BRPI0413917B1

BRPI0413917B1 - ácido nucleico ahas de arroz mutagenizado não transgênico, polipeptídeo ahas isolado, e, método de controle de ervas daninhas dentro da vizinhança de uma planta de arroz

Info

Publication number: BRPI0413917B1
Application number: BRPI0413917A
Authority: BR
Inventors: B Livore Alberto; R Prina Alberto; Singh Bijay; Birk Iwona
Original assignee: Instituto Nacional De Tech Agropecuaria
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2018-09-25
Also published as: EP2294913B1; EP1659855B1; US20120172224A1; ES2743420T3; UY38692A; ES2544692T3; CO5700668A2; AR047107A1; US20070028318A1; MXPA06002155A; UY28495A1; ES2379553T3; WO2005020673A1; EP2982240B1; BRPI0413917A; EP1659855A1; EP2982240A1; EP2294913A1

Abstract

"planta de arroz, parte de planta, célula de planta, semente, ácido nucleico ahas isolado, polipeptídeo ahas isolado, e, métodos de controle de ervas daninhas dentro da vizinhança de uma planta de arroz, e de produção de uma planta transgênica". a presente invenção refere-se às plantas possuindo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona. mais particularmente, a presente invenção inclui plantas de arroz contendo pelo menos uma variante de ácido nucleico ahas tal como uma linhagem iminta 1, 4 ou 5 tolerante à imidazolinona compreendendo uma substituição de alanina por treonina comparada com ahas de tipo selvagem. a presente invenção também inclui sementes produzidas por estas plantas de arroz e métodos de controle de sementes na vizinhança destas plantas de arroz.

Description

(54) Título: ÁCIDO NUCLÉICO AHAS DE ARROZ MUTAGENIZADO NÃO TRANSGÊNICO, POLIPEPTÍDEO AHAS ISOLADO, E, MÉTODO DE CONTROLE DE ERVAS DANINHAS DENTRO DA VIZINHANÇA DE UMA PLANTA DE ARROZ (51) Int.CI.: A01H 5/00; C12N 15/29; C12N 15/60; C12N 9/88 (30) Prioridade Unionista: 29/08/2003 US 60/498895, 30/12/2003 US 60/533105 (73) Titular(es): INSTITUTO NACIONAL DE TECHNOLOGIA AGROPECUARIA (72) Inventor(es): ALBERTO B. LIVORE; ALBERTO R. PRINA; IWONA BIRK; BIJAY SINGH (85) Data do Início da Fase Nacional: 24/02/2006 “ÁCIDO NUCLEICO AHAS DE ARROZ MUTAGENIZADO NÃO

TRANSGÊNICO, POLIPEPTÍDEO AHAS ISOLADO, E, MÉTODO DE

CONTROLE DE ERVAS DANINHAS DENTRO DA VIZINHANÇA DE

UMA PLANTA DE ARROZ”

Campo da invenção

A presente invenção refere-se em geral às plantas possuindo uma tolerância aumentada aos herbicidas de imidazolinona. Mais especificamente, a presente invenção refere-se às plantas de arroz obtidas por mutagênese e procriação cruzada e transformação que possuem uma tolerância aumentada aos herbicidas de imidazolinona.

Fundamentos da invenção

De acordo com uma pesquisa de fazendeiro, as maiores restrições à produção de arroz são as ervas daninhas (Hidaka et al., Agrochemicals Japan, 2000, 77: 21-29). Semeadura direta tem reduzido os problemas laboriosos de transplantação, contudo esta tecnologia tem ajudado a aumentar o problema de ervas daninhas. O uso de herbicidas em culturas de arroz é uma prática comum na maioria das regiões de arroz que diretamente semeiam culturas de arroz e/ou em países desenvolvidos que crescem arroz quer sob transplantação quer sob sistemas de semeadura direta. Normalmente herbicidas para plantas de folha larga e para gramíneas aplicados uma ou mais vezes com o propósito de controlar as ervas daninhas em culturas de arroz.

Gramíneas, juncas e arroz daninho (arroz vermelho) têm sido os maiores grupos de espécies que possuem adaptação elevada aos mesmos ambientes onde arroz está crescendo. Estas ervas daninhas têm se tornado globalmente distribuídas e são de controle difícil em culturas de arroz. Arroz vermelho pertence a mesma espécie que a do arroz cultivado (Oryza sativa L.). A similaridade genética de arroz vermelho e de arroz comercial tem tornado difícil o controle herbicida do arroz vermelho. Várias ₉ βββ · 9 9 9 9 9 9 9 9 V w práticas de cultura ajudam a controlar as ervas daninhas e são convenientes para melhor cuidado ambiental, tais como a preparação do terreno, o nivelamento do terreno, barragens e profundidade de água, rotação de cultura, semente certificada, sistemas de planta apropriada e datas de plantio. Embora

Sr» estas práticas de cultura possam ajudar a reduzir o banco de semente de erva daninha e o desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes a herbicida, impõem certas restrições e aumentam o custo da cultura.

A despeito de muitas recomendações para melhores práticas de cultura, fazendeiros ainda se baseiam no uso de herbicidas como a ferramenta principal para controlar ervas daninhas. O uso e o abuso de alguns destes compostos químicos têm resultado no desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes tal como capim de pátio (Echinochloa crus gallí) resistente a Propanil e a Butaclor. Nestes casos, é conveniente que se tenha outros herbicidas com modos de ação diferentes com a capacidade para controlar a maioria destas espécies de erva daninha, de modo que sua aplicação possa ser alternada com a dos herbicidas comumente aplicados.

Aceto-hidróxi-ácido-sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, acetolactato-sintase (ALS)), codificada pelo ácido nucléico AHAS, é a

I primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica de aminoácidos ramificados valina, leucina, e isoleucina (Singh Β. K., 1999, Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine em: Singh Β. K. (Ed.) Plant aminoacids, Marcei Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-246). AHAS é o sítio de ação de quatro famílias de herbicidas estruturalmente diversos incluindo as sulfoniluréias (LaRossa RA e Falco SC, 1984, Trends Biotechnol. 2: 158-161), as imidazolinonas (Shaner et al., 1984, Plant Physiol. 76: 545-546), as triazolopirimidinas (Subramarian e Gerwick, 1989, Inhibition of acetolactesynthase by triazolopirimidines em (ED) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology, ACS Symposium Series,

American Chemical Society, Washington, D. C. pp. 277-288), e os pirimidilóxi-benzoatos (Subramarian et al., 1990, Plant Physiol. 94: 239-244). Herbicidas de imidazolinona e de sulfonil-uréia são amplamente usados em agricultura moderna devido à sua efetividade em taxas de aplicação muito baixas e não-toxicidade relativa em animais. Pela inibição da atividade de AHAS, estas famílias de herbicidas evitam o crescimento e o desenvolvimento adicionais de planta suscetíveis incluindo muitas espécies de ervas daninhas. Vários exemplos de herbicidas de imidazolinona comercialmente disponíveis são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquina) e ARSENAL® (imazapir). Exemplos de herbicidas de sulfoniluréia são cloro-sulfurona, metsulfurona metil, sulfometurona metil, clorimurona etil, tifensulfurona metil, tribenurona metil, bensulfurona metil, nicosulfarona, etametsulfurona metil, rinsulfurona, triflusulfarona metil, triasulfurona, primisulfurona metil, cinosulfurona, amidosulfarona, fluzasulfurona, imazosulfurona, pirazosulfurona etil, e halosulfurona.

Devido à sua efetividade elevada e à sua toxicidade baixa, os herbicidas de imidazolinona são favorecidos para aplicação por pulverização sobre o topo de uma área ampla de vegetação. A capacidade para pulverizar um herbicida sobre o topo de uma área ampla de vegetação diminui os custos associados com o estabelecimento e a manutenção da plantação, e diminui a necessidade de preparação do sítio antes do uso de tais compostos químicos. Pulverização sobre o topo de uma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade para alcançar o rendimento máximo potencial da espécie desejada devido à ausência de espécie competitiva. Contudo, a capacidade para usar tais técnicas de pulverização sobrejacente é dependente da presença de espécie tolerante à imidazolinona da vegetação desejada na área de pulverização sobrejacente.

Dentre as culturas agrícolas maiores, algumas espécies de leguminosas tal como feijão-soja são naturalmente resistentes aos herbicidas de imidazolinona devido à sua capacidade para rapidamente metabolizar os cv

• β • 9 9 9 compostos herbicidas (Shaner e Robson, 1985, Weed Sei. 33; 469-471). Outras culturas tais como milho (Newhouse et ai, 1992, Plant Physiol. 100: 882-886) e arroz (Barrett et al., 1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press New York, pp. 195-220) são suscetíveis aos herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferente aos herbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida específico e do metabolismo diferente do composto de uma forma tóxica para não-tóxica em cada planta (Shaner et al., 1984, Plant Physiol. 76: 545-546; Brown et al., 1987, Pestic. Biochem. Physiol. 27: 24-29). Outras diferenças fisiológicas de planta tais como absorção e translocação também desempenham um papel importante na sensibilidade (Shaner e Robson, 1985, Weed Sei. 33: 469-471).

Cultivares de cultura resistentes às imidazolinonas, sulfoníluréias e triazolopirimidinas têm sido produzidos com sucesso usando mutagênese de semente, de microesporo, de pólen, e de calo em Zea mays, Brassica napes, Glycine max, e Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989, Crop Sei. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989, Theor. Appl. Genet. 78:525530; Newhouse et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al., 1991, Plant Physiol. 97:104.4-1050; Mourand et al., 1993, J. Heredity 84:9196). Em todos os casos, um único gene nuclear parcialmente dominante conferiu resistência. Quatro plantas de trigo resistentes à imidazolinona também foram previamente isoladas após mutagênese de semente de Triticum aestivum L cv Fidel (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol. 100:882-886). Estudos de hereditariedade confirmaram que um único gene parcialmente dominante conferiu resistência. Baseando-se em estudos alélicos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhagens identificadas estavam localizadas no mesmo locus. Um dos genes de resistência de cultivar Fidel foi chamado de FS-4 (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol. 100:882.886).

Modelagem baseada em computador da conformação tridimensional do complexo de AHAS-inibidor prediz vários aminoácidos na

« 9 9 9 · β β 9 β « » « · » - bolsa de ligação do inibidor proposta como sítios nos quais mutações induzidas provavelmente conferiríam resistência seletiva às imidazolinonas (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:359-368). Plantas de tabaco produzidas com algumas destas mutações racionalmente planejadas nos sítios de ligação propostos da enzima AHAS têm de fato exibido resistência específica a uma única classe de herbicidas (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:359-368).

Resistência de planta aos herbicidas de imidazolinona também tem sido relatada em numerosas patentes. Patentes US 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439, e 6.222.100 em geral descrevem o uso de um ácido nucleico AHAS alterado para gerar uma resistência a herbicida em plantas, e especificamente descrevem certas linhagens de milho resistentes à imidazolinona. Patente US 5.013.659 descreve plantas exibindo resistência a herbicida possuindo mutações em pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões conservadas. As mutações lá descritas codificam quer resistência cruzada para imidazolinonas e sulfonil-uréias quer resistência específica à sulfonil-uréia, mas resistência específica à imidazolinona não é descrita. Adicionalmente, Patente US 5.731.180 e Patente US 5.767.361 discutem um gene isolado possuindo uma substituição de único aminoácido em uma seqüência de aminoácidos AHAS de monocotiledônea de tipo selvagem que resulta em resistência específica à imidazolinona.

