JPH04140661A - 細胞蛍光偏光度分析方法及び細胞蛍光偏光度分析装置 - Google Patents
細胞蛍光偏光度分析方法及び細胞蛍光偏光度分析装置Info
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- JPH04140661A JPH04140661A JP26429390A JP26429390A JPH04140661A JP H04140661 A JPH04140661 A JP H04140661A JP 26429390 A JP26429390 A JP 26429390A JP 26429390 A JP26429390 A JP 26429390A JP H04140661 A JPH04140661 A JP H04140661A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は、フローサイトメトリーを適用した細胞の蛍
光偏光度の分析方法及び分析装置に関する。
光偏光度の分析方法及び分析装置に関する。
（ロ）従来の技術
細胞の蛍光偏光度Ｐは、細胞膜や細胞質の粘性、流動性
に関係しており、細胞の活性化や幼若化の情報を得るこ
とができる。また、リンパ球の蛍光偏光度によるガン診
断の可能性も示唆されている。
に関係しており、細胞の活性化や幼若化の情報を得るこ
とができる。また、リンパ球の蛍光偏光度によるガン診
断の可能性も示唆されている。
（Ｃｅｒｅｋ、Ｌ、 Ｃｅｒｅｋ、Ｂ、 Ｅｕｒ、Ｊ、
Ｃａｎｃｅｒ １９７７Ｖｏ１．．１３、Ｐ２Ｏ３−
９１５）。
Ｃａｎｃｅｒ １９７７Ｖｏ１．．１３、Ｐ２Ｏ３−
９１５）。
蛍光偏光度Ｐを第５図を参照しながら説明すると、Ｃは
蛍光色素で染色された細胞であり、Ｚ軸方向に進む励起
光で励起される。■夕は、Ｘ方向の偏光を、ビ１はＸ方
向の偏光を示している。
蛍光色素で染色された細胞であり、Ｚ軸方向に進む励起
光で励起される。■夕は、Ｘ方向の偏光を、ビ１はＸ方
向の偏光を示している。
励起光による妨害を少なくするために通常は、励起光の
進行方向と直角方向、この第５図の場合は、Ｘ方向から
検出している。■１１、Ｉ工は蛍光の偏光成分を示して
おり、ＩＩｌは励起光の偏光方向Ｉ！と平行な偏光成分
を、Ｉよは垂直な平行成分を示している。蛍光偏光度Ｐ
は、励起光の偏光方向１．の時のＩ、、Ｉ工より、以下
の（１）式で表すことがユきる。
進行方向と直角方向、この第５図の場合は、Ｘ方向から
検出している。■１１、Ｉ工は蛍光の偏光成分を示して
おり、ＩＩｌは励起光の偏光方向Ｉ！と平行な偏光成分
を、Ｉよは垂直な平行成分を示している。蛍光偏光度Ｐ
は、励起光の偏光方向１．の時のＩ、、Ｉ工より、以下
の（１）式で表すことがユきる。
Ｐ＝ （Ｉ、、−１，）／（１，、＋１よ） ・・・（
１）一方、励起光の偏光方向がビ！の時は、蛍光の偏光
方向’ ＩＩ、■、は、励起光の偏光方向１゛！と同じ
傾き角度となり、ＩＩｌとＩよ共に■゛Ｊと垂直な偏光
方向となる。この時は、細胞Ｃの蛍光偏光度によらず、
ＩＩｌと■よは同じ値を示す。この現像は、両部光方向
の蛍光検出感度を同一とするための調整に利用される。
１）一方、励起光の偏光方向がビ！の時は、蛍光の偏光
方向’ ＩＩ、■、は、励起光の偏光方向１゛！と同じ
傾き角度となり、ＩＩｌとＩよ共に■゛Ｊと垂直な偏光
方向となる。この時は、細胞Ｃの蛍光偏光度によらず、
ＩＩｌと■よは同じ値を示す。この現像は、両部光方向
の蛍光検出感度を同一とするための調整に利用される。
実際に分析を行うには、例えばリンパ球の蛍光偏光度を
分析する場合には、被験者より血液を採取し、この血液
を比重遠沈法や、好中球の貧食能を利用してリンパ球を
選別し、測定目的に応じた蛍光標識を施す。
分析する場合には、被験者より血液を採取し、この血液
を比重遠沈法や、好中球の貧食能を利用してリンパ球を
選別し、測定目的に応じた蛍光標識を施す。
こうして得られたリンパ球の浮遊液は、キュベツトに入
れられ、第６図に示す測定装置で偏光成分を測定される
。このキュベツト３１は、石英等光学的に透明な材料で
作られており、光源３２よりの励起光３３が照射される
。なお、この励起光３３の偏光方向は、λ／２板３４に
より、第６図紙面と垂直な方向となっている（以下紙面
に垂直な偏光方向を記号「○」で表す）。
れられ、第６図に示す測定装置で偏光成分を測定される
。このキュベツト３１は、石英等光学的に透明な材料で
作られており、光源３２よりの励起光３３が照射される
。なお、この励起光３３の偏光方向は、λ／２板３４に
より、第６図紙面と垂直な方向となっている（以下紙面
に垂直な偏光方向を記号「○」で表す）。
励起光３３の照射領域３１ａよりの光４０は、散乱光と
共に、蛍光の紙面に垂直な偏光成分と、紙面に平行な偏
光成分（以下紙面に垂直な偏光方向を記号「１」又は「
−」で表す）とを含んでいる。この光４０は、集光レン
