ES2318004T3 - Genes tyra y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada, molécula que comprende como componentes ligados operativamente: (A) una región promotora que funciona en una célula vegetal para generar la producción de una molécula de ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heteróloga a (A), siendo la molécula de ácido nucleico codificante de una enzima con actividades corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, y que comprende además (i) dos o más casetes de expresión, cada uno de los cuales expresa un miembro seleccionado entre fitilprenil transferasa procedente de Synechocystis (sir1736), fitilprenil transferasa procedente de Arabidopsis thaliana (ATPT2), 1-desoxixilulosa-5-fosfato sintasa (dxs), 1-desoxixilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (dxr), geranilgeranil reductasa (GGH), geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPPS), p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), metil transferasa 1 (MT1), tocoferol metil transferasa 2 (TMT2), gamma metil transferasa (GMT), transportador de adenilato (AANT1), tocoferol ciclasa (slr 1737) y un constructo antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa, en la que la enzima codificada por la molécula de ácido nucleico heteróloga presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 o SEC ID N.º 4.
Description
Genes tyrA y usos de los mismos.
La presente invención pertenece al campo de la
genética y la bioquímica vegetal. Más específicamente, la invención
se refiere a genes asociados con la ruta de la biosíntesis del
tocoferol. La presente invención proporciona e incluye moléculas de
ácido nucleico, proteínas y anticuerpos asociados con los genes de
la ruta de la biosíntesis del tocoferol. La presente invención
también proporciona procedimientos para utilizar tales agentes, por
ejemplo, en el aislamiento de genes, el análisis de genes y la
producción de plantas transgénicas. Además, la presente invención
incluye plantas transgénicas modificadas para expresar proteínas
asociadas con la ruta del tocoferol. Además, la presente invención
incluye procedimientos para la producción de productos procedentes
de la ruta de la biosíntesis del tocoferol.
Los tocoferoles son un componente esencial de la
dieta de los mamíferos. Las pruebas epidemiológicas indican que el
complemento de tocoferol puede dar como resultado una disminución
del riesgo de la enfermedad cardiovascular y el cáncer, que puede
ayudar en la función inmune y está asociado con la prevención y el
retraso de un número de procesos patológicos degenerativos en seres
humanos (Traber y Sies, Annu. Rev. Nutr. 16:
321-347 (1996)). El tocoferol funciona, en parte,
estabilizando la bicapa lipídica de las membranas biológicas
(Skrypin y Kagan, Biochim. Biophys. Acta 815: 209 (1995);
Kagan, N. Y. Acad. Sci. p 121, (1989);
Gomez-Femandez et al., Ann. N. Y. Acad. Sci.
p 109 (1989)), reduciendo los radicales libres de ácidos grasos
poliinsaturados (AGPI) generados por la oxidación lipídica
(Fukuzawa et al., "Lipids" 17: 511-513
(1982)), y barriendo los radicales libres de oxígeno, los radicales
peroxilo lipídicos y las especies de oxígeno singlete (Diplock
et al. Ann. NY Acad. Sci. 570: 72 (1989); Fryer, Plant
Cell Environ. 15 (4): 381- 392 (1992)).
El \alpha-tocoferol,
habitualmente denominado vitamina E, pertenece a una clase de
antioxidantes solubles en lípidos que incluye \alpha, \beta,
\gamma y \delta-tocoferoles, y \alpha,
\beta, \gamma y \delta-tocotrienoles. Aunque
los \alpha, \beta, \gamma y
\delta-tocoferoles, y los \alpha, \beta,
\gamma y \delta-tocotrienoles se denominan a
veces colectivamente "vitamina E", la vitamina E se define
químicamente más apropiadamente como
\alpha-tocoferol. El
\alpha-tocoferol es relevante para la salud
humana, en parte porque se absorbe fácilmente y es retenido por el
cuerpo, y tiene un grado más elevado de bioactividad que otras
especies de tocoferol (Traber y Sies, Annu. Rev. Nutr. 16:
321-347 (1996)). Sin embargo, otros tocoferoles
tales como los \beta, \gamma y
\delta-tocoferoles también tienen relevantes
beneficios nutricionales y para la salud.
Los tocoferoles son sintetizados
fundamentalmente sólo por plantas y otros ciertos organismos
fotosintéticos, incluyendo cianobacterias. Por consiguiente, los
tocoferoles para la dieta de los mamíferos se obtienen casi
exclusivamente de estas fuentes. Los tejidos vegetales varían
considerablemente en el contenido de tocoferoles totales y en la
composición de los tocoferoles, siendo el
\alpha-tocoferol la especie de tocoferol que se
encuentra predominantemente en los tejidos verdes de las plantas
fotosintéticas. El tejido de las hojas puede contener de
10-50 \mug de tocoferoles totales por gramo de
peso fresco, pero la mayoría de los cultivos de los principales
alimentos básicos a nivel mundial (p. ej., el arroz, el maíz, el
trigo, la patata) producen niveles de tocoferoles totales bajos a
extremadamente bajos, de los cuales sólo un bajo porcentaje
corresponde al \alpha-tocoferol (Hess, "Vitamin
E, \alpha-tocopherol, In Antioxidants in Higher
Plants", R. Alscher y J. Hess, Eds., CRC Press, Boca Raton. pp.
111-134 (1993)). Los cultivos de semillas
oleaginosas contienen generalmente niveles mucho más elevados de
tocoferoles, pero el \alpha-tocoferol sólo está
presente como un componente minoritario (Taylor y Barnes, Chemy
Ind., Oct.: 722-726 (1981)).
La ingestión dietética diaria recomendada de
15-30 mg de vitamina E es bastante difícil de
alcanzar a partir de una dieta estadounidense media. Por ejemplo,
la satisfacción de esta ingestión de vitamina E diaria recomendada
supondría más de 750 gramos de hojas de espinaca en las que el
\alpha-tocoferol comprende el 60% de los
tocoferoles totales o 200-400 gramos de aceite de
soja. Aunque es posible aumentar la dieta con complementos, la
mayoría de estos complementos contienen vitamina E fundamentalmente
sintética, que tiene seis estereoisómeros, mientras que la vitamina
E natural está compuesta predominantemente sólo por un único
isómero. Además, los complementos tienden a ser relativamente
caros, y la población en general no se siente inclinada a tomar
complementos vitamínicos con regularidad. Por lo tanto, existe la
necesidad en la técnica de composiciones y procedimientos que bien
aumenten la producción de tocoferoles totales o aumenten el
porcentaje relativo del \alpha-tocoferol
producido por las plantas.
Además de los beneficios para la salud de los
tocoferoles, el aumento de los niveles de
\alpha-tocoferol en los cultivos se ha asociado
con una mejor estabilidad y una estabilidad de almacenamiento más
prolongada de los productos vegetales (Peterson,
Cereal-Chem. 72 (1): 21-24
(1995); Ball, "Fat-soluble vitamin assays in food
análisis A comprehensive review", Londres, Elsevier Science
Publishers Ltd. (1988)). Además, se ha observado que el complemento
de tocoferol de los alimentos de cerdo, de ternera y de aves aumenta
significativamente la calidad de la carne y prolonga la estabilidad
de almacenamiento de los productos cárnicos procesados
posteriormente, retardando la oxidación lipídica tras el
procesamiento que aumenta los componentes de sabor no deseados
(Sante y Lacourt, J. Sci. Food Agric. 65 (4):
503-507 (1994); Buckley et al., J. of Animal
Science 73: 3122-3130 (1995)).
Los plastos de plantas superiores presentan
rutas bioquímicas interconectadas que conducen a metabolitos
secundarios que incluyen los tocoferoles. La ruta biosintética del
tocoferol de las plantas superiores implica la condensación de
ácido homogentísico y fitilpirofosfato para formar
2-metil-6 fitilplastoquinol (Fiedler
et al., Planta 155: 511-515 (1982);
Soll et al., Arch. Biochem. Biophys. 204:
544-550 (1980); Marshall et al., Phytochem.
24: 1705-1711 (1985)). Esta ruta del tocoferol de
las plantas se puede dividir en cuatro partes: 1) la síntesis del
ácido homogentísico, que contribuye al anillo aromático del
tocoferol: 2) la síntesis del fitilpirofosfato, que contribuye a la
cadena lateral del tocoferol; 3) la ciclización, que desempeña un
papel en la quiralidad y la subestructura del cromanol de la famila
de la vitamina E; 4) y la metilación dependiente de la
S-adenosil-metionina de un anillo
aromático, que afecta a la abundancia relativa de cada una de las
especies de tocoferol.
El ácido homogentísico es un precursor común
tanto para los tocoferoles como para las plastoquinonas. En al
menos algunas bacterias, se ha publicado que la síntesis del ácido
homogentísico tiene lugar mediante la conversión de corismato en
prefenato y luego en p-hidroxifenil-piruvato
mediante una prefenato deshidrogenasa bifuncional. Los ejemplos de
enzimas prefenato deshidrogenasa bacterianas bifuncionales incluyen
las proteínas codificadas por los genes tyrA de Erwinia
herbicola y Escherichia coli. El producto génico
tyrA cataliza la producción de prefenato a partir de
corismato, así como la posterior deshidrogenación del prefenato para
formar p-hidroxifenilpiruvato (p-HPP), el
precursor inmediato del ácido homogentísico. Entonces se convierte
el p-HPP en ácido homogentísico mediante la
hidroxifenil-piruvato dioxigenasa (HPPD). Por el
contrario, se cree que las plantas carecen de actividad prefenato
deshidrogenasa y se cree, en general, que la síntesis del ácido
homogentísico a partir de corismato tiene lugar mediante la síntesis
y la conversión de un arogenato intermedio. Como las rutas
implicadas en la síntesis del ácido homogentísico también son
responsables de la formación de la tirosina, cualquier modificación
en estas rutas también puede dar como resultado la modificación de
la síntesis de la tirosina y de la síntesis de otros aminoácidos
aromáticos.
Los tocoferoles forman parte de la clase de los
compuestos denominados isoprenoides. Otros isoprenoides incluyen
carotenoides, giberilinas, terpenos, clorofilas y ácido abscísico.
Un compuesto intermedio central en la producción de los
isoprenoides es el isopentenil difosfato (IPP). Se han publicado
rutas citoplasmáticas y basadas en plastos para generar IPP. La
ruta citoplasmática implica las enzimas acetoacetil CoA tiolasa,
HMGCoA sintasa, HMGCoA reductasa, mevalonato quinasa,
fosfomevalonato quinasa y mevalonato pirofosfato descarboxilasa.
Recientemente, se han obtenido pruebas de la
existencia de una ruta biosintética de isoprenoides basada en
plastos alternativa a partir de los estudios de investigación de los
grupos de Rohmer y Arigoni (Eisenreich et al., Chem. Bio.,
5: R221-R233 (1998); Rohmer, Prog. Drug.
Res., 50: 135-154 (1998); Rohmer,
"Comprehensive Natural Products Chemistry", Vol. 2, pp.
45-68, Barton y Nakanishi (eds.), Pergamon Press,
Oxford, Inglaterra (1999)), quienes descubrieron que los patrones
de marcaje de isótopos observados en los estudios acerca de ciertos
terpenoides eubacterianos y vegetales podrían no explicarse en
términos de la ruta del mevalonato. Arigoni y colaboradores
observaron posteriormente que la 1-desoxixilulosa, o
una derivado de la misma, sirve como un compuesto intermedio de la
nueva ruta, actualmente denominada la ruta MEP (Rohmer et al.,
Biochem. J., 295: 517-524 (1993); Schwarz, Ph.
D. thesis, Eidgenössiche Technische Hochschule, Zúrich, Suiza
(1994)). Estudios recientes demuestran la formación de
1-desoxixilulosa 5-fosfato (Broers,
Ph. D. thesis (Eidgenössiche Technische Hochschule, Zúrich, Suiza)
(1994)) a partir de una molécula de cada gliceraldehído
3-fosfato (Rohmer, "Comprehensive Natural
Products Chemistry", Vol. 2, pp. 45-68, Barton y
Nakanishi, eds., Pergamon Press, Oxford, Inglaterra (1999)) y
piruvato (Eisenreich et al., Chem. Biol., 5:
R223-R233 (1998); Schwarz supra; Rohmer
et al., J Arn. Chem. Soc., 118: 2564-2566
(1996); y Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
94: 12857-12862 (1997)) por una enzima codificada
por el gen dxs (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 95: 2105-2110 (1997); y Lange et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 95: 2100-2104
(1998)). Es posible convertir además la
1-desoxixilulosa 5-fosfato en
2-C-metileritritol 4-fosfato (Arigoni et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94:
10600-10605 (1997)) mediante una reductoisomerasa
catalizada por el gen dxr (Bouvier et al., Plant
Physio, 117: 1421-1431 (1998); y Rohdich et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 96:
11758-11763 (1999)).
Los genes publicados de la ruta MEP también
incluyen ygbP, que cataliza la conversión de
2-C-metileritritol 4-fosfato de en su
respectivo derivado de citidil pirofosfato e ygbB, que
cataliza la conversión de
4-fosfocitidil-2C-metil-D-eritritol
en
2C-metil-D-eritritol-3,4-ciclofosfato.
Estos genes están estrechamente relacionados en el genoma de E.
coli (Herz et al., Proc. Natl. Acad.Sci. EE.UU., 97 (6):
2485-2490 (2000)).
Una vez formado el IPP mediante la ruta MEP,
éste es convertido en GGDP por la GGDP sintasa, y luego en
fitilpirofosfato, que es el constituyente principal de la cadena
lateral del tocoferol.
El ácido homogentísico se combina bien con
fitil-pirofosfato o con
solanil-pirofosfato mediante la fitil/prenil
transferasa formando
2-metil-6-fitil
plastoquinol o
2-metil-6-solanil
plastoquinol, respectivamente. El
2-metil-6-solanil
plastoquinol es un precursor de la biosíntesis de las
plastoquinonas, mientras que el
2-metil-6-fitil
plastoquinol es convertido finalmente en tocoferol.
La principal diferencia estructural entre cada
uno de los subtipos de tocoferol es la posición de los grupos
metilo alrededor del anillo fenilo. Tanto el
2-metil-6-fitil
plastoquinol como el
2-metil-6-solanil
plastoquinol sirven como sustratos para la
2-metil-6-fitilplatoquinol/2-metil-6-solanilplastoquinol-9
metiltransferasa (Metil Transferasa 1 o MT1), que cataliza la
formación de plastoquinol-9 y
\gamma-tocoferol, respectivamente, mediante la
metilación de la posición 7. La posterior metilación en la posición
5 del \gamma-tocoferol por la
\gamma-metil-transferasa genera el
\alpha-tocoferol biológicamente activo. La
tocoferol metil transferasa 2 (TMT2) muestra una actividad similar
a la MT1.
Existe la necesidad en la técnica por moléculas
de ácido nucleico codificantes de enzimas implicadas en la
biosíntesis del tocoferol, así como, las enzimas y los anticuerpos
relacionados para el aumento y la modificación de la producción del
tocoferol en plantas. Existe además la necesidad de organismos
transgénicos que expresen aquellas moléculas de ácido nucleico
implicadas en la biosíntesis del tocoferol, que sean capaces de
aumentar el valor nutricional de alimentos y fuentes de
alimentación.
Como se usan en la presente memoria, la
homogentisato fitil transferasa (HPT), fitilprenil transferasa
(PPT), el shr1736 y el ATPT2 se refiere cada uno a proteínas o
genes codificantes de proteínas que tienen la misma actividad
enzimática.
La presente invención incluye y proporciona una
molécula de ácido nucleico sustancialmente purificada según lo
expuesto en la reivindicación 1.
La presente invención incluye y proporciona una
planta transformada según lo expuesto en la reivindicación 7.
La presente invención incluye y proporciona un
procedimiento para producir una planta que tiene niveles aumentados
de tocoferol según lo expuesto en la reivindicación 12.
La presente invención incluye y proporciona un
procedimiento para reducir los niveles de tocoferol en una planta
que comprende: (A) transformar dicha planta con una molécula de
ácido nucleico, en el que dicha molécula de ácido nucleico
comprende como componentes ligados operativamente una región
promotora exógena que funciona en células vegetales para generar la
producción de una molécula de ARNm, una molécula de ácido nucleico
transcrita que tiene una cadena transcrita y una cadena no
transcrita, siendo dicha cadena transcrita complementaria a una
molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico
seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 1 y 3; y estando
dicha molécula de ácido nucleico transcrita ligada a una secuencia
no traducida en 3' que funciona en las células vegetales para
provocar la terminación de la transcripción y la adición de
ribonucleótidos poliadenilados a un extremo 3' de la secuencia de
ARNm; y (B) cultivar dicha planta transformada.
La presente invención incluye y proporciona
realizaciones preferidas según lo expuesto en las reivindicaciones
subordinadas.
La SEC ID N.º 1 expone una secuencia de un ácido
nucleico de una molécula de ADN que codifica una prefenato
deshidrogenasa bifuncional de Erwinia herbicola.
La SEC ID N.º 2 expone una secuencia de
aminoácidos derivada de una prefenato deshidrogenasa bifuncional de
Erwinia herbicola.
La SEC ID N.º 3 expone una secuencia de ácido
nucleico de una molécula de ADN que codifica una prefenato
deshidrogenasa bifuncional de Escherichia coli.
La SEC ID N.º 4 expone una secuencia de
aminoácidos derivada de una prefenato deshidrogenasa bifuncional de
Escherichia coli.
La SEC ID N.º 5 expone un cebador 5' usado para
la amplificación de una secuencia de tyrA de Erwinia
herbicola.
La SEC ID N.º 6 expone un cebador 3' usado para
la amplificación de una secuencia de tyrA de Erwinia
herbicola.
La SEC ID N.º 7 expone un cebador 5' usado para
la amplificación de una secuencia de tyrA de Escherichia
coli.
La SEC ID N.º 8 expone un cebador 3' usado para
la amplificación de una secuencia de tyrA de Escherichia
coli.
La SEC ID N.º 9 expone una secuencia de
cebador.
La SEC ID N.º 10 expone una secuencia de
cebador.
La SEC ID N.º 11 expone una secuencia de
cebador.
La SEC ID N.º 12 expone una secuencia de
cebador.
La figura 1 es una gráfica que compara los
niveles de tocoferoles totales de las semillas de las líneas de
Arabidopsis thaliana que albergan un constructo de expresión
de tyrA de Erwinia herbicola con una secuencia
dirigida a plastos, una planta de tipo natural y una planta con un
vector de control.
La Figura 2 es un esquema del constructo
pMON26588.
La Figura 3 es un esquema del constructo
pMON26589.
La Figura 4 es un esquema del constructo
pMON26591.
La Figura 5 es un esquema del constructo
pMON26590.
La Figura 6 es un esquema del constructo
pMON36510.
La Figura 7 es un esquema del constructo
pMON36512.
La Figura 8 es un esquema del constructo
pMON36511.
La Figura 9 es un esquema del constructo
pMON36520.
La Figura 10 es un esquema del constructo
pCGN10822.
La Figura 11 es un esquema del constructo
pMON36528.
La Figura 12 es un esquema del constructo
pMON69907.
La Figura 13 es un esquema del constructo
pMON69909.
La figura 14 representa el contenido de
tocoferoles y tocotrienoles totales de semillas de
Arabidopsis procedentes de plantas de tipo natural y varias
líneas vegetales transformadas con el vector plasmídico
pMON69907.
La figura 15 representa el contenido de
tocoferoles totales de semillas de Arabidopsis procedentes de
plantas de tipo natural y varias líneas vegetales transformadas con
el vector plasmídico pMON69907.
La figura 16 representa el contenido de
tocoferoles y tocotrienoles totales de semillas de Arabidopsis
thaliana procedentes de plantas de tipo natural y varias líneas
vegetales transformadas por separado con los vectores plasmídicos
pCGN10822, pMON36528, pMON69907 y pMON69909.
La figura 17 representa un análisis detallado
del contenido de tocoferoles y tocotrienoles de semillas de
Arabidopsis procedentes de líneas vegetales transformadas con
el vector pMON69909 en relación con semillas vegetales de tipo
natural.
Las figuras 18a y 18b muestran ejemplos de
constructos para la transformación en plantas.
La Figura 19 es un constructo esquemático de
pMON36582.
La figura 20 es un ejemplo de vector lanzadera
(pMON36586) que alberga un casete de expresión de la homogentisato
fitiltransferasa (HPT) de Arabidopsis como un casete de
Bsp120 I/Not I. El promotor de la napina y el terminador de la
napina están fusionados a los extremos 5' y 3' respectivamente para
dirigir la expresión de semilla
específica.
específica.
La figura 21 representa diversos casetes de
expresión de genes mostrados en un vector lanzadera (A) o en un
vector binario (B).
La Figura 22 es un esquema del constructo
pMON36596.
La Figura 23 es un esquema del constructo
pMON36597.
La Figura 24 es un esquema del constructo
pMON77601.
La Figura 25 es un esquema del constructo
pMON77602.
La Figura 26 es un esquema del constructo
pMON66657.
La Figura 27 es un esquema del constructo
pMON66659.
La Figura 28 es un esquema del constructo
pMON26541.
La Figura 29 es un esquema del constructo
pMON26543.
La Figura 30 es un esquema del constructo
pMON36176.
La figura 31 es una gráfica estándar de
CL/EM.
La figura 32 es una gráfica de CL/EM.
La figura 33 es una cromatografía de CLAR.
La figura 34 es una cromatografía de CLAR.
La Figura 35 es un esquema del constructo
pMON69915.
La Figura 36 es un esquema del constructo
pMON69919.
La Figura 37 es un esquema del constructo
pMON10098.
La Figura 38 es un esquema del constructo
pMON36520.
La Figura 39 es un esquema del constructo
pMON43853.
La Figura 40 es un esquema del constructo
pMON36525.
La Figura 41 es un esquema del constructo
pMON43861.
La Figura 42 es un esquema del constructo
pCGN7770.
La Figura 43 es un esquema del constructo
pMON69911.
La Figura 44 es un esquema del constructo
pCGN11301.
La Figura 45 es un esquema del constructo
pCGN3223.
La Figura 46 es un esquema del constructo
pMON36575.
La Figura 47 es un esquema del constructo
pMON38207R.
La Figura 48 es un esquema del constructo
pMON36571.
La Figura 49 es un esquema del constructo
pMON36576.
La Figura 50 es un esquema del constructo
pMON69924.
La Figura 51 es un esquema del constructo
pMON69943.
La Figura 52 es un esquema del constructo
pMON69929.
La Figura 53 es un esquema del constructo
pMON69936.
La Figura 54 es un esquema del constructo
pMON36592.
La Figura 55 es un esquema del constructo
pMON69945.
La Figura 56 es un esquema del constructo
pMON16602.
La Figura 57 es un esquema del constructo
pMON36525.
La Figura 58 es un esquema del constructo
pMON58171.
La Figura 59 es un esquema del constructo
pMON58172.
La Figura 60 es un esquema del constructo
pMON58170.
La Figura 61 es un esquema del constructo
pMON36591.
La Figura 62 es un esquema del constructo
pMON36588.
La Figura 63 es un esquema del constructo
pMON36592.
La Figura 64 es un esquema del constructo
pMON58182.
La Figura 65 es un esquema del constructo
pMON58176.
La Figura 66 es un esquema del constructo
pMON58183.
La Figura 67 es un esquema del constructo
pMON58185.
La Figura 68 es un esquema del constructo
pMON36593.
La Figura 69 es un esquema del constructo
pMON36589.
La Figura 70 es un esquema del constructo
pMON36590.
La Figura 71 es un esquema del constructo
pMON67162.
La Figura 72 es un esquema del constructo
pMON58178.
La Figura 73 es un esquema del constructo
pMON58186.
La Figura 74 es un esquema del constructo
pMON58188.
La figura 75 muestra los niveles de tocoferol y
tocotrienol, así como los niveles de HGA de líneas
seleccionadas.
La figura 76 muestra los niveles de tocoferol y
2M6PPQ de líneas seleccionadas.
Cualquiera de las moléculas de ácido nucleico
reveladas en la presente memoria puede ser aumentada o
sobre-expresada en una variedad de organismos,
tales como plantas, que pueden dar como resultado niveles más
elevados de precursores del tocoferol tales como el ácido
homogentísico (HGA) y finalmente, mayores niveles de tocoferoles en
tales organismos. Además, el aumento de expresión o la
sobre-expresión de las proteínas expuestas en la
presente memoria también pueden dar como resultado la producción de
mayores niveles de plastoquinonas. Además, la presente invención
proporciona un número de agentes, por ejemplo, moléculas de ácido
nucleico y proteínas asociadas con la producción de tocoferoles, y
proporciona usos de tales agentes.
La presente invención incluye y proporciona
constructos de ácido nucleico para la expresión de prefenato
deshidrogenasas bifuncionales en organismos en los que es deseable
generar una mayor producción de ácido homogentésico, plastoquinonas
o tocoferoles. Tales constructos de ácido nucleico se pueden usar en
organismos para los que sea deseable un mayor nivel de actividad
prefenato deshidrogenasa. La invención también incluye y proporciona
constructos de ácidos nucleicos para la expresión de fitil
preniltransferasas en organismos en los que sea deseable generar
una mayor producción de plastoquinonas o tocoferoles, y el uso de
los constructos produciendo ácidos nucleicos antisentido frente a
las fitil preniltransferasas en organismos en los que sea deseable
generar una mayor producción de ácido homogentésico.
