ES2316606T3

ES2316606T3 - Sensor optico que contiene particulas para la medicion in situ de analitos.

Info

Publication number: ES2316606T3
Application number: ES02764601T
Authority: ES
Inventors: Bo Petersson; Jesper Kristensen
Original assignee: Precisense AS
Current assignee: Precisense AS
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2022-06-27
Also published as: NO332247B1; NO20040098L; WO2003006992A1; GB0116853D0; EP1405075A1; JP4280629B2; EP1405075B1; CA2453430A1; US20040199062A1; DE60230758D1; CA2453430C; JP2004534255A; ATE420356T1; NZ530928A; US7228159B2; DK1405075T3

Abstract

Un sensor para la medición in vivo de un analito, que comprende una pluralidad de partículas no biodegradables con dimensión máxima inferior a 5 µm, de manera que, una vez implantado en el cuerpo de un mamífero, las partículas puedan ser ingeridas por macrófagos y transportadas lejos del sitio de implantación, conteniendo cada partícula los componentes de un análisis que presenta una lectura que consiste en una señal óptica detectable o medible transdérmicamente merced a medios ópticos externos, y estando contenida cada partícula en un gel biodegradable que impida su ingestión por parte de los macrófagos.

Description

Sensor óptico que contiene partículas para la medición in situ de analitos.

La presente invención se refiere a un sensor para uso en la medición o vigilancia de analitos en fluido corporal usando técnicas ópticas. El sensor es particularmente adecuado para uso en situaciones en las que tengan que vigilarse rigurosamente niveles de analito, por ejemplo, con medicamentos que tengan que mantenerse dentro de una ventana terapéutica estrecha, o en las que tengan que realizarse, repetidamente, mediciones de analitos, tales como en la gestión de la diabetes.

De acuerdo con la gestión de la diabetes, la medición regular de glucosa en la sangre es esencial con el fin de garantizar la dosificación de insulina correcta. Además, se ha demostrado que, durante la asistencia médica a largo plazo del paciente diabético, un control mejorado de los niveles de glucosa en sangre puede retardar, si no evitar, la aparición de retinopatía, problemas circulatorios y otras enfermedades degenerativas asociadas a menudo con la diabetes. Por tanto, existe la necesidad de una autovigilancia fiable y precisa de los niveles de glucosa en sangre por parte de pacientes diabéticos.

Actualmente, la glucosa en sangre es vigilada por los pacientes diabéticos mediante el uso de tiras de prueba colorimétricas o biosensores electroquímicos disponibles comercialmente (por ejemplo, electrodos enzimáticos), requiriendo ambos casos el uso regular de un instrumento a modo de lanceta para extraer una cantidad adecuada de sangre cada vez que se haga una medición. En general, la mayoría de pacientes diabéticos usan tales instrumentos para realizar una medición de glucosa en sangre dos veces al día. Pero el "US National Institute of Health" recomendaba recientemente que la prueba de glucosa en sangre debe realizarse, al menos, cuatro veces al día, una recomendación respaldada por la "American Diabetes Association". Este aumento de la frecuencia de la prueba de glucosa en sangre impone una carga considerable al paciente diabético, tanto en términos de coste financiero como en términos de dolor e incomodidad, particularmente, en el caso del diabético de largo plazo que tenga que hacer uso regular de una lanceta para extraer sangre de los dedos. Así, hay necesidad, claramente, de un sistema de vigilancia de glucosa a largo plazo mejor que no requiera extraer sangre del paciente.

Se han hecho distintas propuestas recientes de técnicas de medición de glucosa que no requieren que se extraiga sangre del paciente. Se han hecho varios intentos de construcción de dispositivos en los que se posiciona un biosensor de electrodo enzimático en el extremo de una aguja o catéter que se inserta en un vaso sanguíneo (Wilkins, E. and Atanasov, P., Medical Engineering and Physics, 1996, vol. 18, pág. 273-288). Mientras el dispositivo de detección es posicionado dentro de un vaso sanguíneo, la aguja o el catéter mantiene la conexión con el ambiente externo. En la práctica, tales dispositivos no son adecuados para uso con personas, en primer lugar, porque la inserción de una aguja o un catéter en un vaso sanguíneo supone un riesgo de infección y, además, resulta incómodo para el paciente, y, por tanto, no adecuado para uso continuo. En segundo lugar, los dispositivos de este tipo no han sido homologados para uso con pacientes, porque se ha sugerido que el propio dispositivo, en el extremo de una aguja o catéter, puede ser responsable de la dispersión de trombos en la circulación de un paciente. Obviamente, ello supone un riesgo muy serio para la salud de un paciente.

