ES2317828T3 - Consevacion de materiales biologicos sensibles a temperaturas ambiente mediante vitrificacion. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de barrera para conservar una suspensión o disolución biológica a modo de polvo, que comprende las etapas siguientes: - secar la suspensión o disolución biológica en una cámara mediante ebullición a vacío a una temperatura comprendida entre -15 y 70ºC para formar una espuma mecánicamente estable; - triturar la espuma mecánicamente estable para formar un polvo haciendo funcionar unos medios para triturar la espuma, incorporándose dicha trituración en la cámara.

Description

Conservación de materiales biológicos sensibles a temperaturas ambiente mediante vitrificación.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a la conservación de materiales biológicos sensibles en forma de polvo deshidratado almacenado a temperaturas superiores a 0ºC. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento tecnológico para integrar las siguientes etapas: conservación de los materiales biológicos mediante formación de espuma, secado y molienda posteriores de la espuma para formar un polvo seco y formulación del producto en polvo seco mezclado (cereales) para diferentes aplicaciones prácticas.
Descripción de la técnica relacionada
La conservación y el almacenamiento de suspensiones o disoluciones de materiales biológicamente activos, virus, células y pequeñas muestras multicelulares es importante para las industrias alimentaria y microbiológica, agricultura, fines médicos y de investigación. El almacenamiento de estos materiales deshidratados biológicamente activos supone enormes beneficios, tales como una reducción del peso y una reducción del espacio de almacenamiento, y un aumento de la estabilidad.
Las sugerencias de la técnica anterior para proporcionar la conservación de materiales biológicos sensibles en forma deshidratada incluyen secado por congelación y desecación a vacío o al aire. Tanto el secado por congelación como los procedimientos de conservación por desecación presentan características positivas y negativas. Mientras que los procedimientos de secado por congelación son ampliables a escala hasta cantidades industriales, los procedimientos de desecación a vacío y al aire convencionales no proporcionan preparaciones de materiales biológicos que sean ampliables a escala hasta cantidades industriales. La congelación y otras etapas del procedimiento de secado por congelación son muy dañinas para muchos materiales biológicos sensibles. El procedimiento de secado por congelación es muy largo, poco rentable y no puede realizarse utilizando tecnología de barrera para garantizar la esterilidad del material.
Algunos de los problemas asociados con la conservación mediante congelación y secado se han abordado mediante la adición de moléculas protectoras, especialmente hidratos de carbono, que se ha encontrado que estabilizan los materiales biológicos frente a las tensiones de la congelación y el secado. Sin embargo, a pesar de la presencia de protectores, la estabilidad a largo plazo tras el secado por congelación puede requerir todavía almacenamiento a baja temperatura, con el fin de inhibir reacciones químicas destructivas dependientes de difusión. Por tanto, se han buscado innovaciones adicionales para proporcionar almacenamiento a largo plazo de materiales biológicos lábiles a temperaturas ambientes.
El almacenamiento de materiales secados a temperaturas ambientes sería rentable en comparación con opciones de almacenamiento a baja temperatura. Además, el almacenamiento a temperatura ambiente de materiales biológicos tales como vacunas y hormonas sería extremadamente valioso para llevar tratamientos médicos modernos a países del tercer mundo en los que a menudo no hay refrigeración disponible. A medida que se han llegado a apreciar los muchos beneficios de la autoconservación de muestras biológicas, los investigadores han intentado por todos los medios aprovechar la vitrificación como medio para proteger materiales biológicos frente a procesos degradativos durante el almacenamiento a largo plazo. En consecuencia, se ha anticipado que esta tecnología para lograr el estado "vítreo" surja como una técnica de conservación de importancia primordial para el futuro.
Un cristal es un estado sólido amorfo que puede obtenerse mediante subenfriamiento sustancial de un material que inicialmente estaba en estado líquido. La difusión en materiales vitrificados, o cristales, se produce a velocidades extremadamente bajas (por ejemplo, micras/año). En consecuencia, los cambios químicos o biológicos que requieren la interacción de más de un resto se inhiben prácticamente de manera completa. Los cristales aparecen normalmente como sólidos homogéneos, transparentes, frágiles, que pueden pulverizarse o molerse para dar un polvo. Por encima de una temperatura conocida como temperatura de transición vítrea (Tg), la viscosidad desciende rápidamente y el vidrio se hace deformable y el material se convierte en un fluido a temperaturas incluso superiores. Los beneficios óptimos de la vitrificación durante el almacenamiento a largo plazo sólo pueden asegurarse en condiciones en las que la Tg es superior a la temperatura de almacenamiento. La Tg depende directamente de la cantidad de agua presente, y por lo tanto pude modificarse controlando el nivel de hidratación; cuanta menos agua haya, mayor será la Tg.
Desafortunadamente, las ventajas de la tecnología de vitrificación como medios para conferir estabilidad a largo plazo a materiales biológicos lábiles a temperaturas ambientes no se han utilizado completamente. Los procedimientos convencionales de conservación a temperatura ambiente mediante desecación se diseñan para el procesamiento en laboratorio de cantidades muy pequeñas de materiales. Recientemente, V. Bronshtein desarrolló un procedimiento alternativo de conservación mediante formación de espuma (patente US nº 5.766.520) que es compatible con operaciones comerciales a gran escala. La conservación mediante formación de espuma supera los problemas técnicos relacionados con la ampliación a escala de los procedimientos de conservación por vitrificación y desecación. Por esta razón, la conservación mediante formación de espuma es atractiva como procedimiento ampliable a escala para el almacenamiento a largo plazo de materiales biológicos.
La presente invención resuelve problemas de instrumentación relacionados con la conservación mediante formación de espuma y operaciones de procesamiento. Los instrumentos y dispositivos especialmente diseñados deben emplearse para producir de manera reproducible espumas deshidratadas, autoestables y un polvo uniforme de los materiales conservados. Los instrumentos deben integrar la capacidad para ejecutar una conservación ampliable a escala de barrera de material biológico mediante desecación, posterior transformación del material seco en forma de polvo (por ejemplo mediante molienda) y utilización de polvos secos para formular productos que pueden contener mezclas de diferentes materiales biológicos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de barrera para conservar una suspensión o disolución biológica como una espuma o un polvo. El procedimiento comprende las siguientes etapas: secar la suspensión o disolución biológica en una cámara a temperaturas no dañinas en primer lugar sometiendo a ebullición la muestra a vacío para formar una espuma mecánicamente estable, en segundo lugar deshidratando las espumas a temperatura elevada para obtener la temperatura de transición vítrea requerida para garantizar la estabilidad de materiales conservados durante el almacenamiento y triturando (y/o moliendo) la espuma mecánicamente estable para formar un polvo.
El procedimiento proporciona asimismo que la suspensión o disolución biológica puede combinarse con un protector antes del secado. De manera similar a otros procedimientos de conservación en el estado seco, pueden utilizarse azúcares, polioles y sus polímeros para proteger el material del efecto dañino de la desecación. Más específicamente, el protector comprende una mezcla que comprende un monosacárido, un disacárido y un polímero. El monosacárido puede seleccionarse de entre el grupo constituido por derivados no reductores de fructosa, glucosa, sorbosa, psicosa, ribulosa, xilulosa, eritrulosa y similares. Tales derivados pueden obtenerse mediante metilación, etilación, cloración o modificando de otra manera los grupos reductores.
Antes de moler la espuma, puede secarse adicionalmente de manera opcional en condiciones suficientes para aumentar su estabilidad a una temperatura de almacenamiento deseada. El aumento de estabilidad obtenido durante este procedimiento de secado secundario puede realizarse dentro de la cámara de secado o fuera de la cámara de secado durante el almacenamiento en almacén. Alternativamente, la espuma puede secarse adicionalmente en condiciones suficientes para aumentar su temperatura de transición vítrea por encima de una temperatura de almacenamiento deseada. Estas etapas de secado adicionales pueden aplicarse después de que las espumas se hayan triturado para formar un polvo.
Pueden incorporarse medios para triturar la espuma en la cámara. Los medios de trituración pueden comprender un molino seleccionado de entre el grupo constituido por un molino de cepillos, un molino de cuchilla giratoria, un molino de pulverización, un molino de desgaste giratorio, un molino de chorro, un molino de acción de corte incremental, un molino de bolas, un molino de martillo, un molino tubular giratorio, un homogeneizador y un sonicador. Alternativamente, los medios de trituración pueden comprender un depósito deformable dentro de la cámara, realizándose la etapa de secado dentro del depósito deformable. Cuando el secado se realiza en un depósito deformable, la trituración puede lograrse deformando mecánicamente el depósito deformable. Para mantener la esterilidad, consecuente con la tecnología de barrera, puede sellarse el depósito deformable antes de deformar el depósito.
Una variación del depósito deformable de la presente invención es un depósito permeable a gas, para permitir el secado de la suspensión o disolución biológica, mientras que se mantiene la esterilidad y retiene el líquido o espuma. El depósito deformable también puede ser semirrígido.
Otra variación del procedimiento implica una bandeja dentro de la cámara. La bandeja puede estar subdividida por una rejilla, que puede retener la suspensión o disolución o soportar un depósito deformable flexible tal como una bolsa.
También se da a conocer un aparato para conservar y triturar una muestra biológica que comprende una cámara que presenta medios para regular la temperatura de la cámara, medios para regular la presión de la cámara y medios para triturar espuma mecánicamente estable. La cámara de procedimiento puede dimensionarse para alojar diferentes volúmenes de suspensiones o disoluciones biológicas que oscilan desde por lo menos 1 litro hasta por lo menos 10 litros, hasta por lo menos 100 litros.
