ES2316154T3 - Peptidos cationicos antimicrobianos y procedimientos de seleccion de los mismos. - Google Patents

Abstract

SE DESCUBRE UNA NUEVA CLASE DE PEPTIDOS CATIONICOS QUE POSEEN ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA. ESTOS PEPTIDOS PUEDEN SER COMPRENDIDOS POR LAS FORMULAS: X SUB,1}X SUB,1}PX SUB,2}X SUB,3}X SUB,2}P(X SUB,2}X SUB,2}P) SUB,N}X SUB,2}X SUB,3}(X SUB,5}) SUB,O} (SEQ ID NUM. 23); X SUB,1}X SUB,1}PX SUB,2}X SUB,3}X SUB,4}(X SUB,5}) SUB,R}P X SUB,2}X SUB,3}X SUB,3} (SEQ ID NUM. 24); X SUB,1}X SUB,1}X SUB,3}(PW) SUB,U}X SUB,3}X SUB,2}X SUB,5}X S UB,2}X SUB,2}X SUB,5}X SUB,2}( X SUB,5}) SUB,0} (SEQ ID NUM. 25); X SUB,1}X SUB,1}X SUB,3}X SUB,3}X SUB,2}P(X SUB,2}X SUB,2}P) S UB,N}X SUB,2}(X SUB,5}) SUB,M} SEQ ID NUM. 26; EN LOS QUE M ES DE 1 A 5; N ES 1 O 2; O ES 2 A 5; R ES 0 A 8; U ES 0 A 1; X SUB,1} ES ISOLEUCINA, LEUCINA, VALINA, FENILALANINA, TIROSINA, TRIPTOFANO O METIONINA; X SUB,2} REPRESENTA TRIPTOFANO O FENILALANINA; X SUB,3} REPRESENTA ARGININA O LISINA; X SUB,4} REPRESENA TRIPTOFANO O LISINA; Y X SUB,5} REPRESENTA FENILALANINA, TRIPTOFANO, ARGININA, LISINA O PROLINA. LA INVENCION PROPORCIONA ASIMISMO UN METODO PARA PRODUCIR VARIANTES DE PEPTIDOS CATIONICOS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA.

Description

Péptidos catiónicos antimicrobianos y procedimientos de selección de los mismos.

1. Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica prioridad en virtud de la sección 119 del título 35 de USC del documento de EE.UU. nº de serie 60/002.687 presentado el 23 de agosto de 1995.

2. Campo de la invención

La invención se refiere a péptidos que tienen actividad antimicrobiana.

3. Antecedentes de la invención

Las enfermedades sistémicas que están asociadas con microorganismos patógenos o sus toxinas en la sangre (por ejemplo, septicemia) son una causa principal de muerte entre los seres humanos. Las bacterias gram-negativas son los organismos más comúnmente asociados con tales enfermedades y la patogénesis se ha relacionado en muchos casos con la liberación de un componente de la membrana externa tóxica denominado endotoxina. Sin embargo, las bacterias gram-positivas son una causa cada vez mayor de infecciones fatales. Además, la resistencia a antibióticos está convirtiéndose en un problema importante para todas las clases de antibióticos, y urgentemente se necesitan antibióticos novedosos.

Los péptidos catiónicos que tienen actividad antimicrobiana se han aislado a partir de una amplia variedad de organismos. En la naturaleza, tales péptidos proporcionan un mecanismo de defensa contra microorganismos tales como bacterias y levadura. Generalmente se cree que estos péptidos catiónicos ejercen su actividad antimicrobiana en bacterias interaccionando con la membrana citoplásmica para formar canales o lesiones. En bacterias gram-negativas, interaccionan con el lipopolisacárido de la superficie (LPS) para permeabilizar la membrana externa, llevando a una captación autopromovida a través de la membrana externa y al acceso a la membrana citoplásmica. Ejemplos de péptidos antimicrobianos incluyen indolicidina, defensinas, cecropinas y magaininas.

El documento WO 92/22308 desvela un compuesto antimicrobiano de amplio espectro que incluye el péptido rico en triptófano, indolicidina, que presenta actividad antimicrobiana. También se desvelan variantes de péptidos de indolicidina que retienen la actividad antimicrobiana de indolicidina. Sin embargo, los autores no mencionan nada respecto a variantes de indolicidina que tienen mayor actividad antimicrobiana que la indolicidina.

Croatia Chemica 68(3), 607-614 (1995) desvela cuatro péptidos antimicrobianos, que incluyen indolicidina, caracterizados en extractos de gránulos de neutrófilos bovinos. Sin embargo, los autores no mencionan nada respecto a variantes de indolicidina que tienen mayor actividad antimicrobiana que la indolicidina.

Int. J. Peptide Protein Res. 45, 401-409 (1995) desvela la preparación de indolicidina sintética que tiene potencias antimicrobianas idénticas, como se determina mediante ensayos antimicrobianos y antifúngicos in vitro. Además, las reactividades de los péptidos naturales y sintéticos con anticuerpo anti-indolicidina fueron indistinguibles. Sin embargo, los autores no mencionan nada respecto a variantes de indolicidina que tienen mayor actividad antimicrobiana que la indolicidina.

Resumen de la invención

La invención proporciona una clase novedosa de péptidos catiónicos aislados que tienen actividad antimicrobiana.

Preferentemente, el péptido está amidado o carboximetilado. También están incluidos ácidos nucleicos aislados que codifican los péptidos de la invención. Ejemplos de péptidos preferidos incluyen aquellos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos, como se definen usando el código de aminoácidos de una letra:

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(SEQ ID Nº:1);

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(SEQ ID Nº:2);

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(SEQ ID Nº:4);

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(SEQ ID Nº:7);

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(SEQ ID Nº:22);

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(SEQ ID Nº:32);

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(SEQ ID Nº:33);

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(SEQ ID Nº:34);

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(SEQ ID Nº:38);

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(SEQ ID Nº:39);

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(SEQ ID Nº:40);

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(SEQ ID Nº:41);

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(SEQ ID Nº:42).

La invención también proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de una bacteria (o bacterias) poniendo en contacto la bacteria con una cantidad eficaz inhibidora de uno o más de los péptidos de la invención, usados simultáneamente o secuencialmente. Si se desea, el (los) péptido(s) puede(n) usarse en combinación con un antibiótico, simultáneamente o secuencialmente. Tal terapia de combinación puede resultar beneficiosa mediante una sinergia que se produce entre el péptido y el antibiótico.

La invención también proporciona un procedimiento para inhibir un trastorno asociado a endotoxemia o sepsis en un sujeto (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano) que tiene, o está en riesgo de tener, un trastorno tal; el procedimiento supone administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención.

Además, la invención proporciona un procedimiento para producir una variante de péptido catiónico que tiene actividad antimicrobiana. Este procedimiento supone: identificar la secuencia de aminoácidos de un péptido catiónico de referencia que tiene actividad antimicrobiana; producir una biblioteca de expresión que codifica variantes de péptidos catiónicos del péptido de referencia (en la que cada una de una pluralidad de las variantes contiene al menos una sustitución de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos identificada); expresar la biblioteca en una pluralidad de células huésped (creándose así una pluralidad de clones); y aislar un clon que produce una variante de péptido catiónico que tiene actividad antimicrobiana.

La invención proporciona varias ventajas. Los péptidos de la invención son compactos y tienden a tener una única estructura de hélice extendida de poliprolina tipo II que les permite extender la membrana con relativamente pocos aminoácidos. Los mejores péptidos tienen una actividad del espectro muy amplia contra bacterias resistentes a antibióticos combinada con actividad contra el hongo médicamente importante Candida albicans. Estos péptidos también poseen frecuentemente la capacidad de trabajar sinérgicamente con antibióticos; además, frecuentemente poseen actividad antiendotoxina. Los péptidos pueden producirse eficazmente mediante ADN recombinante y medios químicos de proteínas. La invención también proporciona procedimientos que permiten probar mutantes tanto racionalmente diseñados como semialeatorios de estructuras de núcleo (por ejemplo, proteínas de referencia) para permitir que se produzcan y prueben variantes dentro de las fórmulas descritas en este documento.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1 muestra espectros de DC para CP-11 e indolicidina;

la fig. 2A muestra la estructura de indolicidina;

la fig. 2B muestra una vista transversal de la estructura de indolicidina;

la fig. 3 muestra una curva de destrucción microbiana para CP-11;

la fig. 4 muestra la capacidad de péptidos antimicrobianos para permeabilizar la membrana externa de bacterias;

la fig. 5 muestra la capacidad de péptidos antimicrobianos para permeabilizar la membrana interna de bacterias;

la fig. 6 muestra la relación voltaje/corriente para indolicidina;

la fig. 7 muestra la dependencia del signo del voltaje de la indolicidina;

la fig. 8 muestra las conductancias de los canales individuales producidos por indolicidina en bicapas lipídicas planas;

la fig. 9 muestra los efectos de péptidos en TNF inducido por LPS de 0111:B4 de E. coli;

la fig. 10 muestra el efecto de péptidos en TNF inducido por LPS de P. aeruginosa;

la fig. 11 muestra el efecto de péptidos catiónicos en LPS liberado por P. aeruginosa;

la fig. 12 muestra el efecto de péptidos catiónicos en LPS liberado por Bort de E. coli.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una clase novedosa de péptidos catiónicos (es decir, polipéptidos) que tienen actividad antimicrobiana. Estos péptidos son útiles para inhibir la infección o crecimiento microbiano, además de reducir los efectos de endotoxemia. Los péptidos pueden usarse, por ejemplo, como conservantes en alimentos o cosméticos. Muchos de los péptidos de la invención son sinergistas con antibióticos convencionales y pueden usarse como una terapia complementaria. Además, tales péptidos son útiles como agentes antifúngicos, agentes antitumorales y/o agentes antivirales.

El término "antimicrobiano" como se usa en este documento significa que el péptido destruye o inhibe o previene el crecimiento o la proliferación de un microbio (por ejemplo, una bacteria, hongo y/o virus). Asimismo, el término "antiviral" como se usa en este documento significa que un péptido destruye o inhibe o previene el crecimiento o la proliferación de un virus o una célula infectada por virus. El término "antitumoral" como se usa en este documento significa que un péptido previene, inhibe el crecimiento de o destruye una célula(s) tumoral(es). Similarmente, el término "antifúngico" significa que un péptido previene, destruye o inhibe el crecimiento de un hongo.

Como se usa en este documento, el término "péptido catiónico" se refiere a una cadena de aminoácidos que tiene 5 a 50 (preferentemente 9 a 25) aminoácidos de longitud. Un péptido es "catiónico" si tiene un pKa superior a 9,0. Normalmente, al menos cuatro de los residuos de aminoácido del péptido catiónico son residuos cargados positivamente, por ejemplo, lisina y arginina. "Cargado positivamente" se refiere a la cadena lateral de un residuo de aminoácido que tiene una carga positiva neta a pH 7,0.