Los documentos de Mansouri y Schultz (Biotechnology, 1984), Meadows and Schultz (Analytica Chimica Acta, 1993, vol. 280, pág. 21-30) y la patente norteamericana nº 4.344.438 describen dispositivos para la vigilancia in situ de compuestos de bajo peso molecular en la sangre merced a medios ópticos. Estos dispositivos están destinados a ser insertados en un vaso sanguíneo o posicionados subcutáneamente, pero requieren conexión, por fibra óptica, con una fuente de luz externa y un detector externo. Igualmente, el posicionamiento de estos dispositivos en un vaso sanguíneo lleva consigo el riesgo de favorecer la trombosis, y, además, de acuerdo con una realización, la necesidad de mantener una conexión por fibra óptica con el ambiente externo es poco práctica para uso a largo plazo, y supone riesgo de infección.

En la búsqueda de una técnica de vigilancia de glucosa menos invasiva se ha dirigido cierta atención, también, al uso de espectroscopia por infrarrojos para medir directamente la concentración de glucosa en sangre en vasos sanguíneos de tejidos tales como el lóbulo de la oreja o la punta de un dedo, que son relativamente "transparentes a la luz" y presentan vasos sanguíneos situados cerca de la superficie de la piel (Jaremko, J. and Rorstad, O., Diabetes Care, 1998, vol. 21, pág. 444-450, y Fogt, E.J., Clinical Chemistry, 1990, vol. 36, pág. 1573-80). Obviamente, este enfoque es mínimamente invasivo, pero ha demostrado presentar poco valor práctico por el hecho de que el espectro infrarrojo de la glucosa en sangre es tan similar al del tejido circundante que, en la práctica, es virtualmente imposible resolver los dos espectros.

Se ha observado que la concentración de analitos en fluidos subcutáneos se correlaciona con la concentración de dichos analitos en la sangre, y, consecuentemente, existen distintos informes del uso de dispositivos de vigilancia de glucosa situados en una posición subcutánea. En particular, Atanasov et al. (Medical Engineering and Physics, 1996, vol. 18, pág. 632-640) describe el uso de un dispositivo de detección de glucosa implantable (dimensiones 5,0 x 7,0 x 1,5 cm) para vigilar la glucosa en el fluido subcutáneo de un perro. El dispositivo consiste en un sensor amperométrico de glucosa, un potenciostato miniatura, un transmisor de señales de FM y una fuente de alimentación, y puede ser interrogado a distancia, mediante una antena y un receptor conectados con un sistema de captación de datos informatizado, sin necesidad de conexión con el ambiente externo. Pero, obviamente, las grandes dimensiones de este dispositivo lo hacen impracticable para uso con una persona.

El documento de Ryan J. Russell et al, Analytical Chemistry, vol. 71, número 15, pág. 3126-3132, describe un hidrogel implantable a base de poli(etilenglicol) que contiene dextrano-isotiocianato de fluoresceína (dextrano-FITC) y concanavalina A-isotiocianato de tetrametilrodamina conjugados químicamente con la red del hidrogel para su implantación dérmica. Las esferas de hidrogel implantadas están destinadas a ser interrogadas transdérmicamente.

El documento de R. Ballerstadt et al., Analytica Chimica Acta, 1997, vol. 345, pág. 203-212, describe un sistema de análisis por el que dos moléculas de polímero (dextrano) se marcan, respectivamente, con un primero y un segundo fluoróforos, y se unen, una con otra, mediante moléculas de lectina multivalente, que provocan la inhibición de su fluorescencia. La glucosa satura los sitios de unión de la lectina, dando lugar a la disociación de los dos polímeros y a un aumento de la fluorescencia.

El documento de Joseph R. Lakowicz et al, Analytica Chimica Acta, 1993, vol. 271, pág. 155-164 describe el uso de la fluorimetría por modulación de fase. Se sustituyen las mediciones basadas en intensidad de fluorescencia, enseñadas por la técnica descrita anteriormente, por mediciones basadas en vida de fluorescencia.

La vida de la fluorescencia puede medirse mediante una técnica de modulación de fase, merced a la excitación de fluorescencia usando luz modulada en intensidad, entre 1 y 200 MHz, y la medición del desfase de la emisión en relación con la luz incidente y la modulación de la emisión.

El documento WO91/09312 describe un método y un dispositivo subcutáneo que emplea un análisis de afinidad por la glucosa, interrogable a distancia merced a medios ópticos. El documento WO97/19188 describe otro ejemplo de sistema implantable de análisis de glucosa que genera una señal óptica que puede leerse a distancia. Los dispositivos descritos en los documentos WO91/09312 y WO97/19188 seguirán en el cuerpo durante periodos prolongados una vez que la química del análisis haya dejado de funcionar correctamente, y ello es una desventaja importante en el caso de aplicaciones crónicas. La retirada de los dispositivos requiere un procedimiento quirúrgico.

El documento W000/02048 trata este problema usando un material biodegradable para contener los reactivos de análisis. En ese caso, los materiales de análisis, probablemente, se pondrán en contacto con la corriente sanguínea una vez degradado el material biodegradable. Sería deseable minimizarlo o evitarlo.