ズ３５で集光され、蛍光選別フィルタ３６で蛍光を選別
される。さらに偏光ビームスプリッタ３７で、紙面に垂
直な偏光成分と平行な偏光成分とに分離され、それぞれ
光検出器３８ａ、３８ｂにより電気信号に変換され、デ
ータ処理装置３９で上記（１）弐に基づき蛍光偏光度Ｐ
が算出される。
共に、蛍光の紙面に垂直な偏光成分と、紙面に平行な偏
光成分（以下紙面に垂直な偏光方向を記号「１」又は「
−」で表す）とを含んでいる。この光４０は、集光レン
ズ３５で集光され、蛍光選別フィルタ３６で蛍光を選別
される。さらに偏光ビームスプリッタ３７で、紙面に垂
直な偏光成分と平行な偏光成分とに分離され、それぞれ
光検出器３８ａ、３８ｂにより電気信号に変換され、デ
ータ処理装置３９で上記（１）弐に基づき蛍光偏光度Ｐ
が算出される。
また、他の方法としては、上記リンパ球浮遊液を、蛍光
偏光度検出機能を備えたフローサイトメータで測定する
方法もあった。
偏光度検出機能を備えたフローサイトメータで測定する
方法もあった。
（ハ）発明が解決しようとする課題
上記従来の蛍光偏光度の測定では、目的の細胞集団を選
別する、例えば血液中よりリンパ球を選別する操作が要
求される。しかし、リンパ球の選別は複雑で微妙な操作
を要し、時間と熟練を有する問題点があった。
別する、例えば血液中よりリンパ球を選別する操作が要
求される。しかし、リンパ球の選別は複雑で微妙な操作
を要し、時間と熟練を有する問題点があった。
また、こうした選別では、目的細胞集団の純度を上げる
ことが難しいと共に、細胞の活性に影響を与えることが
多く、正確なデータを得ることが困難である問題点があ
った。
ことが難しいと共に、細胞の活性に影響を与えることが
多く、正確なデータを得ることが困難である問題点があ
った。
さらに、細胞集団の細かい選別、例えばリンパ球のサブ
グループ（Ｂ細胞、Ｔｔ４胞等）を選別することは難し
く、個々のサブグループについて蛍光偏光度の分析が困
難である問題点があった。
グループ（Ｂ細胞、Ｔｔ４胞等）を選別することは難し
く、個々のサブグループについて蛍光偏光度の分析が困
難である問題点があった。
本発明は上記に鑑みなされたもので、試料の作成が容易
で、分析の精度が高く、さらに細胞集団を細かく選別し
て分析することができる細胞蛍光偏光度分析方法及び分
析装置の提供を目的としている。
で、分析の精度が高く、さらに細胞集団を細かく選別し
て分析することができる細胞蛍光偏光度分析方法及び分
析装置の提供を目的としている。
（ニ）課題を解決するための手段及び作用上記課題を解
決するため、第１請求項の細胞蛍光偏光度分析方法は、
少なくとも偏光度分析に係る蛍光色素で試料中の細胞を
染色し、この試料を細い液流中に流し、流れる細胞に光
ビームを照射して、前記蛍光色素の蛍光を励起し、各細
胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメー
タからなる細胞光情報を検出し、これら細胞光情報の内
、他のパラメータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報
を他の細胞集団の細胞光情報より選別し、この選別され
た目的細胞集団の細胞光情報の蛍光の偏光成分強度に基
づき、目的細胞集団の蛍光偏光度を分析するものである
。
決するため、第１請求項の細胞蛍光偏光度分析方法は、
少なくとも偏光度分析に係る蛍光色素で試料中の細胞を
染色し、この試料を細い液流中に流し、流れる細胞に光
ビームを照射して、前記蛍光色素の蛍光を励起し、各細
胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメー
タからなる細胞光情報を検出し、これら細胞光情報の内
、他のパラメータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報
を他の細胞集団の細胞光情報より選別し、この選別され
た目的細胞集団の細胞光情報の蛍光の偏光成分強度に基
づき、目的細胞集団の蛍光偏光度を分析するものである
。
この発明の細胞蛍光偏光度分析方法では、試料中のすべ
ての細胞について細胞光情報を測定した後、他のパラメ
ータ、例えば前方散乱光強度、９０°散乱光強度、蛍光
強度（蛍光偏光度分析に直接関与しない他の蛍光色素に
よる蛍光の強度）等を用いて、目的細胞集団の細胞光情
報を、他の細胞集団の細胞光情報を選別するものである
。従って、試料中より目的細胞集団を実際に選別する必
要がなくなり、試料の作成が容易となり、また、目的細
胞集団の選別精度も向上し、正確な分析が可能となる。
ての細胞について細胞光情報を測定した後、他のパラメ
ータ、例えば前方散乱光強度、９０°散乱光強度、蛍光
強度（蛍光偏光度分析に直接関与しない他の蛍光色素に
よる蛍光の強度）等を用いて、目的細胞集団の細胞光情
報を、他の細胞集団の細胞光情報を選別するものである
