ES2317043T3 - Proteinas portadoras para vacunas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para incrementar la inmunogenicidad de un antígeno carbohidrato que comprende: Conjugar el antígeno con el fragmento C de la toxina del tétanos para dar una vacuna conjugada, en la que la administración a un paciente de la vacuna conjugada con el fragmento C incrementa la potencia del antígeno, sin esencialmente incrementar de la potencia protectora frente a la toxina del tétanos.
Description
Proteínas portadoras para vacunas.
La presente invención se refiere a proteínas
transportadoras mejoradas para vacunas a base de antígenos,
incluidas vacunas a base de polisacáridos.
La conjugación de un polisacárido con una
proteína transportadora puede convertir con eficacia a ese
polisacárido en más inmunogénico. Durante décadas se ha usado el
toxoide del tétanos en esta capacidad cono transportador y su
perfil de seguridad se ha establecido en, al menos, el contexto de
usos pasados.
El gen estructural de la toxina del tétanos se
ha clonado y secuenciado. Fairweather y col., J. Bacteriol. 165:
21-27 (1986); Fairweather y col., Nuci. Acid Res.
14: 7809-7812 (1986). Estos estudios han confirmado
la estructura de la toxina del tétanos como una proteína de 150 kD,
que comprende 1315 aminoácidos. El fragmento C, que constituye la
porción de unión de la toxina nativa del tétanos, es un polipéptido
de 52 kD generado por la escisión de la toxina realizada con
papaína y corresponde a los 451 aminoácidos en el extremo C. Véase
la figura 1.
Se ha descubierto que el toxoide del tétanos
contiene de a 2 a 3 epítopos universales de las células T. Demotz y
col., J. Immunol 142: 394-402 (1989). Esta
característica convierte al toxoide del tétanos en altamente eficaz
en seres humanos. Se ha demostrado que el fragmento C del toxoide no
es tóxico. Este fragmento también contiene al menos uno de los
epítopos inmunogénicos universales de las células T reconocidos por
los donantes reforzados. Valmori y col., J. Immunol 149:
717-2 1 (1992); Panina-Bordignon y
col., Eur. J. Immunol. 19: 2237 (1989).
Actualmente las vacunas de conjugados
polisacáridos capsulares (PC) destinadas a una variedad de
infecciones bacterianas se están desarrollando y bajo evaluación
clínica. La inclusión de múltiples serotipos de PC combinados en
una única inyección está actualmente en estudio. La combinación de
vacunas de conjugados de PC en una única inyección multivalente
puede tener como resultado una competencia entre los diferentes
componentes y afectar de forma adversa a la inmunogenicidad de
cualquiera de los componentes individuales. Fattom y col., Vaccine
17: 126-33 (1999).
El toxoide del tétanos encuentra un mayor uso en
las vacunas de polisacáridos. En la actualidad ha surgido el
problema de que la población vacunada estará sobreexpuesta al
tétanos, con el riesgo de que induzca tolerancia y/o
hipersensibilidad en la población. Por ejemplo, la inyección en
ratones de una dosis inmunogénica del transportador, seguida por
inmunización con el conjugado hapteno-transportador
suprime de forma selectiva la respuesta de anticuerpos
anti-hapteno. Esta supresión epitópica inducida por
transportador puede estar relacionada con la inducción de células T
específicas del transportador que, a su vez, podrían inhibir de
forma selectiva la respuesta anti-hapteno. La
supresión epitópica puede inducirse a través de la expansión de los
clones específicos para los epítopos del transportador y la
competición antigénica entre el hapteno y los epítopos del
transportador. Schutze y col., J. Immunol. 37:
2635-40 (1989). En seres humanos se ha demostrado
que la inmunidad previa contra una proteína transportadora modula la
respuesta sexológica a las vacunas de conjugados sintéticas. Di
John y col., Lancet 2 (8677): 1415-8 (1989).
Barrington y col. (Infect. & Immun. 61: 432-8,
1993) han mostrado que se observaba supresión epitópica de la
respuesta de anticuerpos a la vacuna conjugada de tipo b contra
Haemophilus influenzae mediante preinmunización con los
componentes de la vacuna. Más recientemente, Burrage y col.
