下
に反応させる。反応後、析出晶を濾取、乾燥させて、上
記一般式(2a)で示される化合物（以下、化合物(2a)と略
記する。）を得る。

【００１５】次いで、得られた化合物(2a)と、該化合物
に対して１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリ
シンエチルエステル，β−アラニンメチルエステル等）
とを、例えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、化合物(2
a)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィンと、
これと等モルのジスルフィド化合物（例えば2-ＰＤＳ，
2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等）の存在下、０
〜40℃で２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、不溶
物を瀘去し、溶媒を留去して得られた残渣を、例えばク
ロロホルム、ジクロロメタン等の溶媒で抽出し、抽出液
を例えば飽和重ソウ水，炭酸ナトリウム水溶液等のアル
カリ溶液、次いで水で順次洗浄する。その後、抽出液を
例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム等に
より乾燥し、溶媒を留去して得られた残渣を適当な溶媒
（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を
用いて結晶化する等により、上記一般式(2b)で示される
化合物を得る。これを、常法により鹸化してエステルを
加水分解すれば一般式(2c)で示される化合物（以下、化
合物(2c)と略記する。）が得られる。尚、上記化合物(2
a)と反応させるアミノ酸エステルは、例えば塩酸塩，硫
酸塩等の鉱酸塩となっているものでも良いが、その場合
は、通常これと等モルの塩基（例えばトリエチルアミ
ン，N-メチルモルホリン等）が併せて用いられる。ま
た、上記化合物(2a)とアミノ酸エステルとの脱水縮合反
応は、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合物の
組合せ試薬を用いる方法の代りに、例えばＤＣＣ，ＷＳ
Ｃ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸無水物法、アジド
法等のペプチドの合成の際に用いられる常法により行っ
てもよいことは言うまでもない。

【００１６】次いで、得られた化合物(2c)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(2c)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テ
ル混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式
(2)で示される本発明化合物が得られる。尚、上記反応
に於いて、トリフェニルホスフィンとジスルフィド化合
物の組合せ試薬を用いる代りに、例えばＤＣＣ、ＷＳＣ
等の縮合試薬を用いても、同様に一般式(2)で示される
本発明の化合物が得られる。

【００１７】また、一般式(3)で示される本発明化合物
は、例えば下記の合成ルートに従って容易に合成し得
る。

【式３】 （上記反応スキーム中、Ｒ'はアルキル基を表わし、ｋ
は０〜２の整数を表わし、ｍ、ｎ及びＲ2は前記と同
じ。）

【００１８】即ち、例えば2-アミノピリジン，3-アミノ
ピリジン等のアミノピリジンと、該アミノピリジンに対
して１〜３倍モルの不飽和脂肪酸エステル（例えばアク
リル酸メチル，アクリル酸エチル，ビニル酢酸メチル，
アリル酢酸エチル等）とを、例えば2,5-ジ-tert-ブチル
ヒドロキノン等の重合禁止剤の存在下、60〜100℃で12
〜36時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液を、例え
ばベンゼン、トルエン等の溶媒中に注入して、析出した
結晶を瀘去し、溶媒を留去して得られた残渣を、適当な
溶媒（例えばベンゼン−ヘキサン混合溶媒等）から再結
晶することにより、上記一般式(3a)で示される化合物を
得る。次いで、これを、常法により鹸化してエステルを
加水分解すれば、一般式(3b)で示される化合物（以下、
化合物(3b)と略記する。）が得られる。

【００１９】得られた化合物(3b)と、該化合物に対して
１〜３倍モルのアミノ酸エステル（例えばグリシンエチ
ルエステル，β−アラニンメチルエステル等）とを、例
えばＤＭＦ、ジオキサン等の溶媒中、例えば、該化合物
に対して１〜３倍モルの例えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合
試薬の存在下、０〜30℃で12〜36時間撹拌下に反応させ
る。反応後、不溶物を瀘去し、濾液を減圧濃縮して得ら
れた残渣を例えばクロロホルム、ジクロロメタン等の溶
媒で抽出し、抽出液を例えば飽和重ソウ水、炭酸ナトリ
ウム水溶液等のアルカリ溶液、次いで水で順次洗浄す
る。抽出液を例えば無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグ
ネシウム等により乾燥後、溶媒を留去して、得られた残
渣を適当な溶媒（例えば酢酸エチル−ジエチルエ−テル
混合溶媒等）を用いて結晶化する等により、一般式(3c)
で示される化合物を得る。次いで、これを、常法により
鹸化してエステルを加水分解すれば、一般式(3d)で示さ
れる化合物（以下、化合物(3d)と略記する。）が得られ
る。尚、上記化合物(3b)と反応させるアミノ酸エステル
は、例えば塩酸塩，硫酸塩等の鉱酸塩となっているもの
でも良いが、その場合は、通常これと等モルの塩基（例
えばトリエチルアミン，N-メチルモルホリン等）が併せ
て用いられる。また、上記化合物(3b)とアミノ酸エステ
ルとの脱水縮合反応は、トリフェニルホスフィンとジス
ルフィド化合物の組合せ試薬を用いる方法の代りに、例
えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いる方法、混合酸
無水物法、アジド法等のペプチドの合成の際に用いられ
る常法により行ってもよいことは言うまでもない。