El término "aislado" como se usa en este documento se refiere a un péptido que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (por ejemplo, componentes celulares con los que estaría naturalmente asociado un péptido producido in vivo). Preferentemente, el péptido tiene al menos el 70%, 80%, o lo más preferentemente el 90% de pureza en peso.

La invención también incluye análogos, derivados, variaciones conservativas y variantes de péptidos catiónicos de los polipéptidos enumerados, siempre que el análogo, derivado, variación conservativa o variante tenga una actividad antimicrobiana detectable. No es necesario que el análogo, derivado, variación o variante tenga una actividad idéntica a la actividad del péptido del que se deriva el análogo, derivado, variación conservativa o variante.

Una "variante" de péptido catiónico es un péptido antimicrobiano que es una forma alterada de un péptido catiónico antimicrobiano aludido. Por ejemplo, el término "variante" incluye un péptido catiónico antimicrobiano producido por el procedimiento desvelado en este documento en el que al menos un aminoácido de un péptido de referencia está sustituido en una biblioteca de expresión. El término péptido de "referencia" significa cualquiera de los péptidos antimicrobianos catiónicos de la invención (por ejemplo, como se definen en las fórmulas anteriores) de los que se deriva una variante, derivado, análogo o variación conservativa. Dentro del término "derivado" se incluye un péptido híbrido que incluye al menos una porción de cada uno de los dos péptidos catiónicos antimicrobianos (por ejemplo, 30-80% de cada uno de los dos péptidos catiónicos antimicrobianos). También están incluidos péptidos en los que uno o más aminoácidos están eliminados de la secuencia de un péptido enumerado en este documento, siempre que el derivado tenga actividad antimicrobiana. Por ejemplo, pueden eliminarse aminoácidos del extremo amino o carboxi que no se requieren para la actividad antimicrobiana de un péptido. Asimismo, pueden producirse derivados adicionales añadiendo uno o algunos aminoácidos (por ejemplo, menos de 5) a un péptido antimicrobiano sin inhibir completamente la actividad antimicrobiana del péptido. Además, pueden producirse derivados del extremo C, por ejemplo, ésteres metílicos del extremo C, y están englobados por la invención.

La invención también incluye péptidos que son variaciones conservativas de aquellos péptidos ejemplificados en este documento. El término "variación conservativa" como se usa en este documento denota un polipéptido en el que al menos un aminoácido está sustituido por otro residuo biológicamente similar. Ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina, norleucina o metionina, por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico o glutamina por asparagina, y similares. Los aminoácidos hidrófilos neutros que pueden sustituirse por otro incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. El término "variación conservativa" también engloba un péptido que tiene un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental sin sustituir; preferentemente, los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también se unen específicamente al polipéptido sin sustituir.

La actividad de los péptidos de la invención puede determinarse usando procedimientos convencionales conocidos para aquellos expertos en la materia, tales como en un ensayo de "concentración mínima inhibitoria (CMI)" descrito en este documento por el cual la concentración más baja a la que no se observa cambio en la DO durante un periodo de tiempo dado se registra como la CMI. Alternativamente puede usarse un ensayo de "concentración inhibitoria fraccional (CIF)" para medir la sinergia entre los péptidos de la invención o los péptidos en combinación con antibióticos conocidos. Las CIF pueden realizarse, por ejemplo, mediante titulaciones en damero de péptidos en una dimensión de una placa de microtitulación y de antibióticos en la otra dimensión. La CIF es una función del impacto de un antibiótico en la CMI del otro y viceversa. Una CIF de 1 indica que la influencia de los compuestos es aditiva y una CIF inferior a 1 indica que los compuestos actúan sinérgicamente.

Los péptidos de la invención pueden sintetizarse mediante procedimientos comúnmente usados tales como aquellos que incluyen protección con t-BOC o FMOC de grupos alfa-amino. Ambos procedimientos implican una síntesis escalonada en la que un único aminoácido se añade en cada etapa empezando por el extremo C del péptido (véase, Coligan y col., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, unidad 9). Los péptidos de la invención también pueden sintetizarse mediante los muy conocidos procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida tales como aquellos descritos por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1962) y Stewart y Young, Solid Phase Peptides Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969, pág. 27-62) usando un copoli(estireno-divinilbenceno) que contiene 0,1-1,0 mMol de aminas/g de polímero. Al finalizar la síntesis química, los péptidos pueden desprotegerse y escindirse del polímero mediante tratamiento con HF líquido-10% de anisol durante aproximadamente 1/4 hora a 0ºC. Después de evaporarse los reactivos, los péptidos se extraen del polímero con una disolución de ácido acético al 1%, que luego se liofiliza para dar el material bruto. Los péptidos pueden purificarse mediante técnicas tales como filtración en gel sobre Sephadex G-15 usando ácido acético al 5% como disolvente. La liofilización de fracciones apropiadas del eluato de columna da péptido homogéneo, que entonces puede caracterizarse por técnicas habituales tales como análisis de aminoácidos, cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución, espectroscopía de absorción ultravioleta, rotación molar o midiendo la solubilidad. Si se desea, los péptidos pueden cuantificarse mediante la degradación de Edman en fase sólida.

La invención también incluye ácidos nucleicos aislados (por ejemplo, ADN, ADNc o ARN) que codifican los péptidos de la invención. Se incluyen ácidos nucleicos que codifican análogos, mutantes, variaciones conservativas y variantes de los péptidos descritos en este documento. El término "aislado" como se usa en este documento se refiere a un ácido nucleico que está sustancialmente libre de proteínas, lípidos y otros ácidos nucleicos con los que está asociado un ácido nucleico naturalmente producido in vivo. Preferentemente, el ácido nucleico tiene al menos el 70%, 80% o preferentemente el 90% de pureza en peso, y pueden usarse procedimientos convencionales para sintetizar ácidos nucleicos in vitro en vez de procedimientos in vivo. Como se usa en este documento, "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción génica mayor (por ejemplo, enlazando de forma operable un promotor a un ácido nucleico que codifica un péptido de la invención). En la técnica se conocen numerosas construcciones génicas (por ejemplo, plásmidos y otros vectores de expresión) y pueden usarse para producir los péptidos de la invención en sistemas sin células o células procariotas o eucariotas (por ejemplo, de levadura, insecto o mamífero). Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, un experto en la materia puede sintetizar fácilmente ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse fácilmente en procedimientos de biología molecular convencional para producir los péptidos de la invención.

El ADN que codifica los péptidos catiónicos de la invención puede insertarse en un "vector de expresión". El término "vector de expresión" se refiere a una construcción génica tal como un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que puede manipularse para contener un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Tales vectores de expresión son preferentemente plásmidos que contienen una secuencia promotora que facilita la transcripción de la secuencia genética insertada en una célula huésped. El vector de expresión contiene normalmente un origen de replicación y un promotor, además de genes que permiten la selección fenotípica de las células transformadas (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). En la invención pueden utilizarse diversos promotores, incluyendo promotores inducibles y constitutivos. Normalmente, el vector de expresión contiene un sitio de replicón y secuencias de control que se derivan de una especie compatible con la célula huésped.

La transformación o transfección de una célula huésped con un ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo usando técnicas convencionales muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, si la célula huésped es E. coli, pueden prepararse células competentes que pueden captar ADN usando los procedimientos de CaCl_{2}, MgCl_{2} o RbCl conocidos en la técnica. Alternativamente pueden usarse medios físicos tales como electroporación o microinyección. La electroporación permite transferir un ácido nucleico en una célula mediante impulso eléctrico de alto voltaje. Adicionalmente, los ácidos nucleicos pueden introducirse en células huésped mediante fusión de protoplastos usando procedimientos muy conocidos en la técnica. También se conocen procedimientos adecuados para transformar células eucariotas, tales como electroporación y lipofección.

Las "células huésped" englobadas por la invención son cualquier célula en la que puede usarse los ácidos nucleicos de la invención para expresar los polipéptidos de la invención. El término también incluye cualquier progenie de una célula huésped. Células huésped preferidas de la invención incluyen E. coli, S. aureus y P. aeruginosa.

Los ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención pueden aislarse a partir de una célula (por ejemplo, una célula cultivada) o pueden producirse in vitro. Una secuencia de ADN que codifica un péptido catiónico de interés puede obtenerse mediante: 1) aislamiento de una secuencia de ADN bicatenario partir de ADN genómico; 2) preparación química de un ácido nucleico de forma que codifique el péptido catiónico de interés; o 3) síntesis in vitro de una secuencia de ADN bicatenario mediante transcripción inversa de ARNm aislado a partir de una célula de donante (es decir, para producir ADNc). Entre los procedimientos habituales para aislar secuencias de ADNc de interés está la formación de bibliotecas de ADNc que contienen plásmidos o fagos que se derivan de la transcripción inversa de ARNm en células de donante que tienen un alto nivel de expresión genética. Si se usa en combinación con tecnología de reacción en cadena de la polimerasa, incluso pueden clonarse productos génicos raros.

La invención también proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento de una bacteria poniendo en contacto la bacteria con una cantidad eficaz inhibidora de un péptido de la invención. El término "poner en contacto" se refiere a exponer la bacteria al péptido de manera que el péptido pueda inhibir, destruir o lisar bacterias. Preferentemente, el péptido puede unirse a endotoxina (LPS) o permeabilizar la membrana externa de una bacteria gram-negativa. La puesta en contacto puede producirse in vitro, por ejemplo, añadiendo el péptido a un cultivo bacteriano para probar la susceptibilidad de las bacterias al péptido. Alternativamente, la puesta en contacto puede producirse in vivo, por ejemplo administrando el péptido a un sujeto aquejado de un trastorno bacteriano tal como choque séptico. "Inhibir" o "cantidad eficaz inhibidora" se refiere a la cantidad de péptido que es suficiente para producir un efecto bacteriostático o bactericida. Ejemplos de bacterias que pueden inhibirse incluyen E. coli, P. aeruginosa, E. cloacae, S. typhimurium y S. aureus. El procedimiento para inhibir el crecimiento de bacterias también puede incluir poner en contacto la bacteria con el péptido en combinación con uno o más antibióticos.

Un péptido(s) de la invención puede administrarse a cualquier huésped, incluyendo un ser humano o animal no humano, en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de una bacteria, virus u hongo. Por tanto, los péptidos son útiles como agentes antimicrobianos, agentes antivirales y/o agentes antifúngicos.

Puede usarse cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica para administrar el péptido a un sujeto. Por ejemplo, el péptido de la invención puede administrarse parenteralmente mediante inyección o mediante infusión gradual con el tiempo. El péptido puede administrarse intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad o transdérmicamente. Puede formularse en liposomas para reducir la toxicidad o aumentar la biodisponibilidad. Otros procedimientos preferidos para administrar el péptido incluyen procedimientos por vía oral que suponen la encapsulación del péptido en microesferas o proteinoides, administración de aerosoles (por ejemplo, a los pulmones) o administración transdérmica (por ejemplo, mediante iontoforesis o electroporación transdérmica). Otros procedimientos de administración serán conocidos para aquellos expertos en la materia.

