ES2316997T3 - Uso de la proteina proteinasa 3 (prn3) y del inhibidor de la elastasa leucocitaria (ileu) como un marcador para el cancer colorrectal. - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal (=CRC=) que comprende las etapas de a) aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo b) puesta en contacto de dicha muestra con un aglutinante específico para la proteinasa 3(PRN3) y un segundo aglutinante específico para el inhibidor de elastasa leucocitaria inhibidora de la proteinasa tipo serina (ILEU) en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho primer aglutinante y el segundo aglutinante y PRN3 enlazada a ILEU (PRN3/ILEU), y c) correlación de la cantidad de complejo formado en b) para el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Description
Uso de la proteína proteinasa 3 (PRN3) y del
inhibidor de la elastasa leucocitaria (ILEU) como un marcador para
el cancer colorrectal.
La presente invención se refiere al diagnóstico
del cáncer colorrectal. Revela el uso de la proteína PRN3
(proteinasa3) ligada al inhibidor de la proteinasa tipo serpina ILEU
(inhibidor de la elastasa leucocitaria) (=PRN3/ILEU) en el
diagnóstico del cáncer colorrectal. Además, se refiere especialmente
a un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal de una
muestra líquida, procedente de un individuo al medir el PRN3/ILEU
en dicha muestra. La medición del PRN3/ILEU se puede utilizar, por
ejemplo, en la detección prematura o el diagnóstico del cáncer
colorrectal.
El cáncer sigue siendo un reto importante para
la salud pública a pesar de los avances realizados en su detección y
terapia. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal
(=CCR) es uno de los cánceres más frecuentes en el mundo
occidental.
El cáncer prematuro puede ser
detectado/diagnosticado y lo mejor es la velocidad de supervivencia
global. Esto es especialmente cierto para el CCR. El pronóstico en
los estados avanzados del tumor es pobre. Más de una tercera parte
de los pacientes morirá de la enfermedad a los cinco años de su
diagnóstico, lo que corresponde a una velocidad de supervivencia de
aproximadamente un 40% para cinco años. El tratamiento actual
solamente está curando una fracción de los pacientes y tiene
claramente su mejor efecto en aquellos pacientes diagnosticados en
una etapa prematura de la enfermedad.
Con respecto al CCR como problema de salud
pública, es esencial que se desarrolle un cribado más efectivo y
unas medidas preventivas para el cáncer colorrectal.
Los procedimientos de detección más prematuros
disponibles actualmente para el cáncer colorrectal implican el uso
de ensayos para procedimientos endoscópicos o de sangre oculta en la
materia fecal. Sin embargo, debe existir un tamaño de tumor
significativo antes de que se detecte sangre en la materia fecal. La
sensibilidad de los ensayos de sangre oculta en la materia fecal
basados en el test de guaiac es de -26%, lo que significa que un
74% de los pacientes con lesiones malignas no se detectarán
(Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am. 26 (1997)
41-55). La visualización de lesiones precancerosas y
cancerosas representa el mejor método de detección prematura, pero
la colonoscopia es traumática con costes, riesgos y complicaciones
significativas (Silvis, S.E., y cols., JAMA 235 (1976)
928-930; Geenen, J.E., y cols., Am. J. Dig. Dis. 20
(1975) 231-235; Anderson, W.F., y cols., J. Natl.
Cancer Institute 94 (2002) 1126-1133).
Recientemente se ha informado sobre una cantidad
tremenda de los así llamados genes específicos del colon o incluso
denominados genes específicos del cáncer colorrectal. La gran
mayoría de los correspondientes informes de investigación o de las
solicitudes de patentes se basan en los datos obtenidos por el
análisis de los modelos de expresión del ARN en un tejido del colon
(cáncer) frente a un tejido diferente o bien un tejido normal
adyacente, respectivamente. Dichos métodos pueden resumirse como
técnicas de visualización del ARNm diferencial.
Como un ejemplo de los datos disponibles a
partir de las técnicas de visualización del ARNm se mencionará y
comentará la WO 01/96390. Esta solicitud describe y reivindica más
de doscientos polinucleótidos aislados y los correspondientes
polipéptidos como tal, así como su uso en la detección del CCR. Sin
embargo, en general se sabe que las diferencias a nivel del ARNm no
quedan reflejadas por el nivel de las proteínas correspondientes.
Una proteína codificada por un ARNm raro se puede hallar en
cantidades muy elevadas y una proteína codificada por un ARNm
abundante puede ser difícil de detectar y de encontrar. Esta falta
de correlación entre el nivel de ARNm y el nivel proteínico se debe
a cuestiones como la estabilidad del ARNm, a la eficacia de la
conversión, a la estabilidad de la proteína, etc.
También existen métodos recientes que investigan
las diferencias en los modelos de proteínas entre distintos tejidos
o entre un tejido sano y uno enfermo con el fin de identificar las
moléculas marcador candidatas que se podrían utilizar en el
diagnóstico del CCR. Brünagel, G., y cols., Cancer Research 62
(2002) 2437-2442 han identificado siete proteínas
de matriz nuclear que parecen ser más abundantes en el tejido del
CCR en comparación con el tejido normal adyacente. No existen datos
de muestras líquidas obtenidas de un individuo.
La WO 02/078636 informa acerca de nueve manchas
asociadas al cáncer colorrectal halladas por la deserción y la
ionización mediante láser que aumenta la superficie (SELDI). Estas
manchas se ven más frecuentemente en los sueros obtenidos de
pacientes con CCR en comparación con sueros obtenidos de controles
sanos. Sin embargo, la identidad de la(s) molécula(s)
comprendida(s) en dicha mancha, por ejemplo, su secuencia, se
desconoce.
A pesar de la gran y cada día mayor lista de
marcadores proteínicos candidatos en el campo del CCR, hasta la
fecha se desconoce la utilidad clínica/diagnóstica de estas
moléculas. Para ser de utilidad clínica un marcador diagnóstico
nuevo como marcador independiente debería ser al menos tan bueno
como el mejor marcador individual conocido en la actualidad. O
bien, un marcador nuevo debería conducir a un progreso en la
sensibilidad y/o especificidad diagnóstica tanto si se utilizara
solo como en combinación con uno o más marcadores, respectivamente.
La sensibilidad y/o especificidad diagnóstica de un ensayo es
evaluada mejor por sus características actuando como receptor, que
se describirán con detalle a continuación.
Actualmente, solamente los análisis de sangre
diagnósticos basados en la detección del antígeno carcinoembriónico
(CEA), una glicoproteína asociada a un tumor, se encuentran
disponibles para ayudar al diagnóstico en el campo del CCR. La CEA
se incrementa en un 95% de las muestras tisulares obtenidas de los
pacientes con cánceres pancreáticos, gástricos y colorrectales y en
la mayoría de carcinomas de mama, pulmón y cabeza y cuello
(Goldenberg, D.M., y cols., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57
(1976) 11-22. Los niveles elevados de CEA se han
observado también en pacientes con una enfermedad no maligna, y
muchos pacientes con cáncer colorrectal tienen niveles de CEA
normales en el suero, especialmente durante la etapa prematura de la
enfermedad (Carriquiry, L.A., y Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 41
(1999) 921-929; Herrera, M.A., y cols., Ann. Surg.
183 (1976) 5-9; Wanebo, H.J., y cols., N. Engl. J.
Med. 299 (1978) 448-451). La utilidad de la CEA
medida a partir de suero o plasma en la detección de recurrencias es
considerada controvertida y todavía tiene que ser aplicada
ampliamente (Martell, RE., y cols., Int. J. Bio. Markers 13 (1998)
145-149; Moertel, C.G., y cols., JAMA 270 (1993)
943-947).
A la luz de los datos disponibles, la
determinación de CEA en suero no posee ni sensibilidad ni
especificidad para permitir su uso como una prueba de cribado para
el cáncer colorrectal en la población asintomática (Reynoso, G., y
colaboradores., JAMA 220 (1972) 361-365; Sturgeon,
C., Clinical Chemistry 48 (2002) 1151-1159).