。従って、試料中より目的細胞集団を実際に選別する必
要がなくなり、試料の作成が容易となり、また、目的細
胞集団の選別精度も向上し、正確な分析が可能となる。
さらに、上記他の蛍光色素による染色を、蛍光色素で１
識したモノクローナル抗体と試料中の細胞を反応させる
という形で行えば、モノクローナル抗体の特異性により
、細かい細胞集団の選別、例えばリンパ球Ｔ細胞、Ｂ細
胞等の細胞光情報の選別が可能となり、これら細かい細
胞集団についての蛍光偏光度を分析することができる。
識したモノクローナル抗体と試料中の細胞を反応させる
という形で行えば、モノクローナル抗体の特異性により
、細かい細胞集団の選別、例えばリンパ球Ｔ細胞、Ｂ細
胞等の細胞光情報の選別が可能となり、これら細かい細
胞集団についての蛍光偏光度を分析することができる。
一方、第２請求項の細胞蛍光偏光度分析装置は、少なく
とも、偏光度分析に係る蛍光色素で染色された細胞の浮
遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れ
る細胞に、前記蛍光色素の蛍光を励起する光ビームを照
射する光源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細
胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメー
タからなる細胞光情報を検出する細胞光情報検出手段と
、この細胞光情報検出手段で得られた、前記他のパラメ
ータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報を他の細胞集
団の細胞光情報より選別する細胞光情報選別手段と、こ
の細胞光情報選別手段で選別された目的細胞集団の細胞
光情報の蛍光の偏光成分強度に基づき、目的細胞集団の
蛍光偏光度を分析する細胞蛍光偏光度分析手段と、この
細胞蛍光偏光度分析手段の分析結果を出力する出力手段
とを備えてなるものであり、第１請求項の細胞蛍光偏光
度分析方法を容易に実施することができる。
とも、偏光度分析に係る蛍光色素で染色された細胞の浮
遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れ
る細胞に、前記蛍光色素の蛍光を励起する光ビームを照
射する光源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細
胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメー
タからなる細胞光情報を検出する細胞光情報検出手段と
、この細胞光情報検出手段で得られた、前記他のパラメ
ータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報を他の細胞集
団の細胞光情報より選別する細胞光情報選別手段と、こ
の細胞光情報選別手段で選別された目的細胞集団の細胞
光情報の蛍光の偏光成分強度に基づき、目的細胞集団の
蛍光偏光度を分析する細胞蛍光偏光度分析手段と、この
細胞蛍光偏光度分析手段の分析結果を出力する出力手段
とを備えてなるものであり、第１請求項の細胞蛍光偏光
度分析方法を容易に実施することができる。
（ホ）実施例
本発明の一実施例を第１図乃至第４図に基づいて以下に
説明する。
説明する。
第２図は、実施例細胞蛍光偏光度分析装置の構成を説明
するブロック図である。１は、フローセルであり、石英
ガラス等により構成される。フローセル１の中心には、
フローチャネル１ａが形成されており、シース液と共に
試料中の細胞が第２図紙面垂直方向に流される。これら
細胞は、流体力学的焦点合わせ効果により、フローチャ
ネル１ａの中心軸上を１列になって流れていく。なお、
フローセル１にシース液及び試料を送液する送液系は、
本発明の要部でないため省略している（特願昭６３−１
５９８６６号参照）。
するブロック図である。１は、フローセルであり、石英
ガラス等により構成される。フローセル１の中心には、
フローチャネル１ａが形成されており、シース液と共に
試料中の細胞が第２図紙面垂直方向に流される。これら
細胞は、流体力学的焦点合わせ効果により、フローチャ
ネル１ａの中心軸上を１列になって流れていく。なお、
フローセル１にシース液及び試料を送液する送液系は、
本発明の要部でないため省略している（特願昭６３−１
５９８６６号参照）。
レーザ光源２は、この実施例ではＨｅ−Ｃｄレーザ（発
振波長４２１ｎｍ）又は、Ａｒレーザ（発振、波長４５
８ｎｍ又は４８８ｎｍ）を適用している。レーザ光源２
よりのレーザ光ｌは、偏光方向を第２図紙面に対し垂直
又は平行に回転させるためのλ／２板３を経て、フロー
チャぶル１ａ内を流れる細胞に照射される。
振波長４２１ｎｍ）又は、Ａｒレーザ（発振、波長４５
８ｎｍ又は４８８ｎｍ）を適用している。レーザ光源２