Plantas de arroz resistentes a herbicida e transgênicas também têm sido descritas. Foi descrito um arroz mutante resistente ao herbicida de sulfonil-uréia, derivado por pressão seletiva sobre cultura de tecido de calo, onde a resistência era atribuída a uma enzima AHAS mutante (Terakawa et al., Rice Mutant Resistant to the Herbicide Bensulfuron Methyl (BSM) by in vitro Selection, Japan. J. Breed., 1992 vol. 42:267-275). Outras variedades de planta de arroz resistentes a herbicida têm sido descritas em patentes e pedidos de patente, incluindo WO 97/41218, WO 01/85970 e Patentes US 5.545.822, 5.736.629, 5.773.704, Patentes US 5.773.703, 5.952.553, e

• ··· · · ··· - ·· 6.274.796. Patente US 5.545.822 descreve uma linhagem de planta de arroz possuindo uma resistência metabolizadamente baseada aos herbicidas que interferem com a enzima de planta aceto-hidróxi-ácido-sintase; i.e., a resistência a herbicida destas plantas de arroz não foi devido a uma enzima AHAS resistente. WO 97/41218 descreve uma linhagem de plantas de arroz possuindo uma enzima AHAS variante que é resistente aos herbicidas que interferem com a enzima de planta de tipo selvagem aceto-hidróxi-ácidosintase. Esta linhagem de plantas de arroz foi desenvolvida pela exposição das sementes de arroz ao mutágeno etil-éster de ácido metano-sulfônico (EMS), e pela triagem de milhões de progênie para a resistência ao herbicida.

O que é necessária na arte é a identificação de outras linhagens de arroz compreendendo genes de resistência à imidazolinona. Também são necessárias na arte plantas de arroz possuindo tolerância aumentada aos herbicidas tais como imidazolinona e contendo pelo menos um ácido nucléico AHAS alterado. Também são necessários métodos para controlar o crescimento de ervas daninhas na vizinhança de tais plantas de arroz. Estas composições e métodos permitirão o uso de técnicas de pulverização sobrejacente quando se aplicam herbicidas em áreas contendo plantas de arroz.

Sumário da invenção

A presente invenção proporciona plantas de arroz compreendendo ácidos nucleicos AHAS variantes, na qual a planta de arroz possui tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta. Em uma modalidade, a planta de arroz compreende uma variante de ácido nucléico AHAS. Em outra modalidade, a variante de ácido nucléico AHAS codifica uma proteína AHAS variante compreendendo uma substituição de alanina por treonina em comparação com uma proteína AHAS de tipo selvagem. Também são proporcionadas plantas de arroz e sementes de planta derivadas de plantas de

arroz aqui descritas.

Os ácidos nucleicos AHAS variantes da presente invenção podem compreender uma seqüência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de: um polinucleotídeo como definido um definido na SEQ ID NO: 1; um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 3, um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 5; um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 11; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 2; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 4; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 6; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 12; um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados; sendo que a variante de ácido nucléico AHAS codifica um polipeptídeo AHAS conferindo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com um polipeptídeo AHAS de tipo selvagem.

As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não-transgênicas. Em uma modalidade, as plantas da presente invenção são não-transgênicas. Exemplos de plantas de arroz não-transgênicas possuindo tolerância aumentada aos herbicidas de imidazolinona incluem uma planta de arroz possuindo um Número de Designação de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207, ou NCIMB 41208; ou é um derivado mutante, recombinante ou geneticamente engenheirado da planta com um Número de Designação de Patente NCIMB 41206, NCINB 41207, ou NCIMB 41208; ou qualquer uma progênie da planta com um Número de Designação de Patente NCIMB 41206, NCINB 41207, ou NCIMB 41208; ou é uma planta que é uma progênie de qualquer uma destas plantas.

Em adição às composições da presente invenção, vários métodos são proporcionados. São aqui descritos métodos de modificação de uma tolerância de planta de arroz a um herbicida de imidazolinona compreendendo modificar a expressão de um ácido nucléico AHAS na planta. Também são descritos métodos de produção de uma planta transgênica possuindo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona compreendendo transformar uma célula de planta com um vetor de expressão ^r compreendendo um ou mais ácidos nucléicos AHAS variantes codificadores de uma proteína AHAS variante compreendendo uma substituição de alanina por treonina em comparação com uma proteína AHAS de tipo selvagem e gerar a planta a partir da célula de planta. A invenção adicionalmente inclui ^10 um método de controlar ervas daninhas dentro da vizinhança de uma planta de arroz, compreendendo aplicar um herbicida de imidazolinona nas ervas daninhas e na planta de arroz, no qual a planta de arroz possui tolerância ao herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta de arroz no qual a planta compreende um ou mais ácidos nucléicos AHAS codificadores de uma proteína AHAS variante compreendendo uma substituição de alanina por treonina em comparação com a proteína AHAS de tipo selvagem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figuras 1A-B mostram a seqüência de cDNA parcial do ácido ^20 nucléico IMINTA 1 AHAS (SEQ ID NO: 1) e a sua seqüência de aminoácidos deduzida correspondente (SEQ ID NO: 2). Figuras 1C-D mostram a seqüência de cDNA parcial do ácido nucléico IMINTA 4 AHAS (SEQ ID NO: 3) e a sua seqüência de aminoácidos deduzida correspondente (SEQ ID NO: 4). Figuras 1E-F mostram a seqüência de cDNA parcial do ácido nucléico IMINTA 5 AHAS (SEQ ID NO: 5) e a sua seqüência de aminoácidos deduzida correspondente (SEQ ID NO: 6). Figuras 1G-H mostram a seqüência de cDNA parcial do ácido nucléico IRGA 417 AHAS de tipo selvagem (SEQ ID NO: 7) e a sua seqüência de aminoácidos deduzida correspondente (SEQ ID NO: 8).

β d	d d d	d	d ·	d » d	d d
	•	•	d *	»	d d	d	d	d	9 fr
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Figura 2 mostra o alinhamento de seqüência de cDNA do gene AH AS amplificado do DNA genômico da linhagem IMINTA 1 tolerante a imidazolinona (SEQ ID NO: 1), do gene AHAS amplificado do DNA genômico da linhagem IMINTA 4 tolerante a imidazolinona (SEQ ID NO: 3), do gene AHAS amplificado do DNA genômico da linhagem IMINTA 5 tolerante a imidazolinona (SEQ ID NO: 5), do gene AHAS amplificado do DNA genômico da linhagem de arroz IRGAS 417 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 7), e de uma seqüência de consenso de gene AHAS de arroz (SEQ ID NO: 9). O polimorfismo de nucleotídeo conferindo a tolerância a imidazolinona às linhagens IMINTA 1, 4, e 5 está indicado em negrito.

Figura 3 mostra o alinhamento de seqüência de aminoácidos da seqüência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pelo gene AHAS da linhagem IMINTA 1 tolerante à imidazolinona (SEQ ID NO: 2), da seqüência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pelo gene AHAS da linhagem IMINTA 4 tolerante à imidazolinona (SEQ ID NO: 4), da seqüência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pelo gene AHAS da linhagem IMINTA 5 tolerante à imidazolinona (SEQ ID NO: 6), da seqüência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pelo gene AHAS da linhagem de arroz de tipo selvagem IRGA 417 (SEQ ID NO: 10). O polimorfismo conferindo a tolerância à imidazolinona às linhagens IMINTA 1, 4, e 5 está indicado em negrito.

Figura 4A mostra um exemplo de um cDNA de comprimento total de uma variante de ácido nucleico AHAS (SEQ ID NO: 1) e a Figura 4B mostra um exemplo de uma seqüência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pelo gene AHAS mostrado na Figura 4A (SEQ ID NO: 12), na qual o polipeptídeo confere tolerância a uma imidazolinona em comparação com um polipeptídeo AHAS de tipo selvagem.

Figura 5 é uma tabela mostrando o planejamento de bloco aleatório para o teste de campo da linhagem IMINTA 1 e da variedade IRGA

9 9 9 9	9 9* 9	9 9	9	9 9	r • 9	» 9 9 9	< 9 9	« 9
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417.

Figura 6 é uma tabela mostrando a resposta das linhagens IRGA 417 e IMINTA 1 ao tratamento por imidazolinona.

Figura 7 é uma tabela mostrando o rendimento de grãos em umidade de 14% para as linhagens IRGA 417 e IMINTA 1 após o tratamento com imidazolinona.

Figura 8 é uma tabela mostrando a avaliação dos componentes de rendimento em linhagens IRGA 417 e IMINTA 1 após o tratamento com imidazolinona.

Descrição detalhada

A presente invenção refere-se às plantas de arroz, às partes de planta de arroz e às células de planta de arroz possuindo tolerância aumentada aos herbicidas de imidazolinona. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas de arroz aqui descritas e métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança das plantas de arroz aqui descritas. É para ser entendido que como usados no relatório descritivo e nas reivindicações, um ou uma pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual é empregada. Assim, por exemplo referência a uma célula pode significar que pelo menos uma célula pode ser empregada.

Como aqui usado, o termo planta de arroz refere-se a uma planta que é um membro do gênero Oryza. As plantas de arroz da presente invenção podem ser membros de um gênero Oryza incluindo, mas não limitado a, O. alta, O. australiensis, O. barthii, O. brachyantha, O. eichingeri, O. ingeri, O. glaberrima, O. glumaepatula, O. grandiglumis, O. granulata, O. latifolia, O. longiglumis, O. longistaminata, O. meridionalis, O. meyeriana, O. minute, O. nivara, O. officinalis, O. punctata, O. rhizomatis, O. nidleyi, O. rufipogon, O. sativa, e O. schlechteri e seus híbridos. Exemplos de subespécies de O. sativa incluídas na presente invenção são Japonica, e Indica. Um cultivar não limitante de Japonica é Nipponbare, e um exemplo • 9 ··· tf 0 • · * • · 0

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D¹⁰ não limitante de Indica é o cultivar 93-11.

O termo planta de arroz é intencionado para incluir plantas de arroz em qualquer estágio de maturidade ou de desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de planta) tomados ou derivados de qualquer tal planta a não ser que seja claramente indicado de outro modo pelo contexto. Partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, flores, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos, e semelhantes. A presente invenção também inclui sementes produzidas por plantas de arroz da presente invenção. Em uma modalidade, as sementes são procriação verdadeira para uma tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da semente de planta de arroz.

A presente invenção descreve uma planta de arroz compreendendo pelo menos uma variante de ácido nucleico AHAS, na qual a planta de arroz possui tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta. Como aqui usado, o termo locus de gene AHAS refere-se à posição de um gene AHAS em um genoma, e os termos gene AHAS e ácido nucleico AHAS referemse a um ácido nucleico codificador da enzima AHAS.

Como aqui usado, o termo variante de ácido nucleico AHAS refere-se a um ácido nucleico AHAS possuindo uma seqüência que é mutada a partir de um ácido nucleico AHAS de tipo selvagem e que confere tolerância aumentada à imidazolinona a uma planta na qual ele é expressado. Como aqui usado, o termo alelo AHAS variante refere-se a uma única cópia de um ácido nucleico AHAS específico.

Conseqüentemente, a presente invenção inclui uma planta de arroz compreendendo uma variante de ácido nucleico AHAS, na qual a planta de arroz possui tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em íAD

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®₂₀ comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta e na qual a variante de ácido nucléico AHAS codifica uma proteína AHAS variante compreendendo uma mutação de alanina por treonina em comparação com uma proteína AHAS de tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a mutação de alanina por treonina corresponde à posição 96 da seqüência de aminoácidos AHAS como mostrada na SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade preferida, a variante de ácido nucléico AHAS é selecionado do grupo consistindo de uma seqüência de polinucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 1; uma seqüência de polinucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 3; uma seqüência de polinucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 5; uma seqüência de polinucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 11; uma seqüência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 2; uma seqüência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4; uma seqüência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 6; e uma seqüência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 12.