El documento US 6.163.714 describe, también, el uso de un material biodegradable para contener reactivos de análisis. El documento describe, como alternativas, el uso de partículas biodegradables (bien liposomas de 0,3-2 \mum de diámetro o bien micropartículas de diámetro inferior a 100 \mum), o el uso de un gel biodegradable para contener componentes de análisis. El uso de liposomas para contener los componentes de análisis presenta la desventaja de que los liposomas serán ingeridos por macrófagos y transportados desde el sitio de implantación antes de que el sensor haya experimentado una vida útil. El uso de micropartículas demasiado grandes como para ser ingeridas por macrófagos o un gel biodegradable para contener las partículas de análisis presenta la desventaja de que, a medida que las partículas o el gel biodegradables se degraden, los componentes del análisis se liberarán en la corriente sanguínea.

Sigue existiendo una necesidad clara de técnicas de vigilancia de glucosa en sangre sensibles y precisas que no requieran la extracción regular de sangre del paciente, que no supongan riesgo de infección o incomodidad y que no presenten las desventajas prácticas de los dispositivos implantables descritos en lo que antecede.

Por consiguiente, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención ofrece un sensor para la medición in vivo de un analito, que comprende una pluralidad de partículas no biodegradables con dimensión máxima inferior a 5 \mum, de modo que, una vez implantado en el cuerpo de un mamífero, las partículas puedan ser ingeridas por macrófagos y transportadas lejos del sitio de implantación, conteniendo cada partícula los componentes de un análisis que presenta una lectura que consiste en una señal óptica detectable o medible transdérmicamente merced a medios ópticos externos, y, además, estando contenida cada partícula en un gel biodegradable que impida su ingestión por parte de los macrófagos.

Preferiblemente, las partículas de detección se empotran en una matriz de material biodegradable, pero, alternativamente, pueden ser retenidas mediante una envuelta de material biodegradable, o pueden cubrirse, separadamente, mediante material biodegradable.

El sensor puede ser introducido dentro de la piel por inyección, preferiblemente, usando una jeringuilla, o mediante otros métodos, en particular, los descritos en el documento W000/02048. El sensor puede ser introducido en el grosor de la dermis, o de manera subcutánea, o puede ser introducido en la epidermis, aunque, probablemente, en el último caso sería expulsado de la piel por excrecencia de las capas epidérmicas, posiblemente antes de que el material biodegradable, en su caso, se haya degradado.

Como el sensor se sitúa dentro de la piel, una señal óptica generada por las partículas de detección puede ser detectada transcutáneamente (es decir, a través de la capa o las capas superiores de la piel), obviando así la necesidad de una conexión directa entre el sensor y el entorno externo. Una vez el sensor se encuentre en una posición cutánea pueden realizarse mediciones de analitos con la frecuencia deseada, sin efectos adversos. Ello supone una ventaja particular en relación con la asistencia médica a largo plazo de pacientes diabéticos, porque si las mediciones de glucosa se hacen con más frecuencia, puede mantenerse un control más estricto del nivel de glucosa en la sangre y se reduce el riesgo de desarrollar condiciones relacionadas con glucosa en sangre mal regulada, tales como retinopatía, nefropatía, neuropatía, daño micro y macrovascular general y mala circulación.

Preferiblemente, el gel biodegradable y las partículas de detección son permeables a los fluidos corporales, permitiendo así a los analitos, tales como la glucosa, penetrar en las partículas por difusión e interactuar con los componentes del análisis.

Como el sensor de la invención no contiene ninguno de los componentes ópticos requeridos para interrogar la lectura del análisis (previéndose separadamente, fuera del cuerpo) el sensor puede preverse fácilmente de modo inyectable con mínima incomodidad para el paciente.

El gel biodegradable puede consistir en una formulación inyectable que forme un gel en el punto de inyección dentro de la piel del paciente. Las partículas de detección pueden estar hechas de un material polimérico sólido que incorpore los componentes del análisis, igualmente inyectado o implantado cutáneamente, siendo el material polimérico, típicamente, de un tamaño adecuado para su inyección mediante una aguja de calibre estrecho, con el fin de minimizar la incomodidad del paciente. Una vez posicionado cutáneamente, el material polimérico sólido absorbe agua y se expande para formar un gel, hidratando así los componentes del análisis.

El gel biodegradable contiene las partículas de detección, de manera que sean mantenidas en posición en el sitio de inyección. Ello permite realizar mediciones ópticas en la superficie de la piel, en torno a esta posición. De ese modo, el análisis contenido en todas las partículas de detección puede ser interrogado simultáneamente, con el fin de proporcionar una señal medible.

El gel biodegradable se degradará, a lo largo de un periodo de tiempo, dentro de la piel, liberando las partículas de detección. En ese momento la vida útil del sensor ha terminado, y es deseable eliminar las partículas del cuerpo o mantenerlas en el cuerpo lejos del sitio de detección. Si las partículas han de eliminarse del cuerpo, es deseable hacerlo sin cirugía.

Las células macrófagas existen en el cuerpo como parte del sistema inmune. Estas células se producen en la médula ósea, y son capaces de ingerir partículas extrañas (incluso células necróticas) rodeando a tales partículas merced a extrusiones de la membrana celular, de acuerdo con un proceso denominado fagocitosis. Los macrófagos, también, secretan enzimas que dañan a los organismos extraños.