Los medios para regular la temperatura de la cámara pueden producir una temperatura de la cámara dentro de un intervalo comprendido entre aproximadamente -70º y 300ºC. Los medios para regular la presión pueden producir una presión de la cámara dentro de un intervalo comprendido entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 500 Torr. Los medios para triturar pueden comprender un molino o un depósito deformable (bolsa), dentro de la cámara. El molino puede seleccionarse de entre el grupo constituido por un molino de cepillos, un molino de cuchilla giratoria, un molino de pulverización, un molino de desgaste giratorio, un molino de chorro, un molino de acción de corte incremental, un molino de bolas, un molino de martillo, un molino tubular giratorio, un homogeneizador y un sonicador.
Preferentemente, el aparato presentará sensores para detectar la presión y temperatura de la cámara, así como un ordenador programable adaptado para monitorizar y controlar la presión y temperatura de la cámara.
Los polvos secos pueden almacenarse en condiciones secas. El producto final puede formularse de una variedad de maneras diferentes, tales como mezclando uno o más polvos y colocando la mezcla en viales u otros depósitos que pueden sellarse, preparando comprimidos prensando los polvos o preparando dispositivos para inhalación de polvos, internasal u otras formas de administración de material seco.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un dibujo esquemático de un aparato integrado para secado por formación de espuma en una bolsa deformable según una forma de realización de la presente invención.
La figura 2 es un diagrama de flujo que representa una forma de realización automatizada del aparato de secado-molienda integrado de la presente invención.
Descripción detallada de la forma de realización preferida
La presente invención da a conocer una combinación de procedimiento de procesamiento y conservación para su aplicación a materiales biológicamente activos. Los procedimientos pueden llevarse a cabo utilizando tecnología de barrera para proteger la esterilidad de los materiales biológicos en una cámara de procesamiento integrada, diseñada para facilitar las diversas operaciones metodológicas. Las características y limitaciones de los procedimientos y aparatos se describen por separado en la presente memoria para proporcionar una mayor claridad.
Materiales biológicos - Los materiales biológicamente activos que pueden conservarse mediante los presentes procedimientos incluyen, sin limitación, suspensiones y disoluciones biológicas que contienen péptidos, proteínas, anticuerpos, enzimas, coenzimas, vitaminas, sueros, vacunas, virus, liposomas, células y ciertas muestras multicelulares pequeñas. La deshidratación de muestras biológicas a elevadas temperaturas puede ser muy dañina, particularmente por ejemplo, cuando las temperaturas empleadas para secar son superiores que la temperatura de desnaturalización de proteínas aplicable. Para proteger las muestras del daño asociado con elevadas temperaturas, el procedimiento de deshidratación puede realizarse en etapas o mediante un aumento simultáneo en la temperatura y el grado de deshidratación. Debe realizarse deshidratación primaria a temperaturas que son suficientemente bajas para permitir la deshidratación sin pérdida de actividad biológica.
Protectores (cargas) - Se conocen en la materia una variedad de polioles y polímeros y pueden servir como protectores siempre que potencien la capacidad del material biológicamente activo para resistir al secado y al almacenamiento y no interfieran con la actividad biológica particular. De hecho, las moléculas protectoras proporcionan otras ventajas durante la conservación (véase a continuación, como adyuvante para generar espumas mecánicamente estables) además de estabilizar materiales biológicos durante la deshidratación. Más particularmente, los protectores según la presente invención pueden incluir, sin limitación, azúcares sencillos, tales como sacarosa, glucosa, maltosa, sacarosa, xilulosa, ribosa, manosa, fructosa, rafinosa y trehalosa, derivados no reductores de monosacáridos y otros derivados de hidratos de carbono, alcoholes de azúcar tales como sorbitol, polímeros sintéticos, tales como polietilenglicol, almidón de hidroxietilo, polivinilpirrolidona, poliacrilamida y polietilenamina, y copolímeros de azúcar, tales como Ficoll y dextrano, y combinaciones de los mismos. También pueden servir como protectores proteínas sumamente solubles, de bajo peso molecular.
En una variación de la presente invención, en la que están conservándose células o virus, la composición protectora puede comprender además mezclas de un azúcar de bajo peso molecular, un disacárido, oligosacárido y polímero incluyendo un polímero biológico. El azúcar de bajo peso molecular se utiliza para penetrar en y proteger estructuras intracelulares durante la deshidratación. Los azúcares permeantes, de bajo peso molecular pueden seleccionarse de una variedad de cetosas, que son no reductoras a pH neutro o superior, o monosacáridos metilados o etilados. Entre las cetosas no reductoras, se incluyen: los azúcares de seis carbonos, fructosa, sorbosa y piscosa; los azúcares de cinco carbonos, ribulosa y xilulosa; el azúcar de cuatro carbonos, eritrulosa; y el azúcar de tres carbonos, 1,3-dihidroxidimetilcetona. Entre los monosacáridos metilados están las formas alfa y beta-metiladas de gluco, mano y galactopiranósido. Entre los compuestos de cinco carbonos metilados están las formas alfa y beta de arabino y xilopiranósidos. Se sabe que disacáridos, tales como sacarosa, son protectores eficaces durante la desecación debido a que sustituyen el agua de hidratación sobre la superficie de macromoléculas y membranas biológicas. Además, el inventor ha encontrado que cuando se seca a vacío, la sacarosa y/u otras cargas pueden transformarse eficazmente en una espuma estable, compuesta por películas amorfas delgadas del azúcar concentrado.
El inventor también ha encontrado que la combinación de monosacáridos con disacáridos y oligosacáridos impide eficazmente la cristalización de los oligosacáridos durante la deshidratación. Finalmente, puede emplearse un polímero para aumentar la temperatura de transición vítrea (Tg) de la mezcla deshidratada, que puede disminuirse mediante la inclusión de los monosacáridos de bajo peso molecular. Puede emplearse cualquier polímero biológico que sea sumamente soluble en disoluciones de azúcar concentradas. Por ejemplo, polisacáridos, tales como Ficoll y dextrano, y polímeros sintéticos, tales como almidón de hidroxietilo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, poliacrilamida, así como biopolímeros sintéticos y naturales sumamente solubles (por ejemplo, proteínas) ayudarán a estabilizar membranas biológicas y a aumentar la Tg.
Secado primario por formación de espuma - Para facilitar la ampliación a escala de las operaciones de procesamiento, la conservación mediante formación de espuma implica la formación de una estructura porosa mecánicamente estable mediante ebullición a vacío. La etapa de secado se lleva a cabo a temperaturas en el intervalo de aproximadamente -15 a 70ºC. La estructura porosa mecánicamente estable, o espuma, consiste en películas amorfas delgadas de las cargas concentradas. La conservación mediante formación de espuma es particularmente bien adecuada para el secado eficaz de grandes volúmenes de muestra, antes de la vitrificación, y como adyuvante para preparar un producto secado fácilmente molido para su utilización comercial. Se incluyen detalles adicionales de la conservación mediante formación de espuma en la patente US nº 5.766.520 de Bronshtein; incorporada a la presente memoria en su totalidad como referencia a la misma.
En una variación de la presente invención, pueden concentrarse muestras biológicas diluidas eliminando parcialmente el agua para formar una muestra viscosa antes de la formación de espuma - secado a vacío. Esta etapa de concentración inicial puede lograrse o bien antes o bien después de la introducción de la muestra en la cámara de procesamiento, dependiendo del procedimiento de concentración elegido. Alternativamente, algunas muestras pueden ser suficientemente viscosas tras la adición de las moléculas protectoras, y por tanto no requieren ninguna concentración inicial. En situaciones en las que es deseable aumentar la viscosidad de las muestras, los procedimientos contemplados para su utilización en la concentración inicial incluyen secado por congelación, evaporación a partir del estado líquido o parcialmente congelado, ósmosis inversa, otras tecnologías de membrana o cualquier procedimiento de concentración conocido en la técnica.
Las muestras viscosas se someten a vacío, para provocar su ebullición durante el secado a temperaturas sustancialmente inferiores a 100ºC. En otras palabras, se aplica presión reducida a suspensiones o disoluciones viscosas de materiales biológicamente activos para provocar que las suspensiones o disoluciones formen espuma durante la ebullición, y durante el procedimiento de formación de espuma la eliminación de disolvente adicional provoca la producción final de una espuma porosa de células cerradas o de células abiertas mecánicamente estable.
Mientras que pueden aplicarse presiones de vacío bajas (en el intervalo de 0,1-0,9 atm) para facilitar la evaporación inicial para producir una disolución concentrada, viscosa, se utilizan presiones de vacío mucho más altas (0-24 Torr) para provocar la ebullición. El vacío para la etapa de ebullición es preferentemente de 0-10 Torr y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 4 Torr. Ebullición en este contexto significa nucleación y crecimiento de burbujas que contienen vapor de agua, no aire ni otros gases. De hecho, en algunas disoluciones, puede ser ventajoso purgar gases disueltos mediante la aplicación de vacío bajo (aproximadamente 0,1-0,9 atm) a temperatura ambiente. Tal "desgasificación" puede ayudar a impedir que la disolución salga en erupción del recipiente de secado. Una vez que la disolución es suficientemente viscosa y concentrada, puede aplicarse vacío alto para provocar la formación de espuma o ebullición controlada. La concentración de las moléculas protectoras mencionadas anteriormente, en el intervalo del 5-70% en peso, durante la evaporación inicial ayuda a impedir la congelación a vacío alto posterior y aumenta la viscosidad, facilitando de ese modo la formación de espuma mientras que se limitan las erupciones incontroladas.