A presente invenção inclui plantas de arroz compreendendo um ou mais alelos AHAS, na qual a planta de arroz possui tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta. Os alelos AHAS podem compreender uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo de uma seqüência de polinucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1; uma seqüência de

polinucleotídeo	mostrada	na	SEQ	ID	NO: 3;	uma seqüência	de
polinucleotídeo	mostrada	na	SEQ	ID	NO: 5;	uma seqüência	de
polinucleotídeo	mostrada	na	SEQ	ID	NO: 11;	uma seqüência	de
polinucleotídeo	codificadora do	polipeptídeo mostrado	na SEQ ID NO:	2;

uma seqüência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4; uma seqüência de polinucleotídeo codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 6; e uma seqüência de polinucleotídeo

ι ^20 • · · ....... · · · ·· · 9 · ··· · · ·· · ⁹

9 9 · · · · · · · · ₉ «·« Ο β ··· · 99 9·· · codificadora do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 12, um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados; e um polinucleotídeo complementar a qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados.

Em uma modalidade, a planta de arroz compreende dois ácidos nucleicos AHAS variantes diferentes. Em outra modalidade, a planta de arroz compreende uma variante de ácido nucléico AHAS, na qual o ácido nucléico compreende a seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 5. Preferivelmente, pelo menos um dos ácidos nucleicos AHAS variantes compreende uma seqüência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 5.

O herbicida de imidazolinona pode ser selecionado de, mas não é limitado a, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), um derivado de qualquer um dos herbicidas acima mencionados, ou uma mistura de dois ou mais dos herbicidas acima mencionados, por exemplo imazapir/imzamox (ODYSSEY®). Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado de, mas não é limitado a, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-3-quinolina-carboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-5-(metóxi-metil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-5-metil-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-nicotínico, e uma mistura de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-m-toluato de metila e 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imídazolin-2-il)-p-toluato de metila. O uso de ácido 5-etíl-2-(4-isopropil-4metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e de ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico é preferido. O uso de ácido 2-(4-isopropil-425

··· metil-5 -oxo-2-imidazolin-2-il)-5 -(metóxi-metil)-nicotínico é particularmente preferido.

®20

As plantas de arroz aqui descritas podem ser plantas de arroz transgênicas ou plantas de arroz não-transgênicas. Como aqui usado, o termo transgênico refere-se a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta, que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante está integrado em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de modo que seja passado para gerações sucessivas. Para os propósitos da invenção, o termo polinucleotídeo recombinante refere-se a um polinucleotídeo que tem sido alterado, rearranjado ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo cionado, ou polinucleotídeos, que estão ligados ou unidos em seqüências heterólogas. O termo recombinante não se refere às alterações dos polinucleotídeos que resultam de eventos naturalmente ocorrentes, tais como mutações espontâneas, ou núcleo de espuma mutagênese não-espontânea seguida por procriação seletiva. Plantas contendo mutações decorrentes devido à mutagênese não-espontânea e à procriação seletiva são aqui referidas como plantas não-transgênicas e estão incluídas na presente invenção.

Um exemplo de uma linhagem de planta de arroz nãotransgênica compreendendo uma variante de ácido nucleico AHAS é a linhagem de planta depositada com o NCIMB possuindo Número de Designação de Depósito de Patente NCIMB 41206, aqui chamada de linhagem de arroz AHAS IMINTA 1. A seqüência de nucleotídeos parcial correspondendo ao gene IMINTA 1 AHAS é mostrada na SEQ ID NO: 1.

Outro exemplo de uma linhagem de planta de arroz nãotransgênica compreendendo uma variante de ácido nucleico AHAS é a linhagem de planta depositada com o NCIMB possuindo Número de

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Designação de Depósito de Patente NCIMB 41207, aqui chamada de linhagem de arroz AHAS IMINTA 4. A seqüência de nucleotídeos parcial correspondendo ao gene IMINTA 4 AHAS é mostrada na SEQ ID NO: 3.

Outro exemplo de uma linhagem de planta de arroz não5 transgênica compreendendo uma variante de ácido nucléico AHAS é a » linhagem de planta depositada com o NCIMB possuindo Número de

Designação de Depósito de Patente NCIMB 41208, aqui chamada de linhagem de arroz AHAS IMINTA 5. A seqüência de nucleotídeos parcial correspondendo ao gene IMINTA 5 AHAS é mostrada na SEQ ID NO: 5.

J0 Depósitos separados de cerca de 2.500 sementes cada uma de linhagens de trigo tolerantes à imidazolinona foram feitos com o NCIMB, Aberdeen, Escócia, RU aos 22 de dezembro de 2003. Estes depósitos foram feitos de acordo com os termos e as provisões do Tratado de Budapeste relacionado ao depósito de microorganismos. Os depósitos foram feitos para uma duração de pelo menos trinta anos e pelo menos cinco anos após o pedido mais recente para o fornecimento de uma amostra do depósito recebido por NCIMB. As sementes depositadas foram de acordo com os Números de Designação de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207, e NCIMB 41208.

W20 A presente invenção inclui a planta de arroz possuindo um

Número de Designação de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207, ou NCIMB 41208; um derivado mutante, recombinante, ou geneticamente engenheirado da planta com Número de Designação de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207, ou NCIMB 41208;

qualquer progênie da planta com Número de Designação de Depósito de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207, ou NCIMB 41208; e uma planta que é a progênie de qualquer uma destas plantas. Em uma modalidade preferida, a planta de arroz da presente invenção adicionalmente possui as características de tolerância a herbicida da planta com Número de Designação de Depósito

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• ··· β · ··· · ·· ··· · de Patente NCIMB 41206, NCIMB 41207, ou NCIMB 41208.

Também estão incluídos na presente invenção os híbridos das linhagens de planta de arroz IMINTA 1, 4, e 5 aqui descritas e híbridos de IMINTA 1, 4, e 5 com outra planta de arroz.

Os termos cultivar e variedade referem-se a um grupo de plantas dentro de uma espécie definida pelo compartilhamento de um conjunto comum de características ou feições aceito por aquelas pessoas experientes na arte como suficiente para distinguir um cultivar ou uma variedade de outro cultivar ou outra variedade. Não há implicação em qualquer termo de que todas as plantas de um dado cultivar ou de uma dada variedade serão geneticamente idênticas em nível quer de gene total quer molecular ou que qualquer planta dada será homozigótica e todos os loci. Um cultivar ou uma variedade é considerado(a) procriação verdadeira para uma feição específica se, quando a variedade ou o cultivar de procriação verdadeira for auto-polinizado, toda a progênie contiver a feição. Os termos linhagem de procriação ou linhagem referem-se a um grupo de plantas dentro de um cultivar definido pelo compartilhamento de um conjunto comum de características ou feições aceito por aquelas pessoas experientes na arte como suficiente para distinguir uma linhagem de procriação ou linhagem da outra linhagem de procriação ou linhagem. Não há implicação em qualquer termo de que todas as plantas de qualquer dada linhagem de procriação ou linhagem serão geneticamente idênticas em nível quer de gene total quer molecular ou que qualquer planta dada será homozigótica e todos os loci. Uma linhagem de procriação ou linhagem será considerada procriação verdadeira para uma feição específica se, quando a linhagem de procriação verdadeira ou linhagem de procriação for auto-polinizado, toda a progênie contiver a feição. Na presente invenção, a feição decorre de uma mutação em um gene AH AS da semente ou planta de arroz.

É para ser entendido que a planta de arroz da presente

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999 · ···· · ·· ·9β· invenção pode compreender um ácido nucléico AHAS de tipo selvagem em adição a uma variante de ácido nucléico AHAS. Como descrito no Exemplo 2, é contemplado que as linhagens IMINTA 1, 4, e 5 contêm uma mutação em apenas um alelo AHAS. Portanto, a presente invenção inclui uma planta de arroz compreendendo pelo menos uma variante de ácido nucléico AHAS em adição a um ou mais ácidos nucléicos AHAS de tipo selvagem.

Em adição às plantas de arroz, a presente invenção inclui proteínas AHAS isoladas e ácidos nucléicos isolados que preferivelmente conferem tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com os ácidos nucléico e proteínas AHAS de tipo selvagem. Preferivelmente, os ácidos nucléicos AHAS isolados codificam uma proteína possuindo uma mutação de alanina por treonina. Preferivelmente, a mutação de alanina por treonina está localizada em um resíduo de aminoácido correspondendo à posição 96 da SEQ ID NO: 12. Em uma modalidade, o ácido nucléico isolado compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo de um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 1; um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 3; um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 5; um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 11; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 2; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 4; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 6; um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo como definido na SEQ ID NO: 12; um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos mencionados acima; e um polinucleotídeo complementar a qualquer um dos polinucleotídeos mencionados acima. Em uma modalidade preferida o ácido nucléico AHAS isolado compreende uma seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11.

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O termo proteína AHAS ou polipeptídeo AHAS refere-se a uma proteína acetóxi-hidróxi-ácido-sintase, e os termos proteína AHAS variante ou variante de polipeptídeo AHAS referem-se a qualquer proteína AHAS que é mutada de uma proteína AHAS de tipo selvagem e que confere tolerância aumentada à imidazolinona a uma planta, célula de planta, parte de planta, semente de planta, ou tecido de planta quando expressada na mesma.

Em uma modalidade preferida, a proteína AHAS variante compreende um polipeptídeo codificado por uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade preferida, a proteína _y10 AHAS variante compreende um polipeptídeo codificado por uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade preferida, a proteína AHAS variante compreende um polipeptídeo codificado por uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 5. Ainda em outra modalidade preferida, a proteína AHAS variante compreende um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO:

6.

Como aqui usados, os termos ácido nucléico e polinucleotídeo referem-se a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de fita única ou dupla, ou um seu híbrido. O termo também inclui híbridos

RNA/DNA. Estes termos também incluem seqüência não traduzida localizada em ambas as extremidades 3' e 5' da região codificadora do gene: pelo menos cerca de 1.000 nucleotídeos da seqüência a montante da extremidade 5' da região codificadora e pelo menos cerca de 200 nucleotídeos da seqüência a jusante da extremidade 3' da região codificadora do gene. Bases menos comuns, tais como inosina, 5-metil-citosina, 6-metil-adenina, hipoxantina e outras também podem ser utilizadas para anti-senso, dsRNA e pareamento de ribozima. Por exemplo, tem sido mostrado que polinucleotídeos que contêm análogos de propina C-5 de uridina e citidina se ligam em RNA com afinidade alta e são inibidores de anti-senso potentes da expressão de gene.

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Também podem ser realizadas outras modificações, tal como modificação na estrutura de sustentação de fosfo-diéster, ou na 2'-hidroxila no grupo açúcar ribose do RNA. Os polinucleotídeos de anti-senso e as ribozimas podem consistir inteiramente de ribonucleotídeos, ou podem conter desoxirribonucleosídeos e ribonucleotídeos misturados. Os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por qualquer meio, incluindo preparações genômicas, preparações de cDNA, síntese in vitro, RT-PCR e transcrição in vitro ou in vivo.

Uma molécula de ácido nucléico isolada é uma que está substancialmente separada de outras moléculas de ácido nucléico, que estão presentes na fonte natural do ácido nucléico (i.e., seqüências codificadoras de outros polipeptídeos). Preferivelmente, um ácido nucléico isolado está livre de algumas das seqüências que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (i.e., seqüências localizadas nas extremidades 3' e 5' do ácido nucléico) em seu replicon naturalmente ocorrente. Por exemplo, um ácido nucléico clonado é considerado isolado. Em várias modalidades, a molécula de ácido nucléico AHAS isolada pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb on 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula do qual o ácido nucléico é derivado (por exemplo, uma célula de O. sativa). Um ácido nucléico também é considerado isolado se tiver sido alterado por intervenção humana, ou deixado em um locus ou uma localização que não é seu sítio natural, ou se for introduzido em uma célula por agroinfecção, biolística, ou qualquer outro método de transformação de planta. Ainda mais, uma molécula de ácido nucléico isolada, tal como uma molécula de cDNA, pode estar livre de algum outro material celular com o qual está naturalmente associada, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou precursores químicos ou outros compostos químicos quando quimicamente sintetizado.

