ES2316382T3 - Secuencias gst del frijol de soja y su uso en la produccion de plantas resistentes a los herbicidas. - Google Patents
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Abstract
Una Glutatión-S-transferasa (GST) que comprende la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 10 o una variante de GST que tiene al menos 80% de identidad con la misma cuando se calcula sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 10 con la condición de que dicha variante de GST no comprenda la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 36, y en la cual la GST o variante de GST sea capaz de conferir resistencia y/o tolerancia a un herbicida el cual comprende fomesafen y/o acifluorfen.
Description
Secuencias GST del fríjol de soja y su uso en la
producción de plantas resistentes a los herbicidas.
La presente invención se relaciona entre otras,
con secuencias de
Glutatión-S-transferasa (GST) y su
uso en métodos para la producción de plantas resistentes a los
herbicidas. En particular los polinucleótidos según la invención
pueden ser usados en métodos para la producción de plantas que son
resistentes a los herbicidas que comprenden fomesafen y/o
acifluorfen.
Las plantas que son sustancialmente
"tolerantes" a un herbicida cuando son sometidas a éstos
proporcionan una curva de dosis/respuesta que se desplaza a la
derecha cuando se compara con aquella proporcionada por plantas
parecidas no tolerantes similarmente sometidas. Tales curvas
dosis/respuesta tienen puesto en el eje x del gráfico "dosis"
y en el eje y "porcentaje de muerte", "efecto herbicida"
etc. Las plantas tolerantes típicamente requerirán por lo menos dos
veces más herbicida que las plantas parecidas no tolerantes para
producir un determinado efecto herbicida. Las plantas que son
sustancialmente "resistentes" al herbicida presentan pocas, o
ningunas, lesiones necróticas, líticas, cloróticas u otras cuando
son sometidas al herbicida a concentraciones e índices que son
empleados típicamente por la comunidad agroquímica para matar malas
hierbas en el campo. De aquí en lo adelante cuando sean usadas
individualmente las palabras (i) "tolerante" y (ii)
"resistente" significan "tolerante y/o
resistente".
Las plantas resistentes a los herbicidas ya
están disponibles en el arte por ejemplo, la ROUNDUP READY^{TM}
Soja que es resistente a los herbicidas que tienen como sitio de
acción la enzima
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa, tal como aquellos agroquímicos que contienen glifosato.
Una de las ventajas de estas plantas es que el granjero puede
aplicar los herbicidas a los campos que contienen los cultivos de
plantas y malas hierbas usando "aplicación over the top", para
matar las malas hierbas.
Otros ejemplos de productos para uso en métodos
para la producción de plantas resistentes a los herbicidas son
proporcionados en la Solicitud Internacional de Patente Número de
Publicación WO 93/01294 y WO 99/14337. Aquí la resistencia se logra
insertando en la planta un polinucleótido que proporciona la
producción de una enzima
glutatión-S-transferasa (GST) que
está involucrada en la detoxificación del herbicida. En este
contexto McGonigle y otros. (1998 Pesticide Biochemistry and
Physiology. 62 pp15-25) describe plantas
transgénicas que comprenden genes que codifican para GST de soja
que son tolerantes a los herbicidas de cloroacetanilida y
tiocarbamato. Se ha demostrado que las enzimas
Glutatión-S-transferasas existen en
varios organismos tales como bacterias, hongos, levaduras, plantas,
mamíferos y peces y pueden existir como homo o heterodímeros con
subunidades típicamente entre 24 y 30 kDa. Un ejemplo de una enzima
Glutatión-S-transferasa conocida es
el clon de ADNc Glicina max con el número de acceso EMBL
A1440996. Sin embargo, para esta enzima no se conoce ningún dato en
lo que se refiere a su actividad así como el herbicida sobre el cual
actúa. Se ha demostrado que la detoxificación del herbicida se
logra por la conjugación del herbicida con el glutatión (GSH) de
tiol libre, un tripéptido
(gamma-glutamil-cisteinil-glicina)
dentro de la planta (Cole D.J. 1994 Pesticide Science. 42
pp209-222). Tal conjugación es catalizada por la
GST. También se ha demostrado que la detoxificación de los
herbicidas ocurre siguiendo la conjugación del herbicida con
homoglutatión, el cual es el tiol predominante en algunas especies
de leguminosas. El homoglutatión (hGSH) es también un tripéptido
(gamma-glutamil-cisteinil-Beta-alanina)
pero difiere de la GSH en la adición de
Beta-alanina en vez de una glicina a la parte
gamma-glutamil-cisteinil. La
síntesis del homoglutatión (hGSH) es catalizada por la actividad de
la enzima homoglutatión sintasa (hGSHS). La secuencia parcial de un
hGSHS de Medicago truncatula ha sido publicada (Frendo y
otros. 1999 Plant Journal. 17 pp215-219).
De este modo, la presente invención busca
proporcionar entre otros, nuevos polinucleótidos que codifiquen
para proteínas que puedan ser usadas en métodos para proporcionar
plantas con altos niveles de resistencia a los herbicidas que
comprenden fomesafen y/o acifluorfen.
Según la presente invención aquí se proporciona
una Glutatión-S-transferasa (GST)
que comprende la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID No.
10 o una variante de GST que tenga al menos 80% de identidad con la
condición de que dicha variante de GST no comprenda la secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID No. 36. (la cual corresponde a la
secuencia del clon SE3.03B09 listada como SEQ ID No. 8 en la
Solicitud Internacional de Patente Número de Publicación WO
00/18936). En una nueva realización de la presente invención dicha
variante de GST tiene al menos 85% de identidad con la secuencia
descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización adicional de la
presente invención dicha variante de GST tiene al menos 90% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de GST
tiene al menos 91% de identidad con la secuencia descrita como SEQ
ID No. 10. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de GST tiene al menos 92% de identidad con
la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización
adicional de la presente invención dicha variante de GST tiene al
menos 93% de identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No.