Preparaciones para administración parenteral de un péptido de la invención incluyen disoluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Ejemplos de vehículos acuosos incluyen agua, solución salina y medios tamponados, disoluciones alcohólicas/acuosas y emulsiones o suspensiones. Ejemplos de vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer lactada y aceites no volátiles. Vehículos intravenosos incluyen fluidos y recuperadores de nutrientes, recuperadores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden incluirse conservantes y otros aditivos tales como otros antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

La invención proporciona un procedimiento para inhibir un trastorno asociado a endotoxemia o choque séptico (sepsis) administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención a un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, un trastorno tal. El término "inhibir" significa prevenir o mejorar un signo o síntomas de un trastorno (por ejemplo, endotoxemia). Ejemplos de signos de enfermedad que pueden mejorarse incluyen un aumento en el nivel de TNF en la sangre de un paciente, fiebre, hipotensión, neutropenia, leucopenia, trombocitopenia, coagulación intravascular diseminada, síndrome de dificultad respiratoria aguda, choque e insuficiencia orgánica. Ejemplos de pacientes que pueden tratarse en la invención incluyen aquellos en riesgo de, o aquellos que padecen, una toxemia, tal como endotoxemia resultante de una infección por bacterias gram-negativas, envenenamiento producido por venenos de animales o insuficiencia hepática. Otros ejemplos incluyen pacientes infectados con bacterias gram-positivas, virus u hongos. En particular, la invención es útil para tratar pacientes que muestran signos de sepsis o se quejan de síntomas de sepsis. Ejemplos de pacientes candidatos incluyen aquellos que padecen infección por E. coli, Hemophilus influenza B, Neisseria meningitides, estafilococos o neumococos. Otros pacientes en riesgo de sepsis incluyen aquellos que padecen heridas de bala, insuficiencia renal o hepática, traumatismo, quemaduras, infecciones inmunocompetentes (por ejemplo, infecciones por VIH), neoplasias hematopoyéticas, mieloma múltiple, enfermedad de Castleman o mixoma cardiaco. Aquellos expertos en la materia de la medicina pueden emplear fácilmente criterios convencionales para identificar sujetos apropiados para el tratamiento según la invención.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en este documento para el tratamiento de un paciente aquejado de una enfermedad o trastorno significa una cantidad de péptido catiónico suficiente para mejorar un signo o síntoma de la enfermedad. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede medirse como la cantidad suficiente para disminuir una respuesta del sujeto a LPS o aliviar cualquier signo o síntoma de sepsis. Preferentemente, el sujeto se trata con una cantidad de péptido catiónico suficiente para reducir un aumento inducido por LPS en niveles de TNF en plasma al menos el 50%, y más preferentemente el 90% o el 100%. Generalmente, la dosificación óptima del péptido dependerá del trastorno y factores tales como el peso del paciente. No obstante, un experto en la materia puede determinar fácilmente dosificaciones adecuadas. Si se desea, la eficacia del tratamiento puede medirse normalmente controlando el nivel de LPS o TNF en un paciente. Una disminución de los niveles de LPS y TNF en suero guarda generalmente relación con una mejora del trastorno. Normalmente, una dosificación adecuada es 0,5 a 40 mg de péptido/kg de peso corporal, preferentemente 1 a 8 mg de péptido/kg de peso corporal.

Si se desea, una pauta terapéutica adecuada puede combinar la administración de un péptido(s) de la invención con un inhibidor de TNF, un antibiótico, o ambos. Por ejemplo, la intervención en la importancia de TNF en la sepsis, bien directamente o indirectamente, tal como usando un anticuerpo anti-TNF y/o un antagonista de TNF, puede prevenir o mejorar los signos de sepsis. Se prefiere particularmente un anticuerpo anti-TNF, tal como un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a TNF (por ejemplo, como se describe por Tracey y col. Nature, 330:662, 1987). El (Los) péptido(s), inhibidor(s) y/o antibiótico(s) pueden administrarse, preferentemente, simultáneamente, pero también pueden administrarse secuencialmente. Antibióticos adecuados incluyen aminoglucósidos (por ejemplo, gentamicina), beta-lactamas (por ejemplo, penicilinas y cefalosporinas), quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina) y novobiocina. Generalmente, el antibiótico se administra en una cantidad bactericida. Sin embargo, el péptido proporciona un procedimiento para aumentar la actividad antibiótica permeabilizando la membrana externa bacteriana y combinaciones que implican péptidos y puede administrarse una cantidad subinhibitoria (una cantidad inferior a la cantidad bactericida) de antibiótico. Preferentemente, el péptido catiónico y el antibiótico se administran en el plazo de 48 horas entre sí (preferentemente 2-8 horas, lo más preferentemente simultáneamente). Una "cantidad bactericida" de antibiótico es una cantidad suficiente para lograr una concentración en sangre destructora de bacterias en el paciente que recibe el tratamiento. Según su definición convencional, un "antibiótico", como se usa en este documento, es una sustancia química producida por un microorganismo que, en disoluciones diluidas, inhibe el crecimiento de o destruye otros microorganismos. Por este término también están englobados antibióticos sintéticos (por ejemplo, análogos) conocidos en la técnica.

Los péptidos de la invención pueden usarse, por ejemplo, como conservantes o esterilizantes de materiales susceptibles a contaminación microbiana o viral. Por ejemplo, los péptidos pueden usarse como conservantes en alimentos procesados (por ejemplo, para inhibir organismos tales como Salmonella, Yersinia y Shigella). Si se desea, los péptidos pueden usarse en combinación con aditivos alimentarios antibacterianos, tales como lisozimas. Los péptidos de la invención también pueden usarse como agente tópico, por ejemplo para inhibir Pseudomonas o Streptococcus o destruir microbios que producen olor (por ejemplo, Micrococci). Un experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad óptima de un péptido catiónico de la invención para cualquier aplicación dada.

La invención también proporciona un procedimiento para producir una variante de péptido catiónico antimicrobiano. Este procedimiento supone identificar la secuencia de aminoácidos de un péptido catiónico que tiene actividad antimicrobiana (es decir, un péptido de referencia), producir una biblioteca de expresión que codifica variantes de péptidos del péptido de referencia, conteniendo cada variante al menos una sustitución (por ejemplo, sustituciones aleatorias) de un aminoácido(s) identificado en el péptido de referencia; expresar la biblioteca en una pluralidad de células huésped, produciéndose así una pluralidad de clones; y aislar un clon que produce una variante de péptido que tiene actividad antimicrobiana. La invención también incluye una variante de péptido catiónico producida por este procedimiento.

En este procedimiento pueden introducirse sustituciones de nucleótidos aleatorizadas en ADN que codifica un péptido catiónico de referencia que tiene actividad antimicrobiana. Así pueden producirse péptidos que tienen sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, el ejemplo proporcionado en este documento ejemplifica la aleatorización de un péptido antimicrobiano conocido con el fin de producir variantes que tengan actividad antimicrobiana.

Aunque puede usarse cualquier procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio para producir variantes de péptidos catiónicos, el procedimiento preferido utiliza síntesis de ADN con un conjunto de nucleótidos en el que cada disolución concentrada de nucleótidos, por ejemplo, A, T, C y G, contiene un bajo porcentaje de los otros nucleótidos. Por ejemplo, la disolución concentrada de adenosina contiene aproximadamente del 0,5 al 5% de cada uno de timina, citosina y guanina. Se entiende que cuanto mayor sea el nivel de nucleótidos "contaminantes" (es decir, T, C y G en este ejemplo), mayor será el número de sustituciones de nucleótidos y sustituciones de aminoácidos correspondientes por péptido.

Los procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pueden usarse para aleatorizar regiones específicas de un oligonucleótido que codifica un péptido catiónico de la invención. Los procedimientos de PCR son muy conocidos en la técnica y se ilustran adicionalmente en los ejemplos desvelados en este documento. Los productos de las reacciones de PCR pueden reunirse y purificarse en gel antes de unirse en un vector de expresión para formar una biblioteca. Mediante la expresión de la biblioteca en una pluralidad de células huésped (por ejemplo, una cepa de bacteria) se produce una pluralidad de clones. Un clon que produce una variante de péptido catiónico que tiene actividad antimicrobiana puede aislarse fácilmente usando un ensayo convencional (por ejemplo, un ensayo de CMI como se describe en este documento y como se conoce para aquellos expertos en la materia).

Los cebadores de PCR usados para amplificar un ácido nucleico que codifica una variante de péptido catiónico normalmente son complementarios a las regiones del vector de expresión que flanquean la secuencia que codifica la variante de péptido catiónico.

Cualquier muestra de ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, puede usarse como molde de ácido nucleico para la síntesis de ADN, siempre que contenga un ácido nucleico que codifique el péptido catiónico antimicrobiano de referencia. Por tanto, el procedimiento puede emplear ADN o ARN monocatenario o bicatenario, tal como ARN mensajero. Si se usa ARN como molde, se utilizan enzimas y condiciones para la transcripción inversa del molde de ARN en ADN. Si se desea puede utilizarse un híbrido de ADN-ARN que contiene una hebra de cada ácido nucleico. Si se desea, puede emplearse una mezcla de ácidos nucleicos, o pueden usarse los ácidos nucleicos producidos en una reacción de amplificación previa como se describe en este documento con los mismos cebadores o diferentes. No es necesario que el ácido nucleico que va a amplificarse esté presente en una forma pura; puede constituir una fracción menor de una mezcla compleja.

Si el ácido nucleico que codifica la proteína de referencia es bicatenario, es necesario separar las hebras del ácido nucleico con el fin de proporcionar un molde de ácido nucleico. Esta separación de hebras puede llevarse a cabo usando cualquiera de las diversas condiciones desnaturalizantes conocidas en la técnica (por ejemplo, medios físicos, químicos o enzimáticos). Un ejemplo de un procedimiento físico para separar hebras de ácido nucleico es calentar el ácido nucleico a aproximadamente 80º a 105ºC durante 1 a 10 minutos, seguido por enfriamiento rápido. Alternativamente, la separación de hebras también puede inducirse con una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasa o mediante la enzima RecA, que tiene actividad helicasa. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación de hebras de ácido nucleico con helicasas o RecA se conocen en la técnica (Kuhn Hoffmann-Berling CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978 y Radding, Ann. Rev. Genetics, 16:405-437, 1982).

Si el ácido nucleico que contiene la secuencia que va a amplificarse es monocatenario, su complemento puede sintetizarse usando uno o dos cebadores de oligonucleótidos. Si se utiliza un único cebador, puede sintetizarse un producto de extensión de cebadores en presencia de un agente para la polimerización y los cuatro trifosfatos de nucleótidos comunes.