(Infect. & Immun. 70: 4946-54, 2002) han
demostrado alguna supresión epitópica de la respuesta de
anticuerpos a la vacuna conjugada frente al meningococo C mediante
preinmunización con la proteína transportadora del tétanos. En
ratones se observó supresión epitópica de la respuesta de
anticuerpos de los conjugados de
tétanos-polisacáridos neumocócicos y meningocócicos
tras la administración de dosis de transportador reforzado con el
toxoide del tétanos (Peeters y col. Infect & Immun 59:
3504-10, 991). Debido a estas potenciales
consecuencias adversas, el toxoide del tétanos no debería seguir
administrándose como se ha hecho en el pasado, por lo que se
necesitan transportadores mejorados.
En el documento US 5.443.966 se describe una
vacuna contra el tétanos, que comprende el fragmento C de la toxina
del tétanos, en combinación con un transportador distinto
farmacéuticamente aceptable y que incluye otro antígeno. En el
documento WO99/15671 se describe una vacuna que comprende un
fragmento C de la toxina del tétanos condensado con una región
pre-S1 y/o pre-S2 del VHB y un
transportador farmacéuticamente aceptable. La toxina del tétanos y
el antígeno están condensados a través de una región ligante de tipo
bisagra. En el documento US 5.785.973 se describe el uso de un
conjugado inmunogénico que comprende un antígeno polisacárido unido
a un epítopo de la toxina del tétanos, que se obtiene mediante la
escisión en fragmentos de la molécula de la toxina del tétanos. En
el documento EP 0 427 347 se describe un transportador peptídico
universal que corresponde a los fragmentos de la proteína de la
toxina del tétanos.
En ninguno de estos documentos se describe el
uso de un antígeno conjugado con la toxina del tétanos.
El Fragmento C en la producción de una vacuna
conjugada, en ausencia de un transportador aparte.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona un procedimiento para mejorar la inmunogenicidad de un
antígeno de carbohidrato, en el que el procedimiento se expone en la
reivindicación 1. La invención también proporciona una vacuna
conjugada compuesta esencialmente por un antígeno polisacárido
capsular conjugado con el fragmento C de la toxina del tétanos.
También se proporciona el uso de tal vacuna en la fabricación de un
medicamento para inmunizar un paciente contra una infección.
Otras características de la invención se exponen
en las reivindicaciones adjuntas.
También se describe un antígeno conjugado que
comprende una o más fracciones de polisacáridos de al menos un
patógeno diana unido covalentemente a una fracción proteica del
fragmento c del toxoide del tétanos. Como se usa en la presente
memoria descriptiva, "patógeno diana" se puede referir a
cualquier patógeno exógeno que comprende un epítopo polisacárido
que puede ser reconocido por el sistema inmunitario de un mamífero o
un ave, tal como un patógeno bacteriano o fúngico.
También se describe una vacuna que comprende una
o más fracciones de polisacáridos de al menos un patógeno diana
unido covalentemente a una fracción proteica del fragmento c del
toxoide del tétanos.
También se describe un procedimiento para
provocar una respuesta inmunitaria frente a un patógeno diana en un
mamífero o ave, que comprende la etapa de inocular al mamífero o al
ave una cantidad eficaz de una vacuna que comprende un antígeno
conjugado que comprende una o más fracciones de polisacárido de al
menos un patógeno diana unidas covalentemente a una fracción
proteica del fragmento C del toxoide del tétanos. El procedimiento
puede practicarse en aves tales como pollos, pavos, emúes,
avestruces y otras aves comercialmente importantes.
Preferentemente, el procedimiento se practica con mamíferos tales
como roedores, equinos, bovinos, otros mamíferos de manada
comercialmente importantes, caninos, felinos, otros animales de
compañía, y seres humanos, Particularmente, el procedimiento se
puede practicar en seres humanos.
También se describe un procedimiento para
prevenir una infección posterior en un mamífero por un patógeno
diana en un mamífero o ave, que comprende la etapa de inocular al
mamífero o al ave una cantidad eficaz de una vacuna que comprende
un antígeno conjugado que comprende una o más fracciones de
polisacárido de al menos un patógeno diana unidas covalentemente a
una fracción proteica del fragmento C del toxoide del tétanos. El
procedimiento puede practicarse en aves tales como pollos, pavos,
emúes, avestruces y otras aves comercialmente importantes.
Preferentemente, el procedimiento se practica en mamíferos tales
como roedores, equinos, bovinos, otros mamíferos de manada
comercialmente importantes, caninos, felinos, otros animales de
compañía, y seres humanos, Particularmente, el procedimiento se
puede practicar en seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es una descripción esquemática de la
toxina del tétanos.