【００２０】次いで、得られた化合物(3d)を、該化合物
に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤（例えばＨＯ
ＮＢ、ＨＯＳｕ等）と、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキ
サン等の溶媒中、化合物(3d)に対して１〜３倍モルのト
リフェニルホスフィンと、これと等モルのジスルフィド
化合物（例えば2-ＰＤＳ、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピ
リジン)等）の存在下、０〜40℃で２〜８時間撹拌下に
反応させる。反応後、反応液を減圧濃縮し、得られた残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ等により精製す
れば、一般式(3)で示される本発明の化合物が得られ
る。尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフィン
とジスルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代りに、
例えばＤＣＣ，ＷＳＣ等の縮合試薬を用いても、同様に
一般式(3)で示される本発明の化合物が容易に得られ
る。

【００２１】本発明の蛍光標識化方法は、例えば１級ア
ミノ基を有する化合物と、該化合物の１級アミノ基１当
量に対して、通常１〜10当量、好ましくは１〜５当量、
より好ましくは２〜４当量の、一般式(1)、一般式(2)又
は一般式(3)で示される本発明の化合物とを、水、又は
例えばメタノール，エタノール等のアルコール類、アセ
トン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性
有機溶媒、或はこれら極性有機溶媒と水との混合溶媒
（以下、これらを総称して「水溶媒等」と略記する。）
中で反応させることにより容易に実施し得る。

【００２２】尚、上記反応を実施する際の水溶媒等のp
Ｈとしては、１級アミノ基を有する化合物の安定性に影
響がない範囲であれば特に限定されないが、一般式(1)
〜(3)で示される本発明の化合物の反応性を勘案する
と、中性〜弱アルカリ性（pＨ６〜10程度）が望まし
い。また、上記反応液中には、本発明の化合物と１級ア
ミノ基との反応を阻害しないものであれば、例えばリン
酸塩，重炭酸塩等の１級アミノ基を有さない緩衝剤、防
腐剤、界面活性剤、安定化剤等が共存していてもよい。

【００２３】本発明の方法は、蛍光標識化に際して、従
来のダンシルクロライドによる蛍光標識化のように極性
有機溶媒の使用が必須ではないため、例えば抗体、酵
素、ホルモン、各種因子類（例えば成長因子、増殖因子
等）、ハプテン等の生理活性物質等、有機溶媒により変
性されやすい物質への標識を容易に行うことが可能とな
った。

【００２４】本発明の方法により蛍光標識化が可能な１
級アミノ基を有する化合物としては、水溶媒等に１ピコ
モル以上の濃度で溶解する性質を有する化合物であっ
て、且つ１級アミノ基を有する化合物であれば、天然
品、合成品を問わず特に限定することなく挙げられる
が、より具体的には例えばアミノ酸、例えばグルタチオ
ン，アンジオテンシンＩ，アンジオテンシンII，エンド
ルフィン，エンドセリン等のペプチド類、例えばイムノ
グロブリン，アルブミン，トランスフェリン，甲状腺刺
激ホルモン（ＴＳＨ），ヒト絨毛性ゴナドトロピン（h
ＣＧ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），黄体形成ホルモ
ン（ＬＨ）等の糖蛋白質（又は蛋白質）、これら糖蛋白
質（又は蛋白質）を例えばトリプシン，キモトリプシ
ン，ペプシン，パパイン，Ｖ８プロテアーゼ等のプロテ
アーゼで処理して得られる糖ペプチドフラグメント（又
はペプチドフラグメント）等が好ましく挙げられる。ま
た、本発明の方法により蛍光標識化が可能な１級アミノ
基を有する糖蛋白質（又は糖ペプチドフラグメント）に
於ける糖鎖としては、その構成糖の種類及び数には特に
制限はないが、例えばグルコース，マンノース，ガラク
トース，フコース，シアル酸，N-アセチルグルコサミ
ン，N-アセチルガラクトサミン等の糖残基から構成さ
れ、その糖残基の数が１〜１０個程度のものが好ましく
挙げられる。また、該糖鎖の糖残基間の結合の種類にも
特に制限はなく、例えばα１→４，β１→４，α１→
６，α２→３，β１→２，β１→３，α２→６，α１→
３，α１→２，β１→６等何れにてもよい。但し、本発
明の方法により蛍光標識化した糖蛋白質（糖ペプチド）
を糖転移酵素のアクセプターや糖分解酵素の基質として
使用する場合には、該糖蛋白質（又は糖ペプチド）の糖
鎖は、目的とする糖転移酵素のアクセプターや糖分解酵
素の基質となり得るものでなければならないことは言う
までもない。