10. En aún una realización adicional de la presente invención dicha
variante de GST tiene al menos 94% de identidad con la secuencia
descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización adicional de la
presente invención dicha variante de GST tiene al menos 95% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de
GST tiene al menos 96% de identidad con la secuencia descrita como
SEQ ID No. 10. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de GST tiene al menos 97% de identidad con
la secuencia descrita como SEQ ID No. 10. En aún una realización
adicional de la presente invención dicha variante de GST tiene al
menos 98% de identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 10.
En aún una realización adicional de la presente invención dicha
variante de GST tiene al menos 99% de identidad con la secuencia
descrita como SEQ ID No. 10.
El porcentaje de identidad de secuencia para
proteínas se determina comparando dos secuencias óptimamente
alineadas sobre una ventana de comparación, en la cual la porción de
secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede
comprender adiciones o deleciones (por ejemplo brechas) en
comparación con la secuencia inicial de referencia (que no
comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las
dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de
posiciones en las que se encuentra el residuo de aminoácido
idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones
coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre
el número total de posiciones en la ventana de comparación y
multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de
identidad de secuencia. Cuando se calcula el porcentaje de identidad
de secuencia las secuencias pueden alinearse permitiendo hasta 3
brechas con la condición de que en lo que respecta a las brechas,
un total de no más de 15 residuos de aminoácidos sean afectados. La
alineación óptima de secuencias para la comparación también puede
conducirse por implementaciones computarizadas de algoritmos
conocidos. En una realización particular de la presente invención
la identidad de la secuencia se calcula usando el algoritmo FASTA
versión 3 que usa el método de Pearson y Lipman (Lipman, D.J. y
Pearson, W.R. (1985) Rapid and Sensitive Protein Similarity
Searches and Science. 227:1435-1441 y Pearson, W.R.
y Lipman, D.J. (1988) Improved tools for biological sequence
comparison. PNAS, 852444-2448) para buscar las
similitudes entre la secuencia de referencia (también llamada la
secuencia consultada) y cualquier grupo de secuencias (llamadas
secuencias extensas). Los métodos que existen también en el arte
que permiten calcular el porcentaje de identidad de secuencia entre
las secuencias de polinucleótidos.
La proteína de puede diferir de la secuencia
básica de la proteína GST (SEQ ID No. 10) por sustituciones
conservativas o no-conservativas de aminoácidos.
Una sustitución conservativa será entendida que significa que el
aminoácido se reemplaza con un aminoácido con propiedades químicas
ampliamente similares. En particular pueden hacerse sustituciones
conservativas entre los aminoácidos dentro de los siguientes
grupos:
(i) Alanina y Glicina;
(ii) Serina y Treonina;
(ii) Ácido Glutámico y Ácido Aspártico;
(iii) Arginina y Lisina;
(iv) Asparagina y Glutamina;
(v) Isoleucina y Leucina,
(vi) Valina y Metionina;
(vii) Fenilalanina y Triptófano.
En general, más sustituciones conservativas que
no-conservativas serán posibles sin destruir las
propiedades GST de las proteínas. Las variantes adecuadas de las
proteínas de acuerdo con la presente invención pueden ser
determinadas probando las propiedades de GST de la proteína usando
métodos de rutina los cuales son bien conocidos por la persona
experimentada en el arte. Tales variantes de proteínas también
pueden sintetizarse químicamente usando técnicas estándares.
La presente invención además proporciona una GST
o una variante como se describe anteriormente en la cuál dicha GST
o la variante es capaz de conferir resistencia y/o tolerancia a un
herbicida que comprende fomesafen y/o acifluorfen. El herbicida
también puede comprender otros Difenil éteres o Sulfonilureas como
el Clorimuron Etilo y/o Cloroacetanilidas como el acetoclor.
La invención presente todavía llega más allá
proporcionando un polinucleótido que comprende una región que
codifica para una GST o una variante de GST como se describió
anteriormente. En una realización particular de la presente
invención dicho polinucleótido comprende la secuencia descrita como
SEQ ID No. 14.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID No. 1, o una variante de la
proteína que tiene al menos 80% de identidad con la cuál dicha
proteína o variante es capaz de catalizar la adición de
Beta-alanina sobre gamma glutamilcisteína. En una
nueva realización de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 75% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 85% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 90% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 95% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 96% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 97% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene al menos 98% de identidad con la secuencia descrita
como SEQ ID No. 1. En aún una realización adicional de la presente
invención dicha variante de la proteína tiene al menos 99% de
identidad con la secuencia descrita como SEQ ID No. 1. La identidad
de secuencia puede calcularse y las variantes de proteína
creadas/identificadas de una manera análoga a la descrita
anteriormente.
La presente invención aún proporciona
adicionalmente una variante de la proteína como se describió en el
párrafo precedente que tiene una Km para
Beta-alanina la cual es menor que dichas variantes
de Km para glicina cuando se calcula usando el mismo método. En una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene una Km para Beta-alanina que es menor
o igual a alrededor de 1 mM y una Km para glicina que es mayor que
1 mM cuando se calcula usando el mismo método. En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína tiene una Km para Beta-alanina la cual es
menor o igual a alrededor de 0.8 mM y una Km para glicina que es
mayor que 0.8 mM cuando se calcula usando el mismo método. La Km o
la "Constante de Michaelis-Menten" es un
parámetro cinético que indica la concentración del sustrato a la que
la velocidad inicial de la reacción (Vo) es la mitad de la máxima.
