ES2318318T3

ES2318318T3 - Uso de la proteina spee /espermidina sintasa) como marcador en el cancer colorectal.

Info

Publication number: ES2318318T3
Application number: ES04763899T
Authority: ES
Inventors: Michael Tacke; Peter Berndt; Marie-Luise Hagmann; Johann Karl; Hanno Langen; Stefan Palme; Markus Roessler; Wolfgang Rollinger; Werner Zolg
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2024-08-06
Also published as: ATE418737T1; US20060188950A1; EP1654542A1; DE602004018650D1; EP1654542B1; WO2005015231A1

Abstract

Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende las etapas de (a) aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo, (b) puesta en contacto de dicha muestra con un agente de fijación específico para la espermidina sintasa (=SPEE) en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho aglutinante y la SPEE, y (c) correlacionar la cantidad de complejo formada en (b) respecto al diagnóstico de cáncer colorrectal.

Description

Uso de la proteína SPEE (espermidina sintasa) como marcador en el cáncer colorrectal.

La presente invención se refiere al diagnóstico del cáncer colorrectal. Revela el uso de la espermidina sintasa (=SPEE) en el diagnóstico del cáncer colorrectal. Además, se refiere especialmente a un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de una muestra líquida, procedente de un individuo midiendo la SPEE en dicha muestra. La medición de la SPEE puede ser utilizada, por ejemplo, en la detección prematura o el diagnóstico del cáncer colorrectal.

El cáncer sigue siendo un reto importante en la salud pública a pesar de los avances en la detección y la terapia. Entre los diversos tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (=CRC) es uno de los cánceres más frecuentes en el mundo occidental.

El cáncer prematuro puede ser detectado/diagnosticado, lo mejor es el índice de supervivencia global. Esto es especialmente cierto para el cáncer colorrectal. El pronóstico en estados avanzados del tumor es pobre. Más de una tercera parte de los pacientes morirá de una enfermedad progresiva en los cinco años posteriores al diagnóstico, lo que corresponde a un índice de supervivencia del 40% para cinco años. El tratamiento habitual solamente cura una parte de los pacientes y tiene claramente el mejor efecto en aquellos pacientes diagnosticados en un estado prematuro de la enfermedad.

Con respecto al cáncer colorrectal como problema de salud pública, resulta esencial que se desarrollen unas medidas más eficaces de exploración y de prevención.

Los procedimientos de detección prematura disponibles en la actualidad para el cáncer colorrectal implican el uso de análisis de la sangre fecal o bien de procedimientos endoscópicos. Sin embargo, debe existir un tamaño significativo del tumor antes de que se detecte sangre fecal. La sensibilidad de los análisis o pruebas de sangre oculta en heces es de aproximadamente un 26%, lo que significa que queda un 74% de pacientes con lesiones malignas por detectar (Ahlquist, D.A., Gastroenterol. Clin. North Am.26(1997)41-55). La visualización de las lesiones cancerosas y precancerosas representa el mejor método para la detección prematura, pero la colonoscopia invasiva con un coste, unos riesgos y complicaciones significativas (Silvis, S.E., y cols., JAMA 235(1976)928-930; Geenen, J.E., y cols., Am. J. Dig. Dis. 20(1975) 231-235; Anderson, W.F., y cols., J. Natl. Caner Institute 94(2002) 1126-1133).

Recientemente se tiene información sobre una cantidad tremenda de los llamados genes específicos del colon o incluso de los llamados genes específicos del cáncer colorrectal. La gran mayoría de los informes de investigación correspondientes o de las solicitudes de patentes se basan en datos obtenidos por análisis de los modelos de expresión del ARN en el tejido (cáncer) del colon frente a un tejido diferente o bien un tejido normal adyacente, respectivamente. Dichos métodos pueden resumirse como técnicas diferenciales de visualización del ARNm.

Como un ejemplo de los datos disponibles de las técnicas de visualización del ARNm, se menciona y comenta la solicitud WO 01/96390. Esta solicitud describe y reivindica más de doscientos polinucleótidos aislados y los polipéptidos correspondientes como tal, así como su uso en la detección del cáncer colorrectal. Sin embargo, se sabe en general que las diferencias en el nivel del ARNm no son reflejadas por el nivel de las correspondientes proteínas. Una proteína codificada por un ARNm raro se puede hallar en cantidades muy elevadas y una proteína codificada por un ARNm abundante puede ser difícil de detectar y de hallar. Esta falta de correlación entre el nivel de ARNm y el de proteínas se debe a motivos como la estabilidad del ARNm, la eficacia de la transferencia, la estabilidad de la proteína, etc.

Existen también métodos recientes que investigan las diferencias en los modelos de proteínas entre los diferentes tejidos o entre el tejido sano y el tejido enfermo con el fin de identificar las moléculas del marcador apropiado que se podría utilizar en el diagnóstico del cáncer colorrectal. Brünagel, G., y cols., Cancer Research 62(2002)2437-2442 han identificado siete proteínas de matriz nuclear que son más abundantes en el tejido del CRC en comparación con el tejido normal adyacente. No se tienen datos de muestras líquidas obtenidas de un individuo.

La WO 02/078636 informa sobre nueve manchas asociadas al cáncer colorrectal como resultado de la desorción e ionización (SELDI) por láser. Estas manchas se pueden ver más frecuentemente en los sueros obtenidos de los pacientes con cáncer colorrectal en comparación con los sueros obtenidos de controles sanos. Sin embargo, se desconoce la identidad de la(s) molécula(s) comprendida(s) en dicha mancha, por ejemplo, su secuencia.

A pesar de la lista cada vez mayor de marcadores de proteínas en el campo del cáncer colorrectal, se desconoce hasta la fecha la utilidad clínico/diagnóstica de estas moléculas. Para ser de utilidad clínica un nuevo marcador diagnóstico como marcador individual debería ser al menos tan bueno como el mejor marcado conocido hasta el momento. O bien un marcador nuevo debería conducir a un avance en la sensibilidad y/o especificidad diagnóstica tanto si se utilizara solo o en combinación con uno o más marcadores, respectivamente. La sensibilidad y/o especificidad diagnóstica de una prueba es valorada por sus características receptoras /de funcionamiento, que se indicarán con detalle a continuación.