Estão especificamente excluídos da definição de ácidos nucleicos isolados: cromossomos naturalmente ocorrentes (tais como cromossomos aleatoriamente dispersados), bibliotecas de cromossomos artificiais, bibliotecas genômicas, e bibliotecas de cDNA que existem quer como uma preparação de ácido nucléico in vitro ou como uma preparação de célula hospedeira transfectada/transformada, na qual as células hospedeiras quer são uma preparação heteróloga in vitro quer estão plaqueadas como uma população heterogênea de colônias individuais. Também estão especificamente excluídas as bibliotecas acima nas quais um ácido nucléico específico compõe até menos do que 5% do número de insertos de ácido nucléico nas moléculas de vetor. Estão adicionalmente especificamente excluídas as preparações de RNA de célula inteira ou de DNA genômico (incluindo preparações de célula inteira que são mecanicamente cisalhadas on enzimaticamente digeridas). Estão mais adicionalmente especificamente excluídas as preparações de célula inteira encontradas quer em uma preparação in vitro quer como uma mistura heterogênea separada por eletroforese na qual o ácido nucléico da invenção não tem sido adicionalmente separado dos ácidos nucleicos heterólogos no meio de eletroforese (por exemplo, separação adicional por excisão de uma banda única de uma população de bandas heterogêneas em um gel de agarose ou em blot de náilon).

Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 ou uma sua porção, pode ser isolada usando técnicas de biologia molecular padrão e a informação de seqüência aqui proporcionada. Por exemplo, um O. sativa AHAS cDNA pode ser isolado de uma biblioteca de O. sativa usando toda ou uma porção da seqüência de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11. Ainda mais, uma molécula de ácido nucléico ··· · · · ··· * · ··· ζ, ι · · · · · · ·· · · · ·· ·

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• · · · · ··· · · ·· · · • »·» · · · · · · · incluindo toda ou uma porção de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 pode ser isolada por reação em cadeia de polimerase usando iniciadores de oligonucleotídeo planejados baseados nesta seqüência. Por exemplo, mRNA pode ser isolado de células de planta (por exemplo, por exemplo pelo procedimento de extração em tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294-5299), e cDNA pode ser preparado usando transcriptase reversa (por exemplo, transcriptase reversa Moloney MLV, disponível na Gibco;BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase reversa ANOVA monovariada, disponível na Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para amplificação por reação em cadeia de polimerase podem ser planejados baseando-se na seqüência de nucleotídeos mostrada nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11. Uma molécula de ácido nucléico da invenção pode ser amplificada usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo de iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com as técnicas de amplificação por PCR padrão. A molécula de ácido nucléico assim amplificada pode ser clonada em um vetor apropriado e caracterizada por análise de seqüência de DNA. Ainda mais, oligonucleotídeos correspondendo a uma seqüência de nucleotídeos AHAS podem ser preparados por técnicas de síntese padrão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automático.

Os ácidos nucleicos AHAS da presente invenção podem compreender seqüências codificadoras de uma proteína AHAS (i.e., regiões codificadoras), bem como seqüências não traduzidas 5' e seqüências não traduzidas 3'. Alternativamente, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem compreender apenas as regiões codificadoras de um gene AHAS, ou podem conter fragmentos genômicos inteiros isolados do DNA genômico. Uma região codificadora destas seqüências é indicada como uma posição de ORE. Ainda mais, a molécula de ácido nucléico da invenção

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pode compreender uma porção de uma região codifícadora de um gene AHAS, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou um iniciador. As seqüências de nucleotídeos determinadas da clonagem de genes AHAS de O. sativa permitem a geração de sondas e iniciadores planejados para uso na identificação e/ou clonagem de homólogos de AHAS em outros tipos de célula ou organismos, bem como homólogos de AHAS de outras plantas de arroz e espécies relacionadas. A porção da região codifícadora também pode codificar um fragmento biologicamente ativo de uma proteína AHAS.

Como aqui usado, o termo porção biologicamente ativa de uma proteína AHAS é intencionado para incluir uma porção, por exemplo, um domínio/motivo, de uma proteína AHAS que, quando produzida em uma planta aumenta a tolerância da planta a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta. Métodos para quantificar a tolerância aumentada aos herbicidas de imidazolinona são proporcionados nos Exemplos abaixo. Porções biologicamente ativas de uma proteína AHAS incluem peptídeos derivados de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 12 que incluem menos aminoácidos do que uma proteína AHAD de comprimento total e conferem tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona sob expressão em uma planta. Tipicamente, porções biologicamente ativas (por exemplo, peptídeos que são, por exemplo, de 5, 19, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, ou mais aminoácidos em comprimento) compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de uma proteína AHAS. Ainda mais, outras porções biologicamente ativas nas quais outras regiões do polipeptídeo estão deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais atividades aqui descritas. Preferivelmente, as porções biologicamente ativas de uma proteína AHAS incluem um ou mais domínios conservados selecionados do grupo consistindo de um Domínio A, um Domínio B, um

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Domínio C, um Domínio D e um Domínio E, nas quais o domínio conservado contém uma mutação.

A invenção também proporciona polipeptídeos de fusão ou quiméricos AHAS. Como aqui usado, um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo quimérico AHAS compreende um polipeptídeo AHAS operativamente ligado em um polipeptídeo não-AHAS. Um polipeptídeo não-AHAS refere-se a um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos que não é substancialmente idêntica a um polipeptídeo AHAS, por exemplo, um polipeptídeo que não é uma isoenzima AHAS, cujo peptídeo desempenha uma função diferente da de um polipeptídeo AHAS. Como aqui usado com respeito ao polipeptídeo de fusão, o termo operativamente ligado é intencionado para indicar que o polipeptídeo AHAS e o polipeptídeo nãoAHAS são fusionados um no outro de modo que. amas as seqüências desempenhem a função proposta atribuída à seqüência usada. O polipeptídeo não-AHAS pode estar fusionado na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo AHAS. Por exemplo, em uma modalidade, o polipeptídeo de fusão é um polipeptídeo de fusão GST-AHAS no qual a seqüência AHAS está fusionada na terminação C da seqüência GST. Tais polipeptídeos de fusão podem facilitar a purificação de polipeptídeos AHAS recombinantes. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão é um polipeptídeo AHAS contendo uma seqüência de sinal heteróloga em sua terminação N. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamífero), expressão e/ou secreção de um polipeptídeo AHAS pode ser aumentada pelo uso de uma seqüência de sinal heteróloga.

Uma molécula de ácido nucléico isolada codificadora de um polipeptídeo AHAS possuindo uma certa percentagem de identidade de seqüência a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 12 pode ser formada pela introdução de uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeo em uma seqüência de

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9 9 9 9 « nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11 de tal modo que uma ou mais substituições, adições, ou deleções de aminoácido sejam introduzidas no polipeptídeo codificado. Mutações podem ser introduzidas em uma seqüência de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11 por técnicas padrão, tal como mutagênese sítiodirecionada e mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente, as substituições de aminoácido conservativo são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não-essencial.

Uma substituição de aminoácido conservativa é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácido possuindo cadeias laterais semelhantes têm sido definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil-alanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo tirosina, fenil-alanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não-essencial predito em um polipeptídeo AHAS é preferivelmente substituído por outro resíduo de aminoácido de mesma família de cadeia lateral. Altemativamente, em outra modalidade, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou de parte de uma seqüência codificadora AHAS , tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser triados para uma atividade de AHAS aqui descrita para identificar mutantes que retêm a atividade de AHAS. Após a mutagênese da seqüência de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 11, o polipeptídeo codificado pode ser expressado

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recombinantemente e a atividade do polipeptídeo pode ser determinada por análise da tolerância à imidazolinona de uma planta expressando o polipeptídeo como descrito no Exemplo abaixo.

Para determinar a percentagem de identidade de seqüência de duas seqüências de aminoácidos, as seqüências são alinhadas para propósitos de comparação ótima (por exemplo, hiatos podem ser introduzidos na seqüência de um polipeptídeo para alinhamento ótimo com o outro polipeptídeo). Os resíduos de aminoácido em posições de aminoácido correspondentes são então comparados. Quando uma posição em uma seqüência estiver ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido como a posição correspondente na outra seqüência, então as moléculas serão idênticas naquela posição. O mesmo tipo de comparação pode ser feito entre duas seqüências de ácido nucleico. A percentagem de identidade de seqüência entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (i.e., a percentagem de identidade de seqüência = número de posições idênticas / número total de posições x 100). Para os propósitos da invenção, a percentagem de identidade de seqüência entre duas seqüências de polipeptídeo ou de ácido nucleico é determinada usando o pacote de programas de computador Vector NTI 6.0 (PC) (InfoMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Uma penalidade de abertura de hiato de 15 e uma penalidade de extensão de hiato de 6,66 são usadas para determinar a percentagem de identidade de dois ácidos nucleicos. Uma penalidade de abertura de hiato de 10 e uma penalidade de extensão de hiato de 0,1 são usadas para determinar a percentagem de identidade de dois polipeptídeos. Todos os outros parâmetros são ajustados nos ajustes predeterminados.

E para ser entendido que para os propósitos de determinação da identidade de seqüência, quando se compara uma seqüência de DNA com uma seqüência de RNA, um nucleotídeo timidina é equivalente a um nucleotídeo uracila. Preferivelmente, os polipeptídeos AHAS isolados

• · · · · · · · • · · · · · • · · · · · · · · · ββ β · β ··· * · · · · · s s β β S S S · · · · . SSS · · ··· · · · · · · · incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos 60-70%, e com maior preferência pelo menos 7075%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos a uma seqüência de aminoácidos inteira mostrada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:

6, ou SEQ ID NO: 12. Em outra modalidade, os polipeptídeos AHAS isolados incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos 60-70%, e com maior preferência pelo menos 7075%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ou 90-95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos a uma seqüência de aminoácidos inteira mostrada na SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:

6, ou SEQIDNO: 12.

Adicionalmente, ácidos nucléicos AHAS otimizados podem ser formados. Preferivelmente, um ácido nucleico AHAS otimizado codifica um polipeptídeo AHAS que modula uma tolerância da planta aos herbicidas de imidazolinona, e com maior preferência aumenta uma tolerância da planta a um herbicida de imidazolinona sob sua expressão na planta. Como aqui usado, otimizado refere-se a um ácido nucleico que está geneticamente engenheirado para aumentar sua expressão em uma dada planta ou em um dado animal. Para proporcionar ácidos nucléicos AHAS otimizados, a seqüência de DNA do gene pode ser modificada para 1) compreender códons preferidos pelos genes de planta elevadamente expressados; 2) compreender um conteúdo de A+T em composição de base de nucleotídeo igual àquele substancialmente encontrado nas plantas; 3) formar uma seqüência de iniciação de planta, 4) eliminar as seqüências que causam desestabilização, poliadenilação inapropriada, degradação e terminação de RNA, ou que formam grampos de cabelo de estrutura secundária ou sítios de editoração de RNA. Expressão aumentada de ácidos nucléicos AHAS em plantas pode ser realizada pela utilização de freqüência de distribuição de uso de códon em

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plantas em geral ou em uma planta específica. Métodos para otimizar a expressão de ácido nucléico em plantas podem ser encontrados em EPA 0359472; EPA0385962; Pedido PCT no. WO 91/16432; Patente US 5.380.831; Patente US 5.436.391; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88? 3324-3328; e Murray et al., Nucleic Acids Res. 17: 477-498.