Los agentes de la invención serán
preferiblemente "biológicamente activos" con respecto a bien un
atributo estructural, tal como la capacidad de un ácido nucleico
para hibridarse con otra molécula de ácido nucleico, o la capacidad
de una proteína para ser unida por un anticuerpo (o para competir
con otra molécula por tal unión). Alternativamente, tal atributo
puede ser catalítico y, por tanto, implicar la capacidad del agente
de mediar una reacción o una respuesta química. Los agentes estarán
preferiblemente "sustancialmente purificados". El término
"sustancialmente purificado", como se usa en la presente
memoria, se refiere a una molécula separada de sustancialmente
todas las demás moléculas que se encuentran normalmente asociadas
con ella en su estado nativo. Más preferiblemente, una molécula
sustancialmente purificada es la especie predominante presente en
una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede estar
más del 60% libre, preferiblemente, el 75% libre, más
preferiblemente, el 90% libre, y lo más preferible, el 95% libre de
otras moléculas (excluyendo el disolvente) presentes en la mezcla
natural. El término "sustancialmente purificado" no pretende
englobar las moléculas presentes en su estado nativo.
Los agentes de la invención también pueden ser
recombinantes. Como se usa en la presente memoria, el término
recombinante significa cualquier agente (p.ej., ADN, péptido etc.),
que es, o resulta, aunque indirectamente, de la manipulación humana
de una molécula de ácido nucleico.
Se entiende que los agentes de la invención
pueden estar marcados con reactivos que faciliten la detección del
agente (p.ej., marcadores fluorescentes, Prober et al.,
Science 238: 336-340 (1987); Albarella et
al., EP 144914; marcadores químicos, Sheldon et al.,
patente estadounidense n.º 4.582.789; Albarella et al.,
patente estadounidense n.º 4.563.417; bases modificadas, Miyoshi
et al., EP 119448).
Los agentes de la invención incluyen moléculas
de ácido nucleico que codifican una prefenato deshidrogenasa
bifuncional que tiene actividades tanto corismato mutasa como
prefenato deshidrogenasa. En una realización preferida, la molécula
de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que
tiene las SEC ID N.º 1 ó 3.
Un fragmento de una o más de las moléculas de
ácido nucleico de la invención puede ser una sonda y específicamente
una sonda PCR. Una sonda PCR es una molécula de ácido nucleico
capaz de iniciar una actividad polimerasa cuando está en una
estructura bicatenaria con otro ácido nucleico. Existen diversos
procedimientos para determinar la estructura de las sondas PCR y
diversas técnicas PCR en la técnica. Se pueden usar búsquedas
generadas por ordenador usando programas tales como Primer3
(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi),
STSPipeline
(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STS_Pipeline)
o GeneUp (Pesole et al., BioTechniques 25:
112-123 (1998)), por ejemplo, para identificar
posibles cebadores PCR.
Otro subconjunto de moléculas de ácido nucleico
de la invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican
una proteína o un fragmento de la misma.
Las moléculas de ácido nucleico o los fragmentos
de las mismas de la presente invención son capaces de hibridarse
específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en ciertas
circunstancias.
Como se usa en la presente memoria, se dice que
dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse
específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar
una estructura de ácido nucleico antiparalela bicatenaria.
Se dice que una molécula de ácido nucleico es
"complementaria" a otra molécula de ácido nucleico si presentan
una complementariedad total. Como se usa en la presente memoria, se
dice que las moléculas presentan una "complementariedad total"
cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a
un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son
"mínimamente complementarias" si pueden hibridarse entre sí con
una estabilidad suficiente que les permita permanecer apareadas
entre sí bajo condiciones al menos "poco restrictivas"
convencionales. De manera similar, se dice que las moléculas son
"complementarias" si pueden hibridarse entre sí con una
estabilidad suficiente que les permita permanecer apareadas entre
sí bajo condiciones "muy restrictivas" convencionales. En
Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory
Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York (1989) y Haymes et al., "Nucleic Acid
Hybridization, A Practical Approach", IRL Press, Washington, DC
(1985), se describen las condiciones restrictivas convencionales.
Por lo tanto, se permite una complementariedad incompleta, siempre
y cuando tales complementariedades no excluyan por completo la
capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria.
De este modo, para que una molécula de ácido nucleico pueda servir
como un cebador o una sonda, sólo es necesario que sea
suficientemente complementaria secuencialmente para ser capaz de
formar una estructura bicatenaria estable a las concentraciones de
disolvente y sales particulares empleadas.
Las condiciones restrictivas apropiadas que
promueven la hibridación del ADN son, por ejemplo, 6,0 x cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguidos por un
lavado de 2,0 x SSC a 20-25ºC, y son conocidas por
los expertos en la técnica o se pueden encontrar en "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley e hijos, N. Y.
(1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración
de sales en la etapa de lavado se puede seleccionar entre una
condición poco restrictiva de aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC a una
condición muy restrictiva de aproximadamente 0,2 x SSC a 65ºC.
Además, se puede aumentar la temperatura de la etapa de lavado de
condiciones poco restrictivas a la temperatura ambiente,
aproximadamente 22ºC, a condiciones muy restrictivas a
aproximadamente 65ºC. Se puede variar tanto la temperatura como la
concentración salina, o se puede mantener constante bien la
temperatura o la concentración salina cambiando la otra
variable.
Una o más de las moléculas de ácido nucleico de
la presente invención difieren en la secuencia de ácido nucleico de
aquéllas para las que se proporciona una secuencia específica en la
presente memoria, porque uno o más codones han sido reemplazados
con un codón que codifica una sustitución conservativa del
aminoácido originariamente codificado.
Una clase de agentes incluye una o más de las
proteínas o los fragmentos de las mismas o las moléculas peptídicas
codificadas por un agente de ácido nucleico de la invención.
Los agentes proteicos o peptídicos pueden tener
prolongaciones de la secuencias de aminoácidos
C-terminales o N-terminales. Una
clase de prolongaciones N-terminales empleadas en
una realización preferida son los péptidos de tránsito a plastos.
Cuando se emplean, los péptidos de transito a plastos se pueden
ligar operativamente a la secuencia N-terminal,
permitiendo así la localización del agente peptídico o proteico en
los plastos. En una realización preferida, la secuencia dirigida a
plastos es una secuencia de CTP1. En otra realización, la secuencia
es una secuencia de CTP2.
Como se usa en la presente memoria, el término
"molécula proteína" o "peptídica" incluye cualquier
molécula que comprende cinco o más aminoácidos. Se sabe en la
técnica que las proteínas pueden ser sometidas a una modificación,
incluyendo modificaciones post-traduccionales, tales
como, pero no limitándose a, la formación de enlaces disulfuro,
glicosilación, fosforilación u oligomerización. De este modo, como
se usa en la presente memoria, el término "molécula proteína"
o "peptídica" incluye cualquier proteína que esté modificada
mediante cualquier procedimiento biológico o no biológico. Los
términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos
los L-aminoácidos naturales. Esta definición
pretende incluir norleucina, norvalina, ornitina, homocisteína y
homoserina.
Una o más de moléculas proteicas o fragmentos de
las mismas o moléculas peptídicas se pueden producir mediante
síntesis química, o más preferiblemente, mediante la expresión en un
huésped bacteriano o eucariota adecuado. En Sambrook et al.,
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Ed., Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989) o textos
similares, se describen procedimientos adecuados para la
expresión.
Un "fragmento proteico" es una molécula
peptídica o polipeptídica cuya secuencia de aminoácidos comprende
un subconjunto de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Una
proteína o un fragmento de la misma que comprende una o más
regiones peptídicas adicionales no derivadas de la proteína es una
proteína de "fusión". Tales moléculas pueden ser derivadas
para que contengan hidratos de carbono u otros restos (tales como
hemocianina de lapa californiana). Las moléculas proteicas o
peptídicas de fusión de la invención se producen preferiblemente
mediante procedimientos recombinantes.
Se pueden usar una o más de las moléculas de
ácido nucleico de la invención en la transformación o transfección
de plantas. Se puede transferir material genético exógeno a una
célula vegetal y regenerar la célula vegetal en una planta completa
fértil o estéril. El material genético exógeno es cualquier material
genético, bien natural o de otro tipo, procedente de cualquier
fuente que sea capaz de ser insertado en cualquier organismo. En
una realización preferida, el material genético exógeno codifica una
prefenato deshidrogenasa bifuncional o fragmentos de la misma, más
preferiblemente, una prefenato deshidrogenasa bifuncional procedente
de un organismo procariota, e incluso más preferiblemente, una
prefenato deshidrogenasa bifuncional procedente de Erwinia
herbicola o Escherichia coli.
En una realización de la presente invención, se
introduce el material genético exógeno que comprende un homólogo de
tyrA o un fragmento del mismo en una planta con uno o más
genes adicionales. En una realización, las combinaciones de genes
preferidas incluyen dos o más de los siguientes genes: tyrA,
slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1,
slr 1737, y un constructo antisentido para la ácido
homogentísico dioxigenasa (Krindl et al., Seed Sci. Res. 1:
209: 219 (1991); Keegstra, Cell 56 (2):47-53
(1989); Nawrath, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:
12760-12764 (1994); Xia et al., J. Gen.
Microbiol 138: 1309-1316 (1992); Cyanobase en
la web www. kazusa.or.jp/cyanobase; Lois et al., Poc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU. 95 (5): 2105-2110 (1998); Takahashi
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95 (17),
9879-9884 (1998); Norris et al., Plant
Physiol. 117: 1317-1323 (1998); Bartley y
Scolnik, Plant Physiol. 104: 1469-1470
(1994), Smith et al., Plant J. 11: 83-92
(1997); WO 00/32757; WO 00/10380; Saint Guily, et al., Plant
Physiol., 100(2): 1069-1071 (1992); Sato
et al., J. DNA Res. 7 (1): 31-63
(2000)). En una combinación preferida, el constructo o los
constructos de ácido nucleico codifican, además de tyrA,
HPPD y bien slr1736 o ATPT2.
En tales combinaciones, se puede dirigir uno o
más de los productos génicos hacia el plasto mediante el uso de una
secuencia dirigida a plastos. Alternativamente, se puede localizar
uno o más de los productos génicos en el citoplasma. Se pueden
introducir tales genes, por ejemplo, con el homólogo de tyrA
o un fragmento del mismo sobre un solo constructo, introducir en
diferentes constructos pero en la misma transformación o introducir
en plantas separadas tras lo que se realizan uno o más cruces para
generar la combinación de genes deseada. En tales combinaciones, un
promotor preferido es un promotor de napina y una secuencia dirigida
a plastos preferida es una secuencia de CTP1.
Se puede transferir tal material genético bien a
monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo, pero no limitándose
a, canola, maíz, soja, Arabidopsis phaseolus, cacahuete,
alfalfa, trigo, arroz, avena, sorgo, centeno, tritordeo, mijo,
festuca, valluco perenne, caña de azúcar, arándano, papaya, plátano,
cártamo, aceite de palma, lino, melón, manzana, pepino, dendrobio,
gladiolo, crisantemo, lila, algodón, eucalipto, girasol, Brassica
campestris, Brassica napus, césped, remolacha, café y
dioscorea (Christou, en: "Particle Bombardment for Genetic
Engineering of Plants", Biotechnology Intelligence Unit. Academic
Press, San Diego, California (1996)), siendo la canola, el maíz,
Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica
napus, soja, crambe, mostaza, semilla de ricino, cacahuete,
sésamo, semilla de algodón, semilla de lino, cártamo, aceite de
palma, lino y girasol los preferidos, y los más preferidos canola,
maíz, Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica
napus, soja, girasol, cártamo, aceite de palma y cacahuete. En
una realización más preferida, el material genético se transfiere a
canola. En otra realización más preferida, el material genético se
tranfiere a Brassica napus. En otra más realización
preferida, el material genético se tranfiere a soja.
La transferencia de un ácido nucleico que
codifica una proteína puede dar como resultado la expresión o la
sobre-expresión de la proteína en una célula
transformada o una planta transgénica. Una o más de las proteínas o
los fragmentos de las mismas codificadas por las moléculas de ácido
nucleico de la invención pueden ser
sobre-expresadas en una célula transformada o una
planta transformada. Tal expresión o sobre-expresión
puede ser el resultado de una transferencia transitoria o estable
del material genético exógeno.
En una realización preferida, la expresión o la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, en relación con
una planta sin transformar con un contexto genético similar, un
mayor nivel de tocotrienoles.
En una realización preferida, la expresión o la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, en relación con
una planta sin transformar con un contexto genético similar, un
mayor nivel de tocoferoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, en relación con
una planta sin transformar con un contexto genético similar, un
mayor nivel de \alpha-tocoferoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, en relación con
una planta sin transformar con un contexto genético similar, un
mayor nivel de \gamma-tocoferoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, en relación con
una planta sin transformar con un contexto genético similar, un
mayor nivel de ácido homogentésico.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, en relación con
una planta sin transformar con un contexto genético similar, un
mayor nivel de plastoquinoles o plastoquinonas.
En algunas realizaciones, los niveles de uno o
más productos de la ruta de la biosíntesis del tocoferol, incluyendo
uno cualquiera o más entre tocotrienoles, tocoferoles,
\alpha-tocoferoles,
\gamma-tocoferoles, plastoquinoles,
plastoquinonas o ácido homogentésico, se aumentan en un 10% o, más
preferiblemente, en un 25%, 50%, 100%, 200%, 250%, 1.000%, 2.000% o
2.500%. Los niveles de los productos se pueden aumentar en todo un
organismo, tal como una planta, o en uno o más órganos o tejidos
específicos del organismo. Por ejemplo, se pueden aumentar los
niveles de los productos en uno o más tejidos y órganos de una
planta incluyendo sin limitación: raíces, tubérculos, tallos,
hojas, troncos, fruto, bayas, frutos secos, corteza, vainas,
semillas y flores.
En otra realización, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta proporciona en esa planta, o en un tejido
de esa planta, en relación con una planta o el tejido de la planta
sin transformar con un contexto genético similar, un mayor nivel de
proteína prefenato deshidrogenasa.
En otra realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una planta transformada puede proporcionar tolerancia
a una variedad de estreses, p. ej., tolerancia al estrés oxidativo
tal como al oxígeno o al ozono, tolerancia a la radiación UV,
tolerancia la frío o tolerancia a patógenos
micóticos/microbianos.
Como se usa en la presente memoria, en un
aspecto preferido, la tolerancia o la resistencia a un estrés está
determinada por la capacidad de una planta, cuando es desafiada por
un estrés tal como el frío, de producir una planta que tenga un
mayor rendimiento que una sin tal tolerancia o resistencia a ese
estrés. En un aspecto particularmente preferido de la presente
invención, la tolerancia o la resistencia la estrés se mide en
relación con una planta con un contexto genético similar a la
planta tolerante o resistente a excepción de que la planta expresa
o sobre-expresa una proteína de la presente
invención.
El material genético exógeno puede ser
transferido a una célula huésped mediante el uso de un vector de ADN
o un constructo diseñado para tal efecto. El diseño de tal vector
pertenece generalmente al alcance de la técnica (véase, "Plant
Molecular Biology: A Laboratory Manual", Clark (ed.), Springer,
Nueva York (1997)). En algunas realizaciones de esta invención se
pueden transferir una secuencia de un solo gen seleccionado del
grupo constituido por tyrA, slr1736, ATPT2,
dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD,
MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr 1737,
y un constructo antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa
a la planta diana deseada. En una combinación preferida, el
constructo o los constructos de ácido nucleico codifican, además de
tyrA, HPPD y bien slr1736 o ATPT2. Las plantas
diana que expresan la actividad deseada desde la secuencia génica
transferida se pueden someter a uno o más cruces con plantas que
hayan sido transformadas con una o más secuencias de otros genes
seleccionados del grupo constituido por tyrA,
slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH,
GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT,
AANT1, slr 1737, y un constructo antisentido para la
ácido homogentísico dioxigenasa para obtener plantas que expresen
dos o más de las actividades deseadas desde la secuencia génica
transferida. En una combinación preferida, el constructo o los
constructos de ácido nucleico codifican, además de tyrA,
HPPD y bien slr1736 o ATPT2. En otra realización, los
constructos de vectores de ADN pueden ser constructos de múltiples
genes que comprenden dos o más secuencias génicas seleccionadas del
grupo constituido por tyrA, slr1736, ATPT2,
dxs, dxr, GGH, GGPPS, HPPD,
MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr1737, y un constructo
antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa tal que la
transformación con un constructo de un solo vector de ADN resulte
en la expresión de las dos o más de las secuencias génicas. En una
combinación preferida, el constructo o los constructos de ácido
nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y bien 736 o ATPT2.
Un constructo o un vector pueden incluir un
promotor vegetal que expresa la proteína o el fragmento proteico de
elección. En una realización preferida, cualquier molécula de ácido
nucleico descrita en la presente memoria puede ser ligada
operativamente a una región promotora que funcione en una célula
vegetal para generar la producción de una molécula de ARNm. Por
ejemplo, se puede usar cualquier promotor que funcione en una célula
vegetal para generar la producción de una molécula de ARNm, tal
como aquellos promotores descritos en la presente memoria, sin
limitación. En una realización preferida, el promotor es un promotor
vegetal.
Se ha descrito un número de promotores que son
activos en células vegetales en la bibliografía. Estos incluyen el
promotor de la nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (EE.UU.) 84: 5745-5749 (1987)), el
promotor de la octapina sintasa (OCS) (que es portado en plásmidos
de inducción tumoral de Agrobacterium tumefaciens), los
promotores caulimovirus tales como el promotor 19S del virus del
mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton et al., Plant Mol.
Biol. 9: 315-324 (1987)) y el promotor 35S del
CaMV (Odell et al., Nature 313: 810-812
(1985)), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia,
el promotor foto-inducible de la subunidad pequeña
de
ribulosa-1,5-bis-fosfato
carboxilasa (spRUBISCO), el promotor de Adh (Walker et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 84: 6624-6628
(1987)), el promotor de la sacarosa sintasa (Yang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 87: 4144-4148 (1990)),
el promotor del complejo de genes R (Chandler et al., "The
Plant Cell" 1: 1175-1183 (1989)) y el promotor
del gen proteico de unión a la clorofila a/b, etc. Estos promotores
se han usado para crear constructos de ADN que han sido expresados
en plantas; véase, p.ej., la publicación PCT WO 84/02913. Los
promotores 35S del CaMV son los preferidos para su uso en plantas.
Se pueden usar promotores de los que se sepa o se haya descubierto
que generan la transcripción de ADN en células vegetales en la
invención.
A efectos de la expresión en tejidos fuente de
la planta, tales como la hoja, la semilla, la raíz o el tallo, es
preferible que los promotores utilizados tengan una expresión
relativamente elevada de estos tejidos específicos. La expresión de
tejido específico de una proteína de la presente invención es una
realización particularmente preferida. A tal efecto, se puede hacer
la selección de entre un número de promotores con expresión de
tejido específico, de célula específica o aumentada. Los ejemplos
de tales promotores presentados en la bibliografía incluyen el
promotor GS2 de la glutamina sintetasa cloroplástica procedente del
guisante (Edwards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.)
87: 3459-3463 (1990)), el promotor para la
fructosa-1,6-bifosfatasa (FBPasa)
cloroplástica del trigo (Lloyd et al., Mol. Gen. Genet. 225:
209-216 (1991)), el promotor ST-LS1
fotosintético nuclear de la patata (Stockhaus et al., EMBO
J. 8: 2445-2451 (1989)), el promotor para la
serina/treonina quinasa (PAL) y el promotor para la glucoamilasa
(CHS) de Arabidopsis thaliana. También se han descrito como
activos en tejidos activos fotosintéticamente el promotor para la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
(RbcS) del alerce americano oriental (Larix laricina), el
promotor para el gen cab, cab6, del pino (Yamamoto et
al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778 (1994)), el
promotor para el gen Cab-1 del trigo (Fejes et
al., Plant Mol. Biol. 15: 921-932 (1990)), el
promotor para el gen CAB-1 de la espinaca
(Lubberstedt et al., Plant Physiol. 104:
997-1006 (1994)), el promotor para el gen cab1R del
arroz (Luan et al., Plant Cell. 4: 971-981
(1992)), el promotor de la piruvato ortofosfato diquinasa (PPDK) del
maíz (Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 90:
9586-9590 (1993)), el promotor para el gen Lhcb1*2
del tabaco (Cerdan et al., Plant Mol. Biol. 33:
245-255 (1997)), el promotor para el simportador de
sacarosa-H^{+} SUC2 de Arabidopsis
thaliana (Truernit et al., Planta. 196:
564-570 (1995)) y el promotor para las proteínas de
la membrana tilacoidea de la espinaca (psaD, psaF, psaE, PC, FNR,
atpC, atpD, cab, rbcS). También se pueden utilizar otros
promotores para las proteínas de unión a la clorofila a/b en la
invención, tales como los promotores para el gen LhcB y el
gen PsbP de la mostaza blanca (Sinapis alba; Kretsch
et al., Plant Mol. Biol. 28: 219-229
(1995)).
A efectos de la expresión en tejidos destino de
la planta, tales como el tubérculo de la planta de la patata, el
fruto del tomate o la semilla del maíz, del trigo, del arroz y de la
cebada, es preferible que los promotores utilizados en la invención
tengan una expresión relativamente elevada en estos tejidos
específicos. Se conoce un número de promotores para genes con una
expresión de tubérculo específico o aumentada en tubérculos,
incluyendo el promotor para la patatina de clase I (Bevan et
al., EMBO J. 8: 1899-1906 (1986); Jefferson
et al., Plant Mol. Biol. 14: 995-1006
(1990)), el promotor para los genes ADPGPP del tubérculo de la
patata, tanto la subunidad grande como la pequeña, el promotor de
la sacarosa sintasa (Salanoubat y Belliard, Gene 60:
47-56 (1987), Salanoubat y Belliard, Gene 84:
181-185 (1989)), el promotor para las principales
proteínas de tubérculos incluyendo los complejos proteicos de 22 kd
y los inhibidores de la proteasa (Hannapel, Plant Physiol.
101: 703-704 (1993)), el promotor para el gen de la
almidón sintasa unida a gránulos (GBSS) (Visser et al., Plant
Mol. Biol. 17: 691-699 (1991)) y otros
promotores para patatinas de clase I y II
(Koster-Topfer et al., Mol. Gen. Genet. 219:
390-396 (1989); Mignery et al., Gene. 62:
27-44 (1988)).
También se pueden usar otros promotores para
expresar una proteína, o un fragmento de la misma, en tejidos
específicos, tales como semillas o frutos. De hecho, en una
realización preferida, el promotor usado es un promotor de una
semilla específica. Los ejemplos de tales promotores incluyen las
regiones reguladoras de 5' de genes tales como la napina (Krindl
et al., Seed Sci. Res. 1: 209: 219 (1991)), la faseolina
(Bustos, et al., Plant Cell, 1 (9): 839-853
(1989)), el inhibidor de la tripsina de la soja (Riggs, et al.,
Plant Cell 1 (6): 609-621 (1989)), ACP
(Baerson, et al., Plant Mol. Biol., 22 (2):
255-267 (1993)), estearoil-ACP
desaturasa (Slocombe, et al., Plant Physiol. 104 (4):
167-176 (1994)), subunidad a' de la
b-conglicinina de la soja (7s de la soja, (Chen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8560-8564
(1986))), y la oleosina (véase, por ejemplo, Hong, et al., Plant
Mol. Biol., 34 (3): 549-555 (1997)). Otros
ejemplos incluyen el promotor de la
\beta-conglicinina (Chen et al., Dev.
Genet. 10: 112-122 (1989)). También se incluyen
las zeínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento que se
encuentran en el endoesperma del maíz. Se han aislado clones
genómicos para genes de zeínas (Pedersen et al., Cell 29:
1015-1026 (1982), y Russell et al., Transgenic
Res. 6 (2): 157-168), y también se podrían usar
los promotores de estos clones, incluyendo los genes de 15 kD, 16
kD, 19 kD, 22 kD y 27 kD. Otros promotores conocidos por su
funcionamiento en, por ejemplo, el maíz incluyen los promotores de
los siguientes genes: waxy, Brittle, Shrunken
2, enzimas de ramificación I y II, almidón sintasas, enzimas de
desramificación, oleosinas, glutelinas y sacarosa sintasas. Un
promotor particularmente preferido para la expresión del endoesperma
del maíz es el promotor para el gen de la glutelina del arroz, más
concretamente, el promotor Osgt-1 (Zheng et al.,
Mol. Cell Biol. 13: 5829-5842 (1993)). Los
ejemplos de promotores adecuados para la expresión en trigo incluyen
aquellos promotores para las subunidades de ADPglucosa pirosintasa
(ADPGPP), la almidón sintasa unida a gránulos y otras almidón
sintasa, las enzimas de ramificación y desramificación, las
proteínas abundantes en la embriogénesis, las gliadinas y las
gluteninas. Los ejemplos de tales promotores en el arroz incluyen
aquellos promotores para las subunidades de ADPGPP, la almidón
sintasa unida a gránulos y otra almidón sintasa, las enzimas de
ramificación, las enzimas de desramificación, las sacarosa sintasas
y las glutelinas. Un promotor particularmente preferido es el
promotor para la glutelina del arroz, el Osgt-1.
Los ejemplos de tales promotores en la cebada incluyen aquellos
promotores para las subunidades de ADPGPP, la almidón sintasa unida
a gránulos y otra almidón sintasa, las enzimas de ramificación, las
enzimas de desramificación, las sacarosa sintasas, las hordeínas,
las globulinas embrionarias y las proteínas específicas de la
aleurona. Un promotor preferido para la expresión en la semilla es
un promotor de la napina.
También se pueden usar promotores de una raíz
específica. Un ejemplo de tal promotor es el promotor para el gen
de la chitinasa ácida (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25:
587-596 (1994)). La expresión en tejido de raíz
también se podría realizar utilizando subdominios de una raíz
específica del promotor 35S del CaMV que haya sido identificado
(Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 86:
7890-7894 (1989)). Hay otros promotores de células
de raíz específica que incluyen aquéllos descritos por Conkling
et al. (Conkling et al., Plant Physiol 93:
1203-1211 (1990)).