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En la actualidad, solamente se dispone de pruebas diagnósticas en sangre sobre la detección del antígeno carcinoembriónico (CEA), una glucoproteína asociada al tumor, que ayuden al diagnóstico en el campo del cáncer colorrectal. La CEA está elevada en el 95% de las muestras tisulares obtenidas de pacientes con cánceres pancreáticos, gástricos y colorrectales y en la mayoría de carcinomas de pecho, pulmón, cabeza y cuello (Goldenberg, D.M., y cols. J. Natl. Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22). También existe información sobre niveles elevados de CEA en pacientes con enfermedades no malignas, y muchos pacientes con cáncer colorrectal tienen niveles de CEA normales en el suero, especialmente durante la etapa prematura de la enfermedad (Carriquiry, L.A., y Pineyro, A., Dis. Colon Rectum 42(1999)921-929; Herrera, M.A:, y cols., Ann. Surg.183(1976)5-9; Wanebo, H.J., y cols., N. Engl. J. Med. 299(1978) 448-451). La utilidad de la CEA medida en suero o plasma para detectar recaídas resulta ser controvertida y todavía se tiene aplicar a mayor escala (Martell, R.E., y cols., Int. J. Biol. Markers 13(1998)145-149; Moertel, C.G., y cols., JAMA 270(1993)943-947).

A la luz de los datos disponibles, la determinación de CEA en suero no posee ni la sensibilidad ni la especificidad para permitir su uso como una prueba de detección para el cáncer colorrectal en la población asintomática (Reynoso, G., y cols., JAMA 220 (1972)363-365; Sturgeon, C., Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159).

La sangre entera, el suero o el plasma son las fuentes de muestras más ampliamente utilizadas en la rutina clínica. La identificación de un marcador de tumor de cáncer colorrectal prematuro que permita la detección fiable de cáncer o aporte una información precoz podría llevar a una valoración diagnóstica que ayudaría enormemente en el diagnóstico y en el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad clínica imperiosa de mejorar el diagnóstico del cáncer colorrectal a partir de la sangre. Es especialmente importante mejorar el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal, puesto que para los pacientes diagnosticados a tiempo las posibilidades de supervivencia son mucho mayores si se compara con los diagnosticas en una etapa avanzada de la enfermedad.

La presente invención tenía el cometido de investigar si se puede identificar un marcador nuevo que pueda ayudar en el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Sorprendentemente, se ha descubierto que el uso de la proteína SPEE puede superar al menos parcialmente los problemas ya conocidos de la situación actual.

La presente invención se refiere por tanto a un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende las etapas de a) aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo, b) puesta en contacto de dicha muestra con un aglutinante específico para SPEE en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho aglutinante y el SPEE, y c) correlación de la cantidad de complejo formada en (b) para el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Otra configuración preferida de la invención es un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende las etapas de a) puesta en contacto de una muestra líquida obtenida de un individuo con un aglutinante específico para SPEE en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho agente aglutinante y el SPEE, y b) correlación de la cantidad de complejo formada en (a) para el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Como apreciará el experto en el tema, cualquiera de dichos diagnósticos se realiza in vitro. Luego se tira la muestra del paciente. La muestra del paciente se utiliza meramente para el método diagnóstico in vitro de la invención y el material de la muestra del paciente no es transferida de vuelta al cuerpo del paciente. Típicamente, la muestra suele ser líquida.

La proteína SPEE (espermidina sintasa; SWISS-PROT:P19623) se caracteriza por la secuencia dada en SEQ ID NO:1. El ADNc humano clonado correspondiente codifica una proteína 34-kDa que es un miembro de la familia de la espermidina/espermina sintasa. La estructura básica del ADNc así como la localización cromosómica de los genes se resolvió al principio de los noventa (Wahlfors, J., y cols., DNA Cell Biol.9 (1990)103-110; Wahlfors, J., y cols., DNA Cell Biol. 9(1990)543; Myohanen, S., y cols., DNA Cell Biol. 10(1991)467-474; Wingqvist y cols., Cytogenet. Cell. Genet. 58(1991)1865). La SPEE es una de las cuatro proteínas que están implicadas en la biosíntesis de las poliaminas y cataliza la reacción de la S-adenosilmetioninamina + putrescina a 5'-metiltioadenosina + espermidina, la última etapa en la biosíntesis de la espermidina.

Las poliaminas (por ejemplo, putrescina, espermita, espermidina) son esenciales universalmente para varias funciones celulares (Tabor, C.W., y Tabor, H., Annu. Rev. Biochem. 53(1984)749-790; Janne, J., y cols., Ann. Med.23(1991) 241-259). Informes previos ya han descrito que las actividades enzimáticas de la SPEE y de otras enzimas implicadas en la biosíntesis de las poliamina aumentaban durante la proliferación celular (Hannonen, P., y cols., Biochim. Biophys. Acta 273 (1972)84-90; Kapyaho, K., y cols., Biochem.J. 192 (1980)59-63; Korpela, J., y cols. Biochem. J. 196 (1981)733-738) y es un hecho hace tiempo conocido el que los niveles de poliaminas intracelulares crecen en el tejido maligno en comparación con los controles sanos (Scalabrino, G., y Ferioli, M.E., Adv, Cancer Res. 35(1981)151-268). El trabajo más reciente revelaba que los niveles intracelulares de poliamina en el adenocarcinoma colorrectal humano se correlacionan con la fase del tumor (Weiss, T.S., y cols., Int.J.Colorectal Dis. 17 (2002) 381-387) y tienen un valor pronóstico (Linsalata, M., y cols., Anticancer Res. 22 (2002) 2465-2469).

Como consecuencia de ello, existe un número de inhibidores de la actividad de la SPEE, como el sulfato de diciclohexilamonio (Ito, H., y cols., Cancer Lett.15 (1982)229-235; Feuerstein, B.G., y cols., Cancer Res. 45(1985)4950-4954), la metil-tiopropilamina (Hibasami, H., y cols., Anticancer Res./(1987)1213-1216) y la mercaptoetilamina (Hibasami, H., y cols., FEBS Lett.229(1988)243-246) que se ha informado que presentan un efecto que retarda el crecimiento en las células tumorales.

Nishikawa y cols. realizaron análisis de transferencia para demostrar que la expresión del gene codificador de la SPEE resulta inhibida en las células del hematoma por el factor de crecimiento transformador \beta_{1} (TGF-\beta_{1})(Nishikawa, Y., et al., Biochem.J.321(1997)537-543).

Luk, G.D., y cols. Gastroenterology 94/5(1988)A272, han utilizado seis estirpes celulares de carcinoma de colon humano y han investigado las poliaminas en comparación con el estado diferenciador de las diversas estirpes celulares. Loeser, C., y cols., Cancer 65(1990)958-966, han investigado las poliaminas en el cáncer de colon y han evaluado el nivel de las diversas poliaminas en el tejido de colon, el suero y la orina, respectivamente.