Los métodos para el cálculo de la Km son bien conocidos por las
personas experimentadas en el arte.
La presente invención proporciona además una
variante de proteína como se describió anteriormente que comprende
una secuencia que contiene al menos la secuencia de una de las
regiones de aminoácidos descritas en el grupo descrito como SEQ ID
No. 2 (KKIQQELAKP); SEQ ID No. 3 (CFAGLWSL); SEQ ID No. 4
(VMKPQREGGGNNIYG) y SEQ ID No. 5 (AAYILMQRIFP). En aún una
realización adicional de la presente invención dicha variante de la
proteína comprende una secuencia la cual contiene al menos la
secuencia de dos regiones de aminoácidos seleccionados del grupo
descrito como SEQ ID No. 2, 3, 4 ó 5. En aún una realización
adicional de la presente invención dicha variante de la proteína
comprende una secuencia que contiene las secuencias de todas las
regiones de aminoácidos descritas como SEQ ID No. 2, 3, 4 ó 5.
La presente invención aún proporciona
adicionalmente un polinucleótido que comprende una región que
codifica para la proteína o variante de la proteína como se
describió anteriormente. En una realización adicional de la
presente invención dicho polinucleótido comprende la secuencia
descrita como SEQ ID No. 6.
La presente aún proporciona adicionalmente un
polinucleótido que comprende una primera región que comprende un
polinucleótido que codifica para una GST o variante de GST según la
presente invención y una segunda región que comprende un
polinucleótido que codifica para una proteína o variante de la
proteína de acuerdo a la presente invención. En una realización
adicional de la presente invención dicha primera región comprende un
polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos
descrita como SEQ ID No. 10 y dicha segunda región comprende un
polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos
descrita como SEQ ID No. 1. Las regiones pueden estar separadas por
una región que proporciona un polipéptido para el autoprocesamiento
que es capaz de separar tal como el polipéptido de
autoprocesamiento descrito en US 5,846,767 o cualquier elemento que
funcione similarmente. Como alternativa las regiones pueden
separarse por una secuencia la cual actúa como un sitio diana para
un elemento externo que es capaz de separar las secuencias de
proteína. Como alternativa el polinucleótido puede proporcionar un
poliproteína que comprende una pluralidad de funciones de proteína
tales como una GST y una homoglutatión sintetasa según la
invención. En una nueva realización de la presente invención las
proteínas de la poliproteína pueden colocarse en tándem. En aún una
realización adicional de la presente invención la poliproteína
comprende una pluralidad de funciones de proteína que están
separadas por secuencias enlazadoras.
La presente invención proporciona aún
adicionalmente una construcción de ADN que comprende la secuencia de
un promotor operable de planta operablemente enlazado a un
polinucleótido operablemente enlazados a una región de terminación
de la transcripción según la presente invención. En una realización
adicional de la presente invención la construcción de ADN además
comprende una región o una pluralidad de regiones que proporcionan
el blanco del producto o de los productos de la proteína para una
localización o localizaciones particulares. La construcción de ADN
puede además comprender una región que proporciona para la
producción de una proteína que actúa como un marcador de selección.
El marcador de selección puede, en particular, conferir resistencia
a la kanamicina; higromicina o gentamicina. Los marcadores de
selección más apropiados incluyen genes que confieren resistencia a
otros herbicidas como los herbicidas basados en glifosfato o
resistencia a toxinas como la eutipina. Otras formas de selección
también se encuentran disponibles como los sistemas de selección
basados en hormona como el sistema de Multi Auto Transformación
(MAT) de Hiroyrasu Ebinuma y otros. 1997. PNAS Vol. 94
pp2117-2121; sistemas de selección visual que usan
la conocida proteína de fluorescencia verde, la \beta
glucoronidasa y cualquier otro sistema de selección tal como el de
manosa isomerasa, el de xilosa isomerasa y el de
2-deoxiglucosa (2-DOG). El promotor
operable de planta de la construcción de ADN puede seleccionarse
del grupo que consiste en Agrobacterium rhizogenes
RolD; RolD/Fd; el inhibidor de proteasa de papa II; CaMV35S;
CamV35S doble potenciado; FMV35S; NOS; OCS; Patatin; E9; el
interruptor alcA/alcR.; el interruptor GST; el interruptor RMS; el
oleosin; el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa
bisfosfato carboxilasa-oxigenasa. Los terminadores
que pueden usarse en las construcciones de acuerdo a la presente
invención incluyen Nos, inhibidor de proteinasa II y el terminador
del gen de la alfa-tubulina (EP-A
652,286). Es igualmente posible usar, en asociación con la
secuencia de regulación del promotor, otras secuencias de regulación
las cuales se sitúan entre el promotor y la secuencia que codifica
para la proteína según la presente invención, tales como
potenciadores transcripcionales o traduccionales, por ejemplo, el
activador de traducción del virus del grabado del tabaco (TEV)
descrito en la Solicitud Internacional de Patente, PCT número de
publicación W0 87/07644 o la secuencia líder de la Glucanasa II. El
polinucleótido que codifica para la proteína según la invención
también puede ser codón-optimizado, o alterado por
otra parte para potenciar por ejemplo, la transcripción una vez que
es incorporado en el material de la planta. Tal optimización de
codón también puede usarse para alterar la estructura secundaria
predicha del transcripto de ARN producido en cualquier célula
transformada, o para destruir la inestabilidad de los elementos
crípticos de ARN presentes en el transcripto inalterado, de este
modo aumentando la estabilidad y/o disponibilidad del transcripto en
la célula transformada (Abler and Green. 1996. Plant Molecular
Biology (32) pp63-78).