【００２５】本発明の蛍光標識化方法は、以下に述べる
如く様々な応用が可能である。即ち、例えば１級アミノ
基を有する化合物がアミノ酸である場合には、アミノ酸
組成分析のためのアミノ酸の蛍光標識化方法として、ま
た、１級アミノ基を有する化合物がペプチドである場合
には、例えばa)プロテアーゼ処理後のペプチドフラグメ
ントの検出のための蛍光標識化方法、b)例えば血清、血
漿、尿、髄液等の生体体液中に含まれる超微量ペプチド
（ホルモン等）を検出するための蛍光標識化方法、c)プ
ロテアーゼ活性測定用の蛍光標識化ペプチド基質の調製
方法、d)蛍光標識化ペプチドの調製方法、e)ペプチドの
Ｎ末端保護方法、等として、更にまた、１級アミノ基を
有する化合物が蛋白質である場合には、例えばa)蛍光標
識化抗体の調製方法、b)例えば血清、血漿、尿、髄液等
の生体体液中に含まれる超微量蛋白質を検出するための
蛍光標識化方法（特に、ＵＶ吸収や酵素活性で検出でき
ない微量蛋白質を検出するのに有効である。）、c)プロ
テアーゼ活性測定用の蛍光標識化蛋白質基質の調製方
法、d)蛍光標識化蛋白質の調製方法、等として、また、
１級アミノ基を有する化合物が糖ペプチドや糖蛋白質で
ある場合には、例えばa)フコース、シアル酸、ガラクト
ース、Ｎ−アセチルグルコサミン等を転移する糖転移酵
素の蛍光標識化アクセプターの調製方法、b)各種糖分解
酵素活性測定用の蛍光標識化基質の調製方法、等として
本発明方法は広く利用可能である。

【００２６】尚、本発明の方法は、１級アミノ基を有す
る化合物であれば特に限定されることなく蛍光標識化が
可能であるので、その用途は上記した如きものに限定さ
れるものではないことは言うまでもない。

【００２７】従来、主に用いられてきたダンシルクロラ
イド、フェニルチオヒダントイン(PTH)、ルシファイエ
ロー等の蛍光標識化剤により蛍光標識化されたアミノ
酸、ペプチド、蛋白質、糖ペプチド、糖蛋白質等は保存
時の安定性が悪いため、標準品でさえ用時調製しなけれ
ばならないという問題点を有していた。一方、本発明化
合物を用いて蛍光標識化されたアミノ酸、ペプチド、蛋
白質、糖ペプチド、糖蛋白質等は保存時の安定性が極め
て高いので、予め調製したものを標準品として適宜使用
することが可能である。尚、本発明化合物により蛍光標
識化されたアミノ酸、ペプチド、蛋白質、糖ペプチド、
糖蛋白質等の検出感度は数ヒ゜コモルと極めて高感度であ
る。以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるもの
ではない。

【００２８】

【実施例】

実施例１．2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸 5-
ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル（ＰＡ
Ｅ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ）の合成 1)2-(2-アミノエチル)アミノピリジン（ＰＡＥＡ）の合
成 2-クロルピリジン85gとエチレンジアミン450gとを、120
℃で８時間還流下に反応させた。反応終了後、反応液を
減圧濃縮し、クロロホルムにより目的物を抽出した。抽
出液からクロロホルムを留去し、残渣をベンゼン−石油
エ−テル（１：５）で再結晶して、ＰＡＥＡ86gを得た
（収率83.7％）。 融点：36〜40℃。 ＩＲνmax(neat)cm^-1：3500〜3100(NH)、3000〜2800(-C
H₂-)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、CDCl₃）δppm：1.64(bs,2H,N
H₂)、2.82〜3.58(m,4H,-CH₂CH₂-)、6.40〜8.24(m,4H,ピ
リジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 137（Ｍ⁺）。

【００２９】2)2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸
（ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＨ）の合成 上記1)で得たＰＡＥＡ10gと無水コハク酸7.3gとをエタ
ノ−ル300mlに溶解し、室温にて２時間撹拌下に反応さ
せた。反応終了後、析出晶を濾取し、乾燥させてＰＡＥ
−Ｓｕｃ−ＯＨ13.6gを得た（収率78.6％）。 融点：128〜130℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、1700(カルボン
酸)、1660,1560(アミド)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.32(t,2H,Suc
-CH₂-,J=6.48Hz)、2.34(t,2H,Suc-CH₂-,J=6.48Hz)、3.2
0〜3.30(m,4H,AEA-CH₂-CH₂-)、6.43〜7.95(m,4H,ピリジ
ン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 237（Ｍ⁺）。