En las patentes estadounidenses n.º 5.378.619;
5.391.725; 5.428.147; 5.447.858; 5.608.144; 5.608.144; 5.614.399;
5.633.441; 5.633.435; y 4.633.436, se describen otros promotores que
se pueden utilizar. Además, se puede usar un potenciador de un
tejido específico (Fromm et al., The Plant Cell 1:
977-984 (1989)).
Los constructos o los vectores también pueden
incluir, con la región codificante de interés, una secuencia de
ácido nucleico que actúe, en la totalidad o en una parte, para
terminar la transcripción de esa región. Se ha aislado un número de
tales secuencias, incluyendo la secuencia 3' de Tr7 y la secuencia
3' de NOS (Ingelbrecht et al., "The Plant Cell" 1:
671-680 (1989); Bevan et al., Nucleic
Acids Res. 11: 369-385 (1983)). También se
pueden proporcionar regiones de terminación de transcriptos
reguladores en los constructos de expresión vegetal de esta
invención. Las regiones de terminación de los transcriptos pueden
ser proporcionados por la secuencia de ADN codificante del gen de
interés o una región de terminación de la transcripción conveniente
derivada de una fuente génica diferente, por ejemplo, la región de
terminación de transcriptos que está asociada de manera natural con
la región de iniciación de transcriptos. El experto en la técnica
reconocerá que, en los constructos de la presente invención, se
puede emplear cualquier región de terminación de transcriptos
conveniente que sea capaz de terminar la transcripción en una célula
vegetal.
Un vector o un constructo también pueden incluir
elementos reguladores. Tales ejemplos incluyen el intrón 1 de Adh
(Callis et al., Genes and Develop. 1:
1183-1200 (1987)), el intrón de la sacarosa sintasa
(Vasil et al., Plant Physiol. 91: 1575-1579
(1989)) y el elemento omega del VMT (Gallic et al., "The
Plant Cell" 1: 301-311 (1989)). Se pueden incluir
éstos y otros elementos reguladores cuando sea apropiado.
Un vector o un constructo también pueden incluir
marcadores seleccionables. Los marcadores seleccionables también se
pueden usar para seleccionar las plantas o las células vegetales que
contengan el material genético exógeno. Tales ejemplos incluyen,
pero no se limitan a: un gen neo (Potrykus et al., Mol.
Gen. Genet. 199: 183-188 (1985)), que codifica
la resistencia a la kanamicina y se puede seleccionar para usar
kanamicina, RptII, G418, hpt etc.; un gen bar que codifica la
resistencia a bialafos; un gen de EPSP sintasa mutante (Hinchee
et al., BiolTechnology 6: 915-922 (1988);
Reynaerts et al., "Selectable and Screenable Markers".
En Gelvin y Schilperoort. "Plant Molecular Biology Manual",
Kluwer, Dordrecht (1988); Reynaerts et al., "Selectable
and screenable markers". En Gelvin y Schilperoort. "Plant
Molecular Biology Manual", Kluwer, Dordrecht (1988)),
aadA (Jones et al., Mol. Gen. Genet. (1987)),) que
codifica la resistencia al glifosato; un gen de la nitrilasa que
confiere resistencia al bromoxinilo (Stalker et al., J. Biol.
Chem. 263: 6310-6314 (1988)); un gen de la
acetolactato sintasa mutante (ALS) que confiere resistencia a la
imidazolinona o a la sulfonilurea (solicitud de patente europea
154.204 (11 de sept. de 1985)), ALS (D'Halluin et al.,
Bio/Technology 10: 309-314 (1992)), y un gen de
DHFR resistente al metotrexato (Thillet et al., J. Biol.
Chem. 263: 12500-12508 (1988)). Un vector o un
constructo también pueden incluir un péptido de tránsito.
También se puede emplear la incorporación de un
péptido de tránsito cloroplástico adecuado (publicación de
solicitud de patente europea número 0218571). También se pueden
incorporar ampliadores de la traducción como una parte del ADN
vectorial. Los constructos de ADN podrían contener una o más
secuencias líder no traducidas en 5' que pueden servir para
aumentar la expresión de los productos génicos a partir de los
transcriptos de ARNm resultantes. Tales secuencias pueden ser
derivadas del promotor seleccionado para expresar el gen o pueden
ser modificados específicamente para aumentar la traducción del
ARNm. También se pueden obtener tales regiones de ARN víricos
procedentes de genes eucariotas adecuados, o de una secuencia génica
sintética. Como publicación sobre la optimización de la expresión
de transgenes, véase Koziel et al., Plant Mol. Biol. 32:
393-405 (1996). El péptido de tránsito preferido es
el CTP1. En otra realización, el péptido de tránsito es una
secuencia de CTP2.
Un vector o un constructo también pueden incluir
un marcador detectable. Los marcadores detectables se pueden usar
para controlar la expresión. Los ejemplos de marcadores detectables
incluyen: un gen de \beta-glucuronidasa o
uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen
diversos sustratos cromogénicos (Jefferson, Plant Mol. Biol,
Rep. 5: 387-405 (1987); Jefferson et al., EMBO
J. 6:3901-3907 (1987)); un gen del locus R, que
codifica un producto que regula la producción de pigmentos de
antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et
al., Stadler Symposium 11: 263-282 (1988)); un
gen de la \beta-lactamasa (Sutcliffe et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 75: 3737-3741
(1978)), un gen que codifica una enzima para la que se conocen
diversos sustratos cromogénicos (p.ej., PADAC, una cefalosporina
cromogénica); un gen de la luciferasa (Ow et al., Science
234: 856-859 (1986)); un gen xylE (Zukowsky
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 80:
1101-1105 (1983)) que codifica una catecol
dioxigenasa que puede convertir los catecoles cromogénicos; un gen
de la \alpha-amilasa (Ikatu et al.,
BiolTechnol. 8: 241-242 (1990)); un gen de la
tirosina (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129:
2703-2714 (1983)) que codifica una enzima capaz de
oxidar la tirosina en DOPA y dopaquinona que, a su vez, se condensa
en melanina; una \alpha-galactosidasa, que
convertirá un sustrato de \alpha-galactosa
cromogénico.
Incluidos en el término "genes marcadores
seleccionables o detectables" también están los genes que
codifican un marcador secretable cuya secreción puede ser detectada
como un medio de identificación o selección de células
transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un
antígeno secretable que puede ser identificado mediante la
interacción con anticuerpos, o incluso enzimas secretables que se
pueden detectar catalíticamente. Las proteínas secretables
pertenece a un número de clases, incluyendo proteínas difusibles
pequeñas que son detectables (p.ej., mediante ELISA), pequeñas
enzimas activas, que son detectables en solución extracelular (p.
ej., \alpha-amilasa,
\beta-lactamasa, fosfinotricin transferasa) o
proteínas que están insertadas o atrapadas en la pared celular
(tales como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como la
que se encuentra en la unidad de expresión de la prolongación o
PR-S del tabaco). Hay otros posibles genes
marcadores seleccionables y/o detectables que resultarán evidentes
para los expertos en la técnica.
Hay muchos procedimientos para introducir
moléculas de ácido nucleico transformantes en células vegetales. Se
cree que los procedimientos adecuados incluyen casi cualquier
procedimiento mediante el cual se puedan introducir moléculas de
ácido nucleico en una célula, tales como mediante la infección con
bacterias del género Agrobacterium o la administración
directa de moléculas de ácido nucleico tal como, por ejemplo,
mediante transformación mediada por PEG, mediante electroporación o
mediante aceleración de partículas revestidas de ADN, etc.
(Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:
205-225 (1991); Vasil, Plant Mol. Biol. 25:
925-937 (1994)). Por ejemplo, se ha usado la
electroporación para transformar protoplastos de maíz (Fromm et
al., Nature 312: 791-793 (1986)).
Otros sistemas vectoriales adecuados para
introducir ADN transformante en una célula vegetal huésped incluyen,
pero no se limitan a, vectores de cromosomas artificiales binarios
(BIBAC) (Hamilton et al., Gene 200: 107-116
(1997)); y la transfección con vectores víricos de ARN
(Della-Cioppa et al., Ann. N Y. Acad. Sci.
(1996), 792 ("Engineering Plants for Commercial Products and
Applications"), 57-61). Otros sistemas
vectoriales incluyen también vectores YAC seleccionables vegetales
tales como aquéllos descritos en Mullen et al., "Molecular
Breeding" 4: 449-457 (1988).
\newpage
La tecnología para introducir el ADN en células
es conocida por aquéllos expertos en la técnica. Se han descrito
cuatro procedimientos generales para la administración de un gen en
células:
- (1)
- procedimientos químicos (Graham y van der Eb, Virology 54: 536-539(1973));
- (2)
- procedimientos físicos tales como la microinyección (Capecchi, Cell 22: 479-488 (1980)), la electroporación (Wong y Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584-587 (1982); Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 82: 5824-5828 (1985); patente estadounidense n.º 5.384.253); la pistola de genes (Johnston y Tang, Methods Cell Viol. 43: 353-365 (1994)); y la infiltración al vacío (Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316:1194-1199 (1993)); (3) vectores víricos (Clapp, Clin. Perinatol. 20: 155-168 (1993); Lu et al., J Exp. Med. 178: 2089-2096 (1993); Eglitis y Anderson, Biotechniques 6: 608- 614 (1988)); y (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3: 147-154 (1992), Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 89: 6099-6103 (1992)).
Los procedimientos de aceleración que se pueden
usar incluyen, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles y
similares. Un ejemplo de un procedimiento para introducir moléculas
de ácido nucleico transformantes en células vegetales es el
bombardeo de microproyectiles. Este procedimiento ha sido revisado
por Yang y Christou (eds.), "Particle Bombardment Technology for
Gene Transfer", Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994)).
Partículas no biológicas (microproyectiles) que pueden ser
revestidos con ácidos nucleicos e introducidas en células mediante
una fuerza de propulsión. Los ejemplos de partículas incluyen
aquéllas compuestas por tungsteno, oro, platino y similares.
Una particular ventaja del bombardeo de
microproyectiles es que además de ser un procedimiento eficaz para
transformar reproduciblemente monocotiledóneas, no es necesario ni
el aislamiento de protoplastos (Cristou et al., Plant
Physiol. 87: 671-674 (1988)) ni la
susceptibilidad a la infección con Agrobacterium. Una
realización ilustrativa de un procedimiento de introducción de ADN
en células de maíz mediante aceleración es un sistema biolístico de
administración de partículas \alpha, que se puede usar para
propulsar partículas revestidas de ADN a través de una pantalla,
tal como una pantalla de acero inoxidable o Nytex, sobre una
superficie filtrante cubierta con células de maíz cultivadas en
suspensión. Gordon-Kamm et al. describen el
procedimiento básico para revestir partículas de tungsteno con ADN
(Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:
603-618 (1990)). La pantalla dispersa las
partículas de ácido nucleico de tungsteno de manera que no son
enviadas a las células receptoras en forma de grandes agregados. Un
sistema de administración de partículas adecuado para su uso con la
invención es la pistola PDS-1000/He de aceleración
de helio, que se encuentra disponible en los laboratorios
Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules,
California) (Sanford et al., Technique 3:
3-16 (1991)).
Para el bombardeo, se pueden concentrar sobre
los filtros las células en suspensión. Los filtros que contienen
las células que van a ser bombardeadas se colocan a una distancia
apropiada por debajo de la placa de detención de los
microproyectiles. Si se desea, también se colocan una o más
pantallas entre la pistola y las células que van a ser
bombardeadas.
Alternativamente, se pueden disponer embriones
inmaduros u otras células diana sobre medio de cultivo sólido. Las
células que van a ser bombardeadas se colocan a una distancia
apropiada por debajo de la placa de detención de los
microproyectiles. Si se desea, también se colocan una o más
pantallas entre el dispositivo de aceleración y las células que van
a ser bombardeadas. Mediante el uso de las técnicas expuestas en la
presente memoria es posible obtener 1.000 o más locus de células
que expresen transitoriamente un gen marcador. El número de células
de un foco que expresa el producto génico exógeno 48 horas después
del bombardeo habitualmente varía de una a diez, y una media de uno
a tres.
En la transformación por bombardeo, es posible
optimizar las condiciones de cultivo previas al bombardeo y los
parámetros del bombardeo para producir los números máximos de
transformantes estables. Los parámetros tanto físicos como
biológicos para el bombardeo son importantes en esta tecnología. Los
factores físicos son aquéllos que implican la manipulación del
precipitado de ADN/microproyectiles o aquéllos que afectan al vuelo
y a la velocidad de bien los macro- o
micro-proyectiles. Los factores biológicos incluyen
todas las etapas implicadas en la manipulación de las células antes
e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las
células diana para ayudar a calmar el traumatismo asociado con el
bombardeo y también la naturaleza del ADN transformante, tal como
ADN linealizado o plásmidos super-enrrollados
intactos. Se cree que las manipulaciones previas el bombardeo son
especialmente importantes para la correcta transformación de los
embriones inmaduros.
En otra realización alternativa, se pueden
transformar establemente plastos. Los procedimientos revelados para
la transformación de plastos en plantas superiores incluyen la
administración con una pistola de partículas de ADN que contiene un
marcador seleccionable y la dirección del ADN hacia el genoma del
plasto a través de recombinación de homólogos (Svab et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 87: 8526-8530
(1990); Svab y Maliga, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 90:
913-917 (1993); Staub y Maliga, EMBO J. 12:
601-606 (1993); patentes estadounidenses n.º
5.451.513 y 5.545.818).
Por consiguiente, se contempla que es posible
desear el ajuste de diversos aspectos de los parámetros de bombardeo
en estudios a pequeña escala para optimizar las condiciones por
completo. Puede que se desee en particular ajustar parámetros
físicos tales como la distancia entre huecos, la distancia de vuelo,
la distancia del tejido y la presión del helio. También es posible
minimizar los factores de reducción de los traumatismos modificando
las condiciones que influyen en el estado fisiológico de las células
receptoras y que pueden influir por tanto en la eficacia de
transformación y de integración. Por ejemplo, se pueden ajustar para
una transformación óptima el estado osmótico, la hidratación de los
tejidos y la etapa del subcultivo o el ciclo celular de las células
receptoras. La ejecución de otros ajustes rutinarios será conocida
por aquéllos expertos en la técnica a la luz de la presente
revelación.
La transferencia mediada por
Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para
introducir genes en células vegetales, porque se puede introducir
el ADN en tejidos de toda la planta, superando así la necesidad de
regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. El
uso de vectores de la integración en plantas mediada por
Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es
conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, los procedimientos
descritos por Fraley et al., BiolTechnology 3:
629-635 (1985) y Rogers et al., Methods
Enzymol. 153: 253-277 (1987). Además, la
integración del ADN de Ti es un procedimiento relativamente preciso
que da como resultado pocos reajustes. La región del ADN por ser
transferida está definida por las secuencias de los bordes, y el
ADN intermedio se inserta habitualmente en el genoma de la planta
según lo descrito (Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:
34 (1986)).
Los vectores modernos de transformación con
Agrobacterium son capaces de realizar la replicación en E.
coli, así como en Agrobacterium, permitiendo las
manipulaciones convenientes según lo descrito (Klee et al.,
en: "Plant DNA Infectious Agents", Hohn y Schell (eds.),
Springer-Verlag, Nueva York, pp.
179-203 (1985)). Además, los avances tecnológicos
en vectores para la transferencia de genes mediada por
Agrobacterium han mejorado la disposición de los genes y de
los sitios de restricción en los vectores para facilitar la
construcción de los vectores capaces de expresar diversos genes
codificantes de polipéptidos. Los vectores descritos tienen
regiones multi-ligadoras convenientes flanqueadas
por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión
directa de genes codificantes de polipéptidos insertados y son
adecuados para los presentes objetivos (Rogers et al., Methods
Enzynaol. 153: 253-277 (1987)). Además, se puede
usar Agrobacterium que contenga genes de Ti tanto armados
como desarmados para las transformaciones. En aquellas cepas
vegetales en las que la transformación mediada por
Agrobacterium sea eficaz, éste es el procedimiento de
elección debido a la naturaleza fácil y definida de la
transferencia génica.
Una planta transgénica formada usando
procedimientos de transformación con Agrobacterium contiene
comúnmente un solo gen sobre un cromosoma. Tales plantas
transgénicas se pueden denominar como heterocigóticas para el gen
añadido. Es más preferible una planta transgénica que sea
homocigótica para el gen estructural añadido; i.e., una planta
transgénica que contenga dos genes añadidos, un gen en el mismo
locus de cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener
una planta transgénica homocigótica mediante el apareamiento sexual
(la autofecundación) de un segregante independiente, una planta
transgénica que contenga un solo gen añadido, mediante la
germinación de alguna de las semillas producidas y el análisis de
las plantas resultantes producidas para el gen de interés.
Además, se entenderá que también se pueden
aparear dos plantas transgénicas diferentes para producir
descendencia que contenga dos genes exógenos segregantes
independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada
puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes
exógenos añadidos que codifican un polipéptido de interés. También
se contemplan el retrocruzamiento hacia una planta parental y el
cruzamiento lejano con una planta no transgénica, al igual que la
propagación vegetativa.
Es posible realizar la transformación de
plotoplastos vegetales usando los procedimientos basados en la
precipitación de fosfato de calcio, el tratamiento con
polietilenglicol, la electroporación y combinaciones de estos
tratamientos (véase, por ejemplo, Potrykus et al., Mol. Gen.
Genet. 205: 193-200 (1986); Lorz et al., Mol.
Gen. Genet. 199: 178 (1985); Fromm et al., Nature 319:
791 (1986); Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet. 204: 204
(1986); Marcotte et al., Nature 335: 454-457
(1988)).
La aplicación de estos sistemas a diferentes
cepas vegetales depende de la capacidad de regeneración de esa cepa
vegetal en particular a partir de protoplastos. Hay descritos
procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a
partir de protoplastos (Fujimura et al., Plant Tissue Culture
Letters 2: 74 (1985); Toriyama et al., Theor. Appl.
Genet. 205: 34 (1986); Yamada et al., Plant Cell Rep. 4:
85 (1986); Abdullah et al., Biotechnology 4: 1087
(1986)).
Para transformar cepas vegetales que no pueden
ser regeneradas satisfactoriamente a partir de protoplastos, se
pueden utilizar otros modos de introducir ADN en células o tejidos
intactos. Por ejemplo, se puede efectuar la regeneración de
cereales a partir de embriones inmaduros o explantos según lo
descrito (Vasil, Biotechnology 6: 397 (1988)). Además, se
puede utilizar una tecnología de "pistola de partículas" o de
microproyectiles a alta velocidad (Vasil et al.,
Bio/Technology 10: 667 (1992)).
Usando esta última tecnología, se transporta el
ADN a través de la pared celular y se introduce en el citoplasma
sobre la superficie de pequeñas partículas metálicas según lo
descrito (Klein et al., Nature 328. 70 (1987); Klein et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85:
8502-8505 (1988); McCabe et al.,
BiolTechnology 6: 923 (1988)). Las partículas metálicas
penetran a través de varias cepas de las células, permitiendo así
la transformación de las células en explantos de tejidos.
También se pueden usar otros procedimientos de
transformación celular e incluyen, pero no se limitan a, la
introducción de ADN en plantas mediante la transferencia directa de
ADN en el polen (Hess et al., Intern Rev. Cytol. 107: 367
(1987); Luo et al., Plant Mol Biol. Reporter 6: 165 (1988)),
mediante la inyección directa de ADN en los órganos reproductores
de una planta (Pena et al., Nature 325: 274 (1987)), o
mediante la inyección directa de ADN en células de embriones
inmaduros seguida por la rehidratación de embriones disecados
(Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987)).
La regeneración, el desarrollo y el cultivo de
plantas a partir de transformantes de un solo protoplasto vegetal o
a partir de diversos explantos transformados son conocidos en la
técnica (Weissbach y Weissbach, en: "Methods for Plant Molecular
Biology", Academic Press, San Diego, CA, (1988)). Este
procedimiento de regeneración y crecimiento incluye comúnmente las
etapas de selección de células transformadas, el cultivo de aquéllas
células individualizadas a través de las etapas habituales del
desarrollo embrionario en la etapa de plántula enraizada. Los
embriones y las semillas transgénicos son regenerados similarmente.
Los brotes enraizados transgénicos resultantes son después
plantados en un medio de crecimiento vegetal apropiado tal como
tierra.
El desarrollo o la regeneración de plantas que
contienen el gen foráneo exógeno que codifica una proteína de
interés son conocidos en la técnica. Preferiblemente, las plantas
regeneradas se auto-polinizan para proporcionar
plantas transgénicas homocigóticas. Aparte de eso, el polen obtenido
de las plantas regeneradas se cruza con plantas cultivadas a partir
de semillas de líneas importantes agronómicamente. Por el contrario,
el polen de las plantas de estas líneas importantes se usa para
polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la
invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva usando los
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
Hay una variedad de procedimientos para la
regeneración de plantas a partir de tejido vegetal. El procedimiento
particular de regeneración dependerá del tejido vegetal inicial y
de la especie vegetal en particular que se vaya a regenerar.
Se han publicado procedimientos para transformar
dicotiledóneas, fundamentalmente mediante el uso de Agrobacterium
tumefaciens y obtener plantas transgénicas para el algodón
(patente estadounidense n.º 5.004.863; patente estadounidense n.º
5.159.135; patente estadounidense n.º 5.518.908); la soja (patente
estadounidense n.º 5.569.834; patente estadounidense n.º 5.416.011;
McCabe et. al., Biotechnology 6: 923 (1988); Christou et
al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988));
Brassica (patente estadounidense n.º 5.463.174); el cacahuete
(Cheng et al., Plant Cell Rep. 15: 653-657
(1996), McKently et al., Plant Cell Rep. 14:
699-703 (1995)); la papaya; el guisante (Grant
et al., Plant Cell Rep. 15: 254-258 (1995));
y Arabidopsis thaliana (Bechtold et al., C. R. Acad. Sci.
Paris, Life Sci. 316: 1194-1199 (1993)). Este
último procedimiento para transformar Arabidopsis thaliana
se denomina comúnmente "inmersión" o infiltración al vacío, o
transformación germoplasmática.
También se ha descrito la transformación de
monocotiledóneas mediante el uso de electroporación, bombardeo de
partículas y Agrobacterium. La transformación y la
regeneración vegetal se han realizado en el espárrago (Bytebier
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 84: 5354 (1987)); la
cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol 104: 37 (1994)); el maíz
(Rhodes et al., Science 240: 204 (1988);
Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:
603-618 (1990); Fromm et al., Bio/Technology
8: 833 (1990); Koziel et al., Bio/Technology 11: 194 (1993);
Armstrong et al., Crop Science 35: 550-557
(1995)); la avena (Somers et al., Bio/Technology 10: 1589
(1992)); la pata de gallina (Horn et al., Plant Cell Rep. 7:
469 (1988)); el arroz (Toriyama et al., Theor Appl. Genet.
205:34 (1986); Part et al., Plant Mol. Biol. 32:
1135-1148 (1996); Abedinia et al., Aust. J.
Plant Physiol. 24: 133-141 (1997); Zhang y Wu,
Theor. Appl. Genet. 76: 835 (1988); Zhang et al., Plant
Cell Rep. 7: 379 (1988); Battraw y Hall, Plant Sci. 86:
191-202 (1992); Christou et al.,
Bio/Technology 9: 957 (1991)); el centeno (De la Pena et al.,
Nature 325: 274 (1987)); la caña de azúcar (Bower y Birch,
Plant J. 2: 409 (1992)); la festuca alta (Wang et al.,
Bio/Technology 10: 691 (1992)) y el trigo (Vasil et al.,
BiolTechnology 10: 667 (1992); patente estadounidense n.º
5.631.152).
Se han desarrollado análisis para la expresión
génica basados en la expresión transitoria de constructos de ácido
nucleico clonados mediante la introducción de moléculas de ácido
nucleico en células vegetales mediante el tratamiento con
polietilenglicol, la electroporación o el bombardeo de partículas
(Marcotte et al., Nature 335: 454-457
(1988); Marcotte et al., Plant Cell 1:
523-532 (1989); McCarty et al., Cell 66:
895-905 (1991); Hattori et al., Genes Dev.
6: 609-618 (1992); Goff et al., EMBO J.
9:2517-25222 (1990)). Se pueden usar sistemas de
expresión transitoria para diseccionar funcionalmente constructos
génicos (véase, en general, Mailga et al., "Methods in
Plant Molecular Biology", Cold Spring Harbor Press (1995)).
Se puede introducir cualquiera de las moléculas
de ácido nucleico de la invención en una célula vegetal de una
manera permanente o transitoria, en combinación con otros elementos
genéticos tales como vectores, promotores, potenciadores, etc.
Además, se puede introducir cualquiera de las moléculas de ácido
nucleico de la invención en una célula vegetal de una manera que
permita la expresión o la sobre-expresión de la
proteína o del fragmento de la misma codificada por la molécula de
ácido nucleico.
La co-supresión es la reducción
de los niveles de expresión, habitualmente a nivel del ARN, de un
determinado gen endógeno o una familia de genes mediante la
expresión de un constructo sentido homólogo que sea capaz de
transcribir ARNm del mismo encadenamiento como el transcripto del
gen endógeno (Napoli et al., Plant Cell 2:
279-289 (1990); van der Krol et al., Plant
Cell 2: 291-299 (1990)). La
co-supresión puede resultar de la transformación
estable con una sola molécula de ácido nucleico de copia que sea
homóloga a la secuencia de ácido nucleico encontrada con la célula
(Prolls y Meyer, Plant J. 2: 465-475 (1992))
o con múltiples copias de una molécula de ácido nucleico que sea
homóloga a una secuencia de ácido nucleico encontrada con la célula
(Mittlesten et al., Mol. Gen. Genet. 244:
325-330 (1994)). Los genes, incluso los diferentes,
unidos a promotores homólogos pueden dar como resultado la
cosupresión de los genes ligados (Vaucheret, C. R. Acad. Sci.
