ES2317032T3 - Procedimiento para calibrar un fluorometro de polarizacion. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para calibrar un fluorómetro de polarización, comprendiendo el fluorómetro un canal de excitación para conducir una luz de excitación polarizada a una muestra (4; 4.1) y un canal de emisión para conducir una luz de emisión desde la muestra, comprendiendo el canal de emisión un filtro de polarización (5H), en cuyo procedimiento - un primer filtro de polarización (3 H) está colocado en el canal de excitación, la luz se conduce a través del canal de excitación y la intensidad de la luz transmitida se mide mediante un detector de excitación (8), - a continuación, el primer filtro de polarización se retira y se reemplaza con un segundo filtro de polarización (3V), cuyo plano de polarización está invertido, preferiblemente 90 grados, respecto al plano de polarización del primer filtro de polarización, conduciéndose la luz a través del canal de excitación, y midiéndose la intensidad de la luz transmitida mediante el detector de excitación, caracterizado porque - el fluorómetro también comprende un detector de referencia (10), de manera que una parte de la luz polarizada del canal de excitación se conduce a través de unos medios adecuados (9; 9.1; 9.2) al detector de referencia antes de conducirse a la muestra o al detector de excitación y porque una parte de la luz polarizada del canal de excitación se conduce al detector de excitación (8), y porque - sobre la base de las dos mediciones de la intensidad del detector de excitación (8), el detector de referencia se calibra para medir de manera precisa las sensibilidades del fluorómetro sobre los planos de polarización.
Description
Procedimiento para calibrar un fluorómetro de
polarización.
La invención se refiere a un fluorómetro de
polarización y está dirigida a la calibración del fluorómetro. La
invención es aplicable a analizadores para examinar las propiedades
químicas de muestras mediante fluorometría de polarización. Estos
estudios se realizan en biotecnología y en particular en
laboratorios de química clínica.
En la fluorometría, la luz de excitación en una
longitud de onda dada se dirige a una muestra. La iluminación genera
fluorescencia en cualquier fluoróforo presente en la muestra,
generando así la emisión de luz que tiene una longitud de onda más
larga.
Si se polariza la luz de excitación, actuará en
las moléculas del fluoróforo depositadas correctamente respecto a la
polarización de la luz de excitación, y también se polariza la luz
de emisión. El ángulo de polarización de la emisión es específico
para el fluoróforo independiente de la longitud de onda.
Una emisión se puede despolarizar por diferentes
razones. La despolarización se provoca mediante el cambio del estado
de la molécula entre excitación y emisión. La diferencia de tiempo
típica es de aproximadamente 10 nanosegundos. La despolarización se
puede utilizar de diferentes maneras, por ejemplo para monitorizar
reacciones químicas. Una causa principal de la despolarización es la
oscilación circular de una molécula. La extensión del movimiento
circular depende, entre otras cosas, de la forma y del tamaño de la
molécula y de la viscosidad del medio. La despolarización se ve así
afectada mediante el movimiento circular promedio de las moléculas
de la substancia durante la diferencia de tiempo entre la excitación
y la emisión. Si una molécula fluorescente está asociada con otra
molécula, esto provocará un movimiento circular retardado del
fluoróforo y una polarización aumentada de la emisión.
En particular en aplicaciones biotecnológicas,
frecuentemente se ha asociado un fluoróforo fluorescente con una
molécula que se refiere específicamente a moléculas que se pueden
identificar. Un tamaño de molécula aumentado provoca un movimiento
circular retardado de la molécula, reteniendo así mejor el
fluoróforo el nivel de polarización original. Así, una medición de
la polarización permite la medición directa y rápida de esta
reacción específica. Una medición de la polarización espectral
también puede proporcionar información importante sobre la muestra,
que implica la medición de la polarización de la muestra en
diferentes longitudes de onda de excitación o emisión.
La fluorescencia de la polarización es
particularmente adecuada en el análisis de grandes cantidades de
muestras debido al rápido crecimiento y al proceso de medición
fiable.
La polarización se mide mediante un fluorómetro
que comprende un filtro de polarización, tanto en el canal de
excitación como en el de emisión.
Se requieren dos mediciones para calcular la
polarización:
1. Un filtro de polarización de excitación y un
filtro de polarización de emisión en alineación;
2. Un filtro de polarización de excitación y un
filtro de polarización de emisión con un ángulo entre sí de 90
grados.
La polarización P se deriva de la fórmula:
- P = (I_{II} - I_{T})/(I_{II} + I_{T})
- fórmula (1)
en la
cual:
I_{II}: intensidad de emisión con filtros
paralelos
I_{T}: intensidad de emisión con filtros
perpendiculares
La cantidad de polarización también se describe
con el término de aniosotropía r:
- r = (I_{II} - I_{T})/(I_{II} + 2I_{T})
- fórmula (2)
P y r se pueden calcular así entre sí:
- P(r) = 3r/(2 + r)
- fórmula (1a)
Los fluorómetros de polarización normalmente
utilizan geometría llamada L, en la cual la luz de emisión se mide
con un ángulo de 90 grados respecto a la luz de excitación. Esto
reduce de manera eficiente el acceso de la luz de excitación al
detector de emisión. En la configuración usual, el canal de
excitación utiliza un filtro de polarización estacionario y el
filtro de emisión utiliza un filtro de polarización reemplazable,
pero esta configuración también se puede invertir.