よりのレーザ光ｌは、偏光方向を第２図紙面に対し垂直
又は平行に回転させるためのλ／２板３を経て、フロー
チャぶル１ａ内を流れる細胞に照射される。
細胞よりは信号光が生じるが、その内部方向の信号光！
工は、前方散乱光としてレンズ５に集光されて、光検出
器１３ａに入射する。４は、レザビーム！。が直接光検
出器１３ａに入射するのを防止するビームブロッカであ
る。
工は、前方散乱光としてレンズ５に集光されて、光検出
器１３ａに入射する。４は、レザビーム！。が直接光検
出器１３ａに入射するのを防止するビームブロッカであ
る。
一方、細胞よりの９０°方向の信号光１２はレンズ６で
集光される。信号光１２は、その一部がグイクロイック
ミラー７で反射されて、９０°散乱光検出用の光検出器
１３ｂに入射する。９は、レーザ光源２の波長の光を透
過し、細胞よりの蛍光成分を阻止するフィルタである。
集光される。信号光１２は、その一部がグイクロイック
ミラー７で反射されて、９０°散乱光検出用の光検出器
１３ｂに入射する。９は、レーザ光源２の波長の光を透
過し、細胞よりの蛍光成分を阻止するフィルタである。
グイクロイックミラー７を透過した信号光は、さらにそ
の一部がもう１つのグイクロイックミラー８に入射する
。このダイクロインクミラー８は、後述のリンパ球の蛍
光偏光度分析の場合には蛍光色素ＰＥの蛍光（５１０ｎ
ｍにピークを持つ）と、フルオレセインの蛍光（５７５
ｎｍにピークを持つ）を分離するだめのものである。
の一部がもう１つのグイクロイックミラー８に入射する
。このダイクロインクミラー８は、後述のリンパ球の蛍
光偏光度分析の場合には蛍光色素ＰＥの蛍光（５１０ｎ
ｍにピークを持つ）と、フルオレセインの蛍光（５７５
ｎｍにピークを持つ）を分離するだめのものである。
ダイクロイックミラー８を透過した信号光は、前記ＰＥ
の蛍光を含み、この蛍光はフィルタ１１で選別され、Ｐ
Ｅの蛍光検出用の光検出器１．３ ｅに入射する。
の蛍光を含み、この蛍光はフィルタ１１で選別され、Ｐ
Ｅの蛍光検出用の光検出器１．３ ｅに入射する。
ダイクロイックミラー８で反射された蛍光はフルオレセ
インの蛍光を透過するフィルタ１０を透過し、偏光ビー
ムスプリッタ、この実施例では、グラントムソンプリズ
ム１２に入射し、第２図紙面に垂直な偏光成分と平行な
偏光成分とに分離され、垂直な偏光成分、平行な偏光成
分は、それぞれ光検出器１３ｄ、１３ｃに入射する。
インの蛍光を透過するフィルタ１０を透過し、偏光ビー
ムスプリッタ、この実施例では、グラントムソンプリズ
ム１２に入射し、第２図紙面に垂直な偏光成分と平行な
偏光成分とに分離され、垂直な偏光成分、平行な偏光成
分は、それぞれ光検出器１３ｄ、１３ｃに入射する。
この実施例では、前方散乱光用の光検出器１３ａにはホ
トダイオードを、その他の光検出器１３ｂ、１３ｃ、１
．３ ｄ、１３ｅには、光電子増倍管を適用している 光検出器１３ｃ、１３ｄは、蛍光検出感度補正回路１４
に接続される。フローセル１から光検出器１．Ｊｃ、１
３ｄまでの光学系の透過、反射、光検出特性は、一般に
第２図紙面に垂直な偏光成分と平行な偏光成分とは同一
にならない。このため、蛍光検出感度補正回路１４で、
細胞から発する同じ強度の偏光成分に対して、光検出器
１３ｃ、１３ｄが同じ大きさの信号出力を発生するよう
に補正する。
トダイオードを、その他の光検出器１３ｂ、１３ｃ、１
．３ ｄ、１３ｅには、光電子増倍管を適用している 光検出器１３ｃ、１３ｄは、蛍光検出感度補正回路１４
に接続される。フローセル１から光検出器１．Ｊｃ、１
３ｄまでの光学系の透過、反射、光検出特性は、一般に
第２図紙面に垂直な偏光成分と平行な偏光成分とは同一
にならない。このため、蛍光検出感度補正回路１４で、
細胞から発する同じ強度の偏光成分に対して、光検出器
１３ｃ、１３ｄが同じ大きさの信号出力を発生するよう
に補正する。
この補正回路１４で補正された、光検出器１３Ｃ１１３
ｄの信号出力、及び光検出器１３ａ、１３ｂ、１３ｅの
信号出力は、信号処理回路部１５で増幅された後、アナ
ログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器１６でデジタル変換さ
れて、ＭＰＵ１７に取り込まれる。信号処理回路部１５
の詳細は図示しないが、各光検出器１．３ ａ−１３ｅ
の信号出力をプリアンプで増幅した後、積分器で積分し
、さらにログ（又はリニア）アンプで増幅し、ピークボ
ールド回路でピークを保持して、Ａ／Ｄ変換器１６に出
力する。
ｄの信号出力、及び光検出器１３ａ、１３ｂ、１３ｅの
信号出力は、信号処理回路部１５で増幅された後、アナ
ログ／デジタル（Ａ／Ｄ）変換器１６でデジタル変換さ
れて、ＭＰＵ１７に取り込まれる。信号処理回路部１５
の詳細は図示しないが、各光検出器１．３ ａ−１３ｅ
の信号出力をプリアンプで増幅した後、積分器で積分し
、さらにログ（又はリニア）アンプで増幅し、ピークボ