【００３０】3)2-ピリジルアミノエチルスクシナミン酸
5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドエステル
（ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ）の合成 上記2)で得たＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＨ 2.37gと、N-ヒドロ
キシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド（ＨＯＮ
Ｂ）1.8gとを、ＤＭＦ50mlに溶解し、これに、2,2'-ジ
チオジピリジン（2ーＰＤＳ）2.2gと、トリフェニルホス
フィン2.6gを含むＤＭＦ溶液20mlを添加した後、室温で
４時間撹拌下に反応させた。反応終了後、ＤＭＦを減圧
留去し、得られた残渣を酢酸エチル−エ−テルで結晶化
して、下記化学式で示されるＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢ2.
5gを得た（収率62.5％）。

【化１】 融点：122℃〜(dec.)。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3100(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1780(エステル)、1660,1600(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：1.60(m,2H,N
B)、2.50〜2.88(m,4H,AEA-CH₂CH₂-)、3.33〜3.60(m,8H,
Suc-CH₂CH₂- and NB)、6.23(s,2H,NB)、6.50〜8.16(m,4
H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 398（Ｍ⁺）。

【００３１】実施例２．N-(2-ピリジル)スクシナモイル
アミノプロピオン酸 コハク酸イミドエステル（Ｐｙ−
Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ）の合成 1)2-ピリジルスクシナミン酸（Ｐｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ）の
合成 2-アミノピリジン131gと無水コハク酸139gとを、トルエ
ン２ｌに懸濁させた後、90℃で１時間、更に室温で１時
間撹拌下に反応させた。反応終了後、析出晶を濾取し、
乾燥させてＰｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ195gを得た（収率72.2
％）。 融点：171〜172℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3000(NH)、1700(カルボン
酸)、1620,1580(アミド)、780(ピリジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：1.84(dd,2H,-C
H₂-,J=6.21)、1.98(dd,2H,-CH₂-,J=6.21)、6.35〜7.62
(m,4H,ピリジン環)、9.72(s,1H,NH)、11.36(s,1H,カル
ボン酸)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 194（Ｍ⁺）。

【００３２】2)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプ
ロピオン酸 メチルエステル（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＭｅ）の合成 上記1)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−ＯＨ 9.7gとβ-アラニン
メチルエステル塩酸塩7.0gとをＤＭＦ250mlに溶解し、
これにトリエチルアミン7.0mlを加えた後、2-ＰＤＳ11.
0gとトリフェニルホスフィン13.1gを含むＤＭＦ溶液100
mlを加えて、室温で６時間撹拌下に反応させた。反応終
了後、反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をクロロホル
ムで抽出、抽出液を飽和重ソウ水、飽和食塩水で順次洗
浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥
後、クロロホルムを留去し、得られた残渣を酢酸エチル
−エ−テルで再結晶して、Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭ
ｅ11.7gを得た（収率84.0％）。 融点：135〜139℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3100(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1740(エステル）、1660,1580(アミド)、780(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.36〜2.51(m,
4H,Suc-CH₂CH₂-,J=7.02)、2.61(t,2H,Ala-CH₂CO,J=6.2
1)、3.26(t,2H,AlaN-CH₂-,J=6.21)、3.60(s,3H,CH₃)、
7.02〜8.28(m,5H,ピリジン環 and NH)、10.41(s,1H,N
H)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 279（Ｍ⁺）。

【００３３】3)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプ
ロピオン酸（Ｐｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成 上記2)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＭｅ 15.4gと水
酸化ナトリウム2.5gとを、水200mlとメタノ−ル100mlの
混合溶媒に溶解し、室温で８時間撹拌下に反応させた。
反応終了後、1N-塩酸62mlで中和し、液量が100mlになる
まで減圧濃縮した。析出した結晶を濾取し、水、アセト
ンで順次洗浄した後乾燥させてＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−
ＯＨ12.1gを得た（収率82.5％）。 融点：186〜189℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3500〜3200(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1700(カルボン酸)、1680〜1550(アミド)、800(ピ
リジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.35〜2.42(m,
4H,Suc-CH₂CH-,J=7.02)、2.61(t,2H,Ala-CH₂CO,J=6.4
8)、3.24(dd,2H,AlaN-CH₂-J=6.48)、7.03〜8.08(m,5H,
ピリジン環 and NH)、10.42(s,1H,NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 265（Ｍ⁺）。