De una manera asumida, el canal de excitación
comprende un filtro de polarización estacionario cuyo plano de
polarización es X. La emisión de la muestra se mide con esta
polarización, produciendo I_{XX}. Una segunda medición se realiza
con la polarización de emisión girada 90 grados (plano Y),
produciendo I_{XY}. En el caso ideal, la polarización se puede
calcular directamente a partir de los resultados de la medición de
la emisión I_{XX} y I_{XY}:
- P = (I_{XX} - I_{XY})/(I_{XX} + I_{XY})
- fórmula (3)
Sin embargo, el nivel de transmisión de la señal
desde el canal de emisión y la transmitancia del filtro de
polarización de la emisión puede variar en intensidad en diferentes
planos de polarización. Esto es porque es necesario un factor de
calibración para compensar la diferencia entre las sensibilidades de
medición de diferentes polarizaciones. El factor de calibración se
llama el factor G. la polarización así compensada se deriva de la
fórmula:
- P = (I_{XX} - G I_{XY})/(I_{XX} + G I_{XY})
- fórmula (4)
Con las sensibilidades de la medición de la
emisión en planos de polarización diferentes que son S_{Y} y
S_{X}, siendo el factor G su relación mutua:
- G = S_{X}/S_{Y}
- fórmula (5)
El factor G se puede determinar si está también
disponible un filtro de polarización reemplazable en el lado de
excitación. G se calcula mediante la medición de la polarización de
la muestra con las dos polarizaciones. Sin embargo, esta manera de
medición implica numerosos problemas:
1. Un diseño complejo; un filtro de polarización
dual, que requiere que el filtro se coloque con un ángulo de
exactamente 90 grados.
2. La medición consiste en cuatro mediciones y,
por lo tanto, es lenta. El factor G se puede medir por adelantado en
una muestra adecuadamente representativa en un nivel de señal alto.
Esto es poco práctico si la medición se realiza en una muestra cuya
polarización es desconocida. El reemplazo de los filtros de
polarización es también una operación relativamente lenta,
considerando el período de medición real.
3. Ruido; el ruido de P consiste en todos de los
cuatro componentes de la medición de la polarización. La medición
requiere una muestra con una fluorescencia adecuada para minimizar
los factores de ruido.
Debido a los problemas citados anteriormente, de
hecho, el factor G se mide en los casos más concretos mediante la
utilización de una muestra de referencia cuya polarización P es
conocida. G se puede derivar entonces a partir del término de P
(fórmula (4)). La fluoresceína, por ejemplo, es esta substancia de
referencia. Este procedimiento también implica problemas:
1. El mantenimiento de la solución para
cualquier medición incidental; por ejemplo, la fluoresceína exacta
solamente para aplicaciones que utilizan la fluoresceína como
fluoróforo.
2. Las mediciones de la polarización espectral
como una función de la longitud de onda de excitación y la longitud
de onda de emisión (P(\lambda)) son difíciles de realizar.
Es necesario conocer exactamente tanto el espectro
P(\lambda_{excitación}) como el
P(\lambda_{emisión}) de la sustancia de referencia.
El documento WO 91/07652 propone ópticas y un
procedimiento para medir la polarización de fluorescencia corregida
de la fuente. En esta disposición, el fluorómetro se basa en un
fotodetector de referencia para monitorizar la intensidad de la
fuente de luz y para corregir las intensidades fluorescentes
medidas. En el canal de excitación hay un polarizador ajustable, y
en el canal de emisión uno fijo. Solamente son necesarias dos
mediciones para la corrección: una en cada posición del polarizador
de excitación. Las mediciones de corrección se podrán realizar con
una cubeta modelo o sin cubeta.
El documento US 4074939 describe un aparato con
dos canales de emisión completos, mediante los cuales se calibra la
medición de la polarización. El documento US 6297018 describe un
aparato con filtros de polarización reemplazables, tanto en el canal
de excitación como en el canal de emisión. Los procedimientos de
SPIE Vol. 4625 (2002) 126-130 describen un
instrumento con un polarizador horizontal o vertical y un detector
de referencia al cual se conducen una parte de la luz polarizada en
el canal de excitación, antes de alcanzar la muestra.
Un procedimiento para calibrar un fluorómetro de
polarización, según la reivindicación 1, se ha inventado ahora. Las
otras reivindicaciones definen algunas de las realizaciones de la
invención.
Según la invención, el canal de emisión utiliza
un filtro de polarización estacionario y el canal de excitación
utiliza un filtro de polarización reemplazable. La calibración del
dispositivo meramente requiere la medición de la intensidad de
excitación en los dos planos de polarización. No es necesaria
ninguna muestra para esto, y la medición se puede realizar
directamente sobre la trayectoria de la luz de excitación. Así, un
dispositivo con geometría L puede comprender un detector de
excitación especial (especialmente libre de polarización)
específicamente adecuado para medir la intensidad de la excitación.