Resulta obvio para el experto que la presente invención no haya sido realizada para limitarse a la proteína de longitud larga SPEE de SEQ ID NO: 1. Los fragmentos fisiológicos o artificiales de la SPEE, las modificaciones secundarias de la SPEE así como los variantes alélicos de las SPEE son también abarcadas por la presente invención. Los fragmentos artificiales abarcan preferiblemente un péptido producido sintéticamente o siguiendo técnicas recombinantes, que al menos comprende un epítopo de interés diagnóstico formado por al menos 6 aminoácidos contiguos derivados de la secuencia revelada en SEQ ID NO:1. Dicho fragmento puede ser utilizado ventajosamente para la generación de anticuerpos o como un estándar en un inmunoanálisis. El fragmento artificial comprende al menos dos epítopos de interés apropiados para llevar a cabo un inmunoanálisis en sándwich.

En las configuraciones preferidas, el marcador nuevo SPEE se puede usar para controlar así como para fines de exploración.

Cuando se utiliza en el control de pacientes, el método diagnóstico conforme a la presente invención puede ayudar a evaluar la carga tumoral, la eficacia del tratamiento y la recurrencia del tumor en el seguimiento de los pacientes. Los niveles elevados de SPEE se correlacionan directamente con la carga tumoral. Después de la quimioterapia, un aumento a corto plazo (pocas horas hasta 14 días) en el SPEE puede servir como un indicador de la muerte de células tumorales. En el seguimiento de los pacientes (de 3 meses a 10 años) se puede usar un aumento del SPEE como indicador de la recurrencia del tumor.

En una configuración preferida el método diagnóstico conforme a la presente invención se utiliza para fines de exploración o detección. Se utiliza para evaluar los individuos sin un diagnóstico previo del cáncer colorrectal midiendo el nivel de SPEE y correlacionando el nivel medido respecto a la presencia o ausencia del cáncer colorrectal.

El cáncer colorrectal avanza con frecuencia de adenomas (pólipos) a carcinomas malignos. Los diferentes estadios de CRC se solían clasificar conforme a los estadios A a D de Dukes.

La estatificación del cáncer es la clasificación de la enfermedad en cuanto a su extensión, avance y gravedad. Agrupa pacientes con cáncer de manera que se pueden hacer generalizaciones sobre el pronóstico y la elección de la terapia.

Actualmente, el sistema TNM es la clasificación utilizada mayoritariamente de la extensión anatómica del cáncer. Representa un sistema de estadificación uniforme, aceptado internacionalmente. Existen tres variables básicas: T (la extensión del tumor básico), N(el estado de los nódulos linfáticos regionales) y M(la presencia o ausencia de metástasis a distancia). Los criterios del TNM han sido publicados por la UICC (Internacional Union Against Cancer) (Sobón, L.H., Wittekind, Ch.(eds): TNM Classification of Malignant Tumours, quinta edición, 1997).

Lo que es especialmente importante es que el diagnóstico prematuro del cáncer colorrectal se traduzca en un pronóstico más favorable. Los tumores malignos surgen de los tumores benignos, es decir, del adenoma. Por lo tanto, los mejores pronósticos son diagnosticados en aquellos pacientes que están en la etapa del adenoma. Los pacientes diagnosticados como en la etapa T_{is}, NO, MO ó T1-3; NO; MO, si son tratados de forma apropiada tienen una posibilidad superior al 90% de supervivencia 5 años después del diagnóstico, si se compara con un índice de supervivencia a los 5 años de solamente el 10% para los pacientes que son diagnosticados cuando las metástasis a distancia ya se encuentran presentes.

En el sentido de la presente invención, el diagnóstico prematuro del cáncer colorrectal se refiere a un diagnóstico en un estado pre-maligno (adenoma) o en un estado tumoral donde no existe metástasis (ni proximal ni distal), es decir, T_{is}, NO, M0 ó T1-4;N0;M0 están presentes. T_{is} indica un carcinoma in situ.

En una configuración preferida la SPEE se utiliza para diagnosticar el cáncer colorrectal tan pronto como en la etapa del adenoma.

Además se prefiere que el CRC sea diagnosticado cuando no ha crecido totalmente a través de la pared intestinal y por consiguiente no se ha perforado ni el peritoneo visceral ni otros órganos o estructuras han sido invadidas, es decir, que el diagnóstico se realiza en la etapa T_{is}, N0, M0 ó T1-3;N0;M0(=T_{is}-3;N0;M0).

El método diagnóstico conforme a la presente invención se basa en una muestra líquida que procede de un individuo. A diferencia de los métodos conocidos, la SPEE se mide de forma específica en esta muestra líquida usando un aglutinante específico.

Un aglutinante específico es, por ejemplo, un receptor de SPEE, una lectina que se enlaza a la SPEE o un anticuerpo a la SPEE. El aglutinante específico tiene preferiblemente una afinidad de 10^{8} l/mol o incluso superior de 10^{9} l/mol por su molécula de referencia. Como apreciará el experto en la materia el término específico se utiliza para indicar que otras biomoléculas presentes en la muestra no se enlazan de forma significativa al aglutinante específico para la SPEE. Preferiblemente, el nivel de enlace a una biomolécula diferente de la molécula de referencia da lugar a una afinidad de enlace que es meramente del 10%, más preferiblemente sólo del 5% de la afinidad de la molécula de referencia o bien inferior. El agente aglutinante específico preferido es el que cumple ambos criterios, tanto el de afinidad como el de especificidad.

Un aglutinante específico preferido es un anticuerpo reactivo con la SPEE. El término anticuerpo se refiere a un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, fragmentos de dichos anticuerpos, así como a construcciones genéticas que comprenden el dominio aglutinante de un anticuerpo.

También se puede usar cualquier fragmento de anticuerpo que tenga los criterios mencionados de un aglutinante específico. Los anticuerpos son generados mediante procedimientos de vanguardia, por ejemplo, tal como se describen en Tijssen (Tijssen,P., Practice and theory of enzyme immnumoassays 11(1990) en todo el libro especialmente en las páginas 43-78; Elsevier, Ámsterdam). Además, el experto conoce perfectamente los métodos basados en inmunoadsorbentes que se pueden utilizar para el aislamiento específico de anticuerpos. Con estos medios se puede incrementar la cali-
dad de los anticuerpos policlonales y de ahí su rendimiento en los inmunoanálisis (Tijssen, P., supra, páginas 108-115).