Cuando se separan las hebras complementarias de ácido o ácidos nucleicos, independientemente de si el ácido nucleico era originalmente mono o bicatenario, las hebras separadas pueden usarse como moldes para la síntesis de hebras de ácido nucleico adicionales. Normalmente, la síntesis de ADN se produce en una disolución acuosa tamponada, preferentemente a un pH de 7-9, lo más preferentemente a aproximadamente 8. Preferentemente se añade un exceso molar (para ácido nucleico genómico, normalmente aproximadamente 10^{8}:1 de cebador:molde) de los dos cebadores de oligonucleótidos al tampón que contiene las hebras del molde separadas. En la práctica, la cantidad de cebador añadido estará generalmente en exceso molar respecto a la cantidad de hebra complementaria (molde) cuando la secuencia que va a amplificarse está contenida en una mezcla de complicadas hebras de ácido nucleico de cadena larga.

Normalmente, los trifosfatos de desoxirribonucleótido dATP, dCTP, dGTP y dTTP se añaden a la mezcla de síntesis, bien por separado o junto con los cebadores, en cantidades adecuadas y la disolución resultante se calienta a aproximadamente 90º-100ºC de aproximadamente 1 a 10 minutos, preferentemente de 1 a 4 minutos. Si se desea, los análogos de nucleótidos pueden usarse en vez de, además de, los nucleótidos comunes. Después de este periodo de calentamiento, la disolución se deja normalmente enfriar a una temperatura que es óptima para la hibridación de cebadores (aproximadamente 42ºC). A la mezcla enfriada se le añade un agente apropiado para efectuar la reacción de extensión de cebadores (llamada en este documento "agente para la polimerización") y se deja que la reacción de síntesis avance en condiciones conocidas en la técnica. El agente para la polimerización (por ejemplo, una polimerasa termoestable) también puede añadirse junto con los otros reactivos. Esta reacción de síntesis (o amplificación) puede producirse a cualquier temperatura a la que funcione el agente para la polimerización.

El agente para la polimerización puede ser cualquier compuesto (por ejemplo, una enzima) o sistema que funcione para sintetizar productos de extensión de cebadores. Enzimas adecuadas para este fin incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, T4 ADN polimerasa, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa y otras enzimas, especialmente polimerasas estables al calor. Entonces, la molécula bicatenaria que resulta de la síntesis de ADN se desnaturaliza y el procedimiento de síntesis anteriormente descrito puede repetirse en los ácidos nucleicos monocatenarios resultantes. Si se desea puede añadirse un agente adicional para la polimerización, nucleótidos y cebadores. Si se desea pueden repetirse las etapas de desnaturalización y síntesis de ADN (como en procedimientos de PCR convencionales).

Los ácidos nucleicos de la invención pueden evaluarse, detectarse, clonarse, secuenciarse y similares, bien en disolución o después de unirse a un soporte sólido, mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, PCR, restricción de oligómeros (Saiki y col., Bio/Technology, 3:1008-1012, 1985), análisis de sondas de oligonucleótidos específicos para alelo (ASO) (Conner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 80:278,1983), ensayos de ligamiento de oligonucleótidos (OLA) (Landegren y col., Science, 241:1077, 1988), hibridación fluorescente in situ (FISH) y similares).

En la presente invención, un ácido nucleico que codifica un péptido catiónico o variantes de péptidos puede insertarse en un "vector de expresión" recombinante. El término "vector de expresión" se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que puede manipularse mediante inserción o incorporación de un ácido nucleico que codifica un péptido catiónico o variante. Normalmente, los vectores de expresión son plásmidos que contienen un promotor para dirigir la transcripción de la secuencia genética insertada.

Si se desea, el vector de expresión puede codificar un "péptido portador" que normalmente se produce como una fusión con el extremo amino de la variante de péptido. Preferentemente, el péptido portador es suficientemente aniónico de forma que se supera la carga positiva asociada al péptido catiónico y el péptido de fusión resultante tiene una carga neta que es neutra o negativa. El péptido portador aniónico puede corresponderse en secuencia con una proteína que se produce naturalmente o puede ser de diseño completamente artificial. Funcionalmente, el péptido portador puede ayudar a estabilizar el péptido catiónico y a protegerlo de proteasas, aunque no necesita mostrarse que el péptido portador sirve para un fin tal. Similarmente, el péptido portador puede facilitar el transporte del péptido de fusión. Ejemplos de péptidos portadores que pueden utilizarse incluyen pre-pro péptidos aniónicos y péptidos de la membrana externa aniónicos. Péptidos portadores preferidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa (GST) (Smith y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8703, 1986), proteína A de Staphylococcus aureus (Nilsson y col., EMBO, 4:1075, 1985; pRIT5 (Pharmacia)), dos dominios de unión a IgG sintéticos (ZZ) de proteína A (Löwenadler y col., Gene, 58:87, 1987) y proteína F de la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa (Duchene y col., J. Bacteriol, 170:155, 1988). La invención no se limita al uso de estos péptidos como portadores; otros péptidos portadores adecuados son conocidos para aquellos expertos en la materia. Alternativamente, el péptido portador puede omitirse totalmente.

Puede usarse cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la técnica para la purificación de proteínas para aislar los péptidos de la invención. Por ejemplo, pueden usarse separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas (tales como aquellas que emplean anticuerpos monoclonales o policlonales). Los péptidos portadores pueden facilitar el aislamiento de proteínas de fusión que incluyen los péptidos de la invención. Por ejemplo, la glutatión-S-transferasa (GST) permite la purificación con una columna de afinidad de glutatión agarosa. Si se usa proteína A o el dominio ZZ de Staphylococcus aureus como proteína portadora, la purificación puede llevarse a cabo en una única etapa usando una columna de afinidad de IgG-sefarosa. El péptido pOprF, que es la mitad del extremo N de la proteína F de la membrana externa de P. aeruginosa, puede purificarse fácilmente debido a que es la especie de proteína destacada en preparaciones de membrana externa. Si se desea, los péptidos de fusión pueden aislarse usando reactivos que son específicamente reactivos con (por ejemplo, se unen específicamente) el péptido catiónico del péptido de fusión. Por ejemplo, en procedimientos de purificación convencional pueden usarse anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen específicamente al péptido catiónico. Las técnicas para producir tales anticuerpos son muy conocidas en la técnica.

En la práctica de la invención puede ser ventajoso incluir una "secuencia de ADN espaciadora" en los vectores de expresión. Como se usa en este documento, "secuencia de ADN espaciadora" se refiere a cualquier secuencia codificante localizada entre la secuencia que codifica el péptido portador y la secuencia que codifica el péptido catiónico. Aunque no se desea estar ligado a una teoría particular, se cree que la secuencia de ADN espaciadora, cuando se traduce, puede crear una región "similar a bisagra" que permite que interaccionen los residuos cargados negativamente del péptido portador aniónico y los residuos cargados positivamente del péptido catiónico objeto, inhibiéndose así efectos de carga positiva.

Si se desea, la secuencia de ADN espaciadora puede codificar un sitio de reconocimiento de proteínas para la escisión del péptido portador a partir del péptido de fusión. Ejemplos de tales secuencias de ADN espaciadoras incluyen, pero no se limitan a, secuencias de escisión de proteasas, tales como aquellas para la proteasa del factor Xa, las secuencias de codones de metionina, triptófano y ácido glutámico y la secuencia de pre-pro defensina. El factor Xa se usa para la escisión proteolítica en la secuencia de escisión de proteasas del factor Xa, mientras que la escisión química mediante tratamiento con bromuro de cianógeno libera el péptido en los codones de metionina o relacionados. Además, el producto fusionado puede escindirse mediante inserción de un codón para triptófano (escindible mediante ácido o-yodobenzoico) o ácido glutámico (escindible mediante proteasa de Staphylococcus). La inserción de tales secuencias de ADN espaciadoras no es un requisito para la producción de péptidos catiónicos funcionales, tales secuencias pueden potenciar la estabilidad del péptido de fusión. La secuencia de pre-pro defensina está cargada negativamente; por consiguiente, se prevé dentro de la invención que otras secuencias de ADN que codifican péptidos cargados negativamente también puedan usarse como secuencias de ADN espaciadoras para estabilizar el péptido de fusión.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la invención. Aunque son típicos de aquellos que pueden usarse, alternativamente pueden usarse otros procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia.

Ejemplos Ejemplo I Síntesis de péptidos catiónicos

Los péptidos catiónicos de la invención pueden sintetizarse según protocolos convencionales para la síntesis de proteínas (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1962; Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969, pág. 27-62). Generalmente, los péptidos resultantes son sustancialmente puros, es decir, al menos el 70% de pureza. Normalmente, los péptidos resultantes tienen al menos el 80% de pureza y más normalmente al menos el 99% de pureza. Por ejemplo, los péptidos catiónicos, denominados CP-11 y CP-13, se sintetizaron mediante procedimientos químicos de proteínas habituales y tuvieron al menos el 99% de pureza. En los ejemplos proporcionados más adelante se usa indolicidina (un agente antimicrobiano conocido en la técnica) como control. La indolicidina también se sintetizó según procedimientos convencionales y tenía al menos el 99% de pureza. El péptido CP-12 tenía aproximadamente el 80% de pureza, lo más probable porque su secuencia contenía un mayor número de residuos cargados positivamente muy próximos a triptófanos. Los péptidos CP-IA y CP-AA se sintetizaron empleando química de f-moc. Las modificaciones del extremo amino se hicieron a péptidos CP-11 e indolicidina; cada uno se sintetizó con el aminoácido del extremo N en la forma D, produciéndose así CP-11D e indolicidina-D. Además, cada uno de CP-11, CP-11D, indolicidina e indolicidina-D se esterificó con metilo en el extremo C, produciéndose así CP-11, CP-11DC, indolicidina-C e indolicidina-DC, respectivamente. Por tanto, CP-11 se sintetizó para contener un extremo C amidado, produciéndose así CP-11N. Los procedimientos para producir péptidos que tienen un aminoácido del extremo N, un extremo C esterificado con metilo o un extremo C amidado son muy conocidos en la técnica (Stewart y Young, anteriormente; Kadaba, Synthesis, pág. 628-631, 1992). Las secuencias de aminoácidos primarios de indolicidina, CP-11, CP-12 y CP-13 se muestran en la tabla 1. Para la comparación también se sintetizaron dos péptidos que carecían de actividad antimicrobiana significativa, CP-IA y CP-AA. Se espera que CP-IA actúe sinérgicamente con antibióticos como un antimicrobiano.

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TABLA 1 Péptidos catiónicos sintéticos

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Ejemplo II Análisis de dicroismo circular

Combinando un análisis de estructura de péptidos con función de péptidos (por ejemplo, actividad antimicrobiana), los solicitantes han ideado una fórmula que define los péptidos antimicrobianos de la invención (véase más adelante). Usando la fórmula de los solicitantes, un experto en la materia puede producir fácilmente un péptido antimicrobiano, tal como un péptido especificado en este documento, además de aquellos péptidos que están englobados por la fórmula, pero no se especifican en este documento.