También hay un detector de referencia, al cual se puede conducir la
luz polarizada desde el canal de excitación, especialmente a través
de un separador de rayos, antes de conducirse a la muestra o al
detector de excitación. Este detector de referencia se puede
calibrar sobre la base del detector de excitación, de manera que las
sensibilidades de la medición del fluorómetro sobre los planos de
polarización se pueden calcular también sin conducir la luz al
detector de excitación. Por lo tanto, se pueden medir de manera
correcta los espectros de fluorescencia.
Los dibujos adjuntos forman parte de la
descripción escrita de la invención y se refieren a la siguiente
descripción detallada de la invención. En los dibujos
- La figura 1 muestra un principio de medición
de fluorómetro de polarización con geometría L;
- La figura 2 muestra un fluorómetro de
polarización realizado con óptica de lente y diseñado para medir
pocillos sobre una placa de matriz; y
- La figura 3 muestra un fluorómetro de
polarización realizado con óptica de espejo para medir pocillos
sobre una placa de matriz.
Según la invención, el canal de emisión utiliza
un filtro de polarización estacionario y el canal de excitación
utiliza un filtro reemplazable. Cuando el plano de polarización del
canal de emisión se marca con una X y el plano de polarización
perpendicular a éste se marca con una Y, la polarización P se deriva
a partir de la fórmula:
- P = (I_{XX} - G I_{YX})/(I_{XX} + G I_{YX})
- fórmula (6)
- G = E_{X}/E_{Y}
- fórmula (7)
I_{XX} = intensidad de emisión con el plano de
excitación X
I_{YX} = intensidad de emisión con el plano de
excitación Y
E_{X} = intensidad de excitación sobre el
plano X
E_{Y} = intensidad de excitación sobre el
plano Y
\vskip1.000000\baselineskip
Combinando las fórmulas (6) y (7) se
consigue
- P = (I_{XX}/E_{X} - I_{YX}/E_{Y})/(I_{XX}/E_{X} + I_{YX}/E_{Y})
- fórmula (8)
Así, la determinación del factor G solamente
requiere dos mediciones. Los componentes del factor G en este caso
se han formado antes de la muestra, pudiéndose realizar las
mediciones para determinar el factor G en ausencia de la muestra
utilizando un detector de excitación, que se coloca sobre la
trayectoria del rayo de excitación, en otras palabras, sin conducir
la luz a través del canal de emisión.
La medición del factor G de excitación de esta
manera provoca ventajas significativas, entre otras cosas:
1. La medición es completamente independiente de
la muestra. La medición se realiza preferiblemente sin ninguna
muestra y también sin utilizar ningún recipiente de muestra.
2. La medición es rápida, considerando que la
determinación real requiere solamente dos mediciones. Respecto al
canal de referencia calibrado, la determinación solamente requiere
dos mediciones.
3. No se requieren componentes adicionales si la
medición fotométrica ya se ha previsto en el dispositivo, es decir,
permite simultáneamente la medición fotométrica.
4. Con bajas concentraciones de la muestra, el
ruido P de la polarización es bajo, porque el resultado solamente
consiste en dos componentes del resultado de la medición de bajo
nivel. Los otros dos factores requeridos para calcular el factor G
de la polarización prácticamente no presentan ruido gracias al alto
nivel de la señal.
Con el uso de filtros de polarización de
excitación separados, el filtro se puede reemplazar con un
movimiento lineal, permitiendo un fácil posicionamiento de alta
precisión. Uno podría utilizar opcionalmente un único filtro, que se
gira entre las mediciones.
La fuente de luz puede comprender, por ejemplo,
una bombilla incandescente (por ejemplo, una lámpara halógena), que
genera un amplio espectro uniforme y es así adecuado para mediciones
versátiles. Una lámpara de deuterio también se puede utilizar,
específicamente cuando se desea un fuerte efecto de iluminación en
el intervalo ultravioleta. Una luz de flash de xenón, sin embargo,
es una fuente de luz particularmente adecuada. Esta fuente de luz
permite cubrir un intervalo de longitudes de onda de excitación muy
grande. La fuente de luz de flash genera cortos pulsos de luz de
una intensidad muy alta. El uso de una lámpara de luz de flash es
eficiente, porque la lámpara está en funcionamiento solamente en el
momento de la medición.
Para la determinación del factor G, es posible
utilizar un detector de excitación que está específicamente libre de
polarización y adecuado de una manera óptima y precisa para medir la
intensidad de la excitación. El detector se puede colocar, por
ejemplo, después del área de muestra, permitiendo que el detector
esté en una posición fija sin interferir con la colocación de la
muestra. El detector de excitación puede ser, por ejemplo, un
fotodetector de silicio o un tubo multiplicador fotográfico (PMT).
Un fotodetector de silicio situado perpendicularmente respecto a la
luz de excitación que se debe medir es un detector particularmente
adecuado. Por ejemplo, se pueden prever ópticas de lente o espejo
frente al detector en vista a ampliar el área efectiva del detector.
El detector de la excitación que mide el factor G también se puede
colocar delante del recipiente de la muestra.