【００３４】4)N-(2-ピリジル)スクシナモイルアミノプ
ロピオン酸 コハク酸イミドエステル（Ｐｙ−Ｓｕｃ−
Ａｌａ−ＯＳｕ）の合成 上記3)で得たＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＨ 2.7gとN-ヒ
ドロキシコハク酸イミド1.2gとを、ＤＭＦ50mlに溶解
し、これに、2-ＰＤＳ2.2gとトリフェニルホスフィン2.
6gを含むＤＭＦ溶液20mlを添加した後、室温で４時間撹
拌下に反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、
得られた残渣を酢酸エチル−エ−テルで結晶化して、下
記化学式で示されるＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ3.4g
を得た（収率93.1％）。

【化２】 融点：172〜176℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、3100〜2900(-CH
₂-)、1790(エステル)、1660,1580(アミド)、790(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.42〜2.59(m,
4H,Suc-CH₂CH₂-,J=7.02)、2.83(s,4H,Su)、2.83〜2.97
(m,2H,Ala-CH₂CO)、3.24〜3.42(dd,2H,AlaN-CH₂-,J=6.2
1)、7.00〜8.45(m,4H,ピリジン環)、10.47(b,1H,NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 362（Ｍ⁺）。

【００３５】実施例３．N-(2ーピリジル)ーβ-アラニルア
ミノプロピオン酸 5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシ
イミドエステル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢ）の合
成 1)N-(2-ピリジル)-β-アラニン メチルエステル（Ｐｙ
−Ａｌａ−ＯＭｅ）の合成 2-アミノピリジン94gにアクリル酸メチル100mlと2,5-ジ
-tert-ブチルヒドロキノン1.1gを加え、撹拌下24時間還
流反応させた。反応終了後、反応液をベンゼン１ｌに注
ぎ、０℃で５時間放置した。析出した結晶を瀘去し、瀘
液を濃縮して得られた残渣をベンゼン−ヘキサン（１：
５）で結晶化して、Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＭｅ64.5gを得た
（収率35.8％）。 融点：48〜49℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3200(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1760(エステル)、1610,1580(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（270MHz、DMSO-d6）δppm：2.57(t,2H,-CH
₂CO-,J=7.02)、3.48(dd,2H,NCH₂-,J=7.02)、3.60(s,3H,
CH₃)、6.44〜7.98(m,4H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 180（Ｍ⁺）。

【００３６】2)N-(2-ピリジル)-β-アラニン（Ｐｙ−Ａ
ｌａ−ＯＨ）の合成 上記1)で得たＰｙ−Ａｌａ−０Ｍｅ 62.1gを水620mlに
懸濁し、撹拌下24時間還流反応させた。反応終了後、水
を減圧留去し、得られた残渣をエタノ−ルで再結晶し
て、Ｐｙ−Ａｌａ−ＯＨ43.1gを得た（収率75.2％）。 融点：136〜138℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300〜3000(NH)、3000〜2800(-CH
₂-)、1700(カルボン酸)、1640,1550(アミド)、760(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ-ＮＭＲ（270MHz、DMSOーd6）δppm：2.50(t,2H,-CH₂
CO,J=6.75)、3.45(m,2H,NCH₂-,J=6.75)、6.44〜7.98(m,
4H,ピリジン環)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 166（Ｍ⁺）。

【００３７】3)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロ
ピオン酸 メチルエステル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｏ
Ｍｅ）の合成 ＤＭＦ60mlに、上記2)で得たＰｙ−Ａｌａ−ＯＨ 3.3g
とβ-アラニン メチルエステル塩酸塩 2.8g及びＤＣＣ
4.1gを加え、これに更にトリエチルアミン2.8mlを加え
て、室温で24時間撹拌下に反応させた。反応終了後、不
溶物を瀘去し、瀘液を減圧濃縮して得られた残渣をクロ
ロホルムで抽出し、抽出液を飽和重ソウ水、飽和食塩水
で順次洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウム
で乾燥後、クロロホルムを留去し、得られた残渣を酢酸
エチル−エ−テルで再結晶して、Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ
−ＯＭｅ4.3gを得た（収率86.5％）。 融点：68〜70℃。 ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3400〜3200(NH)、3100〜2800(-CH
₂-)、1730(エステル)、1650,1600(アミド)、780(ピリジ
ン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：2.35〜2.69(m,4
H,2×Ala-CH₂CO)、3.30〜3.57(m,4H,2×AlaN-CH₂-)、3.
59(s,3H,CH₃)、6.33〜8.02(m,6H,ピリジン環 and 2×N
H)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 251（Ｍ⁺）。

【００３８】4)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロ
ピオン酸（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ）の合成 上記3)で得たＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＭｅ 16.0gと水
酸化ナトリウム2.6gとを、水200mlとメタノ−ル100mlの
混合溶媒に溶解した後、室温で24時間撹拌下に反応させ
た。反応終了後、1N-塩酸64mlで中和し、減圧濃縮し
た。得られた残渣を水−エタノ−ル（１：５）で再結晶
して、Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ14.7gを得た（収率9
7.4％）。 融点：146〜149℃ ＩＲνmax(KBr)cm^-1：3300(NH)、3000〜2800(-CH₂-)、1
680(カルボン酸)、1630,1550(アミド)、760(ピリジン
環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSP-d6）δppm：2.20〜2.59(m,4
H,2×Ala-CH₂CO)、3.09〜3.64(m,4H,2×AlaN-CH₂-)、6.
38〜8.09(ピリジン環 and 2×NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 237（Ｍ⁺）。