ールド回路でピークを保持して、Ａ／Ｄ変換器１６に出
力する。
ＭＰＵ１７は、細胞から光情報を記憶するリストメモリ
機能、オートトリガに関する機能、細胞光情報の内１又
は２のパラメータについて、ヒストグラム、サイトグラ
ムを作成する機能、その他送液系を制御する機能等を備
えている。
機能、オートトリガに関する機能、細胞光情報の内１又
は２のパラメータについて、ヒストグラム、サイトグラ
ムを作成する機能、その他送液系を制御する機能等を備
えている。
ＭＰＵ１７には、キーボード１８、ＣＲＴ１９、プリン
タ２０が接続されている。キーボード１８は、各種コマ
ンドやデータを入力するためのものである。なお、入力
手段にマウスを併用すれば、操作がより簡単なものとな
る。ＣＲＴ１９、プリンタ２０は、上記ヒストグラム、
サイトグラムや分析結果を、表示、プリントするための
ものである。
タ２０が接続されている。キーボード１８は、各種コマ
ンドやデータを入力するためのものである。なお、入力
手段にマウスを併用すれば、操作がより簡単なものとな
る。ＣＲＴ１９、プリンタ２０は、上記ヒストグラム、
サイトグラムや分析結果を、表示、プリントするための
ものである。
次に、実施例細胞蛍光偏光度分析装置の動作について説
明する。
明する。
以下の説明では、リンパ球Ｔ細胞の蛍光偏光度分析を例
に挙げる。蛍光偏光度分析のための蛍光色素としては、
フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ）を用い、また
Ｔ細胞とＢ細胞の細胞光情報を分離するための蛍光色素
としてＰ Ｅ （ｐｈｙｃｈｏ ｅｒｙｔｈｒｉｎ）を
適用する。
に挙げる。蛍光偏光度分析のための蛍光色素としては、
フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ）を用い、また
Ｔ細胞とＢ細胞の細胞光情報を分離するための蛍光色素
としてＰ Ｅ （ｐｈｙｃｈｏ ｅｒｙｔｈｒｉｎ）を
適用する。
そして、各細胞について前方散乱光強度Ｉ。、９０°上
乱光強度Ｉ、。、ＰＥ蛍光強度ＩＦ、フルオレセインの
垂直偏光成分強度１よ、平行偏光成分強度Ｉ の５つの
パラメータを測定し、前方散乱光強度■。、９０°散乱
光強度Ｉ、。を用いてリンパ球の細胞光情報を選別し、
ＰＥ蛍光強度ＩＰにより、さらにＴ細胞の細胞光情報を
選別している。
乱光強度Ｉ、。、ＰＥ蛍光強度ＩＦ、フルオレセインの
垂直偏光成分強度１よ、平行偏光成分強度Ｉ の５つの
パラメータを測定し、前方散乱光強度■。、９０°散乱
光強度Ｉ、。を用いてリンパ球の細胞光情報を選別し、
ＰＥ蛍光強度ＩＰにより、さらにＴ細胞の細胞光情報を
選別している。
測定を行う前に、蛍光検出感度補正回路１４の調整が行
われる。まず、フローセル１に入射するレーザビーム！
。の偏光方向が第２図紙面に対して平行となるようにλ
／２板３を回転調整する。
われる。まず、フローセル１に入射するレーザビーム！
。の偏光方向が第２図紙面に対して平行となるようにλ
／２板３を回転調整する。
次にフローセル１に、フルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）で標識したラテックス粒子を流す。光検
出器１３ｃ、１３ｄの信号出力をオシロスコープ（図示
せず）でモニタし、パルスの波高が同じになるように、
蛍光検出感度補正回路の増幅器ゲインを調整する。調整
後、フローセル１に入射するレーザビーム！。の偏光方
向が第２図に示すように紙面と垂直となるように、λ／
２板３を回転させて設定する。なお、この調整は毎回の
測定時に行う必要はない。
ト（ＦＩＴＣ）で標識したラテックス粒子を流す。光検
出器１３ｃ、１３ｄの信号出力をオシロスコープ（図示
せず）でモニタし、パルスの波高が同じになるように、
蛍光検出感度補正回路の増幅器ゲインを調整する。調整
後、フローセル１に入射するレーザビーム！。の偏光方
向が第２図に示すように紙面と垂直となるように、λ／
２板３を回転させて設定する。なお、この調整は毎回の
測定時に行う必要はない。
次に試料の作成について説明する。まず、全血をリン酸
緩衝液で洗浄後血清成分を除去する。次に、ＰＥで標識
したモノクローナル抗体０ＢＫ７を添加して、数十分反
応さセた後、溶血処理して洗浄する。さらに、Ｆ Ｄ
Ａ （ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ ｄｉａｉｅｔａｔｅ）を
加える。ＦＤＡは、細胞膜を透過して、細胞内の酵素に
より、フルオレセインに変換する。
緩衝液で洗浄後血清成分を除去する。次に、ＰＥで標識
したモノクローナル抗体０ＢＫ７を添加して、数十分反
応さセた後、溶血処理して洗浄する。さらに、Ｆ Ｄ
Ａ （ｆｌｕｏｒｅｃｅｉｎ ｄｉａｉｅｔａｔｅ）を
加える。ＦＤＡは、細胞膜を透過して、細胞内の酵素に