Según la invención, también hay un segundo
detector, llamado detector de referencia, y este detector de
referencia está colocado antes de dicho detector de excitación y
también antes de la muestra. El detector de referencia se puede
utilizar también cuando una muestra colocada en el fluorómetro evita
el uso del detector de excitación. Una parte de la luz polarizada
se conduce al detector de referencia preferiblemente a través de
unos medios adecuados. Estos medios provocan la polarización tanto
en el rayo de luz transmitido como en el rayo de luz reflejado.
Estos fenómenos dependen de la longitud de onda. Por esta razón, una
medición realizada a través de estos medios será imprecisa, a menos
de que se calibre por separado. Esta calibración se puede realizar
antes de colocar la muestra en el fluorómetro mediante el detector
de excitación. Cuando el detector de referencia se ha calibrado, se
puede utilizar para medir el factor G en tiempo real durante la
medición de la muestra, también cuando la muestra está sobre la
trayectoria de la luz del detector de excitación. De esta manera,
las desviaciones de los componentes eléctricos y ópticos se pueden
tener en cuenta de una manera muy fiable en los cálculos. Esto es
una ventaja significativa, especialmente cuando se miden los
espectros de fluorescencia. En estas mediciones, es necesario
aproximadamente 10 minutos para medir en cada plano de
polarización.
Los medios para conducir una parte de la luz
pueden ser, por ejemplo, una placa de vidrio, un espejo
semitransparente, un espejo menor que el área del canal de
excitación, o una fibra óptica.
El detector de excitación permite la calibración
del detector de referencia para hacer que mida correctamente las
características de polarización del canal de excitación. El detector
de referencia como tal no proporciona mediciones exactas de las
características de polarización del canal de excitación,
especialmente debido al comportamiento de la polarización de los
medios para conducir parte de la luz. Sin embargo, estos medios
tienen un comportamiento de polarización estable, de manera que,
después de una medición mediante un detector fotométrico y un
detector de referencia, el detector de referencia se puede calibrar
en vista a la medición de la polarización del canal de excitación.
Esto hace que el proceso de medición sea incluso más rápido, ya que
no se requiere una calibración del factor G antes de la medición.
Sin embargo, será necesaria una calibración periódica en los casos
donde se requiera un factor G de alta precisión.
Si el detector de excitación proporciona en los
planos vertical y horizontal las señales F_{V} y F_{H}, y el
detector la referencia al mismo tiempo las señales R_{V} y
R_{H}, y si las señales reales obtenidas mediante el detector de
referencia durante las mediciones de la muestra son R_{Va} y
R_{Ha}, el factor G corregido G_{corr} es
- G_{corr} = k * G = k * R_{X}/R_{Y}
- fórmula (A)
- k = (F_{XC}/F_{YC})*(R_{YC}/R_{XC})
- fórmula (B)
- P = (I_{XX} - G_{corr}I_{YX})/(I_{XX} + G_{corr}I_{XY})
- fórmula (C)
en las
que
R_{XC} = intensidad del canal de referencia en
la fase de calibración en el plano X
R_{YC} = intensidad del canal de referencia en
la fase de calibración sobre el plano Y
F_{XC} = intensidad del foto detector en la
fase de calibración sobre el plano X
F_{YC} = intensidad del foto detector en la
fase de calibración sobre el plano Y
R_{X} = intensidad del canal de referencia en
la fase de medición sobre el plano X
R_{Y} = intensidad del canal de referencia en
la fase de medición sobre el plano Y
I_{XX} = intensidad de emisión con el plano de
excitación X
I_{YX} = intensidad de emisión con el plano de
excitación Y
\vskip1.000000\baselineskip
Combinando las fórmulas (A) y (B) y (C) se
obtiene
- P = (I_{XX}/R_{X} - kI_{YX}/R_{Y})/(I_{XX}/R_{X} + kI_{YX}/R_{Y})
- fórmula (D)
- k = (F_{XC}/F_{YC}/*(R_{YC}/R_{XC})
- fórmula (E)
La fórmula (E) contiene información solamente de
la fase de calibración y la fórmula (D) contiene información
solamente de la fase de medición.
A no ser que la intensidad de la fuente de luz
permanezca suficientemente constante a lo largo de varias etapas de
medición, también se debe medir la intensidad de la fuente de luz
antes de la muestra. En la práctica, la medición de la intensidad es
necesaria. Esto es especialmente en el caso cuando se utiliza
iluminación de luz de flash de xenón. La luz de flash de xenón tiene
una inestabilidad del orden de 0,5 ... 1%. En la práctica, se
requerirá una medición de referencia en cada etapa de medición.
En el fluorómetro según la invención, la
medición de la intensidad de referencia se puede realizar utilizando
detector de referencia ya utilizado para la medición del factor G.
El nivel de fluctuación de la fuente de luz se tiene en cuenta
mediante una señal a partir del detector de referencia. Como en la
fórmula P cada valor de la intensidad de emisión (I_{XX},
I_{YX}) se mide con el valor de excitación correspondiente
(E_{X}, E_{Y}), la fluctuación del flash se cancela
automáticamente. No es necesario ningún procesamiento de señal
adicional.