Para los logros obtenidos en la actual invención se han utilizado anticuerpos monoclonales y policlonales. Los anticuerpos policlonales se han conseguido en conejos. Sin embargo, también se han obtenido anticuerpos policlonales de diferentes especies, por ejemplo, ratas o cobayas. Los anticuerpos monoclonales se han fabricado usando células de bazo de ratones inmunizados. Puesto que se pueden producir anticuerpos monoclonales en cualquier cantidad con unas propiedades constantes, representan unas herramientas ideales en el desarrollo de un ensayo para la rutina clínica. La generación y el uso de anticuerpos monoclonales contra la SPEE en un método conforme a la presente invención es otra de las configuraciones preferidas.

Como apreciará ahora el experto en la materia que la SPEE se ha identificado como un marcador útil en el diagnóstico del CRC, se pueden usar caminos alternativos para llegar a un resultado comparable a los logros de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar estrategias alternativas para generar anticuerpos. Dichas estrategias comprenden entre otras cosas el uso de péptidos sintéticos, lo que representa un epítopo de la SPEE para la inmunización. Alternativamente se puede utilizar la inmunización del ADN, conocida también como vacunación del ADN.

Para la medición, la muestra líquida obtenida de un individuo se incuba con el aglutinante específico para la SPEE en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo de SPEE aglutinante. No es preciso especificar dichas condiciones puesto que el experto sin esfuerzo inventivo alguno puede identificar fácilmente las propiedades de incubación apropiadas.

Como una etapa final conforme al método divulgado en la presente invención se mide la cantidad de complejo y se correlaciona con el diagnóstico del cáncer colorrectal. Como apreciará el especialista existen numerosos métodos para medir la cantidad de complejo-aglutinante específico de SPEE, todos ellos descritos con detalle en relevantes libros de texto (por ejemplo, Tijssen P., supra, o Diamandis y cols., eds.(1996) Immunoassay, Academic Press, Boston).

Preferiblemente la SPEE se detecta en un formato de análisis tipo sándwich. En dicho análisis se utiliza un primer aglutinante específico para capturar la SPEE por un lado y se utiliza un segundo aglutinante específico que se marca para ser detectado directa o indirectamente por otro lado.

Tal como se ha mencionado antes, se ha descubierto sorprendentemente que la SPEE se puede medir a partir de una muestra líquida obtenida de una muestra individual. No se requiere ninguna muestra tisular o de biopsia para aplicar la SPEE en el diagnóstico del cáncer colorrectal.

En una configuración preferida, el método conforme a la presente invención se prueba con suero como material de muestra líquido.

En otra configuración preferida, el método conforme a la presente invención se prueba con plasma como material de muestra líquido.

En otra configuración preferida, el método conforme a la presente invención se prueba con sangre entera como material de muestra líquido.

Además las heces se pueden preparar de diversas formas bien conocidas por el experto para obtener así una muestra líquida. Dicha muestra líquida derivada de las heces representa asimismo una configuración preferida conforme a la presente invención.

Mientras que la aplicación de métodos rutinarios proteinómicos a las muestras tisulares conduce a la identificación de muchos candidatos marcadores potenciales para el tejido elegido, sorprendentemente los inventores de la presente invención han sido capaces de detectar la proteína SPEE en una muestra de fluido corporal. Todavía más sorprendentemente, han sido capaces de demostrar que la presencia de la SPEE en dicha muestra líquida obtenida de un individuo puede correlacionarse con el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Los anticuerpos contra la SPEE se pueden utilizar con gran ventaja en procedimientos establecidos, por ejemplo, para detectar células de cáncer colorrectal in situ, en biopsias, o en procedimientos inmunohistológicos.

Preferiblemente, un anticuerpo contra la SPEE se utiliza en un inmunoanálisis cualitativo (SPEE presente o ausente) o cuantitativo (se determina la cantidad de SPEE).

El medir el nivel de SPEE proteínico ha demostrado ser una gran ventaja en el campo del cáncer colorrectal. Por lo tanto, en otra configuración preferida, la presente invención se refiere al uso de SPEE proteínica como molécula marcador en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida obtenida de un individuo.

El término molécula marcador se utiliza para indicar que un nivel elevado de la SPEE analito medido a partir de un líquido corporal de un individuo indica la presencia de cáncer colorrectal.

Se prefiere especialmente el uso de SPEE marcador nuevo en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal.

El uso de la SPEE proteínica propiamente representa un avance significativo hacia el campo desafiante del diagnóstico del cáncer colorrectal. El combinar las mediciones de la SPEE con otros marcadores conocidos, como CEA, o con otros marcadores del cáncer colorrectal todavía por descubrir, lleva a mejoras adicionales. Por lo tanto en otra configuración preferida la presente invención se refiere al uso de la SPEE como una molécula marcador para el cáncer colorrectal en combinación con una o más moléculas marcador para el cáncer colorrectal en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida obtenida de un individuo. A este respecto, la expresión "uno o más" equivale a 1 a 10, preferiblemente 1 a 5, más preferiblemente 3. Otros marcadores del cáncer colorrectal preferidos con los cuales se puede combinar la medición del SPEE son el CEA y CA 19-9, CA 72-4 y/o CA 242. Así pues, una configuración muy especialmente preferida de la presente invención es el uso de la proteína SPEE como una molécula marcador para el cáncer colorrectal en combinación con una o más moléculas marcador para el cáncer colorrectal en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida obtenida de un individuo, donde se elige al menos otra molécula marcador del grupo formado por la CEA, CA 19-9, CA 72-4 y CA 242. Lo más preferible es utilizar la proteína SPEE en combinación con la CEA.

La exactitud de una prueba se describe mejor por medio de sus características operativas receptoras (ROC) (ver especialmente Zweig, M...H., y Campbell, G. Clin. Chem. 39(1993)561-577). El gráfico ROC es una línea de todos los pares de sensibilidad/especificidad resultantes de modificar de forma continuada el umbral de decisión en la gama completa de datos observados.

El rendimiento clínico de una prueba de laboratorio depende de su exactitud diagnóstica o de la capacidad para clasificar correctamente los individuos en subgrupos relevantes desde el punto de vista clínico. La exactitud diagnóstica mide la capacidad de la prueba para distinguir correctamente dos condiciones distintas de los individuos investigados. Dichas condiciones son por ejemplo la salud y la enfermedad o bien la enfermedad benigna frente al cáncer.