【００３９】5)N-(2-ピリジル)-β-アラニルアミノプロ
ピオン酸 5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミドエス
テル（Ｐｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−０ＮＢ）の合成 上記4)で得たＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＨ 3.6gとＨＯ
ＮＢ 2.7gとを、ＤＭＦ75mlに溶解し、次いで、これ
に、2-ＰＤＳ 3.3gとトリフェニルホスフィン3.9gを含
むＤＭＦ溶液30mlを加えた後、室温で６時間撹拌下に反
応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、得られた
残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（溶出液；クロロホ
ルム−アセトン＝１：１の混合溶媒）にて精製し、下記
化学式で示されるＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢ2.4gを
油状物質として得た（収率40.5％）。

【化３】 ＩＲνmax(neat)cm^-1：3600〜3200(NH)、3100〜2900(-C
H₂-)、1780(エステル)、1700,1580(アミド)、760(ピリ
ジン環)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（60MHz、DMSO-d6）δppm：1.29(s,2H,N
B)、2.41〜2.85(m,4H,2×Ala-CH₂CO)、3.09〜3.68(m,8
H,2×AlaNCH₂- and NB)、6.15(s,2H,NB)、6.44〜7.97
(m,6H,ピリジン環 and 2×NH)。 ＭＳ：ｍ／ｚ 398（Ｍ⁺）。

【００４０】実施例４．アミノ酸の蛍光標識化 （蛍光標識化試液）上記実施例１で得られたＰＡＥ−Ｓ
ｕｃ−ＯＮＢを蒸留水に溶解して0.1M溶液としたものを
蛍光標識化試液とした。 （反応緩衝液）炭酸水素ナトリウムを蒸留水に溶解し、
0.2Mとしたものを反応緩衝液とした。 （アミノ酸試料）グリシン、アスパラギン酸、リジン及
びフェニルアラニンを夫々蒸留水に溶解し、夫々0.1Mと
したものをアミノ酸試料とした。 （操作法）蛍光標識化試液20μl、反応緩衝液70μl及び
所定のアミノ酸試料10μlを混合した後、37℃で３時間
反応させた。反応終了後、反応液10μlをとり、これに
蒸留水200μlを加えてよく混合し、その20μlを高速液
体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分析した。尚、
ＨＰＬＣの測定条件は以下の通り。 ・装置：SHIMADSU LC-6A（(株)島津製作所製）。 ・カラム：Wakopak 5C18 (4.6 x 150 mm) （和光純薬
工業（株）製）。 ・溶離液Ａ：0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・溶離液Ｂ：30% アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・グラジエント：Ａ→Ｂ 0→17分 （リニア
グラジエント） Ｂ 17→20分 ・溶離液流速：1.5ml/min。 ・カラム温度：55℃。 ・蛍光検出波長：励起波長314nm及び蛍光波長386nm。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果を図１に示す。尚、図
中、１はアミノ酸としてアスパラギン酸を含むアミノ酸
試料を用いて得られたＨＰＬＣによる分析結果を、２は
アミノ酸としてリジンを含むアミノ酸試料を用いて得ら
れたＨＰＬＣによる分析結果を、３はアミノ酸としてグ
リシンを含むアミノ酸試料を用いて得られたＨＰＬＣに
よる分析結果を、４はアミノ酸としてフェニルアラニン
を含むアミノ酸試料を用いて得られたＨＰＬＣによる分
析結果を、５は蒸留水を試料として得られたＨＰＬＣに
よる分析結果を夫々示す。図１から明らかな如く、何れ
のアミノ酸試料の場合も、10.8分にＰＡＥＡ−Ｓｕｃ−
ＯＮＢの分解物が溶出し、15分付近に未反応のＰＡＥＡ
−Ｓｕｃ−ＯＮＢが溶出していることが判る。一方、蛍
光標識化アスパラギン酸は10.2分に、蛍光標識化リジン
は10.3分に、蛍光標識化グリシンは9.8分に、蛍光標識
化リジンは10.3分に、蛍光標識化フェニルアラニンは1
7.8分に、夫々特異的なピークが得られることが判る。
以上の結果から、本発明の蛍光標識化方法を利用して、
アミノ酸組成分析が可能であることが判る。