Como aqui usada, freqüência de uso de códon preferido refere-se à preferência exibida por uma célula hospedeira específica no uso de códons de nucleotídeo para especificar um dado aminoácido. Para determinar a freqüência de uso de um códon específico em um gene, o número de ocorrências daquele códon no gene é dividido pelo número total de ocorrências de todos os códons especificando o mesmo aminoácido no gene. Semelhantemente, a freqüência de uso de códon preferido exibida por uma célula hospedeira pode ser calculada pela determinação da freqüência média de uso de códon em um número grande de genes expressados pela célula hospedeira. É preferível que esta análise seja limitada aos genes que são elevadamente expressados pela célula hospedeira. O desvio percentual da freqüência de uso de códon preferido para um gene sintético daquela empregada por uma célula hospedeira é calculado primeiro pela determinação do desvio percentual da freqüência de uso de um único códon daquela da célula hospedeira seguida pela obtenção do desvio médio sobre todos os códons. Como aqui definido, este cálculo inclui códons únicos (i.e., ATG e TGG). Em termos gerais, o desvio médio total de uso de códon de um gene otimizado daquele de uma célula hospedeira é calculado usando a equação 1A = η = 1 Z X_n-Y_nX_n vezes 100 Z na qual X_n = freqüência de uso para códon n na célula hospedeira; Y_n = freqüência de uso para códon n no gene sintético, n representa um códon individual que especifica um aminoácido e o número total de códons é Z. O desvio total da freqüência de uso de códon, A, para todos os aminoácidos deve ser preferivelmente menor do que cerca de 25%, e com maior preferência menor do que 10%.

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Portanto, um ácido nucléico AHAS pode ser otimizado de tal modo que sua frequência de distribuição de uso de códon desvie, preferivelmente, em não mais de 25% daquela de genes de planta elevadamente expressados e, com maior preferência, não mais do que 10%. Em adição, consideração é dada ao conteúdo percentual de G+C da terceira base degenerada (monocotiledôneas parecem favorecer G+C nesta posição, enquanto que dicotiledôneas não). Também é reconhecido que o nucleotídeo XCG (no qual X é A, T, C, ou G) é o códon menos preferido em dicotiledôneas enquanto que o códon XTA está destituído em ambas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Ácidos nucleicos AHAS otimizados desta invenção também possuem preferivelmente índices para evitar dubletes CG e AT muito próximos daqueles da planta hospedeira escolhida (i.e. Oryza sativa). Mais preferivelmente estes índices se desviam daquele do hospedeiro em não mais do que cerca de 10-15%.

Em adição às moléculas de ácido nucléico codificadoras de polipeptídeos AHAS descritas acima, outro aspecto da invenção refere-se às moléculas de ácido nucléico isoladas que são de anti-senso em relação às mesmas. É considerado que os polinucleotídeos de anti-senso inibem a expressão de gene de um polinucleotídeo alvo pela ligação específica do polinucleotídeo alvo e pela interferência com a transcrição, a editoração, o transporte, a tradução e/ou a estabilidade do polinucleotídeo alvo. Métodos são descritos na arte anterior para selecionar o polinucleotídeo de anti-senso para o DNA cromossômíco, para um transcrito de RNA primário ou para um mRNA processado. Preferivelmente, as regiões alvo incluem sítios de editoração, códons de iniciação de tradução, códons de terminação de tradução, e outras seqüências dentro da matriz de leitura aberta.

O termo anti-senso, para os propósitos da invenção, refere-se a um ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo que é suficientemente complementar a todo ou a uma porção de um gene, transcrito

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primário, ou mRNA processado, de modo a interferir com a expressão do gene endógeno. Polinucleotídeos complementares são aqueles que são capazes de parear bases de acordo com as regras de complementaridade de Watson-Crick padrão. Especificamente, purinas parear-se-ão com bases pirimidinas para formar uma combinação de guanina pareada com citocina (G:C) e adenina parear-se-á com timidina (A:T) no caso de DNA, ou adenina parear-se-á com uracila (A:U) no caso de RNA. E entendido que dois polinucleotídeos podem hibridizar entre si até mesmo se não forem completamente complementares entre si, desde que cada um possua pelo menos uma região que seja substancialmente complementar ao outro. O termo ácido nucléico de anti-senso inclui cassetes de expressão de RNA de fita única bem como de DNA de fita dupla que podem ser transcritos para produzir um RNA de anti-senso. Ácidos nucleicos de anti-senso ativos são moléculas de RNA de anti-senso que são capazes de seletivamente hibridizar com um mRNA ou transcrito primário codificador de um polipeptídeo possuindo pelo menos 80% de identidade de seqüência com a seqüência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 12.

Em adição aos polipeptídios e ácidos nucleicos AHAS descritos acima, a presente invenção inclui estes polipeptídeos e ácidos nucleicos ligados em um grupo. Estes grupos incluem, mas não são limitados a, grupos de detecção, grupos de hibridização, grupos de purificação, grupos de entrega, grupos de reação, grupos de ligação, e semelhantes. Um grupo típico de ácidos nucleicos possuindo grupos ligados são sondas e iniciadores. Sondas e iniciadores tipicamente compreendem um oligonucleotídeo substancialmente isolados. Os oligonucleotídeos tipicamente compreendem uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes em pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca de 25, com maior preferência cerca de 40, 50, ou 75 nucleotídeos consecutivos de uma • Μ · · · 0 09 Ο

fita de senso da seqüência mostrada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11, uma seqüência de anti-senso das seqüências descritas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11, ou seus mutantes naturalmente ocorrentes. Iniciadores baseados em uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11 podem ser usados nas reações PCR para clonar homólogos de AHAS. Sondas baseadas em seqüências de nucleotídeos AHAS podem ser utilizadas para detectar transcritos ou seqüências genômicas codificadoras de polipeptídeos iguais ou homólogos. Em modalidades preferidas, a sonda compreende adicionalmente um grupo marcador ligado na mesma, por exemplo o grupo marcador pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, uma co-fator de enzima. Tais sondas podem ser usadas como uma parte de um kit de teste de marcador genômico para identificar células que expressam um polipeptídeo AHAS, tal como pela medição de um nível de um ácido nucléico codificador de AHAS, em uma amostra de células, por exemplo, detecção de níveis de AHAS mRNA ou determinação de se um gene AHAS genômico tem estado mutado ou deletado.

A invenção proporciona adicionalmente um vetor de expressão recombinante isolado compreendendo um ácido nucléico AHAS como descrito acima, no qual a expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta em tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da célula hospedeira. Como aqui usado, o termo vetor refere-se a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico no qual tem estado ligada. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem estar ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, no qual segmentos de DNA adicionais podem estar ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma · · β β · • 9 9 9 9 9

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célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero nãoepissomais) são integrados no genoma de uma célula hospedeira sob introdução em uma célula hospedeira, e deste modo são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Ainda mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes no qual estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como vetores de expressão. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, plasmídeo e vetor podem ser usados intercambiavelmente visto que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada. Contudo, a invenção é intencionada para incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus deficientes em replicação, adenovírus, e vírus adeno-associados), que servem com funções equivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção na forma adequada para expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências regulatórias, selecionadas baseando-se nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, que estão operativamente ligadas na seqüência de ácido nucléico a ser expressada. Com respeito a um vetor de expressão recombinante, operativamente ligado é intencionado para significar que a seqüência de nucleotídeos de interesse está ligada na(s) seqüência(s) regulatória(s) em uma maneira que permite a expressão da seqüência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor for introduzido na célula hospedeira). O termo seqüência regulatória é intencionado para incluir promotores, intensificadores, e outros elementos controladores de expressão ♦ ·· I • β «3 (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick e Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluindo as referência lá citadas. Seqüências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas de dirigem a expressão da seqüência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras ou sob outras condições. Será reconhecido por aquelas pessoas experientes na arte que o planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão do polipeptídeo desejado etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para deste modo produzirem 15 polipeptídeos ou peptídeos, incluindo peptídeos ou polipeptídeos de fusão, codificados pelos ácidos nucleicos como aqui descrito (por exemplo, polipeptídeos AHAS, polipeptídeos de fusão, etc.).

Em uma modalidade preferida da presente invenção, os j polipeptídeos AHAS são expressados em plantas e células de planta tais como 20 células de planta unicelular (tais como algas) (veja Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 e referências lá citadas) e células de planta de plantas superiores (por exemplo, espermatófitos, tais como plantas de cultura). Um polinucleotideo AHAS pode ser introduzido em uma célula de planta por qualquer meio, incluindo transfecção, transformação ou 25 transdução, eletroporação, bombardeio de partículas, agroinfecção, biolística e semelhantes.

Métodos adequados para a transformação ou a transfecção de células hospedeiras incluindo células de planta podem ser encontrados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold

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Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e em outros manuais de laboratório tais como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Visto que a tolerância aumentada aos herbicidas de imidazolinona é uma feição geral desejada a ser herdada em uma ampla variedade de plantas como milho, trigo, centeio, aveia, trigo, centeio, aveia triticale, arroz, cevada, feijão-soja, amendoim, algodão, colza e canola, euforbiácea Manihot, pimenta, girassol e tagete, plantas solanáceas como batata, tabaco, berinjela, e tomate, espécie Vicia, ervilha, alfafa, plantas de arbusto (café, cacau, chá), espécie, árvores (palma, coqueiro), gramíneas perenes e culturas de forragem, estas plantas de cultura também são plantas alvo preferidas para uma engenharia genética como uma outra modalidade da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a planta é uma planta de arroz. Culturas de forragem incluem, mas não são limitadas a, grama-deponta, alpiste, capim cevadinha, gramínea de centeio selvagem, capim-docampo, capim de pomar, alfafa, salfoin, trevo pé-de-ave, trevo branco, trevo vermelho, e trevo-de-cheiro.

Em uma modalidade da presente invenção, a transfecção de um polinucleotídeo AHAS em uma planta é realizada por transferência de gene mediada por Agrobacterium. Um método de transfecção conhecido por aquelas pessoas experientes na arte é a imersão de uma planta florescendo em uma solução de Agrobacterium, na qual as agrobactérias contêm o ácido nucléico AHAS, seguida pela procriação dos gametas transformados. A transformação de planta mediada por Agrobacterium pode ser realizada usando, por exemplo, a cepa GV3101(pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) ou LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. Transformação pode ser realizada por técnicas de transformação e regeneração padrão (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Galvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology

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Manual, 2 Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995, - em Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-79232731-4; Glick, Bemard R. e Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por exemplo, colza pode ser transformada via transformação de cotilédone ou de hipocótilo (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8;238-242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91:694-701). Uso de antibióticos para Agrobacterium e seleção de planta depende do vetor binário e da cepa de Agrobacterium utilizada para transformação. Seleção de colza é normalmente realizada usando canamicina como um marcador de planta selecionável. Transferência de gene mediada por Agrobacterium em linho pode ser realizada usando, por exemplo, uma técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, transformação de feijão-soja pode ser realizada utilizando por exemplo, uma técnica descrita em Patente Européia No. 0.424.047, Patente US 5.322.783, Patente Européia No. 0.397.687, Patente US 5.376.543, ou Patente US 5.169.770. Transformação de milho pode ser realizada por bombardeio de partículas, captação de DNA mediada por poli(etileno-glicol) ou via a técnica de fibra de carbeto de silício. (Veja, por exemplo, Freeling e Walbot The maize handbook Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específico de transformação de milho é encontrado na Patente US 5.990.387, e um exemplo específico de transformação de trigo pode ser encontrado em Pedido PCT No. WO 93/07256.