III 316: 1471-1483 (1993); Flavell, Proc.
Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 91: 3490-3496 (1994));
van Blokland et al., Plant J. 6: 861-877
(1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8:
340-344 (1990); Meins y Kunz, en: "Gene
Inactivation and Homologous Recombination in Plants", Paszkowski
(ed.), pp. 335-348, Kluwer Academic, Países Bajos
(1994)).
Se entiende que es posible introducir uno o más
de los ácidos nucleicos de la invención en una célula vegetal y
transcribirlos usando un promotor apropiado con tal transcripción
dando como resultado la cosupresión de una proteína endógena.
Los enfoques antisentido son un modo de evitar o
reducir la función génica dirigiéndose al material genético (Mol
et al., FEBS Lett. 268: 427-430 (1990)). El
objetivo del enfoque antisentido consiste en usar una secuencia
complementaria al gen diana para bloquear su expresión y crear una
línea celular o un organismo mutante en el que se reduzca o se
inhiba selectivamente el nivel de una sola proteína seleccionada.
Las técnicas antisentido tienen varias ventajas frente a otros
enfoques "genéticos inversos". El sitio de la desactivación y
su efecto en el desarrollo se pueden manipular mediante la elección
del promotor para los genes antisentido o mediante el cronometraje
de la aplicación externa o de la microinyección. El antisentido
puede manipular su especificidad seleccionando bien regiones únicas
del gen diana o regiones en las que comparta homología con otros
genes relacionados (Hiatt et al., en: Genetic Engineering,
Setlow (ed.), Vol. 11, Nueva York: Plenum 49-63
(1989)).
Las técnicas de ARN antisentido implican la
introducción de ARN que sea complementario al ARNm diana en las
células, lo que resulta en dúplex de ARN:ARN específicos formados
mediante el apareamiento de bases entre el sustrato antisentido y
el ARNm diana (Green et al., Annu. Rev. Biochem. 55:
569-597 (1986)). En una realización, el
procedimiento implica la introducción y la expresión de una
secuencia génica antisentido. Tal secuencia es una en la que parte
de o todas las secuencias génicas normales están colocadas bajo un
promotor en sentido opuesto, tal que la cadena "errónea" o
complementaria se transcriba en un ARN antisentido no codificante
que se hibrida con el ARNm diana e interfiere en su expresión
(Takayama e Inouye, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25:
155-184 (1990)). Los vectores antisentido se
construyen mediante procedimientos estándar y se introducen en
células mediante transformación, transfección, electroporación,
microinyección, infección, etc. El tipo de transformación y la
elección del vector determinarán si la expresión es transitoria o
estable. El promotor usado para el gen antisentido puede influir en
el nivel, la duración, el tejido, la especificidad o la
inductibilidad de la inhibición antisentido.
Se entiende que la actividad de una proteína en
una célula vegetal puede ser reducida o bajada mediante el cultivo
de una célula vegetal transformada que contenga una molécula de
ácido nucleico cuya cadena no transcrita codifique una proteína o
un fragmento de la misma.
El silenciamiento génico
post-transcripcional (PTGS) puede resultar en una
inmunidad vírica o un silenciamiento génico en las plantas. El PTGS
es inducido por ARNbc y es mediado por una ARN polimerasa
dependiente del ARN, presente en el citoplasma, que requiere un
molde de ARNbc. El ARNbc se forma mediante la hibridación de varios
ARNm transgénicos complementarios o regiones complementarias del
mismo transcripto. La formación de los dúplex se puede realizar
usando transcriptos de un gen sentido y un gen antisentido colocados
en el genoma de la planta, un solo transcripto que tenga
auto-complementariedad, o transcriptos sentido y
antisentido de genes unidos mediante cruzamiento. La ARN polimerasa
dependiente de ARNbc forma una cadena complementaria a partir del
ARNm transgénico, y las moléculas de RNasa se unen a esta cadena
complementaria (ARNc). Estas moléculas de
ARNc-RNasa se hibridan con el ARNm endógeno y
escinden el ARN monocatenario adyacente al híbrido. Se siguen
degradando los ARN monocatenarios escindidos mediante otras RNasas
huésped, porque uno carecerá de un extremo 5' con casquete y el
otro carecerá de la cola poli(A) (Waterhouse et al.,
PNAS 95: 13959- 13964 (1998)).
Se entiende que es posible introducir uno o más
de los ácidos nucleicos de la invención en una célula vegetal y
transcribirlos usando un promotor apropiado con tal transcripción
dando como resultado el silenciamiento génico
post-traduccional de un transcripto endógeno.
Se han expresado anticuerpos en plantas (Hiatt
et al., Nature 342: 76-78 (1989); Conrad y
Fielder, Plant Mol. Biol. 26: 1023-1030
(1994)). Se ha informado que la expresión citoplasmática de un Fvmc
(anticuerpo Fv monocatenario) retrasa la infección por el virus del
rizado moteado de la alcachofa. Las plantas transgénicas que
expresan anticuerpos dirigidos frente a proteínas endógenas pueden
presentar un efecto fisiológico (Philips et al., EMBO J. 16:
4489-4496 (1997); Marion-Poll,
"Trends in Plant Science" 2: 447-448 (1997)).
Por ejemplo, se ha informado que los anticuerpos
anti-abscísicos expresados dan como resultado una
perturbación general del desarrollo de la semilla (Philips et
al., EMBO J. 16: 4489-4496 (1997)).
Los anticuerpos que son catalíticos también
pueden ser expresados en plantas (abzimas). El principio que hay
tras las abzimas es que como los anticuerpos pueden crecer frente a
muchas moléculas, se puede dirigir esta capacidad de reconocimiento
hacia la generación de anticuerpos que unan estados de transición
para forzar el avance una reacción química (Persidas, Nature
Biotechnology 15: 1313-1315 (1997); Baca et
al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:
461-493 (1997)). Las capacidades catalíticas de las
abzimas se pueden aumentar mediante mutagénesis de sitio dirigida.
Los ejemplos de abzimas se exponen, por ejemplo, en la patente
estadounidense n.º 5.658.753; la patente estadounidense n.º:
5.632.990; la patente estadounidense n.º: 5.631.137; la patente
estadounidense n.º 5.602.015; la patente estadounidense n.º
5.559.538; la patente estadounidense n.º 5.576.174; la patente
estadounidense n.º 5.500.358; la patente estadounidense n.º
5.318.897; la patente estadounidense n.º: 5.298.409; patente
estadounidense n.º: 5.258.289 y la patente estadounidense n.º:
5.194.585.
Se entiende que es posible expresar cualquiera
de los anticuerpos de la invención en plantas y que tal expresión
puede dar como resultado un efecto fisiológico. También se entiende
que cualquiera de los anticuerpos expresados puede ser
catalítico.
Las modificaciones de los fenotipos vegetales de
la presente invención pueden ser relativas a una planta que tenga
un contexto genético similar que carezca del ácido nucleico
introducido de interés. En un aspecto preferido, un contexto
genético similar es un contexto en el que los organismos que están
siendo comparados comparten el 50% o más de su material genético
nuclear. En un aspecto más preferido, un contexto genético similar
es un contexto en el que los organismos que están siendo comparados
comparten el 75% o más, incluso, más preferiblemente, el 90% o más
de su material genético nuclear. En otro aspecto incluso más
preferido, un contexto genético similar es un contexto en el que
los organismos que están siendo comparados son plantas, y las
plantas son isogénicas excepto para cualquier material genético
introducido originariamente usando técnicas de transformación
de
plantas.
plantas.
La presente invención también proporciona partes
de las plantas, particularmente, partes reproductoras o de
almacenamiento, de la presente invención. Las partes de las plantas
incluyen sin limitación semilla, endoesperma, óvulo y polen. En una
realización particularmente preferida de la presente invención, la
parte de la planta es una semilla. En una realización, la semilla
es un constituyente de alimento para animales.
En otra realización, la parte de la planta es un
fruto, más preferiblemente, un fruto con una estabilidad de
almacenamiento mejorada. En otra realización preferida, el fruto
tiene mayores niveles de un tocoferol.
La presente invención también proporciona un
recipiente de más de 10.000, más preferiblemente, 20.000, e incluso
más preferiblemente de 40.000 semillas en las que más del 10%, más
preferiblemente, del 25%, más preferiblemente, del 50% e incluso
más preferiblemente, del 75% o del 90% de las semillas son semillas
derivadas de una planta de la presente invención.
La presente invención también proporciona un
recipiente de más de 10 kg, más preferiblemente, de 25 kg, e
incluso más preferiblemente de 50 kg de semillas en las que más del
10%, más preferiblemente, del 25%, más preferiblemente, del 50% e
incluso más preferiblemente, del 75% o del 90% de las semillas son
semillas derivadas de una planta de la presente invención.
Cualquiera de las plantas o de las partes de las
mismas de la presente invención puede ser procesada para producir
una preparación alimentaria, de harina, proteica u oleaginosa. Una
parte de planta particularmente preferida a tal efecto es una
semilla. En una realización preferida, la preparación alimentaria,
de harina, proteica u oleaginosa está diseñada para animales
rumiantes. Los procedimientos para producir preparaciones
alimentarias, de harina, proteicas u oleaginosas son conocidos en la
técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º
4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669 y
6.156.227. En una realización preferida, la preparación proteica es
una preparación con un alto contenido en proteínas. Tal preparación
con alto contenido en proteínas tiene preferiblemente un contenido
de proteínas mayor del 5% p/v, más preferiblemente, del 10% p/v e
incluso más preferiblemente, del 15% p/v. En una preparación
oleaginosa preferida, la preparación oleaginosa es una preparación
con alto contenido en aceite derivado de una planta o de una parte
de la misma de la presente invención de más del 5% p/v, más
preferiblemente, del 10% p/v e incluso más preferiblemente, del 15%
p/v. En una realización preferida, la preparación oleaginosa es un
líquido y de un volumen mayor de 1, 5, 10 ó 50 litros. La presente
invención también proporciona aceite producido a partir de plantas
de la presente invención o generado mediante un procedimiento de la
presente invención. Tal aceite puede ser un componente minoritario
o mayoritario de cualquier producto resultante. Además, tal aceite
puede ser mezclado con otros aceites. En una realización preferida,
el aceite producido a partir de plantas de la presente invención o
generado mediante un procedimiento de la presente invención
constituye más del 0,5%, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% o 90% en
volumen o peso del componente oleaginoso de cualquier producto. En
otra realización, se puede mezclar la preparación oleaginosa y puede
constituir más del 10%, 25%, 35%, 50% o 75% de la mezcla en
volumen. El aceite producido a partir de una planta de la presente
invención se puede mezclar con uno o más disolventes orgánicos o
destilados del petróleo.
Las plantas de la presente invención pueden ser
parte de o ser generadas a partir de un programa de mejora
genética. La elección del procedimiento de mejora depende del modo
de reproducción de la planta, de la heredabilidad del carácter o de
los caracteres que se estén mejorando y del tipo de cultivar usado
comercialmente (p. ej., cultivar de híbrido F_{1}, cultivar de
purelina, etc). A continuación, se exponen los enfoques no
restrictivos seleccionados para la mejora genética de las plantas
de la presente invención. Se puede perfeccionar un programa de
mejora usando una selección con marcadores de la progenie de
cualquier cruzamiento. Se entiende además que se puede utilizar
cualquier cultivar comercial o no comercial en un programa de mejora
genética. Factores tales como, por ejemplo, el vigor de los brotes,
el vigor vegetativo, la tolerancia al estrés, la resistencia a
enfermedades, la ramificación, la floración, la colección de
semillas, el tamaño de la semilla, la densidad de las semillas, la
capacidad de permanencia y la capacidad de trillado, etc., serán los
que rijan en general la elección.
Para caracteres altamente hereditarios, la
elección de plantas individuales superiores evaluadas en una sola
ubicación será eficaz, mientras que para caracteres con baja
heredabilidad, la selección debería estar basada en valores medios
obtenidos a partir de evaluaciones por duplicado de familias de
plantas relacionadas. Los procedimientos de selección comunes
incluyen la selección genealógica, la selección genealógica
modificada, la selección de la masa y la selección recurrente. En
una realización preferida, se lleva a cabo un retrocruzamiento o
programa de mejora genética recurrente.
La complejidad de la herencia influye en la
elección del procedimiento de mejora genética. La mejora por
retrocruzamiento se puede usar para transferir uno o unos cuantos
genes favorables para un carácter altamente hereditario en un
cultivar deseable. Este enfoque se ha usado ampliamente para la
selección de cultivares resistentes a enfermedades. Se usan
diversas técnicas de selección recurrente para mejorar los
caracteres heredados cuantitativamente controlados por numerosos
genes. El uso de la selección recurrente en cultivos
auto-polinizantes depende de la facilidad de la
polinización, de la frecuencia de los híbridos satisfactorios
procedentes de cada polinización y del número de descendientes
híbridos de cada cruce satisfactorio.
Las líneas de selección se pueden analizar y
comparar con patrones apropiados en entornos representativos de la
zona o las zonas diana comerciales para dos o más generaciones. Las
mejores líneas son candidatos para nuevos cultivares comerciales;
aquéllas todavía deficientes en caracteres se pueden usar como
padres para producir nuevas poblaciones para una selección
posterior.
Un procedimiento para identificar una planta
superior consiste en observar su rendimiento en comparación con
otras plantas experimentales y con un cultivar estándar extensamente
cultivado. Si hay una sola observación que no es concluyente, las
observaciones por duplicado pueden proporcionar una mejor estimación
de su valor genético. Un cultivador puede seleccionar y cruzar dos
o más líneas parentales, siguiendo con la autofecundación y la
selección repetidas, produciendo muchas nuevas combinaciones
genéticas.
El desarrollo de nuevos cultivares requiere el
desarrollo y la selección de variedades, el cruzamiento de estas
variedades y la selección de cruces híbridos superiores. La semilla
híbrida se puede producir mediante cruces manuales entre padres
fértiles varones seleccionados o usando sistemas de esterilidad de
varones. Los híbridos se seleccionan para ciertos caracteres de un
solo gen tales como el color de la vaina, el color de la flor, el
rendimiento de las semillas, el color de las pubescencias o la
resistencia a herbicidas, que indican que la semilla es
verdaderamente un híbrido. Hay más datos sobre las líneas
parentales, así como el fenotipo del híbrido, que influyen en la
decisión del cultivador sobre si continuar con el cruzamiento de un
híbrido específico.
Los procedimientos de selección genealógica y de
mejora por selección recurrente se pueden usar para desarrollar
cultivares a partir de las poblaciones de mejora genética. Los
programas de mejora combinan los caracteres deseables de dos o más
cultivares o varias fuentes de características comunes en mezclas de
selección a partir de las cuales se desarrollan los cultivares
mediante la autofecundación y la selección de fenotipos deseados.
Se pueden evaluar nuevos cultivares para determinar cuál tiene
potencial comercial.
Los sistemas de selección genealógica se usan
comúnmente para la mejora de cultivos
auto-polinizantes. Dos padres que poseen caracteres
favorables complementarios se cruzan para producir un F_{1}. Se
produce una población de F_{2} mediante la autofecundación de uno
o más F_{1}. Se lleva a cabo la selección de los mejores
individuos de las mejores familias. El análisis por duplicado de las
familias puede comenzar en la generación F_{4} para mejorar la
eficacia de la selección de los caracteres con una baja
heredabilidad. En una etapa avanzada de la autopolinización (i.e.,
F_{6} y F_{7}), se analizan las mejores líneas o mezclas de
líneas fenotípicamente similares para una posible liberación como
nuevos cultivares.
La mejora por retrocruzamiento se ha usado para
transferir genes para un carácter altamente heredable heredado
simplemente a una línea consanguínea o un cultivar homocigótico
deseable, que es el padre recurrente. El origen del carácter por
ser transferido se denomina padre donante. Se espera que la planta
resultante tenga los atributos del padre recurrente (p. ej., el
cultivar) y el carácter deseable transferido del padre donante. Tras
el cruce inicial, se seleccionan los individuos que poseen el
fenotipo del padre donante y se cruzan repetidamente (retrocruzan)
con el padre recurrente. Se espera que el padre resultante tenga los
atributos del padre recurrente (p. ej., el cultivar) y el carácter
deseable transferido del padre donante.
El procedimiento de descendencia de una sola
semilla se refiere en sentido estricto a la plantación de una
población segregante, la cosecha de una muestra de una semilla por
planta y el uso de la muestra de una sola semilla para plantar la
siguiente generación. Cuando la población se ha producido a partir
de F_{2} hasta el nivel deseado de autopolinización, las plantas
de cuyas líneas son derivadas seguirán cada una hasta individuos
F_{2} diferentes. El número de plantas de una población disminuye
cada generación debido a que algunas semillas no germinan o que
algunas plantas no producen al menos una semilla. Por consiguiente,
no todas las plantas F_{2} muestreadas originariamente en la
población estarán representadas por una progenie una vez completado
el avance de la
generación.
generación.
En un procedimiento de múltiples semillas, los
cultivadores comúnmente cosechan una o más vainas de cada planta de
una población y las trillan conjuntamente para agruparlas. Parte del
grupo se usa para plantar la siguiente generación y la otra parte
se reserva. El procedimiento ha sido denominado técnica de
descendencia de una sola semilla modificada o de agrupamiento de
vainas.
El procedimiento de múltiples semillas se ha
usado para ahorrar mano de obra en la cosecha. Es considerablemente
más rápido trillar vainas con una máquina que retirar una semilla de
cada una a mano para el procedimiento de una sola semilla. El
procedimiento de múltiples semillas también permite plantar el mismo
número de semillas de una población de cada generación de la
autopolinización.
Se pueden encontrar descripciones de otros
procedimientos de mejora genética que son comúnmente usados para
diferentes caracteres y cultivos en uno de varios libros de
referencia (e. g. Fehr, "Principles of Cultivar Development"
Vol. 1, pp. 2-3 (1987))).
También es posible reproducir una planta
transgénica de la presente invención usando la apomixis. La apomoxis
es un procedimiento controlado genéticamente de reproducción en
plantas en el que el embrión se forma sin la unión de un huevo y un
esperma. Hay tres tipos básicos de reproducción apomíctica: 1) la
aposporia, en la que el embrión se desarrolla a partir de un huevo
no reducido cromosómicamente en un saco embrionario derivado del
núcleo, 2) diplosporia, en la que el embrión se desarrolla a partir
de un huevo sin reducir en un saco embrionario derivado de la
célula madre de la macrospora y 3) embrionía adventicia, en la que
el embrión se desarrolla directamente a partir de una célula
somática. En la mayoría de las formas de apomixis, es necesaria la
pseudogamia o la fertilización de los núcleos polares para producir
endoesperma para conseguir una viabilidad de las semillas. En la
aposporia, se puede usar un cultivar de cría como fuente de polen
para la formación de endoesperma en las semillas. El cultivar de
cría no afecta a la genética del cultivar apomíctico aposporios,
pues el huevo sin reducir del cultivar se desarrolla
partenogenéticamente, pero hace posible la producción de
endoesperma. La apomixis es importante económicamente, especialmente
en plantas transgénicas, porque provoca la verdadera mejora de
cualquier genotipo, independientemente de lo heterocigótico que sea.
De este modo, con la reproducción apomíctica, las plantas
transgénicas heterocigóticas pueden mantener su fidelidad genética
a lo largo de ciclos de vida repetidos. Los procedimientos para
producir plantas apomícticas son conocidos en la técnica. Véase la
patente estadounidense n.º 5.811.636.
Es posible introducir un ácido nucleico de la
presente invención en cualquier célula u organismo tal como una
célula de mamífero, un mamífero, una célula de pez, un pez, una
célula de ave, un ave, una célula de alga, un alga, una célula de
hongo, un hongo o una célula bacteriana. Una proteína de la presente
invención se puede producir en una célula o en un organismo
apropiado. El huésped y los transformantes preferidos incluyen:
células micóticas, telas como Aspergillus, levaduras,
mamíferos, particularmente, bovino y porcino, insectos, bacterias y
algas. En la técnica, se conocen procedimientos para transformar
tales células u organismos (EP 0 238 023; Yelton et al.,
Proc.Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 81: 1470-1474
(1984); Malardier et al., Gene, 78: 147-156
(1989); Becker y Guarente, en: Abelson y Simon (eds.), "Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology", Method Enzymol.,
Vol. 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nueva
York; Ito et al., J. Bacteriology, 153: 163 (1983) Hinnen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 75: 1920 (1978);
Bennett y LaSure (eds.), "More Gene Manipulations in fungi",
Academic Press, CA (1991)). También se conocen procedimientos para
producir proteínas de la presente invención (Kudla et al.,
EMBO, 9: 1355-1364 (1990); Jarai y Buxton,
Current Genetics, 26: 2238-2244 (1994);
Verdier, Yeast, 6: 271-297 (1990; MacKenzie
et al., Journal of Gen. Microbiol., 139:
2295-2307 (1993); Hartl et al., TIBS, 19:
20-25 (1994); Bergenron et al., TIBS, 19:
124-128 (1994); Demolder et al., J.
Biotechnology, 32: 179-189 (1994); Craig,
Science, 260: 1902-1903 (1993); Gething y
Sambrook, Nature, 355: 33-45 (1992); Puig y
Gilbert, J. Biol. Chem., 269: 7764-7771
(1994); Wang y Tsou, FASEB Journal, 7:
1515-1517 (1993); Robinson et al.,
Bio/Technology, 1: 381-384 (1994); Enderlin
y Ogrydziak, Yeast, 10: 67-79 (1994); Fuller
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 86:
1434-1438 (1989); Julius et al., Cell, 37:
1075-1089 (1984); Julius et al., Cell 32:
839-852 (1983).
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una célula o un organismo proporciona en esa célula o
ese organismo, en relación con una célula o un organismo con un
contexto genético similar, un mayor nivel de tocotrienoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una célula o un organismo proporciona en esa célula o
ese organismo, en relación con una célula o un organismo con un
contexto genético similar, un mayor nivel de tocoferoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una célula o un organismo proporciona en esa célula o
ese organismo, en relación con una célula o un organismo con un
contexto genético similar, un mayor nivel de
\alpha-tocoferoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una célula o un organismo proporciona en esa célula o
ese organismo, en relación con una célula o un organismo con un
contexto genético similar, un mayor nivel de
\gamma-tocoferoles.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una célula o un organismo proporciona en esa célula o
ese organismo, en relación con una célula o un organismo con un
contexto genético similar, un mayor nivel de ácido
homogentísico.
En una realización preferida, la
sobre-expresión de una proteína de la presente
invención en una célula o un organismo proporciona en esa célula o
ese organismo, en relación con una célula o un organismo con un
contexto genético similar, un mayor nivel de plastoquinoles o
plastoquinonas.
Un aspecto de la invención se refiere a
anticuerpos, moléculas de unión antigénica monocatenarias, u otras
proteínas, que se unen específicamente a una o más de las moléculas
proteicas o peptídicas de la invención. En una realización, el
anticuerpo se une específicamente a una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID N.º 2 y 4. En otra
realización, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de
fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la
secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID N.º 2 y 4. En otra
realización, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de
fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID N.º 2 y 4. Los
anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar
cuantitativa o cualitativamente las moléculas proteicas o
peptídicas de la invención, o para detectar las modificaciones
post-traduccionales de las proteínas. Como se usa
en la presente memoria, se dice que un anticuerpo o un péptido "se
une específicamente" a una molécula proteica o peptídica de la
invención si tal unión no es inhibida competitivamente por la
presencia de moléculas no relacionadas.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
toda o parte de la proteína de la invención se pueden expresar,
mediante procedimientos recombinantes, para producir la proteína o
los péptidos que puedan a su vez ser usados para provocar que los
anticuerpos sean capaces de unirse a la proteína o el péptido
expresado. Tales anticuerpos se pueden usar en inmunoanálisis para
esa proteína. Tales moléculas codificante de proteínas, o sus
fragmentos, pueden ser una molécula "de fusión" (i.e., una
parte de una molécula de ácido nucleico mayor), tal que, tras la
expresión, se produzca una proteína de fusión. Se entiende que
cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la invención puede
ser expresada, mediante procedimientos recombinantes, para generar
proteínas o péptidos codificados por estas moléculas de ácido
nucleico.
Los anticuerpos que se unen específicamente a
proteínas y a fragmentos de proteínas de la invención pueden ser
policlonales o monoclonales, y pueden comprender inmunoglobulinas
intactas o partes de unión antigénica de fragmentos de
inmunoglobulinas (tales como F(ab'), F(ab')_{2}, o
inmunoglobulinas monocatenarias producibles, por ejemplo, mediante
procedimientos recombinantes. Se entiende que los profesionales
están familiarizados con los materiales de información estándar que
describen condiciones específicas y procedimientos para la
construcción, la manipulación y el aislamiento de anticuerpos
(véase, por ejemplo, Harlow y Lane, en: "Antibodies: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York
(1988)).
Según lo tratado más adelante, tales moléculas
de anticuerpo o sus fragmentos se pueden usar a efectos de
diagnóstico. Cuando se pretenden emplear los anticuerpos a efectos
de diagnóstico, puede ser deseable derivarlos, por ejemplo, con un
grupo ligando (tal como biotina) o un grupo marcador detectable (tal
como un grupo fluorescente, un radioisótopo o una enzima).
La capacidad para producir anticuerpos que se
unan a moléculas proteicas o peptídicas de la invención permite la
identificación de compuestos miméticos derivados de aquellas
moléculas. Estos compuestos miméticos pueden contener un fragmento
de la proteína o del péptido, o simplemente, una región
estructuralmente similar, presentando, no obstante, una capacidad
para unirse específicamente a anticuerpos dirigidos frente a ese
compuesto.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
se pueden emplear para obtener otras moléculas de ácido nucleico de
la misma especie (las moléculas de ácido nucleico del maíz se pueden
utilizar para obtener otras moléculas de ácido nucleico del maíz).