En cada caso, la línea ROC representa el solapamiento entre las dos distribuciones trazando la sensibilidad frente a la especificidad 1 para la gama completa de umbrales de decisión. En el eje y es la sensibilidad, o la fracción verdadera positiva (definida como (número de resultados de de la prueba verdaderos-positivos) (número de resultados de la prueba verdaderos-positivos + falsos-negativos)). A esto se le llama también positividad en la presencia de una enfermedad o estado. Se calcula meramente del subgrupo afectado. En el eje x está la fracción falsa-positiva o bien la especificidad 1 (definida como (el número de resultados falsos-positivos) / (número de resultados verdaderos-negativos + número de resultados falsos-positivos)). Se trata de un índice de especificidad y se calcula íntegramente del subgrupo no afectado. Debido a que las fracciones de verdaderos y falsos positivos se calculan totalmente por separado, al utilizar los resultados de la prueba de dos subgrupos diferentes, la línea ROC resulta independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto en la línea ROC representa un par de sensibilidad/especificidad que corresponde a un umbral de decisión especial. Una prueba con discriminación perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados) tiene una línea ROC que atraviesa el extremo izquierdo superior, donde la fracción verdadera-positiva es 1,0 o del 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción falsa-positiva es 0 (especificidad perfecta). La línea teórica para una prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45º desde el extremo izquierdo inferior al extremo derecho superior. La mayoría de líneas caen entre estos dos extremos. (Si la línea ROC cae completamente por debajo de la diagonal de 45º, esto se soluciona fácilmente invirtiendo el criterio para "positividad" de "más de" a "menos de" o viceversa). Cualitativamente, cuanto más próxima está la línea al extremo superior izquierdo, mayor es la exactitud global de la prueba.

Un objetivo conveniente para cuantificar la exactitud diagnóstica de una prueba de laboratorio es expresar su rendimiento con un solo número. La medida global más común es el área bajo la línea ROC. La costumbre es que esta área sea siempre \geq0,5 (en caso de que no lo sea, uno puede invertir la decisión para hacerlo así). Los valores oscilan entre 1,0 (separación perfecta de los valores de ensayo de los dos grupos) y 0,5 (no existe diferencia aparente en la distribución entre los dos grupos de valores de prueba). El área no depende solamente de una parte especial de la línea como el punto más próximo a la diagonal o bien la sensibilidad para una especificidad del 90%, sino que de toda la línea. Esta es una expresión cuantitativa, descriptiva de lo próxima que se encuentra la línea ROC a la perfecta (área=1,0).

La utilidad clínica del marcador nuevo SPEE ha sido evaluada en comparación frente y en combinación con el marcador establecido CA 15-3 usando un análisis de la curva del operador receptor (ROC; Zweig, M.H., y Campbell, G., Clin.Chem. 39(1993)561-557). Este análisis se ha basado en grupos de pacientes bien definidos y consta de 50 muestras de cada uno de los pacientes en T1-3; NO; MO, tumor más avanzado, es decir T4 y/o varios grados de metástasis (N+ y/o M+) y controles de salud, respectivamente.

Descripción de las figuras

Figura 1 Identificación de la SPEE con un peso molecular aparente de 34 kDa y un punto isoeléctrico a un pH 5 (superior) en el tejido del tumor de colon. La figura 1 muestra un ejemplo típico de un gel 2D, cargado de una muestra tumoral (lado izquierdo), y un gel cargado con una muestra de control comparable (lado derecho), obtenida de la mucosa sana adyacente. El círculo en la sección alargada de estos geles indica la posición de la proteína SPEE. Usando el mismo método esta proteína no ha sido detectada en mucosa sana.

Figura 2 Ejemplo típico de un coágulo por inmunotransferencia. El gel de poliacrilamida se cargaba con lisados de tejido del tejido tumoral colorrectal y de tejido de control sano adyacente de 4 pacientes (individuo 4:colon ca (carcinoma), Dukes C; individuo 7: colon ca, Dukes C; individuo 13; colon ca, Dukes B; e individuo 14: colon ca, Dukes B) y después de la electroforesis las proteínas se transferían a una membrana de nitrocelulosa. La presencia de SPEE en las muestras se verificaba usando un suero anti-SPEE de conejo policlonal. La flecha indica la posición en el gel de la banda de la SPEE. Todas las muestras tumorales dan una señal fuerte en la posición de la SPEE, mientras que solamente se puede detectar una señal débil en los lisados del tejido de control normal adyacente.

Abreviaciones

ABTS: sal de diamonio de 2,2'-Azino-di-[3-etilbenzo-tiazolinsulfonato(6)]

BSA: albúmina de suero bovina

cADN: ADN complementario

CHAPS: (3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propano-sulfonato)

DMSO: sulfóxido de dimetilo

DTT: ditiotreitol

EDTA: ácido etilendiaminotetracético

ELISA: enzimoinmunoanálisis de adsorción

HRP: peroxidasa de rábano

IAA: acetamida de yodo

IgG: inmunoglobulina G

IEF: enfoque isoeléctrico

IPG: gradiente de pH inmovilizado

LDS: dodecilsulfato de litio

MALDI-TOF: tiempo de ionización/desorción asistido por láser de la espectrometría de masa

MES: mesitil, 2, 4,6-trimetilfenilo

OD: densidad óptica

PAGE: electroforesis de gel de poliacrilamida

PBS: solución salina tamponada de fosfato

PI: punto isoeléctrico

RTS: sistema de traslación rápido

SDS: dodecilsulfato sódico

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Ejemplo 1 Identificación de la SPEE como un marcador potencial del cáncer colorrectal Fuentes del tejido

Para identificar las proteínas específicas de los tumores como potenciales marcadores diagnósticos para el cáncer colorrectal, se ha realizado el análisis de tres clases diferentes de tejido usando métodos proteinómicos.

En total, se han analizado muestras de tejido de 14 pacientes que padecen cáncer colorrectal. De cada paciente se han recogido dos tipos diferentes de tejido de las resecciones terapéuticas: Tejido tumoral (>80% de tumor) (T), y tejido sano adyacente (N). Este último tipo de tejido sirve de muestra de control sana comparativa. Los tejidos son congelados a trozos inmediatamente después de la resección y se almacenan a -80ºC antes de su tratamiento. Se efectúa el diagnóstico de los tumores según los criterios histopatológicos.