La sangre entera, el suero o el plasma son las
fuentes de muestras más ampliamente utilizadas en la rutina
clínica. La identificación de un marcador tumoral de CCR prematuro
que permitiera la detección fiable del cáncer o aportara
información sobre un pronóstico prematuro podría conducir a una
valoración diagnóstica que ayudaría enormemente al diagnóstico y al
tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad
clínica urgente de mejora del diagnóstico del CCR de la sangre. Es
especialmente importante mejorar el diagnóstico prematuro del CCR,
ya que los pacientes diagnosticados prematuramente con posibilidades
de supervivencia son mucho mayores en comparación con los
diagnosticados en una etapa avanzada de la enfermedad.
La tarea de la presente invención consistía en
investigar si se puede identificar un marcador nuevo que pueda
ayudar en el diagnóstico del CCR.
Sorprendentemente, se ha descubierto que el uso
de la PRN3 enlazada al inhibidor de la proteinasa tipo serpina ILEU
(PRN3/ILEU) puede al menos parcialmente superar los problemas
conocidos hasta el momento.
Por lo tanto la presente invención se refiere a
un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende
las etapas de a) aporte de una muestra líquida obtenida de un
individuo, b)puesta en contacto de dicha muestra con un
primer agente de enlace específico para la proteinasa 3 (PRN3) y un
segundo agente de enlace específico para el inhibidor de la
elastasa leucocitaria inhibidora de la proteinasa tipo serpina
(ILEU) en unas condiciones apropiadas para la formación de un
complejo entre dicho primer agente de enlace y el segundo agente de
enlace y la PRN3 ligada al ILEU (PRN3/ILEU), y c) la correlación de
la cantidad de complejo formada en (b) para el diagnóstico del
cáncer colorrectal.
Otra configuración preferida de la invención es
un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende
las etapas de a) puesta en contacto de una muestra líquida obtenida
de un individuo con un primer agente de enlace específico para la
proteinasa 3(PRN3) y un segundo agente específico para el
inhibidor de la elastasa leucocitaria inhibidora de la proteinasa
tipo serpota (ILEU) en unas condiciones apropiadas para la formación
de un complejo entre dicho primer y segundo agente de enlace y la
PRN3 enlazada al ILEU (PRN3/ILEU), b)la correlación de la
cantidad de complejo formado en a) para el diagnóstico del cáncer
colorrectal.
Como apreciará el experto, cualquier diagnóstico
se realiza in vitro. La muestra del paciente es descartada
después. La muestra del paciente se utiliza exclusivamente para el
método diagnóstico in vitro de la invención y el material de
la muestra del paciente no se devuelve al cuerpo del paciente.
Habitualmente, la muestra es una muestra líquida.
La proteína PRN3 (proteinasa 3, también conocida
como precursor de mieloblastina o autoantígeno de Wegener;
SwissPROT:P24158) se caracteriza por la secuencia SEQ ID NO:1. La
proteinasa 3 es una proteinasa de la serina que se encuentra en los
gránulos azurofílicos de los neutrófilos polimorfonucleares
(Baggiolini, M., y cols., Agents Actions 8 (1978)
3-10). La proteinasa 3 se ha caracterizado y se
conoce independientemente como p29b (Campanelli, D., y cols., J.
Clin. Invest. 85 (1990) 904-915) y la mieloblastina
(Bories, D., y cols., Cell 59 (1989) 959-968), las
cuales resultaron ser idénticas a la proteinasa 3. La PRN3 es una
proteína de unos 29 kDa y existe como especie Mr múltiple, debido
probablemente a las diferencias en glucosilación (Wilde, C.G., y
cols., J. Bio. Chem. 265 (1990) 2038-2041).
La PRN3 se ha asociado a una serie de
enfermedades del hombre. Se trata del antígeno de referencia del
modelo citoplásmico de los autoanticuerpos citoplásmicos
antineutrófilos (c-ANCA) detectados en la
circulación de los pacientes con granulomatosis de Wegener (WG)
(Ludemann, J., et al., J. Exp. Med. 171 (1990)
357-362). La PRN3 también está involucrada en el
crecimiento y la diferenciación de células de leucemia (Bories, D.,
y cols, Cell 59 (1989) 959-968) y los modelos
animales han indicado un papel para el PRN3 en un enfisema (Kao,
R.C., y cols., J. Clin. Invest. 82 (1988)
1963-1973).
La PRN3 puede ser detectada en la superficie
celular tras la activación por el factor de necrosis tumoral
(TNF\alpha) in vitro (Charles, L.A., y cols., J. Leuk.
Biol. 50 (1991) 539-546), y se ha informado de que
el PRN3 libera la TNF\alpha de las superficies celulares in
vitro (Robache-Galilea y cols., 1995). Se ha
averiguado que la PRN3 también hallada en la superficie de las
células en los pacientes con vasculitidas asociadas a ANCA (Csernok,
E., y cols., Advan. Exp. Med. Biol. 336 (1993)
45-50).
La secuencia de ILEU (inhibidor de elastasa
leucocitaria, conocido asimismo como inhibidor de elastasa de
monocito/neutrófilo; Swiss-PROT P30740) se da en SEQ
ID NO:2. Se trata de una proteína de 42 kDa de la superfamilia de
la serpina (Remold-O'Donnell, E., et al.,
PNAS 89 (1992) 5635-5639). Los inhibidores tipo
serpina se han descrito formando un enlace covalente con sus
proteinasas de referencia y formando complejos estables
serpina-proteinasa, que no se disocian cuando se
tratan con la SDS (Olson, S., y cols., JBC 270 (1995)
30007-30017).
En particular, se demostraba que el ILEU inhibía
entre otros, la PRN3 (proteinasa-3) rápida y
eficazmente (Cooley, J., y cols., Biochem. 40 (2001)
15672-15770). Esta inhibición se realiza a través de
una unión covalente en una relación estequiométrica 1:1. La
SDS-PAGE revelaba que el complejo
ILEU-PRN3 formado era resistente al tratamiento SDS
(Cooley, J., y cols., Biochem. 40 (2001)
15672-15770).
Obviamente, la presente invención no se ha
creado para limitarse a la proteína de longitud completa PRN3 de
SEQ ID NO: 1 enlazada a la proteína de longitud completa ILEU de SEQ
ID NO ID: 2. Los complejos ILEU-PRN3 pueden
comprender también fragmentos fisiológicos o artificiales de PRN3 o
ILEU, modificaciones secundarias de PRN3 o ILEU, así como variantes
alélicas de PRN3 o ILEU. Por lo tanto, la PRN3 así como sus
fragmentos, modificaciones y variantes de PRN3 enlazados a ILEU o a
sus fragmentos, modificaciones y variantes son también abarcados por
la presente invención.
Los fragmentos artificiales de PRN3 incluyen
preferiblemente un péptido producido de forma sintética o bien
mediante técnicas recombinantes, que al menos comprende un epítopo
de interés diagnóstico que consiste en al menos 6 aminoácidos
contiguos como derivados de la secuencia revelada en SEQ ID NO:1.
Dicho fragmento puede ser utilizado de forma ventajosa para la
generación de anticuerpos o bien como un estándar en un
inmunoanálisis. Más preferiblemente el fragmento artificial
comprende al menos dos epítopos de interés apropiado para ajustar
un inmunoanálisis según la técnica sándwich. Del mismo modo, la
presente invención abarca anticuerpos generados usando un péptido
como antes para la PRN3 pero derivado de la secuencia revelada en
SEQ ID NO:2, donde el péptido representa al menos un epítopo
ILEU.
Una configuración preferida de la presente
invención es un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal
que comprende las etapas de a) aporte de una muestra líquida
obtenida de un individuo, b) puesta en contacto de dicha muestra
con un primer agente de enlace específico para la proteinasa 3
(PRN3) y un segundo agente de enlace específico para el inhibidor
de la elastasa leucocitaria inhibidor de la proteinasa tipo serpina
(ILEU) en unas condiciones apropiadas para la formación de un
complejo entre dicho primer y segundo agente de enlace y la PRN3
enlazada al ILEU (PRN3/ILEU), y c) correlación de la cantidad de
complejo formado en (b) para el diagnóstico del cáncer colorrectal.