Tales moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido
nucleico que codifican la secuencia codificante completa de una
proteína y promotores y secuencias flanqueantes de tales moléculas.
Además, tales moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de
ácido nucleico que codifican otras isozimas o miembros de la
familia de genes. Tales moléculas se pueden obtener fácilmente
usando las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas o
fragmentos de las mismas para rastrear ADNc o genotecas genómicas.
Los procedimientos para formar tales genotecas son conocidos en la
técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
también se pueden emplear para obtener homólogos de ácido nucleico.
Tales homólogos incluyen las moléculas de ácido nucleico de plantas
y otros organismos, incluyendo bacterias y hongos, incluyendo
moléculas de ácido nucleico que codifiquen, totalmente o en parte,
homólogos proteicos de otras especies vegetales o de otros
organismos, secuencias de elementos genéticos, tales como
promotores y elementos reguladores transcripcionales. Tales
moléculas se pueden obtener fácilmente usando las moléculas de
ácido nucleico anteriormente descritas o fragmentos de las mismas
para rastrear ADNc o genotecas genómicas obtenidas de tales
especies vegetales. Los procedimientos para formar tales genotecas
son conocidos en la técnica. Tales moléculas homólogas pueden
diferir en sus secuencias de nucleótidos de aquéllas encontradas en
una o más de las SEC ID N.º 1 y 3, y los complementos de las mismas,
porque no es necesaria una complementariedad total para lograr una
hibridación estable.
Se puede usar cualquiera de una variedad de
procedimientos para obtener una o más de las moléculas de ácido
nucleico anteriormente descritas (Zamechik et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (EE.UU.) 83: 4143-4146 (1986);
Goodchild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85:
5507-5511 (1988); Wickstrom et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 1028-1032 (1988); Holt
et al., Molec. Cell. Biol. 8: 963-973 (1988);
Gerwirtz et al., Science 242: 1303-1306
(1988); Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 86:
3379-3383 (1989); Becker et al., EMBO J. 8:
3685-3691 (1989)). Se pueden emplear a tal efecto
sintetizadores de ácidos nucleicos automatizados. En lugar de tal
síntesis, se pueden usar las moléculas de ácido nucleico reveladas
para definir un par de cebadores que se puedan usar con la reacción
en cadena de la polimerasa (Mullis et al., Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich
et al., Patente europea 50.424; Patente europea 84.796;
Patente europea n.º 258.017; Patente europea n.º 237.362; Mullis,
Patente europea n.º 201.184; Mullis et al., patente
estadounidense n.º 4.683.202; Erlich, patente estadounidense n.º
4.582.788; y Saiki et al., patente estadounidense n.º
4.683.194) para amplificar y obtener cualquier molécula de ácido
nucleico o fragmento deseados.
También se pueden obtener secuencias promotoras
y otros elementos genéticos, incluyendo, pero no limitándose a,
secuencias flanqueantes reguladoras transcripcionales, asociadas con
una o más de las secuencias de ácidos nucleico reveladas usando la
secuencia de ácido nucleico revelada proporcionada en la presente
memoria. En una realización, tales secuencias se obtienen incubando
moléculas de ácido nucleico de la presente invención con miembros
de genotecas genómicas y recuperando los clones que se hibriden a
tales moléculas de ácido nucleico de las mismas. En una segunda
realización, se pueden usar procedimientos de "paseo
cromosómico" o PCR inversa para obtener tales secuencias
(Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85:
8998-9002 (1988); Ohara et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (EE.UU.) 86: 5673-5677 (1989); Pang
et al., Biotechniques 22: 1046-1048 (1977);
Huang et al., Methods Mol. Biol. 69: 89-96
(1997); Huang et al., Method Mol. Biol.
67:287-294 (1997); Benkel et al., Genet.
Anal. 13: 123-127 (1996); Hartl et al.,
Methods Mol. Biol. 58: 293-301 (1996)). El
término "paseo cromosómico" significa un procedimiento de
ampliación de un mapa genético mediante sucesivas etapas de
hibridación.
Se pueden usar las moléculas de ácido nucleico
de la invención para aislar promotores de perfiles de expresión
celulares mejorados, de una célula específica, titulares mejorados,
de un tejido específico, evolutivamente o medioambientalmente
regulados. El aislamiento y el análisis funcional de las secuencias
promotoras flanqueantes en 5' de estos genes procedentes de
genotecas genómicas, por ejemplo, usando procedimientos de detección
genómica y técnicas de PCR darían como resultado en el aislamiento
de promotores útiles y elementos reguladores transcripcionales.
Estos procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica y
han sido descritos (véase, por ejemplo, Birren et al.,
"Genome Analysis: Analyzing DNA", 1, (1997), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Los promotores
obtenidos utilizando las moléculas de ácido nucleico de la invención
también podrían ser modificados para afectar a sus características
de control. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen, pero no
se limitan a, secuencias potenciadoras. Tales elementos genéticos
podrían ser usados para aumentar la expresión génica de caracteres
nuevos y existentes para una mejora de cosechas.
Otro subconjunto de moléculas de ácido nucleico
de la invención incluye moléculas de ácido nucleico que son
marcadores. Los marcadores se pueden usar en un número de modos
convencionales en el campo de la genética molecular. Tales
marcadores incluyen moléculas de ácido nucleico de SEC ID N.º 1 y 3,
complementos de las mismas, y fragmentos de cualquiera que pueda
actuar como marcadores y otras moléculas de ácido nucleico de la
presente invención que pueden actuar como marcadores.
Los marcadores genéticos de la invención
incluyen marcadores "dominantes" o "codominantes". Los
"marcadores codominantes" revelan la presencia de dos o más
alelos (dos por individuo diploide) en un locus. Los "marcadores
dominantes" sólo revelan la presencia de un solo alelo por locus.
La presencia del fenotipo del marcador dominante (p.ej., una banda
de ADN) es una señal de que un alelo está en una condición bien
homocigótica o heterocigótica. La ausencia del fenotipo del
marcador dominante (p.ej., la ausencia de una banda de ADN)
simplemente es la prueba de que hay "algún otro" alelo
indefinido presente. En el caso de las poblaciones en las que los
individuos son predominantemente homocigóticos y los locus son
predominantemente dimórficos, los marcadores dominantes y
codominantes pueden ser igualmente valiosos. A medida que las
poblaciones se vuelven más heterocigóticas y
multi-alélicas, los marcadores codominantes se
suelen volver más informativos del genotipo que los marcadores
dominantes. Las moléculas de marcadores pueden ser, por ejemplo,
capaces de detectar polimorfismos tales como polimorfismos de un
solo nucleótido (SNP).
Los genomas de los animales y las plantas se
someten de manera natural a una mutación espontánea en el transcurso
de su continua evolución (Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55:
831-854 (1986)). Un "polimorfismo" es una
variación o una diferencia en la secuencia del gen o de sus
regiones flanqueantes que surge en alguno de los miembros de la
especie. La secuencia divergente y la secuencia "original"
coexisten en la población de la especie. En algunos casos, tal
coexistencia está en equilibrio estable o
casi-estable.
Por lo tanto, se dice que un polimorfismo es
"alélico" cuando, debido a la existencia del polimorfismo,
algunos miembros de una población pueden tener la secuencia
original (i.e., el "alelo" original), mientras que otros
miembros pueden tener la secuencia divergente (i.e., el "alelo"
divergente). En el caso más simple, sólo puede existir una
secuencia divergente y se dice, por tanto, que el polimorfismo es
di-alélico. En otros casos, la población de la
especie puede contener múltiples alelos y el polimorfismo se
denomina tri-alélico, etc. Un solo gen puede tener
múltiples polimorfismos no relacionados diferentes. Por ejemplo,
puede tener un polimorfismo di-alélico en un sitio
y un polimorfismo multi-alélico en otro sitio.
La variación que define el polimorfismo puede
variar de la variación de un solo nucleótido a la inserción o la
eliminación de regiones prolongadas dentro de un gen. En algunos
casos, las variaciones de las secuencias de ADN están en regiones
del genoma que se caracterizan por repeticiones en tándem cortas
(STR) que incluyen motivos repetidos di- o trinucleotídicos en
tándem de nucleótidos. Los polimorfismos caracterizados por tales
repeticiones en tándem se denominan polimorfismos de "repeticiones
en tándem de un número variable" (VNTR). Las VNTR se han usado
en análisis de la identidad (Weber, patente estadounidense n.º
5.075.217; Armour et al., FEBS Lett. 307:
113-115 (1992); Jones et al., Eur. J.
Haematol. 39: 144-147 (1987); Horn et
al., solicitud de patente vía PCT W091/14003; Jeffreys,
solicitud de patente europea 370.719; Jeffreys, patente
estadounidense n.º 5.175.082; Jeffreys et al., Amer. J. Hum.
Genet. 39: 11-24 (1986); Jeffreys et al.,
Nature 316: 76-79 (1985); Gray et al., Proc.
R. Acad. Soc. Lond. 243: 241-253 (1991); Moore
et al., Genomics 10: 654-660 (1991);
Jeffreys et al., Anim. Genet. 18: 1-15
(1987); Hillel et al., Anim. Genet. 20:
145-155 (1989); Hillel et al., Genet. 124:
783-789 (1990)).
La detección de sitios polimórficos en una
muestra de ADN puede ser facilitada por el uso de procedimientos de
amplificación ácidos nucleicos. Tales procedimientos aumentan
específicamente la concentración de polinucleótidos que abarcan el
sitio polimórfico o incluyen ese sitio y las secuencias localizadas
bien distal o proximalmente al mismo. Tales moléculas amplificadas
pueden ser fácilmente detectadas mediante electroforesis sobre gel
u otros procedimientos.
En una realización alternativa, tales
polimorfismos se pueden detectar a través del uso de una molécula de
ácido nucleico marcadora que esté ligada físicamente a tal o tales
polimorfismos. A tal efecto, se pueden emplear moléculas de ácido
nucleico marcadoras que comprenden una secuencia de nucleótidos de
un polinucleótido localizado en 1 mb del o de los polimorfismos y,
más preferiblemente, en 100kb del o de los polimorfismos, y lo más
preferible, en 10kb del o de los polimorfismos.
Se puede determinar la identificación de un
polimorfismo en una variedad de modos. Correlacionando la presencia
o la ausencia del mismo en una planta con la presencia o la ausencia
de un fenotipo, es posible predecir el fenotipo de esa planta. Si
un polimorfismo crea o destruye un sitio de escisión de una
endonucleasa de restricción, o si da como resultado la pérdida o la
inserción de ADN (p. ej., un polimorfismo de VNTR), alterará el
tamaño o el perfil de los fragmentos de ADN que son generados
mediante la digestión con esa endonucleasa de restricción. Como
tales, los organismos que poseen una secuencia divergente se pueden
distinguir de aquéllos que tienen la secuencia original mediante el
análisis de los fragmentos de restricción. Los polimorfismos que se
pueden identificar de esta manera se denominan "polimorfismos de
la longitud de los fragmentos de restricción" ("RFLPs")
(Glassberg, solicitud de patente británica 2135774; Skolnick et
al., Cytogen. Cell Genet. 32: 58-67 (1982);
Botstein et al., Ami. J. Hum. Genet. 32:
314-331 (1980); Fischer et al., (solicitud
vía PCT W090/13668; Uhlen, solicitud vía PCT W090/11369).
Los polimorfismos también se pueden identificar
mediante análisis de polimorfismos de configuración monocatenaria
(SSCP) (Elles, "Methods in a Molecular Medicine: Molecular
Diagnosis of Genetic Diseases", Humana Press (1996)); Orita
et al., Genomics 5: 874-879 (1989)). Se ha
descrito un número de protocolos para el SSCP incluyendo, pero no
limitándose a, Lee et al., Anal. Biochem. 205:
289-293 (1992); Suzuki et al., Anal. Biochem.
192: 82-84 (1991); Lo et al., "Nucleic
Acids Research" 20: 1005-1009 (1992); Sarkar
et al., Genomics 13: 441-443 (1992). Se
entiende que se pueden utilizar uno o más de los ácidos nucleicos de
la invención como marcadores o sondas para detectar los
polimorfismos mediante el análisis de SSCP.
También se pueden encontrar polimorfismos usando
una técnica de análisis de la huella del ADN denominada polimorfismo
de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP), que se basa en la
amplificación por PCR selectiva de fragmentos de restricción
procedentes de un digesto total de ADN genómico para perfilar ese
ADN (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23:
4407-4414 (1995)). Este procedimiento permite la
co-amplificación específica de elevados números de
fragmentos de restricción, que pueden ser visualizados por PCR sin
conocer la secuencia de ácido nucleico. Se entiende que se pueden
utilizar uno o más de los ácidos nucleicos de la invención como
marcadores o sondas para detectar los polimorfismos mediante el
análisis de polimorfismos AFLP o para la huella del ARN.
También se pueden encontrar polimorfismos usando
ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) (Williams et
al., Nucl. Acids Res. 18: 6531-6535 (1990)) y
secuencias polimórficas amplificadas escindibles (CAPS) (Lyamichev
et al., Science 260: 778-783 (1993)). Se
entiende que se pueden utilizar una o más de las moléculas de ácido
nucleico de la invención como marcadores o sondas para detectar los
polimorfismos mediante el análisis de RAPD o CAPS.
Los polimorfismos de de un solo nucleótido (SNP)
tienen lugar generalmente a una mayor frecuencia que otros
marcadores polimórficos y están espaciados con una mayor uniformidad
por un genoma que otras formas descritas de polimorfismo. La mayor
frecuencia y uniformidad de los SNP significa que hay una mayor
probabilidad de que tal polimorfismo sea encontrado cerca o en un
locus genético de interés que la que habría en el caso de otros
polimorfismos. Los SNP se localizan en regiones codificantes de
proteínas y en regiones no codificantes de un genoma. Algunos de
estos SNP pueden dar como resultado una expresión de proteínas
defectuosa o divergente (p. ej., como resultado de mutaciones o un
corte y empalme defectuoso). El análisis (el genotipado) de SNP
caracterizados puede requerir sólo un análisis más o menos en lugar
de una medición larga y pesada, lo que facilita la
automatización.
Los SNP se pueden caracterizar usando cualquiera
de una variedad de procedimientos. Tales procedimientos incluyen la
secuenciación directa o indirecta del sitio, el uso de enzimas de
restricción (Botstein et al., Am. J. Hum. Genet. 32:
314-331 (1980); Konieczny y Ausubel, Plant J.
4: 403-410 (1993)), análisis enzimáticos y químicos
de apareamientos erróneos (Myers et al., Nature 313:
495-498 (1985)), PCR de alelo específico (Newton
et al., Nucl. Acids Res. 17: 2503-2516
(1989); Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:
2757-2760 (1989)), la reacción en cadena de la
ligasa (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:
189-193 (1991)), el análisis de polimorfismos de
configuración monocatenaria (Labrune et al., Am. J Hum.
Genet. 48: 1115-1120 (1991)), la prolongación
de cebadores de una sola base (Kuppuswamy et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 88: 1143-1147 (1991), Goelet
US 6.004.744; Goelet 5.888.819), el análisis de unión de
oligonucleótidos basados en ELISA en fase sólida (Nikiforov et
al., Nucl. Acids Res. 22: 4167-4175 (1994), la
huella didesoxi (Sarkar et al., Genomics 13:
441-443 (1992)), el análisis de detención de la
fluorescencia de oligonucleótidos (Livak et al., PCR
Methods Appl. 4: 357-362 (1995a)), el análisis
de TaqMan® de hibridación de alelo específico de la nucleasa de 5'
(Livak et al., Nature Genet. 9: 341-342
(1995)), el análisis de incorporación de terminadores con
colorantes dirigido a un molde (TDI) (Chen y Kwok, Nucl. Acids
Res. 25: 347-353 (1997)), el análisis molecular
beacon de alelo específico (Tyagi et al., Nature Biotech. 16:
49-53 (1998)), el análisis PinPoint (Haff y
Smirnov, Genome Res. 7: 378-388 (1997)), el
análisis dCAPS (Neff et al., Plant J. 14:
387-392 (1998)), la pirosecuenciación (Ronaghi et
al, Analytical Biochemistry 267: 65-71 (1999);
Ronaghi et al solicitud vía PCT WO 98/13523; Nyren et
al solicitud vía PCT WO 98/28440; http//www.pyrosequencing.com),
usando una espectrometría de masas, p.ej., el sistema
Masscode^{TM} (Howbert et al WO 99/05319; Howber et
al WO 97/27331; http//www.rapigene.com; Becker et al
solicitud vía PCT WO 98/26095; Becker et al solicitud vía
PCT; WO 98/12355; Becker et al solicitud vía PCT WO 97/33000;
Monforte et al US 5.965.363), escisión invasiva de sondas de
oligonucleótido (Lyamichev et al Nature Biotechnology 17:
292-296; http//www. twt.com), y usando
alineamientos de oligonucleótidos de alta densidad (Hacia et al
Nature Genetics 22: 164-167;
http//www.affymetrix. com).
Los polimorfismos también se pueden detectar
usando oligonucleótidos de alelo específico (ASO) que se pueden
usar, por ejemplo, en combinación con una tecnología basada en la
hibridación incluyendo hibridaciones de transferencia southern,
northern y de puntos, hibridaciones de transferencia de puntos
inversa e hibridaciones realizadas sobre microalineamientos y la
tecnología relacionada.
Las condiciones restrictivas de la hibridación
para la detección de polimorfismos son muy dependientes de una
variedad de factores, incluyendo la longitud del oligonucleótido de
alelo específico, la composición secuencial, el grado de
complementariedad (i.e., la presencia o la ausencia de apareamientos
erróneos de bases), la concentración de sales y otros factores
tales como la formamida y la temperatura. Estos factores son
importantes tanto durante la propia hibridación como durante los
posteriores lavados realizados para eliminar el polinucleótido diana
que no se haya hibridado específicamente. En la práctica, las
condiciones del lavado más restrictivo final son las más
fundamentales. Además, la cantidad de polinucleótido diana que es
capaz de hibridarse al oligonucleótido de alelo específico también
está gobernada por factores tales como la concentración de tanto el
ASO como el polinucleótido diana, la presencia y la concentración
de factores que actúan para "amarrar" las moléculas de agua,
para concentrar eficazmente los reactivos (p.ej., PEG, dextrano,
sulfato de dextrano, etc.) bien si los ácidos nucleicos están
inmovilizados o en disolución, y la duración de la hibridación y las
etapas de lavado.
Las hibridaciones se realizan preferiblemente
por debajo de la temperatura de fusión (T_{f}) del ASO. Cuanto
más se acerca la hibridación y/o la etapa de lavado a la T_{f},
más restrictivas serán las condiciones. La T_{f} de un
oligonucleótido puede ser determinada, por ejemplo, según la
siguiente fórmula: T_{f} = 81,5 + 16,6 x (Iog10 [Na+]) + 0,41 x
(%G+C)-675/n; en la que [Na+] es la concentración
molar de sales de Na+ o de cualquier otro catión adecuado y n =
número de bases del oligonucleótido. Hay otras fórmulas para
determinar la T_{f} disponibles y conocidas por aquéllos expertos
habituales en la técnica.
Preferiblemente, se ajustan las condiciones
restrictivas para permitir que un determinado ASO se hibride
diferencialmente con un polinucleótido diana del alelo correcto y
un polinucleótido diana del alelo incorrecto. Preferiblemente,
habrá al menos un diferencial del doble entre la señal producida por
el ASO en hibridación con un polinucleótido diana del alelo
correcto y el nivel de la señal producida mediante la hibridación
cruzada del ASO con un polinucleótido diana del alelo incorrecto
(p. ej., un ASO específico para un alelo mutante en hibridación
cruzada con un alelo de tipo natural). En realizaciones más
preferidas de la presente invención, hay al menos un diferencial
cinco veces mayor de la señal. En realizaciones muy preferidas de la
presente invención, hay al menos un diferencial de la señal de un
orden de magnitud entre el ASO en hibridación con un polinucleótido
diana del alelo correcto y el nivel de la señal producida mediante
la hibridación cruzada del ASO con un polinucleótido diana del alelo
incorrecto.
Aunque en la presente memoria se describen
ciertos procedimientos para la detección de polimorfismos, se pueden
utilizar otras metodologías de detección. Por ejemplo, hay más
metodologías conocidas y se exponen en Birren et al., Genome
Analysis, 4: 135-186, "A Laboratory Manual.
Mapping Genomes", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY (1999); Maliga et al., "Methods in Plant
Molecular Biology. A Laboratory Course Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1995); Paterson,
"Biotechnology Intelligence Unit: Genome Mapping in Plants",
R. G. Landes Co., Georgetown, TX, y Academic Press, San Diego, CA
(1996); "The Maize Handbook", Freeling y Walbot, eds.,
Springer-Verlag, Nueva York, NY (1994); "Methods
in Molecular Medicine: Molecular Diagnosis of Genetic Diseases",
Elles, ed., Humana Press, Totowa, NJ (1996); Clark, ed., "Plant
Molecular Biology: A Laboratory Manual", Clark, ed.,
Springer-Verlag, Berlín, Alemania (1997).
Los requisitos para una selección la ayuda de
marcadores en un programa de mejora genética vegetal son: (1) el o
los marcadores deberían cosegregar o estar estrechamente unidos con
el carácter deseado; (2) debería haber un procedimiento eficaz de
rastreo de grandes poblaciones para el o los marcadores moleculares;
y (3) la técnica de rastreo debería tener una elevada
reproductibilidad en laboratorios y, preferiblemente, ser fácil de
usar y económica.
El enlace genético de moléculas marcadoras se
puede establecer mediante un modelo de mapeado génico tal como, sin
limitación, el modelo de marcadores flanqueantes descrito por Lander
y Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989) y
el mapeado de intervalos, basado en procedimientos de probabilidad
máxima descritos por Lander y Botstein, Genetics 121:
185-199 (1989) y puesto en marcha en el paquete
informático MAPMAKER/QTL (Lincoln y Lander, "Mapping Genes
Controlling Quantitative Traits Using MAPMAKER/QTL", Whitehead
Institute for Biomedical Research, Massachusetts, (1990). Otros
programas incluyen el Qgene, Versión 2.23 (1996), Departamento de
biometría y mejora genética vegetal, 266 Emerson Hall, Cornell
University, Ithaca, NY. El uso del programa Qgene es un enfoque
particularmente preferido.
Se calcula una estimación de la probabilidad
máxima (MLE) para la presencia de un marcador junto con una MLE
suponiendo un efecto nulo del QTL para evitar falsos positivos.
Entonces se calcula una lógica de razón de posibilidades (LOD)
como: LOD = log_{10} (MLE para la presencia de un QTL/MLE dada no
unida a un QTL).
La puntuación de la LOD indica esencialmente
cuánto mayor es la probabilidad de que los datos hayan surgido
suponiendo la presencia de un QTL que en su ausencia. El valor
umbral de LOD para evitar un falso positivo con una determinada
confianza, es decir del 95%, depende del número de marcadores y de
la longitud del genoma. En Lander y Botstein, Genetics 121:
185-199 (1989), se exponen gráficas que indican
umbrales de LOD descritos además por Arus y
Moreno-González, "Plant Breeding", Hayward
et al., (eds.) Chapman & Hall, London, pp.
314-331
(1993).
(1993).
En una realización preferida de la presente
invención el marcador de ácido nucleico presenta una puntuación de
LOD de más de 2,0, más preferiblemente, de 2,5, incluso más
preferiblemente de más de 3,0 ó 4,0 con el carácter o el fenotipo
de interés. En una realización preferida, el carácter de interés es
el de niveles o composiciones de tocoferol modificados.
Se pueden usar otros modelos. Se han descrito
muchas modificaciones y enfoques alternativos al mapeado de
intervalos, incluyendo el uso de procedimientos no paramétricos
(Kruglyak y Lander, Genetics 139: 1421-1428
(1995)). También se pueden usar procedimientos de regresión
múltiple, en los que el carácter es sometido a una regresión sobre
un gran número de marcadores (Jansen, "Biometrics in Plant
Breeding", van Oijen y Jansen (eds.), "Proceedings of the
Ninth Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant
Breeding", Países Bajos, pp. 116-124 (1994);
Weber y Wricke, "Advances in Plant Breeding",
Black-well, Berlín, 16 (1994)). Jansen y Stam,
Genetics 136: 1447-1455 (1994), y Zeng,
Genetics 136: 1457-1468 (1994) han descrito
procedimientos que combinan el mapeado de intervalos con el
análisis de regresión, mediante los cuales se somete el fenotipo a
una regresión sobre un solo QTL putativo en un determinado intervalo
de marcadores y al mismo tiempo sobre un número de marcadores que
sirven como "cofactores". Generalmente, el uso de cofactores
reduce el margen de error y el error de muestreo de las posiciones
de QTL estimadas (Utz y Melchinger, "Biometrics in Plant
Breeding", van Oijen y Jansen (eds.) "Proceedings of the Ninth
Meeting of the Eucarpia Section Biometrics in Plant Breeding",
Países Bajos, pp. 195-204 (1994), mediante lo que se
mejora la eficacia del mapeado de QTL (Zeng, Genetics 136:
1457-1468 (1994)). Se pueden ampliar estos modelos a
experimentos multi-ambientales para analizar
interacciones entre genotipos y el medio ambiente (Jansen et al.,
Theo. Appl. Genet. 91: 33-37 (1995)).
Se entiende que se pueden utilizar una o más de
las moléculas de ácido nucleico de la invención como marcadores
moleculares. También se entiende que se pueden utilizar una o más de
las moléculas proteicas de la invención como marcadores
moleculares.