La figura 2 representa el perfil y el peso
molecular de la TTc nativa y recombinante.
La figura 3 representa comparaciones del
fragmento C recombinante y el toxoide del tétanos con conjugados
meningocócicos.
La figura 4 representa comparaciones del
fragmento C recombinante y el toxoide del tétanos con conjugados
meningocócicos.
La figura 5 representa IgG específicas de tipo
producidas por conjugados de GBSP con el toxoide del tétanos o el
fragmento C recombinante.
La figura 6 representa la eficacia de los
conjugados de GBSP en un modelo de ratón neonato.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se desvela por primera vez en la presente
memoria descriptiva, el Fragmento C de la toxina del tétanos, a
menudo denominado "TTc", se puede usar como proteína
transportadora de polisacáridos, como, por ejemplo, para vacunas de
polisacáridos capsulares, para protección contra infecciones
bacterianas o fúngicas. El Fragmento C, cuando se conjuga con un
antígeno puede incrementar la inmunogenicidad de dicho antígeno, lo
que significa que la capacidad de dicho antígeno para provocar una
respuesta inmunitaria se potencia a través de la conjugación con el
Fragmento C. Esta potenciación a menudo se ha denominado efecto del
transportador, que, en esencia, transforma el polisacárido de un
antígeno independiente de células T a un antígeno dependiente de
células T. La evidente falta de anticuerpos neutralizantes de la
toxina del tétanos en los animales inmunizados con los conjugados
de TTC con polisacáridos y la reducción resultante del
reconocimiento del toxoide del tétanos nativo, junto con la
evidente conservación de la capacidad transportadora, hace del TTc
un atractivo sustituto del toxoide del tétanos.
Los datos presentados en la presente memoria
descriptiva demuestran que el TTc y un TTC recombinante (rTTc) se
pueden usar como transportadores de polisacáridos y provocan una
respuesta inmunitaria equivalente a la del toxoide del tétanos en
términos de anticuerpos IgG específicos frente al polisacárido.
Véase la Figura 2. Estos anticuerpos tienen una elevada actividad
funcional medida por la capacidad para matar las bacterias.
El Fragmento C (TTc) se refiere a la porción del
extremo carboxilo de aproximadamente 865-1315
posiciones aminoacídicas, como se representa en la figura 1. Por
tanto, en el contexto de la presente invención, el Fragmento C se
refiere a la separación de la región de al menos una porción del
resto de la molécula completa del toxoide del tétanos, que se puede
realizar mediante digestión del toxoide con papaína u otras
proteasas a través de la expresión recombinante del fragmento. La
expresión recombinante del Fragmento C se describe en la patente de
EE.UU. 5.443.966. En consecuencia, una vacuna que comprende un
antígeno conjugado con el fragmento C carecerá de al menos una
porción de la región que no corresponde al Fragmento C (es decir, el
fragmento B en la figura 1).
Por supuesto, se pueden realizar diversas
adiciones, deleciones y sustituciones en la secuencia del TTc para
dar variantes sin que ello afecte de forma adversa a las capacidades
transportadoras de la molécula. Por ejemplo, se pueden efectuar
sustituciones conservadoras y semiconservadoras de aminoácidos.
Entre las sustituciones conservadoras de aminoácidos se incluyen
cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a
glutamina o histidina-, aspartato a glutamato; cisteína a serina;
glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina;
histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina;
leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina, glutamina o
glutamato; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a
tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a
serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina;
valina a isoleucina o leucina. Como los expertos en las técnicas de
ingeniería de proteínas apreciarán, las mutaciones conservadoras y
semiconservadoras mencionadas en la presente memoria descriptiva se
realizan, preferentemente, en regiones fuera de la región
antigénica/inmunogénica reconocida del TTc. Entre las regiones
adecuadas para mutaciones con varios propósitos (p. ej., la adición
de una "marca" polipeptídica para facilitar la purificación de
la proteína) se incluyen las regiones C terminal y
N terminal.
N terminal.