より、フルオレセインに変換する。
こうして数分間反応させた後、測定が行われる。
まず、試料が図示しない送液系に吸引され、シース液と
共にフローチャネルｌａ内を流れる。
共にフローチャネルｌａ内を流れる。
試料中の細胞は、フローチャネル１ａ中心軸上を一列に
なって流れていく。各細胞が、レーザビーム！。を横切
る時に、信号光！！工、Ｉ２が発生し、前方散乱光強度
Ｉ。、９０°散乱光強度■、。、ＰＥ蛍光強度Ｉ２、垂
直偏光成分強度Ｉよ、平行偏光成分強度Ｉ が測定され
る〔ステップ（以下ＳＴという）１、第１図参照］。こ
うして測定された細胞光情報は、ＭＰＵ１７のメモリに
格納されていく （リストメモリ）。
なって流れていく。各細胞が、レーザビーム！。を横切
る時に、信号光！！工、Ｉ２が発生し、前方散乱光強度
Ｉ。、９０°散乱光強度■、。、ＰＥ蛍光強度Ｉ２、垂
直偏光成分強度Ｉよ、平行偏光成分強度Ｉ が測定され
る〔ステップ（以下ＳＴという）１、第１図参照］。こ
うして測定された細胞光情報は、ＭＰＵ１７のメモリに
格納されていく （リストメモリ）。
次に４、ＭＰＵ１７は前方散乱光強度■。、９０゜散乱
光強度■、。を、それぞれ縦軸、横軸とするサイトダラ
ムを作成する（Ｓｒ２、第３図（ａ）参照）。
光強度■、。を、それぞれ縦軸、横軸とするサイトダラ
ムを作成する（Ｓｒ２、第３図（ａ）参照）。
第３図（ａ）中、Ａは溶血赤血球のゴースト及びゴミ、
Ｌはリンパ球、Ｍは単球、Ｇは顆粒球のグループを示し
ている。
Ｌはリンパ球、Ｍは単球、Ｇは顆粒球のグループを示し
ている。
次に、オートトリガ演算を行い、リンパ球のグループＬ
のみを含む画分りを設定する（Ｓｒ３）。
のみを含む画分りを設定する（Ｓｒ３）。
このオートトリガ演算は種々の方式があり、例えば特願
昭６３−１９３０３３号明細書又は、特願昭６３−１９
３０７２号明細書記載の方式を適用できる。また、異常
なデータの場合には、マウス等を用いて手動で両分を設
定することも可能である。
昭６３−１９３０３３号明細書又は、特願昭６３−１９
３０７２号明細書記載の方式を適用できる。また、異常
なデータの場合には、マウス等を用いて手動で両分を設
定することも可能である。
画分りに属する細胞光情報、すなわちリンパ球の細胞光
情報の内、ＰＥ蛍光強度ＩＰについてヒストグラムを作
成する（Ｓｒ１、第３図（ｂ）参照〕。
情報の内、ＰＥ蛍光強度ＩＰについてヒストグラムを作
成する（Ｓｒ１、第３図（ｂ）参照〕。
前記モノクローナル抗体０ＫＢ７は、リンパ球Ｂ細胞に
選択的に結合するので、第３図（ｂ）に示すようにＢ細
胞のグループとＴ細胞のグループとが分離して現われる
。Ｓｒ１では、オートトリガ演算により［ｐいを設定し
、Ｔ細胞の細胞光情報を選別する Ｓｒ６では、こうして得られたＴ細胞の細胞光情報の垂
直成分偏光強度ｒよ、平行成分偏光強度■ より、各Ｔ
細胞について蛍光偏光度Ｐを算出する。そして、偏光成
分強度■よ、■Ｉ＋についてヒストグラムを作成すると
共に［第４図（ａ）参照］、蛍光偏光度Ｐのヒストグラ
ムを作成する〔第４図い）参照、５Ｔ７）。さらに、蛍
光偏光度Ｐのヒストグラムより、平均値等の統計量を算
出しく５Ｔ８）、これらの値を、ＣＲＴ１９に表示する
と共に（Ｓｒ９）、プリンタ２０でプリントアウトされ
る（ＳＴＩＯ）。なお、第４図（ｂ）の蛍光偏光度Ｐの
ヒストグラムの平均値が、第６図に示す従来のキュヘッ
ト法による測定結果に対応する。
選択的に結合するので、第３図（ｂ）に示すようにＢ細
胞のグループとＴ細胞のグループとが分離して現われる
。Ｓｒ１では、オートトリガ演算により［ｐいを設定し
、Ｔ細胞の細胞光情報を選別する Ｓｒ６では、こうして得られたＴ細胞の細胞光情報の垂
直成分偏光強度ｒよ、平行成分偏光強度■ より、各Ｔ
細胞について蛍光偏光度Ｐを算出する。そして、偏光成
分強度■よ、■Ｉ＋についてヒストグラムを作成すると
共に［第４図（ａ）参照］、蛍光偏光度Ｐのヒストグラ
ムを作成する〔第４図い）参照、５Ｔ７）。さらに、蛍
光偏光度Ｐのヒストグラムより、平均値等の統計量を算
出しく５Ｔ８）、これらの値を、ＣＲＴ１９に表示する
と共に（Ｓｒ９）、プリンタ２０でプリントアウトされ
る（ＳＴＩＯ）。なお、第４図（ｂ）の蛍光偏光度Ｐの
ヒストグラムの平均値が、第６図に示す従来のキュヘッ
ト法による測定結果に対応する。
なお、上記説明では、リンパ球Ｔ細胞の蛍光偏光度分析
を例に挙げたが、リンパ球Ｂ細胞、単球、顆粒球、ある
いはその他の血球、細胞の蛍光偏光度分析にも本発明は
適用可能である。
を例に挙げたが、リンパ球Ｂ細胞、単球、顆粒球、ある
いはその他の血球、細胞の蛍光偏光度分析にも本発明は
適用可能である。
（へ〕溌明の効果
以上説明したように第１請求項の細胞蛍光偏光度分析方
法は、少なくとも偏光度分析に係る蛍光色素で試料中の
細胞を染色し、この試料を細い液流中に流し、流れる細
胞に光ビームを照射して、前記蛍光色素の蛍光を励起し