Los macrófagos son capaces de ingerir y transportar partículas de hasta cierto tamaño, por ejemplo, 5 \mum de dimensión máxima. Por tanto, cuando el gel biodegradable de detección de esta invención se degrada y libera partículas de detección adecuadamente pequeñas, las partículas de detección serán ingeridas por macrófagos. Las partículas de detección pueden ser ingeridas, también, por otros componentes del sistema inmune.

Si las partículas de detección no están contenidas en un material biodegradable serán ingeridas por macrófagos sin el retardo de la degradación del material biodegradable. Por tanto, las mediciones ópticas tendrían que realizarse durante el periodo relativamente corto entre la introducción de partículas de detección en el cuerpo y su retirada por macrófagos.

Preferiblemente, las partículas de detección de la invención presentan características superficiales adecuadas para su ingestión por macrófagos.

Después de la fagocitosis, los macrófagos se desplazan al sistema linfático. Como las partículas de detección no son biodegradables, seguirán en los nodos linfáticos. Ello significa que los reactivos de la invención serán eliminados a través del sistema linfático, en lugar de ser liberados en la piel.

Cada una de las partículas de detección puede contener los componentes del análisis, bien encapsulados en el interior de una micropartícula hueca o bien dispersados en el material de una micropartícula sólida. Se conocen técnicas para crear tales micropartículas. Típicamente, los componentes del análisis, polímero y disolvente, se combinan para formar gotitas. El disolvente se separa y las gotitas se juntan, secan y filtran para dar lugar a un polvo seco, suelto, de micropartículas sólidas que contengan componentes de análisis dispersados. Alternativamente, pueden usarse técnicas de emulsión o coacervación. Ambos procesos pueden incorporar técnicas de estabilización.

Los materiales adecuados como materiales biodegradables de un sensor de la invención incluyen copolímeros de bloques biodegradables, tales como los descritos por el documento de Jeong et al., Nature, vol. 388: pág. 860-862. Las soluciones acuosas de estos materiales son termosensibles, presentando transiciones gel-sol reversibles dependientes de la temperatura. El material biodegradable de polímero puede cargarse con las partículas de detección a una temperatura elevada, a la que el material constituya un sol. De ese modo el material es inyectable, y, cuando se inyecte cutáneamente y, de modo subsiguiente, se enfríe rápidamente a temperatura corporal, el material formará una matriz de gel. Las partículas de detección están suspendidas en esta matriz de gel, que, así, constituye un sensor adecuado para detectar o medir analitos en fluido corporal. Analitos de bajo peso molecular, tales como glucosa, pueden difundirse libremente en la matriz de gel desde el fluido corporal circundante. La inyección cutánea del material en fase de sol no causa dolor significativo ni daño al tejido.

Como alternativa al sensor a base de gel descrito en lo que antecede, el sensor puede comprender un material biodegradable de polímero sólido o a modo de gel, en cuyo interior estén distribuidas las partículas de detección. Una vez inyectado o implantado cutáneamente, este sensor de polímero sólido se hidrata e hincha, y el analito penetra a través de la estructura para encontrar las partículas de detección.

Los materiales biodegradables adecuados para uso en la construcción de los sensores incluyen proteínas reticuladas tales como albúmina humana, geles de fibrina, polisacáridos tales como almidón o agarosa, poliláctidos (PLA) tales como poli(DL-láctido), poliglicólidos (PGA) tales como poli(DL-glicólido), poli(láctido-co-glicólido) (PLGA), polianhídridos, poliortoésteres, mezclas ácido graso/colesterol que formen derivados semisólidos, hialuronatos y cristales líquidos de monooloeína y agua. Estos materiales presentan la ventaja de que se descomponen en moléculas aceptables desde el punto de vista biológico, que son metabolizadas y eliminadas del cuerpo a través de vías
normales.

De acuerdo con las realizaciones preferidas del sensor, resulta ventajoso que los componentes del análisis experimenten una difusión limitada con el fin de minimizar su pérdida, a partir de las partículas de detección, en el material biodegradable, y, potencialmente, en la corriente sanguínea. Ello puede conseguirse garantizando que las partículas de detección tengan un tamaño de poro que permita la difusión de analitos de bajo peso molecular, tales como glucosa, pero no la difusión de los propios componentes del análisis. Preferiblemente, los componentes del análisis son de peso molecular elevado, tales como proteínas o polímeros, con el fin de limitar su pérdida a partir de las partículas de detección.