Para medir exactamente la emisión, las
longitudes de onda de la excitación y de la emisión se deben filtrar
de manera cuidadosa. La elección de la longitud de onda de emisión
debe evitar que la luz de excitación proceda directamente del
detector de medición de la emisión.
La longitud de onda se selecciona en los canales
de excitación y emisión mediante un monocromator. El monocromator se
puede basar en la interferencia, especialmente sobre membranas
finas, o sobre la transmitancia natural de la substancia. El
monocromator, por ejemplo, puede ser un monocromator de grabado o el
filtro de color. Las configuraciones del monocromator pueden
comprender varias etapas para aumentar el efecto del filtro. El
término monocromator, por lo tanto, puede indicar un aparato que
comprende 1 ... n elementos de monocromator idénticos o
diferentes.
Se pueden utilizar ópticas de lente o espejo
para la conducción de la luz.
Un tubo fotomultiplicador se utiliza
frecuentemente como un detector de la medición de la luz de emisión,
porque las señales ópticas que se debe medir son muy pequeñas,
requiriendo así una alta sensibilidad de medición. También se
utilizan fotodetectores de silicio. Estos detectores tienen el
beneficio de una estabilidad excelente.
El filtro de polarización del canal de emisión
también puede ser reemplazable según el intervalo de longitud de
onda a utilizar. A menudo, un filtro de polarización cubre el
intervalo ultravioleta, otro el intervalo visible, y un tercero el
intervalo próximo a infrarrojos.
En muchos casos, una medición fluorométrica y
una medición de la transmisión de una muestra se refieren a
mediciones de las muestras en la misma área. Es ventajoso para el
usuario que el mismo aparato realice tanto las mediciones
fluorométricas como las mediciones fotométricas de densidad óptica,
porque un aparato combinado es más económico que dos separados. Los
grandes laboratorios también favorecen el uso de equipos
combinados.
Las muestras se tratan usualmente sobre placas,
donde unos recipientes de muestras, por ejemplo pocillos, están
situados en una matriz bidimensional. Hay típicamente 6 ... 1536
pocillos, mientras que el área de la placa es bastante constante. En
la mayoría de los casos, hay 96 ó 384 pocillos sobre la placa. Las
dimensiones externas y el número de pocillos pueden variar en
aplicaciones especiales.
Con los pocillos formando una matriz muy
estrecha sobre la placa, la geometría de medición L no es aplicable.
Las direcciones de medición libres se permiten desde el lado
superior o el lado inferior del pocillo. Debido a problemas de la
fluorescencia de fondo, la medición a través de la ventana inferior
se evita preferiblemente en fluorometría. Además, el poliestireno,
que es el material más frecuentemente utilizado en las placas, no es
apto para mediciones de polarización a través del fondo, porque
interfiere con los planos de polarización de manera aleatoria.
\newpage
A un rayo de excitación se le puede dar una
forma troncocónica en el pocillo para que el tamaño del rayo de
excitación sea menor que el diámetro del pocillo. Esto consigue una
buena separación del canal entre los pocillos y las tolerancias de
posicionamiento del pocillo perjudicarán los resultados de la
medición lo mínimo posible.
En consecuencia, se utiliza un filtro de
polarización de excitación reemplazable: uno puede elegir un filtro
en V o en H, o el filtro se puede eliminar de la medición de la
intensidad de la fluorescencia. Los filtros de polarización se
pueden cambiar óptimamente según la longitud de onda. El filtro de
polarización también puede ser rotativo. Un filtro rotativo permite
una medición precisa del valor angular del máximo de polarización
cuando la polarización de la substancia a determinar tiene un ángulo
de rotación característico, con el cual la oscilación de la
molécula interfiere posteriormente. Un filtro rotativo es
particularmente adecuado para medir muestras viscosas.
Así, la dirección de medición preferida es desde
el lado superior del pocillo: la luz de excitación y la medición de
la emisión se realizan desde la parte superior del pocillo. Con la
excitación y la emisión utilizando la misma trayectoria, están
separadas entre sí mediante un separador de rayos. Unos medios de
este tipo se describen en el documento WO 97/11354, en el cual la
óptica fluorométrica se ha realizado con ópticas de lentes. Mediante
la incorporación de filtros de polarización en los canales de
excitación y emisión, la medición del factor G descrita
anteriormente se puede realizar con la ayuda de un fotodetector
colocado por debajo del pocillo. Al mismo tiempo, esto proporciona
la opción de medición fotométrica.
El separador de rayos puede ser especialmente un
espejo semitransparente, en particular de manera que está dividido
en superficies de espejo mediante sectores. Respecto al efecto de
baja difracción, esta ventana no interferirá con la calidad del rayo
de medición de la excitación. El espejo también se puede vivir, por
ejemplo, en círculos concéntricos, o más ventajosamente en elipses.