、各細胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパ
ラメータからなる細胞光情報を検出し、これら細胞光情
報の内、他のパラメータを用いて、目的細胞集団の細胞
光情報を他の細胞集団の細胞光情報より選別し、この選
別された目的細胞集団の細胞光情報の蛍光の偏光成分強
度に基づき、目的細胞集団の蛍光偏光度を分析するもの
であるから、試料の作成が容易で、分析の精度が高く、
さらに細胞集団を細かく選別して分析できる利点を有し
ている。
法は、少なくとも偏光度分析に係る蛍光色素で試料中の
細胞を染色し、この試料を細い液流中に流し、流れる細
胞に光ビームを照射して、前記蛍光色素の蛍光を励起し
、各細胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパ
ラメータからなる細胞光情報を検出し、これら細胞光情
報の内、他のパラメータを用いて、目的細胞集団の細胞
光情報を他の細胞集団の細胞光情報より選別し、この選
別された目的細胞集団の細胞光情報の蛍光の偏光成分強
度に基づき、目的細胞集団の蛍光偏光度を分析するもの
であるから、試料の作成が容易で、分析の精度が高く、
さらに細胞集団を細かく選別して分析できる利点を有し
ている。
また、第２請求項の細胞蛍光偏光度分析装置は、少なく
とも、偏光度分析に係る蛍光色素で染色された細胞の浮
遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れ
る細胞に、前記蛍光色素の蛍光を励起する光ビームを照
射する光源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細
胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメー
タからなる細胞光情報を検出する細胞光情報検出手段と
、この細胞光情報検出手段で得られた、前記他のパラメ
ータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報を他の細胞集
団の細胞光情報より選別する細胞光情報選別手段と、こ
の細胞光情報選別手段で選別された目的細胞集団の細胞
光情報の蛍光の偏光成分強度に基づき、目的細胞集団の
蛍光偏光度を分析する細胞蛍光偏光度分析手段と、この
細胞蛍光偏光度分析手段の分析結果を出力する出力手段
とを備えてなるものであるから、第１請求項の細胞蛍光
偏光度分析方法を容易に実施することができる利点を有
している。
とも、偏光度分析に係る蛍光色素で染色された細胞の浮
遊液が流されるフローセルと、このフローセル内を流れ
る細胞に、前記蛍光色素の蛍光を励起する光ビームを照
射する光源と、この光ビームが照射されたそれぞれの細
胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメー
タからなる細胞光情報を検出する細胞光情報検出手段と
、この細胞光情報検出手段で得られた、前記他のパラメ
ータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報を他の細胞集
団の細胞光情報より選別する細胞光情報選別手段と、こ
の細胞光情報選別手段で選別された目的細胞集団の細胞
光情報の蛍光の偏光成分強度に基づき、目的細胞集団の
蛍光偏光度を分析する細胞蛍光偏光度分析手段と、この
細胞蛍光偏光度分析手段の分析結果を出力する出力手段
とを備えてなるものであるから、第１請求項の細胞蛍光
偏光度分析方法を容易に実施することができる利点を有
している。
第１図は、本発明の一実施例に係る細胞蛍光偏光度分析
装置の動作を説明するフロー図、第２図は、同細胞蛍光
偏光度分析装置の構成を説明する図、第３図（ａ）は、
同細胞蛍光偏光度分析装置における、前方散乱光強度−
９０°散乱光強度サイトグラム辺−例を示す図、第３図
（ｂ）は、同細胞蛍光偏光度分析装置におけるＰＥ蛍光
強度のヒストグラムの一例を示す図、第４図（ａ）は、
同細胞蛍光偏光度分析装置における蛍光偏光成分強度の
ヒストグムの一例を示す図、第４図（ｂ）は、同細胞蛍
光偏光度分析装置における蛍光偏光度のヒストグラムの
一例を示す図、第５図は、蛍光偏光度分析の原理を説明
する図、第６図は、従来の蛍光偏光度分析方法を説明す
る図である。 １：フローセル、 ２：レーザ光源、１２ニゲラ
ントムソンプリズム、 １３ａ・１３ｂ１３ｃ・１３ｄ−１３ｅ：光検出器、 １７：ＭＰＵ、 １９：ＣＲＴ。 ２０：プリンタ。 特許出願人 オムロン株式会社代理人 弁
理士 中 村 茂 信第 図 第 図 （ａ） ｈ 第 図 （ｂ） ｐ ｈ 第 図 （ａ） ｎ 工１ ｈ 第 図 （ｂ） ｈ 第 図
装置の動作を説明するフロー図、第２図は、同細胞蛍光
偏光度分析装置の構成を説明する図、第３図（ａ）は、
同細胞蛍光偏光度分析装置における、前方散乱光強度−