Se pueden crear variantes mediante técnicas
recombinantes que emplean procedimientos genómicos o de clonación
de ADNc. Se pueden emplear técnicas de mutagénesis específica de
sitio y dirigida a una región. Véase CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY vol. 1, cap. 8 (Ausubel y col. eds., J. Wiley & Sons
1989 & Supp 1990-93); PROTEIN ENGINEERING
(Oxender & Fox eds., A. Liss, Inc. 1987). Además, para la
mutagénesis se pueden emplear técnicas mediadas por mutaciones en
bloques cortos y mediante PCR. Véase PCR TECHNOLOGY (Erlich ed.,
Stockton Press 1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vols.
1 & 2, ant. En PROTEIN ENGINEERING, loc. cit. y CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, vols. 1 & 2, ant. Se
describen abordajes de secuenciación, estructura y diseño de
modelos de proteínas para usar con cualquiera de las técnicas
anteriores. Si se desea, se pueden realizar otras variaciones del
Fragmento C empleando química combinatoria, selección por afinidad
y/o exposición de fagos.
Se pueden producir miméticos peptídicos del
fragmento C mediante el abordaje que se indica en Saragovi y col.,
Science 253: 792-95 (1991) y otros artículos. Los
miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan a los
elementos de la estructura secundaria de las proteínas. Véase, por
ejemplo, Johnson y col., "Peptide Turn Mimetics" in
BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto y col., Eds., (Chapman y Hall,
Nueva York, 1993). El fundamento subyacente al uso de miméticos
peptídicos es que la estructura peptídica de las proteínas existe
principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de
modo que se faciliten las interacciones moleculares, como las de
los anticuerpos y los antígenos. De este modo, cuando un
transportador del mimético peptídico de acuerdo con la presente
invención se administra a un huésped ayudaría a provocar una
respuesta inmunitaria.
El fragmento C se puede conjugar con el
polisacárido, tal como un polisacárido capsular bacteriano o
fúngico. Por ejemplo, los polisacáridos se pueden desafilar con
tratamiento en condiciones ligeramente básicas y, después,
conjugarse con el fragmento C a través de afinación reductora con un
agente reductor, tal como aniones de cianoborohidruro. Véase el
documento EP 0 658 118 B1. El experto en la técnica dispone de otros
abordajes de conjugación, como los que se exponen en los ejemplos
siguientes y en los descritos en el documento W00010599A2, la
solicitud de patente publicada de EE.UU. Nº US 2001/0014332 Al.
Marburg y col., (J. Am. Chem. Soc., 108, 5282 1986) describen otro
abordaje de conjugación usando espaciadores bigénicos y también se
describen en los documentos US 4.695.624; US 4.830.852; US
4.882.317 y US 5.623.057, que es un procedimiento mejor que los
últimos tres.
De una amplia variedad de fuentes se pueden
obtener fuentes de polisacáridos, que definirán el tipo y la
especificidad de la vacuna. Entre los ejemplos de bacterias se
incluyen: Neisseria meningitidis, incluidos los grupos A, B,
C, Y, W135 y X; Streptococcus, incluidos los grupos A, B, y
C; Pneumococcus, incluidos los tipos 1,2, 3,4, 6A, 6B, 9,
14, 18F, 19F y 23; Staphylococcus aureus incluidos los tipos
5 y 8; Haemophilus influenzae, incluido el tipo b;
Mycobacterium tuberculosis; Campylobacter spp.;
aislamientos de Escherichia coli enteroinvasiva;
Salmonella typhii; Vibrio cholerae;
Shigellaflexneri; Brucella spp.; Francicella
tularensis; y Yersinia pestis. Particularmente, los
antígenos de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae,
Pneumococcus y Streptococcus pueden utilizarse para la
conjugación a TTc. Ejemplos de hongos incluyen, entre otros,
Candida albicans, Cryptococcus neoformans y Aspergillus
niger. Usando la química estándar de carbohidratos, se pueden
emplear como vacunas polisacáridos sintéticos que tienen una o más
características de PC naturales.
\newpage
El Fragmento C, incluidas variantes, se puede
usar como transportador de un modo muy parecido al del toxoide del
tétanos. Entre las formulaciones farmacéuticamente aceptables para
los conjugados se incluyen soluciones acuosas, excipientes no
tóxicos, incluidos sales, conservantes, tampones y similares, como
se describe en UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY
(USP 24-NF 19); REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES;
HANDBOOK ON PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (2ª ed., Wade y Weller eds.,
1994). Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables
tales como etiloleato. Entre los disolventes acuosos se incluyen
agua, soluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos
parenterales tales como cloruro sódico, dextrosa de Ringer, etc.