De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo AHAS introduzido pode ser mantido estavelmente na célula de planta se estiver incorporado em um replicon autônomo não-cromossômico ou integrado nos cromossomos da planta. Altemativamente, o polinucleotídeo AHAS introduzido pode ser representado em um vetor de não-replicação nãocromossômico e ser transi entemente expressado ou transientemente ativo. Em · · · * · ·


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« 999 · · 999 9 99 999 9 uma modalidade, um microorganismo recombinante homólogo pode ser formado no qual o polinucleotídeo AHAS está integrado em um cromossomo, um vetor é preparado o qual contém pelo menos uma porção de um gene AHAS na qual uma deleção, adição ou substituição tem sido introduzida para deste modo alterar, por exemplo, interromper a funcionalidade, do gene AHAS endógeno e formar um gene AHAS. Para preparar uma mutação pontual via recombinação homóloga, híbridos de DNA-RNA podem ser usados em uma técnica conhecida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 e Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3)240-247). Outros procedimentos de recombinação homóloga em espécies Oryza também são bem conhecidos na arte e são aqui contemplados para uso.

No vetor de recombinação homóloga, o gene AHAS pode estar flanqueado em suas extremidades 3' e 5' por uma molécula de ácido nucleico adicional do gene AHAS para permitir a ocorrência da recombinação homóloga entre o gene AHAS exógeno realizada pelo vetor e um gene AHAS endógeno, em um microorganismo ou uma planta. A molécula de ácido nucleico AHAS flanqueadora adicional é de comprimento suficiente para recombinação homóloga bem sucedida com o gene endógeno. Tipicamente, várias centenas de pares de base até quilobases de DNA flanqueador (em ambas as extremidades 3' e 5') estão incluídas no vetor (veja, por exemplo, Thomas, K. FL, e Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503 para uma descrição de vetores de recombinação homóloga ou Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8):43684373 para recombinação baseada em cDNA em Physcomitrella patens). Contudo, visto que o gene AHAS normalmente difere do gene AHAS em muitos poucos aminoácidos, uma seqüência flanqueadora nem sempre é necessária. O vetor de recombinação homóloga é introduzido em um microorganismo ou em uma célula de planta (por exemplo, via DNA mediado por poli(etileno-glicol)), e as células nas quais o gene AHAS introduzido tem

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sido homologamente recombinado com o gene AHAS endógeno são selecionada usando técnicas conhecidas na arte.

Em outra modalidade, microorganismos recombinantes podem ser produzidos os quais contêm sistemas selecionados que permitem a expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão de um gene AHAS em um vetor colocando-o sob o controle de operon lac permite a expressão do gene AHAS apenas na presença de IPTG. Tais sistemas regulatórios são bem conhecidos na arte.

Esteja presente em um vetor de não-replicação extracromossômico ou em um vetor que está integrado em um cromossomo, o polinucleotídeo AHAS preferivelmente reside em um cassete de expressão em planta. Um cassete de expressão em planta preferivelmente contém seqüências regulatórias capazes de dirigir a expressão de gene em células de planta que estão operativamente ligadas de modo que cada seqüência possa desempenhar sua função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Os sinais de poliadenilação preferidos são aqueles originários de tDNA de Agrobacterium tumefaciens tal como o gene 3 conhecido como octopina-sintase do plasmídeo-Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) ou seus equivalente funcionais, mas também todos ao terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Como a expressão de gene em planta muitas vezes não está limitada aos níveis de transcrição, um cassete de expressão em planta preferivelmente contém outras seqüências operativamente ligadas como intensificadores de tradução tal como a seqüência de atividade intensa contendo a seqüência líder nãotraduzida-5' do vírus do mosaico do tabaco intensificadora da razão de polipeptídeo para RNA (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15:86938711). Exemplos de vetores de expressão em planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. et a.i, 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol.

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20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; e Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Expressão de gene de planta deve estar operativamente ligada a um promotor apropriado conferindo expressão de gene em uma maneira conveniente, preferida para tipo de célula, ou preferida para tecido. Promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem qualquer promotor que seja capaz de iniciar a transcrição em uma célula de planta. Tais promotores incluem, mas não são limitados àqueles que podem ser obtidos de plantas, vírus de planta e bactérias que contêm gene que são expressados em plantas, tais como Agrobacterium e Rhizobium.

O promotor pode ser constitutivo, induzível, preferido para estágio de desenvolvimento, preferido para tipo de célula, preferido para tecido ou preferido para órgão. Os promotores constitutivos são ativos sob a maioria das condições. Exemplos de promotores constitutivos incluem os promotores CaMV 195 e 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812), o promotor sX CaMV 35S (Kay et al., 1987, Science 236:1299-1302) o promotor Sepl, o promotor actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171), o promotor actina de Arabidopsis, o promotor ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec. Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), o promotor 35S do vírus do mosaico de figwort (Scrophulariaceaé), o promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor cinamil-álcooldesidrogenase Patente US 5.683.439), promotores de T-DNA de Agrobacterium, tais como promotor manopina-sintase, nopalina-sintase, e octopina-sintase, um subunidade pequena de ribulose-bifosfato-carboxilase (ssuRUBISCO), e semelhantes.

Promotores induzíveis são ativos sob certas condições

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9 9 9 ambientais, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou metabólito, calor ou frio, luz, ataque de patógeno, condições anaeróbicas, e semelhantes. Por exemplo, o promotor hsp80 de Brassica é induzido por choque térmico; o promotor PPDK é induzido por luz; os promotor PR-1 de tabaco, Arabidopsis, e milho são induzíveis por infecção com um patógeno; e o promotor Adhl é l>

induzido por hipoxia e estresse de frio. Expressão de gene de planta também pode ser facilitada via um promotor induzível (para revisão, veja, Getz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Promotores quimicamente induzíveis serão especialmente adequados se for desejada a expressão de gene tempo-específica. Exemplos de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (Pedido PCT No. WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2:397-404) e um promotor induzível por etanol (Pedido PCT No. WO 93/21334).

Promotores preferidos para estágio de desenvolvimento são preferivelmente expressados em certos estágios de desenvolvimento. Promotores preferidos para tecido e órgão incluem aqueles que são preferivelmente expressados em certos tecidos e órgãos, tais como folhas, raízes, sementes, ou xilema. Exemplos de promotores preferidos para tecido e preferidos para órgão incluem, mas não são limitados a promotores preferidos para fruta, preferidos para óvulo, preferidos para tecido macho, preferidos para semente, preferidos para tegumento, preferidos para tubérculo, preferidos para caule, preferidos para pericarpo, e preferidos para folha, preferidos para estigma, preferidos para pólen, preferidos para antera, preferidos para pétala, preferidos para sépala, preferidos para pedicelo, preferidos para síliqua, preferidos para tronco, preferidos para raiz e semelhantes. Promotores preferidos para semente são preferivelmente expressados durante o desenvolvimento e/ou a germinação da semente. Por exemplo, promotores preferidos para semente podem ser preferidos para embrião, preferidos para endosperma e preferidos para casca de semente. Veja Thompson et al., 1989,

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BioEssays 10:108. Exemplos de promotores preferidos para semente incluem, mas não são limitados a, celulose-sintase (celA), Ciml, gama-zeína, globulina-1, zeína de 19 kD de milho (cZ19Bl) e semelhantes.

Outros promotores preferidos para tecido ou preferidos para órgão incluem o promotor de gene de napina de colza (Patente US 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3): 459-67), o promotor oleosina de Arabidopsis (Pedido PCT No. WO 98/45461), o promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente US 5.504.200), o promotor Bce-4 de Brassica (Pedido PCT No. WO 91/13980), ou o promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9) bem como os promotores conferidores de expressão específica em semente em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz etc. Promotores adequados a citar são promotor de gene Ipt2 ou Iptl de cevada (Pedido PCT No. WO 95/15380 e Pedido PCT No. WO 95/23230) ou aqueles descritos no Pedido PCT No. WO 99/16890 (promotores de gene hordeína de cevada, gene glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene promalina de arroz, gene gliadina de trigo, gene glutelina de trigo, gene glutelina de gato, gene casirina de sorgo, e gene secalina de centeio).

Outros promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem, mas não são limitados a, o promotor proteína maior clorofila a/b, promotores histona, promotor Ap3, promotor β-conglicina, promotor napina, promotor lecitina de feijão-soja, promotor zeína de 15 1<D de milho, promotor zeína de 22 kD de milho, promotor zeína de 27 kD de milho, promotor gzeína, promotor ceroso, shrunken 1, shrunken 2, e bronze, o promotor Zml3 (Patente US 5.086.169), os promotores polígalacturonase de milho (PG) (Patentes US 5.412.085, e 5.545.546), e o promotor SGB6 (Patente US 5.470.359), bem como outros promotores naturais ou sintéticos.

Flexibilidade adicional no controle de expressão de gene heterólogo em plantas pode ser obtida pelo uso de domínios de ligação de

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DNA e elementos de resposta de fontes heterólogas (i.e., domínios de ligação de DNA de fontes de não-planta). Um exemplo de um tal domínio de ligação de DNA heterólogo é o domínio de ligação de DNA LexA (Brent e Ptashne, 1985, Cell 43:729-736).

Outro aspecto da invenção refere-se às células hospedeiras nas quais um vetor de expressão recombínante da invenção tem estado introduzido. Os termos célula hospedeira e célula hospedeira recombínante são usados aqui intercambiavelmente. É entendido que tais termos não se referem apenas à célula individual específica mas também se aplicam à progênie ou progênie potencial de uma tal célula. Devido ao fato de que certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas decorrentes de mutação ou de influências ambientais, tal progênie, na verdade, pode não ser idêntica à célula parental, mas está ainda incluída dentro do escopo do termo como aqui usado. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polinucleotídeo AHAS pode ser expressado em células bacterianas tais como C. glutamicum, células de inseto, células de fungo, ou células de mamífero (tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS), algas, ciliados, células de planta, fungos ou outros organismos como C. glutamicum. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte.

Uma célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, pode ser usada para produzir (i.e., expressar) um polinucleotídeo AHAS. Conseqüentemente, a invenção proporciona adicionalmente métodos para produzir polipeptídeos AHAS usando as células hospedeiras da invenção. Em uma modalidade, o método compreende cultivar a célula hospedeira da invenção (na qual um vetor de expressão recombínante codificador de um polipeptídeo AHAS tem estado introduzido, ou em cujo genoma tem estado introduzido um gene codificador de um polipeptídeo AHAS ou de tipo selvagem) em um meio apropriado até que o polipeptídeo AHAS seja produzido. Em uma outra modalidade, o método compreende adicionalmente isolar os polipeptídeos AHAS do meio ou da célula hospedeira. Outro aspecto da invenção refere-se aos polipeptídeos AHAS isolados, e às suas porções biologicamente ativas.

Um polipeptídeo isolado ou purificado ou sua porção biologicamente ativa isolada ou purificada estará livre de algum material celular quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou de precursores químicos ou de outros compostos químicos quando sinteticamente sintetizado. A frase substancialmente livre de material celular inclui preparações de polipeptídeo AHAS nas quais o polipeptídeo é separado de alguns dos componentes celulares das células nas quais ele é natural ou recombinantemente produzido. Em uma modalidade, a frase substancialmente livre de material celular inclui preparações de um polipeptídeo AHAS possuindo menos do que cerca de 30% (em base seca) de material de não-AHAS (também aqui referido como um polipeptídeo contaminado), mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de material de não-AHAS, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de material de não-AHAS, e muito mais preferivelmente menos do que cerca de 5% de material de não-AHAS.