Incluso preferible a este método es un inmunoanálisis tipo sándwich
que utiliza un anticuerpo específico de la PRN3 para la captura y un
anticuerpo específico del ILEU para detectar PRN3/ILEU, o bien un
anticuerpo específico del ILEU para la captura y un anticuerpo
específico del PRN3 para detectar PRN3/ILEU.
Se ha anticipado que no solamente la PRN3/ILEU
puede servir como un marcador para el CCR sino que también sin
PRN3, solo o en combinación con la PRN3/ILEU. Por este motivo, los
hallazgos sobre los que se basa esta invención se refieren a tres
objetivos específicos distintos: (i) PRN3/ILEU solo, (ii) PRN3/ILEU
y sin PRN3, y (iii) PRN3 solo no enlazado. Los tres objetivos se
pueden usar individualmente como marcadores o bien se puede
determinar un porcentaje de las cantidades de al menos dos de los
objetivos (i), (ii) y (iii). El porcentaje puede servir como un
parámetro que caracteriza el CCR.
Más adelante se informa sobre un método para el
diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende las etapas de (a)
aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo, b) puesta en
contacto de dicha muestra con un agente de enlace frente a un
epítopo compartido por la PRN3 y la PRN3/ILEU en unas condiciones
apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente de
enlace y la PRN3 así como la PRN3/ILEU, y (c) correlación de la
cantidad de complejo formada en (b) para el diagnóstico del cáncer
colorrectal. De este modo se mide toda la PRN3 presente en la
muestra líquida ("total PRN3").
Más adelante se informa sobre un método para el
diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende las etapas de (a)
aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo, b) puesta en
contacto de dicha muestra con un agente de enlace frente a un
epítopo presente en la PRN3 no enlazada pero no en la PRN3/ILEU en
unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre
dicho agente de enlace y la PRN3 y (c) correlación de la cantidad
de complejo formada en (b) para el diagnóstico del cáncer
colorrectal. Como apreciará el experto se requiere al menos un
reactivo de enlace que reconozca un epítopo en el PRN3 ausente, por
ejemplo, enmascarado si el PRN3 está unido al ILEU. En un análisis
mediante la técnica sándwich se utiliza al menos dicho reactivo como
reactivo de captura o de detección.
Cualquiera de los nuevos marcadores PRN3/ILEU,
PRN3 total y/o PRN3 solo no enlazado o en combinación pueden ser
utilizados para fines de control así como de cribado.
Cuando se utiliza en el control del paciente el
método diagnóstico conforme a la presente invención puede ayudar a
evaluar la carga tumoral, la eficacia del tratamiento y la
recurrencia tumoral en el seguimiento de los pacientes. Niveles
elevados de PRN3/ILEU se correlacionan directamente con la carga
tumoral. Después de la quimioterapia un incremento a corto plazo
(pocas horas a 14 días) en PRN3/ILEU puede servir como indicador de
la muerte de las células tumorales. En el seguimiento de los
pacientes (de 3 meses a 10 años) se puede utilizar un aumento de la
PRN3/ILEU como un indicador de la recurrencia tumoral.
En una configuración preferida, el método
diagnóstico conforme a la presente invención se utilizará para fines
de cribado, es decir, se utilizará para evaluar los individuos sin
un diagnóstico previo del CCR midiendo el nivel de PRN3/ILEU y
correlacionando el nivel medido con la presencia o ausencia de
CCR.
El cáncer colorrectal frecuentemente pasa de un
adenoma (pólipo) a un carcinoma maligno. Las diferentes etapas del
CCR se solían clasificar conforme a las etapas A a D de Duke.
El estadificación del cáncer es la clasificación
de la enfermedad en términos de su extensión, avance y gravedad.
Agrupa a pacientes con cáncer de forma que se pueden hacer
generalizaciones acerca del pronóstico y de la elección de la
terapia.
Hoy en día, el sistema TNM es la clasificación
más ampliamente utilizada de la extensión anatómica del cáncer.
Representa un sistema de estadificación uniforme, aceptado
internacionalmente. Existen tres variables básicas: T (la extensión
del tumor primario), N (el estado de los nódulos linfáticos
regionales) y M (la presencia o ausencia de las metástasis
distantes). Los criterios TNM han sido publicados por el UICC
(Internacional Union Against Cancer), Sobón, L.H., Wittekind,
Ch.(eds): TNM Classification of Malignant Tumors, fifth edition,
1997.
Lo que es especialmente importante es que el
diagnóstico prematuro del CCR proporciona un pronóstico mucho más
bueno. Los tumores malignos del colo-recto surgen de
los tumores benignos, es decir, del adenoma. Por lo tanto, aquellos
pacientes diagnosticados en la etapa del adenoma tienen un mejor
pronóstico. Los pacientes diagnosticados como prematuros como en la
etapa T_{is}, NO, MO o bien T1-3; NO; MO, si son
tratados de forma apropiada tienen una probabilidad superior al 90%
de supervivencia 5 años después del diagnóstico en comparación con
un índice de supervivencia de 5 años de solamente el 10% para los
pacientes diagnosticados cuando las metástasis distantes ya se
encuentran presentes.
En el sentido de la presente invención el
diagnóstico prematuro del CCR se refiere a un diagnóstico en un
etapa previa del cáncer (adenoma) o bien en una fase del tumor donde
no existe metástasis (ni proximal ni distal), es decir, adenoma,
T_{is}, NO MO o bien T1-4; MO están presentes.
T_{is} indica carcinoma in situ.
En una configuración preferida, la detección del
PRN3/ILEU se utiliza para diagnosticar el CCR como prematuro como en
la etapa del adenoma.
Además es preferible que el CCR sea
diagnosticado cuando no ha crecido completamente a través de la
pared intestinal y por consiguiente ni el peritoneo visceral está
perforado ni otros órganos o estructuras se encuentran invadidas,
es decir, que el diagnóstico se realiza en la etapa T_{is}, NO, MO
o T1-3; NO; MO(=T_{is}-3; NO;
MO).
El método diagnóstico conforme a la presente
invención se basa en una muestra líquida que procede de un
individuo. A diferencia de los métodos conocidos actualmente, la
PRN3/ILEU se mide específicamente a partir de esta muestra líquida
usando un agente de enlace específico.
Un agente de enlace específico es, por ejemplo,
un receptor para la PRN3, ILEU, o PRN3/ILEU, una lectina que se
enlaza a la PRN3, ILEU o PRN3/ILEU o bien un anticuerpo frente a la
PRN3, ILEU o PRN3/ILEU. Un agente de enlace específico tiene al
menos una afinidad de 10^{7} l/mol por su molécula de referencia
correspondiente. El agente de enlace específico tiene
preferiblemente una afinidad de 10^{8} l/mol o incluso más
preferiblemente de 10^{9} l/mol por su molécula de referencia.
Como apreciará el experto el término específico se utiliza para
indicar que otras biomoléculas presentes en la muestra no se enlazan
de forma significativa al agente de enlace específico para la PRN3,
ILEU o PRN3/ILEU. Preferiblemente, el nivel de enlace a una
biomolécula distinta de la molécula de referencia da lugar a una
afinidad de enlace que es únicamente del 10%, más preferiblemente
solo del 5% de la afinidad de la molécula de referencia o bien
inferior. Un agente de enlace específico preferido cumplirá tanto
el criterio mínimo anterior por la afinidad así como por la
especificidad.
Un par de agentes de enlace específicos
comprenden preferiblemente un primer anticuerpo reactivo con la PRN3
y un segundo anticuerpo reactivo con ILEU, de forma que el par de
anticuerpos sea capaz de formar un complejo con el PRN3/ILEU.