【００４１】実施例５．アンジオテンシンIIの蛍光標識
化及びその定量 （蛍光標識化試液）実施例４と同じ。 （反応緩衝液）実施例４と同じ。 （試料）ヒト・アンジオテンシンII（(株)ペプチド研究
所製）0.58mgを蒸留水に適宜溶解して、ヒト・アンジオ
テンシンIIを10、50、100、250及び500μg/ml含む溶液
を調製し、試料とした。 （操作法）蛍光標識化試液20μl、反応緩衝液60μl及び
所定の試料20μlを混合した後、37℃で３時間反応させ
た。反応終了後、反応液10μlをとり、これに蒸留水200
μlを加えてよく混合し、その100μlをＨＰＬＣにより
分析した。尚、ＨＰＬＣの測定条件は以下の通り。 ・装置：SHIMADSU LC-6A（(株)島津製作所製）。 ・カラム：Wakopak 5C18 (4.6 x 150 mm) （和光純薬
工業（株）製）。 ・溶離液Ａ：0.1M 酢酸アンモニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・溶離液Ｂ：60% アセトニトリルを含む0.1M 酢酸アン
モニウム緩衝液 (pH 4.0)。 ・グラジエント：Ａ 0→ 5分 Ａ→Ｂ 5→20分 （リニアグラジエント） Ｂ 20→25分 ・溶離液流速：1.5ml/min。 ・カラム温度：55℃。 ・蛍光検出波長：励起波長314nm及び蛍光波長386nm。 （結果）ＨＰＬＣによる分析結果を図２に、また、試料
中のヒト・アンジオテンシンII濃度と蛍光標識化ヒト・
アンジオテンシンIIの蛍光強度との関係を示すグラフを
図３に夫々示す。図２から、蛍光標識化ヒト・アンジオ
テンシンIIは15.9分に溶出することが判った。また、図
３より、試料中のヒト・アンジオテンシンII濃度と、該
試料を用いて得られる蛍光標識化ヒト・アンジオテンシ
ンIIの蛍光強度との関係を示すグラフは良好な直線性を
示すことが判る。以上の結果から、本発明化合物はヒト
・アンジオテンシンIIと定量的に反応し、本発明の方法
によりヒト・アンジオテンシンIIを蛍光標識化すること
により、試料中のヒト・アンジオテンシンII量を高感度
で定量することができることが判った。

【００４２】尚、ＰＡＥ−Ｓｕｃ−ＯＮＢの代りに、実
施例２で得られたＰｙ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−ＯＳｕ又は実
施例３で得られたＰｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＮＢを用い
てヒト・アンジオテンシンIIを蛍光標識化した場合も、
上記と同様の結果が得られた。このことから、これらを
蛍光標識化試薬として用いた場合も、試料中のヒト・ア
ンジオテンシンII量を高感度で定量することができるこ
とが判った。

【００４３】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、微量物質の
蛍光標識化に極めて有効なピリジルアミノ基を、水溶媒
等中に於いて１級アミノ基を有する化合物に容易に導入
し得る水溶性蛍光標識化試薬と、これを用いた１級アミ
ノ基を有する化合物へのピリジルアミノ基の導入方法を
提供するものであり、本発明によれば、従来の方法では
抗体、酵素、ホルモン、各種因子類、ハプテン等の生理
活性物質にこれらの活性を保持させたまま導入するのが
難しかったピリジルアミノ基を、穏和な条件下でこれら
の活性を保持させたまま導入することが可能となる点に
優れた効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で得られた、本発明により蛍光標識化
された各種アミノ酸の高速液体クロマトグラフィ（ＨＰ
ＬＣ）による分析結果を示す。

【図２】実施例５で得られた、本発明により蛍光標識化
されたヒト・アンジオテンシンIIのＨＰＬＣによる分析
結果を示す。

【図３】実施例５で得られた、本発明化合物により蛍光
標識化されたヒト・アンジオテンシンIIの濃度（μg/m
l）と蛍光強度（10-3μV）との関係を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