Aumentos rápidos en presión o temperatura pueden provocar que una espuma se colapse. En este caso, para potenciar la estabilidad mecánica de las estructuras porosas, pueden añadirse tensioactivos siempre que esos aditivos no interfieran con la actividad biológica del soluto destinado para la conversión en forma seca. Además, el secado de los polímeros protectores también contribuye a la estabilidad mecánica de las estructuras porosas. Las espumas preparadas según la presente invención pueden almacenarse en la cámara de procesamiento a vacío, en gas seco, tal como atmósfera de N_{2} y/o desecante químico, antes de operaciones de procesamiento posteriores (por ejemplo, secado en estabilidad, molienda o vitrificación).
Los siguientes ejemplos de trabajo ilustran la formación de la espuma porosa mecánicamente estable según el procedimiento de conservación mediante formación de espuma:
(1) Se dializó una disolución de isocitrato deshidrogenasa en glicerol al 50% de Sigma Chemical Co. que contenía 59,4 unidades de actividad por ml durante 5 horas en tampón TRIS HCl 0,1 M (pH 7,4). La actividad de la isocitrato deshidrogenasa en la disolución de TRIS HCl 0,1 M tras la diálisis fue de 26 \pm 1,8 unidades por ml. Se asoció la disminución de la actividad con una disminución en la concentración de enzima debido a la dilución durante la diálisis.
Se colocó una mezcla (100 l) que contenía 50 l de disolución de sacarosa al 50% en peso y 50 l de la suspensión de isocitrato deshidrogenasa en tampón TRIS HCl 0,1 M (pH 7,4) en tubos de plástico de 1,5 ml y se conservaron mediante secado a temperatura ambiente. En primer lugar, se secaron las muestras durante 4 horas a vacío bajo (0,2 atm). En segundo lugar, se sometieron a ebullición las muestras durante 4 horas a vacío alto (< 0,01 atm). Durante esta etapa, se formó en los tubos una espuma seca mecánicamente estable. En tercer lugar, se almacenaron las muestras durante 8 días sobre DRIERITE a vacío a temperatura ambiente.
Tras 8 días, se rehidrataron las muestras con 500 l de agua. La rehidratación de las muestras que contenían espumas secas fue un procedimiento fácil que se completó en el plazo de varios segundos. Se sometió a ensayo la muestra reconstituida para determinar la actividad sometiendo a ensayo la capacidad para reducir NADP, medida espectrofotométricamente a 340 nm. La mezcla de reacción incluía: 2 ml de tampón TRIS HCl 0,1 M, pH 7,4; 10 l de NADP+ al 0,5% en peso; 10 l de MnSO_{4} 10 mM; 10 l de 1-isocitrato 50 mM y 10 l de una disolución de isocitrato deshidrogenasa. La actividad fue de 2,6 \pm 0,2 unidades/ml, lo que significa que no hubo pérdida de actividad durante el secado y posterior almacenamiento a temperatura ambiente.
(2) Se colocó una mezcla (100 l) que contenía 50 l de sacarosa al 50% en peso y 50 l de una suspensión de bacterias inductoras de escarcha (INB), Pseudomonas Syringae ATCC 53543, en tubos de plástico de 1,5 ml y se conservaron mediante secado a temperatura ambiente. En primer lugar, se secaron las muestras durante 4 horas a vacío bajo (0,2 atm). En segundo lugar, se sometieron a ebullición las muestras durante 4 horas a vacío alto (<0,01 atm). Tras la ebullición a alto vacío, se formó una estructura porosa mecánicamente estable. En tercer lugar, se almacenaron las muestras durante 8 días sobre DRIERITE a vacío a temperatura ambiente.
Tras 8 días, se rehidrataron las muestras con 500 l de agua. La rehidratación de las muestras que contenían espumas secas fue un procedimiento fácil que se completó en varios segundos. Entonces, se sometieron a ensayo las muestras para determinar la actividad de inducción de escarcha en comparación con muestras control. No hubo diferencia significativa entre la actividad de inducción de escarcha por 1000 bacterias en las muestras conservadas mediante el presente procedimiento frente a las muestras control.
(3) Se utilizó una muestra que contenía una mezcla 1:1 de una suspensión concentrada de bacterias inductoras de escarcha (INB) Pseudomonas Syringae ATCC 53543 y sacarosa. Se mezcló la muestra hasta que se disolvieron todos los cristales de sacarosa, de modo que la suspensión final contenía sacarosa al 50% en peso. Se colocó la suspensión en viales de 20 ml a 2 g por vial. Se secaron los viales dentro de una cámara de vacío. Se situaron los viales sobre la superficie de un anaquel de acero inoxidable dentro de la cámara. Se controló la temperatura del anaquel haciendo circular anticongelante de etilenglicol/agua a una temperatura controlada dentro del anaquel. Antes de aplicar el vacío, se disminuyó la temperatura del anaquel hasta 5ºC. Luego, se disminuyó la presión hidrostática dentro de la cámara hasta 0,3 Torr. En estas condiciones, se sometió a ebullición la suspensión durante 30 min. Se aumentó lentamente la temperatura del anaquel (durante 30 min.) hasta 25ºC. Se formaron espumas secas visualmente estables dentro de los viales en estas condiciones experimentales en el plazo de 3 horas. Después de eso, se mantuvieron las muestras a vacío a temperatura ambiente durante un día más. Se midió la actividad de inducción de escarcha de INB conservadas tras la rehidratación de la muestra con 10 ml de tampón fosfato 0,01 M. Se midió la actividad de inducción de escarcha como una concentración de centros inductores de escarcha que pueden inducir un cristal de hielo en una gota de tampón de 10 l durante 5 min. a -5ºC. Los resultados del ensayo muestran que la actividad de inducción de escarcha en las muestras conservadas era equivalente a la observada en controles nuevos.
(4) Se congeló una suspensión de INB concentrada hasta -76ºC para su utilización futura. Se descongeló la suspensión congelada (6 g) a 4ºC y se mezcló con 4 g de mezcla de sacarosa:maltrina 9:1. Se mezcló la muestra hasta que los azúcares se disolvieron completamente, de modo que la suspensión final contenía sacarosa al 35% en peso y maltrina al 4% en peso. Se colocó la suspensión dentro de viales de 20 ml a 2 g por vial. Se secaron los viales dentro de una cámara de vacío. Se situaron los viales sobre la superficie de un anaquel de acero inoxidable dentro de la cámara. Se controló la temperatura del anaquel haciendo circular anticongelante de etilenglicol/agua a una temperatura controlada dentro del anaquel. Antes de aplicar el vacío, se disminuyó la temperatura del anaquel hasta 5ºC. Entonces se disminuyó la presión hidrostática dentro de la cámara hasta 0,5 Torr. En tales condiciones, se sometió a ebullición la suspensión durante 30 min. Entonces se aumentó lentamente la temperatura del anaquel (durante 30 min.) hasta 25ºC. Visualmente, la formación de espumas secas estables dentro de los viales en estas condiciones se completó en el plazo de 2,5 horas. Tras la retirada de varios viales, se aumentó la temperatura hasta 50ºC y se mantuvieron las muestras restantes a vacío durante 7 días.
Se midió la actividad de inducción de escarcha de INB conservadas tras rehidratar la muestra con 10 ml de tampón fosfato 0,01 M. Se midió la actividad de inducción de escarcha como una concentración de centros inductores de escarcha que inducen un cristal de hielo en una gota de tampón de 10 ul durante 5 min. a -5ºC.
La actividad de inducción de escarcha de las muestras que se habían retirado de la cámara de vacío después de secar a 25ºC fue aproximadamente el 50% inferior que la actividad inicial de INB congeladas-descongeladas. (El error estándar relativo en la medición de la actividad de inducción de escarcha es inferior al 20%). Dado que se sabe que la congelación de INB no disminuye significativamente la actividad de inducción de escarcha, la disminución del 50% de la actividad observada en este experimento se debe probablemente a que la etapa de congelación adicional aumenta la sensibilidad de INB a la conservación mediante secado. Al mismo tiempo, no se observó disminución adicional de la actividad de las INB tras un secado de 7 días adicionales a 50ºC a vacío.
(5) Cuando se sometieron espumas estables que contenían INB, preparadas tal como anteriormente, a molienda utilizando un homogeneizador Virtis modificado, no hubo pérdida de actividad de inducción de escarcha en el polvo rehidratado, en comparación con la espuma rehidratada.
(6) Se secó una disolución de sacarosa al 60% en peso (1 ml) en viales de vidrio de 20 ml dentro de una cámara de vacío. Se situaron los viales sobre la superficie de un anaquel de acero inoxidable dentro de la cámara. Se controló la temperatura del anaquel haciendo circular anticongelante de etilenglicol/agua a una temperatura controlada dentro del anaquel. Se mantuvo la temperatura del anaquel en este experimento a 20ºC. Se mantuvo la presión hidrostática dentro de la cámara igual a 0,3 Torr. En tales condiciones, se sometió a ebullición la disolución lentamente, formando una espuma que consistía en películas delgadas que contenían sacarosa concentrada en estado amorfo. Se tardaron 2 a 3 horas en formar espumas secas visualmente estables dentro de los viales en estas condiciones experimentales.
(7) Se rehidrataron muestras secadas por congelación de urocinasa con 2 ml de sacarosa al 40% en peso. Entonces se transfirieron las disoluciones a viales de vidrio esterilizados de 20 ml para su conservación futura mediante secado. Antes de secar, se cubrieron los viales con tapones de caucho con ranuras grises. Entonces se transfirieron los viales dentro de una cámara de vacío. Se situaron los viales sobre la superficie de un anaquel de acero inoxidable dentro de la cámara. Se controló la temperatura del anaquel haciendo circular anticongelante de etilenglicol/agua a una temperatura controlada dentro del anaquel. Antes de aplicar el vacío se disminuyó la temperatura del anaquel hasta 5ºC. Entonces, se disminuyó la presión hidrostática dentro de la cámara hasta 0,5 Torr. En tales condiciones, se sometió a ebullición la suspensión durante 30 min. Se aumentó lentamente la temperatura del anaquel hasta 25ºC durante 30 min. Visualmente, en estas condiciones experimentales, se formaron espumas secas estables dentro de los viales en el plazo de 3 horas. Tras otras 12 horas de secado a temperatura ambiente, se aumentó la temperatura hasta 45ºC durante otras 24 horas. Tras llenar la cámara con gas N_{2} seco, se apretaron los tapones de caucho y se sellaron los viales con sellos ondulados de aluminio.