Los análisis adecuados para uso con el sensor incluyen reacciones, tales como hidrólisis y oxidación, que den lugar a un cambio óptico detectable, por ejemplo, intensificación o inhibición de fluorescencia, que pueda ser observado transcutáneamente. Un análisis preferido para uso con el sensor de la invención es un análisis de unión, cuya lectura consista en una señal óptica detectable o medible que pueda ser interrogada transcutáneamente usando medios ópticos. Preferiblemente, el análisis de unión que genere la señal óptica debe ser reversible, de manera que pueda lograrse una vigilancia continua de los niveles fluctuantes del analito. Esta reversibilidad es una ventaja particular del uso de un formato de análisis de unión en el que los componentes del análisis no se consuman. Los análisis de unión se prefieren, también, para uso con el sensor de la invención por razones de seguridad, ya que no pueden generar productos no deseados, como en el caso de una reacción enzimática o electroquímica.

Los tipos de análisis de unión preferidos para uso con el sensor de la invención incluyen un análisis de unión reversible competitiva, con reactivos limitantes, cuyos componentes incluyan un análogo de analito y un agente de unión de analito capaz de unir, de modo reversible, el analito de interés con el análogo de analito. El analito de interés y el análogo de analito compiten por la unión con el mismo sitio de unión del agente de unión de analito. Tales tipos de análisis de unión competitiva son bien conocidos en la técnica de diagnóstico clínico y se describen, por ejemplo, en el libro "The Immunoassay Handbook", Ed. David Wild, Macmillan Press, 1994. Los agentes de unión de analito adecuados para uso con el análisis incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que conserven un sitio de unión de analito (por ejemplo, fragmentos Fab), lectinas (por ejemplo, concanavalina A), receptores de hormonas, receptores de medicamentos, aptámeros y polímeros de impresión molecular. Preferiblemente, el análogo de analito sería una sustancia de peso molecular mayor que el analito, de manera que no pueda difundirse libremente fuera de las partículas de detección. Por ejemplo, un análisis de glucosa podría emplear un polímero de glucosa de peso molecular elevado, tal como dextrano, como análogo de analito.

Las señales ópticas adecuadas que pueden usarse como lectura de un análisis de acuerdo con la invención incluyen cualquier señal óptica que pueda ser generada mediante un análisis de proximidad, tal como las generadas mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, polarización de fluorescencia, inhibición de fluorescencia, técnica de fosforescencia, intensificación de luminiscencia, inhibición de luminiscencia, difracción o resonancia de plasmones, tal como se conoce en la técnica.

La realización más preferida del sensor de la invención incorpora un análisis de unión competitiva, con reactivos limitantes, que genera una lectura óptica que usa la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. De acuerdo con este formato de análisis, el análogo de analito se marca mediante un primer cromóforo y el agente de unión de analito se marca mediante un segundo cromóforo. Uno de ambos cromóforos actúa como cromóforo donante y el otro actúa como cromóforo aceptor. Una particularidad esencial del análisis consiste en que el espectro de emisión de fluorescencia del cromóforo donante se solapa con el espectro de absorción del cromóforo aceptor, de manera que cuando los cromóforos donante y aceptor sean puestos muy cerca uno de otro por el agente de unión, cierta proporción de la energía que normalmente produciría fluorescencia, emitida por el cromóforo donante (de modo subsiguiente a la irradiación con radiación incidente de una longitud de onda absorbida por el cromóforo donante) será transferida, de modo no radiativo, al cromóforo aceptor adyacente, un proceso conocido en la técnica como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, con el resultado de que cierta proporción de la señal fluorescente emitida por el cromóforo donante se inhibe, la vida de la fluorescencia se modifica, y, en algunos casos, el cromóforo aceptor emite fluorescencia. Pero el cromóforo aceptor puede ser un colorante no fluorescente. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia se producirá, solamente, cuando los cromóforos donante y aceptor sean puestos uno muy cerca de otro, merced a la unión del análogo de analito con el agente de unión de analito. Así, en presencia de analito, que compita con el análogo de analito por la unión con el agente de unión de analito, se reduce la magnitud de la inhibición (dando lugar a un aumento medible de la intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo donante o una caída de la intensidad de la señal emitida por el cromóforo aceptor) a medida que análogo de analito marcado sea desplazado de su unión con el agente de unión de analito. Así, la intensidad o la vida de la señal fluorescente emitida por el cromóforo donante se correlaciona con la concentración de analito en el fluido subcutáneo que bañe al sensor.

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Otra característica ventajosa del formato de análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia se pone de manifiesto por el hecho de que cualquier señal fluorescente emitida por el cromóforo aceptor, de modo subsiguiente a la excitación mediante un haz de radiación incidente con una longitud de onda que se encuentre dentro del espectro de absorción del cromóforo aceptor, no es afectada por el proceso de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Es posible, por tanto, usar la intensidad de la señal fluorescente emitida por el cromóforo aceptor a modo de señal de referencia interna, por ejemplo, para la calibración continua del sensor o para vigilar la medida en que el sensor se haya degradado y, por tanto, para indicar la necesidad de implantar o inyectar un sensor nuevo. A medida que el material biodegradable del sensor se degrade y se liberen partículas de detección, la magnitud de cromóforo aceptor presente en el sensor disminuirá, y, por tanto, la intensidad de la señal fluorescente detectada por la excitación del cromóforo aceptor disminuirá también. La caída de esta señal por debajo de un nivel de referencia aceptable indicaría la necesidad de implantar o inyectar un sensor nuevo. Se conocen análisis de unión competitiva que usan la técnica de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia susceptibles de ser usados con el sensor de la invención. La patente norteamericana nº 3.996.345 describe inmunoanálisis que emplean anticuerpos y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre un par cromofórico agente fluorescente-inhibidor. El documento de Meadows and Schultz (Analytica Chimica Acta, 1993, vol. 280: pág. 21-30) describe un método de análisis homogéneo para la medición de glucosa basado en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre un análogo de glucosa marcado (dextrano marcado con FITC) y un agente de unión de glucosa marcado (concanavalina A marcada con rodamina). En todas estas configuraciones los cromóforos aceptor y donante/inhibidores pueden enlazarse con el agente de unión o el análogo de analito.