El análisis estructural de la indolicidina (un control) y CP-11 se realizó usando análisis de dicroismo circular convencional (DC) y un espectropolarímetro J-720 (Jasco, Japón). Se han descrito procedimientos adecuados para DC (véase Haschmeyer y Haschmeyer, Proteins, A Guide to Study by Physical and Chemical Methods, Wiley-Interscience, pág. 237-253; 1973). En este caso, los espectros de DC se midieron en tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,0) y en presencia o ausencia de liposomas de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)/1-palmotoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerina (POPG) (7:3). Los liposomas multilaminares se prepararon mediante procedimientos habituales (véase, por ejemplo, Mayer y col., Biochim. Biophys. Acta 817 (1985) 193-196) y se extruyeron usando un dispositivo extrusor (Lipex Biomembranes, Vancouver, Canadá) para producir vesículas unilaminares. La concentración de péptido y liposomas fue 50 \muM y 2 mM, respectivamente.

En ausencia de liposomas, la indolicidina y el CP-11 presentaron espectros de DC que fueron característicos de una estructura desordenada (fig. 1). A diferencia, en presencia de liposomas (imitando así la estructura del péptido con la interacción con una membrana celular), el espectro de la indolicidina fue característico de uno producido por una estructura de hélice extendida de poli-L-prolina II. El espectro se caracterizó por un mínimo a 202 nm, un máximo a 226 nm y un mínimo más pequeño a 235 nm. Este espectro sólo se indujo en presencia de liposomas cargados negativamente (es decir, tales estructuras no se indujeron en presencia de liposomas de POPC solos). Esta observación no se esperaba debido que se hubiera esperado que el bajo contenido de prolina de la indolicidina excluyera una estructura tal. El descubrimiento de los solicitantes de que la indolicidina formó una hélice de poli-L-prolina II fue crítico para idear una fórmula para el diseño de péptidos catiónicos.

Usando dicroismo circular, el CP-11 produjo un espectro (fig. 1) que, aunque tenía un máximo y mínimo a las mismas longitudes de onda que la indolicidina, era distinto del de la indolicidina porque los mínimos a 202 y 235 se redujeron y el máximo a 226 aumentó en magnitud. También se analizaron mediante dicroismo circular dos péptidos que carecían de actividad antimicrobiana significativa, CP-IA y CP-AA (tabla 1). El análisis estructural de los péptidos no antimicrobianos CP-IA y CP-AA reveló que ciertos motivos contribuyen significativamente a la estructura inducida por lípidos de los péptidos antimicrobianos. Tanto CP-IA como CP-AA siguieron desordenados tanto en ausencia de liposomas como en presencia de liposomas que pudieran inducir la estructura a los péptidos antimicrobianos (indolicidina y CP-11). El péptido IA se diferencia de la indolicidina en que contiene Phe^{9} y Val^{10} en vez de Trp^{9}, Pro^{10} y Trp^{11} de la indolicidina. Tanto CP-IA como CP-AA tienen actividades antimicrobianas significativamente inferiores a las de la indolicidina (véase más adelante). Basado en este análisis estructural se espera que una estructura de hélice de poli-L-prolina II contribuya a la actividad antimicrobiana.

Ejemplo III Modelado asistido por ordenador de péptidos antimicrobianos

Usando el software de modelado molecular InsightII (Biosym. Inc., San Diego, CA), la indolicidina se modeló usando las coordenadas para una hélice de poli-L-prolina II. La estructura resultante se muestra en la fig. 2A. Estos datos muestran que el péptido en esta forma tiene aproximadamente 40 \ring{A} de longitud. Por tanto, Trp^{6}, Trip^{8}, Trp^{9} y Trp^{11} están todos alineados en el mismo plano (fig. 2B), a diferencia de Trp^{4}, que está alineado en el plano opuesto. Usando CP-11 y las coordenadas para una hélice de poli-L-prolina II, el modelado por ordenador mostró que todos los triptófanos de CP-11 estaban alineados en un único plano. Debido a que CP-11 es un péptido antimicrobiano más potente que la indolicidina (véase más adelante), este análisis estructural combinado con el análisis funcional sugiere que se desea la formación de una estructura anfipática, como en CP-11.

Ejemplo IV Ensayo para actividad antimicrobiana

Cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica para medir la actividad antimicrobiana de péptidos puede usarse en la caracterización de los péptidos de la invención. En estos ejemplos se usaron procedimientos convencionales para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de un péptido en un medio líquido (Amsterdam. Antibiotics in Laboratory Medicine, Williams y Wilkins, Baltimore (1991) 72-78). Brevemente, se diluyeron cultivos durante la noche de los organismos de prueba (descritos más adelante) para producir un inóculo que contenía aproximadamente 10^{4} a 10^{5} organismos. El tamaño del inóculo se confirmó contando el número de organismos en placas que se inocularon al mismo que los cultivos líquidos.

La concentración de péptido se midió ensayando grupos sin amino usando un ensayo de dinitrofenilación sirviendo la polimixina B de patrón. Las diluciones por duplicado de péptido se realizaron (32 \mug/ml-0,25 \mug/ml) en volúmenes de 100 \mul en una placa de microtitulación de 96 pocillos y todos los pocillos se inocularon posteriormente con el cultivo diluido del organismo de prueba. El ensayo se leyó después de 24 horas de incubación a 37ºC. El valor de CMI es la concentración de péptido a la que el crecimiento del organismo de prueba se redujo el 50%. El número de células en el inóculo del cultivo se calculó a partir del recuento en placa después de incubar la placa durante 24 horas a 37ºC. El medio usado para el cultivo celular y la dilución en este ensayo fue caldo Luria (LB). Cada péptido se probó tres veces contra cada organismo y los valores de CMI presentados a continuación son los valores medios de los tres experimentos. Los organismos de prueba usados en los ensayos de CMI se enumeran en la tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Cepas de prueba usadas para la determinación de CMI

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En la tabla 3 se muestran los valores de CMI para cada uno de los péptidos. Estos datos muestran que el péptido catiónico CP-11 tenía mayor actividad antimicrobiana contra bacterias gram-negativas y la levadura Candida albicans que la indolicidina. Similarmente, CP-13 mostró mayor actividad antimicrobiana contra bacterias gram-negativas que la indolicidina. El péptido CP-16, que tenía triptófano sustituido fenilalanina por, pero por lo demás tenía la misma secuencia que CP-13, era equivalente a este péptido en actividad contra S. aureus, mostrando que los péptidos de la invención no necesitaban estar enriquecidos en triptófano. Otra sustitución de los primeros dos residuos en CP-24 para el aminoácido hidrófobo fenilalanina condujo a un péptido que era superior a la indolicidina y mejor que CP-13 contra S. aureus.

Los valores de CMI también se determinaron para diversos derivados de indolicidina, CP-11 y CP-13. Como se describe anteriormente, el extremo C de indolicidina y CP-11 se convirtió químicamente en un éster metílico, produciéndose así indolicidina-C y CP-11C. El derivado amidado de CP-11, CP-11N, se preparó mediante química de f-moc. En el caso de indolicidina, la esterificación con metilo redujo la CMI para todos los organismos, excepto P. aeruginosa y C. albicans. En el caso de CP-11, la esterificación con metilo redujo los valores de CMI para todos los organismos, excepto SAP0017 de S. aureus, y C. albicans. CP-11C produjo valores de CMI 8 veces inferiores a los de la indolicidina para los organismos gram-negativos y C. albicans. CP-11 y CP-11C son particularmente valiosos por su actividad antimicrobiana contra P. aeruginosa. Estos resultados se atribuyen al aumento en la carga positiva y la orientación de los residuos hidrófobos de CP-11 y sus derivados. El péptido que tiene la actividad antimicrobiana más potente, CP-11C, presentó valores de CMI de 1-8 \mug/ml para todos los organismos probados.

TABLA 3 Valores de CMI para péptidos sintéticos CMI \mug/ml

3

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La indolicidina, indolicidina C y CP-11 también se sintetizaron de forma que el aminoácido del extremo N estuviera en la forma D, produciéndose así indolicidina-D, indolicidina-DC y CP-11C, respectivamente. La modificación del extremo N de CP-11 (creando CP-11D) disminuyó el valor de CMI para el péptido. La CMI para CP-11DC fue comparable a la CMI para CP-11D. La indolicidina-D presenta valores de CMI que son de 1 a 2 factores de dilución inferiores a los de la indolicidina para los organismos gram-negativos y gram-positivos probados (excepto P. aeruginosa). En este ejemplo, la indolicidina-DC tenía aproximadamente la misma actividad que la indolicidina-C.

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Ejemplo V Destrucción microbiana mediante CP-11

Las curvas de destrucción se determinaron para CP-11 contra E. coli, P. aeruginosa, S. aureus y C. albicans (fig. 3). Este ensayo se realizó en tampón HEPES 10 mM y se usaron recuentos viables para determinar los números de células supervivientes. En todos los casos, CP-11 (a 32 \mug/ml) destruyó rápidamente los organismos de prueba. En el plazo de 30 minutos de añadir el péptido, el recuento viable de bacterias gram-negativas, bacterias gram-positivas y levadura disminuyó al menos 3 órdenes logarítmicos. Estos datos muestran que CP-11 es un potente péptido antimicrobiano.

Ejemplo VI Estudios de sinergia

En una variación del ensayo de CMI descrito anteriormente, los efectos antimicrobianos de los péptidos se midieron en presencia de antibióticos u otros péptidos. Este ensayo mostró que CP-11 y CP-13 eran sinérgicos con polimixina B, cefepima, ceftazidima. CP-11 también fue sinérgico con novobiocina y un péptido híbrido de cecropina/melitina (CEME) (Piers, anteriormente). Estos experimentos se realizaron mediante titulaciones en damero en las que el péptido sinergista se diluyó en etapas dobles en una dirección en una bandeja de microtitulación de 96 pocillos y los antibióticos o péptidos se diluyeron a ángulos rectos respecto al péptido. Después de la adición de 10^{4} - 10^{5} bacterias por pocillo e incubación durante la noche a 37ºC, se determinó una concentración inhibitoria fraccional (CIF) usando un procedimiento conocido en la técnica (LeMan, Antibiotics in Laboratory Medicine, 3ª ed., Williams y Wikins, pág. 180-197,1986). Una CIF de 0,5 indica sinergia.

Ejemplo VIII Unión de péptidos antimicrobianos a lipopolisacárido purificado

Se cree que los péptidos que se unen a lipopolisacárido funcionan potencialmente como antiendotoxinas. La unión de diversos péptidos CP a lipopolisacárido (LPS) de H103 de P. aeruginosa se midió en un ensayo de desplazamiento de dansil polimixina B (DPX) como se describe por Moore y col. (AAC, 26 (1986) 496-500). Brevemente, DPX presenta fluorescencia potenciada cuando se une a LPS. El LPS purificado se saturó con DPX titulando el LPS con muestras de DPX hasta que se alcanzó la máxima fluorescencia. La fluorescencia se midió en un espectrofotómetro de fluorescencia de Perkin-Elmer 650-10S y el desplazamiento de DPX se midió como una disminución en la fluorescencia con la adición de un péptido antimicrobiano.