Entre los vehículos intravenosos se incluyen fluidos y reponedores
de nutrientes. Entre los conservantes se incluyen antimicrobianos,
antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la
concentración exacta de los diversos componentes de la composición
de unión se ajustan de acuerdo con las habilidades de rutina en la
técnica. Véase GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR
THERAPEUTICS (9ª ed.) Además, se pueden añadir uno o más adyuvantes
a la composición vacunal. La alúmina (hidróxido de aluminio) es un
ejemplo de un adyuvante generalmente aceptado para usar, aunque los
expertos en las técnicas de las vacunas conocen otros
adyuvantes.
El fragmento C, como parte de una vacuna
conjugada de polisacáridos normalmente se administrará mediante una
dosis única (niños pequeños y adultos) o en múltiples dosis pequeñas
para la inmunización primaria (régimen en lactantes) y como
inyecciones de refuerzo durante un periodo de tiempo. El nivel
específico de dosis y, por tanto, la cantidad terapéuticamente
eficaz, para cualquier paciente dado puede depender de la edad, el
peso y el sexo. No obstante, como es cierto con la mayoría de las
vacunas, se pueden establecer valores normalizados para desarrollar
dosificaciones generalizadas que sean eficaces en una población de
grupos o subpoblaciones. Generalmente, las vacunas que contienen de
aproximadamente 5 a aproximadamente 100 \mug, preferentemente de
aproximadamente 10 a 50 \mug, son adecuadas para provocar niveles
eficaces de anticuerpos en mamíferos jóvenes frente a polisacáridos
capsulares de organismos patogénicos gramnegativos o grampositivos,
y se pueden además definir mediante titulación y similares. Cabría
esperar que varias dosis pequeñas administradas de forma secuencial
fueran superiores a la misma cantidad de conjugado administrado en
forma de una única inyección.
La invención se describe además mediante los
ejemplos siguientes, que son ilustrativos de la invención pero no
limitan la invención de ningún modo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Preparación de polisacáridos meningocócicos de
tipo C (GCMP), Y (GYMP) y W (GWMP):
Los polisacáridos meningocócicos de tipo C, Y y
W se purificaron en caldos de fermentación que contenían glucosa y
extracto de levadura.
El GCMP
des-O-acetilado (dOA) se preparó tal
y como se describe en la patente de EE.UU. 5.425.946.
\vskip1.000000\baselineskip
El GYMP
des-O-acetilado se preparó del
siguiente modo:
Captura de polisacáridos mediante UF con una
membrana de COPM de 300 kDa:
Aproximadamente 13 l de permeado de fermentación
microfiltrado sin células se concentra mediante UF hasta
aproximadamente 1 litro usando una membrana Biomax 300K Pellicon
(0,5 m^{2}). El retenido concentrado se somete a
diafiltración 12x contra NaCl 1M y después 10x contra agua DE.
Después se concentra hasta aproximadamente 0,2 l y se recoge.
La solución retenida de 300 K (aprox. 5 mg
PS/ml) se ajustó hasta una concentración final de NaOH 2N y se
colocó en un horno a 80ºC durante 16-18 horas. Una
vez enfriada la mezcla de reacción hasta una temperatura inferior a
50ºC, se diluyó en 10 l de agua DE. Tras la concentración a través
de una membrana Pellicon de COPM de 30 kDa, el retenido concentrado
se sometió a diafiltración 12 veces contra NaCl 1M y después 10
veces contra agua DE. Después se concentró hasta aproximadamente
0,2 l y se recogió.
La solución retenida se transfirió a una
reacción de teflón y se añadió acetato sódico (NaOAc) hasta una
concentración final de 0,1N. La mezcla de reacción se ajustó hasta
un pH de 5 usando HCl 6N y se colocó en un baño de agua a 70ºC. Se
agitó bien a 65 rpm hasta que el polisacárido alcanzó un PM diana de
aproximadamente 10-20 kDa medido mediante
SEC-MALLS usando una columna de Superose 12
(Pharmacia).
El pH de la solución se ajustó a 8 con una
solución de HCl 6N y, después, gota a gota, se añadió anhídrido
acético a temperatura ambiente hasta una concentración final de
anhídrido acético 0,8M. Para mantener el pH de la mezcla de
reacción entre 7 y 9 se usó NaOH SN. Tras la finalización de la
reacción, el pH de la mezcla de reacción se incrementó hasta 13 y
la mezcla se agitó durante 1,5 horas adicionales. Después, el pH de
la reacción se ajustó hasta un pH de 8 con una solución de HCl 6N.