Pueden usarse las distintas modalidades de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) descritas en la técnica anterior, citadas en la introducción de este documento.

Pueden realizarse mediciones de vida o intensidad de fluorescencia. Como describe el documento de Lakowicz et al., la vida de fluorescencia puede medirse mediante técnicas de modulación de fase.

Una alternativa a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia es la técnica de inhibición de fluorescencia. En este caso se usa un compuesto con capacidad de inhibición de fluorescencia en vez del cromóforo aceptor específico, y la intensidad de la señal óptica durante un análisis de unión competitiva aumentará con la concentración de analito. El documento de Tyagi et al., Nature Biotechnology, 1988, vol. 18, pág. 49, ofrece un ejemplo de inhibidor de fluorescencia fuerte y no específico.

El sensor de la invención puede destinarse a la detección o medición cuantitativa de cualquier analito presente en fluido corporal. Los analitos preferidos incluyen glucosa (en relación con la vigilancia a largo plazo de diabéticos), urea (en relación con enfermedad o disfunción renal), lactato (en relación con la estimación del comportamiento muscular en medicina deportiva), iones tales como sodio, calcio o potasio, y medicamentos terapéuticos cuya concentración en la sangre tenga que vigilarse estrechamente, tales como, por ejemplo, digoxina, teofilina o medicamentos inmunosupresores. Los analitos anteriores se citan sólo a modo de ejemplo y debe entenderse que la naturaleza precisa del analito a medir no es objeto de la invención.

El sensor es interrogado transcutáneamente usando medios ópticos, es decir, no se requiere conexión física entre el sensor y los medios ópticos. Cuando el sensor incorpore un análisis de unión competitiva, con reactivos limitantes, que emplee la técnica de transferencia de energía fluorescente, los medios ópticos tienen que entregar un primer haz de radiación incidente con una longitud de onda que se encuentre dentro del espectro de absorción del cromóforo donante, y, preferiblemente, un segundo haz de radiación incidente con una longitud de onda dentro del espectro de absorción del cromóforo aceptor. Además, preferiblemente, los medios ópticos tienen que poder medir señales ópticas generadas por el sensor con dos longitudes de onda diferentes: longitud de onda 1, dentro del espectro de emisión del cromóforo donante (la señal generada en relación con la medición de analito) y longitud de onda 2, dentro del espectro de emisión del cromóforo aceptor (que podría ser la señal de analito o la señal de referencia interna o calibración).

Los medios ópticos adecuados para uso en la interrogación a distancia del dispositivo de la invención incluyen un fluorímetro simple de caudal elevado que comprenda una fuente de luz de excitación, tal como, por ejemplo, un diodo fotoemisor (azul, verde o rojo), un filtro de luz de excitación (filtro dicroico o de colorante) y un detector de luz fluorescente (configuración de diodo PIN). Un fluorímetro con estas características puede presentar sensibilidad para concentraciones de fluoróforo entre picomolar y femtomolar.

Una realización de fluorímetro adecuado se muestra en la figura adjunta 1, y se describe en los ejemplos incluidos en este documento. El fluorímetro mide, separadamente, los parámetros siguientes:

Con longitud de onda 1 (cromóforo donante)

: Intensidad de luz de excitación, I(1, 0)

: Intensidad de luz ambiente, I(1, 1)

: Intensidad de luz fluorescente y ambiente combinada, I(1, 2)

\global\parskip1.000000\baselineskip

Con longitud de onda 2 (cromóforo aceptor)

: Intensidad de luz de excitación, I(2, 0)

: Intensidad de luz ambiente, I(2, 1)

: Intensidad de luz fluorescente y ambiente combinada, I(2, 2)

\vskip1.000000\baselineskip

Las mediciones se realizan sujetando el fluorímetro cerca de la piel y en alineación con el sensor. Al hacer mediciones transcutáneas de las señales fluorescentes generadas por el sensor es necesario tener en cuenta la absorción de señal por la piel, habiéndose encontrado, mediante ensayos, que la capacidad de absorción de la piel de las personas es menor en el intervalo entre 400 nm y 900 nm. La salida final proporcionada consiste en la razón normalizada entre la intensidad fluorescente de los dos fluoróforos, definida mediante la relación siguiente (Ecuación 1):

(1)Salida final = (I (1, 2) - I (1, 1)) * I (2, 0) / (I (2, 2) - I (2, 1) * I (1, 0)

La salida final de los medios ópticos (por ejemplo, el fluorímetro) proporcionada mediante la ecuación 1 anterior se convierte en concentración de analito, preferiblemente, por medio de un ordenador que use datos de calibración que puedan obtenerse basándose en los principios expuestos en lo que sigue.