Se sometieron a ensayo las muestras justo después de secar y tras 30 días de almacenamiento a 40ºC. Después de secar la urocinasa, la actividad era del 93% de la actividad inicial. Esta disminución se asoció con la pérdida de urocinasa durante la transferencia desde los viales iniciales hasta los viales en los que se secó la urocinasa. Tras 30 días de almacenamiento a 40ºC, la actividad era del 90%. En otras palabras, no se observó disminución significativa adicional de la actividad urocinasa durante un mes de almacenamiento a 40ºC.
(8) Se rehidrataron muestras secadas por congelación de anfotericina B con 5 ml de sacarosa al 40% en peso por vial. Entonces se transfirieron las disoluciones a viales de vidrio esterilizados de 50 ml para su conservación futura mediante secado. Antes de secar, se cubrieron los viales con tapones de caucho de butilo con ranuras grises. Se secaron los viales dentro de una cámara de vacío. Se colocaron los viales sobre la superficie de un anaquel de acero inoxidable dentro de la cámara. Se controló la temperatura del anaquel haciendo circular anticongelante de etilenglicol/agua a una temperatura controlada dentro del anaquel. Antes de aplicar el vacío se disminuyó la temperatura del anaquel hasta 5ºC. Se disminuyó la presión hidrostática dentro de la cámara hasta 0,5 Torr. En tales condiciones, se sometió a ebullición la suspensión durante 30 min. Entonces se aumentó lentamente la temperatura del anaquel (durante 30 min.) hasta 25ºC. Visualmente, se formaron espumas secas estables dentro de los viales en estas condiciones experimentales en el plazo de 3 horas. Tras otras 12 horas de secado a temperatura ambiente, se llenó la cámara con el gas N_{2} seco y se apretaron los tapones de caucho en una parte de los viales. Se retiraron los viales de la cámara y se sellaron posteriormente con sello ondulado de aluminio. Se sometieron a ensayo las muestras justo después de secar y tras 30 días de almacenamiento a 27,5 y 40ºC. Los resultados se muestran en la tabla 1, junto con los resultados obtenidos en el próximo experimento.
Se rehidrató otro conjunto de muestras secadas por congelación de anfotericina B con 5 ml de sacarosa al 40% en peso por vial. Entonces se transfirieron las disoluciones a viales de vidrio esterilizados para su conservación futura mediante secado similar al descrito anteriormente con secado adicional a 45ºC durante otras 24 horas. Después de eso, se llenó la cámara de nuevo con el gas N_{2} seco, se apretaron los tapones de caucho y se sellaron los viales. Se sometieron a ensayo las muestras justo después de secar y tras 30 días de almacenamiento a 27,5 y 40ºC. Los resultados se muestran en la tabla 1.
TABLA 1 Potencia de anfotericina (%)
1
en la que Td es la temperatura máxima durante el secado.
La disminución de la actividad de anfotericina justo después de secar se asoció con la pérdida de anfotericina durante la transformación desde los viales iniciales hasta los viales en los que se secó la anfotericina. Los resultados del ensayo (tabla 1) sugirieron que la pérdida de potencia se detectaba sólo en aquellas muestras secadas a la temperatura inferior (25ºC) y almacenadas posteriormente a 40ºC.
(9) Se descongeló en un baño de hielo un tubo de 1,5 ml que contenía una suspensión congelada (-76ºC) de E. coli (XL10-GOLD) de Stratagene. Se transfirió una alícuota de 100 l a 50 ml de caldo NZYM (medio de extracto de levaduras con digerido de caseína) y se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante la noche. Tras 14 horas de crecimiento, se inocularon 10 ml de este cultivo de crecimiento en 100 ml de caldo NZYM estéril para continuar el crecimiento del cultivo a 37ºC. Durante el crecimiento del cultivo, se midió la densidad óptica (DO a 620 nm) cada hora para determinar el final del crecimiento logarítmico de las bacterias. Cuando se alcanzó la fase de transición (DO = de 1 a 1,06), las células estaban listas para recogerse. Se pipeteó el medio de cultivo (5 ml) en un tubo de centrífuga y se centrifugó durante 10 min. Entonces se eliminó el sobrenadante mediante vertido y se midió el peso de los sedimentos para determinar la concentración aproximada de las células.
Se resuspendieron las células con 5 ml de caldo NZYM o disolución de conservación que consistía en sacarosa al 25% y fructosa al 25% en caldo MRS. Se utilizaron las células resuspendidas con caldo NZYM como control. Se colocaron las células suspendidas en sacarosa al 25% y fructosa al 25% en caldo MRS (1 ml) en viales de vidrio de 20 ml y se secaron a vacío de manera similar a la que se secaron las INB en el ejemplo nº 2. Después de eso, se mantuvieron las muestras a vacío hasta 24 días a temperatura ambiente. Se sometieron a ensayo las muestras secadas a intervalos de tiempo seleccionados. Se midió la supervivencia de las células conservadas tras la rehidratación con disolución de peptona al 0,1% en agua a temperatura ambiente. Para determinar la concentración de células viables, se vertieron las suspensiones en placas Petri a la dilución apropiada sobre agar LB Miller seguido por incubación a 37ºC durante 36-48 horas. Aproximadamente el 25 \pm 10% de las células control sobrevivieron tras el secado y un día de almacenamiento a vacío. Además, la parte de células supervivientes no disminuyó durante los 24 días posteriores de almacenamiento a vacío a temperatura ambiente.
Secado en estabilidad/vitrificación - Las espumas mecánicamente estables formadas durante el secado primario pueden experimentar opcionalmente un secado secundario o "en estabilidad" a temperaturas aumentadas. Dado que la Tg depende del contenido en agua de la muestra y dado que la Tg aumenta con el aumento de la deshidratación, pueden aplicarse diferentes protocolos de secado en estabilidad dependiendo de la temperatura de almacenamiento deseada, para generar una Tg consecuente con la vitrificación tras el enfriamiento hasta esa temperatura de almacenamiento. Sin embargo, debido a que la deshidratación de los materiales es prácticamente imposible una vez que han entrado en el estado de cristal, la clave para la vitrificación según la presente invención, en la que pueden desearse temperaturas de almacenamiento ambientales, es realizar el secado en estabilidad a una temperatura significativamente superior a la temperatura ambiente.
Temperaturas de almacenamiento finales están preferentemente dentro del intervalo de 0-70ºC. Más preferentemente, selecciones de temperaturas de almacenamiento comunes son superiores o iguales a 0, 4, 20, 40 y 50ºC. En algunos casos, en los que puede preferirse almacenamiento en refrigeración, el secado en estabilidad podría llevarse a cabo a temperatura ambiente seguido por enfriamiento hasta la temperatura de almacenamiento o inferior. Sin embargo, en otros casos, en los que se desea estabilidad a temperatura ambiente, debe emplearse deshidratación a una temperatura superior a la temperatura ambiente, seguida por enfriamiento hasta temperatura ambiente.
Para cualquier muestra dada que va a conservarse, la naturaleza y las características de estabilidad de la muestra determinarán la temperatura máxima que puede resistir durante la etapa de secado primario. En el caso de conservación de enzimas, se mostró que tras el secado primario a temperatura ambiente puede aumentarse la temperatura de secado en estabilidad hasta 50ºC sin pérdida de actividad enzimática. Luego, puede continuarse el procedimiento de deshidratación durante el secado en estabilidad a temperatura superior. Por tanto, mediante aumentos graduales o continuos en la temperatura de deshidratación, pueden colocarse proteínas lábiles en un estado de estabilidad térmica a temperaturas muy por encima de su temperatura de desnaturalización.
Además de realizar el secado en estabilidad a una temperatura superior a la temperatura de almacenamiento seleccionada, es crítico que este secado se lleve a cabo durante un periodo de tiempo suficiente para elevar realmente la Tg por encima de la temperatura de almacenamiento. Basándose en resultados empíricos obtenidos con gotas de 10 ul secadas de disolución de sacarosa al 15% + rafinosa al 15%, se demostró que se requerían más de 12 horas de secado en estabilidad a temperaturas superiores a 70ºC para elevar la Tg por encima de 25ºC. El secado primario en estos experimentos fue durante 12 horas a temperatura ambiente (20ºC). Los resultados sugieren que pueden necesitarse tiempos de secado en estabilidad prolongados (más de 12 horas a 70ºC y más de 36 horas a 50ºC) para realizar aumentos en la Tg por encima de la temperatura ambiente. Para algunos materiales biológicos que no son termolábiles, el secado primario a temperaturas superiores reduciría el tiempo de secado en estabilidad a temperaturas elevadas necesario para aumentar la Tg hasta por encima de la temperatura de almacenamiento seleccionada.
En una forma de realización de la presente invención se enfría la espuma desde la temperatura de secado en estabilidad hasta la temperatura de molienda, se muele y luego se somete el polvo a secado adicional o bien a vacío o bien a presión atmosférica. La temperatura de secado posterior puede estar en el intervalo de aproximadamente 0ºC a 100ºC. Tal secado puede continuarse hasta que la temperatura de transición vítrea se eleva por encima de una temperatura de almacenamiento seleccionada dentro del intervalo de aproximadamente 0 a 70ºC.