La mezcla de reacción se vertió en 4 l de NaCl 1M concentrado hasta
aproximadamente 1 l usando una membrana Biomax 100K Pellicon (0,5
m^{2}) y se recogió el permeado. El permeado final de 100k se
concentra mediante UF hasta aproximadamente 1 litro usando una
membrana Biomax 5K Pellicon (0,5 m^{2}). El retenido concentrado
se somete a diafiltración 10 veces frente a agua DI, después se
concentra hasta aproximadamente 0,2 l y se recoge. A continuación,
el polisacárido fragmentado se activó con metaperyodato sódico para
generar grupos aldehído en sus residuos de ácido siálico.
Después, los polisacáridos oxidados se
conjugaron mediante aminación reductora usando cianoborohidruro
sódico con el toxoide del tétanos (Serum Statens Institute,
Copenhague, Dinamarca) o una forma recombinante (E. coli)
del fragmento C de la toxina del tétanos (rTTc) (Roche Molecular
Biochemicals, Indianapolis, IN). La comparación bioquímica de la
forma recombinante del fragmento C de la toxina del tétanos de Roche
y del fragmento C aislado de la toxina del tétanos (TTc) tras la
digestión con papaína (List Biological Laboratories, Inc. Campbell,
CA) indicó que ambas proteínas eran idénticas (misma composición AA,
mismo PM medido mediante MALDI-TOFF y mismo perfil
de elución mediante HPLC). Véase la figura 2.
Algunas de las características fisicoquímicas de
estos conjugados se muestran en la Tabla 1 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Tres de los serotipos (Ia, III y V) de
polisacáridos de estreptococos del grupo B (GB S) más clínicamente
importantes se acoplaron mediante aminación reductora al toxoide del
tétanos y al rTTc. Véase la patente de EE.UU. No. 5.993.825. La
tabla 2 expone algunas de sus características.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otro procedimiento de acoplar los polisacáridos
anteriores al fragmento C del tétanos además de la aminación
reductora se describe en la solicitud de patente W00010599A2. El
procedimiento implica, en primer lugar, la
re-N-acroilación del polisacárido
parcial o totalmente
des-N-acetilado, seguido por el
acoplamiento directo del polisacárido activado a la proteína
transportadora a pH 9-10. La química es una adición
de Michael de los grupos amino primarios sobre la proteína
(u-NH2 de los residuos de lisinilo) a los grupos
N-acriloílo insaturados del polisacárido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Potencia de los conjugados meningocócicos -
Calendario de inmunización: Ratones Swiss Webster hembra de
4-6 semanas de edad fueron inmunizados por vía
subcutánea los días 0, 28 y 42 con 2 \mug de polisacárido
conjugado a TT (toxoide del tétanos) o rTTc. Se extrajo sangre de
los animales los días 0, 28 y 52. Los niveles de IgG específica del
polisacárido se midieron mediante ELISA usando los respectivos
conjugados con los polisacáridos C, Y o W en seroalbúmina humana
como antígeno de recubrimiento y se prepararon de un modo similar al
usado para las vacunas conjugadas contra el tétanos. Los
anticuerpos de la toxina del tétanos producidos frente a los
conjugados se midieron mediante ELISA con el toxoide del tétanos
como antígeno de recubrimiento. La muerte mediada por
anticuerpos-complemento del antisuero se determinó
mediante un ensayo bactericida en suero (SBA) usando suero de
cachorro de conejo como fuente de complemento.
La potencia (IgG específica del polisacárido y
actividad bactericida en suero) frente a estos conjugados se
muestra en la figura 3 para una comparación entre los conjugados
TTc, rTTc y TT de GCMP y en la figura 4 para la correspondiente
respuesta inmunitaria a los conjugados de GYMP, GWMP y GCMP unidos a
TT o a rTTc.
\newpage
Como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4,
los conjugados de rTTc meningocócicos no muestras diferencias
significativas en la potencia cuando se comparan con sus
correspondientes constructos de TT. Además, también se midió la
respuesta anti-tétanos y
anti-fragmento C del tétanos (TTc) mediante una
serie de ELISA. Básicamente se abolió la respuesta significativa
anti-tétanos en el antisuero frente a los conjugados
GCMP-TT en los sueros provocada con los conjugados
con TTc y rTTc, como se muestra en la Tabla 3.