En una realización preferida, el polimorfismo
está presente y es rastreado en una población de mapeado, p. ej.,
una colección de plantas capaces de ser usadas con marcadores tales
como marcadores polimórficos para mapear la posición genética de
caracteres. La elección de la población de mapeado apropiada depende
habitualmente del tipo de sistemas marcadores empleados (Tanksley
et al., J. P. Gustafson y R. Appels (eds.). Plenum Press,
Nueva York, pp: 157-173 (1988)). Se debe tener en
cuenta el origen de los padres (adaptados frente a exóticos) usados
en la población de mapeado. El apareamiento de cromosomas y las
velocidades de recombinación pueden ser gravemente perturbadas
(inhibidas) en cruces de amplio espectro (adaptados x exóticos) y
generalmente producen distancias de enlace enormemente reducidas.
Los cruces de amplio espectro proporcionarán habitualmente
poblaciones segregantes con un número relativamente elevado de
polimorfismos en comparación con la progenie en un cruce
restringido (adaptado x adaptado).
Una población F_{2} es la primera generación
de la autofecundación (auto-polinización) una vez
producida la semilla híbrida. Habitualmente, se autofecunda una
sola planta F_{1} para generar una población segregante para
todos los genes en un patrón de Mendel (1: 2: 1). Se obtiene una
información genética máxima de una población F_{2} completamente
clasificada usando un sistema de marcadores codominantes (Mather,
"Measurement of Linkage in Heredity": Methuen y Co., (1938)).
En el caso de los marcadores dominantes, se requieren análisis de la
progenie (p. ej., F_{3}, BCF_{2}) para identificar los
heterocigotos, con el fin de clasificar la población. Sin embargo,
este procedimiento suele ser prohibitivo debido al coste y al tiempo
implicado en el análisis de la progenie. El análisis de la progenie
de individuos F_{2} se usa habitualmente en la construcción de
mapas en los que los fenotipos no reflejan de manera sistemática el
genotipo (p. ej., la resistencia a una enfermedad) o en los que la
expresión del carácter está controlada por un QTL. Los datos de
separación procedentes de las poblaciones del análisis de la
progenie (p.ej., F_{3} o BCF_{2}) se pueden usar en la
construcción de mapas. Entonces se puede aplicar la selección con
marcadores a la progenie del cruce en base a las asociaciones en el
mapa de marcador-carácter (F_{2}, F_{3}), en las
que los grupos de enlace no hayan sido disociados completamente
mediante recombinaciones (i.e., desequilibrio máximo).
Se pueden usar las líneas consanguíneas
recombinantes (RIL) (líneas relacionadas genéticamente;
habitualmente >F_{5}, desarrolladas a partir de líneas de
F_{2} de autofecundación continua hacia la homocigosidad) como
una población de mapeado. La información obtenida de los marcadores
dominantes se puede maximizar mediante el uso de RIL, porque todos
los locus son homocigóticos o casi lo son. En condiciones de fuerte
unión (i.e., una recombinación de aproximadamente <10%) los
marcadores dominantes y codominantes evaluados en las poblaciones
de RIL proporcionan más información por individuo que cualquier tipo
de marcador de las poblaciones de retrocruzamiento (Reiter.
Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 89: 1477-1481
(1992)). Sin embargo, a medida que crece la distancia entre los
marcadores (i.e., los locus se vuelven más independientes),
disminuye la información de las poblaciones de RIL de manera
espectacular en comparación con los marcadores codominantes.
Las poblaciones de un retrocruzamiento (p.ej.,
las generadas a partir del cruce ente una variedad satisfactoria
(padre recurrente) y otra variedad (padre donante) que porta un
carácter que no está presente en el primero) se pueden utilizar
como una población de mapeado. Se puede hacer una serie de
retrocruzamientos con el padre recurrente para recuperar la mayoría
de los caracteres deseables. Por lo tanto, se crea una población
constituida por individuos casi como el padre recurrente, pero
portando cada individuo cantidades variables o mosaico de regiones
genómicas procedentes del padre donante. Las poblaciones de
retrocruzamiento pueden ser útiles para mapear marcadores
dominantes si todos los locus del padre recurrente son
homocigóticos, y el donante y el padre recurrente tienen alelos de
marcadores polimórficos contrastados (Reiter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (EE.UU.) 89: 1477-1481 (1992)). La
información obtenida a partir de poblaciones de retrocruzamiento
que usan marcadores bien codominantes o dominantes es menor que la
obtenida a partir de poblaciones F_{2}, porque se muestrea uno en
lugar de dos gametos recombinantes por planta. Sin embargo, las
poblaciones de retrocruzamiento son más informativas (a una
saturación de marcadores baja) en comparación con las RIL, pues la
distancia entre los locus enlazados aumenta en las poblaciones de
RIL (i.e., una recombinación del aproximadamente 0,15%). El aumento
de la recombinación puede ser beneficioso para la resolución de los
enlaces fuertes, pero puede no ser deseable en la construcción de
mapas con una saturación baja de marcadores.
Se pueden usar líneas isogénicas cercanas (NIL)
(creadas mediante muchos retrocruzamientos para producir una
colección de individuos que es casi idéntica en composición genética
a excepción del carácter o la región genómica interrogante) como
una población de mapeado. En el mapeado con NIL, sólo se espera el
mapeado de una parte de los locus polimórficos hasta una región
seleccionada.
El análisis de segregantes agrupados (BSA) es un
procedimiento desarrollado para la rápida identificación del enlace
entre marcadores y caracteres de interés (Michelmore et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 9828-9832
(1991)). En los BSA, se representan dos muestras de ADN agrupadas
procedentes de una población segregante originaria de un solo
cruce. Estos grupos contienen individuos que son idénticos para un
determinado carácter (resistentes o susceptibles a una determinada
enfermedad) o una región genómica pero arbitraria en regiones no
alineadas (i.e., heterocigótico). Las regiones no unidas a la región
diana no diferirán entre las muestras agrupadas de muchos
individuos en el BSA.
En un aspecto de la presente invención, se usan
una o más moléculas nucleicas de la presente invención para
determinar el nivel (i.e., la concentración de ARNm de una muestra,
etc.) en una planta (preferiblemente canola, maíz, Brassica
campestris, Brassica napus, soja, crambe, mostaza, aceite
de ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón, semilla de lino,
cártamo, aceite de palma, lino o girasol) o un patrón (i.e., la
cinética de la expresión, la velocidad de descomposición, el perfil
de estabilidad, etc.) de la expresión de una proteína codificada en
parte o por completo por una o más de las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención (colectivamente, la "respuesta
a la expresión" de una célula o de un tejido).
Como se usa en la presente memoria, la respuesta
a la expresión manifestada por una célula o por un tejido se dice
que está "modificada" si difiere de la respuesta a la expresión
de células o de tejidos de plantas que no presentan el fenotipo.
Para determinar si una respuesta a la expresión está modificada, se
compara la respuesta a la expresión manifestada por la célula o el
tejido de la planta que presenta el fenotipo con la de una muestra
celular o tisular similar de una planta que no presenta el fenotipo.
Como se comprenderá, no es necesario volver a determinar la
respuesta a la expresión de la muestra celular o tisular de las
plantas que no presentan el fenotipo cada vez que se hace tal
comparación; más bien, se puede comparar la respuesta a la
expresión de una determinada planta con los valores obtenidos
previamente de plantas normales. Como se usa en la presente
memoria, el fenotipo del organismo es cualquiera de entre una o más
características de un organismo (p. ej., resistencia a una
enfermedad, tolerancia a una plaga, tolerancia ambiental tal como
la tolerancia a un estrés abiótico, la esterilidad masculina, la
mejora de la calidad o el rendimiento, etc.). Un cambio de genotipo
o fenotipo puede ser transitorio o permanente. También como se usa
en la presente memoria, una muestra tisular es cualquier muestra
que comprenda más de una célula. En un aspecto preferido, una
muestra tisular comprende células que comparten una característica
común (p. ej., derivadas de una raíz, semilla, flor, hoja, tallo o
polen, etc.).
En un aspecto de la presente invención, se puede
realizar una evaluación para determinar si una determinada molécula
de ARNm está presente. Se utilizan una o más de las moléculas de
ácido nucleico de la presente invención para detectar la presencia
o la cantidad de la especie de ARNm. Entonces se incuban tales
moléculas con extractos celulares o tisulares de una planta en
condiciones suficientes para permitir la hibridación del ácido
nucleico. La detección de las moléculas híbridas de
sonda-ARNm bicatenarias indica la presencia del
ARNm; la cantidad de tal híbrido formado es proporcional a la
cantidad de ARNm. De este modo, se pueden usar tales sondas para
determinar el nivel y el grado de producción del ARNm en células o
tejidos de una planta. Tal hibridación de ácidos nucleicos se puede
realizar en condiciones cuantitativas (proporcionando así un valor
numérico de la cantidad del ARNm presente). Alternativamente, se
puede realizar el análisis como un análisis cualitativo que indica
bien que el ARNm está presente o que su nivel supera un valor
predefinido fijado por el usuario.
Se puede usar un número de procedimientos para
comparar la respuesta a la expresión entre dos o más muestras de
células o tejido. Estos procedimientos incluyen análisis de
hibridación, tales como transferencia northern, análisis de
protección de RNasa e hibridación in situ. Alternativamente,
los procedimientos incluyen análisis de tipo PCR. En un
procedimiento preferido, la respuesta a la expresión se compara
hibridando los ácidos nucleicos de dos o más muestras con un
alineamiento de ácidos nucleicos. El alineamiento contiene una
pluralidad de secuencias sospechosas conocidas o sospechosas de
estar presentes en las células o el tejido de las muestras.
Una ventaja de una hibridación in situ
frente a técnicas más convencionales para la detección de ácidos
nucleicos es que permite a un investigador determinar la población
espacial exacta (Angerer et al., Dev. Biol. 101:
477-484 (1984); Angerer et al., Dev. Biol.
112: 157-166 (1985); Dixon et al., EMBO J.
10: 1317-1324 (1991)). Se puede usar la hibridación
in situ para mediar el nivel de estado constante de la
acumulación de ARN (Hardin et al., J. Mol. Biol. 202:
417-431 (1989)). Se ha creado un número de
protocolos para la hibridación in situ, cada uno con
condiciones para la preparación tisular, la hibridación y el lavado
(Meyerowitz, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 242-250
(1987); Cox y Goldberg, en: "Plant Molecular Biology: A Practical
Approach", Shaw (ed.), pp. 1-35, IRL Press,
Oxford (1988); Raikhel et al., "In situ RNA
hybridization in plant tissues", en: "Plant Molecular Biology
Manual", vol. B9: 1-32, Kluwer Academic
Publisher, Dordrecht, Bélgica (1989)).
La hibridación in situ también permite la
localización de proteínas dentro de un tejido o una célula
(Wilkinson, "In Situ Hybridization", Oxford University
Press, Oxford (1992); Langdale, "In Situ Hybridization"
en: "The Maize Handbook, Freeling y Walbot" (eds.), pp.
165-179, Springer-Verlag, Nueva York
(1994)).Se entiende que es posible utilizar una o más moléculas de
la invención, preferiblemente una o más moléculas de ácido nucleico,
o fragmentos de las mismas, de la invención, o uno o más
anticuerpos de la invención para detectar el nivel o el patrón de
una proteína o un ARNm de la misma mediante hibridación in
situ.
La hibridación in situ fluorescente
permite la localización de una determinada secuencia de ADN a lo
largo de un cromosoma, que sea útil, entre otros usos, para el
mapeado de genes, el seguimiento de cromosomas en líneas híbridas o
la detección de cromosomas con translocaciones, transversiones o
eliminaciones. La hibridación in situ se ha usado para
identificar cromosomas de varias especies vegetales (Griffor et
al., Plant Mol. Biol. 17: 101-109 (1991);
Gustafson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 87:
1899-1902 (1990); Mukai y Gill, Genome 34:
448-452 (1991); Schwarzacher y
Heslop-Harrison, Genome 34:
317-323 (1991); Wang et al., Jpn. J. Genet.
66: 313-316 (1991); Parra y Windle, Nature
Genetics 5: 17-21 (1993)). Se entiende que se
pueden usar las moléculas de ácido nucleico de la invención como
sondas o marcadores para localizar secuencias a lo largo de un
cromosoma.
Otro procedimiento para localizar la expresión
de una molécula es la impresión de tejidos. La impresión de tejidos
proporciona un modo de detectar, al mismo tiempo sobre la misma
membrana, muchas partes de tejido procedentes de diferentes plantas
o diferentes etapas evolutivas (Yomo y Taylor, Planta
112:35-43 (1973); Harris y Chrispeels, Plant
Physiol. 56: 292-299 (1975); Cassab y Varner,
J. Cell. Biol. 105: 2581-2588 (1987); Spruce
et al., Phytochemistry 26: 2901-2903 (1987);
Barres et al., Neuron 5: 527-544 (1990);
Reid y Pont-Lezica, "Tissue Printing: Tools for
the Study of Anatomy, Histochemistry and Gene Expression",
Academic Press, Nueva York, Nueva York (1992); Reid et al., Plant
Physiol. 93: 160-165 (1990); Ye et al.,
Plant J. 1: 175-183 (1991)).
Cualquier experto en la técnica puede recurrir a
textos de referencia generales para obtener descripciones
detalladas de técnicas conocidas tratadas en la presente memoria o
técnicas equivalentes. Estos textos incluyen "Current Protocols
in Molecular Biology" de Ausubel, et al., eds., John Wiley
e hijos, N.Y. (1989), y los suplementos de septiembre (1998),
"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Sambrook et
al, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva
York (1989), "Genome Analysis: A Laboratory Manual 1: Analyzing
DNA", Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York (1997); "Genome Analysis: A Laboratory Manual
2: Detecting Genes", Birren et al., Cold Spring Harbor
Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1998); "Genome Analysis: A
Laboratory Manual 3: Cloning Systems", Birren et al., Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1999);
"Genome Analysis: A Laboratory Manual 4: Mapping Genomes",
Birren et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva
York (1999); "Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual",
Clark, Springer-Verlag, Berlin, (1997), "Methods
in Plant Molecular Biology", Maliga et al., Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1995). Estos textos
también pueden ser consultados, por supuesto, para elaborar o usar
un aspecto de la invención. Se entiende que cualquiera de los
agentes de la invención puede ser sustancialmente purificado y/o
ser biológicamente activo y/o recombinante.
Habiendo ya descrito de manera general la
invención, se comprenderá más fácilmente la misma en referencia a
los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustración y
no pretenden ser restrictivos de la presente invención a no ser que
se especifique lo contrario.
Se obtienen los vectores pJX1, pJX181 y pJX184
(Zhao y Jensen de "Molecular Evolution" 36 (2):
107-20 (1993)). Se amplifica el gen tyrA por
PCR usando cebadores tyrA5' (ACT GCC ATG GTG GCT GAA CTG ACC G (SEC
ID N.º 5)) y tyrA3' (ACT GGA ATT CTT ATT ATG GGC GGC TGT CAT TG
(SEC ID N.º 6)) y ADN plasmídico procedente de los vectores pJX1,
pJX181 y pJX184 como ADN molde. Se llevan a cabo reacciones PCR
usando el equipo de PCR de alta fidelidad Expand^{TM} de
Boehringer Mannheim en un volumen total de 50 \mul según el
protocolo del fabricante. Se amplifica el gen tyrA mediante
30 ciclos de PCR bajo las siguientes condiciones: incubación de 10
min a 95ºC, seguida por 30 ciclos de 1 min a 95ºC, apareamiento de 1
min a 56ºC y prolongación de 1,5 min a 72ºC. Estas reacciones
fueron seguidas por una incubación a 72ºC durante 5 minutos. La
forma del producto de la PCR pJX184 se selecciona para la clonación
de los genes y se digiere con NcoI y EcoRI. Se une el fragmento de
restricción purificado sobre gel en el pSE280 digerido por
NcoI/EcoRI purificado sobre gel (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)
resultando en la formación de pMON26588 (Figura 2). El inserto de
tyrA en pMON26588 es verificado mediante secuenciación de
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplifica el gen tyrA de E.
coli por PCR usando cebadores tyrAecoli5' (ACT GCC ATG GTT GCT
GAA TTG ACC G (SEC ID N.º 7)) y tyrAecoli3' (ACT GGA ATT CTT ATT
ACT GGC GAT TG (SEC ID N.º 8)) y ADN genómico total de DH5a de
E. coli como ADN molde. Se aísla el ADN genómico total de
E. coli usando el equipo Qiaamp Tissue de Qiagen (Qiagen
Inc. Valencia, CA). Se llevan a cabo reacciones PCR usando el equipo
de PCR de alta fidelidad Expand^{TM} de Boehringer Mannheim en un
volumen total de 50 \mul según el protocolo del fabricante. Se
amplifica el gen tyrA mediante 30 ciclos de PCR bajo las
siguientes condiciones: incubación de 10 min a 95ºC, seguida por 30
ciclos de 1 min a 95ºC, apareamiento de 1 min a 56ºC y prolongación
de 1,5 min a 72ºC. Estas reacciones fueron seguidas por una
incubación a 72ºC durante 5 minutos. Se digiere el producto de la
PCR con NcoI y EcoRI. Se une el fragmento de restricción purificado
sobre gel en pSE280 digerido con NcoI/EcoRI y purificado sobre gel
(Invitrogen Co., Carlsbad, CA) resultando en la formación de
pMON26589 (Figura 3). El inserto de tyrA en pMON26589 es
verificado por secuenciación de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman los vectores pMON26588 y
pMON26589 en DH5a de E. coli y se cultivan las células en un
cultivo de LB de 15 ml hasta una densidad óptica a 600 nm de
aproximadamente 0,6, y se inducen añadiendo IPTG hasta una
concentración final de 0,66 \muM. Tras una incubación durante 2 a
3 horas, se cosechan las células. Se vuelven a suspender los
sedimentos celulares en 0,5 ml de Tris/HCl 25 mM, pH 8,2 y se
perturba el desarrollo de las células mediante un tratamiento de
ultrasonidos. Se sedimentan las membranas y los restos celulares
mediante centrifugación a 100.000 xg durante tres horas. Se usa el
sobrenadante en análisis enzimáticos como un extracto celular
crudo. Se mide la actividad prefenato deshidrogenasa en un volumen
final de 1,5 ml que contiene EDTA 1 mM, DTE 1 mM, NAD 1 mM y
prefenato (sal de Ba) 1 mM en Tris/HCl 25 mM, pH 8,2. Se determina
la actividad específica de la prefenato deshidrogenasa controlando
la conversión de NAD^{+} en NADH según lo descrito en "Methods
in Enzymology" Vol. 17 (Parte A) páginas 564-574
(1970). En la siguiente tabla 1 se muestran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se escinden los genes tyrA de E.
coli y E. herbicola como fragmentos de NcoI/EcoRI desde
pMON26589 y pMON26588, se purifican sobre gel y se clonan en
pMON26541 digerido por NcoI/EcoRI y purificado sobre gel (Figura
28), dando como resultado la formación de pMON26591 y pMON26590,
respectivamente (figuras 4 y 5). Estos vectores colocan al gen
tyrA bajo el control del promotor T7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se selecciona el gen tyrA de E.
herbicola para la expresión vegetal. Se escinde el gen de
pMON26590 mediante el digesto de restricción NcoI/EcoRI, se
purifica sobre gel y se liga en pMON26541 digerido con NcoI/EcoRI y
purificado sobre gel, dando como resultado la formación del vector
lanzadera pMON36510 (figura 6). Estas uniones fusionan el gen
tyrA bacteriano con el CTP1, que es el péptido diana
cloroplástico de la subunidad pequeña de la ribulosa bifosfato
carboxilasa de Arabidopsis, y se coloca bajo el control del
promotor e35S.
Para colocar el gen tyrA bajo el control
del promotor de napina, se digiere pMON36510 con EcoRI, se rellenan
los extremos usando el fragmento de Klenow (Maniatis) y se digiere
el vector purificado sobre gel con Bgl II. Se purifica sobre gel el
fragmento más pequeño codificante del gen tyrA fusionado con
CTP1 y se une para una unión en pCGN3223 digerido y purificado
sobre gel (figura 45). Para realizar esta unión, se digiere
pCGN3224 con PstI, se rellenan los extremos con fragmento de Klenow
(Maniatis) y se digiere posteriormente el vector con Bgl II y se
purifica sobre gel. La unión del vector purificado y la fusión de
CTP1::tyrA purificada da como resultado la formación de
pMON36512 (figura 7).
Para transferir el gen tyrA de E.
herbicola a un vector binario de Arabidopsis, se digiere
pMON36510 con HindIII y Sac I, y se fusiona el fragmento purificado
sobre gel que porta el promotor e35S con CTP1, y se une tyrA
en pMON26543 digerido con HindIII-SacI y purificado
sobre gel (figura 29), lo que resulta en la formación de pMON36511
(figura 8). Este vector contiene tyrA bajo el control del
promotor e35S. El vector de expresión binario pNapina se obtiene
uniendo el fragmento de NotI purificado sobre gel que alberga el
casete de expresión de pNapina::CTP1::tyrA::3' de napina en
pMON36176 digerido con NotI (figura 30), lo que da como resultado
la formación de pMON36520 (figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara la transformación de
Arabidopsis con pMON36520 y pMON36511 de Agrobacterium
que han sido transformados con pMON36520 y pMON36511 como se
explica a continuación. Se extienden 100 \mul de un cultivo de
una noche sobre una placa de LB en agar con antibióticos. Se coloca
la placa al revés en una cámara a 30ºC durante una noche. Se
retiran las placas una vez que las colonias han crecido
(24-48 horas).
Se inicia un cultivo a pequeña escala colocando
10 ml de medio de LB líquido en un tubo de 50 ml. Se añaden 10
\mul de kanamicina (50 \mug/\mul), 10 \mul de
espectinomicina (75-100 \mug/\mul) y 10 \mul
de cloranfenicol (25 \mug/\mul). Se añade Agrobacterium
de una placa y se agita el tubo y se coloca en un agitador a 30ºC
durante una noche.
Tras el cultivo de una noche de 10 ml de
cultivo, se retira el mismo a un matraz de 500 ml. Se colocan 200
ml de LB líquido en un matraz, se añaden 200 \mul de kanamicina
(50 \mug/\mul), 200 \mul de espectinomicina
(75-100 \mug/\mul) y 200 \mul de cloranfenicol
(25 \mug/\mul), y después se añade el cultivo de una noche de
10 ml entero. Se coloca el matraz de 500 ml en un agitador a 30ºC y
se cultiva durante una noche.
Se coloca el cultivo de 200 ml entero en un tubo
de centrifugación y se centrifuga durante 25 minutos a 3.750 rpm y
a 19ºC. Tras la centrifugación, se vierte el líquido y se vuelven a
suspender los sedimentos en 25 ml de solución de sacarosa al 5%
(Silwet al 0,05%).
Se colocan 900 \mul de solución de sacarosa y
100 \mul del cultivo bacteriano de 25 ml en una cubeta y se agita
la cubeta tapada con una envoltura transparente. Se toma una
lectura de la DO del blanco con 1 ml de solución de sacarosa y
luego se toman lecturas de todas las soluciones bacterianas. Se
registra la DO (a una longitud de onda de 600) de cada cultivo.
Entonces se realizan los siguientes cálculos: C_{1}V_{1} =
C_{2}V_{2}; C_{1}V_{1} = (0,8) (200 ml); C_{1}V_{1} =
160; V_{1} = 160/C_{1}; y V_{1} = X ml/10 para determinar la
DO_{600} = 0,8 de un cultivo de Agrobacterium.
Se empapan las plantas durante al menos 30
minutos en agua antes de sumergirlas. Se vierte la solución
bacteriana en un recipiente de plástico poco profundo y se sumergen
las partes aéreas de la planta (flores y semillas prematuras,
rosetas) en la solución durante 3-5 segundos con una
agitación suave. Se colocan las plantas sumergidas de lado en una
placa negra revestida con un pañal y se cubren con un domo durante
una noche (16-24 horas) para mantener una
hume-
dad elevada. Se retira la tapa y se reanudan las condiciones de crecimiento normales de la planta durante 4 semanas.
dad elevada. Se retira la tapa y se reanudan las condiciones de crecimiento normales de la planta durante 4 semanas.
Tras la transformación y el tratamiento a
humedad elevada, se mantienen las plantas a 22ºC, a una HR del 60%
y un fotoperíodo de 16 horas durante 4 semanas. A los
5-7 días de la transformación, las plantas han dado
fruto. Se realiza semanalmente una fertilización con un fertilizador
de 20-20-20 semanas. Tras 4 semanas
de crecimiento, se colocan las plantas en un invernadero y se
detiene el riego para potenciar el secado de la planta destinado a
cosechar las semillas. Las plantas están listas para la cosecha de
las semillas tras 1-1,5 semanas de secado.
Las semillas se cosechan cortando la base de la
planta por debajo de los conos, colocando la planta sobre un tamiz
de semillas y una hoja blanca de papel, y pasando las semillas por
el orificio del cono para recoger las semillas limpias mediante
tamizado.
Se esterilizan las semillas conectando una
manguera de secado al vacío en una campana de evacuación de
humos/banco de flujo. Se colocan 100 ml de blanqueador en un vaso
de precipitados de 250 ml y se añaden 3 ml de HCl concentrado al
blanqueador. Se coloca el vaso de precipitados en el desecador y las
semillas de los tubos de semillas en un soporte de tubos del
desecador. Se pone una tapa sobre el desecador y se inicia el vacío.
Se deja toda la noche el desecador, pero no más de 16 horas.