Puede establecerse empíricamente una curva de calibración merced a la medición de la respuesta en función de la concentración de analito para una gama relevante, desde el punto de vista fisiológico, de concentraciones de analito. Preferiblemente, ello puede realizarse in vitro durante la fabricación del dispositivo sensor. El procedimiento de calibración puede simplificarse considerablemente usando la relación matemática entre respuesta y concentración de analito para un sensor de afinidad competitiva, que se obtiene como se indica en lo que sigue.

La respuesta de un sensor de afinidad competitiva es determinada por las reacciones:

RC \leftrightarrow R + C

RL \leftrightarrow R + L

que representan la disociación de los complejos RC y RL, formados por la combinación de agente de unión de analito (R) con analito (L) o análogo de analito (C).

Las constantes de equilibrio de disociación correspondientes son:

K_{1} = \frac{C_{R}C_{C}}{C_{RC}}

y

K_{2} = \frac{C_{R}C_{L}}{C_{RL}}

designando C el número de moles de las especies en el sensor dividido por el volumen del sensor. Usando esta medición de concentración se tratan del mismo modo especies inmovilizadas y especies en solución.

Las ecuaciones de balance de masa son:

T_{C} = C_{C} + C_{RC}

para la concentración total de análogo de analito y,

T_{R} = C_{R} + C_{RC} + C_{RL}

para la concentración total de agente de unión de analito.

\newpage

Mediante la expresión anterior se obtiene la relación entre respuesta y concentración de analito:

(2)\frac{T_{C}-C_{C}}{C_{C}} \ K_{1} = \frac{T_{R} - (T_{C}-C_{C})}{1 + (C_{L}/K_{2})}

Usando esta relación, la cantidad de datos necesarios para la calibración puede reducirse a dos parámetros clave: concentración total de agente de unión de analito y concentración total de análogo de analito. Así, la curva de calibración se determinará mediante dos puntos de la curva.

La presente invención se entenderá mejor con referencia a los ejemplos no limitativos que siguen, junto con las figuras adjuntas, en las que:

la figura 1 es un diagrama esquemático de la parte óptica del fluorímetro de fibra óptica; y

la figura 2 es un diagrama esquemático de un circuito de accionamiento/amplificación usado junto con la parte óptica del fluorímetro de fibra óptica.

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Ejemplo 1

Un análisis de glucosa de acuerdo con el documento de Meadows and Schultz (Talanta, 1988, vol. 35, pág. 145-150, se desarrolló usando concanavalina A-rodamina y dextrano-FITC (de Molecular Probes Inc., Oregon, USA). El principio del análisis consiste en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre los dos fluoróforos cuando estén muy cerca uno de otro; en presencia de glucosa la transferencia de energía por resonancia se inhibe y la señal fluorescente del FITC (isotiocianato de fluoresceína) aumenta en intensidad. Así, un aumento de la fluorescencia se correlaciona con un aumento de glucosa. Se encontró que el análisis respondía a la glucosa, según el documento de Schultz, con, aproximadamente, un 50% de recuperación de la señal fluorescente de la fluoresceína para 20 mg/dL de glucosa. La fluorescencia se midió mediante un fluorímetro Perkin Elmer, adaptado para la medición de flujo usando un dispositivo de aspiración.

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Ejemplo 2

Las partículas de detección se obtienen combinando concanavalina A-rodamina y dextrano-FITC con polímero y disolvente para formar gotitas. El disolvente se separa y las gotitas se juntan, secan y filtran para dar lugar a un polvo seco, suelto.

Las partículas de detección se combinan con material biodegradable de formulación inyectable para obtener el sensor.

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Ejemplo 3

Se prepara dextrano-verde de malaquita usando el método descrito por el documento de Joseph R. Lakowicz et al., Analytica Chimica Acta, 1993, vol. 271, pág. 155-164. Se disuelve dextrano amino (PM 10.000) en tampón de bicarbonato con pH 9,0 y se hace reaccionar con isotiocianato-verde de malaquita en exceso (factor 10) durante 4 h, a temperatura ambiente. El dextrano marcado es liberado del fluoróforo en exceso mediante una columna Sephadex G-50.

Puede conseguirse concanavalina A-azul de cascada (Cascade Blue-Con A) a partir de Sigma.

Las partículas de detección se crean combinando concanavalina A-azul de cascada y dextrano-verde de malaquita con polímero y disolvente para formar gotitas. El disolvente se separa, y las gotitas se juntan, secan y filtran para dar lugar a un polvo seco, suelto.