Se usaron tres ensayos: (a) ELISA de antígeno
doble para tétanos, (b) ELISA IgG indirecto del tétanos (Rristiansen
y col., APMIS 105:843-53 (1997), (c) ELISA IgG
indirecto del fragmento C de la toxina del tétanos recombinante.
Los ensayos se incubaron a 4-8ºC durante la noche.
Las placas a y b del ensayo se revistieron con toxoide del tétanos,
lote 57 SSI diluido 1:10000 en tampón carbonato a pH 9,6 y se
incubaron a 4-8ºC durante la noche. La(s)
placa(s) para el ensayo c se realizaron con el fragmento C de
la toxina del tétanos recombinante (rTTc) reconstituido, lote
85161832, Roche - en NaHCO_{3} 0,1M diluido hasta 1 \mug/ml en
tampón carbonato a pH 9,6 y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente. A una placa de cada recubrimiento se aplicó
las mismas pre-diluciones de las muestras y los
patrones. La incubación se realizó durante la noche a
4-8ºC.
Para la detección se usó el sistema de
biotina-TT/HRP-Estreptavidina para
el ensayo a) y se usó HRP-IgG de cabra
anti-ratón (Fc) 1:5000 para los ensayos b) y c). El
cromógeno O-fenilendiamina (OPD) a una concentración
de 1 mg/ml se usó como sustrato y la reacción se detuvo con
H_{2}SO4 2M. La DO (densidad óptica) se leyó a 492 nm. Los datos
se analizaron usando un método de línea de referencia.
Los AcMo anti-rTTc se usaron
para estandarizar los datos del ELISA IgG sobre la base de los datos
del ELISA de doble antígeno. El AcMo frente a rTTc reconoce el
toxoide soluble así como el toxoide del tétanos nativo recubierto y
el fragmento C en la misma medida. También indica que los
anticuerpos producidos frente a rTTc se pueden mediar mediante los
tres tipos de ELISA.
Los datos presentados en la Tabla 3 indican que
se ha medido una respuesta de IgG anti-tétanos muy
significativa en el antisuero a los conjugados de
GCMP-TT, pero esta respuesta estaba prácticamente
ausente en los sueros producidos contra los conjugados de GCMP y
TTc y rTTc.
Los conjugados GBS usando TT o rTTc como
proteína transportadora se analizaron para determinar su capacidad
para producir una respuesta inmunitaria protectora. La eficacia de
los conjugados monovalentes de tipos Ia, III y V preparados tal y
como se describe en la presente memoria descriptiva se evaluó en el
modelo de ratones neonatos de Madoff y col. Infec. & Immun.
60:4989-94 (1992). En los animales (ratones hembra
CD1) se inoculó o la combinación de mezcla de vacuna tetravalente,
cada animal recibió 1 pg de cada uno de los tipos de polisacáridos
conjugados los días 0 y 21. Las vacunas se absorbieron en hidróxido
de aluminio (Superfos, Dinamarca). Se impregnó a los ratones el día
21. Los neonatos fueron expuestos 48 horas después del nacimiento al
GBS de tipo Ia (090), GBS de tipo II (M781) o al GBS de tipo V
(CJ111). La IgG de polisacárido GBS específica de tipo inducida por
cada conjugado individual se muestran en la Figura 5. Los datos
indican que los conjugados con rTTc de tipos Ia y III provocan
títulos similares, si no mejores, de IgG específica del polisacárido
que su correspondiente homólogo con TT, no obstante, los conjugados
con rTTc de tipo V provocan una respuesta IgG específica del tipo V
significativamente superior a la de su correspondiente con TT.
Los resultados de eficacia de la exposición de
los ratones neonatos se correlacionan bien con los niveles
SURROGATE de anticuerpos, es decir existe una protección
significativamente mejor contra la exposición al tipo V obtenida
con los conjugados V-rTTc (eficacia de aprox. 85%)
que con V-TT (aprox. 65%), mientras que se
proporcionó una protección similar contra la exposición con los
organismos GBS de tipo Ia y III con una eficacia cercana al 100%
contra Ia, del 90-95% contra III con cualquiera de
los conjugados correspondientes de rTTc o TT. Véase la Figura 6.