La tabla 4 muestra el porcentaje de la fluorescencia de DPX restante unida a LPS como una función de la concentración de péptido. Para cada péptido se muestra el valor I_{50}, que es la concentración a la que se desplazó el 50% de la DPX máxima del LPS. También se muestra el valor de I_{máx}, que representa el máximo desplazamiento de LPS expresado como porcentaje cuando el 100% indica el desplazamiento de todo el DPX unido.

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TABLA 4 Unión de péptidos antimicrobianos a lipopolisacárido purificado

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Como se muestra anteriormente, los CP-11C fueron más eficaces en el desplazamiento de DPX de LPS de P. aeruginosa que de indolicidina. La concentración I_{50} relativamente baja de CP-11 y CP-11C refleja la afinidad relativamente alta de estos compuestos para LPS de H103 de P. aeruginosa purificado. La I_{50} de iones Mg^{2+} en estos experimentos fue aproximadamente 620 \muM. Estos iones son los cationes divalentes nativos que normalmente se unen a LPS. Por tanto, todos los péptidos probados pudieron unirse a LPS de superficie mediante desplazamiento de tales iones.

Ejemplo VIII Permeabilización de membranas

El grado de permeabilización de membranas externas de UB1005 de E. coli por los péptidos sintéticos se determinó en un ensayo de captación de 1-N-fenilnaftilamina (NPN) (Loh y col. AAC, 26 (1984) 2311-2316). Brevemente, la NPN es una pequeña molécula (200 kD) hidrófoba que, cuando se divide en la membrana externa bacteriana, presenta un aumento en la fluorescencia. Por tanto, usando un espectrofotómetro de fluorescencia, un aumento en la fluorescencia en presencia de un péptido indica que el péptido puede permeabilizar la membrana externa bacteriana. La fluorescencia se mide como una función de la concentración del péptido, como se muestra en la fig. 4. Este ejemplo muestra que la permeabilización de E. coli a NPN mediante CP-11C fue superior a la de mediante CP-11. Similarmente, la permeabilización mediante indolicidina-C fue superior a la de mediante indolicidina. Además, CP-11 pudo permeabilizar sustancialmente mejor la membrana externa de E. coli que la indolicidina.

La permeabilización de la membrana interna de E. coli se midió usando ML-35 de E. coli, que es una cepa deficiente en lactosa permeasa que tiene actividad \beta-galactosidasa citoplásmica constitutiva (Lehrer y col., J. Clin. Invest. 84 (1989) 553-561). El "desenmascaramiento" de la actividad \beta-galactosidasa debido a la permeabilización de la membrana interna puede detectarse usando el sustrato ONPG (o-nitrofenil-\beta-D-galactósido). La hidrólisis de ONPG puede seguirse espectrofotométricamente a 420 nm. La fig. 5 muestra que CP-11 permeabilizó la membrana interna de E. coli a concentraciones de péptido que eran 4 veces inferiores a la concentración de indolicidina requerida. Ambos péptidos permeabilizaron la membrana después de un pequeño o sin tiempo de retraso. Estos datos muestran que no sólo es la membrana interna la diana primaria putativa para CP-11, sino que el péptido también alcanza esta diana rápidamente. Por tanto, el cruce de la membrana externa también debe ser un procedimiento rápido.

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Ejemplo IX Análisis de bicapas lipídicas planas

Con el fin de llegar a comprender bien el mecanismo por el que estos péptidos catiónicos permeabilizan la membrana citoplásmica de bacterias se examinaron los efectos del péptido indolicidina en bicapas lipídicas planas usando la técnica habitual de análisis de bicapas lipídicas negras (Benz y Hancock, Biochim. Biophys. Acta 646 (1981) 298-308). Brevemente, las bicapas lipídicas (preparadas a partir del 1,5% (p/v) de fosfatidilcolina y fosfotidilserina (5:1 en n-decano) se formaron a través de un orificio de 0,2 mm^{2} que separaba dos compartimentos de una cámara de teflón que contenía KCl 1 M ajustado a pH 7,0 con KH_{2}PO_{4}. En cada compartimento se colocaron electrodos de calomel conectados mediante un puente de sal (Metrohm), uno conectado a una fuente de voltaje y el otro conectado a un multímetro Keithley. La orientación del voltaje se diseñó con respecto a la adición del péptido al lado cis con un potencial trans-negativo indicado por un signo menos. Para detectar los acontecimientos individuales de despolarización, un electrodo se conectó a un amplificador de corriente y un registrador gráfico.

En la fig. 6 se muestran las características del voltaje de corriente de la indolicidina caracterizadas por experimentos de conductancia macroscópica. El aumento en el voltaje sólo tuvo un efecto menor en la corriente producida por la permeabilización de la bicapa mediante indolicidina inferior a -70 mV. A y por encima de -70 mV hubo un aumento espectacular en la corriente. El requisito de la indolicidina para un potencial transmembrana superior a -70 mV hace dependiente del voltaje la acción del péptido contra la membrana citoplásmica. Cuando el voltaje se redujo de -80 mV a 0 mV, la disminución fue lineal (fig. 6). Esto indica que el potencial umbral sólo puede requerirse para entrar el péptido en la bicapa, y una vez se ha producido esto, los canales permanecen relativamente estables. Las bacterias en crecimiento tienen un potencial transmembrana superior a -140 mV a pH neutro. El requisito de un potencial negativo de 70 mV para la actividad se confirmó mediante la inversión del potencial a +70 mV, dando como resultado una gran reducción en la actividad (fig. 6).

El aumento en la corriente de membrana producido por la indolicidina fue debido, al menos en parte, a la formación de canales individuales (fig. 8). Las conductancias de los canales individuales variaron de 0,05-0,15 nS. Sin embargo, se observaron repetidamente canales de aproximadamente 0,13 nS. También se mostró que CP-11 formaba canales de dimensiones similares.

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Ejemplo X Eficacia in vivo de péptidos antimicrobianos

La eficacia in vivo de CP-11 y CP-11CN se midió en un modelo de infección por P. aeruginosa de ratones inmunodepresores (Cryz y col. 39:3 (1983) 1067-1071). Los ratones se convirtieron en leucopénicos mediante una serie de tres inyecciones intraperitoneales (IP) de ciclofosfamida. Los ratones CD-1 recibieron ciclofosfamida en los días 0, 2 y 4 a 150 \mug/g de peso de ratón. En el día 4, los ratones se expusieron a 100 bacterias M2 de P. aeruginosa vivas y los grupos de prueba recibieron péptido catiónico (8 mg/kg) en 100 \mul de H_{2}O destilada treinta minutos después de la inyección de bacterias. En un experimento (resumido en la tabla 6), los ratones recibieron una inyección de péptido catiónico adicional 17 horas después de la exposición bacteriana. Los resultados de estos experimentos se resumen en las tablas 5 y 6.

TABLA 5 Influencia de una dosis única de péptido catiónico en la supervivencia de ratones neutropénicos expuestos IP a la cepa M2 de P. aeruginosa

5

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TABLA 6 Influencia de dos dosis de péptido catiónico en la supervivencia de ratones neutropénicos expuestos IP a P. aeruginosa

6

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Este ejemplo muestra que CP-11 y CP-11CN inhiben cada uno los efectos fatales de la infección con P. aeruginosa. Además, estos datos muestran que dosis múltiples del péptido antimicrobiano prolongan la supervivencia.

Ejemplo XI Efecto de péptidos en glóbulos rojos

Este ejemplo muestra que CP-11, CP-11C y CP-13 son menos tóxicos para las células humanas que la indolicidina. Se mezcló sangre humana recién recogida con heparina y se centrifugó para eliminar la capa leucocitaria. Los eritrocitos resultantes se lavaron tres veces en solución salina al 0,85% y se almacenaron a 4ºC. Las diluciones seriadas de los péptidos en solución salina se prepararon en placas de microtitulación de fondo redondo usando volúmenes de 100 \mul. Los glóbulos rojos se diluyeron con solución salina a 1/25 del volumen de relleno de células y a cada pocillo se añadieron 50 \mul de glóbulos rojos. Las placas se incubaron mientras se sacudían a 37ºC y la concentración de péptido requerida para la lisis de glóbulos rojos superior al 80% de células (es decir, lisis visible) se determinó a 4 y 24 horas (tabla 7).

TABLA 7 Lisis de glóbulos rojos

7

Estos datos muestran que, aunque la indolicidina es tóxica para los glóbulos rojos a 32 \mug/ml, CP-11, CP-11C, y CP-13 son significativamente menos tóxicos para los glóbulos rojos. Experimentos adicionales han mostrado que CP-11 también es menos tóxico que la indolicidina para linfocitos T (datos no mostrados).

Ejemplo XII Producción de péptidos antimicrobianos adicionales

Las determinaciones de la estructura de proteínas preparadas anteriormente han permitido el diseño racional de péptidos antimicrobianos, muchos de los cuales presentan actividad antimicrobiana aumentada y toxicidad reducida. Previamente se ha descrito la expresión y purificación de diversos péptidos catiónicos (Hancock y col., documento de EE.UU. nº de serie 08/575.052, incorporado en este documento como referencia, y Gene, 134 (1993) 7-13). Con el fin de expresar recombinantemente diversos péptidos antimicrobianos descritos más adelante, los oligonucleótidos que representan ambas hebras de ADN que codifican los diversos péptidos se sintetizaron en un sintetizador 392 DNA/RNA de Applied Biosystems usando procedimientos convencionales. Después de hibridar las hebras de ADN, los fragmentos de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresión pRIT5 de Staphylococcus aureus. Tras la transformación de los diversos clones en DH5\alpha de E. coli, los plásmidos recombinantes se purificaron y se secuenciaron y luego se sometieron a electroporación (aparato de transfección Bio Rad Gene Pulser) en K147 de S. aureus. En este sistema se expresaron nueve péptidos y sus actividades antimicrobianas relativas se determinaron midiendo las CMI antimicrobianas de preparaciones brutas de los péptidos catiónicos contra 14028S de Salmonella typhimurium (Piers y col., anteriormente). Las actividades relativas basadas en estas mediciones se presentan en la tabla 8.

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TABLA 8 Actividad antimicrobiana relativa de péptidos recombinantes

8

Se han descrito procedimientos usados para expresar y purificar péptidos catiónicos y microbianos como proteínas de fusión de proteínas A (Piers y col., Gene, 134 (1993) 7-13). En este caso, los sobrenadantes de cultivos de células que contenían pRIT5 que expresaban diversos péptidos antimicrobianos se pasaron por una columna de IgG-sefarosa según protocolos convencionales. Entonces, la proteína expresada se eluyó en ácido acético 0,5 M para dar una muestra relativamente pura. Tras la liofilización, la muestra se volvió a resuspender en ácido fórmico al 70% que contenía bromuro de cianógeno 1 M. La digestión se realizó durante la noche bajo nitrógeno en tubos herméticos a la luz. La reacción se detuvo mediante una dilución de diez veces en agua destilada estéril y la muestra se liofilizó. El péptido se purificó adicionalmente pasando la muestra por una columna de tamizado de gel Bio-gel P100, y las fracciones se analizaron mediante absorbancia UV a 280 nm y Page de ácido-urea. Se recogieron y liofilizaron todas las fracciones que contenían el péptido puro. Los péptidos se volvieron a resuspender en agua destilada estéril y se almacenaron a -80ºC.