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente un método para proporcionar plantas que son
resistentes y/o tolerantes a un herbicida difenil éter que
comprende: (a) insertar en el material del genoma de la planta un
polinucleótido o secuencia de polinucleótido que proporciona una GST
o variante de GST como se describió anteriormente o una
construcción de ADN como se describió anteriormente; y (b) regenerar
plantas o partes de plantas de allí; y (c) aplicar a dichas plantas
o partes de plantas una cantidad de dicho herbicida difenil éter
que es fitotóxico a las plantas tipo control y seleccionar estas
plantas o partes de plantas que son resistentes a dicho herbicida
difenil éter. En una nueva realización de la presente invención el
polinucleótido insertado en el material de la planta de acuerdo con
el método de la oración precedente codifica para una secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID No. 10.
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente métodos como los descritos en el párrafo precedente
en los cuáles dicho herbicida difenil éter comprende fomesafen y/o
acifluorfen. La construcción polinucleótido/ADN puede ser
incorporada en el material del genoma de la planta de acuerdo con la
presente invención por técnicas de transformación de plantas las
cuáles son bien conocidas por las personas experimentadas en el
arte. Tales técnicas incluyen pero no se limitan a la
transformación por partículas mediada por biolística. La
transformación mediada por Agrobacterium, transformación de
protoplastos (opcionalmente en presencia de polietilenglicoles);
sonicación de tejidos de plantas, células o protoplastos en un medio
que comprende el polinucleótido o vector; microinserción del
polinucleótido o vector en el material totipotente de la planta
(opcionalmente empleando la conocida técnica de "pelos" de
carburo de silicio), electroporación y similares. Las técnicas que
son específicamente optimizadas para un cultivo particular pueden
ser empleadas para los propósitos de transformar un cultivo
particular de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, cuando
se transforma la soja puede ser preferible usar un método basado en
uno descrito por Christou y otros (1990). Dan y otros
(1999). Williams y otros (2000) y Hinchee y otros
(1999). El método de transformación per se no es pertinente a
la presente invención y la persona experta puede emplear cualquier
método funcional apropiado para el cultivo diana.
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente plantas o partes de plantas resistentes a los
herbicidas obtenidas de acuerdo a los métodos descritos
anteriormente. Tales plantas o partes de planta pueden seleccionarse
del grupo que consiste de: melones; mangos; soja; algodón; tabaco;
remolacha azucarera; colza oleaginosa; canola; lino; girasol; papa;
tomate; alfalfa; lechuga; maíz; trigo; sorgo; centeno; bananos;
cebada; avena; césped de hierba; césped de forraje; caña de azúcar;
guisante; haba; arroz; pino; álamo; manzana; melocotones; uva;
fresas; zanahoria; lechuga; berza; cebolla; cítrico; cereal; plantas
de nuez u otros cultivos de horticultura. En una realización
particular de la presente invención dichas plantas o partes de
planta son las plantas o partes de la planta de soja (Glicina
sp.).
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente un método de proporcionar una planta con una
característica agronómica deseada adicional que comprende: (a)
insertar en el material del genoma de la planta o parte de una
planta como es descrito anteriormente un polinucleótido que
proporciona la característica agronómica deseada; y regenerar
plantas o partes de planta de dicho material; o (a) cruzar una
primera planta o parte de planta como se describió anteriormente
con una segunda planta que proporciona dicha característica
agronómica deseada; y (b) seleccionar aquellas plantas resultantes
que contienen dicha característica agronómica deseada adicional.
Sería apreciado que la planta resultante de tal método contenga las
características de las GSTs y/o homoglutatión sintetasa según la
presente invención como se describió anteriormente junto con las
características asociadas con dichas características agronómicas.
En una realización adicional de la presente invención dicha
característica agronómica deseada adicional proporciona la
resistencia a un herbicida que comprende glifosato o una sal del
mismo. La característica agronómica deseada adicional también puede
ser seleccionada del grupo que consiste de: mayor resistencia al
herbicida; resistencia al insecto; resistencia al nematodo;
tolerancia al stress; rendimiento alterado; valor de nutricional
alterado; cualidad alterada o cualquier otra característica
agronómica deseable. En aún una realización adicional de la
invención dicha característica agronómica adicional comprende la
resistencia y/o tolerancia a insectos lograda por la producción de
proteínas insecticidas tales como las lectinas o proteínas
derivadas de Bacillus thuringiensis, Xenorhabdus sp. y
de Photorabdus sp en la planta. En aún una realización
adicional de la invención dicha característica agronómica adicional
comprende la resistencia y/o tolerancia a nemátodos lograda por
medio de la producción de proteínas nematicidas tales como los
inhibidores de enzima, en la planta.
La presente invención todavía proporciona
adicionalmente un método para controlar selectivamente las malas
hierbas en un campo dicho campo comprendiendo la cosecha de las
plantas y las malas hierbas dicho método comprende la aplicación a
dicho de campo de una formulación agrícolamente aceptable de un
agroquímico que comprende fomesafen y/o acifluorfen en la cual
dicho cultivo de plantas son las plantas según la invención.
La invención será ahora descrita por vía de los
siguientes ejemplos no limitantes con referencia a las figuras y
secuencias enumeradas en las que:
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del
vector de clonaje pMJB2.
La Figura 2 muestra un diagrama esquemático del
vector de clonaje pMOG1051
La Figura 3 muestra un diagrama esquemático del
vector binario pMOG800
La Figura 4 muestra un diagrama esquemático del
vector pFT2 usado, para la transformación por medio de
Agrobacterium, para transformar las plantas para dar la
resistencia a los herbicidas.