Debe observarse que en el modelo murino, la exposición al tipo V es
la más difícil de conseguir tras la inmunización con el conjugado
de polisacárido y, por tanto, es significativo el hecho de que el
fragmento C del tétanos como proteína transportadora para el
polisacárido V es una proteína transportadora demostrablemente
mejor que toda la molécula del tétanos.
La respuesta anti-tétanos
generada con los conjugados de GBS con TT y rTTc, así como la
actividad TT residual media en unidades LF (medición de la
floculación) se muestran en la Tabla 4.
Este estudio se basa en la suposición de que la
concentración de proteínas es de 10 \mug/l, la concentración
prevista se establece en 4 LF/ml para TT y de 10 lf/ml para
rTTc.
Los datos de la Tabla 4 indican que la respuesta
IgG anti-tétanos en el suero inducida por los
conjugados con rTTc se reduce de forma espectacular cuando se
compara con la respuesta inducida por los correspondientes
conjugados con TT. Además, el número de epítopos de células B de la
toxina del tétanos conservados tras la conjugación del fragmento C
con los polisacáridos GBS se reduce virtualmente a cero cuando se
comparan con los mismos epítopos de las células B conservados en
los correspondientes conjugados con TT. En consecuencia, los datos
presentados en la Tabla 3 y la Tabla 4 avalan y demuestran las
ventajas adicionales de la presente invención a la hora de superar
la posible supresión epitópica inducida por el transportador de la
respuesta de anticuerpos frente a la vacuna conjugada de
polisacáridos que contiene tétanos como proteína transportadora.
Claims (15)
1. Un procedimiento para incrementar la
inmunogenicidad de un antígeno carbohidrato que comprende:
Conjugar el antígeno con el fragmento C de la
toxina del tétanos para dar una vacuna conjugada, en la que la
administración a un paciente de la vacuna conjugada con el fragmento
C incrementa la potencia del antígeno, sin esencialmente
incrementar de la potencia protectora frente a la toxina del
tétanos.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el antígeno es un polisacárido capsular
de una bacteria.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la bacteria se selecciona del grupo
constituido por meningococos de grupos A, B, C, Y, W135 y X,
estreptococos de grupos A, B y C; neumococos de los tipos 1, 2, 3,
4, 6A, 6B, 9, 14, 18F, 19F y 23; Staphylococcus aureus de los
tipos 5 y 8, y Haemophilus influenzae de tipo b.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el antígeno es un polisacárido capsular
de un hongo.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que hongo se selecciona del grupo constituido por Candida
albicans y Cryptococcus neoformans.
6. Uso de una vacuna conjugada constituida
esencialmente por antígeno conjugado con el fragmento C de la toxina
del tétanos, en la que dicho antígeno es un polisacárido capsular,
en la fabricación de un medicamento para inmunizar un paciente
contra una infección.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que el antígeno es un polisacárido capsular de una bacteria.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que la bacteria se selecciona del grupo constituido por
meningococos de grupos A, B, C, Y, W135 y X, estreptococos de
grupos A, B y C; neumococos de los tipos 1, 2, 3, 4, 6A, 6B, 9, 14,
18F, 19F y 23; Staphylococcus aureus de los tipos 5 y 8, y
Haemophilus influenzae de tipo b.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en
el que el antígeno es un polisacárido capsular de un hongo.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
hongo se selecciona del grupo constituido por Candida
albicans y Cryptococcus neoformans.
11. Una vacuna conjugada constituida
esencialmente por antígeno conjugado con el fragmento C de la toxina
del tétanos, en la que dicho antígeno es un polisacárido
capsular.
12. La vacuna conjugada de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que el antígeno es un polisacárido capsular
de una bacteria.
13. La vacuna conjugada de acuerdo con la
reivindicación 12, en la que la bacteria se selecciona del grupo
constituido por meningococos de grupos A, B, C, Y, W135 y X,
estreptococos de grupos A, B y C; neumococos de los tipos 1, 2, 3,
4, 6A, 6B, 9, 14, 18F, 19F y 23; Staphylococcus aureus de los
tipos 5 y 8, y Haemophilus influenzae de tipo b.
14. La vacuna conjugada de acuerdo con la
reivindicación 11, en la que el antígeno es un polisacárido capsular
de un hongo.
15. La vacuna conjugada de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que el hongo se selecciona del grupo
constituido por Candida albicans y Cryptococcus
neoformans.
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