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Preparación del tejido

0,8-1,2 g de tejido congelado se colocan en un mortero y se encuentran totalmente congelados por el nitrógeno líquido. El tejido es pulverizado en el mortero, disuelto en 10 veces el volumen (p/v) de tampón de lisis (citrato sódico 40 mM, MgCl_{2} 5 mM, 1% de Genapol X-080, 0,02% azida sódica, Complete® libre de EDTA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Nr. cat. 1873580) y posteriormente son homogenizados en un homogenizador de vidrio Wheaton® (20xajuste flojo, 20xajuste hermético). 3 ml del homogenizado se someten a una centrifugación de densidad de la sacarosa (10-60% de sacarosa) durante 1 h a 4500 x g. Tras esta etapa de centrifugación, se obtienen tres fracciones. La fracción en la parte superior del gradiente contiene las proteínas solubles y se utiliza para un posterior análisis.

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Enfoque isoeléctrico (IEF) y SDS-PAGE

Para IEF, se mezclan 3 ml de la suspensión con 12 ml de tampón de muestra (urea 7M, tiourea 2M, 2% CHAPS, 0,4% tampón de IPG pH 4-7, 0,5% DTT) y se incuban durante 1 hora. Las muestras se concentran en un dispositivo Amicon® Ultra-15 (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y la concentración proteínica se determina usando la valoración proteínica Bio-Rad® (nr.cat.500-0006; Bio-Rad Laboratorios GmbH, München, Alemania) siguiendo las instrucciones del manual del proveedor. A un volumen correspondiente a 1,5 mg de proteína se añade tampón de muestra hasta un volumen final de 350 \mul. Esta solución se utiliza para volver a hidratar las tiras de IPG a pH 4-7 (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) durante la noche. El IEF se lleva a cabo usando el siguiente protocolo de gradientes: (1.) 1 minuto a 500 V;(2.) 2 h a 3500 V; (3.) 22 h a 3500 V constantes lo que da lugar a 82 kVh. Después del IEF, las tiras se almacenan a -80ºC o se utilizan directamente para SDS-PAGE.

Previamente al SDS-PAGE las tiras se incuban en un tampón de equilibrio (urea 6M, Tris/HCl 50 mM, pH 8,8, 30% de glicerina 2% SDS), se añade DTT para la reducción (15 min+50 mg de DTT/10 ml), y se añade IAA para la alquilación (15 min + 235 mg de acetamida de yodo/10 ml). Las tiras se ponen en geles de poliacrilamida del 12,5% y se someten a una electroforesis a 1W/gel y luego 1 h a 17 W/gel. Posteriormente, se fijan los geles (50% de metanol, 10% de acetato) y se tiñen durante la noche con un equipo Novex^{TM} Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Cat No.LC6025, 45-7101).

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Detección de la SPEE como marcador potencial para el cáncer colorrectal

Cada paciente es analizado por separado mediante el análisis de la imagen con el software ProteomeWeaver® (Definiens AG, Alemania. Munich). Además, todas las manchas del gel se extirpan mediante un robot de expulsión y las proteínas presentes en las manchas son identificadas por espectrometría de masa MALDI-TOF (Ultraflex^{TM} Tof/Tof, Bruker Daltonick GmbH, Bremen, Alemania). Para cada paciente se comparan 4 geles de la muestra tumoral con 4 geles de tejido adyacente y se analizan en busca de manchas diferentes correspondientes a proteínas expresadas de forma diferente. De esta forma, la SPEE proteínica se expresa de forma específica o bien se sobreexpresa intensamente en el tejido tumoral y no se puede detectar en el tejido de control sano. Por lo tanto, entre otras muchas proteínas, se considera como un marcador candidato para ser utilizado en el diagnóstico del cáncer colorrectal.

Ejemplo 2 Generación de anticuerpos frente a la SPEE proteínica marcador del cáncer colorrectal

El anticuerpo policlonal contra la SPEE proteínica marcador del cáncer colorrectal se genera para su uso posterior en la medición de los niveles en suero, plasma y sangre de SPEE por análisis de inmunodetección, por ejemplo, inmunotransferencia y ELISA.

Expresión de la proteina recombinante en E. coli

Para generar anticuerpos contra la SPEE, se lleva a cabo la expresión recombinante de la proteína para obtener los antígenos. La expresión se realiza aplicando una combinación del sistema de expresión RTS 100 y E. coli. En una primera etapa, se analiza la secuencia de ADN y se obtienen recomendaciones para las variantes silenciosas de mutación del cADN de alto rendimiento y se obtienen las respectivas secuencias RCP-cebador usando el sistema "ProteoExpert RTS E. coli HY". Este es un servicio comercial basado en una web (www.proteoexpert.com). Usando los pares recomendados del cebador, se emplea el sistema "RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag" (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Cat.nr.3186237) para generar los patrones de RCP lineales del ADNc para la transcripción in vitro y se utiliza la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante proteínica de SPEE. Para la detección por inmunotransferencia y posterior purificación, la proteína expresada contiene un His-tag. Se identifica la variante que mejor se expresa. Todas las etapas desde la RCP hasta la expresión y detección se llevan a cabo según las instrucciones del fabricante. El producto respectivo de la RCP, que contiene todas las regiones reguladoras necesarias T7 (promotor, lugar de fijación ribosómico y finalizador T7) se clona en el vector pBAD TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Germany, Cat.Nr.K 4300/01) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la expresión que utiliza las secuencias reguladoras T7, la construcción se transforma en E. coli BL 21(DE 3)(Studier, F.W., y cols., Methods Enzymol.185(1990)60-89) y las bacterias transformadas son cultivadas en un lote 11 para la expresión proteínica.

La purificación de la proteína de fusión His-SPEE se realiza siguiendo los procedimientos estándar en una columna de quelato de níquel. Brevemente, 1 litro de cultivo bacteriano que contiene el vector de expresión para la proteína de fusión His-SPEE se tritura por centrifugación. Los gránulos celulares se vuelven a suspender en un tampón de lisis, que contiene fosfato, cloruro de guanidio 7M a pH 8,0, imidazol y tiogliceroles, a lo que sigue una homogenización usando un Ultra-Turrax®. El material insoluble se granula mediante centrifugación a alta velocidad y el sobrenadante se aplica a una columna cromatográfica de quelato de níquel. La columna se lava con varios volúmenes de tampón de lisis seguidos de lavados con tampón, que contienen fosfato, pH 8,0 y urea. Finalmente, el antígeno fijado es eluido usando un tampón fosfato que contiene SDS en condiciones ácidas.