９０°散乱光強度サイトグラム辺−例を示す図、第３図
（ｂ）は、同細胞蛍光偏光度分析装置におけるＰＥ蛍光
強度のヒストグラムの一例を示す図、第４図（ａ）は、
同細胞蛍光偏光度分析装置における蛍光偏光成分強度の
ヒストグムの一例を示す図、第４図（ｂ）は、同細胞蛍
光偏光度分析装置における蛍光偏光度のヒストグラムの
一例を示す図、第５図は、蛍光偏光度分析の原理を説明
する図、第６図は、従来の蛍光偏光度分析方法を説明す
る図である。 １：フローセル、 ２：レーザ光源、１２ニゲラ
ントムソンプリズム、 １３ａ・１３ｂ１３ｃ・１３ｄ−１３ｅ：光検出器、 １７：ＭＰＵ、 １９：ＣＲＴ。 ２０：プリンタ。 特許出願人 オムロン株式会社代理人 弁
理士 中 村 茂 信第 図 第 図 （ａ） ｈ 第 図 （ｂ） ｐ ｈ 第 図 （ａ） ｎ 工１ ｈ 第 図 （ｂ） ｈ 第 図
Claims (2)
- （１）少なくとも偏光度分析に係る蛍光色素で試料中の
細胞を染色し、 この試料を細い液流中に流し、流れる細胞に光ビームを
照射して、前記蛍光色素の蛍光を励起し、各細胞につい
て、前記蛍光の偏光成分強度及び他のパラメータからな
る細胞光情報を検出し、これら細胞光情報の内、他のパ
ラメータを用いて、目的細胞集団の細胞光情報を他の細
胞集団の細胞光情報より選別し、 この選別された目的細胞集団の細胞光情報の蛍光の偏光
成分強度に基づき、目的細胞集団の蛍光偏光度を分析す
る細胞蛍光偏光度分析方法。 - （２）少なくとも、偏光度分析に係る蛍光色素で染色さ
れた細胞の浮遊液が流されるフローセルと、このフロー
セル内を流れる細胞に、前記蛍光色素の蛍光を励起する
光ビームを照射する光源と、この光ビームが照射された
それぞれの細胞について、前記蛍光の偏光成分強度及び
他のパラメータからなる細胞光情報を検出する細胞光情
報検出手段と、 この細胞光情報検出手段で得られた、前記他のパラメー
タを用いて、目的細胞集団の細胞光情報を他の細胞集団
の細胞光情報より選別する細胞光情報選別手段と、 この細胞光情報選別手段で選別された目的細胞集団の細
胞光情報の蛍光の偏光成分強度に基づき、目的細胞集団
の蛍光偏光度を分析する細胞蛍光偏光度分析手段と、 この細胞蛍光偏光度分析手段の分析結果を出力する出力
手段とを備えてなる細胞蛍光偏光度分析装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26429390A JPH04140661A (ja) | 1990-10-01 | 1990-10-01 | 細胞蛍光偏光度分析方法及び細胞蛍光偏光度分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26429390A JPH04140661A (ja) | 1990-10-01 | 1990-10-01 | 細胞蛍光偏光度分析方法及び細胞蛍光偏光度分析装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04140661A true JPH04140661A (ja) | 1992-05-14 |
Family
ID=17401157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26429390A Pending JPH04140661A (ja) | 1990-10-01 | 1990-10-01 | 細胞蛍光偏光度分析方法及び細胞蛍光偏光度分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04140661A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100396954B1 (ko) * | 2001-03-27 | 2003-09-03 | 임채헌 | 광원의 파장 분석용 필터박스 및 필터박스를 이용한 세포분석 장치 |
| JP2007505307A (ja) * | 2003-09-10 | 2007-03-08 | サーモ エレクトロン オイ | 偏光蛍光計 |
-
1990
- 1990-10-01 JP JP26429390A patent/JPH04140661A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100396954B1 (ko) * | 2001-03-27 | 2003-09-03 | 임채헌 | 광원의 파장 분석용 필터박스 및 필터박스를 이용한 세포분석 장치 |
| JP2007505307A (ja) * | 2003-09-10 | 2007-03-08 | サーモ エレクトロン オイ | 偏光蛍光計 |
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