Una vez esterilizadas, se colocan las semillas
sobre medio de selección (preparado añadiendo 10 g (2 g/l) de
Phyta-gel; 10,75 g (2,15 g/l) de sales basales MS
(M-5524 de Sigma); 50 g (10 g/l) de sacarosa y 6 ml
(1,2 ml/l) de solución de kanamicina (950 mg/ml); 5 ml (1 ml/l) de
solución de cefotaxima (250 mg/ml) y 5 ml (1 ml/l) de solución de
carbenecilina (250 mg/ml) hasta un volumen total de 5 litros a un pH
de 5,7). Se golpean ligeramente los tubos de semillas sobre una
placa para distribuir las semillas escasamente. Se envuelven las
placas con una película transparente y se colocan en un refrigerador
a 4ºC durante 1-2 días de tratamiento frío. Tras
este tratamiento de frío, se colocan las placas en una cámara a 28ºC
para la germinación.
Las plántulas seleccionadas son verdes y tienen
un desarrollo de hojas secundarias. Se mueven las plántulas
seleccionadas a la tierra una vez desarrolladas las hojas
secundarias.
Se plantan las plántulas en tierra y se tapan
con un domo durante 5 días para mantener una humedad elevada. Se
transplantan las plántulas a un invernadero una vez que las silicuas
inferiores comienzan a amarillear.
Se cultivan las semillas de las plántulas
seleccionadas en macetas de 6,35 cm con tierra (1/2
Metro-200; 1/2 PGX Mix). Se amontona la tierra y se
cubre la maceta con una malla. Se sujeta la malla a la maceta con
una tira de caucho. Se siembran las semillas y se tapan con un domo
de germinación.
Se cultivan las plántulas en un fotoperíodo de
12 h a una humedad relativa del 70% a 22ºC. Se suministra agua cada
dos días según lo necesario y se aplica un fertilizador
20-20-20 de Peter desde abajo cada
dos semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivan las plantas de semillas
transformadas del ejemplo 6 que representan 20 transformaciones
independientes y se recogen las semillas para producir semillas
T_{2}. Se cultivan las semillas T_{2} y se analizan en cuanto a
los niveles de tocoferol. En la figura 1, se expresan los niveles de
tocoferol como los nanogramos de tocoferol total por cada miligramo
de semilla. Se determinan los niveles de tocoferol añadiendo de 10 a
15 mg de semillas de Arabidopsis a un microtubo de 2 ml. Se
añaden al tubo una masa de 1 g de microperlas de 0,5 mm
(Biospecifics Technologies Corp., Lynbrook, NY) y 500 \mul de
pirogalol al 1% (Sigma Chem, St. Louis, MO) en etanol que contiene
5 \mug/ml de tocol. Se agita la muestra dos veces durante 45
segundos en un FastPrep (Bio101/Savant) a una velocidad de 6,5. Se
filtra el extracto (acrodisco de 0,2 \mum de PTFE Gelman, filtros
de jeringa de 13 mm, Pall Gelman Laboratory Inc, Ann Arbor, MI) en
un tubo automuestreador. Se realiza una CLAR sobre una columna de
CLAR de sílice Zorbax, 4.6 mm x 250 mm (5 \mum) con una detección
de la fluorescencia usando una CLAR de Hewlett Packard (Agilent
Technologies, Palo Alto CA). Se realiza la excitación de las
muestras a 290 nm y se controla la emisión a 336 nm. Se separan los
tocoferoles con un gradiente de hexano
metil-t-butil éter usando un volumen
de inyección de 20 \mul, un caudal de 1,5 ml/min y un tiempo de
ejecución de 12 min (40ºC). Se calcula la concentración y la
composición de los tocoferoles en base a curvas estándar para los
\alpha, \beta, \delta y \gamma-tocoferoles y
\alpha, \beta, \delta y \gamma-tocotrienoles
usando un programa Chemstation (Agilent Technologies, Palo Alto
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman plantas de canola, Brassica
napus, Arabidopsis y soja con una variedad de constructos
de ADN usando un enfoque de bombardeo de partículas esencialmente
según lo expuesto en Christou, "In Particle Bombardment for the
Genetic Engineering of Plants", Biotechnology Intelligence Unit,
Academic Press, San Diego, California (1996) y usando una
transformación mediada por Agrobacterium. Se producen dos
conjuntos de constructos de ADN. El primer conjunto de constructos
es el de los "constructos de un solo gen". Cada uno de los
siguientes genes se inserta en un constructo de ADN vegetal
independiente bajo el control de un promotor de napina (Krindl
et al., Seed Sci. Res. 1:209: 219 (1991)) y los productos de
los genes se pueden dirigir hacia el plasto mediante un péptido
dirigido a plastos codificado tal como el CTP1 (Keegstra,
Cell 56 (2): 247-53 (1989); Nawrath, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:
12760-12764 (1994)) o el CTP2): un gen tyrA
de E. herbicola (Xia et al., J. Gen. Microbiol.
138: 1309-1316 (1992)), un gen slr1736 (en la
Cyanobase de la web www.kazusa.or.jp/cyanobase), un gen ATPT2
vegetal (Smith et al., Plant J. 11: 83-92
(1997)), un gen dxs (Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 95 (5): 2105-2110 (1998)), un gen dxr
(Takahashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95 (17),
9879-9884 (1998)), un gen HPPD de Arabidopsis
thaliana (Norris et al., Plant Physiol. 117:
1317-1323 (1998)), un gen GGH (Keller et al.,
Eur. J. Biochem. 251: 413-417 (1998)), un gen
GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley y Scolnik, Plant
Physiol. 104: 1469-1470 (1994)), un gen AANT1
(Saint Guily, et al., Plant Physiol., 100 (2):
1069-1071 (1992)), se usó un gen MT1 (la secuencia
de MT1 de Synechocystis (Número de identificador general del
NCBI 1653572) en la búsqueda de blastos frente a EST de la cepa PCC
7120 de Anabaena sp. (Kaneko 2001). Se descubrió una
secuencia con una homología sustancial con MT1 de
Synechocystis en una búsqueda de blastos frente a EST de la
cepa PCC 7120 de Anabaena sp. (Kaneko et al., DNA
Research 8 (5): 205-213 (2001)), un gen TMT2
(según lo revelado en la solicitud estadounidense US 2003/0150015),
un gen GMT (según lo revelado en los documentos U.S. 2003/0154513;
WO 00/32757, WO 00/10380) y un gen slr1737 (en la cyanobase (de la
web www.kazusa.or.jp/cyanobase) y un constructo antisentido para la
ácido homogentísico dioxigenasa (Sato et al., J. DNA Res. 7
(1): 31-63 (2000))). Se transforma cada constructo
en al menos una planta de canola, Brassica napus,
Arabidopsis y soja. Se seleccionan las plantas que expresan
cada uno de estos genes para participar en más cruces. Se analiza
también la composición y el nivel de tocoferol de cada planta
usando el procedimiento expuesto en el ejemplo 7. Se llevan a cabo
los cruces para cada especie para generar plantas transgénicas que
tengan uno o más de los de la siguiente combinación de genes
introducidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH, GGPPS,
HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr1737, y un constructo
antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa. En una
combinación preferida, el constructo o los constructos de ácido
nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y bien
slr736 o ATPT2.
Se analiza también la composición y el nivel de
tocoferol de cada planta generada mediante los cruces (incluyendo
todos los cruces intermedios) usando el procedimiento expuesto en el
ejemplo 7. La progenie de los transformantes de estos constructos
será cruzada entre sí para apilar los genes adicionales y alcanzar
el nivel deseado de
tocoferol.
tocoferol.
Se genera el segundo conjunto de constructos de
ADN y se denomina "constructos de múltiples genes". Los
constructos de múltiples genes contienen múltiples genes cada uno
bajo el control de un promotor de napina (Krindl et al., Seed
Sci. Res. 1: 209: 219 (1991)) y los productos de cada uno de los
genes son dirigidos al plasto por un péptido dirigido a plastos
codificado. El constructo de múltiples genes puede tener dos o más
de los siguientes genes: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH,
GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr1737, y un constructo
antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa. En una
combinación preferida, el constructo o los constructos de ácido
nucleico codifican, además de tyrA, HPPD y bien slr736
o ATPT2.
Se transforma entonces cada constructo en al
menos una planta de canola, Brassica napus, Arabidopsis y
soja. Se analiza también la composición y el nivel de tocoferol de
cada planta usando el procedimiento expuesto en el ejemplo 7. La
progenie de los transformantes de estos constructos será cruzada
entre sí para apilar los genes adicionales y alcanzar el nivel
deseado de tocoferol.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman plantas de Arabidopsis de
tipo natural y líneas vegetales de Arabidopsis con el vector
plasmídico pMON69907 (figura 12), se cultivan y se recogen las
semillas según lo descrito en los ejemplos anteriores, y se analiza
la semilla en cuanto al contenido de tocoferoles y tocotrienoles
según lo descrito anteriormente. El plásmido pMON69907 codifica una
prefenato deshidrogenasa bifuncional (tyrA) y una fitil
preniltransferasa (ATPT2). La figura 14 representa el contenido de
tocoferoles y tocotrienoles totales de semillas de
Arabidopsis procedentes de plantas de tipo natural y de
varias líneas vegetales transformadas con el vector plasmídico
pMON69907. La figura 15 representa el contenido de tocoferoles
totales de semillas de Arabidopsis procedentes de una planta
de tipo natural y de varias líneas vegetales transformadas con el
vector plasmídico pMON69907. La figura 31 muestra los patrones de
CL/EM para el tocoferol y el tocotrienol. La figura 32 muestra los
resultados de la LC/EM para las líneas seleccionadas, mostrando la
presencia de tocotrienoles. La figura 33 muestra un cromatograma de
CLAR/FLD de extracto de semillas de control, que muestra la falta
de presencia de tocotrienoles. La figura 34 muestra un cromatograma
de CLAR/FLD de extracto de semillas de control que muestra la
presencia de tocotrienoles en las líneas seleccionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan los constructos de expresión
pCGN10822, pMON36528, pMON69907 y pMON69909 mostrados en las figuras
10-13, respectivamente.
\newpage
Se transforman plantas de Arabidopsis con
los vectores indicados usando las técnicas de transformación
descritas en el ejemplo 8. Se aíslan los transformantes y se
cultivan en líneas individuales mediante
auto-polinización y se recoge la semilla de cada
línea. Se analiza la composición de los tocoferoles y tocotrienoles
de las semillas de cada línea usando el procedimiento expuesto en
el ejemplo 7. La figura 16 muestra los niveles de tocoferoles y
tocotrienoles totales para las líneas vegetales que albergan los
constructos descritos o un control. En la figura 17, se muestra un
análisis de las semillas T_{2} de las líneas vegetales derivadas
de la transformación con el vector pMON69909 en relación con el tipo
natural. Las líneas vegetales transformadas con pMON69909
demuestran un aumento sustancial de los tocoferoles totales y los
tocotrienoles totales, con aumentos mayores en el delta tocoferol,
alfa tocotrienol, delta tocotrienol y gamma tocotrienol. Alguna
semilla de las plantas que albergan el vector pMON69909 muestran
una coloración oscura como resultado de la acumulación de ácido
homogentísico, lo que queda confirmado por el análisis de CL/EM
(véanse las figuras 31 y 32).
La expresión heteróloga de tyrA en las
semillas de plantas de Arabidopsis transgénicas produce un
aumento de 1,6 veces de los niveles de tocoferol de las semillas en
comparación con la líneas control. Otra enzima clave esencial para
la biosíntesis del tocoferol es la HPT, que está implicada en la
condensación del fitil pirofosfato (PPP) y el homogentisato (HGA)
para producir
2-metil-6-ftilplastoquinol
(2M6PPQ), un precursor para la síntesis de cuatro isoformas
diferentes de tocoferoles. La sobre-expresión de
HPT_{Arabidopsis} (ATPT2) y HPT_{Synechocystis} (slr1736)
independientemente en semillas de A. thaliana transgénicas
resulta en un aumento de 1,6 veces de los tocoferoles de las
semillas. Se observa que un transportador del adenilato putativo
procedente de A. thaliana (AANT1) expresado como un solo gen
aumenta los niveles de tocoferol en las semillas hasta 1,4 veces en
A. thaliana. Para analizar si una combinación de estos genes
daría como resultado un efecto sinérgico sobre la biosíntesis del
tocoferol, se analizaron diversas combinaciones en A.
thaliana.
Se analizan, en cuanto al contenido y la
composición de los tocoferoles de las semillas, las semillas de
Arabidopsis de T_{2} que albergan los constructos de los
dos genes ATPT2 y tyrA (pMON69907), los constructos
de los tres genes ATPT2 tyrA y HPPD
(pMON69909), los constructos de los tres genes ATPT2,
tyrA y GGPPS (pMON69915 (figura 35)) y los constructos
de los tres genes ATPT2, tyrA y AANT1
(pMON69919 (figura 36)). El contenido de los tocoferoles y
tocotrienoles totales de las semillas aumenta hasta aproximadamente
2,4-veces en las líneas transformadas con pMON69907
(vector de dos genes) y hasta 5 veces en las líneas que portan el
vector de tres genes (pMON69909) (véase la figura 16 y 17). El HPPD
expresado como un solo gen en A. thaliana da como resultado
un aumento apenas detectable de los niveles de tocoferol. La
combinación de HPPD con ATPT2 no resulta en un mayor
aumento de los niveles de tocoferol en comparación con las líneas
que albergan sólo ATPT2 (no se muestran los datos). Por el
contrario, cuando se combina HPPD con tyrA y
ATPT2, los niveles de tocoferoles y tocotrienoles se duplican
en comparación con la combinación de tyrA y ATPT2.
Las semillas que albergan el constructo de tres genes pMON69909
aparecen mucho más oscuras que las semillas control. Además, se
sabe que las plantas dicotiledóneas de tipo natural no acumulan
tocotrienoles. Sin embargo, las semillas de A. thaliana
transgénica que albergan los cuatro constructos acumulan niveles
sustanciales de tocotrienoles (confirmados por CLAR y para las
muestras seleccionadas por CL/EM (véanse las figuras 31, 32, 33 y
34). El contenido de tocoferoles y tocotrienoles de las semillas
que albergan el constructo de expresión de tres genes pMON69909
constan del 60% de tocotrienoles y el 40% de tocoferoles. Cuando se
eleva la disponibilidad del HGA endógeno mediante la
sobre-expresión de las enzimas biosintéticas de HGA
(tyrA y HPPD) junto con la HPT, la HPT utilizaría
geranilgeranil pirofosfato (GGPP) y HGA para producir
tocotrienoles en lugar de tocoferoles en condiciones limitadas por
la disponibilidad del nivel endógeno de la geranilgeranil reductasa
(GGH). La GGH funciona sobre la hidrogenación del
GGPP en PPP, un sustrato para la HPT en la
síntesis del tocoferol. Por consiguiente, la mayor acumulación de
tocotrienoles observada en los constructos analizados puede ser
superada por la sobre-expresión de la GGH en
combinación con tyrA, HPPD y HPT.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman plantas con los constructos de
ADN mostrados en las tablas 2 y 3 que se presentan a continuación,
empleando las técnicas descritas en el ejemplo 8. Los constructos
contienen uno o más de los genes bajo el control de un promotor de
napina (Krindl et al., Seed Sci. Res. 1: 209: 219 (1991)), el
promotor 7Sa' (Chen et al., PNAS 83 (22):
8560-8564 (1998)) o el promotor Arc5 (Goossens et
al., Plant Physiol. 120: 1095-1104 (1999)). Los
productos de los genes se pueden dirigir al plasto mediante un
péptido dirigido a plastos codificado tal como el CTP1 (Keegstra,
Cell 56(2): 247-53 (1989); Nawrath,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:
12760-12764 (1994)) o CTP2. Se usa uno o más de los
siguientes genes: un gen tyrA de E. herbicola (Xia
et al., J. Gen. Microbiol. 138: 1309-1316
(1992)), un gen slr1736 (en la Cyanobase de web
www.kazusa.org.jp/cyanobase), un gen ATPT2 (Smith et al., Plant
J. 11: 83-92 (1997)), un gen dxs de
E. coli (Lois et al., Proc. Natl. Acad.Sci. EE.UU. 95
(5): 2105-2110 (1998)), un gen dxr (Takahashi
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95 (17),
9879-9884 (1998)), un gen HPPD (Norris et al.,
Plant Physiol. 117: 1317-1323 (1998)), un gen
GGH (Keller et al., Eur. R Biochem. 251: 413- 417 (1998)), un
gen GGPPS de Arabidopsis thaliana (Bartley y Scolnik,
Plant Physiol. 104: 1469-1470 (1994)), un gen
AANT1 (Saint Guily, et al., Plant Physiol., 100 (2):
1069-1071 (1992)), un gen MT1 (como el anterior para
el ejemplo 8), un gen TMT2 (como el anterior para el ejemplo 8), un
gen GMT (como el anterior para el ejemplo 8, y los documentos WO
00/32757, WO 00/10380), un gen slr1737 (de la Cyanobase de la web
www.kazusa.org.jp/cyanobase), y un constructo antisentido para la
ácido homogentísico dioxigenasa (denominada HGD_{AS}) (Sato et
al., J. DNA Res. 7 (1) 31-63 (2000)). Se
transforma cada constructo en al menos una planta de canola,
Brassica napus, Arabidopsis y soja. Se analiza
también la composición y el nivel de tocoferol de cada planta
usando el procedimiento expuesto en el ejemplo 7. Los ejemplos de
las plantas transformadas con tyrA y otros genes de la
biosíntesis del tocoferol incluyen plantas de Arabidopsis
transformadas con los constructos expuestos en la tabla 2 y plantas
de soja transformadas con los constructos de la tabla 3.
Se pueden someter las plantas con las
características deseadas a más cruces para generar plantas
transgénicas que tengan uno o más genes de la siguiente combinación
de genes introducidos: tyrA, slr1736, ATPT2, dxs, dxr, GGH,
GGPPS, HPPD, MT1, TMT2, GMT, AANT1, slr1737, y un constructo
antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa.
Alternativamente, se pueden cruzar las plantas para apilar múltiples
copias de uno o más de los genes anteriormente mencionados en una
planta transgénica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes de cada casete de expresión
génica incluyen un promotor, en este ejemplo, el promotor de napina,
un terminador, un péptido dirigido a plastos (que puede ser un
péptido dirigido a plastos nativo o un péptido diana cloroplástico
fusionado al terminal N) y un gen de interés, según lo mostrado en
las figuras 18a y 18b. Los casetes de expresión se pueden orientar
de cabeza a cola, de cabeza a cabeza o la orientación puede
variar.
La clonación se realiza usando casetes de
expresión flanqueados por los sitios de restricción de Bsp120 I y
Not I. Se construye un vector lanzadera (pMON36582 (figura 19))
apareando los cebadores SV MCS 1A y SV MCS 1B:
y uniéndolos en pSP72 digerido por
BgI II y Xho I, y purificado sobre gel (Promega, www.promega.com).
El vector resultante se denomina pMON36582 (figura 19). El vector
es confirmado mediante secuenciación de
ADN.
Todos los casetes de expresión génica están
preparados para ser flanqueados por los sitios de restricción de
Not I. Se aíslan estos casetes mediante la digestión de los vectores
anteriores con Not I, seguida por la purificación sobre gel de los
casetes de expresión. Se digiere pMON36582 con Eag I, que corta dos
veces en este vector, una vez en el sitio de Not I y una vez 19 pb
secuencia arriba del sitio de Not I. Ambos salientes son
compatibles con Not I. Los casetes de expresión de Not I son ligados
en el pMON36582 digerido con Eag I purificado sobre gel, resultando
en un vector con un solo sitio de Not I. El casete de expresión está
por tanto disponible como un casete de Bsp120 I/Not I. En la figura
20, se muestra pMON36586 como un ejemplo de un casete de expresión
para la homogentisato fitiltransferasa de Arabidopsis
disponible como un casete de Bsp120 I/Not. Este vector se obtiene
según lo descrito
anteriormente.
anteriormente.
\newpage
La preparación de los casetes de expresión se
realiza en un vector lanzadera, tal como pMON36586. Los casetes de
expresión génica son liberados desde otros vectores lanzadera
mediante digestos de Bsp120/Not I y se unen en un vector lanzadera
tal como pMON36586, que ha sido digerido con Not I. El vector
resultante alberga un casete de expresión génica adicional y un
solo sitio de Not I. Este procedimiento se puede repetir según lo
requerido. Una vez realizada la preparación del gen, se pueden
liberar los casetes de expresión combinados mediante el digesto de
Bsp120 I/Not I (pMON10098 (figura 37)). Entonces se purifica el
fragmento resultante que porta los casetes de expresión y se une en
un solo sitio de Not I de un vector binario. Alternativamente, se
puede realizar la preparación de los casetes de expresión génica
directamente en un vector binario (figura 21). Un vector binario se
define por la presencia de las secuencias del borde izquierdo y
derecho que son necesarias para la transferencia de ADN de
Agrobacterium a las células vegetales. Todos los reactivos
químicos y las enzimas para esta manipulación son de grado
molecular. Estos reactivos y estas enzimas se utilizan según las
instrucciones del suministrador. Se usan técnicas de clonación
molecular estándar.
Se representan varios ejemplos de constructos
binarios vegetales, sus componentes y los mapas plasmídicos. Los
ejemplos representados que contienen las combinaciones de
tyrA con otros genes de interés para el diseño de la ruta
del tocoferol se enumeran en las figuras 18a y 18b. Los componentes
de estos constructos también se proporcionan en la tabla 4. Los
mapas vectoriales mostrados en las Figuras 22-27
representan diversos constructos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo expone el uso de una prefenato
deshidrogenasa (tyrA) tal como tyrA de Erwinia herbicola en
combinación con otras enzimas clave en la ruta biosintética del
tocoferol para aumentar la producción de tocoferol en semillas de
plantas transgénicas tales como semillas de Arabidopsis
thaliana. Las enzimas combinadas con tyrA incluyen ATPT2,
p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD_{Arabidopsis}) y
geranilgeranilpirofosfato sintasa (GGPPSA_{Arabidopsis}) de
Arabidopsis thaliana. Además, se analizó tyrA también en
combinación con ATPT2 y un transportador de adenilato putativo
(AANT1_{Arabidopsis}) de Arabidopsis thaliana.
La construcción de un vector de dos genes que
alberga los casetes de expresión de tyrA y ATPT2 de
una semilla específica se realiza según lo siguiente. Se somete ADN
plasmídico purificado de pMON36520 (figura 38) a un digesto de KpnI
parcial y se une con un fragmento de Kpn I purificado sobre gel de
4,2 kpb aislado de pMON43853 (figura 39). El inserto de 4,2 kb de
pMON43853 contiene el casete de expresión del gen PPT
(pNapina::ATPT2::3' de napina). Se usa el vector binario vegetal
resultante pMON69907 (figura 12) para la transformación de
Arabidopsis thaliana para analizar el efecto combinatorio de
la expresión de tyrA y ATPT2 de una semilla específica.
Para aumentar más la biosíntesis del tocoferol,
se expresa HPPD_{Arabidopsis} además de tyrA y ATPT2 en
semilla de Arabidopsis thaliana. Esto se realizó añadiendo un
casete de expresión de semilla específica para HPPD_{Arabidopsis}
a pMON69907 dando como resultado la formación de pMON69909. El
vector binario pMON69909 se construyó digiriendo parcialmente
pMON69907 con KpnI. El pMON69907 con un solo corte de KpnI se
purifica sobre gel y se une con un inserto de KpnI/KpnI de 4,6 kb
aislado de pMON36525 (figura 40). El inserto KpnI/KpnI de 4,6 kb de
pMON36525 contiene el casete de expresión del gen HPPD,
pNapina::CTP2::HPPD_{Arabidopsis}::3' de napina para dirigir la
expresión dirigida a plastos de semilla específica de HPPD. El CTP2
es una señal diana cloroplástica procedente del gen
5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) de Arabidopsis.
Se construye el vector binario pMON69915 (figura
35) para analizar efecto de las combinaciones de los tres genes,
tyrA, ATPT2 y GGPPS_{Arabidopsis} sobre la producción de
tocoferoles de las semillas. Se digirió parcialmente el vector
pMON69907 con KpnI. El pMON69907 con un solo corte de KpnI se
purifica sobre gel y se une con un fragmento de KpnI/KpnI de 4,3 kb
purificado sobre gel de pMON43861 (figura 41) para crear pMON69915.
El fragmento de KpnI de pMON43861 contiene el casete de expresión
génica para la geranilgeranildifosfato sintasa de
Arabidopsis procedente de Arabidopsis thaliana
(pNapina::GGPPS_{Arabidopsis}::3' de napina). Se identifica el
ADNc de GGPPS como un clon de EST, buscando en una base de datos de
EST con la información secuencial disponible en la bibliografía
(Okada et al., Plant Physiol. 122: 1045-1056
(2000)). Se digiere el clon de EST con NcoI y se redondean los
extremos rellenando el saliente de 5' con el fragmento de Klenow.
Posteriormente, se digiere el clon con BamHI y se escinde el
fragmento de ADNc. Se une el fragmento de ADNc romo/BamHI
purificado sobre gel con vector pCGN7770 digerido con BglII/SalI
(con los extremos redondeados con SalI) (figura 42) para crear
pMON43861.
Se construye el vector binario vegetal pMON69919
(figura 36) para analizar la expresión combinada de tyrA, ATPT2 y
AANT1_{Arabidopsis} sobre los niveles de tocoferol de las
semillas. Para generar este vector, se digiere parcialmente
pMON69907 con KpnI. El pMON69907 con un solo corte de KpnI se
purifica sobre gel y se une con un fragmento de KpnI/KpnI
purificado sobre gel de 4,2 kb de pMON69911 (figura 43). El
fragmento de 4,2 kb contiene un casete de expresión de semilla
específica para el transportador de adenilato de Arabidopsis
AANT1 (pNapina::AANT1_{Arabidopsis}::3' de napina). Se genera
pMON69911 escindiendo el fragmento de AANT1 de pCGN11301 (figura
44) con SalI y PastI (se redondea el sitio de PstI retirando el
saliente de 3' con Klenow) y luego se une a pCGN7770 digerido con
SalI/XhoI (con extremos redondeados con XhoI).