Las partículas de detección se combinan con material biodegradable de formulación inyectable, para obtener el sensor.

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Ejemplo 4

Un fluorímetro óptico de fibra se montó como sigue:

La parte óptica de un fluorímetro de fibra óptica se hizo a partir de componentes estándar en un micro banco. La realización, que comprende un diodo fotoemisor rojo como fuente de luz, lentes, un divisor de haz dicroico, filtros y diodos detectores, se muestra en la figura 1. Brevemente, el fluorímetro comprende un diodo fotoemisor (1) que entrega un haz de luz de excitación, que pasa por un condensador (2) que contiene un filtro de excitación (3), e incide en un divisor de haz (4). De ese modo, parte del haz excitador es desviado hacia la óptica de transmisión (5) y penetra en una fibra óptica (6). Cuando el fluorímetro se encuentre, en uso, en plena interrogación de un sensor posicionado cutáneamente al final de la piel, en alineación con el sensor cutáneo, de modo que el haz de luz de excitación incida en el sensor, parte de la señal óptica emitida por el sensor de modo subsiguiente a la excitación penetra en la fibra óptica (6), y, de ese modo, es transmitida al fluorímetro, en el que pasa por un diodo de bloqueo (7). El fluorímetro contiene, también, un diodo detector (9) de referencia, que proporciona una medición de referencia de la luz de excitación emitida por el diodo fotoemisor (1). Los extremos de una fibra óptica Ensign Beckford, de 1 m de largo, 0,5 mm de diámetro y apertura numérica de 0,65, se pulieron para darles un acabado de espejo usando pasta de diamante sobre pasta de vidrio. Un extremo de la fibra se montó en un soporte XYZ, delante de un objetivo de microscopio 20x. Los diodos (diodo fotoemisor (1) y diodos detectores (7) y (9)) se conectaron con un circuito de accionamiento/amplificación hecho a medida, como se muestra en la figura 2. El circuito comprende un transmisor (10), amplificadores de corriente (11) y (12), multiplexores (13) y (14), integradores (15) y (16) y un divisor analógico (17). El circuito de accionamiento se ajustó con el fin de activar el diodo fotoemisor (1) a 238 Hz, y las señales de los diodos detectores (7) y (9) se conmutaron entre tierra y los condensadores de almacenamiento (integrador con una constante de tiempo de 1 segundo) de modo sincronizado con la señal de accionamiento. Las dos señales integradas corresponden a señal fluorescente con corrección de fondo y nivel de luz de excitación con corrección de fondo (intensidad de diodo fotoemisor). Se dividió la primera por la segunda mediante un divisor analógico, como muestra la figura 2. Para las pruebas se introdujo el extremo distal de la fibra (6) en una solución diluida de rodamina y se ajustó la óptica para maximizar la señal del divisor analógico.

El fluorímetro es de accionamiento mediante pilas (consumo de energía típico de 150 mA a 9 V), y, por conveniencia, puede construirse con la forma y las dimensiones de un lápiz.

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Ejemplo 5

El sensor preparado de acuerdo con el ejemplo 2 se inyecta mediante una jeringuilla en el dorso de la mano de un voluntario.

Se dirige un fluorímetro de fibra óptica (véase el ejemplo 4) hacia la piel y se obtiene una señal de vida de fluorescencia de rodamina y se correlaciona con una medición de glucosa de sangre convencional, mostrando que pueden hacerse mediciones transdérmicas mediante sensores implantados.

Claims

1. Un sensor para la medición in vivo de un analito, que comprende una pluralidad de partículas no biodegradables con dimensión máxima inferior a 5 \mum, de manera que, una vez implantado en el cuerpo de un mamífero, las partículas puedan ser ingeridas por macrófagos y transportadas lejos del sitio de implantación, conteniendo cada partícula los componentes de un análisis que presenta una lectura que consiste en una señal óptica detectable o medible transdérmicamente merced a medios ópticos externos, y estando contenida cada partícula en un gel biodegradable que impida su ingestión por parte de los macrófagos.

2. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análisis consiste en un análisis de unión.

3. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el análisis de unión consiste en un análisis de unión competitiva, cuyos componentes incluyen un agente de unión de analito y un análogo de analito.

4. Un sensor de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el análogo de analito se marca con un primer cromóforo y el agente de unión de analito se marca con un segundo cromóforo, solapándose el espectro de emisión del primer cromóforo o del segundo cromóforo, respectivamente, con el espectro de absorción del segundo cromóforo o del primer cromóforo.

5. Un sensor de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en el que el agente de unión consiste en un anticuerpo, un fragmento Fab, una lectina, un receptor de hormona, un receptor de medicamento, un aptámero o un polímero de impresión molecular.

6. Un sensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la señal óptica detectable o medible es generada mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, polarización de fluorescencia, inhibición de fluorescencia, fosforescencia, intensificación de luminiscencia, inhibición de luminiscencia, difracción o resonancia de plasmones.

7. Un sensor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el analito consiste en glucosa.