- SEQ ID No.1.
- Homoglutatión sintetasa de Glicina max.
- SEQ ID Nos. 2 a 5.
- Regiones de la proteína Homoglutatión sintetasa.
- SEQ ID No. 6.
- Secuencia polinucleotídica que codifica para la Homoglutatión sintetasa de Glicina max.
- SEQ ID Nos. 7 a 10.
- Glutatión-S-transferasas 2.6, 3.1, 3.2 y 3.3 respectivamente.
- SEQ ID No. 11 a 14.
- Polinucleótidos que codifican para las GSTs 2.6, 3.1, 3.2 y 3.3 respectivamente. (GST 3.3 también puede estar referida como GST 3.6).
- SEQ ID Nos. 15 a 24.
- Los cebadores.
- SEQ ID Nos. 25 a 34.
- La secuencia de soja derivada de la secuencia de ácidos nucleicos P32110; la secuencia de Fríjol Mungo U20809; la secuencia de Tabaco Q03663; la secuencia de papa derivada de la secuencia de ácidos nucleicos P32111; la secuencia de Arabidopsis P46421; la secuencia (genómica) de Arabidopsis P46421; la secuencia de Papaya AJ000923; la secuencia de Abeto AF051214; la secuencia de trigo AF004358; la secuencia de Abeto AF051238 respectivamente.
- SEQ ID No. 35.
- El cebador.
- SEQ ID Nos 36 a 43.
- Las secuencia de clones enumeradas como SEQ ID Nos. 8, 22, 7,21, 31, 15, 23 y 25 en la Solicitud Internacional de Patente Número de Publicación WO 00/18936.
1.1 Se obtuvieron ADNcs parciales que codifican
para GSTs de soja usando la reacción en cadena de la polimerasa
reverso-transcriptasa (RT-PCR) con
oligonucleótidos cebadores degenerados diseñados para las regiones
conservadas dentro de las conocidas GSTs clase tau usando métodos
de alineamiento conocidos en el arte. El ARN total se obtuvo de
cultivos celulares de soja (Glicina max cv. Mandarin) usando
el reactivo TRIZOL^{TM} (Life Technologies^{TM}) según las
pautas de los fabricantes. La primera cadena de ADNc se obtuvo de 5
\mug de ARN total usando el oligonucleótido OG2 (SEQ ID No. 35)
en conjunto con la reverso transcriptasa
Superscript-II (Life Technologies^{TM}) usando
los protocolos estándares proporcionados por el fabricante. Los
oligonucleótidos cebadores degenerados CON2 (SEQ ID No. 17) y CON3
(SEQ ID No. 18) se usaron entonces en las reacciones de PCR
independientes con el oligonucleótido cebador OG9 (SEQ ID No. 16)
para amplificar parcialmente los genes que codifican para la GST a
partir de la primera cadena de ADNc. 2 \mul de la primera cadena
de ADNc sintetizada se usaron como plantilla en la reacción. Las
condiciones de PCR usadas son (94ºC, 45 s; 51ºC, 30 s y 72ºC, 60 s)
35 ciclos usando la Taq ADN polimerasa suministrada por Life
Technologies y un termociclador Techne. Los productos amplificados
fueron ligados en el vector pCR2.1 (Invitrogen^{TM}) y
transformados en células de E. coli INV F'.
1.2 Las colonias transformadas se seleccionaron
en medio LB que contiene 100 ug ml-l de ampicilina y
40 ug ml de X-GAL. Los plásmidos se recuperaron a
partir de cultivos de toda la noche de 5 ml, iniciado cada uno de
90 colonias blancas individuales (45 de cada reacción de RT
inicial). Los diferentes plásmidos fueron sometidos entonces a
análisis de restricción (EcoRI, SspI, SspI: SphI y RsaI) permitiendo
agrupar los clones similares. Los distintos ADNcs fueron
identificados por secuencia automatizada de ADN con los cebadores
M13, usando un secuenciador automático de ADN ABI 377, y analizados
por similitud con las secuencias de GST conocidas mediante la
realización de búsquedas en bases de datos usando el algoritmo BLAST
(Altschul S.F y otros, 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
2.1 Un ADNc de longitud parcial que codifica
para la homoglutatión sintetasa fue obtenido por
RT-PCR. Los oligonucleótidos cebadores degenerados
MS-3 (el SEQ ID No.15) y OG9 (SEQ ID No. 16) se
usaron para amplificar específicamente el clon deseado de primera
cadena de ADNc, producido por cultivos celulares de soja como se
describe anteriormente.
2.2 El producto de PCR obtenido se clonó en el
vector pCR2.1 y fue secuenciado usando un secuenciador automático
de ADN AB1377^{TM}. Los productos que exhiben homología con
glutatión sintetasas relacionadas fueron identificados buscando en
las bases de datos usando el algoritmo BLAST.
\vskip1.000000\baselineskip
3.1 Se construyó una biblioteca de ADNc usando
el sistema lambda ZAP-II (Stratagene). El ARN total
se aisló de una suspensión celular de cultivos de 5 días de células
soja (cv. Mandarin) usando reactivo TRIZOL^{TM}. El ARNm Poli A+
se aisló a partir de ARN total usando PolyATtract (Promega^{TM})
según los protocolos estándares suministrados. La biblioteca de
ADNc se construyó según los siguientes protocolos estándares
proporcionados por Stratagene^{TM}.
La tabla 1 más abajo muestra las características
de la biblioteca de ADNc construida de una suspensión celular de
cultivos de 5 días de células soja (cv. Mandarin).