^w20 Quando o polipeptídeo AHAS, ou a sua porção biologicamente ativa, for recombinantemente produzido(a), ele(a) também estará substancialmente livre de meio de cultura, i.e., meio de cultura representa menos do que cerca de 20%, com maior preferência menos do que cerca de 10%, e mais preferivelmente menos do que cerca de 5% do volume da preparação de polipeptídeo. A frase substancialmente livre de precursores químicos ou de outros compostos químicos inclui preparações de polipeptídeo AHAS nas quais o polipeptídeo está separado dos precursores químicos ou de outros compostos químicos que estão envolvidos na síntese de polipeptídeo. Em uma modalidade, a frase substancialmente livre de

• 9 β · (· · · ··· • 9 9 · · 9 9 9·· 9

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9999 9 · · 9999 precursores químicos ou de outros compostos químicos inclui preparações de polipeptídeo AHAS possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou de compostos químicos de não-AHAS, com maior preferência menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou de compostos químicos de não-AHAS, ainda com maior preferência menos do que cerca de 10% de precursores químicos ou de compostos químicos de nãoAHAS, e mais preferivelmente menos do que cerca de 5% de precursores químicos ou de compostos químicos de não-AHAS. Em modalidades preferidas, os polipeptídeos isolados, ou suas porções biologicamente ativas, são faltantes de polipeptídeos contaminantes do mesmo organismo do qual o polipeptídeo AHAS é derivado. Tipicamente, tais polipeptídeos são produzidos por expressão recombinante de, por exemplo, um polipeptídeo AHAS de Oryza sativa em plantas diferentes de Oryza sativa ou microorganismos tais como C. glutamicum, ciliados, algas, ou fungos.

As seqüências de polipeptídeo e de polinucleotídeo AHAS da invenção possuem uma variedade de usos. As seqüências de ácido nucléico e de aminoácidos da presente invenção podem ser utilizadas para transformar plantas, modulando deste modo a tolerância da planta aos herbicidas de imidazolinona. Conseqüentemente, a invenção proporciona um método de produção de uma planta transgênica possuindo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona compreendendo: (a) transformar uma célula de planta com um ou mais vetores de expressão compreendendo um ou mais ácidos nucleicos AHAS variantes, e (b) gerar da célula de planta uma planta transgênica com uma tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta. Em uma modalidade, a variante de ácido nucléico AHAS codifica uma variante de polipeptídeo AHAS compreendendo uma mutação de alanina por treonina em comparação com um polipeptídeo AHAS de tipo selvagem.

A presente invenção inclui métodos de modificar uma

Φ4 • β 9 · · · · · · · · • · · · · 9 9 9 9 9 · ····· ···· · ····· · · ·· 9 · ·· · β · · · 9 · ₉ ··· 9 9 9·9 9 99 ··· 9 tolerância da planta a um herbicida de imidazolinona compreendendo modificar a expressão de um ou mais ácidos nucléicos AHAS variantes. A tolerância da planta ao herbicida de imidazolinona pode ser aumentada ou diminuída de acordo com o realizado pelo aumento ou pela diminuição da * 5 expressão de um polinucleotídeo AHAS, respectivamente. Preferivelmente, a tolerância da planta ao herbicida de imidazolinona é aumentada pelo aumento da expressão de um polinucleotídeo AHAS. Em outra modalidade, a variante de ácido nucleico AHAS codifica uma variante de polipeptídeo AHAS compreendendo uma mutação de alanina por treonina em comparação com

Λ 10 um polipeptídeo AHAS de tipo selvagem. Expressão de um polinucleotídeo AHAS pode ser modificada por qualquer método conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Os métodos de aumentar a expressão de polinucleotídeos AHAS podem ser usados nos quais a planta é quer transgênica quer não-transgênica. Nos casos quando a planta for transgênica, a planta poderá ser transformada com um vetor contendo qualquer um dos ácidos nucléicos codificadores de AHAS descritos acima, ou a planta poderá ser transformada por exemplo com um promotor que dirige a expressão de polinucleotídeos AHAS endógenos na planta. A invenção proporciona que um tal promotor seja específico para tecido ou regulado para desenvolvimento. ^w20 Altematívamente, plantas não-transgênicas podem ter expressão de polinucleotídeo AHAS endógeno modificada pela indução de um promotor nativo. A expressão de polinucleotídeos compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo como definida em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 11 em plantas alvo pode ser realizada por, mas não é limitada a, um dos seguintes exemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor quimicamente induzido, e (c) superexpressão de promotor engenheirado com por exemplo fatores de transcrição derivados de dedo de zinco (Greisman & Pabo, 1997, Science 275:657).

Em uma modalidade preferida, a transcrição de

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polinucleotídeo AHAS é modulada usando fatores de transcrição derivados de dedo de zinco (ZFPs) como descrito em Greisman & Pabo, 1997, Science 275:657 e manufaturados por Sangamo Biosciences, Inc. Estes ZFPs compreendem ambos um domínio de reconhecimento de DNA e um domínio funcional que causa ativação ou repressão de um ácido nucléico alvo tal como um ácido nucléico AHAS. Portanto, ativação ou repressão de ZFPs pode ser realizada de modo que reconheça especificamente os promotores de polinucleotídeo AHAS descritos acima e usada para aumentar ou diminuir a expressão de polinucleotídeo AHAS em uma planta, modulando deste modo a tolerância da planta ao herbicida.

Como descrito com mais detalhe acima, as plantas produzidas pelos métodos da presente invenção podem ser monocotiledôneas e dicotiledôneas. As plantas podem ser por exemplo selecionadas de milho, trigo, centeio, aveia, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, feijão-soja, amendoim, algodão, colza e canola, euforbiácea Manihot, pimenta, girassol e tagete, plantas solanáceas como batata, tabaco, berinjela, e tomate, espécie Vicia, ervilha, alfafa, café, cacau, chá, palma, coqueiro, gramíneas pereniais e culturas de forragem, estas plantas de cultura também são plantas alvo preferidas para uma engenharia genética como uma outra modalidade da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a planta é uma planta de arroz. Culturas de forragem incluem, mas não são limitadas a, grama-deponta, alpiste, capim cevadinha, gramínea de centeio selvagem, capim-docampo, capim de pomar, alfafa, salfoin, trevo pé-de-ave, trevo branco, trevo vermelho, e trevo-de-cheiro. Em cada um dos métodos descritos acima, a célula de planta inclui, mas não é limitada a, um protoplasto, uma célula produtora de gameta, e uma célula que se regenera em uma planta inteira. Como aqui usado, o termo transgênico refere-se a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta, ou parte de planta, que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, todo ou parte

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do polipeptídeo recombinante está estavelmente integrado em um cromossomo ou elemento extra-cromossômico estável, de modo que é passado a gerações sucessivas.

Cultura de tecido de vários tecidos de arrozes e regeneração de plantas dos mesmos são bem conhecidas e amplamente publicadas. Por exemplo, referência pode ser feita a Chu, Q. R., et al., (1999) Use of bridging parents with high anther culturability to improve plant regeneration and breeding value in rice, Rice Biotechnology Quarterly 38:25-26; Chu, Q. R., et al., (1998), A novel plant regeneration médium for rice anther culture of Southern US crosses, Rice Biotechnology Quarterly 35:15-16; Chu, Q. R., et al., (1997), A novel basal médium for embryogenic callus induction of Souther US crosses, Rice Biotechnology Quarterly 32:19-20; e Oono, K, Broadening the Genetic Variability By Tissue Culture Methods, ap. J. Breed. 33 (Suppl.2), 306-307, illus. 1983, cujas descrições são aqui incorporadas em sua totalidade como referências.

Como descrito acima, a presente invenção ensina composições e métodos para aumentar a tolerância à imidazolinona de uma planta ou semente de arroz em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta ou semente. Em uma modalidade preferida, a tolerância à imidazolinona de uma semente ou planta de arroz é aumentada de tal modo que a planta ou semente pode suportar uma aplicação de herbicida de imidazolinona preferivelmente de aproximadamente 10-400 gramas de ingrediente ativo por hectare, com maior preferência 20-160 gramas de ingrediente ativo por hectare, e mais preferivelmente 40-80 gramas de ingrediente ativo por hectare. Como aqui usado, suportar uma aplicação de herbicida de imidazolinona significa que a planta é quer não morta quer não lesionada por tal aplicação.

É aqui adicionalmente proporcionado um processo de controle de ervas daninhas dentro da vizinhança de uma planta de arroz, » * · ου

_C10

₉ 099 9> O 909 O 90 »· compreendendo aplicar um herbicida de imidazolinona nas ervas daninhas e na planta de arroz, no qual a planta de arroz possui uma tolerância aumentada ao herbicida de imidazolinona em comparação com uma variedade de tipo selvagem da planta de arroz, e no qual a planta tolerante à imidazolinona compreende pelo menos uma variante de ácido nucléico AHAS. Em uma modalidade, a variante de ácido nucléico AHAS codifica uma variante de polipeptídeo AHAS compreendendo uma mutação de alanina por treonina em comparação com um polipeptídeo AHAS de tipo selvagem. Preferivelmente, a mutação está em um resíduo de aminoácido correspondendo à posição 96 da seqüência mostrada na SEQ ID NO: 12. Pela provisão de plantas de arroz possuindo tolerância aumentada ao herbicida de imidazolinona, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger as plantas de arroz das ervas daninhas, de modo a aumentar o crescimento da cultura e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida de imidazolinona pode ser usado em si mesmo para controle de ervas daninhas de pré-emergência, de pós-emergência, de pré-plantio, e no plantio em áreas circundando as plantas de arroz aqui descritas ou pode ser utilizada uma formulação de herbicida de imidazolinona que contém outros aditivos. O herbicida de imidazolinona também pode ser empregado como um tratamento de semente. Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida de imidazolinona incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de pegajosidade, agentes estabilizadores, ou semelhantes. A formulação de herbicida de imidazolinona pode ser uma preparação seca ou úmida e pode incluir, mas não é limitada a, pós escoáveis, concentrados emulsificáveis e concentrados líquidos. O herbicida de imidazolinona e as formulações de herbicida podem ser aplicados de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por pulverização, irrigação, polvilhamento, ou semelhantes.

Em todo este relatório descritivo, várias publicações são referidas. As descrições de todas estas publicações e aquelas referências

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β» β 9 Μ» 9 9 9 9 9 ,» 9 9 9 9 «· #9999 · « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

4, « · · t« 9 β « « 9 · e · · 9 9 9 9 9 *9 ||« t- 9999 9 9 · 99*9 citadas naquelas publicações em suas totalidades são por meio desta incorporadas como referências neste pedido com o propósito de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.

Também deve ser entendido que a descrição acima refere-se às modalidades preferidas da presente invenção e que numerosas modificações podem ser feitas nas mesmas sem se desviarem do escopo da invenção. A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, que não são para serem entendidos em nenhuma maneira como impondo limitações sobre o escopo dos mesmos. Ao contrário, é para ser claramente entendido que se pode recorrer a várias outras modalidades, modificações, e equivalentes das mesmas, que, após a leitura da descrição aqui, podem se tomar sugestão para aquelas pessoas experientes na arte sem se desviarem do espírito da presente invenção e/ou do escopo das reivindicações apendidas.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Mutagênese e seleção de linhagens de arroz tolerantes à imidazolinona

Duas amostras de sementes (600 g cada) de cultivar de arroz IRGA 417 foram tratadas com uma solução aquosa de azida de sódio 0,001 M em pH 3 (tampão fosfato 0,067 M) para produzir semente Ml. Este tratamento foi aplicado por embebimento de cada amostra de semente em um Erlenmeyer de dois litros contendo um litro de solução de azida de sódio, sob agitação constante, por 18 horas, na temperatura ambiente. Após o tratamento, as sementes foram enxaguadas com água de torneira e, mais tarde, as sementes foram parcialmente secas-aeradas sobre folhas de papel absorvente com o propósito de extrair a umidade da superfície das sementes. Depois, as sementes tratadas foram diretamente semeadas em campo de formação do viveiro com sementeira e repicagem.