Para garantizar que la Tg es realmente superior a la temperatura de almacenamiento, se conocen por lo menos dos procedimientos para estimar la Tg mediante análisis térmico. La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es la técnica más comúnmente utilizada. Sin embargo, el inventor ha encontrado que la DSC puede no ser fiable para medir la Tg en muestras que contienen polímeros. Alternativamente, procedimientos de corriente de polarización estimulada térmicamente (TSPC) están específicamente adaptados para el análisis de polímeros. Se prefiere el procedimiento de TSPC porque es fiable para todas las muestras, aunque requiere volúmenes de muestra ligeramente mayores.
Formación de un polvo uniforme - Independientemente de los medios seleccionados para triturar la espuma estable para dar un polvo, el aparato de la presente invención incorpora preferentemente tales medios de trituración dentro de la misma cámara, cilindro o recipiente en el que se lleva(n) a cabo la(s) etapa(s) de secado en estabilidad primario y opcional. De hecho, una de las ventajas de la presente invención es la integración de funciones, llevadas a cabo anteriormente mediante piezas separadas del equipo. Por tanto, los medios de trituración están alojados preferentemente en la cámara de procesamiento y se hacen funcionar cuando se ha completado por lo menos una de la(s) etapa(s) de conservación.
Los medios de trituración según la presente invención incluyen molinos convencionales, homogeneizadores y sonicadores, así como otros medios para reducir la espuma estable para dar un polvo. Estos otros medios pueden incluir la deformación física de un segundo depósito colocado dentro de la cámara de secado. La segunda cámara puede ser semirrígida, en la que la espuma se pulveriza mediante golpes físicos en el depósito o puede ser flexible, como una bolsa, en la que la espuma se pulveriza mediante trituración u otra deformación física. Alternativamente, la conservación puede tener lugar dentro de las celdas de rejilla en una bandeja dividida, en las que la espuma puede rasparse de la rejilla y triturarse. Los diversos medios de trituración se describen en mayor detalle a continuación.
A. Molienda convencional - Según la presente invención pueden utilizarse componentes y procedimientos de molienda convencionales. Estos incluyen sin limitación: molinos de cepillos; molinos de cuchilla giratoria tal como se describen en la patente US nº 5.352.471, incorporada a la presente memoria como referencia; molinos pulverizadores tal como se describen en la patente US nº 4.651.934, incorporada a la presente memoria como referencia; molinos de desgaste giratorios descritos en la patente US nº 4.404.346, incorporada a la presente memoria como referencia; molinos de chorro, por ejemplo, del tipo de los molinos espirales o de contratubo (CF Winnacker, Kucher; Chemische Technologie, 4ª edición, volumen 1, págs. 91-93, 1984) tal como se describen y se mejoran en la patente US nº 4.917.309, incorporada a la presente memoria como referencia; molinos de acción de corte incremental, por ejemplo, un molino COMITROL® 1700, tal como se describe en la patente US nº 5.520.932, incorporada a la presente memoria como referencia; molinos de bolas; molinos de martillo (por ejemplo MIKROPULVERIZER®); molinos tubulares giratorios que contienen bolas metálicas, barras o cilindros metálicos o piedras resistentes a impactos, por ejemplo el molino de micronización descrito en la patente US nº 5.174.512, incorporada a la presente memoria como referencia; homogeneizadores; sonicadores; y molinos que contienen alambres, como una desbrozadora; y cualquier otro medio de molienda conocido en la técnica Las diferencias y ventajas de los diversos tipos de molinos, trituradoras y mecanismos de trituración las conocen bien los expertos ordinarios en las técnicas de fabricación farmacéuticas.
B. Depósito deformable - Hay varios enfoques alternativos que pueden tomarse para poner en práctica el concepto de secado y reducción para dar un polvo en la misma cámara de secado. Una variación de la molienda convencional utiliza un segundo depósito colocado dentro de la cámara de secado. Este segundo depósito serviría como soporte del fluido de procedimiento que va a conservarse mediante formación de espuma. El depósito se colocaría en la cámara y se llenaría con la disolución conservante. El llenado podría llevarse a cabo mediante un tubo de llenado separado. Posteriormente a la finalización de la conservación mediante formación de espuma, este mismo depósito podría sellarse y retirarse de la cámara de secado y servir o bien como depósito final o bien como depósito intermedio para el procesamiento adicional. El sellado podría llevarse a cabo mediante un dispositivo de tapado sencillo para depósitos semirrígidos o mediante termosellado para depósitos flexibles. Además, si el depósito es semirrígido, la espuma mecánicamente estable contenida dentro puede romperse en una clase de molienda basta, mediante una serie de impactos de la pared del depósito con una superficie dura no flexible, o viceversa. Si el recipiente es flexible, como con una bolsa Lyoguard® permeable a gas, la espuma contenida dentro puede molerse de manera basta triturando la bolsa, utilizando una fuerza relativamente débil. Esto podría llevarse a cabo con un dispositivo de rodillos sencillo. Una vez rotas de manera basta, puede o bien considerarse que las partículas resultantes están en forma acabada o bien, dependiendo de los requisitos de utilización final, procesarse adicionalmente mediante transferencia a una máquina de molienda. Dado que en este punto el material estaría en forma de partículas, esta transferencia se realizaría fácilmente mediante dispositivos de vacío o gravedad utilizados comúnmente en sistemas de manejo de polvos. La molienda final se realizaría mediante equipo de molienda disponible comercialmente y se realizaría de tal manera que se molería el material para dar una distribución de tamaño de partícula particular dictada por las especificaciones finales del material. Un aparato Quadro Comil®, por ejemplo, sería adecuado para este fin.
Dado que el depósito secundario estaría en un entorno a vacío durante la conservación mediante formación de espuma, la transferencia de calor hasta la disolución de conservación en el interior podría ser lenta y difícil de controlar. Esta limitación podría superarse utilizando el concepto de calentamiento por inducción. Una bobina de inducción enrollada alrededor del exterior de la cámara proporcionaría la fuente de calentamiento induciendo movimiento molecular en especies iónicas en la disolución de conservación. Alternativamente, un dispositivo de soporte de la bolsa, denominado casete, que se deslizaría dentro y fuera de la cámara de secado para proporcionar una carga y descarga más fáciles del producto podría servir también como dispositivo que soportaría la bobina de inducción. Se ilustra una forma de realización del aparato de la presente invención en la figura 1. El condensador 10 está conectado a la cámara de secado 14, que presenta un calentador 12. Un casete 16 está adaptado para ajustarse dentro de la cámara de secado y para soportar el depósito 24 deformable. El aparato también comprende un sistema 18 refrigerador, una bomba 20 de vacío y un motor 22 de impulsión de la rotación. Alternativamente, el casete podría servir como alojamiento para sistemas de transferencia de calor más tradicionales tales como calentamiento mediante resistencia eléctrica y calentamiento mediante fluido de recirculación. Con el fin de proporcionar un procesamiento más uniforme de la disolución de conservación, también podría hacerse que gire el casete que soporta el recipiente.
El concepto de un segundo depósito proporciona varias ventajas más allá de las ya identificadas anteriormente. En particular, para un procesamiento aséptico, el tubo de llenado, la cámara y el depósito podrían esterilizarse previamente mediante prácticas comúnmente aceptadas (por ejemplo, irradiación, vapor de peróxido de hidrógeno (VHP), vapor de agua, etc., dependiendo de los materiales de construcción de los artículos respectivos). Este enfoque, acoplado con los dispositivos de sellado descritos anteriormente, proporciona un procesamiento de tipo barrera, aislando así eficazmente al operario y al producto entre sí durante el transcurso de la conservación mediante formación de espuma. Esto es sumamente deseable para manejar materiales biológicos y tóxicos. La utilización de tecnología de barrera o aislamiento
está convirtiéndose en el enfoque de diseño convencional para procesar tales materiales en la industria farmacéutica.
Se han realizado varios experimentos de viabilidad que han demostrado la prueba del concepto. Se presentan a continuación ejemplos de trabajo y los resultados obtenidos utilizando un depósito deformable.
(1) En la primera prueba, la configuración del equipo consistió en un tubo de vidrio con un diámetro interno de 4,5 pulgadas conectado a una sección del condensador Virtis SL600 Unitop convencional y calentado mediante dos placas calentadoras de tipo laboratorio de Corning. El extremo opuesto del tubo de vidrio estaba cerrado. Se introdujo una disolución de 200 ml de sacarosa al 50% p/p en agua desionizada en una botella de bebidas de PET de 2 l, utilizada comúnmente para refrescos. Esto puede calificarse como un recipiente semirrígido. Se colocó la botella en el tubo y se conservó la disolución de sacarosa mediante formación de espuma. Tras formarse espuma mecánicamente estable, se mantuvo la botella que contenía la espuma durante la noche a 0,3 Torr y 25ºC. A la mañana siguiente, se rompió el vacío con aire. El tiempo de procedimiento total fue de 23 horas. Inmediatamente tras desmontar el tubo, se retiró la botella del tubo y se purgó con nitrógeno seco durante aproximadamente un minuto. Se tapó la botella con el tapón de rosca de plástico adjunto. La espuma pareció llenar completamente la botella. Una ligera presión aplicada manualmente en el exterior de la botella mostró que la espuma era extremadamente frágil. A continuación, se golpeó la botella contra la mesa de laboratorio aproximadamente 8-10 veces con fuerza ligera-moderada. Toda la espuma en el interior se rompió en partículas diferenciadas con las características visuales y de flujo de la arena. Una pequeña cantidad de material permaneció adherida al interior de la botella. La temperatura de transición vítrea del material particulado grueso era de 18ºC.