Si la luz de excitación es lineal, el espejo tiene un orificio en el
centro y su área de los bordes es reflectante. En este caso, la luz
de excitación tendrá un ángulo sólido estrecho comparado con la
trayectoria de la luz de emisión. Esto es ventajoso para la
fotometría, considerando que la transmisión de la luz a través de
un pocillo estrecho es difícil en fotometría. La luz de excitación
fotométrica tendrá que penetrar a través de una superficie líquida
cóncava de manera afilada (usualmente un detergente se utiliza para
establecer la superficie con una concavidad máxima y por esta razón
la luz de excitación tendrá un ángulo sólido muy estrecho y se debe
focalizar exactamente a la altura correcta. El espejo también puede
ser dicroico. Este espejo refleja diferentes longitudes de onda de
diferentes maneras. Como la longitud de onda de excitación es menor
que la longitud de onda de emisión, las características de longitud
de onda del espejo se pueden adaptar para producir una eficiencia
conjunta óptima. Un espejo distrófico implica el problema de ser
practicable solamente en un par de longitudes de onda de
excitación-emisión.
El separador de rayos que separa la excitación y
la emisión también sirve como separador de rayos para que la luz de
excitación se separe en el detector de referencia, de manera que la
construcción será así directa.
La medición de la placa también se puede
realizar mediante ópticas de espejo. El uso de dos espejos esféricos
conectados en secuencia se prefiere especialmente. Sin embargo, un
espejo esférico genera un fuerte astigmatismo y así degrada las
características de imagen en la medición de pocillos estrechos. Sin
embargo, si los espejos conectados en secuencia tienen planos de
giro según un ángulo de 90 grados, el astigmatismo se compensará.
En otras palabras, el error se hace doble, pero el error del
astigmatismo del segundo espejo compensa el error del astigmatismo
del primer espejo y el resultado de la imagen será bueno con vista a
la medición fluorométrica y fotométrica. Este principio se ha
descrito en detalle en el documento WO 03/016979. Los espejos son
esféricos y cóncavos. Estos espejos son precisos y tienen costes de
producción bajos comparados con los espejos esféricos. Las ópticas
de espejo se pueden realizar también con la ayuda de espejos
esféricos substancialmente más caros, que permiten el uso de, por
ejemplo, un único espejo para generar un rayo de luz de excitación
cónico y preciso.
En las ópticas de espejo, un separador de rayos
puede ser uno de los utilizados en ópticas de lente tal como se han
mencionado anteriormente.
Las ópticas de espejo tienen la ventaja de ser
independientes de la longitud de onda.
Cuando las ópticas de espejo utilizan un
monocromator de grabado como monocromator de excitación, se
representa la hendidura de salida del grabado al pocillo. Los
filtros de polarización de excitación se colocan preferiblemente en
la proximidad de la hendidura. Los filtros de polarización de
excitación están colocados después del monocromator, porque los
monocromatores provocan la despolarización (es decir, la
degeneración de la polarización). El filtro de polarización de
emisión se coloca preferiblemente la proximidad de la hendidura de
entrada del monocromator de emisión. Los rayos de luz de excitación
y emisión se pueden separar entre sí a lo largo de su eje de
medición óptico común mediante un pequeño espejo plano (por
ejemplo, circular o elíptico). La luz de emisión volverá desde el
pocillo a la óptica y pasa mediante este espejo. Además, se puede
prever un separador de rayos para el canal de referencia justo por
encima del pocillo. Este separador de rayos es, por ejemplo, una
placa de vidrio, especialmente una placa de sílice (cuarzo
sintético). Una placa de sílice típicamente refleja un máximo del
10%, y así habrá una pérdida de señal relativamente pequeña. La
placa de vidrio protege simultáneamente la óptica contra vapores
desde los
pocillos.
pocillos.
El detector de excitación está situado en el
otro lado del pocillo. Un sistema de lentes se puede prever frente
al detector (por ejemplo, dos lentes
plano-convexas), para la luz de excitación ampliada
mediante la superficie líquida en el pocillo para focalizarse mejor
sobre la superficie del fotodetector. Las ópticas del ente se pueden
remplazar con ópticas de espejo mediante la utilización, por
ejemplo, de dos espejos cóncavos de la misma manera que las ópticas
de excitación.
La fuente de luz de excitación y el
monocromator, y también el monocromator de emisión y el detector,
pueden requerir un espacio relativamente grande. Para un tamaño de
analizador más pequeño, el uso de ópticas de fibra puede ser
conveniente, aunque provocarán una pérdida de señal en ese caso. El
analizador puede comprender, por ejemplo, tres módulos: un módulo de
excitación, un módulo de ópticas de medición y un módulo de emisión,
con ópticas de fibra utilizadas para conducir la luz entre los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de diferentes realizaciones de la
invención se proporcionan a continuación. Los ejemplos utilizan un
plano de polarización horizontal en el canal de emisión, sin
embargo, disposiciones similares se pueden realizar de manera
natural como por ejemplo, mediante polarización de emisión vertical.
La posición mutua relativa de los filtros de polarización del canal
de excitación y el canal de emisión es esencial en este caso.
En la medición fluorométrica representada en la
figura 1, la luz de excitación desde la fuente de luz 1 se conduce
al monocromator de excitación 2 y a través del filtro de
polarización de excitación 3H o 3V al recipiente de muestra 4. La
luz de emisión generada en el recipiente de muestra se conduce en
una dirección perpendicular a la luz de excitación a través del
filtro de polarización de emisión 5H y el monocromator de emisión 6.
La luz de emisión así generada se conduce al detector 7. El filtro
de polarización de emisión es así estacionario, mientras que el
filtro de excitación es reemplazable.