As sementes Ml foram plantadas no campo de formação do

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Φ °\°\ viveiro com sementeira e repicagem com um plantador de sementes experimental Wintersteiger em uma taxa de 50 plantas por metro quadrado. As linhagens checadas de uma variedade de tipo selvagem de IRGA 417 foram plantadas com plantador do tipo empurra. As linhagens foram crescidas sob condições de inundação até a maturidade (umidade do grão de 26%) e foram colhidas a granel. A semente (M2) colhida foi seca em um secador de correia transportadora por 14 horas a 45°C. As sementes M2 foram mantidas em armazenagem fechada até a estação seguinte.

A semente das plantas Ml (semente M2) foi plantada com um plantador de sementes experimental para áreas grandes (AVEC) em uma taxa de 50 kg/ha. Uma estimativa de 3 ha foi finalmente estabelecida compreendendo uma população de 6x10⁶ plantas. Linhagens checadas de uma variedade de tipo selvagem de IRGA 417 foram plantadas com um plantador do tipo empurra. A área inteira foi submetida a uma pressão de seleção com uma mistura de dois herbicidas de imidazolinona. Três aplicações separadas dos herbicidas de imidazolinona foram realizadas com um pulverizador comercial em direções diferentes para evitar qualquer escape e resultou em um tratamento de 3X. Um volume total de 222 L/ha foi pulverizado a 345 kPa, com bocais Teejests 8002, em cada aplicação de herbicidas de imidazolinona.

A taxa do tratamento IX foi uma mistura de Arsenal (Imazapir 75 g de ingrediente ativo / ha) e Cadre (Imazapic 24,85 g de ingrediente ativo / ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não-iônico (Citowet) em uma taxa de 0,25% (v/v). As aplicações foram realizadas no estágio de 4 folhas das plantas de arroz. Não foi registrada qualquer chuva durante os 7 dias após os tratamentos.

Observações foram feitas em tempos regulares para inspeção da área inteira. Após 90 dias, as plantas individuais sobreviventes foram marcadas e transplantados para a estufa para multiplicação assexuada e /(X) ίτ _Vl°

aumento de produção de semente. Um total de 10 plantas individuais foi crescido, e a semente foi colhida e seca em uma incubadora de sementes por 7 dias a 50°C. Nenhumas plantas das linhagens de checagem sobreviveram após o tratamento com herbicida.

Sementes das plantas M2 selecionadas foram plantadas em potes individuais sob condições de estufa. Um tratamento de 2X foi aplicado com um Pulverizador backpack R&D, dividido em duas aplicações de taxa de IX de Arsenal (Imazapir 75 g de ingrediente ativo / ha) e Cadre (Imazapic 24,85 g de ingrediente ativo / ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não-iônico (Citowet) em uma taxa de 0,25% (v/v). As plantas foram crescidas até a maturidade (umidade de grão de 26%) e colhidas manualmente. A semente colhida foi submetida a um tratamento de quebra de dormência de 7 dias a 50°C e preparada para um plantio em estação posterior na região norte.

Semente das populações de três plantas tolerantes selecionadas crescidas em estufa foi transplantada no campo em Las Palmas Chaco para aumento de sementes. As três populações identificadas como tolerantes aos herbicidas de imidazolinona foram chamadas de IMINTA 1, IMINTA 4 e IMINTA 5. Foram plantadas com um plantador de arroz comercial na taxa de 50 kg/ha. Um tratamento de herbicidas de imidazolinona de 2X, Arsenal (Imazapir 75 g de ingrediente ativo / ha) e Cadre (Imazapic 24,85 g de ingrediente ativo / ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não-iônico (Citowet) em uma taxa de 0,25% (v/v) foi aplicado no estágio de quatro a cinco folhas das plantas de arroz. Nenhuns sintomas fitotóxicos foram observados em qualquer uma das três populações. As três populações sobrepujaram em rendimento o lote de checagem tratado com um herbicida de gramínea regular. Não foram observados segregantes e foi produzida uma população elevadamente homogênea em qualquer um dos testes de tolerância e agronômicos.

Exemplo 2

Caracterização molecular de IMINTA i, IMINTA 4, e

IMINTA 5

DNA genômico foi extraído de folgas de plântulas crescidas em estufa de linhagens de arroz de tipo selvagem e variantes IMINTA 1,

IMINTA 4, e IMINTA 5 e o gene AHAS foi amplificado por PCR. O produto de PCR foi seqüenciado usando protocolos padrão. Análise de seqüência revelou uma única mudança de par de bases na região codificadora do gene AHAS que causou uma mudança de aminoácido de Alanina no aminoácido 96 na linhagem de tipo selvagem para Treonina nas linhagens mutantes. Esta mutação corresponde a uma mudança de aminoácido em Alanina 122 na seqüência de AHAS de Arabidopsis para Treonina 122. As seqüências de nucleotídeos AHAS para IMINTA 1, IMINTA 4, e IMINTA 5 são mostradas nas Figuras IA, C , e E, respectivamente como SEQ. ID. NOS: 1, 3, e 5; e as seqüências de aminoácidos AHAS deduzidas de IMINTA 1, IMINTA 4, e

IMINTA 5 são mostradas nas Figuras 1B, D , e F, respectivamente como SEQ. ID. NOS: 2, 4, e 6, respectivamente. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzida de AHAS de cepa IRGA 417 de arroz de tipo selvagem são mostradas nas Figuras IG e H, respectivamente, como SEQ. ID. NOS: 7 e

8. Alinhamentos das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos AHAS para ®20 IMINTA 1, IMINTA 4, e IMINTA 5 são mostradas na Figura 2 e na Figura 3, respectivamente. A seqüência de consenso de gene AHAS de arroz é mostrada como SEQ ID NO: 9, e a seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de consenso de gene AHAS de arroz é mostrada como SEQ ID NO: 10. O polimorfismo conferindo às linhagens IMINTA 1, IMINTA 4, e

IMINTA 5 tolerância à imidazolinona é indicado em negrito.

Um exemplo de cDNA de comprimento total de um ácido nucléico AHAS codificador de um polipeptídeo conferindo tolerância aos herbicidas de imidazolinona é mostrado como SEQ ID NO: 11, e a seqüência de aminoácidos deduzida da proteína codificada pelo gene AHAS é mostrada

»»

········ · · · · <

• · · β · ··· · · · · · ⁹ • · · · · · · · · ♦ · · * como SEQ ID NO: 12 na Figura 4.

Exemplo 3

Tolerância aos herbicidas AHAS proporcionada por

IMINTA 1

Um teste de campo foi realizado com a linhagem mutante IMINTA 1 e a linhagem IRGA 417, comparando o desempenho na presença e na ausência de tratamento com imidazolinona. O tratamento de IX com imidazolinona consistiu de Arsenal (Imazapir 75 g de ingrediente ativo / ha) e Cadre (Imazapic 24,85 g de ingrediente ativo / ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não-iônico (Citowet) em uma taxa de 0,25%. As variedades e os tratamentos foram realizados como indicado na Figura 5 em um planejamento de bloco aleatório com três replicações.

Os resultados do tratamento são mostrados na Figura 6. Não houve diferença estatística entre os tratamentos no número de plantas/m , mostrando assim que a aplicação de herbicida de 3X não teve efeito prejudicial. Linhagens de checagem suscetíveis semeadas ao longo dos lotes não sobreviveram ao tratamento com herbicida. O valor mais alto nos lotes de IMINTA 3 X após o tratamento poderiam ser devido à arrebentação radicular.

Rendimento de grãos e componentes de rendimento foram avaliados para se entender o efeito do tratamento sobre os diferentes estágios fisiológicos, e são mostrados nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Nenhumas diferenças estatísticas foram verificadas entre os tratamentos, embora valores absolutos mostrassem um desempenho melhor da IMINTA 1 3X. A análise dos componentes de rendimento mostrou uma número maior de panículas por metro quadrado e de espículas/panícula nos lotes de IMINTA 1 3X que têm determinado um rendimento maior do que o de outros tratamentos. Em adição, uma percentagem de espaço vazio elevada foi observada devido às temperaturas baixas antes e durante a floração. Os dias e as noites frias reduziram a germinação das sementes e foram o motivo de rendimentos • ··

médios baixos.

Embora não houvesse diferenças estatísticas entre os tratamentos, houve um valor de ganho de rendimento maior da IMINTA 1 3X. Como mencionado, mais panículas e espículas/panícula foram verificadas nestes lotes. Observações sobre outras linhagens tolerantes sob tratamentos de aplicação maiores mostraram arrebentação radicular mais alta e número de espículas/panícula mais elevado sugerindo um possível efeito dos herbicidas sobre o processo de diferenciação dos rebentos e das flores.

As variedades IMINTA 4 e IMINTA 5 também foram testadas ^>10 em campo na maneira igual àquela da variedade IMINTA 1. Foi verificado que o rendimento de grãos e os componentes de rendimento são comparáveis com os da variedade IMINTA 1.

Devido ao fato de a tolerância em IMINTA 1, IMINTA 4, e IMINTA 5 ser decorrente de uma mutação na enzima AHAS tomando-a tolerante à inibição pelos herbicidas de imidazolinona, a atividade in vitro de

AHAS extraída de plantas de tipo selvagem (não possuindo mutação para tolerância) é comparada com a atividade in vitro de AHAS extraída de plantas tolerantes na presença de concentrações variadas de um herbicida de imidazolinona.

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Claims

REIVINDICAÇÕES χ

1. Acido nucleico AHAS de arroz mutagenizado não transgênico em virtude de uma mutação randômica introduzida pela mutagênese não-espontânea, caracterizado pelo fato de que:

(i) o ácido nucleico compreende um polinucleotídeo selecionado dentre:

(a) sequências de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5;

(b) a sequência de polinucleotídeo da SEQ ID NO: 11;

(c) sequências de polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo a) ou b) acima, sendo que o ácido nucleico AHAS codifica um polipeptídeo AHAS de arroz que confere tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comparado a um polipeptídeo AHAS de arroz de tipo selvagem, e o ácido nucleico codifica dita substituição de alanina por treonina.

X
2. Acido nucleico AHAS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito ácido nucleico é ainda isolado ou tornado recombinante quando comparado ao de um polinucleotídeo de arroz de tipo selvagem.

X
3. Acido nucleico AHAS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo da SEQ ID NO:

1.

X
4. Ácido nucleico AHAS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo da SEQ ID NO:

3.

X
5. Ácido nucleico AHAS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo da SEQ ID NO:

5.
6. Polipeptídeo AHAS isolado, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem a sequência de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 12, sendo que o polipeptídeo confere tolerância aumentada ao herbicida de imidazolinona em comparação com um polipeptídeo AHAS de tipo selvagem.
7. Polipeptídeo AHAS de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 2.
8. Polipeptídeo AHAS de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 4.
9. Polipeptídeo AHAS de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 6.
10. Método de controle de ervas daninhas dentro da vizinhança de uma planta de arroz usando um herbicida de imidazolinona sem inibir o crescimento da planta de arroz, caracterizado pelo fato de que dito método compreende:

(a) fornecer uma planta de arroz ou semente compreendendo o ácido nucleico AHAS como definido na reivindicação 1, a expressão do polipeptídeo AHAS que confere para a tolerância da planta a um herbicida de imidazolinona;

(b) aplicar uma quantidade eficaz de um herbicida de imidazolinona:

(i) em um locus que contém dita planta ou dita semente, ou (ii) em um locus para plantação da dita planta ou semente, antes da plantação da dita planta ou semente de arroz;

(iii) à dita semente antes da plantação a dita semente;

a quantidade eficaz de herbicida de imidazolinona sendo capaz de inibir o crescimento de uma planta de arroz de tipo selvagem.

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