(2) En una segunda prueba, se sustituyó el tubo de vidrio utilizado en la primera prueba por un tubo de vidrio con camisa. Se llenó la camisa con agua y se conectó a un baño calentador de recirculación. Se sustituyó la botella utilizada anteriormente por una bolsa de almacenamiento de plástico de polietileno con una capacidad de 1 galón, disponible comúnmente en supermercados. Esto puede calificarse como un depósito flexible. Se sujetó la bolsa con cinta adhesiva en su sitio en un soporte de plástico para mantener la bolsa abierta. Se llenó la bolsa con 150 ml de sacarosa al 50% p/p en agua desionizada. Se completó el secado primario de la espuma esencialmente 90 minutos más tarde y se cambió la fuente de calentamiento por placas calentadoras. Las condiciones en ese punto eran 31ºC y 0,15 Torr. Entonces se mantuvo la espuma durante la noche. Por la mañana, se rompió el vacío con nitrógeno seco, se retiró la bolsa, se purgó con nitrógeno durante aproximadamente 1 minuto y entonces se colocó dentro de una bolsa de almacenamiento de plástico de 1 galón Zip-Loc®. El tiempo de procedimiento total fue de 71 horas. La trituración manual cuidadosa de la bolsa redujo inmediatamente la espuma a partículas muy parecidas a las producidas en la botella anteriormente. La temperatura de transición vítrea de las partículas resultantes era de 18,33ºC.
(3) En una tercera prueba, se sustituyó la bolsa del tipo anterior por una bolsa más grande, más larga obtenida de las bolsas utilizadas para empaquetar placas Petri suministradas por VWR (placas de tamaño de 100 x 15 mm). Se llenó la bolsa más grande con un volumen de 300 ml de una disolución de sacarosa, de nuevo al 50% p/p en agua desionizada. Tras aproximadamente 3 horas de secado primario de la espuma, se desconectó el calentamiento en el baño de circulación y se suministró calor mediante las dos placas calentadoras. A la mañana siguiente se desconectaron las placas calentadoras (T = 30ºC, P = 0,8 Torr) y se fijó el baño de circulación a 50ºC. Tras aproximadamente 7 horas, la temperatura y presión del sistema eran de 55ºC y 0,2 Torr, respectivamente. El tiempo de procedimiento total fue de 23,5 horas. Se rompió el vacío del sistema con nitrógeno seco, se retiró la bolsa, se transfirió a una bolsa Zip-loc® de 1 galón y se trituró cuidadosamente. Como anteriormente, se redujo fácilmente toda la espuma a partículas como las observadas anteriormente. La temperatura de transición vítrea era de 33,3ºC.
(4) Se hizo crecer la cepa bacteriana Lactobacillus acidophilus en un fermentador con una capacidad de dos litros utilizando un protocolo convencional específico para la especie. Se contó la población celular del fermentador a 8,1 \pm 0,73 x 10^{8}. Se recogieron las células mediante centrifugación, dando como resultado 200 ml de concentrado celular con una población de 7,83 \pm 0,75 x 10^{9}. Se diluyó el concentrado celular en disolución de conservación que consistía en 800 ml de sacarosa al 40%, metil-\alpha-D-glucopiranósido al 10% disuelto en tampón al 50% (p/p). Se llenó una bolsa de placas Petri de polietileno con la mezcla resultante a 300 ml. Se reservó el resto para otra utilización. Se unió la bolsa de polietileno vacía a un dispositivo de soporte ubicado dentro de una cámara de vidrio cilíndrica, de 4,5 x 19 pulgadas soportada por un marco de aluminio. Esta cámara de vidrio sirvió como cámara de secado en masa para la conservación mediante formación de espuma. Se llenó la bolsa de polietileno con la disolución de prueba con la ayuda de un trozo de tubo de silicona. También se equipó la cámara de vidrio con una camisa de vidrio con agua externa a lo largo de toda la longitud del tubo. Se acopló la camisa a un baño de agua de recirculación con temperatura controlada. La camisa de agua sirvió como fuente de calentamiento para el procedimiento. Se conectó la cámara de vidrio en el extremo de descarga al condensador de un liofilizador. Al final de la conservación mediante el procedimiento de formación de espuma, se rompió el vacío del sistema con nitrógeno seco. Se retiró la bolsa y se examinó. Se había producido claramente espuma frágil, mecánicamente estable, seca. Se trituró cuidadosamente el material para dar partículas con la consistencia de la arena utilizando presión manual ligera. La bolsa se abrió mediante corte y se transfirió el contenido a un depósito limpio. Se tomaron muestras del depósito por triplicado. A continuación, se purgó el depósito con nitrógeno seco y se selló. Se cultivaron las muestras y se compararon las poblaciones celulares con cultivos control de 1 ml de Lactobacillus acidophilus secados por formación de espuma en viales de 10 ml mediante el mismo procedimiento. Se resumen a continuación resultados que demuestran claramente la supervivencia de la cepa bacteriana de prueba:
2
Bolsa permeable a gas - También se sometió a prueba un producto (ahora denominado Lyoguard®) desarrollado por W.L. Gore para la liofilización en masa de una manera aséptica para determinar su utilidad como depósito deformable, inserto en el procedimiento de conservación mediante formación de espuma. La bolsa de liofilización Lyoguard® era una bolsa flexible termosellable que consistía en un lado que era un plástico que no era permeable al vapor de agua y otro lado que consistía en una membrana de Gore-Tex®. Esta membrana es un politetrafluoroetileno (PTFE) expandido, de un tamaño de poro nominal de 0,2 micras, hidrófoba y no permeable al agua líquida, pero permeable al vapor de agua.
Debido a que la bolsa Lyoguard® puede dejar pasar vapor de agua mientras que todavía impide que el producto en estado líquido penetre en la membrana y gotee, proporciona una forma ideal para procesar productos farmacéuticos que en general requieren esterilidad. El procedimiento básico también podría aplicarse a productos veterinarios, probióticos, alimentos, etc. En resumen, cualquier producto para el que el procesamiento en depósito cerrado pudiese presentar una ventaja en las áreas de esterilidad, facilidad de manejo, aislamiento de patógenos (por ejemplo, bacterias y virus) de los operarios y control de la contaminación con partículas extrañas, podría beneficiarse potencialmente de la aplicación de la bolsa Lyoguard® para la conservación mediante formación de espuma. Además, la naturaleza flexible de la bolsa potencia el contacto de la bolsa con el anaquel de la secadora. Dado que el anaquel es la superficie de transferencia de calor en una secadora por congelación convencional, la transferencia de calor debe ser óptima cuando se realiza la conservación mediante formación de espuma con la bolsa Lyoguard®. Esto podría conducir a ciclos de secado más rápidos.
Se inició una serie de experimentos para investigar las posibilidades de utilizar la bolsa de Gore-Tex Lyoguard® para la conservación mediante formación de espuma. Una disolución al 50% p/p con agua desionizada sirvió como medios de prueba. Se llenó una bolsa Lyoguard® de 10 x 14 pulgadas con un volumen de 200 ml. Entonces se termoselló la bolsa utilizando un dispositivo de termosellado disponible comercialmente. A continuación, se colocó la bolsa en uno de los 3 anaqueles de la liofilizadora Virtis Genesis® que UPT hizo que se modificara a medida para la conservación mediante formación de espuma. Se realizó el procedimiento de secado. Se observaron la ebullición y finalmente la formación de espuma a través de la membrana semipermeable inferior semitransparente de la bolsa a medida que avanzaba el secado. Después de secar durante la noche a 40ºC, se retiró la bolsa de la liofilizadora y se examinó. Parecía que se había formado espuma mecánicamente estable. Esta espuma secada era frágil y se trituraba fácilmente en partículas pequeñas en la bolsa sin abrir la bolsa. Esto indicaba que la bolsa podría funcionar también como depósito para la molienda basta del producto de espuma. En el plazo de aproximadamente 30 minutos, se abrió la bolsa y se añadió aproximadamente 1 l de agua para observar el carácter de reconstitución de las particular secadas. La mayoría de las partículas se disolvían fácilmente en menos de 10 segundos. Protocolos de prueba posteriores que implicaban incrementos de presión y temperatura alterados y llenados que oscilaban desde 200 hasta 400 ml en la bolsa de 10 x 14 pulgadas sugirieron que aproximadamente 300 ml era el nivel de llenado óptimo. Al finalizar una ejecución típica, el aspecto de la bolsa muestra formación completa de espuma y que todo el material de la bolsa vuelve a disolverse fácilmente.
La liofilización en masa de productos farmacéuticos, alimentos y enzimas industriales se realiza comúnmente utilizando bandejas de acero inoxidable, que se colocan en los anaqueles con temperatura controlada de la liofilizadora. Las bandejas se llenan normalmente en un entorno apropiado para el producto particular de interés y se transportan hasta la secadora por congelación, tras lo que se cargan en la secadora y se ejecuta el ciclo de liofilización. La capacidad y las dimensiones de la bandeja se determinan en gran medida mediante el área del anaquel de la liofilizadora, la altura de llenado permisible para el producto y las características de manejo del material deseadas. Para la conservación mediante formación de espuma, la operación básica sería la misma. El producto se prepara según los ejemplos previos, se vierte en bandejas de liofilización convencionales y se conserva mediante formación de espuma en una máquina configurada para cumplir las condiciones requeridas. La bandeja puede construirse con cualquier material que permita la transferencia de calor desde el anaquel del producto hasta el producto contenido dentro de la bandeja. Ejemplos de materiales adecuados son aceros inoxidables, aceros recubiertos, aleaciones no ferrosas tales como aluminio y titanio y plásticos tales como polipropileno, polietileno y similares. Se reconoce que los plásticos transferirán calor de manera menos eficaz, pero pueden presentar otras ventajas que compensan.