Además, un agente de enlace específico preferiblemente es aquel
antibiótico específicamente reactivo con la PRN3/ILEU pero no con
la PRN3 o la ILEU solas. También incluido en la presente invención
se encuentra un agente de enlace específico dirigido contra una
PRN3 no enlazada, donde el agente de enlace específico es
preferiblemente un anticuerpo reactivo con un epítopo de la PRN3
que es enmascarado cuando la PRN3 se enlaza al ILEU.
El término anticuerpo se refiere a un anticuerpo
policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de dichos
anticuerpos, así como construcciones genéticas que comprenden el
dominio de enlace de un anticuerpo. Se puede utilizar cualquier
fragmento de anticuerpo que cumpla los criterios anteriores de
agente de enlace específico. Los anticuerpos son generados por
procedimientos novedosos, por ejemplo, tal como se describe en
Tijssen (Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays
11(1990) todo el libro, en especial las páginas
43-78; Elsevier, Amsterdam). Además, el experto
conoce bien los métodos basados en los inmunosorbentes que se pueden
utilizar para el aislamiento específico de anticuerpos. Mediante
estos métodos la calidad de los anticuerpos policlonales y su
funcionamiento en los inmunoanálisis aumenta (Tijssen, P.,
supra, páginas 108-115).
Para lograr todo esto de acuerdo con la presente
invención, se han utilizado anticuerpos policlonales en conejos.
Sin embargo, también se pueden utilizar claramente anticuerpos
policlonales de diferentes especies, por ejemplo, de ratas o
cobayas, así como anticuerpos monoclonales. Puesto que los
anticuerpos monoclonales se fabrican en cualquier cantidad
requerida con propiedades constantes, representan las herramientas
ideales en el desarrollo de un ensayo de rutina clínica. La
generación y el uso de anticuerpos monoclonales a la PRN3, ILEU y
PRN3/ILEU en un método conforme a la presente invención es asimismo
otra de las configuraciones preferidas.
Como el experto apreciará ahora que la
combinación PRN3/ILEU se ha identificado como un marcador útil en el
diagnóstico del CCR, vías alternativas se podrán utilizar para
llegar a un resultado comparable a los logros de la presente
invención. Por ejemplo, se pueden utilizar estrategias alternativas
para generar anticuerpos. Dichas estrategias comprenden entre otras
cosas el uso de péptidos sintéticos, que representan un epítopo de
la PRN3, ILEU o PRN3/ILEU para la inmunización. Alternativamente, se
puede usar la inmunización del ADN conocida también como vacuna del
ADN.
Para la medición la muestra líquida obtenida de
un individuo se incuba con el agente de enlace específico o con un
par de agentes de enlace para la PRN3/ILEU en unas condiciones
apropiadas para la formación de un complejo del agente de enlace o
de un par de agentes de enlace y de la PRN3/ILEU. No es preciso que
dichas condiciones sean especificadas, puesto que el experto sin
apenas esfuerzo inventivo alguno puede identificar fácilmente las
condiciones apropiadas para la incubación.
Como etapa final conforme al método revelado en
la presente invención se mide la cantidad de complejo y se
correlaciona con el diagnóstico del CCR. Como apreciará el experto
existen numerosos métodos para medir la cantidad de complejo
formado que consiste en el agente de enlace específico o un par de
agentes de enlace específicos y la PRN3/ILEU, todo descrito con
detalle en los libros de texto pertinentes (cf., por ejemplo,
Tijssen P., supra, o Diamandis, y cols., eds (1996)
Immunoassay, Academia Press, Boston).
Preferiblemente la PRN3/ILEU se detecta en un
formato de análisis tipo sándwich. En dicho análisis se utiliza un
primer agente de enlace específico para capturar la PRN3/ILEU por un
lado y por otro lado se utiliza un segundo agente específico de
enlace, que se marca para ser detectado directa o
indirectamente.
Tal como se ha mencionado antes,
sorprendentemente se ha averiguado que la PRN3/ILEU se puede medir a
partir de una muestra líquida obtenida de una muestra de un
individuo. No se requiere ni tejido ni muestra de biopsia para
aplicar el marcador PRN3/ILEU al diagnóstico del CCR.
En una configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se lleva a cabo con suero como
material de muestra líquida.
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se lleva a cabo con plasma como
material de muestra líquida.
En otra configuración preferida, el método
conforme a la presente invención se lleva a cabo con sangre entera
como material de muestra líquida.
Además las heces se pueden preparar de diversas
formas según el experto para obtener una muestra líquida. Dicha
muestra líquida procedente de las heces representa una configuración
preferida conforme a la presente invención.
Mientras que la aplicación de los métodos de
proteinómica rutinarios a las muestras de tejido, conduce a la
identificación de muchos candidatos marcadores potenciales para el
tejido seleccionado, los inventores de la presente invención han
sido capaces de detectar la PRN3/ILEU en una muestra de fluido
corporal. Y todavía más sorprendentemente, han sido capaces de
demostrar que la presencia de la PRN3/ILEU en dicha muestra líquida
obtenida de un individuo se puede correlacionar con el diagnóstico
del cáncer colorrectal.
Los anticuerpos a la PRN3/ILEU con gran ventaja
se pueden utilizar en los métodos establecidos, con el fin de
detectar células cancerosas colorrectales in situ, en
biopsias o en procedimientos inmunohistológicos.
Preferiblemente, se utiliza un anticuerpo a la
PRN3/ILEU en un inmunoanálisis cualitativo (PRN3/ILEU presente o
ausente) o bien cuantitativo (se determina la cantidad de
PRN3/ILEU).
En base a la determinación cuantitativa del
PRN3/ILEU y del PRN3 total o PRN3 no enlazado el porcentaje entre
estos marcadores puede estar correlacionado con el diagnóstico del
cáncer colorrectal.
La medición del nivel de PRN3/ILEU proteínico ha
demostrado ser muy favorable en el campo del CCR. Por lo tanto, en
otra configuración preferida, la presente invención se refiere al
uso del PRN3/ILEU como una molécula marcador en el diagnóstico del
cáncer colorrectal de una muestra líquida obtenida de un
individuo.
El término molécula marcador se utiliza para
indicar que un nivel elevado del analito PRN3/ILEU medido en un
fluido corporal de un individuo marca la presencia de CCR.
Se prefiere especialmente utilizar el marcador
PRN3/ILEU en el diagnóstico prematuro del cáncer colorrectal.
El uso del PRN3/ILEU propiamente, representa un
avance significativo hacia el campo desafiante del diagnóstico del
CCR. Combinando las mediciones del PRN2/ILEU con otros marcadores
conocidos, como el CEA, o con otros marcadores del CCR todavía por
descubrir, se han alcanzado grandes mejorías. Por lo tanto, en otra
configuración preferida la presente invención se refiere al uso de
la PRN3/ILEU como molécula marcador del cáncer colorrectal en
combinación con una o más moléculas marcadores para el cáncer
colorrectal en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra
líquida obtenida de un individuo. A este respecto, la expresión
"una o más" se refiere a 1 a 10, preferiblemente 1 a 5, más
preferiblemente 3. Otros marcadores del CCR seleccionados
preferiblemente con los que se puede combinar la medición del
PRN3/ILEU son el CEA, CA 19-9, y/o CA 242. Por
consiguiente, una configuración muy preferida de la presente
invención es el uso de la PRN3 proteínica o PRN3/ILEU como molécula
marcador del cáncer colorrectal en combinación con una o más
moléculas marcador del cáncer colorrectal en el diagnóstico del CCR
de una muestra líquida obtenida de un individuo, de forma que al
menos se elige una molécula marcador del grupo formado por CEA, CA
19-9, y/o CA 242.
Los diagnósticos reactivos en el campo de los
análisis específicos, como los inmunoanálisis, se encuentran
preferiblemente recogidos en un estuche que comprende el agente de
enlace específico y los reactivos auxiliares requeridos para
realizar el análisis.