En un ensayo de CMI, los péptidos CP-3R, CP-pM2a y CP-pM2b tenían una actividad aumentada contra bacterias gram-negativas cuando se compararon con indolicidina-R (es decir, indolicidina recombinante). Los péptidos restantes tenían la misma actividad o reducida cuando se compararon con indolicidina-R. Posteriormente se purificaron la indolicidina-R y CP-3R y los datos de CMI se resumen en la tabla 9. CP-3R tuvo una actividad aumentada contra E. coli, P. aeruginosa y S. typhimurium.

TABLA 9 Valores de CMI para péptidos recombinantes

9

Ejemplo XIII Diseño de péptidos

Basándose en el análisis de la estructura y la función de péptidos catiónicos antimicrobianos resumidos anteriormente, los solicitantes han ideado una fórmula que puede usarse para producir péptidos catiónicos adicionales. Se espera que los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos englobada por una de las fórmulas mostradas a continuación (mostradas usando el código de aminoácidos de una letra; SEQ ID Nº:23-26) tengan actividad antimicrobiana.

X_{1}X_{1}PX_{2}X_{3}X_{2}P(X_{2}X_{2}P)_{n}X_{2}X_{3}(X_{5})_{o};

(SEQ ID Nº:23)

X_{1}X_{1}PX_{2}X_{3}X_{4}(X_{5})_{r}PX_{2}X_{3}X_{3}.

(SEQ ID Nº:24)

X_{1}X_{1}X_{3}(PW)_{u}X_{3}X_{2}X_{5}X_{2}X_{2}X_{5}X_{2}(X_{5})_{o}; y

(SEQ ID Nº:25)

X_{1}X_{1}X_{3}X_{3}X_{2}P(X_{2}X_{2}P)_{n}X_{2}(X_{5})_{m};

(SEQ ID Nº:26)

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en las que:

m es 1 a 5;

n es 1 ó 2;

o es 2 a 5;

r es 0 a 8;

u es 0 ó 1;

X_{1} es isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, tirosina, triptófano o metionina;

X_{2} representa triptófano o fenilalanina

X_{3} representa arginina o lisina;

X_{4} representa triptófano o lisina; y

X_{5} representa fenilalanina, triptófano, arginina, lisina o prolina.

Según la fórmula proporcionada anteriormente, los solicitantes han diseñado una serie de péptidos catiónicos que se espera tengan actividad antimicrobiana. Estos péptidos están enumerados en la tabla 10. Esta lista no es exhaustiva de los péptidos antimicrobianos de la invención. Aquellos expertos en la materia reconocerán que, siguiendo la fórmula anterior, pueden sintetizarse fácilmente péptidos catiónicos antimicrobianos adicionales. Si se desea, la actividad antimicrobiana de tales péptidos puede medirse en ensayos convencionales (por ejemplo, ensayos de CMI). Debido a que los solicitantes han identificado los componentes estructurales necesarios para la actividad antimicrobiana, se espera que todos los péptidos englobados esencialmente por la fórmula tengan actividad antimicrobiana. No es necesario que estos péptidos tengan actividad equivalente a o mejor que los péptidos ejemplificados en este documento, siempre que el péptido tenga un nivel de actividad detectable (por ejemplo, en un ensayo de CMI).

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TABLA 10

10

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Ejemplo XIV Síntesis y expresión de una biblioteca que codifica variantes de péptidos

Se creó una biblioteca de variantes de péptidos en S. aureus usando el vector de expresión pRIT5. Las hebras de ADN de una biblioteca combinatoria de ADN que codifica variantes de indolicidina se sintetizaron en el sintetizador 392 DNA/RNA de Applied Biosystems Canada Incorporated (Ontario, Canadá). Estos oligonucleótidos se construyeron en 3 secciones. La primera sección, el extremo 3' que contiene sitios de endonucleasas de restricción y secuencias de parada, se sintetizó usando protocolos habituales (Applied Biosystems Canada Inc.). La segunda sección, que codifica la secuencia de péptidos de indolicidina, se sintetizó usando disoluciones concentradas de nucleótidos que se doparon con cada uno de los otros tres nucleótidos. La relación entre la concentración de dopaje y la tasa de mutación se define por una ecuación descrita por McNeil y Smith (Mol. Cell. Biol., 5 (1985) 3545-3551). La tercera sección también se sintetizó según protocolos habituales (Applied Biosystems Canada Inc.). Los oligonucleótidos resultantes contuvieron un conjunto de secuencias de indolicidina aleatoriamente mutadas flanqueadas por secuencias de 3' y 5' conservadas. Entonces, el conjunto de oligonucleótidos se hizo bicatenario mediante PCR usando cebadores diseñados para hibridar las secuencias de 3' y 5'. La reacción de PCR se realizó en 100 \mul usando las condiciones y parámetros mostrados a continuación.

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Parámetros de reacción de PCR

1 minuto 94ºC, 1 minuto 50ºC, 1 minuto 72ºC

Ciclo repetido 30 veces

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Condiciones de reacción de PCR

100

El producto amplificado se digirió en sitios de endonucleasas de restricción localizados en las regiones flanqueantes conservadas del fragmento de ADN y el producto se purificó en gel de agarosa usando el kit de purificación de ADN Mermaid Glassfog (BIO 101, La Jolla, CA, EE.UU.). Después de clonar los fragmentos de ADN en pRIT5, el conjunto aleatoriamente mutado de plásmidos recombinantes se sometió a electroporación en K147 de S. aureus y los clones se almacenaron como una biblioteca a -80ºC. La selección de varias cepas de S. aureus recombinantes mostró que el 75% de las cepas recombinantes expresó el producto de fusión de proteína A/péptido. La secuenciación de una selección aleatoria de clones reveló de 4 a 8 cambios de pares de bases que dieron como resultado 4 a 6 sustituciones de aminoácidos (véase a continuación).

101

Este procedimiento puede usarse para producir una biblioteca de péptidos recombinantes que expresa péptidos con una tasa de mutación predeterminada.

Ejemplo XV Selección de la biblioteca de péptidos recombinantes

Se desarrolló un protocolo de selección para detectar un aumento en la actividad antibacteriana en clones que expresan variantes aleatorias de los péptidos producidos como se describe anteriormente. Este protocolo permite seleccionar grandes cantidades de clones recombinantes.

En este procedimiento, 100 ml de caldo LB con alto contenido en sales (que contiene 10 \mug/ml de cloranfenicol) se inoculó con 1 ml de un cultivo durante la noche de un clon candidato. El cultivo se cultivó a DO_{600} a 37ºC mientras se agitaba a 180 rpm. Tras la centrifugación a 2.500 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se eliminó y se pasó por una columna de IgG-sefarosa (Pharmacia) de 1 ml. La proteína de fusión se eluyó de la columna con ácido acético 0,5 M (pH 3,0) y la segunda alícuota de 1 ml contuvo prácticamente toda la proteína de fusión.

Entonces, la alícuota de 1 ml se liofilizó y se volvió a resuspender en 75 \mul de ácido fórmico al 70% que contenía bromuro de cianógeno 1 M. La reacción se hermetizó a la luz bajo nitrógeno en un tubo con tapa de rosca de 1,5 ml y se rotó durante la noche. Tras una dilución de diez veces en agua destilada estéril, la reacción se liofilizó de nuevo, se lavó en 200 \mul de agua destilada estéril, se volvió a liofilizar y se volvió a resuspender en 100 \mul de caldo LB sin sales.

La preparación de péptidos se usó en un ensayo de CMI de caldo modificado usando una placa de microtitulación de 96 pocillos. En cada pocillo se puso una alícuota de 100 \mul de caldo LB sin sales. La preparación de péptidos de 100 \mul se añadió al primer pocillo y se realizó una serie de dilución duplicada en 8 pocillos. A cada pocillo se le añadió un inóculo de 10^{2} a 10^{3} de 14028S de Salmonella typhimurium (un mutante supersusceptible a defensina) y la placa se incubó durante la noche a 37ºC.

La placa de microtitulación se examinó después de 24 horas. El extracto de la cepa K148 de S. aureus (Piers y col., anteriormente) que contenía pRIT5 y carecía de inserto de indolicidina no presentó actividad antibacteriana. Sin embargo, las cepas que expresaban indolicidina-R y CP-R3 evitaron el crecimiento del organismo de prueba en el primer, y el primer y segundo, pocillo, respectivamente. Por tanto, los péptidos que pueden destruir a diluciones superiores a 0,5 pueden identificarse como que tienen una actividad antimicrobiana aumentada con respecto a la proteína de referencia. Este procedimiento también puede usarse para identificar péptidos que tienen actividad antimicrobiana que es equivalente a o inferior a la proteína de referencia.

Ejemplo XVI Inducción de TNF en células de macrófagos RAW 264.7

El (Los) mecanismo(s) fisiológico(s) por el (los) que la endotoxina ejerce su efecto en los seres humanos implica la liberación de citocinas inflamatorias, particularmente factor de necrosis tumoral (TNF). Se probó CP-11 para su capacidad para bloquear la inducción de TNF mediante unión a LPS. Esto se probó in vitro en una línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7 y in vivo para la capacidad para revertir la muerte en un modelo de choque endotóxico murino y en un modelo de infección por P. aeruginosa.

El efecto de CP-11 e indolicidina en el TNF inducido por LPS en macrófagos se examinó usando la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7, que produce TNF en respuesta a LPS. La línea celular se cultivó sembrando 10^{6} células en un matraz de cultivo celular de 162 cm^{2}, que se incubó a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 1 semana. Entonces se eliminó el medio de células RAW [medio Eagle modificado por Dulbecco con 450 ml de tampón Hepes (2,4 mM); 3 ml de L-glutamina (400 mM); 3 ml de Pen/Strep (10^{4} U/ml de Pen, 1 mg/ml de strep); y 50 ml de suero bovino fetal al 10% (SBF) inactivado por calor] de los matraces de cultivo celular. A cada matraz se añadió una alícuota de 10 ml de disolución y se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Las células se eliminaron de los matraces, se diluyeron en medio de células RAW y se centrifugaron durante 6 minutos. El sedimento celular se volvió a resuspender en 5 ml de medio/matraz. Se eliminó una suspensión celular de 100 \mul y se añadió a 400 \mul de azul tripano y las células se contaron usando un hemocitómetro. La suspensión celular se diluyó a 1 X 10^{6} células/ml y se añadió 1 ml de suspensión por pocillo de una placa de 24 pocillos. Las placas de 24 pocillos se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} durante la noche para uso en el ensayo.