図１に於ける各符号は夫々以下のものを示す。 １ アミノ酸としてアスパラギン酸を含むアミノ酸試料
を用いて得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ２ アミノ酸としてリジンを含むアミノ酸試料を用いて
得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ３ アミノ酸としてグリシンを含むアミノ酸試料を用い
て得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ４ アミノ酸としてフェニルアラニンを含むアミノ酸試
料を用いて得られたＨＰＬＣによる分析結果。 ５ 蒸留水を試料として得られたＨＰＬＣによる分析結
果。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年１月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】即ち、先ず例えば2-クロロピリジン，2-ブ
ロモピリジン，3-クロロピリジン，3-ブロモピリジン等
の2-又は3-ハロピリジンと、該2-又は3-ハロピリジンに
対して10〜20倍モルのアルキレンジアミン（例えばエチ
レンジアミン，1,3-プロパンジアミン，1,4-ブタンジア
ミン等）とを80〜120℃で８〜 24時間撹拌下に反応させ
る。反応後、反応液を減圧濃縮し、目的物をクロロホル
ム、ジクロロエタン等で抽出し、溶媒留去後、残渣を、
適当な溶媒（例えばベンゼン−石油エ−テル混合溶媒
等）を用いて結晶化して、上記一般式(1a)で示されるア
ミノアルキルアミノピリジンを得る。次いで、該アミノ
アルキルアミノピリジンとこれに対して１〜３倍モルの
ジカルボン酸無水物（例えば無水コハク酸，無水グルタ
−ル酸，無水マレイン酸等）又は、ジカルボン酸（例え
ばコハク酸，グルタ−ル酸，マレイン酸等）の２分子間
脱水縮合物{[ＨＯＯＣ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ]₂Ｏ}（式中ｎは
前記に同じ）とを、例えばメタノ−ル、エタノ−ル、イ
ソプロパノール等の溶媒中、０〜30℃で２〜６時間撹拌
下に反応させる。反応後、析出晶を濾取、乾燥させて、
上記一般式(1b)で示される化合物（以下、化合物(1b)と
略記する。）を得る。次いで、この化合物(1b)を、該化
合物に対して１〜３倍モルの活性エステル化剤［例えば
N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
（以下、ＨＯＮＢと略記する。）、N-ヒドロキシコハク
酸イミド（以下、ＨＯＳｕと略記する。）等］と、例え
ばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、ジオキサン等の溶媒中、例えば、化合物
(1b)に対して１〜３倍モルのトリフェニルホスフィン
と、これと等モルのジスルフィド化合物［例えば2,2'-
ジチオジピリジン（以下、2-ＰＤＳと略記する。）、2,
2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)等］と、０〜40℃で
２〜８時間撹拌下に反応させる。反応後、反応液 を減
圧濃縮し、得られた残渣を、適当な溶媒（例えば酢酸エ
チル−ジエチルエ−テル混合溶媒等）を用いて結晶化す
る等により、一般式(1)で示される本発明の化合物が得
られる。尚、上記の反応に於いて、トリフェニルホスフ
ィンとジスルフィド化合物との組合せ試薬を用いる代り
に、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）等の縮合試薬を用いても、同
様に一般式(1)で示される本発明の化合物が得られる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】即ち、例えば2-アミノピリジン，3-アミノ
ピリジン等のアミノピリジンと、該アミノピリジンに対
して１〜３倍モルのアクリル酸エステル（例えばアクリ
ル酸メチル，アクリル酸エチル等）とを、例えば2,5-ジ
-tert-ブチルヒドロキノン等の重合禁止剤の存在下、60
〜100℃で12〜36時間撹拌下に反応させる。反応後、反
応液を、例えばベンゼン、トルエン 等の溶媒中に注入
して、析出した結晶を瀘去し、溶媒を留去して得られた
残渣を、適当な溶媒（例えばベンゼン−ヘキサン混合溶
媒等）から再結晶することにより、上記一般式(3a)で示
される化合物を得る。次いで、これを、常法により鹸化
してエステルを加水分解すれば、一般式(3b)で示される
化合物（以下、化合物(3b)と略記する。）が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/533 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 1/06 8318−4Ｈ (72)発明者 田中 巧 尼崎市高田町６番１号 和光純薬工業株式 会社大阪研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式(1)、(2)又は(3) Ｒ1ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (1) Ｒ1ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ2 (2) Ｒ1-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (3) （式中、Ｒ1は2-ピリジルアミノ基又は3-ピリジルアミ
   ノ基を表わし、Ｒ2は活性エステル化剤に起因する基を
   表わし、ｍ及びｎは夫々独立して１〜４の整数を表わ
   す。）で示される化合物の内の何れかと、１級アミノ基
   を有する化合物とを水又は極性有機溶媒、或はこれらの
   混合溶媒中で反応させることを特徴とする、１級アミノ
   基を有する化合物の蛍光標識化方法。
2. 【請求項２】１級アミノ基を有する化合物が、アミノ
   酸、ペプチド、蛋白質、糖ペプチド又は糖蛋白質であ
   る、請求項１に記載の蛍光標識化方法。
3. 【請求項３】下記一般式(1) Ｒ1ー(ＣＨ₂)m-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (1) で示される化合物。（式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ及びｎは前記
   に同じ。）
4. 【請求項４】下記一般式(2) Ｒ1ーＣＯ-(ＣＨ₂)n-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)m-ＣＯＯ-Ｒ2 (2) で示される化合物。（式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ及びｎは前記
   に同じ。）
5. 【請求項５】下記一般式(3) Ｒ1-(ＣＨ₂)m-ＣＯ-ＮＨ-(ＣＨ₂)n-ＣＯＯ-Ｒ2 (3) で示される化合物。（式中、Ｒ1、Ｒ2、ｍ及びｎは前記
   に同じ。）