La exactitud de una prueba ha sido descrita por
sus características como receptor (ROC) (ver especialmente Zweig,
M.H., y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577). El gráfico ROC es un diseño de todos los
pares de sensibilidad/especificidad resultantes de modificar de
forma continuada el umbral de decisión en todo el intervalo de datos
observado.
El rendimiento clínico de un ensayo de
laboratorio depende de su exactitud diagnóstica, de la habilidad
para clasificar correctamente los individuos en subgrupos
clínicamente relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad
de la prueba para distinguir correctamente dos situaciones distintas
de los individuos analizados. Dichas situaciones son, por ejemplo,
la salud y la enfermedad o la enfermedad benigna frente a la
maligna.
En cada caso, el diagrama ROC refleja el
solapamiento entre las dos distribuciones plasmando la sensibilidad
frente a la 1-especificidad en el umbral completo de
decisión. El eje y representa la sensibilidad o la fracción de
verdaderos positivos (definida como (número de resultados verdaderos
positivos)/ (número de verdaderos positivos + número de falsos
negativos)). Esto se conoce también como la positividad en presencia
de una enfermedad o estado. Se calcula a partir del subgrupo
afectado. En el eje x se representa la fracción positiva falsa o
1-especificidad (definida como ((número de
resultados falsos positivos)/número de verdaderos negativos +
número de falsos positivos)). En un índice de la especificidad y se
calcula totalmente a partir del subgrupo no afectado. Puesto que
las fracciones de verdaderos y falsos positivos se calculan por
separado, usando los resultados del ensayo de dos diferentes
subgrupos, el diagrama ROC es independiente de la prevalencia de la
enfermedad en la muestra. Cada punto del diagrama representa un par
sensibilidad/especificidad que corresponde a un umbral de decisión
en particular. Un ensayo con una discriminación perfecta (sin
solapamiento en las dos distribuciones de resultados) tiene un
diagrama ROC que pasa a través de la esquina superior izquierda,
donde la fracción de verdaderos positivos es 1,0 ó 100%
(sensibilidad perfecta), y la fracción de falsos positivos es 0
(especificidad perfecta). El gráfico teórico para un ensayo sin
discriminación (distribuciones idénticas de resultados de los dos
grupos) es una línea en diagonal de 45º desde el extremo izquierdo
inferior hasta el extremo derecho superior. La mayoría de líneas
caen entre estos dos extremos. (Si la línea ROC se encuentra
completamente por debajo de la diagonal de 45º, esto se soluciona
fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad" de
"mayor a" a "menor que" o viceversa). Cualitativamente,
cuanto más próxima la línea al extremo superior izquierdo, mayor
exactitud global del ensayo.
Un objetivo conveniente para cuantificar la
exactitud diagnóstica de una prueba de laboratorio es expresar su
funcionamiento mediante un único número. La medida global más
frecuente es el área bajo la línea ROC. Por convención, esta área
es siempre >0,5 (si no lo es, se puede invertir la orden de
decisión de hacerlo). Los valores oscilan entre 1,0 (separación
perfecta de los valores de prueba de los dos grupos) y 0,5
(diferencia de distribución no aparente entre los dos grupos de
valores de prueba). El área no depende únicamente de una parte en
particular de la línea como el punto más próximo a la diagonal o la
sensibilidad para una especificidad del 90%, sino que de toda la
línea. Esta es una expresión cuantitativa, descriptiva de la
proximidad de la línea ROC a la perfección (área=1,0).
La utilidad clínica del nuevo marcador PRN3/ILEU
se ha evaluado en comparación y en combinación con el marcador
establecido CEA usando un análisis de la curva del operador receptor
(ROC; Zweig, M.H., y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)
561-577). Este análisis se ha basado en unos grupos
de pacientes bien definidos que constan de 50 muestras cada uno de
pacientes en T1-3; NO; MO, tumor más avanzado, por
ejemplo, T4 y/o diversa gravedad de metástasis (N+ y/o M+), y
controles de salud, respectivamente.
El método diagnóstico basado en la medición de
PRN3/ILEU solo, en comparación con el marcador establecido CEA
solo, ha resultado que tiene una exactitud diagnóstica al menos tan
buena como la demostrada por el área bajo la curva (perfil de
sensibilidad/especificidad).
Figura 1 Identificación del PRN3/ILEU intacto
con un PM aparente de 54 kDa en el tejido con cáncer de colon. La
figura 1 muestra un ejemplo típico de un gel 2D cargado con una
muestra del tumor (lado izquierdo), y un gel, cargado con una
muestra de control (lado derecho) obtenido de la mucosa sana
adyacente. El complejo PRN3/ILEU no se detectaba por el mismo método
en la mucosa sana.
Figura 2 La figura 2 muestra un ejemplo típico
de un análisis de inmunotransferencia. El gel se cargaba con los
lisados tisulares del tejido de cáncer colorrectal y del tejido
adyacente de control sano de 5 pacientes (individuo 22: colon ca,
Dukes B; individuo 23: colon ca, Dukes B; individuo 27:rectum ca,
Dukes B; individuo 29:rectum ca, Dukes A, e individuo 34: colon ca,
Dukes B). La presencia del complejo PRN3-ILEU
(recorte superior) o de PRN3 (recorte inferior) en las muestras se
comprobaba usando un suero anti-ILEU de conejo
policlonal (recorte superior) o un suero anti-PRN3
policlonal (recorte inferior). Las líneas o tiras que contienen
lisados tumorales se indican con una "T", y las que contienen
un tejido de control normal con una "N". Las flechas indican
la posición en los geles del PRN3-ILEU (PM aparente
de -70kDa) y del PRN3 sin formar complejo (PM aparente de -28
kDa).Todas las muestras del tumor daban una señal fuerte en las
posiciones de PRN3-ILEU y PRN3, mientras que
solamente se podía detectar una señal débil o nula en los lisados
del tejido de control normal adyacente.
El peso molecular aparente del complejo de
PRN3-ILEU en este experimento era de aproximadamente
70 kDa y por lo tanto distinto del peso molecular aparente del
complejo de PRN3-ILEU según se determina en los
geles 2D donde se medía un peso molecular aparente de
aproximadamente 54 kDa (ver figura 1). La determinación del peso
molecular aparente en el experimento de inmunotransferencia se
considera como más precisa puesto que en este experimento se
incluye un marcador del peso molecular. Los geles 2D, en contraste,
no contienen un peso molecular estándar y por lo tanto las
estimaciones del peso molecular de una mancha determinada son
claramente menos precisas. El peso molecular del complejo
PRN3-ILEU tal como se determina en el experimento de
inmunotransferencia está bien de acuerdo con el peso molecular
teórico.
- ABTS
- sal de diamonio 2,2'-azino-di-(sulfonato de 3-etilbenzotiazolina (6)
- BSA
- albúmina de suero bovino
- ADNc
- ADN complementario
- CHAPS
- 3-((3-colamidopropil)-dimetilamonio)-1-propano-sulfonato)
- DMSO
- sulfóxido de dimetilo
- DTT
- ditiotreitol
- EDTA
- ácido etilendiaminotetracético
- ELISA
- enzimoinmunoanálisis de absorción
- HRP
- peroxidasa de rábano picante
- IAA
- acetamida de yodo
- IgG
- inmunoglobulina G
- IEF
- enfoque isoeléctrico
- IPG
- gradiente de pH inmovilizado
- LDS
- dodecilsulfato de litio
- MALDI-TOF
- Tiempo de desorción/ionización mediante láser de la espectrometría de masas
- MES
- mesitil, 2, 4,6-trimetilfenilo
- OD
- densidad óptica
- PAGE
- electroforesis en gel de poliacrilamida
- PBS
- solución salina tamponada de fosfato
- PI
- punto isoeléctrico
- RTS
- sistema rápido de traslación
- SDS
- dodecilsulfato sódico
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar las proteínas específicas del
tumor como marcadores potenciales de diagnóstico para el cáncer
colorrectal, se realiza un análisis de tres clases distintas de
tejido usando métodos sobre proteinómica.