Debido a ciertos aspectos de la conservación mediante formación de espuma, son necesarias varias innovaciones descritas en la presente memoria para la bandeja de liofilización típica con el fin de realizar de manera apropiada la producción de una espuma seca, mecánicamente estable. En una forma de realización preferida, la bandeja estará equipada con una estructura de rejilla ubicada en el espacio interno definido por los laterales y el fondo de la bandeja. Esta estructura de rejilla dividirá esencialmente el área de la bandeja en una serie de celdas de área igual o desigual de modo que toda la bandeja estará dividida en unidades más pequeñas. La función de la rejilla será reducir el área disponible para la expansión de la espuma durante la conservación mediante formación de espuma, conteniendo de ese modo las burbujas de espuma dentro del área de cada rejilla. Esto reduce eficazmente la altura hasta la que puede crecer una estructura de espuma, minimizando así la posibilidad de que la espuma en crecimiento entre en contacto con el anaquel de la secadora u otra superficie de la secadora inmediatamente por encima de la espuma y/o se derrame fuera de la bandeja. La estructura de rejilla puede tomar cualquier forma geométrica que se ajuste al interior de la bandeja. Un patrón cuadrado tal como el utilizado para separar viales en depósitos de transporte es un ejemplo. La altura de la pared de la rejilla debe ser por lo menos la mitad de la altura del lateral de la bandeja para impedir la interconexión de burbujas de espuma con burbujas adyacentes a medida que avanza el procedimiento de formación de espuma.
En otra forma de realización, la bandeja presentará una cubierta colocada sobre toda el área definida por el fondo de la bandeja. Esta cubierta se ubicará de tal forma que permita el escape de vapor de agua durante la conservación mediante formación de espuma. El hueco entre el borde de la cubierta y la parte superior de los laterales de la bandeja debe ser de un cuarto de pulgada o menos. Aunque ciertamente funcionarán huecos de mayores dimensiones, se desea minimizar la separación de un anaquel a otro con el fin de maximizar el volumen disponible para la producción. La cubierta de la bandeja se soportará mediante cualquier medio adecuado disponible para realizar tal soporte y proporcionar el espacio necesario entre la parte superior de los laterales de la bandeja y el borde inferior de la cubierta. Postes auxiliares, lengüetas de cubierta integrales o espaciadores fabricados de cualquiera de los materiales anteriores o cualquier procedimiento similar lograrán la separación requerida. Estos procedimientos de secado en bandeja podrán aplicarse a productos veterinarios, probióticos, alimentos, enzimas industriales, etc.
Secado en masa en bandejas - Se realizó una serie de experimentos para investigar la viabilidad del secado en masa en bandejas utilizando una secadora por congelación, modificada para la conservación mediante formación de espuma. En el primer experimento, se llenó una bandeja de acero inoxidable que medía 9,5 x 19,5 x 1,25 pulgadas con 400 ml de disolución de prueba, que consistía en sacarosa al 50% p/p en agua desionizada. Se colocó la bandeja en el anaquel del medio de una secadora de 3 anaqueles. Entonces se secó el material según la presente invención. Esta prueba mostró que aunque la bandeja podía funcionar como depósito de formación de espuma en masa, había problemas tanto en la contención de la espuma como en las salpicaduras de líquido sobre superficies colindantes durante el procedimiento de ebullición. Inicialmente, se creía que ambos problemas eran suficientemente graves como para impedir la utilización de bandejas para la conservación mediante formación de espuma. Sin embargo, una observación más estrecha mostró que las burbujas de espuma parecían formar puentes a través de toda el área de la bandeja. En consecuencia, se planteó la teoría de que la reducción de este área disponible impediría que las burbujas de espuma crecieran de manera incontrolable.
Un inserto que consistía en un material de cartón recubierto con plástico en una rejilla de 1, 7/16 x 1, 7/16 pulgadas, que se había utilizado para separar viales de 20 ml en sus cajas de cartón de transporte, se cortó para ajustarse dentro de la bandeja de acero inoxidable utilizada en la prueba anterior. Se realizó una serie de experimentos utilizando el inserto de rejilla. Estas pruebas mostraron que la espuma podía producirse de manera mucho más controlable y se redujeron considerablemente las salpicaduras fuera de la bandeja cuando se utilizó la rejilla. Sin embargo, el material de prueba mostró una pronunciada tendencia a pegarse a la bandeja, haciendo difícil su retirada tras completarse el ciclo. El recubrimiento de la superficie de acero inoxidable con un recubrimiento no pegajoso tal como politetrafluoroetileno (PTFE) podía proporcionar una solución a ese problema.
Con el fin de someter a prueba esta idea, se decidió explorar la utilización de bandejas de plástico. Se preparó una bandeja de 9,5 x 19,5 x 2,5 pulgadas con polietileno de alta densidad (HDPE). También se fabricó un inserto de HDPE desmontable que presentaba una rejilla de 6 celdas x 12 celdas y una cubierta de HDPE. En otra serie de experimentos, se mejoró claramente la recuperación de la bandeja. La espuma resultante también se hidrató fácil y rápidamente cuando se reconstituyó. La utilización de la cubierta condujo al control de las salpicaduras. Además, también se mejoró la uniformidad de la espuma entre celdas dentro de la bandeja. El secado en masa en bandejas con rejillas puede requerir la retirada del material de celdas de rejilla individuales sobre la bandeja. Medios para facilitar esto serán fabricar un dispositivo para sostener manual, semiautomática o automáticamente la bandeja y raspar el contenido del interior de la bandeja. Esto puede llevarse a cabo agarrando por separado la bandeja y el inserto de bandeja, separándolos y luego arrastrando un rascador de tipo cuchilla, de poca separación a lo largo del interior expuesto de la bandeja. El inserto puede limpiarse mediante rascado mediante la aplicación de dedos mecánicos dimensionados para obtener una separación estrecha con respecto a las dimensiones de las celdas de rejilla. Estos dedos se forzarán a través de las celdas de rejilla, empujando el material hacia fuera de las celdas sobre una superficie que puede limpiarse adicionalmente mediante rascado en un depósito de recogida.
Cámara de procesamiento. Las operaciones de procesamiento dadas a conocer en la presente memoria, que comprenden concentración inicial, secado primario por formación de espuma, secado en estabilidad/vitrificación y posterior molienda se realizan preferentemente en un aparato cerrado utilizando tecnología de barrera. En su forma de realización más sencilla, el aparato de la invención puede ser una nueva combinación de una cámara que presenta un calentador y un enfriador y un termostato para regular la temperatura de la cámara, una bomba de vacío y una válvula de seguridad para regular la presión de la cámara y medios para triturar una espuma porosa mecánicamente estable. El aparato puede dotarse opcionalmente de medios para girar la cámara durante el procesamiento, tales como un motor con un mecanismo de impulsión de correa o directo, tal como se conoce bien en la técnica. En referencia a la figura 2, el aparato incluye preferentemente medios de detección para monitorizar la temperatura 26, la presión 24 y la molienda 28 dentro de la cámara 10. Pueden accionarse manualmente medios para aumentar 14 o disminuir 16 la temperatura, y controlar los parámetros de presión 12 y molienda 18, por el operario, o, preferentemente, por un ordenador 30 programable adaptado para monitorizar los datos de temperatura 26, presión 24 y molienda 28 (por ejemplo, rpm o ciclos por minuto, etc.), integrar esa información e iniciar acciones de respuesta sobre los diversos medios para regular la temperatura, la presión y la molienda.
La cámara de procesamiento 10 presenta preferentemente orificios de entrada 20 y de salida 22 separados para la introducción de los materiales biológicos y la dispensación del producto molido, respectivamente. El aparato de la presente invención incluye medios para regular la presión y la temperatura de la cámara, así como medios para regular la molienda. Los medios para regular la temperatura pueden incluir un calentador y un refrigerador/congelador y un termostato, que juntos pueden producir temperaturas de la cámara en el intervalo desde aproximadamente -70 hasta 100ºC durante las diversas operaciones de procesamiento. Opcionalmente, el calentador también puede proporcionar temperaturas dentro de la cámara para la esterilización en el intervalo de aproximadamente 100 a 300ºC. Los medios para regular la presión de la cámara comprenden una bomba de vacío, equipada opcionalmente con un condensador con una válvula de seguridad o de purga que puede producir vacíos de la cámara en el intervalo de desde aproximadamente 0-500 Torr. Más preferentemente, la bomba de vacío puede producir presiones de la cámara en el intervalo de aproximadamente 0-24 Torr (vacío alto) a aproximadamente 0,1-0,9 atm (vacío bajo). Un controlador de molino puede proporcionar medios externos para controlar el funcionamiento del molino; los elementos de molienda (por ejemplo, cepillos o cuchillas) se ubican dentro de la cámara. Además, las características preferidas del aparato pueden incluir un sensor de temperatura, un sensor de presión y posiblemente un detector para el funcionamiento del molino (por ejemplo, un tacómetro).
Aunque el aparato de la presente invención no necesita incorporar necesariamente un microprocesador o utilizar medios de control accionados por ordenador, la utilización de un ordenador programable para integrar los datos de temperatura, presión y molienda, generar señales de control en tiempo real y ejecutar gradientes simultáneos o graduales tanto de la presión como de la temperatura según las instrucciones programadas permite la puesta en práctica automatizada de un nuevo protocolo de vacío y temperatura bidimensional para el secado.