3.2 Las secuencias parciales de ADNc
identificadas en los ejemplos anteriores fueron marcadas con
P^{32} usando el kit de marcaje
Ready-to-go (Pharmacia^{TM}) y
usadas para muestrear la biblioteca de ADNc de soja por ADNcs de
longitud completa. Fueron muestreados 160,000 pfu y las colonias
supuestas hibridaron de forma cruzada con las sondas sometidas a un
muestreo secundario y terciario hasta que se observó pureza en la
placa. El ADN de los plásmidos se recuperó de las reservas de
placas puras usando protocolos de escisión in vivo
suministrados por Stratagene^{TM}. Fueron identificados los ADNcs
de longitud completa que codifican para GSTs y los ADNcs de
longitud completa que codifican para la homoglutatión sintetasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNcs de longitud completa que codifican
para homoglutatión sintetasa y glutatión
S-transferasa se expresaron de forma independiente
en E.coli usando el sistema de expresión pET
(Novagen^{TM}).
4.2 Los sitios NdeI o NcoI fueron
introducidos de forma apropiada en el extremo 5' de los ADNcs que
codifican para la glutatión S-transferasa y
BamHI en el extremo 3' usando PCR. El ADNc se clonó entonces
en el pET-24a o pET-24d como es
apropiado. Los plásmidos resultantes se introdujeron en
E.coli BL21 (DE3) usando procedimientos estándares de
transformación bacteriana conocidos por aquellos expertos en el
arte. La expresión y purificación de la GST recombinante se realizó
usando cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de
afinidad S-Hexil-glutatión según los
métodos conocidos en el arte (por ejemplo, Skipsey y otros,
1997). La actividad GST de la proteína recombinante purificada hacia
CDNB, acetoclor, acifluorfen, etil clorimuron, fluorodifen,
fomesafen y metolaclor en presencia de ambas glutatión y
homoglutatión se realizó por medio de ensayos que se describen en
Andrews y otros, 1997 y Skipsey y otros, 1997.
4.3 La tabla 2 más abajo muestra la actividad de
enzimas recombinantes. \pmSE, n=2, ND = No detectable, *Actividad
nkat mg-1, **Actividad pkat mg-1
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr \cr \cr
\cr}
\newpage
Sitios de enzimas de restricción 5' NcoI
y 3' XhoI fueron introducidos en el ADNc de homoglutatión
sintetasa por medio de PCR usando los cebadores MS4-Nco (SEQ
ID No. 20). Además, el uso del cebador
MS-4-HIS proporciona una cola de
HIS C-terminal para ayudar a la purificación de la
enzima.
5.2 El fragmento resultante de la PCR fue
digerido con NcoI y XhoI y ligado en el
pET-24d similarmente digerido. Este vector fue
llamado pET-MS4-His. La purificación
de la homoglutatión sintetasa se realizó usando el siguiente
método. Las E.coli BL21 (DE3) que portaban el plásmido
pET-MS4-His (sección 1.3) fueron
crecidas a 30ºC hasta una DO_{600} = 0.5, luego se añadió
isopropil-\beta-tiogalactósido
(IPTG) a una concentración final de 0.1 mM. Posterior a una
incubación de 3 horas las bacterias fueron colectadas por
centrifugación, resuspendidas en tampón A (20 mM. Tris, 0.5 M NaCl,
5 mM. imidazol pH 8.0) y lisadas. Los restos celulares fueron
removidos por centrifugación (10,000 g, 10 min) y el sobrenadante
aplicado a una columna de 5 ml de ácido iminidiaceico
(Sigma^{TM}), previamente cargado con NiSO_{4} y equilibrado en
tampón A. La columna fue lavada con tampón A que contiene 20 mM de
imidazol, seguido por tampón A que contiene 300 mM de imidazol para
remover las proteínas unidas por afinidad.
5.3 La proteína eluida fue concentrada usando
una columna de centrifugación Centriplus 30 (Amicon^{TM}) y
resuspendida en tampón A previo a su aplicación a una columna
quelante HiTrap de 1 ml (Pharmacia^{TM}),
pre-cargada con NiSO_{4} y equilibrada como se
describió anteriormente. La proteína unida por afinidad es
recobrada entonces usando una concentración creciente de imidazol de
20-200 mM y la presencia de la homoglutatión
sintetasa recombinante con cola de Histidina fue detectada usando
anticuerpos para colas de Histidina de acuerdo a procedimientos
conocidos. Las fracciones que contenían la homoglutatión sintetasa
recombinante fueron agrupadas, concentradas usando columnas de
centrifugación Centricon 30 y resuspendidas en 20 mM
Tris-HCl pH 8.0, 1 mM DTT.
5.4 Se ensayó la actividad de la homoglutatión
sintetasa en 250 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KCl, 20
mM MgCl_{2}, 5 mM DTT, 10 mM ATP, 1 mM
\gamma-glutamilcisteína y 50 mM glicina o 10 mM
\beta-alanina en un total de 100 \mul. Los
controles experimentales no contenían la enzima o glicina/
\beta-alanina. Los ensayos se realizaron a 30ºC
por 60 minutos, con alícuotas de 20 \mul removidas a intervalos de
tiempo regulares. Entonces se realizó una derivatización
monobromobimana en las alícuotas para determinar la presencia de o
glutatión o homoglutatión de acuerdo con los métodos descritos por
Cummins y otros, 1997.
6.1 Las plantas con tolerancia incrementada a
los herbicidas acifluorfen y fomesafen fueron obtenidas por
expresión en la planta hospedero de ambos la GST 3.3 activa de soja
y la homoglutatión sintetasa para incrementar además los niveles de
homoglutatión, requeridos para potenciar la eficiencia de la función
de GST 3.3.