Producción de anticuerpos monoclonales contra la SPEE a) Inmunización de ratones

Ratones A/J de 12 semanas son inmunizados inicialmente por vía intraperitoneal con 100 \mug de SPEE o bien de conjugado de hemocianina-péptido (ver antes). Al cabo de 6 semanas se realizan dos inmunizaciones intraperitoneales con intervalos mensuales. En este proceso cada ratón recibe 100 \mug de SPEE o bien de conjugado de péptido de hemocianina adsorbido al hidróxido de aluminio y 10^{9} gérmenes de Bordetella pertussis. Posteriormente se llevan a cabo las dos últimas inmunizaciones por vía intravenosa, el tercer y segundo día previo a la fusión, usando 100 \mug de SPEE en tampón de PBS.

b) Fusión y clonación

Las células del bazo de los ratones inmunizados conforme a a) se amalgaman con células de mieloma conforme a Galfre, G., y Milstein, C., Methods in Enzymology 73(1981)3-46. En este proceso, aprox. 1x10^{8} células del bazo del ratón inmunizado se mezclan con 2x10^{7} células de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) y se centrifugan (10 min a 300 x g y 4ºC). Luego las células se lavan una vez con un medio RPMI 1640 sin suero bovino fetal (FCS) y se centrifugan de nuevo a 400xg en un tubo cónico de 50 ml. Se desecha el sobrenadante, el sedimento celular se agita suavemente dando unos golpecitos, se añade 1 ml de PEG (peso molecular 4000, Merck, Darmstadt) y se mezcla mediante pipeteo. Tras 1 minuto en un baño de agua a 37ºC, se añaden 5 ml de RPMI 1640 sin FCS gota a gota a temperatura ambiente durante un periodo de 4-5 minutos. Luego se añaden 5 ml de RPMI 1640 que contienen un 10% de FCS, gota a gota, durante aproximadamente 1 minuto, se mezclan intensamente, se enrasa hasta 50 ml con el medio (RPMI 1640+10% FCS) y posteriormente se centrifuga durante 10 minutos a 400xg y 4ºC. Las células sedimentadas son absorbidas en un medio RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y son cultivadas en un medio de selección de hipoxantina-azaserina (100 mmol/l de hipoxantina, 1 \mug/ml de azaserina en RPMI 1640+10% de FCS). Se añaden 6 a 100 U/ml de interleucina al medio como un factor de crecimiento.

Después de aproximadamente 10 días se analiza la presencia de anticuerpos específicos en los cultivos primarios. Los cultivos principales positivos de SPEE son clonados en placas de cultivo celular de 96 pocillos por medio de un clasificador celular activado por la fluorescencia. En este proceso de nuevo se añade interleucina 6 a 100 U/ml al medio como un aditivo de crecimiento.

c) Aislamiento de inmunoglobulina de los sobrenadantes del cultivo celular

Las células del hibridoma obtenidas son cultivadas en una densidad de 1x10^{5} células por ml en un medio de RPMI 1640 que contiene un 10% de FCS y se multiplican o reproducen durante 7 días en un fermentador (Thermodux Co., Wertheim/Main, Model MCS-104XL, pedido nr.144-050). Se obtienen concentraciones medias de 100 \mug de anticuerpos monoclonales por ml de sobrenadante del cultivo. La purificación de este anticuerpo del sobrenadante del cultivo se realiza mediante métodos convencionales en la química proteínica (por ejemplo, conforme a Bruck, C., y cols., Methods in Enzymology 121 (1986)587-695).

Generación de anticuerpos policlonales a) Inmunización

Para la inmunización se prepara una emulsión nueva de solución proteínica (100 \mug/ml de SPEE o de conjugado de hemocianina-péptido) y el adyuvante completo de Freund en una proporción 1:1. Cada conejo es inmunizado con 1 ml de la emulsión los días 1, 7,14 y 30,60 y 90. Se extrae la sangre y el suero anti-SPEE resultante es utilizado para posteriormente experimentos tal como se ha descrito en los ejemplos 3 y 4.

b) Purificación de IgG (Inmunoglobulina G) del suero de conejo por la precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato de amonio

Un volumen de suero de conejo se diluye con 4 volúmenes de tampón de acetato (60 mM, pH 4,0). El pH se ajusta a 4,5 con Tris-base 2M. Se añade ácido caprílico (25 \mum/ml de muestra diluida) gota a gota agitando vigorosamente. Al cabo de 30 minutos, se centrifuga la muestra (13.000 x g, 30 min, 4ºC), se desechan los gránulos y se recoge el sobrenadante. El pH del sobrenadante se ajusta a 7,5 añadiendo Tris-base 2M y se filtra (0,2 \mum).

La inmunoglobulina en el sobrenadante se precipita agitando vigorosamente mediante la adición gota a gota de una solución de sulfato de amonio 4M hasta una concentración final de 2M. Las inmunoglobulinas precipitadas se recogen por centrifugación (8000 x g, 15 min., 4ºC).

Se desecha el sobrenadante. Los gránulos se disuelven en NaH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM y se dializan de forma exhaustiva. El dializado se centrifuga (13.000xg, 15 min., 4ºC) y se filtra (0,2 \mum).

Biotinilación del IgG policlonal de conejo

El IgG policlonal de conejo se prepara con 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Se añaden 50 \mul de N-hidroxisuccinimida de biotina (3,6 mg/ml en DMSO) por ml de solución de IgG. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra es cromatografiada en Superdex 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se recoge la fracción que contiene IgG biotinilada. Los anticuerpos monoclonales son biotinilados según el mismo procedimiento.

Digoxigenilación del IgG policlonal de conejo

El IgG policlonal de conejo se prepara con 10 mg/ml en NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM. Se añaden 50 \mul de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido digoxigenin-3-O-metilcarbonil-\varepsilon-aminocaproico por ml de IgG(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Nr. cat. 1 333 054) (3,8 mg/ml en DMSO). Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra es cromatografiada en Superdex 200 (NaH_{2}PO_{4}/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se recogen las fracciones que contienen IgG digoxigenilada. Los anticuerpos monoclonales son marcados con digoxigenina según el mismo procedimiento.

Ejemplo 3 Inmunotransferencia para la detección de SPEE en tejido humano de cáncer colorrectal utilizando anticuerpos policlonales tal como se han generado en el ejemplo 2

Los lisados tisulares de las muestras de tumor y de las muestras de control sano se preparan tal como se descrito en el ejemplo 1, "preparación del tejido".