En la divulgación de la patente, se abarca una variedad de materiales y tamaños de la cámara de procesamiento. De hecho, el aparato puede producirse con cámaras dimensionadas analíticas, más pequeñas, así como cámaras a escala industrial, más grandes. Puede emplearse cualquier material para fabricar la cámara siempre que sea estable a los intervalos de presión y temperatura indicados, y compatible con las suspensiones y disoluciones biológicas sensibles. Materiales a modo de ejemplo para la construcción de la cámara de procesamiento incluyen acero inoxidable, vidrio y Plexiglas. Además, la cámara puede esterilizarse por medios convencionales. En una forma de realización, los medios de calentamiento de la unidad pueden hacerse funcionar entre ejecuciones de muestra a temperaturas suficientes para esterilizar la cámara y los medios de molienda encerrados. Además, el diseño integrado emplea preferentemente tecnología de barrera, en la que no se requiere manipulación de la muestra una vez que se ha introducido en el sistema cerrado; manteniendo así una calidad y esterilidad óptimas del producto.
Otra forma de realización de la presente invención incluye las funciones integradas de secado, molienda y formulación de una mezcla de polvos secos para formar un "cereal" para diversas aplicaciones. Por ejemplo, se hace crecer la cepa bacteriana Lactobacillus acidophilus en un fermentador con una capacidad de dos litros utilizando un protocolo convencional específico para la especie. Se recoge la población celular del fermentador mediante centrifugación y se diluye el concentrado celular en disolución de conservación que consiste en 800 ml de sacarosa al 40%, metil-\alpha-D-glucopiranósido al 10% disuelto en tampón al 50% (p/p). Se seca la mezcla resultante por formación de espuma tal como se describió anteriormente en un depósito deformable. Al finalizar el procedimiento de conservación, se rompe el vacío del sistema con nitrógeno seco. Se sella el depósito deformable, se retira de la cámara de vacío y se tritura cuidadosamente la espuma porosa para dar partículas con la consistencia de la arena, utilizando presión manual ligera.
Se seca por formación de espuma una disolución de vitamina C al 5% en la misma disolución de conservación que el Lactobacillus anterior en un depósito deformable. Se sella el depósito deformable y se tritura la espuma porosa. Posteriormente, puede mezclarse entonces el polvo de Lactobacillus probiótico con el polvo de vitamina C utilizando equipo de manejo de polvo convencional para mantener la esterilidad para formar un cereal complejo que presenta propiedades únicas relacionadas con los componentes probiótico y de vitamina. Tales formulaciones pueden prepararse mezclando una variedad de diferentes componentes en polvo farmacológicos y biológicos, tal como mezclando diferentes vacunas o diferentes antígenos.
Pueden utilizarse a continuación polvos que representan un único componente o formulaciones para preparar composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, los materiales pueden comprimirse para formar comprimidos, que proporcionan preparaciones de dosis sólida que pueden disolverse rápidamente.

Claims (46)

1. Procedimiento de barrera para conservar una suspensión o disolución biológica a modo de polvo, que comprende las etapas siguientes:
-
secar la suspensión o disolución biológica en una cámara mediante ebullición a vacío a una temperatura comprendida entre -15 y 70ºC para formar una espuma mecánicamente estable;
-
triturar la espuma mecánicamente estable para formar un polvo haciendo funcionar unos medios para triturar la espuma, incorporándose dicha trituración en la cámara.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho vacío está comprendido entre 0 y 24 Torr.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho vacío es inferior a 4 Torr.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de dicha etapa de secado, se aplica un vacío a dicha suspensión o disolución biológica para purgar gases disueltos.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se combina dicha suspensión o disolución biológica con un protector antes de dicha etapa de secado.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho protector se selecciona de entre el grupo constituido por azúcares, polioles y polímeros.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho protector comprende asimismo una mezcla que comprende un monosacárido, un disacárido, un oligosacárido y un polímero.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho monosacárido es un derivado no reductor de un monosacárido seleccionado de entre el grupo constituido por fructosa, glucosa, sorbosa, psicosa, ribulosa, xilulosa y eritrulosa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho derivado no reductor se prepara a partir de monosacáridos que presentan por lo menos un grupo reductor, en el que dicho por lo menos un grupo reductor está modificado mediante metilación, etilación o cloración.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de dicha etapa de secado se combina dicha suspensión o disolución biológica con un tensioactivo.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de dicha etapa de trituración se seca adicionalmente la espuma en condiciones suficientes para aumentar su estabilidad a una temperatura de almacenamiento deseada.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de dicha etapa de trituración, se seca adicionalmente la espuma a una temperatura por encima de una temperatura de transición vítrea durante un periodo de tiempo suficientemente largo para aumentar la temperatura de transición vítrea por encima de una temperatura de almacenamiento deseada, en el que la temperatura de transición vítrea se mide mediante un procedimiento de corriente de polarización estimulada térmicamente.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se seca adicionalmente el polvo en condiciones suficientes para aumentar su estabilidad a una temperatura de almacenamiento deseada.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se seca adicionalmente el polvo en condiciones suficientes para aumentar su temperatura de transición vítrea por encima de una temperatura de almacenamiento deseada.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos medios de trituración comprenden un molino seleccionado de entre el grupo constituido por un molino de cepillos, un molino de cuchilla giratoria, un molino de pulverización, un molino de desgaste giratorio, un molino de chorro, un molino de acción de corte incremental, un molino de bolas, un molino de martillo, un molino tubular giratorio, un homogeneizador y un sonicador.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos medios de trituración comprenden un depósito deformable dentro de la cámara, en el que dicha etapa de secado se realiza en el depósito deformable.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha etapa de trituración se logra deformando mecánicamente el depósito deformable.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que se sella el depósito deformable antes de deformar el depósito.
19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el depósito deformable es permeable a gas para permitir el secado de dicha suspensión o disolución biológica.
20. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el depósito deformable es semirrígido.
21. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de secado se realiza sobre una bandeja dentro de la cámara.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la bandeja está subdividida por una rejilla.
23. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende asimismo la etapa de hacer girar la cámara durante por lo menos una de entre dichas etapas de secado y trituración.
24. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cámara se dimensiona para permitir el secado y la trituración de un volumen de suspensión o disolución biológica de por lo menos un litro.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cámara se dimensiona para permitir el secado y la trituración de un volumen de suspensión o disolución biológica de por lo menos diez litros.
26. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cámara se dimensiona para permitir el secado y la trituración de un volumen de suspensión o disolución biológica de por lo menos cien litros.
27. Procedimiento de barrera para preparar una formulación en polvo de materiales biológicos conservados, que comprende las etapas siguientes:
-
secar por lo menos dos suspensiones o disoluciones que contienen un material biológico mediante ebullición a vacío para formar por lo menos dos espumas mecánicamente estables;
-
triturar las espumas mecánicamente estables dentro de la cámara de vacío para formar por lo menos dos polvos; y
-
mezclar los polvos que contienen los materiales biológicos para formar una formulación en polvo,
en el que los materiales biológicos están protegidos mediante barrera frente a la exposición a un entorno externo durante todas las etapas de secado, trituración y mezclado.
28. Aparato integrado para secar y triturar una suspensión o disolución biológica, que comprende una cámara que presenta un calentador y un enfriador y un termostato para regular la temperatura de la cámara, una bomba de vacío y una válvula de seguridad para regular la presión de la cámara, caracterizado porque el aparato comprende asimismo unos medios para triturar una espuma porosa mecánicamente estable.
29. Aparato según la reivindicación 28, en el que el calentador, enfriador y termostato para regular la temperatura de la cámara pueden producir una temperatura de la cámara comprendido entre -70 y 300ºC.
30. Aparato según la reivindicación 28, en el que el calentador, enfriador y termostato para regular la temperatura pueden producir una temperatura de la cámara comprendida entre -70 y 100ºC.
31. Aparato según la reivindicación 28, en el que la bomba de vacío y la válvula de seguridad para regular la presión pueden producir una presión de la cámara dentro de un intervalo comprendido entre 0 y 500 Torr.
32. Aparato según la reivindicación 28, en el que la bomba de vacío y la válvula de seguridad para regular la presión pueden producir una presión de la cámara dentro de un intervalo de 0 a 24 Torr.
33. Aparato según la reivindicación 28, que comprende asimismo un motor para hacer girar la cámara.
34. Aparato según la reivindicación 28, en el que dichos medios para triturar comprenden un molino dentro de la cámara o un depósito deformable dentro de la cámara.
35. Aparato según la reivindicación 34, en el que dicho molino se selecciona de entre el grupo constituido por un molino de cepillos, un molino de cuchilla giratoria, un molino de pulverización, un molino de desgaste giratorio, un molino de chorro, un molino de acción de corte incremental, un molino de bolas, un molino de martillo, un molino tubular giratorio, un homogeneizador y un sonicador.
36. Aparato según la reivindicación 34, en el que el depósito deformable es una bolsa.
37. Aparato según la reivindicación 34, que comprende asimismo un casete adaptado para soportar dicho depósito deformable dentro de la cámara.
38. Aparato según la reivindicación 37, en el que el casete incluye unos elementos para facilitar la transferencia de calor.
39. Aparato según la reivindicación 28, que comprende asimismo un sensor para detectar la temperatura de la cámara.
40. Aparato según la reivindicación 28, que comprende asimismo un sensor para detectar la presión de la cámara.
41. Aparato según la reivindicación 28, que comprende asimismo un sensor para monitorizar dichos medios de trituración.
42. Aparato según la reivindicación 28, que comprende asimismo un ordenador programable adaptado para monitorizar la temperatura de la cámara y la presión de la cámara, estando adaptado adicionalmente dicho ordenador para controlar la temperatura de la cámara y la presión de la cámara.
43. Aparato según la reivindicación 42, en el que dicho ordenador está adaptado asimismo para controlar dichos medios de trituración.
44. Aparato según la reivindicación 28, que comprende asimismo una bandeja en la cámara.
45. Aparato según la reivindicación 44, en el que la bandeja está subdividida por una rejilla.
46. Aparato según la reivindicación 45, en el que la bandeja comprende asimismo una cubierta para reducir las salpicaduras.
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