Para la determinación del factor G, se prevé un
detector 8 sobre la trayectoria de la luz de excitación, por detrás
del recipiente demuestra 4, perpendicular a la luz. Puede ser un
fotodetector de silicio en particular.
Para una determinación simple del factor G, el
recipiente de muestra se retira y la intensidad de excitación se
mide en los dos filtros de excitación 3_{H} y 3_{V}. A
continuación, el factor G se deriva a partir de la fórmula 7
anterior.
Con el uso de los filtros de excitación
separados 3_{H} y 3_{V}, el filtro se puede reemplazar con un
movimiento lineal, permitiendo la factibilidad de una orientación
precisa. Opcionalmente, uno podría utilizar un único filtro, que se
gira entre las mediciones.
El canal de excitación también comprende,
después del filtro de polarización 3_{H} (o 3_{V}), un separador
de rayos 9, a través del cual la luz se conduce a un detector la
referencia 10. Mediante este detector de referencia es posible
determinar el factor G en tiempo real también cuando la muestra está
en su posición. A continuación, el factor G se deriva según la
fórmula A anterior.
Una señal desde el detector de referencia
permite también que se tenga en cuenta el nivel de fluctuación de la
fuente de luz.
Cuando se retiran los filtros de polarización
3_{H} y 3_{V} del canal de excitación, se puede realizar una
medición y fotométrica utilizando el detector 8. Esto permite el uso
del aparato como equipo combinado sin ningún componente
suplementario.
En la figura 2, el fluorómetro de polarización
tiene una fuente de luz 1, a partir de la cual la luz de excitación
se condensa mediante un sistema de lentes 11 a una abertura de
excitación 12. La luz de excitación desde la abertura de excitación
se colima con un sistema de lentes 13, y la luz colimada se conduce
a través de un monocromator 2 (filtro de longitud de onda) y un
filtro de polarización horizontal o vertical 3H o 3V a un espejo
semitransparente 9.1.
La luz que ha pasado a través del espejo 9.1
converge mediante un sistema de lentes de focalización 14 a un
pocillo de muestra 4.1 situado por debajo. De esta manera, se
obtiene un punto luminoso en un área espacial definida en la muestra
en el pocillo.
La porción de la luz de excitación reflejada
desde el espejo 9.1 se conduce a un detector de referencia 10. Una
muestra representativa de la luz de excitación se obtiene desde el
espejo. Con la mitad de la luz utilizada para la excitación, la otra
mitad se puede utilizar en la determinación de la amplitud de
excitación. Un rayo de luz paralelo se puede dirigir a un detector
que tiene un área grande, o utilizando una lente convergente, a un
detector más
pequeño.
pequeño.
La luz de emisión que emana para la medición
desde el punto de luz sobre la muestra en el pocillo 4.1 pasa a
través de un sistema de lentes de focalización 14 a la superficie
inferior del espejo 9.1. La porción reflejada desde el mismo se
utiliza para formar una imagen del punto con la ayuda de un sistema
de lentes convergente 15 en una abertura de emisión 16. Desde la
abertura, la luz de emisión se conduce a través de un sistema de
lentes de colimación 17, un filtro de polarización de emisión
5_{H}, un monocromator 6 (filtro de longitud de onda) y un sistema
de lentes de condensador 18 al detector 7 (tubo
fotomultiplicador).
Para una medición a través, un sistema de lentes
de medición a través 19 (por ejemplo dos lentes
plano-convexas) y un detector 8 (por ejemplo un
fotodetector de silicio) están previstos por debajo del pocillo 4.1.
Esto permite realizar la calibración de la invención descrita
anteriormente (sin un pocillo) o por ejemplo una medición
fotométrica.
El haz de excitación se ha conformado mediante
ópticas de lentes con una forma troncocónica en el pocillo 4.1 para
obtener una buena separación del canal entre los pocillos y evitar
cualquier efecto perjudicial de las tolerancias de posicionamiento
del pocillo sobre los resultados de la medición.
El filtro de excitación es reemplazable: uno
puede elegir un filtro vertical 3_{V} o un filtro horizontal
3_{H}, o el filtro se puede eliminar en la medición de la
intensidad de la fluorescencia.
Un espejo semitransparente 9.1 puede ser una
ventana dividida en superficies de espejo mediante sectores. Esta
ventana no interfiere con la calidad del rayo de medición de la
excitación respecto a su efecto de baja difracción.
En el fluorómetro de la figura 3, la luz de
excitación desde una fuente de luz 1 se conduce a través de un
monocromator 2 (monocromator de grabado) y un filtro de polarización
de excitación 3_{H} y 3_{V} de manera perpendicular respecto a
una abertura de excitación 12.1 en la pared de la carcasa como un
objeto a modo de punto. Desde la abertura de excitación 12.1, el
rayo de luz se refleja con un espejo plano de pequeño tamaño 20 a un
primer espejo cóncavo 21, de manera que un rayo de luz paralelo se
emite a un segundo espejo cóncavo idéntico 22, cuyo plano de
inclinación está según un ángulo de 90 grados respecto al plano de
inclinación del primer espejo. En esta disposición, el astigmatismo
se compensa y el segundo espejo cóncavo forma una imagen a modo de
punto a través de una ventana de vidrio 9.2 prevista en el fondo de
la carcasa en un pocillo de medición 4.1 situado por debajo. La
ventana de vidrio 9.2 está ligeramente inclinada respecto a la
trayectoria de la luz. Una porción de la luz de excitación se
refleja desde la superficie de la ventana a un detector de
referencia 10. El detector de referencia está situado en el plano de
la imagen formado por la óptica, ya que es el pocillo de medición.