La SDS-PAGE y la inmunotransferencia se realizan usando reactivos y equipo de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania. Por cada muestra de tejido analizada, se diluyen 10 \mug de lisado tisular en tampón de muestra NuPAGE® (Invitrogen) SDS y se calientan durante 10 minutos a 95ºC. Las muestras se hacen pasar sobre geles NuPAGE® 4-12% (Tris-glicina) en el sistema tampón MES. La mezcla proteínica separada del gel se transfiere a las membranas de nitrocelulosa usando el sistema tampón de transferencia Invitrogen XCell II^{TM}Blot Module (Invitrogen) y NuPAGE®. Las membranas se lavan 3 veces en PBS/0,05% de Tween-20 y se bloquean con tampón de bloqueo Roti®-Block(A151.1: Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania) durante 2 horas. El anticuerpo primario, suero anti-SPEE de conejo policlonal (generación descrita en el ejemplo 2) se diluye 1:10.000 en Tween-20 del 0,05%. El anticuerpo de conejo primario enlazado de forma específica se marca con un anticuerpo de IgG anti-conejo de oveja policlonal conjugado a POD, se diluye a 10 mU/ml en tamón de bloqueo 0,5 x Roti®-Block. Después de una incubación durante 1 h, las membranas se lavarán 6 veces en PBS/0,05% Tween-20. Para la detección del anticuerpo anti-conejo POD-conjugado enlazado, la membrana se incuba con el sustrato de inmunotransferencia Lumi-Light^{PLUS} (Pedido nr. 2015196, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y se expone a una película autoradiográfica.

Resultados de un experimento típico se muestran en la figura 2.

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Ejemplo 4 ELISA para la medición de SPEE en muestras de suero y plasma humano

Para la detección de la SPEE en suero o plasma humano, se realiza un ELISA sándwich. Para la detección y captura del antígeno, se conjugarán partes alícuotas del anticuerpo policlonal anti-SPEE (ver ejemplo 2) con biotina y digoxigenina, respectivamente.

Las placas de microvaloración de 96 pocillos revestidas de estreptavidina son incubadas con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-SPEE biotinilado durante 60 minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% de BSA, 0,9% de NaCl y 0,1% de Tween-20. Tras la incubación, las placas se lavan tres veces con 0,9% de NaCl, 0,1% de Tween-20. Luego los pocillos son incubados durante 2 horas con una dilución en serie de proteína recombinante (ver ejemplo 2) como antígeno estándar o con muestras de plasma diluidas de los pacientes. Tras la fijación de la SPEE, las placas se lavan tres veces con NaCl 0,9%, Tween-20 0,1%. Para una detección específica de la SPEE fijada, los pocillos se incuban con 100 \mul de anticuerpo policlonal anti-SPEE digoxigenilado durante 60 minutos a 10 \mug/ml en fosfato 10 mM, pH 7,4, 1% de BSA, NaCl 0,9% y Tween-20 0,1%. A continuación, las placas se lavan tres veces para eliminar el anticuerpo no fijado. En una siguiente etapa, los pocillos se incuban con conjugados de anti-digoxigenina-POD 20 mU/ml (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim. Alemania, nr. Catálogo 1633716) durante 60 minutos en fosfato 10 mM, pH 7,4, BSA al 1%, NaCl 0,9% y Tween-20 0,1%. Las placas se lavan posteriormente tres veces con el mismo tampón. Para la detección de los complejos antígeno-anticuerpo, los pocillos se incubarán con 100 \mul de solución de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Nr. catálogo 11685767) y se mide el OD después de 30-60 minutos a 405 nm con un lector de ELISA.

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Ejemplo 5 Análisis del ROC para evaluar la utilidad clínica en términos de la exactitud del diagnóstico

La exactitud se valora analizando las muestras líquidas individuales obtenidas de los grupos de pacientes caracterizados en cada pocillo, por ejemplo, 50 pacientes a los que se ha hecho una colonoscopia y que están libres de adenoma o CRC, 50 pacientes diagnosticados y clasificados como NO, MO de cáncer colorrectal, T1-3 y 50 pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal en progreso, que tienen al menos infiltración tumoral en como mínimo un nódulo linfático proximal o bien formas severas de metástasis, respectivamente. El CEA medido como un análisis disponible en el comercio (Roche Diagnostics, CEA-análisis (nr. catálogo 1 173 1629 para el analizador Elecsys®Systems de inmunoanálisis) y la SPEE medida tal como se ha descrito antes, han sido cuantificados en un suero obtenido de cada uno de estos individuos. El análisis ROC se realiza de acuerdo con Zweig, M.H., y Campbell, supra. El poder discriminatorio para diferenciar los pacientes del grupo T_{is}-3, NO, M0 de los individuos sanos para la combinación de la SPEE con el marcador establecido CEA se ha calculado mediante un análisis discriminante regularizado (Friedman, J.H., Regularized Discriminant Analysis, Journal of the American Statistical Association 84(1989)165-175).

Los datos preliminares indican que la SPEE puede ser también muy útil en el seguimiento de pacientes después de la cirugía.

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Zweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577

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<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG

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<120> Uso de SPEE proteínica como marcador del cáncer colorrectal

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<130> 21896

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<150> EP 03017585.5

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<151> 2003-08-08

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<160> 1

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<170> Versión de la paciente 3.2

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<210> 1

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<211> 300

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MISC_FEATURE

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<223> Espermidina sintasa (SPEE), SWISS-PROT:P19623

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<400>1

100

101

Claims

1. Un método para el diagnóstico del cáncer colorrectal que comprende las etapas de

(a) aporte de una muestra líquida obtenida de un individuo,

(b) puesta en contacto de dicha muestra con un agente de fijación específico para la espermidina sintasa (=SPEE) en unas condiciones apropiadas para la formación de un complejo entre dicho aglutinante y la SPEE, y

(c) correlacionar la cantidad de complejo formada en (b) respecto al diagnóstico de cáncer colorrectal.

2. El método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque dicha muestra es suero.

3. El método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque dicha muestra es plasma.

4. El método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque dicha muestra es sangre entera.

5. Uso de la SPEE proteínica como una molécula marcador en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida que se obtiene de un individuo.

6. Uso de la SPEE proteínica como una molécula marcador en el diagnóstico precoz del cáncer colorrectal de una muestra líquida que se obtiene de un individuo.

7. Uso conforme a la reivindicación 6, de manera que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra derivada de pacientes con cáncer colorrectal en la etapa del adenoma.

8. Uso conforme a la reivindicación 6, de manera que el diagnóstico precoz se realiza con una muestra derivada de pacientes con cáncer colorrectal en la etapa T_{is}-3;N0;M0.

9. Uso de la SPEE proteínica como una molécula marcador en el cáncer colorrectal en combinación con otra molécula marcador para el cáncer colorrectal en el diagnóstico del cáncer colorrectal de una muestra líquida de un individuo.