Después de una incubación durante la noche, el medio se aspiró de todos los pocillos. Se añadió LPS a 100 ng/100 \mul. El péptido se añadió a la concentración deseada/100 \mul a pocillos especificados. El medio de células RAW se añadió a todos los pocillos de manera que tuvieron un volumen final de 1 ml. Entonces, las placas se incubaron durante seis horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Luego se eliminó el sobrenadante de los pocillos y se almacenó durante la noche a 4ºC.

Los experimentos también se realizaron usando bacterias completas en un sistema de filtración Transwell. Se incubaron Bort de E. coli y P. aeruginosa viables en insertos de filtración de 0,22 \mum, que evitaron el contacto directo de las bacterias con las células de macrófagos que todavía permitieron que interaccionaran los productos liberados por las bacterias (por ejemplo, LPS) con las células. Los cultivos durante la noche se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato a una DO_{600} de 0,3 (aproximadamente 10^{8} células/ml). Las bacterias se diluyeron adicionalmente 1:100 y se contaron.

Los sobrenadantes de los experimentos de cultivo de tejido anteriores se usaron en el ensayo citotóxico de células L929. Los sobrenadantes de células RAW se diluyeron en una serie de dilución de tres veces en placas de 96 pocillos. A todos los pocillos se les añadió una alícuota de 50 \mul de medio TNF en todas las placas excepto a aquellos pocillos en la primera fila. Se añadieron por duplicado diez \mul de patrón de TNF murino (20 ng/ml) y 90 \mul de medio TNF a la placa y se diluyeron 1:2 hacia abajo de la placa de la segunda a la última fila.

Las células de fibroblasto de ratón L929 sensibles a TNF se sembraron a 10^{6} células/162 cm^{2} de matraz de cultivo celular y se dejaron cultivar durante 1 semana. Las células L929 se eliminaron del matraz con 10 ml de tripsina-EDTA/matraz y se incubaron 3-5 minutos. La suspensión celular se diluyó y luego se centrifugó durante 6 minutos. El sedimento se volvió a resuspender en 5 ml de medio de L929 fresco/matraz y se contó (igual que las células RAW). La suspensión celular se diluyó a 10^{6} células/ml. Se usaron cien \mul para inocular cada pocillo de las placas de 96 pocillos con los sobrenadantes (el medio de crecimiento de L929 era el mismo que el medio de células RAW, excepto que en lugar de SBF se utilizaron 50 ml de suero de caballo al 10% inactivado por calor; el medio de ensayo de TNF era el mismo que el medio de células, RAW excepto 4 \mug/ml de actinomicina D). Las placas se incubaron durante dos días a 37ºC, 5% de CO_{2}. Entonces, las placas se leyeron a 570 nm en un lector de placas de ELISA con filtro de referencia de 690 nm. Una unidad de actividad de TNF se definió como la cantidad requerida para destruir el 50% de las células L929. Por tanto, el nivel de TNF en unidades por ml fue el recíproco de la dilución que llevó a una destrucción del 50% de células L929. Los cálculos se realizaron usando el programa ELISA+.

La figura 9 muestra niveles de TNF (U/ml) producidos por las células de macrófagos después de un tratamiento de 6 horas con cantidades crecientes (0, 2, 5, 10, 20 ó 50 \mug) de o CP-11 o péptido de indolicidina y 100 ng de LPS de 0111:B4 de E. coli. Los datos indican que ambos péptidos redujeron eficazmente el nivel de LPS inducido en macrófagos por LPS el 70% y 71%, respectivamente. Los resultados de una incubación de 6 horas con LPS de P. aeruginosa e indolicidina o CP-11 se muestran en la figura 10. Cincuenta \mug de CP-11 e indolicidina disminuyeron la producción de TNF el 51% y 67%, respectivamente. Cincuenta \mug de indolicidina y PP-11 disminuyeron la producción de TNF por macrófagos incubados con 100 ng de LPS de Bort de E. coli el 68% y 74%, respectivamente.

En los experimentos usando bacterias intactas, los péptidos pudieron reducir eficazmente la inducción de TNF por los productos difusibles de P. aeruginosa y E. coli. CP-11 e indolicidina redujeron la inducción de TNF por LPS liberada por P. aeruginosa el 97% y 91%, respectivamente (fig. 11). Ambos péptidos redujeron la inducción de TNF por Bort de E. coli el 99% (fig. 12).

Para confirmar que la indolicidina estaba actuando en LPS en vez de directamente en las líneas celulares de macrófagos se añadieron 20 \mug de indolicidina a células RAW y se incubaron durante 60 minutos antes de la aspiración del medio y el lavado de las células 3 veces con HBSS (disolución salina tamponada de Hanks). La adición de 100 ng de LPS a las células RAW lavadas dio como resultado un alto nivel de inducción de TNF (4168 unidades de TNF por ml), sugiriendo que la indolicidina no había reducido permanentemente la capacidad de las células RAW para inducir TNF en respuesta a la adición de LPS. A diferencia, el medio aspirado que contenía indolicidina podría reducir la capacidad de células RAW frescas para inducir TNF en respuesta a 100 ng de LPS de Bort de E. coli el 74%. Hasta 50 \mug de CP-11 o indolicidina no produjeron disminución aparente en la viabilidad de células RAW como se juzgó mediante exclusión de azul tripano.

Ejemplo XVII Modelo de choque endotóxico murino

Se evaluó la capacidad de la indolicidina y variantes para proteger contra endotoxemia inducida por LPS in vivo. Los ratones (8-10 semanas de edad) se inyectaron intraperitonealmente (IP) con 20 mg de D-galactosamina (Dgal) para sensibilizarlos a LPS según el modelo de Galanos (Galanos, C., M.A., Freudenberg y W. Reutter, 1979, Galactosamine sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5939), seguido por 200 \mug de péptido en 100 \mul. Inmediatamente después de esto se inyectó LPS (10 \mug) en 100 \mul. Los ratones se observaron 24 horas después de las inyecciones y se anotaron los supervivientes. La inyección de 200 \mug de indolicidina-D, CP-11, o CP-11 o CP-11D no produjo mortalidad. Cuando también se inyectaron Dgal y LPS, esos 200 \mug de indolicidina redujeron la mortalidad a 24 horas del 100% en los controles al 60%. Por tanto, este ejemplo demuestra que los péptidos catiónicos de la invención tienen actividad antiendotoxina in vivo.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Falla y col., Timothy J.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS CATIÓNICOS ANTIMICROBIANOS Y PROCEDIMIENTOS DE SELECCIÓN DE LOS MISMOS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 44

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Fish & Richardson P.C.

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(B)

CALLE: 4225 Exeutive Square, Suite 1400

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(C)

CIUDAD: La Jolla

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(D)

ESTADO: CA

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 92037

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/002.687

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-AGOSTO-1995

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(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Wetherell, Jr., John R.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.678

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 07420/013001

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 619/678-5070

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 619/678-5099

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: no relevante

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:1:

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11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:4

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:8:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:10:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:11:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:12:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:13:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:14:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SECUENCIA CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:15:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID Nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:18:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:19:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:20:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:21:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:22:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:23:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:24:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:25:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:26:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:27:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:28:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:29:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:30:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:31:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DESCRIPCIÓN PARA SEQ ID Nº:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:32:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:33:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:34:

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:35:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:36:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:37:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:38:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:39:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:40:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:41:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:42:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:43:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº:44:

\vskip1.000000\baselineskip

54

Claims (20)

1. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que contienen el motivo -WPW- seleccionado del grupo que está constituido por:

ILKKWPWWPWRRK

(SEQ ID Nº:1);

ILKPWKWPWWPWRRKK

(SEQ ID Nº:2);

ILPWKKWPWWRWRR

(SEQ ID Nº:4);

ILPWKWPWWPWRKWR

(SEQ ID Nº:6);

ILPWKWPWWPWRRWR

(SEQ ID Nº:7);

ILPWKWPWWPWWPWRR

(SEQ ID Nº:11);

ILKKWPWWPWKWKK

(SEQ ID Nº:18);

ILPWKWPPWPPWPWRR

(SEQ ID Nº:22);

ILKKWPWWPWKRR

(SEQ ID Nº:17);

ILKKWPWWRWRR

(SEQ ID Nº:27);

ILKWAWWPWRRK

(SEQ ID Nº:30);

ILKKWPWWPWKKK

(SEQ ID Nº:32);

ILRRWPWWPWRRR

(SEQ ID Nº:33);

WWKKWPWWPWRRK

(SEQ ID Nº:34);

ILKKWPWWPWWPWRRK

(SEQ ID Nº:38);

ILKKWPWWPWRWWRR

(SEQ ID Nº:39);

ILKKWPWWPWRRWWK

(SEQ ID Nº:40);

ILKKWPWWPWPPRRK

(SEQ ID Nº:41); y

ILKKWPWWPWPPFFRRK

(SEQ ID Nº:42).

\vskip1.000000\baselineskip

2. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido está amidado o carboximetilado.

3. Ácido nucleico que codifica un péptido de la reivindicación 1.

4. Un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una bacteria o levadura que comprende poner en contacto la bacteria o levadura con una cantidad eficaz inhibidora de un péptido según la reivindicación 1 ó 2.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la bacteria es gram-positiva o gram-negativa.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la bacteria gram-positiva es Staphylococcus aureus o S. epidermidis.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la bacteria gram-negativa se selecciona del grupo que está constituido por E. coli, P. aeruginosa y S. typhimurium.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende además poner en contacto la bacteria o levadura con al menos un antibiótico.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el antibiótico se selecciona del grupo que está constituido por una \beta-lactama, novobiocina y polimixina B.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 4, 8 ó 9, en el que la levadura es Candida albicans.

11. Un péptido según la reivindicación 1 ó 2 para uso en la inhibición de un trastorno asociado a endotoxemia o sepsis en un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un trastorno tal.

12. El péptido de la reivindicación 11, en el que el trastorno es choque séptico.

13. El péptido de la reivindicación 1 ó 2 para uso en la inhibición del crecimiento de una bacteria o levadura en un sujeto en necesidad del mismo.

14. El péptido de la reivindicación 1 ó 2 para uso como agente tópico.

15. El péptido de la reivindicación 13, en el que la bacteria es gram-positiva o gram-negativa.

16. El péptido de la reivindicación 15, en el que la bacteria gram-positiva es Staphylococcus aureus o S. epidermidis.

17. El péptido de la reivindicación 15, en el que la bacteria gram-negativa se selecciona del grupo que está constituido por E. coli, P. aeruginosa y S. typhimurium.

18. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 15 a 17, en el que el uso comprende además poner en contacto la bacteria o levadura con al menos un antibiótico.

19. El péptido de la reivindicación 18, en el que el antibiótico se selecciona del grupo que está constituido por una \beta-lactama, novobiocina y polimixina B.

20. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 13, 18 ó 19, en el que la levadura es Candida albicans.