En total, se analizan muestras de tejido de 10
pacientes que padecen cáncer colorrectal. De cada paciente se
recogen tres tipos de tejidos diferentes a partir de resecciones
terapéuticas: tejido tumoral (>80% tumor) (T), tejido sano
colindante (N) y tiras de mucosa de mucosa sana colindante (M). Los
dos últimos tipos de tejido sirven de muestras de control sanas.
Los tejidos se cortan y congelan inmediatamente después de la
resección y se almacenan a -80ºC antes de su tratamiento. Los
tumores se diagnostican siguiendo criterios histopatológicos.
\vskip1.000000\baselineskip
0,8-1,2 g de tejido congelado se
colocan en un mortero y completamente congelados por el nitrógeno
líquido. El tejido se pulveriza en el mortero, se disuelve en un
volumen 10 veces mayor (w/v) de tampón de lisis (nitrato sódico 40
mM, MgCl_{2} 5 mM, 1% de genapol X-080, 0,02% de
azida sódica, Complete® EDTA-free (Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Germany, Nr. cat. 1873 580)y posteriormente
se homogenizan en un homogenizador de vidrio Wheaton® (20x ajuste
flojo, 20 x ajuste hermético). 3 ml del homogenizado se someten a
una centrifugación por densidad de sacarosa (10-60%
de sacarosa) durante 1h a 4500 x g. Después de esta etapa de
centrifugación se obtienen tres fracciones. La fracción en la parte
superior del gradiente contiene las proteínas solubles y se utiliza
para un análisis posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el IEF, se mezclan 3 ml de suspensión con
12 ml de tampón de muestra (urea 7M, tiourea 2M, 2% CHAPS, 0,4%
tampón IPG pH 6-9, 0:5% DTT) y se incuban durante 1
hora. Las muestras se concentran en un dispositivo
Amicon®Ultra-15 (Millipore GmbH, Schwalbach,
Alemania) y la concentración de proteínas se determina usando el
análisis proteínico Bio-Rad® (Nr. cat.
500-006; Bio-Rad Laboratories GmbH,
Munich Alemania) siguiendo las instrucciones del manual del
proveedor. A un volumen correspondiente a 1,5 mg de muestra
proteínica se añade tampón hasta un volumen final de 350 \mul.
Esta solución se utiliza para rehidratar las tiras de IPG pH
6-9 (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)
durante la noche. El IEF se realiza usando el siguiente protocolo
del gradiente: 1.) 1 minuto a 500 V; 2.) 2 h a 3500 V; 3.) 22 h a
3500 V constantes lo que da lugar a 82 kVh. Después del IEF, las
tiras se almacenan a -80ºC o se utilizan directamente para el
SDS-PAGE.
Previamente al SDS-PAGE las
tiras se incuban en el tampón de equilibrio (urea 6M, Tris/HCl 50
mM, pH 8,8, 30% de glicerina, 2% de SDS) para la reducción se añade
DTT (15 min. + 50 mg de DTT/10 ml), y para la alquilación IAA (15
min. + 235 mg de acetamida de yodo/10 ml). Las tiras se ponen en
geles de poliacrilamida del 12,5% y se someten a una electroforesis
a 1W/gel durante 1 hora y después a 17W/gel. Posteriormente, los
geles se fijan (50% metanol, 10% acetato) y se colorean durante la
noche con Novex Colloidal Blue Staining kit (Invitrogen, Karlsruhe,
Germany, Cat. nr LC6025, 45-7101).
\vskip1.000000\baselineskip
Cada paciente se analiza por separado mediante
un análisis de la imagen con el software ProteomeWeaver® (Definiens
AG, Alemania, Munich). Adicionalmente, todas las manchas del gel se
recortan mediante un robot y las proteínas presentes en las manchas
son identificadas mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF (Ultraflex^{TM} Tof/Tof, Broker
Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente, se comparan 4
geles de la muestra tumoral con 4 geles de tejido normal adyacente
y de mucosa y se analizan las manchas claras que corresponden a
proteínas expresadas de forma diferente. De este modo, se puede
expresar la proteína PRN3/ILEU de forma específica o bien se
sobreexpresa fuertemente en el tejido tumoral y no se detecta o bien
se expresa menos fuertemente en el tejido de control sano. Por lo
tanto, entre muchas otras proteínas, se destaca como candidato
marcador a utilizar en el diagnóstico del cáncer colorrectal.
El anticuerpo policlonal a la proteína marcador
del cáncer colorrectal PRN3/ILEU es generado para el uso adicional
del anticuerpo en la medición del suero y del plasma y de los
niveles en sangre y heces de PRN3/ILEU, PRN3 total y/o PRN3 no
enlazado mediante ensayos de inmunodetección, por ejemplo la
inmunotransferencia y ELISA.
Para generar anticuerpos al PRN3/ILEU, se
realiza una expresión recombinante de cada proteína para obtener
inmunógenos. La expresión se realiza aplicando una combinación del
sistema de expresión RTS 100 y la E. coli. En una primera
etapa, las secuencias ADN que codifican la PRN3 y el ILEU son
analizadas y se obtienen recomendaciones para las variantes
mutacionales silenciosas del ADNc de alto rendimiento y de las
respectivas secuencias del cebador PCR, usando el sistema
"ProteoExpert RTS E. coli HY". Se trata de un servicio
basado en una web comercial (www.proteoexpert.com). Usando
los pares del cebador recomendados, se emplea el sistema "RTS 100
E. coli Linear Teplate Generation Set,
His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany, Cat. No. 3186237) para generar templados de PCR lineales a
partir del ADNc y para la transcripción in vitro y expresión
de la secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas PRN3 y
ILEU. Para la detección por inmunotransferencia y posterior
purificación, la proteína expresada contiene un
His-tag. Se identifican las mejores variantes de
expresión. Todas las etapas desde la PCR a la expresión y detección
se llevan a cabo conforme a las instrucciones del fabricante. Los
productos PCR respectivos, que contienen todas las regiones
reguladoras T7 necesarias (promotor, lugar de enlace ribosómico y
T7 finalizador) son clonados en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen,
Karlsruhe, Germany, Cat. No K 4300/01) siguiendo las instrucciones
del fabricante. Para la expresión que utiliza las secuencias
reguladoras T7, la construcción se transforma en E. coli BL
21 (DE 3) (Studier, F.W., y cols., Methods Enzymol. 185 (1990)
60-89) y las bacterias transformadas son cultivadas
en un lote para la expresión proteínica. La PRN3 y ILEU se
expresarán por separado.
La purificación de las proteínas de fusión
His-PRN3 y His-ILEU se realiza
siguiendo los procedimientos estándar en una columna de quelato de
níquel. Se realiza la centrifugación y el gránulo celular se
suspende en tampón de lisis que contiene fosfato, pH 8,0, cloruro
de guanidio 7 M, imidazol y tioglicerol, y se homogeniza usando un
Ultra-Turrax®. El material insoluble se granula
mediante centrifugación a elevada velocidad y el sobrenadante se
aplica a una columna cromatográfica de quelato de níquel. La columna
se lava con varios volúmenes de tampón de lisis seguidos de lavados
con tampón, que contiene fosfato, pH 8,0 y urea.
Finalmente, el antígeno enlazado es eluido
usando un tampón de fosfato que contiene SDS en condiciones
ácidas.
Dos grupos de ratones A/J de 12 semanas son
inmunizados inicialmente por vía intraperitoneal, un grupo con 100
\mug de PRN3 y el otro con 100 \mug de ILEU. Al cabo de 6
semanas se producen otras dos inmunizaciones intraperitoneales a
intervalos mensuales. En este proceso cada ratón recibe 100 \mug
de PRN3 o ILEU adsorbidos en hidróxido de aluminio y 10^{9}
gérmenes de Bordetella pertussis. Posteriormente, se llevan a
cabo las dos últimas inmunizaciones por vía intravenosa en el
tercer y el segundo día previos a la fusión usando 100 \mug de
PRN3 o ILEU, respectivamente, en el tampón de PBS para cada uno.