El detector de referencia monitoriza las variaciones en la
intensidad del rayo de luz, y las variaciones se tienen en cuenta
en el cálculo de las intensidades. Como el rayo de luz converge
hacia el pocillo 4.1, el rayo de luz incidente sobre el detector de
referencia se converge en consecuencia. Con la reflexión de la
ventana siendo aproximadamente del 10%, la pérdida de señal total
será de aproximadamente el 20%. Esto no disminuye la sensibilidad
del aparato substancialmente. Para evitar fluorescencia del fondo,
la ventana se puede prever con un espesor mínimo la ventana también
proporciona protección para las ópticas de medición, estando situado
el pocillo demuestra en un espacio cerrado, en el cual la humedad, u
otros gases o vapores perjudiciales, no tienen acceso al interior
de la óptica. El material de la ventana es preferiblemente sílice.
La ventana está preferiblemente colocada a un nivel suficientemente
alto por encima del pocillo de medición para evitar salpicaduras
desde cualquier dispositivo de dosificación que alcancen la
superficie de la ventana.
La luz de emisión generada en el pocillo de
medición 4.1 sigue a través del segundo espejo 22 al primer espejo
21 y desde ahí hacia el espejo plano 20. Parte de la luz de emisión
pasa mediante el espejo sobre su exterior, formando una imagen a
modo de punto con un astigmatismo corregido de manera perpendicular
respecto a una abertura de emisión 16.1 sobre la superficie de la
carcasa. Así, el espejo plano 20 tiene la función de separar la luz
de excitación de la luz de emisión. Para una eficiencia máxima, la
relación de división es preferiblemente del 50%: 50%.
Desde la abertura de emisión 16.1, la luz de
emisión se conduce a través de un filtro de polarización de emisión
5_{H} y un monocromator de emisión 6 (monocromator de grabado) a
un detector 7.
Para una medición a través, un sistema de lentes
de medición a través 19 (por ejemplo, dos lentes
plano-convexas) y un detector 8 (por ejemplo un
fotodetector de silicio) están previstos por debajo del pocillo 4.1.
Esto permite realizar la calibración de la invención (sin un
pocillo) o, por ejemplo, una medición fotométrica.
Claims (5)
1. Procedimiento para calibrar un fluorómetro de
polarización, comprendiendo el fluorómetro un canal de excitación
para conducir una luz de excitación polarizada a una muestra (4;
4.1) y un canal de emisión para conducir una luz de emisión desde la
muestra, comprendiendo el canal de emisión un filtro de polarización
(5_{H}), en cuyo procedimiento
- un primer filtro de polarización (3_{H})
está colocado en el canal de excitación, la luz se conduce a través
del canal de excitación y la intensidad de la luz transmitida se
mide mediante un detector de excitación (8),
- a continuación, el primer filtro de
polarización se retira y se reemplaza con un segundo filtro de
polarización (3_{V}), cuyo plano de polarización está invertido,
preferiblemente 90 grados, respecto al plano de polarización del
primer filtro de polarización, conduciéndose la luz a través del
canal de excitación, y midiéndose la intensidad de la luz
transmitida mediante el detector de excitación,
caracterizado porque
- el fluorómetro también comprende un detector
de referencia (10), de manera que una parte de la luz polarizada del
canal de excitación se conduce a través de unos medios adecuados (9;
9.1; 9.2) al detector de referencia antes de conducirse a la muestra
o al detector de excitación y porque una parte de la luz polarizada
del canal de excitación se conduce al detector de excitación (8), y
porque
- sobre la base de las dos mediciones de la
intensidad del detector de excitación (8), el detector de referencia
se calibra para medir de manera precisa las sensibilidades del
fluorómetro sobre los planos de polarización.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el detector de excitación (8) es un detector libre de
polarización.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que, frente al detector de excitación (8), hay un sistema
óptico (19), tal como un sistema de lentes o de espejos, que aumenta
su área efectiva.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los medios (9; 9.1; 9.2) en el
canal de excitación para conducir una parte de la luz polarizada
desde el canal de excitación al detector de referencia (10) y una
parte al detector de excitación (8) o a la muestra, es una placa de
vidrio, un espejo semitransparente, un espejo menor que el área del
canal de excitación, o una fibra óptica.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el polarizador de excitación
comprende un primer filtro de polarización (3_{H}) y un segundo
filtro de polarización (3_{V}), de manera que uno de los mismos
puede colocarse a su vez, preferiblemente con un movimiento lineal,
sobre la trayectoria de la luz dirigida desde una fuente de luz, o
en el que el polarizador de excitación es un polarizador
rotativo.
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