6.2 La PCR, usando los oligonucleótidos
cebadores hGSH-NcoI (SEQ ID No. 21) y
hGSH-KpnI (SEQ ID No. 22) se usó para introducir un
sitio 5' NcoI y un sitio 3' KpnI en el ADNc GST 3.6.
El producto resultante de la PCR fue purificado, secuenciado,
digerido con NcoI y KpnI y ligado en el vector pMJB2
(Figura 1). El cassette de expresión, que comprende el promotor
doble potenciado CaMV35S: Glucanasa II líder, ADNc de hGSH
sintetasa y terminador nos fue escindido entonces de pMJB2
usando HindIII/EcoRI y ligado en el vector binario
pMOG800 similarmente digerido (Figura 3).
6.3 Los oligonucleótidos cebadores
3.6-BglII (SEQ ID No. 23) y 3.6 NcoI (SEQ ID
N. 24) fueron usados para introducir los sitios NcoI y
BglII en los extremos 5' y 3' del ADNc GST 3.6
respectivamente. El producto resultante de la PCR fue purificado,
secuenciado y digerido con NcoI y BglII y
sub-clonado en el vector pMOG1051 (Figura 2). El
cassette de expresión que comprende el promotor RolD/Fd, ADNc de GST
3.3 y el terminador PI-II de papa fue escindido
entonces de pMOG1051 usando BamHI y ligado en el único sitio
BamHI en el vector binario pMOG800 (Figura 3) que porta el
cassette de expresión de la homoglutatión sintetasa (ver adelante).
La orientación del inserto fue determinada por PCR. El vector
binario resultante, llamado pFT2 (Figura 4) fue secuenciado
íntegramente para confirmar su autenticidad.
\vskip1.000000\baselineskip
7.1 El vector binario pFT2 fue transformado en
Agrobacterium tumefaciens cepa LBA 4404 usando el método de
transformación de congelación descongelación proporcionado por
Holsters y otros, 1978. La transformación de tabaco y
regeneración de la planta entera fue realizada usando Nicotiana
tabacum var. Samsun según los protocolos estándares detallados
por Bevan, 1984. Los eventos de transformación se seleccionaron en
medio MS que contiene kanamicina. Pueden ser empleados otros
métodos de transformación para la transformación de otros cultivos,
tales como la soja. Ejemplos de tales métodos son referidos a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras de hojas de líneas
transformadas y se extrajo ADNc según los métodos descritos por
Edwards y otros, 1991. Los pares de oligonucleótidos
cebadores SEQ ID No. 21 y SEQ ID No. 22 y SEQ ID. No. 23 SEQ ID No.
24 fueron usados para amplificar regiones específicas dentro de la
homoglutatión sintetasa y GST 3.3 para permitir la detección de
ambos transgenes dentro del material putativo de la planta
transformada.
Los análisis siguientes fueron realizados en
material positivo a PCR para confirmar la funcionalidad de los
genes introducidos.
La actividad GST hacia el fomesafen en líneas
transgénicas fue realizado de acuerdo a los métodos descritos en la
publicación de Andrews y otros, 1997.
Las actividades glutatión y homoglutatión
sintetasa fueron determinadas en las líneas transgénicas usando el
ensayo descrito anteriormente.
La presencia de tiol libre en las plantas
transgénicas fue determinada usando el método de derivatización
monobromobimana. El tejido (1 g) fue pesado con precisión, congelado
en nitrógeno líquido, triturado a polvo fino y transferido a un
tubo limpio que contiene 3 ml de HCl 0.1 M. Después de una
incubación en hielo por 30 minutos con mezcla ocasional, la mezcla
fue transferida a un tubo eppendorf y centrifugada (13,000 g, 3
min). Dos alícuotas de 100 \mul de sobrenadante fueron
transferidas a tubos eppendorfs limpios, y se añadió 10 \mul de
agua a uno y al otro se le añadió 1 mM de glutatión o homoglutatión
(10 \mul). El tiol libre presente fue reducido por la adición de
10 \mul de NaOH 1M seguido por 10 \mul de NaOH que contenía 20
mg/ml NaBH_{4} y la solución fue incubada por 10 minutos a
temperatura ambiente.
8.4.1 La reacción fue detenida por la adición de
120 \mul de HCl 3.6 M y las muestras centrifugadas (13,000 g, 5
min). El sobrenadante (100 \mul) fue transferido a un tubo fresco
y 10 \mul de 5 mg ml de monobromobimana disueltos en acetonitrilo
añadidos, seguido por 5 \mul de N-etilmorfolina al
35% v/v. Las muestras fueron puestas en la oscuridad por un período
de 20 min, y la reacción fue parada por la adición de 880 \mul de
ácido acético al 5% (5 \mul v/v). Una curva estándar fue preparada
derivatizando glutatión o homoglutatión (0-20
mmol), y los conjugados S-bimana analizados por HPLC
usando metodología conocida en el arte (Cummins y otros,
1997).
\vskip1.000000\baselineskip
9.1 A continuación del cultivo de tejidos, las
plántulas resistentes a la kanamicina fueron transferidas a
recipientes de 5 pulgadas que contienen abono para recipientes John
Innes no. 3. Se les permitió a las plantas desarrollarse hasta
aproximadamente un estadío 10 de hoja y se aplicó fomesafen a 10 g
ai ha^{-1}, formulado con surfactante no iónico, al tejido aéreo
usando un atomizador de pista. La evaluación visual de la
fitotoxicidad/necrosis de la planta se realiza a los 5 días
posteriores a la aplicación.