Las células del bazo de los ratones inmunizados
conforme a a) se funden con células de mieloma conforme a Galfre,
G., y Milstein, C., Methods in Enzimology 73
(1981)3-46. En este proceso, aproximadamente
1.10^{8} células del bazo del ratón inmunizado se mezclan con
2x10^{7} células de mieloma
(P3x63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) y se
centrifugan (10 min a 300xg y 4ºC). Luego las células se lavan una
vez con medio RPMI 1640 sin suero fetal bovino (FCS) y se
centrifugan de nuevo a 400 g en un tubo cónico de 50 ml. El
sobrenadanse te descarta, el sedimento celular se suelta suavemente
dando ligeros toques, se añade 1 ml de PEG (peso molecular 4000,
Merck, Darmstadt) y se mezcla pipeteando. Después de 1 minuto en un
baño de agua a 37ºC, se añaden 5 ml de RPMI 1640 sin FCS gota a
gota a temperatura ambiente en un periodo de 4-5
minutos. Después se añaden 5 ml de RPMI 1640 que contienen un 10%
de FCS gota a gota en aproximadamente 1 minuto y se mezclan
intensamente y se enrasa con medio hasta 50 ml (RPMI 1640 + 10%
FCS) y posteriormente se centrifuga durante 10 minutos a 400 g y
4ºC. Las células sedimentadas son absorbidas en el medio RPMI 1640
que contiene un 10% de FCS y cultivadas en el medio de selección de
hipoxantina-azaserina (100 mmol/l de hipoxantina, 1
\mug/ml de azaserina en RPMI 1640 + 10% FCS). Se añade
interleucina 6 a 100 U/ml al medio como un factor de
crecimiento.
Después de aproximadamente 10 días se verifican
los cultivos primarios en busca de anticuerpos específicos. El
anticuerpo monoclonal específico del PRN3 no enlazado es
identificado como reactivo con el PRN3 pero no reactivo con el
PRN3/ILEU. Los cultivos primarios positivos de PRN3 e ILEU son
clonados en placas de cultivo celular de 96 pocillos por medio de
un selector celular activado por fluorescencia. En este proceso se
añade interleucina de nuevo al medio en una proporción de 6 a 100
U/ml como un aditivo de crecimiento.
Las células del hibridoma obtenidas son
cultivadas en una densidad de 1x10^{5} células por ml en un medio
de RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y proliferan durante 7 días
en un fermentador (Thermodux Co., Wertheim/Main, modelo
MCS-104XL, pedido nr. 144-050). En
promedio se obtienen concentraciones de 100 \mug de anticuerpo
monoclonal por ml. La purificación de este anticuerpo del
sobrenadante del cultivo se realiza mediante métodos convencionales
en la química de las proteínas (por ejemplo, conforme a Bruck, C., y
cols., Methods in ENzymology 121 (1986)
587-695).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos grupos de conejos son inmunizados, uno con
PRN3 y otro con ILEU. Para la inmunización, se prepara una emulsión
reciente de la solución proteínica (100 \mug/ml de PRN3 o ILEU,
respectivamente) y adyuvante de Freund completo en el porcentaje de
1:1. Cada conejo es inmunizado con 1 ml de la emulsión los días 1,
7, 14 y 30, 60 y 90. Se extrae la sangre y el suero
anti-PRN3 y anti-ILEU se utiliza
para otros experimentos tal como se describe en los ejemplos 3 a
7.
\vskip1.000000\baselineskip
Un volumen de suero de conejo se diluye con 4
volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). El pH se ajusta a 4,5
con Tris-base 2M. El ácido caprílico (25 \mul /ml
de muestra diluida) se añadirá gota a gota agitando vigorosamente.
Al cabo de 30 minutos, la muestra se centrifuga (13.000 x g, 30 min,
4ºC), se descartan los gránulos y se recoge el sobrenadante. El pH
del sobrenadante se ajusta a 7,5 por la adición de
tris-base 2M y se filtra (0,2 \mum).
La inmunoglobulina en el sobrenadante se
precipita agitando vigorosamente por la adición gota a gota de una
solución de sulfato de amonio 4M hasta una concentración final de
2M. Las inmunoglobulinas precipitadas son recogidas por
centrifugación (8.000 x g, 15 min, 4ºC).
Se descarta el sobrenadante. Los gránulos se
disuelven en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM y se
dializan de forma exhaustiva. El dializado se centrifuga (13.000xg,
15 min, 4ºC) y se filtra (0,2 \mum).
\vskip1.000000\baselineskip
La IgG de conejo policlonal se lleva a 10 mg/ml
en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Se añaden 50
\mul de
Biotina-N-hidroxisuccinimida por ml
de IgG (3,6 mg/ml en DMSO). Después de 30 minutos a temperatura
ambiente, la muestra se cromatografía en Superdex 200
(NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se recoge la fracción
que contiene IgG biotinilado. Los anticuerpos monoclonales son
biotinilados conforme al mismo procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
La IgG de conejo policlonal se lleva a 10 mg/ml
en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Se añaden 50
\mul de éster de
digoxigenina-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico-N-hidroxisuccinimida
(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (3,8
mg/ml en DMSO). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la
muestra se cromatografía en Superdex 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH
7,5, NaCl 30 mM). Se recoge la fracción que contiene IgG
biotinilado. Los anticuerpos monoclonales son marcados con
digoxigenina conforme al mismo procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Los lisados tisulares de muestras de tumor y las
muestras de control sanas se preparaban tal como se ha descrito en
el ejemplo 1, "Preparación tisular".
SDS-PAGE y el ensayo de
inmunotransferencia se llevaban a cabo usando reactivos y equipo de
Invitrogen, Karlsruhe, Germany. Para cada muestra tisular
analizada, se diluían 10 \mug de lisado tisular en tampón de
muestra SDS NuPAGE® reductor (Invitrogen) y se calentaban durante
10 minutos a 95ºC. Las muestras se colocaban en los geles de NuPAGE
4-12% (tris-glicina) en el sistema
tampón circulante MES. La mezcla proteínica separada del gel se
transfería a las membranas de nitrocelulosa usando el módulo XCell
II^{TM} (Invitrogen) y el sistema tampón de transferencia NuPAGE.
Las membranas se lavaban 3 veces en PBS/0,05% Tween 20 y se
bloqueaban con tampón de bloqueo Roti®-Block (A151.1; Carl Roth
GmbH, Karlsruhe, Germany) durante 2h. El suero
anti-PRN3 de conejo policlonal o bien
anti-ILEU de conejo policlonal, anticuerpo primario
(generación descrita en el ejemplo 2) se diluía 1:10.000 en tampón
de bloqueo Roti®-Block y se incubaba con la membrana durante 1 hora.
Las membranas se lavaban 6 veces en PBS/0,05% Tween 20. El
anticuerpo de conejo primario enlazado de forma específica se
marcaba con un anticuerpo de IgG anti-conejo de
oveja policlonal POD-conjugado, y se diluía a 10
mU/ml en tampón de bloqueo 0,5xRoti®-Block. Tras una incubación de
1 hora, las membranas se lavaban 6 veces en PBS/0,5% Tween 20. Para
la detección del anticuerpo anti-conejo
POD-conjugado enlazado, la membrana se incubaba con
el sustrato de transferencia Lumi-Light^{PLUS}
(Pedido nr. 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) y se
exponía a una película autoradiográfica.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de la PRN3 total en suero
humano o plasma, se desarrolla un ELISA con técnica sándwich. Para
la captura y detección del antígeno, se conjugan partes alícuotas de
anticuerpo policlonal anti-PRN3 (ver ejemplo 2) con
biotina y digoxigenina, respectivamente.