10.1 Las líneas transgénicas de planta de una
sola copia fueron identificadas por análisis con Southern blot
según los métodos descritos por Sambrook, 1989 usando sondas
apropiadas radiomarcadas. El análisis de segregación fue realizado
en plantas que contenían un solo evento de inserción por germinación
en medio MS que contiene kanamicina. La confirmación posterior de
líneas homocigóticas puede ser realizada por retro cruzamiento de
líneas transgénicas con tabaco tipo salvaje y análisis de
segregación genética seguido por selección en kanamicina.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SECUENCIAS DE GST DE SOJA Y SU USO
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CASO ZENECA PPD50449/WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB9922346.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Fragmento de Proteína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1854
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 899
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 840
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 918
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16, 24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2763
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ácidos nucleicos derivada de SOJA P32110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Fríjol mungo U20809
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2038
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Tabaco Q03663
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2796
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de ácidos nucleicos derivada de Papa P32111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Arabidopsis P46421
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia genómica de Arabidopsis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 968
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Secuencia de Papaya AJ000923
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1040
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Abeto AF051214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 902
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Trigo AF004358
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1127
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Abeto AF051238
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 895
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 895
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 977
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1006
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 885
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glicina max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 991
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
Claims (13)
1. Una
Glutatión-S-transferasa (GST) que
comprende la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 10 o
una variante de GST que tiene al menos 80% de identidad con la misma
cuando se calcula sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 10
con la condición de que dicha variante de GST no comprenda la
secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 36, y en la cual
la GST o variante de GST sea capaz de conferir resistencia y/o
tolerancia a un herbicida el cual comprende fomesafen y/o
acifluorfen.
2. Un polinucleótido que comprende la región que
codifica para una GST o variante de GST de acuerdo a la
reivindicación 1.
3. Un polinucleótido de acuerdo a la
reivindicación 2 que comprende la secuencia descrita como SEQ ID NO.
14.
4. Una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos descrita como SEQ ID NO. 1 o una variante de proteína
que tiene al menos un 80% de identidad con la misma cuando se
calcula sobre la longitud completa de la SEQ ID NO. 1, donde dicha
proteína o variante es capaz de catalizar la adición de
Beta-alanina sobre gamma glutamilcisteína y donde
la variante tiene una Km para Beta-alanina la cual
es menor que dichas variantes de Km para glicina cuando se calcula
usando el mismo método.
5. Una variante de proteína de acuerdo a la
reivindicación 4 cuya variante comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo descrito como SEQ ID NOs. 2, 3,
4 ó 5.
6. Un polinucleótido que comprende una región
que codifica para una proteína o variante de proteína según las
reivindicaciones 4 ó 5.
7. Un polinucleótido de acuerdo a la
reivindicación 6 que comprende la secuencia descrita como SEQ ID NO.
6.
8. Un polinucleótido que comprende la primera
región que comprende un polinucleótido según las reivindicaciones 2
ó 3 y una segunda región que comprende un polinucleótido según las
reivindicaciones 6 ó 7.
9. Un polinucleótido de acuerdo a la
reivindicación 8 donde dicha primera región comprende un
polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos
descrita como SEQ ID NO. 10 y dicha segunda región comprende un
polinucleótido que codifica para un aminoácido descrito como SEQ ID
NO. 1.
10. Un método de proporcionar plantas que sean
resistentes y/o tolerantes a un herbicida difenil éter que
comprende:
- (a)
- insertar en el material del genoma de la planta un polinucleótido o una secuencia de polinucleótido de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 8 ó 9;
- (b)
- regenerar plantas o partes de plantas de la misma; y
- (c)
- aplicar a dichas plantas o partes de plantas una cantidad de dicho herbicida difenil éter el cual es fitotóxico a las plantas tipo control y seleccionar aquellas plantas o partes de plantas las cuales son resistentes a dicho herbicida difenil éter.
11. Plantas o partes de plantas, donde dichas
plantas o partes de plantas son resistentes a los herbicidas
difenil éter debido a la expresión de una GST de acuerdo a la
reivindicación 1 codificada por una construcción de ADN que
comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones
2, 3, 8 ó 9.
12. Un método para proporcionar una planta con
una característica agronómica deseada adicional que comprende:
- (a)
- insertar en el material del genoma de la planta de una planta o parte de una planta de acuerdo a la reivindicación 11 un polinucleótido el cual proporciona una característica agronómica deseada adicional y regenerar plantas o partes de plantas de dicho material; o
- (b)
- el método de la reivindicación 10, seguido por el cruzamiento de la primera planta o parte de planta proporcionada por el paso (c) del método de la reivindicación 10 con una segunda planta la cual proporciona dicha característica agronómica deseada y seleccionar dichas plantas resultantes las cuáles contienen dicha característica agronómica deseada adicional.
13. Un método de controlar selectivamente las
malas hierbas en un campo dicho campo comprendiendo plantas de
cultivo y malas hierbas, dicho método comprendiendo aplicar a dicho
campo una formulación agrícolamente aceptable de un agroquímico que
comprende fomesafen y/o acifluorfen, donde dichas plantas de cosecha
son las plantas de acuerdo a la reivindicación 11.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9922346 | 1999-09-21 | ||
| GBGB9922346.3A GB9922346D0 (en) | 1999-09-21 | 1999-09-21 | Improvements in or relating to organic compounds |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2316382T3 true ES2316382T3 (es) | 2009-04-16 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00960838T Expired - Lifetime ES2316382T3 (es) | 1999-09-21 | 2000-09-18 | Secuencias gst del frijol de soja y su uso en la produccion de plantas resistentes a los herbicidas. |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP1218517B1 (es) |
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