Las placas de microvaloración de 96 pocillos
revestidas de estreptavidina se incuban con 100 \mul de anticuerpo
policlonal anti-PRN3 biotinilado durante 60 minutos
a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1%
Tween 20. Tras la incubación, las placas se lavan tres veces con
NaCL al 0,9%, NaCl 0,1% Tween 20. Los pocillos se incuban luego
durante 2 horas con una dilución en serie de la proteína
recombinante (ver ejemplo 2) como antígeno estándar o con muestras
de plasma diluidas de los pacientes. Tras el enlace de PRN3, las
placas se lavan tres veces con NaCl 0,9%, Tween 20 0,1%. Para la
detección específica de la PRN3 total enlazada, los pocillos se
incuban con 100 \mul de anticuerpo policlonal
anti-PRN3 digoxigenilado durante 60 minutos a 10
\mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween
20. Posteriormente, las placas se lavarán tres veces para eliminar
el anticuerpo no ligado. En una siguiente etapa, los pocillos se
incuban con 20 mU/ml de conjugados
anti-digoxigenina-POD (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1633716) durante
60 minutos en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9%NaCl y 0,1% Tween
20. Las placas se lavan seguidamente tres veces con el mismo
tampón. Para la detección de complejos
antígeno-anticuerpo, los pocillos se incuban con
100 \mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany, Catalog No. 11685767) y el DO se mide después de
30-60 minutos a 405 nm con un lector de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
La exactitud se evalúa analizando las muestras
líquidas individuales obtenidas de caracterizar correctamente los
grupos de pacientes, es decir, 50 pacientes a los que se ha
realizado una colonoscopia y en los que se ha observado que no
presentan adenoma de CRC, 50 pacientes diagnosticados y clasificados
como T1-3, N0, M0 de CRC y 50 pacientes
diagnosticados con CRC avanzado, que presentan al menos infiltración
tumoral en al menos un nódulo linfático proximal o formas más
graves de metástasis, respectivamente. La CEA medida como un ensayo
disponible en el comercio (Roche Diagnostics,
CEA-assay (Cat No. 1 173 1629 for Elecsys® Systems
Immunoassay analyzer) y la PRN3 total medida tal como se ha
descrito antes son cuantificadas en un suero obtenido de cada uno
de estos individuos. El análisis ROC se realiza conforme a Zweig,
M.H., y Campbell, supra. La fuerza discriminatoria para
diferenciar pacientes en el grupo T_{is}-3, N0, M0
de individuos sanos medidos en función del área bajo la curva
resulta ser tan buena para la PRN3 total en comparación con el CEA
marcador establecido.
Datos preliminares indican que la PRN3 total
puede ser muy útil en el seguimiento de pacientes después de la
cirugía.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de la PRN3/ILEU en suero
humano o plasma, se desarrolla un ELISA con técnica sándwich. Para
la captura y detección del antígeno, se utilizan anticuerpos
policlonales anti-PRN3 y anti-ILEU,
respectivamente, o viceversa. Para la captura del antígeno, se
conjugan partes alícuotas de anticuerpo policlonal
anti-PRN3 o anticuerpo policlonal
anti-ILEU (ver ejemplo 2) con biotina. Para la
detección del antígeno, se conjugan partes alícuotas de anticuerpo
policlonal anti-PRN3 o anticuerpo policlonal
anti-ILEU (ver ejemplo 2) con digoxigenina.
Las placas de microvaloración de 96 pocillos
revestidas de estreptavidina se incuban con 100 \mul de anticuerpo
policlonal anti-PRN3 o anti-ILEU
biotinilado durante 60 minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH
7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween 20. Tras la incubación, las
placas se lavan tres veces con NaCL al 0,9%, NaCl 0,1% Tween 20.
Los pocillos se incuban luego durante 2 horas con una dilución en
serie de la proteína recombinante (ver ejemplo 2) como antígeno
estándar o con muestras de plasma diluidas de los pacientes. Tras el
enlace del antígeno de referencia PRN3 ó ILEU, las placas se lavan
tres veces con NaCl 0,9%, Tween 20 0,1%. Para la detección
específica de la PRN3/ILEU enlazada, los pocillos se incuban con 100
\mul de anticuerpo policlonal anti-PRN3 o
anti-ILEU digoxigenilado durante 60 minutos a 10
\mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9% NaCl y 0,1% Tween
20. Posteriormente, las placas se lavarán tres veces para eliminar
el anticuerpo no ligado. En una siguiente etapa, los pocillos se
incuban con 20 mU/ml de conjugados
anti-digoxigenina-POD (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1633716) durante
60 minutos en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% BSA, 0,9%NaCl y 0,1% Tween
20. Las placas se lavan seguidamente tres veces con el mismo tampón.
Para la detección de complejos antígeno-anticuerpo,
los pocillos se incuban con 100 \mul de solución de ABTS (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 11685767) y el DO
se mide después de 30-60 minutos a 405 nm con un
lector de ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
La exactitud se evalúa analizando las muestras
líquidas individuales obtenidas de caracterizar correctamente los
grupos de pacientes, es decir, 50 pacientes a los que se ha
realizado una colonoscopia y en los que se ha observado que no
presentan adenoma de CRC, 50 pacientes diagnosticados y clasificados
como T1-3, N0, M0 de CRC y 50 pacientes
diagnosticados con CRC avanzado, que presentan al menos infiltración
tumoral en al menos un nódulo linfático proximal o formas más
graves de metástasis, respectivamente. La CEA medida como un ensayo
disponible en el comercio (Roche Diagnostics,
CEA-assay (Cat No. 1 173 1629 for Elecsys® Systems
Immunoassay analyzer) y la PRN3 total medida tal como se ha
descrito antes son cuantificadas en un suero obtenido de cada uno
de estos individuos. El análisis ROC se realiza conforme a Zweig,
M.H., y Campbell, supra. La fuerza discriminatoria para
diferenciar pacientes en el grupo T_{is}-3, N0, M0
de individuos sanos medidos en función del área bajo la curva
resulta ser tan buena para la PRN3 total en comparación con el CEA
marcador establecido.
Datos preliminares indican que la PRN3/ILEU
puede ser muy útil en el seguimiento de pacientes después de la
cirugía.
<110> Roche Diagnostics GmbH F.
Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de PRN3/ILEU como marcador del
cáncer colorrectal
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21821
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 0301 15695.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-07-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión paciente 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 256
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteinasa leucocitaria 3, sinónimo
a mieloblastina (precursor)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inhibidor de la elastasa
leucocitaria
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (9)
1. Un método para el diagnóstico del cáncer
colorrectal (=CRC=) que comprende las etapas de
a) aporte de una muestra líquida obtenida de un
individuo
b) puesta en contacto de dicha muestra con un
aglutinante específico para la proteinasa 3(PRN3) y un
segundo aglutinante específico para el inhibidor de elastasa
leucocitaria inhibidora de la proteinasa tipo serina (ILEU) en unas
condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho
primer aglutinante y el segundo aglutinante y PRN3 enlazada a ILEU
(PRN3/ILEU), y
c) correlación de la cantidad de complejo
formado en b) para el diagnóstico del cáncer colorrectal.
2. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza además porque dicha muestra es suero.
3. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza además porque dicha muestra es plasma.
4. El método conforme a la reivindicación 1, que
se caracteriza además porque dicha muestra es sangre
entera.
5. Uso de PRN3/ILEU como una molécula marcador
en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida
obtenida de un individuo.
6. Uso de PRN3/ILEU como una molécula marcador
en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida
obtenida de un individuo.
7. Uso conforme a la reivindicación 6, donde el
diagnóstico prematuro se realiza con muestras procedentes de
pacientes con CRC en la fase del adenoma.
8. Uso conforme a la reivindicación 6, donde el
diagnóstico prematuro se realiza con muestras procedentes de
pacientes con CRC en la etapa T_{is}-3; N0;
M0.
9. Uso de PRN3/ILEU como una molécula marcador
para el cáncer colorrectal en combinación con otra molécula marcador
para el cáncer colorrectal en el diagnóstico del cáncer colorrectal
de una muestra líquida obtenida de un individuo.
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