Se identifican varios clones de longitud
completa en las bases de datos de EST usando la secuencia parcial
publicada de AANT1 (Saint-Guily et al., Plant
Physiol. 100 (2): 1069-1071 (1992)). La región
codificante de AANT1 es amplificada por PCR usando los cebadores,
AANT1F
5'-GGATCCGCGGCCGCACC ATG GTTGATCAAGTTCAGCA
(SEC ID N.º 11) y AANT1R
5'-GAGCTCCTGCAGGAAGCTT TTA GGCACCTCCTGATCCGT-3'
(SEC ID N.º 12). El sitio de NotI (subrayado) se coloca
secuencia arriba del codón de iniciación (cursivas) en el cebador
AANT1F, mientras que el sitio de Sse8387l (subrayado) fue
colocado secuencia abajo del codón de terminación (cursivas) en
AANT1R. Primero se clonan los productos de la PCR en pCR2.1 y se
verifican los insertos mediante la secuenciación de ambas cadenas.
Posteriormente, se insertan los fragmentos de
NotI/Sse8387I en los sitios de
NotI/Sse8387I del casete de expresión de la napina en
pCGN9979 en una orientación sentido con respecto al promotor de
napina para generar pCGN11301. Los constructos de expresión
vegetales se usan para la transformación de Arabidopsis
thaliana mediante una transformación mediada por
Agrobacterium según lo descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transforman plantas de Arabidopsis
thaliana con vectores del ejemplo 13 usando la técnica de
transformación ofrecida en el ejemplo 8. Los resultados para
pMON69909 se proporcionan en las Figuras 14, 15, 16, 17 y
31-34. En la siguiente tabla se ofrecen más
resultados, así como en las figuras 75 y 76, que muestran los
niveles de tocoferol, tocotrienol, homogentisato y
2-metilfitilplastoquinol para las plantas
transformadas que tienen pMON69909.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo describe el procedimiento implicado
en la preparación de vectores binarios vegetales para analizar tyrA
solo y en combinación con otras enzimas clave en la ruta
biosintética del tocoferol para aumentar la producción del
tocoferol en semillas de Glycine max transgénicas. La
siguiente tabla describe los vectores binarios vegetales preparados
para la transformación de G. max con su respectivo gen de los
casetes de expresión de interés para la expresión de semilla
específica de los transgenes.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara el pMON36575 (Figura 46) uniendo el
fragmento de NotI purificado sobre gel de 3 kb procedente de
pMON38207R (Figura 47) en el sitio de NotI de pMON36571 (Figura 48)
que contiene el casete de expresión p7S\alpha'::CTP1::tyrA_{E.
\ herbicola}::3' de E9. El CTP1 codifica la secuencia señal
diana cloroplástica de la subunidad pequeña de RUBISCO de
Arabidopsis. El fragmento de Notl de 3 kb contiene el casete
marcador seleccionable, pFMV::CTP2::CP4syn::3' de E9. El CTP2
codifica la secuencia señal diana cloroplástica procedente del gen
5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) de Arabidopsis. El CP4syn es un gen
sintético de EPSPS. El vector pMON36575 se digiere además con
HindIII para liberar el fragmento de 3 kb que contiene el casete de
expresión p7S\alpha'::CTP1::tyrA_{E. \ herbicola}::3' de E9. Se
redondean los extremos del fragmento rellenando los salientes de 5'
con fragmento de Klenow, se purifica sobre gel y se une por el
sitio de PmeI de pMON36576 (figura 49) que porte el casete de
expresión de p7S\alpha'::CTP2::HPPD_{Arabidopsis}::3' de E9 para
generar el pMON69924 (figura 50).
Se prepara el vector binario vegetal pMON69943
(figura 51) digiriendo pMON69929 (figura 52), que contiene el
casete de expresión p7S\alpha'::CTP2::HPPD_{Arabidopsis}::3' de
E9, con NotI y uniéndolo con el fragmento purificado sobre gel de
7,3 kb generado mediante la digestión de pMON69936 (figura 53) con
Bsp120I y NotI. Este fragmento contiene los casetes de expresión de
p7S\alpha'::CTP1::tyrA_{E. \ herbicola}::3' de E9 y
pArcelina-5::CTP1::slr1736::3' de Arcelina. Se
digiere más el vector pMON69943 con NotI y se une con un fragmento
purificado sobre gel de Bsp120I/NotI de 4,5 kb procedente de
pMON36592 (figura 54) para generar pMON69945 (figura 55). El
fragmento de pMON36592 contiene el casete de expresión de
pNapina::GGH_{Arabidopsis}::3' de napina.
Se transforma Gluycine max con los
vectores descritos según el procedimiento expuesto en el documento
WO 00/61771 A3, páginas 99-100.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los casetes de expresión génica usados
para la expresión en canola se preparan como casetes de Not I que
contenían el promotor de napina, un gen de interés y el terminador
de napina. Los genes de interés están fundidos
N-terminalmente con el péptido diana cloroplástico,
a no ser que haya presente un péptido diana cloroplástico natural.
Todas las combinaciones de genes se preparan en un solo vector de
múltiples genes.
Para facilitar la construcción de los vectores
de múltiples genes, se aíslan los casetes de expresión de Not I
mediante la digestión con Not I desde pMON16602 (figura 56),
pMON36525 (figura 57), pMON36520 (figura 38) y se clonan en
pMON36582 digerido por Eag I y purificado sobre gel (figura 19),
dando como resultado la formación de pMON58171 (figura 58) (casete
de expresión slr1736), pMON58172 (figura 59) (casete de expresión de
HPPD_{Arabidopsis}) y pMON58170 (figura 60) (casete de expresión
de tyrA_{E \ herbicola}). Todos los casetes de expresión
resultantes están flanqueados por Bsp120 I y Not I.
Se obtiene un casete de expresión dirigido por
napina para la GGH de Arabidopsis mediante el aislamiento y
la purificación sobre gel de un fragmento de Not I/Hind III de 3.191
pb procedente de pMON36591 (figura 61) y un fragmento de Not I/Hind
III de 5.612 pb procedente de pMON36588 (figura 62). Se unen estos
dos fragmentos purificados, dando como resultado la formación de
pMON36592 (figura 63). Se digiere el vector pMON36592 con Bsp120I y
Not I, se purifica sobre gel el casete de expresión de GGH y se une
en pMON36582 purificado sobre gel y digerido con Eag I (figura 19),
dando como resultado la formación de pMON58182 (figura 64).
Se obtienen vectores de múltiples genes
combinando estos cuatro genes mediante la digestión de los vectores
pMON58171, pMON58172, pMON58170 y pMON58182 con Bsp120I y Not I,
seguida por la purificación sobre gel de los fragmentos más largos
de cada constructo. Estos fragmentos contienen los casetes de
expresión de slr1736, HPPD, tyrA y GGH, respectivamente. Se unen
los casete de expresión de tyrA procedentes de pMON58170 en
pMON58171 digerido con Not I y tratado con fosfatasa alcalina,
dando como resultado la formación del vector de dos genes pMON58176
(figura 65) que contiene los casetes de expresión génica para tyrA y
slr1736, respectivamente. Se vuelve a digerir este vector con Not
I, se trata con fosfatasa alcalina y se une con el casete de
expresión de HPPD procedente de pMON58172. El vector de tres genes
resultante, pMON58183, (figura 66) contiene los casetes de
expresión de HPPD, tyrA y slr1736. Se digiere también el vector
pMON58183 con Bsp120 I, se trata con fosfatasa alcalina y se une
con el casete de expresión de GGH purificado sobre gel (véase la
purificación anterior), dando como resultado la formación de
pMON58185 (figura 67).
Se prepara el vector lanzadera pMON36593 (figura
68) (que contiene los casetes de expresión de tyrA y HPPD) uniendo
un casete de expresión de tyrA purificado sobre gel digerido con
Bsp120I/Not I procedente de pMON36589 (figura 69) en pMON36590
digerido con NotI y tratado con fosfatasa alcalina (figura 70).
Se escinden los casetes de expresión de genes
combinados mediante el digesto Bsp120 I/Not I procedente de
pMON36593 (HPPD/tyrA), pMON58183 (HPPD/tyrA/slr1736) y pMON58185
(HPPD, tyrA, slr1736, GGH). Se purifican sobre gel estos casetes de
expresión de genes combinados y se unen en pMON67162 digerido con
Not I y tratado con fosfatasa alcalina (figura 71), dando como
resultado la formación de los vectores binarios pMON58178 (figura
72), pMON58186 (figura 73) y pMON58188 (figura 74), respectivamente.
Los tres últimos vectores binarios se usan para la transformación
en canola.
<110> Valentin, Henry E.
\hskip1cmMitsky, Timothy A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes TyrA y usos de los mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 16515.149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Por ser asignada
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
03-05-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/289.527
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-05-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia herbicola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Erwinia herbicola
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (20)
1. Una molécula de ácido nucleico
sustancialmente purificada, molécula que comprende como componentes
ligados operativamente: (A) una región promotora que funciona en
una célula vegetal para generar la producción de una molécula de
ARNm; (B) una molécula de ácido nucleico heteróloga a (A), siendo la
molécula de ácido nucleico codificante de una enzima con
actividades corismato mutasa y prefenato deshidrogenasa, y que
comprende además (i) dos o más casetes de expresión, cada uno de
los cuales expresa un miembro seleccionado entre fitilprenil
transferasa procedente de Synechocystis (sir1736),
fitilprenil transferasa procedente de Arabidopsis thaliana
(ATPT2),
1-desoxixilulosa-5-fosfato
sintasa (dxs),
1-desoxixilulosa-5-fosfato
reductoisomerasa (dxr), geranilgeranil reductasa
(GGH), geranilgeranil pirofosfato sintasa (GGPPS),
p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), metil
transferasa 1 (MT1), tocoferol metil transferasa 2 (TMT2),
gamma metil transferasa (GMT), transportador de adenilato
(AANT1), tocoferol ciclasa (slr 1737) y un constructo
antisentido para la ácido homogentísico dioxigenasa, en la que la
enzima codificada por la molécula de ácido nucleico heteróloga
presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 o SEC ID N.º
4.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, molécula de ácido nucleico que comprende la
secuencia de nucleótidos de SEC ID N.º 1 o SEC ID N.º 3.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, molécula de ácido nucleico que comprende además
una secuencia no traducida en 3' que funciona en dicha célula
vegetal para provocar la terminación de la transcripción y la
adición de ribonucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la
molécula de ARNm.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico heteróloga
comprende además un casete de expresión que expresa fitil
preniltransferasa, en concreto, un casete de expresión que expresa
hidroxifenilpiruvato deshidrogenada.
5. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que dichos dos o más casetes de expresión
expresan HPPD y bien sir1736 o la ATPT2.
6. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico heteróloga
es una molécula de ácido nucleico bicatenaria.
7. Una planta transformada que tiene la molécula
de ácido nucleico de la reivindicación 1 o de la reivindicación
3.
8. La planta transformada de la reivindicación
7, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende además un
casete de expresión que expresa fitil preniltransferasa, en
concreto, un casete de expresión que expresa hidroxifenilpiruvato
deshidrogenada.
9. La planta transformada de la reivindicación
7, planta que se selecciona entre canola, maíz, Arabidopsis,
Brassica campestris, Brassica napus, soja, crambe,
mostaza, semilla de ricino, cacahuete, sésamo, semilla de algodón,
semilla de lino, cártamo, aceite de palma, lino y girasol, en
concreto, siendo dicha planta soja, canola o Brassica
napus.
10. La planta transformada de la reivindicación
7, planta que presenta niveles aumentados de tocoferol, tocotrienol,
\alpha-tocoferol,
\alpha-tocotrienol,
\gamma-tocoferol y/o
\gamma-tocotrienol en comparación con una planta
con un contexto genético similar pero que carece de dicha molécula
de ácido nucleico de la reivindicación 3, en concreto, en la que
dichos niveles están aumentados en al menos aproximadamente el 25%,
en al menos aproximadamente el 250% o en al menos aproximadamente
el 2.500% en comparación con la planta con un contexto genético
similar pero que carece de dicha molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 3.
11. La planta transformada de la reivindicación
7, en la que la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3
comprende además una secuencia dirigida a plastos, en la que dicha
secuencia dirigida a plastos está ligada operativamente a la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 para hacer que un
transcripto de dicha molécula de ácido nucleico heteróloga
codifique además una secuencia peptídica dirigida a plastos ligada
operativamente a dicha secuencia de aminoácidos.
12. Un procedimiento de producción de una planta
que tiene niveles aumentados de tocoferol, procedimiento que
comprende las etapas de:
- (A)
- transformar dicha planta con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1; y
- (B)
- cultivar dicha planta.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicha molécula de ácido nucleico comprende además un casete
de expresión que expresa fitil preniltransferasa, en concreto, un
casete de expresión que expresa hidroxifenilpiruvato
deshidrogenada.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dichos dos o más casetes de expresión expresan HPPD y
bien slr1736 o ATPT2.
15. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicha molécula de ácido nucleico está ligada a una secuencia
no traducida en 3' que funciona en la planta para provocar la
terminación de la transcripción y la adición de ribonucleótidos
poliadenilados en el extremo 3' de una molécula de ARNm, y en el que
la expresión de dicha molécula de ácido nucleico resulta en la
sobre-expresión de dicha proteína.
16. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicha planta se selecciona entre canola, maíz,
Arabidopsis, Brassica campestris, Brassica napus,
soja, crambe, mostaza, semilla de ricino, cacahuete, sésamo, semilla
de algodón, semilla de lino, cártamo, aceite de palma, lino y
girasol, en concreto, siendo dicha planta soja, canola o
Brassica napus.
17. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicha planta presenta niveles aumentados de tocoferol,
\alpha-tocoferol,
\gamma-tocoferol y/o tocotrienol en comparación
con una planta con un contexto genético similar pero que carece de
dicha molécula de ácido nucleico.
18. Un procedimiento para reducir los niveles de
tocoferol en una planta, procedimiento que comprende las etapas
de:
- (A)
- transformar dicha planta con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3, teniendo la molécula de ácido nucleico una cadena transcrita y una cadena no transcrita, en la que dicha cadena transcrita es complementaria a la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID N.º 1 o SEC ID N.º 3; y
- (B)
- cultivar dicha planta transformada.
19. Una célula que comprende la molécula de
ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 ó 5.
20. La célula de la reivindicación 19, célula
que es una célula bacteriana o una célula de alga verde azulada.
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| DE60230608D1 (de) * | 2001-05-09 | 2009-02-12 | Monsanto Technology Llc | Tyra-gene und ihre verwendung |
| WO2003016482A2 (en) | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Monsanto Technology Llc | Methyltransferase genes and uses thereof |
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| EP1546334A4 (en) * | 2002-08-05 | 2007-01-03 | Monsanto Technology Llc | GENES ASSOCIATED WITH TOCOPHEROL BIOSYNTHESIS AND USES THEREOF |
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| US7297541B2 (en) * | 2004-01-26 | 2007-11-20 | Monsanto Technology Llc | Genes encoding 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) enzymes for plant metabolic engineering |
| US7531345B2 (en) * | 2005-05-16 | 2009-05-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutations for enhanced tyrosine production |
| BRPI0621321A2 (pt) * | 2006-02-10 | 2011-12-06 | Mannatech Inc | formulações de suplemento dietético de multivitamìnico e multimineral natural para melhor absorção e utilização biológica |
| WO2010037714A1 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Basf Plant Science Gmbh | Method for producing a transgenic plant cell, a plant or a part thereof with increased resistance biotic stress |
| US9528119B2 (en) * | 2013-06-17 | 2016-12-27 | Los Alamos National Security, Llc | Transgenic cells with increased plastoquinone levels and methods of use |
| CN108588115A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-09-28 | 湖北文理学院 | 异戊烯转移酶基因作为筛选标记基因在培育转基因拟南芥植株中的应用 |
| CN112237139A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-19 | 云南省农业科学院花卉研究所 | 一种提高铁皮石斛种子变异率的诱变方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB560529A (en) | 1942-04-16 | 1944-04-07 | Distillation Products Inc | Preparation of stabilized edible substances |
| CN86105538A (zh) * | 1986-07-25 | 1988-02-24 | 平乡县粮食局油脂加工厂 | 一种食用油精炼方法 |
| US4727219A (en) | 1986-11-28 | 1988-02-23 | Agracetus | Genic male-sterile maize using a linked marker gene |
| US5922602A (en) | 1988-02-26 | 1999-07-13 | Biosource Technologies, Inc. | Cytoplasmic inhibition of gene expression |
| US5693507A (en) | 1988-09-26 | 1997-12-02 | Auburn University | Genetic engineering of plant chloroplasts |
| US5429939A (en) | 1989-04-21 | 1995-07-04 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | DNA sequences useful for the synthesis of carotenoids |
| EP0462231A4 (en) | 1989-08-01 | 1992-05-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Transcriptional activators of anthocyanin biosynthesis as visual markers for plant transformation |
| GB8928179D0 (en) | 1989-12-13 | 1990-02-14 | Ici Plc | Dna,constructs,cells and plants derived therefrom |
| US5618988A (en) | 1990-03-02 | 1997-04-08 | Amoco Corporation | Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants |
| JP3782442B2 (ja) | 1990-03-02 | 2006-06-07 | ビーピー・コーポレーション・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド | 遺伝子操作した宿主におけるカロテノイドの生合成 |
| US5684238A (en) | 1990-03-02 | 1997-11-04 | Amoco Corporation | Biosynthesis of zeaxanthin and glycosylated zeaxanthin in genetically engineered hosts |
| US5545816A (en) | 1990-03-02 | 1996-08-13 | Amoco Corporation | Phytoene biosynthesis in genetically engineered hosts |
| MY108071A (en) * | 1990-05-23 | 1996-08-15 | Pentad Foods Int | Stabilization and recovery method for tocotrienol and tocopherol products. |
| EP0531639B1 (en) | 1991-07-18 | 1999-09-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tocopherol cyclase |
| GB9204583D0 (en) | 1992-03-03 | 1992-04-15 | Unilever Plc | Recombinant plant enzyme |
| DK0668919T3 (da) | 1992-11-17 | 2003-09-15 | Du Pont | Gener for mikorsomale delta-12-fedtsyredesaturaser og beslægtede enzymer fra planter |
| AU5676394A (en) | 1992-11-20 | 1994-06-22 | Agracetus, Inc. | Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic |
| JPH08506490A (ja) | 1993-02-05 | 1996-07-16 | モンサント・カンパニー | 植物中の改変リノレン酸及びリノール酸含量 |
| US6291745B1 (en) | 1993-04-02 | 2001-09-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Limonene and other downstream metabolites of geranyl pyrophosphate for insect control in plants |
| AU7925094A (en) | 1993-09-30 | 1995-04-18 | Agracetus, Inc. | Transgenic cotton plants producing heterologous peroxidase |
| US5792903A (en) | 1993-10-25 | 1998-08-11 | Yissum Research Development Company Of Hebrew University Of Jerusalem | Lycopene cyclase gene |
| EP1203818A3 (en) | 1993-12-27 | 2002-06-12 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | DNA Strands useful for the synthesis of xanthophylls and the process for producing the xanthophylls |
| US5880332A (en) | 1994-03-01 | 1999-03-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | DNA constructs related to capsanthin capsorubin synthase, cells and plants derived therefrom |
| JP3198842B2 (ja) | 1994-03-24 | 2001-08-13 | トヨタ自動車株式会社 | ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ |
| CA2190760A1 (en) | 1994-07-18 | 1996-02-01 | Zeneca Limited | Dna, constructs, cells and plants derived therefrom |
| KR0178871B1 (ko) | 1994-08-23 | 1999-04-01 | 게이사쿠 마나베 | 케토기 도입 효소, 그를 암호화하는 dna 및 케토카로테노이드를제조하는방법 |
| DE4438232A1 (de) | 1994-10-26 | 1996-05-02 | Guenter Prof Dr Fuhr | Kryokonservierung und Tieftemperaturbearbeitung von biologischen Zellen |
| DE19501906A1 (de) | 1995-01-23 | 1996-07-25 | Basf Ag | Transketolase |
| AU5897796A (en) | 1995-05-17 | 1996-11-29 | Centre National De La Recherche Scientifique | Dna sequences encoding a lycopene cyclase, antisense sequenc es derived therefrom and their use for the modification of c arotenoids levels in plants |
| FR2734842B1 (fr) | 1995-06-02 | 1998-02-27 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides |
| JP3538998B2 (ja) | 1995-09-01 | 2004-06-14 | トヨタ自動車株式会社 | 長鎖プレニル二燐酸合成酵素 |
| JP2000500016A (ja) | 1995-11-07 | 2000-01-11 | カルジーン，インコーポレーテッド | 植物ｖｄｅ遺伝子及びそれに関連する方法 |
| US5916791A (en) | 1995-11-24 | 1999-06-29 | Hirschberg; Joseph | Polynucleotide molecule from Haematococcus pluvialis encoding a polypeptide having a β--C--4--oxygenase activity for biotechnological production of (3S,3S)astaxanthin |
| US6087563A (en) | 1996-01-29 | 2000-07-11 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Cloned arabidopsis p-hydroxyphenyl pyruvic acid dioxygenase DNA |
| BR9710855A (pt) | 1996-06-27 | 1999-08-17 | Du Pont | Fragmento de cido nucl-ico isolado gene quim-rico vetor de plasmideo c-lula hospedeira transformada planta transformada m-todo para identifica-Æo de um composto composto m-todo para conferir toler-ncia a uma planta m-todo para a produ-Æo microbiana e m-todo para sobreexpressar enzima de p-hidroxifenilpiruvato dioxigenase em uma planta |
| EA199900150A1 (ru) | 1996-07-25 | 2000-04-24 | Америкэн Сиэнамид Компани | Ген hppd и ингибиторы |
| US6429356B1 (en) | 1996-08-09 | 2002-08-06 | Calgene Llc | Methods for producing carotenoid compounds, and specialty oils in plant seeds |
| WO1998006862A1 (en) | 1996-08-09 | 1998-02-19 | Calgene Llc | Methods for producing carotenoid compounds and speciality oils in plant seeds |
| DE19730066A1 (de) | 1997-07-14 | 1999-01-21 | Basf Ag | DNA-Sequenz codierend für eine Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase und deren Überproduktion in Pflanzen |
| US6642434B1 (en) | 1997-07-25 | 2003-11-04 | University Of Community College System Of Nevada | Transgenic plants with γ-tocopherol methyltransferase |
| IL134267A0 (en) | 1997-08-01 | 2001-04-30 | Performance Plants Inc | Stress tolerance and delayed senescence in plants |
| EP1007626A4 (en) | 1997-09-02 | 2004-08-04 | Univ Washington | NUCLEIN AND AMINO ACID SEQUENCES OF A NEW TRANSKETOLASE FROM MENTHA PIPERITA |
| US5876964A (en) | 1997-10-16 | 1999-03-02 | Washington State University Research Foundation | Geranyl diphosphate synthase from mint |
| US6653530B1 (en) * | 1998-02-13 | 2003-11-25 | Calgene Llc | Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds |
| WO1999055887A2 (en) | 1998-04-24 | 1999-11-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Carotenoid biosynthesis enzymes |
| WO1999058649A1 (en) | 1998-05-13 | 1999-11-18 | University Of Maryland | Methods of modifying the production of isopentenyl pyrophosphate, dimethylallyl pyrophosphate and/or isoprenoids |
| FR2778527A1 (fr) | 1998-05-18 | 1999-11-19 | Rhone Poulenc Agrochimie | Nouvelle methode de production de tocopherols dans les plantes et plantes obtenues |
| JP4579415B2 (ja) | 1998-07-06 | 2010-11-10 | ディーシーブイ・インコーポレイテッド・ドゥーイング・ビジネス・アズ・バイオ−テクニカル・リソーシィズ | ビタミン製造方法 |
| EP1571221B1 (en) | 1998-08-04 | 2011-10-12 | CropDesign N.V. | Genes involved in tolerance to environmental stress |
| CA2339519A1 (en) | 1998-08-05 | 2000-02-17 | Sungene Gmbh & Co.Kgaa | Dna sequence coding for a 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase and the overproduction thereof in plants |
| DE19835219A1 (de) | 1998-08-05 | 2000-02-10 | Basf Ag | DNA-Sequenz codierend für eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Synthase und deren Überproduktion in Pflanzen |
| AU5572599A (en) | 1998-08-21 | 2000-03-14 | Regents Of The University Of Michigan, The | Role of human kis (hkis) as an inhibitory kinase of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. compositions, methods and uses thereof to control cell proliferation |
| EP1107662A4 (en) | 1998-08-25 | 2003-07-02 | Univ Nevada | MANIPULATION OF TOCOPHEROL RATES IN TRANSGENIC PLANTS |
| AU5812199A (en) | 1998-09-08 | 2000-03-27 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant farnesyltransferases |
| AP2001002104A0 (en) | 1998-09-22 | 2001-03-31 | Jomaa Pharmaka Gmbh | Genes of the 1-desoxy-d-xylulose biosynthetic pathway. |
| US6043072A (en) | 1998-11-05 | 2000-03-28 | Washington State University Research Foundation | Nucleic acids encoding Taxus geranylgeranyl diphosphate synthase, and methods of use |
| AU2037700A (en) | 1998-12-03 | 2000-06-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant vitamin e biosynthetic enzymes |
| AU2163300A (en) | 1998-12-04 | 2000-06-26 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Plant 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate reductoisomerase |
| AU2290900A (en) | 1999-01-15 | 2000-08-01 | Syngenta Participations Ag | Herbicide target gene and methods |
| US6281017B1 (en) | 1999-02-03 | 2001-08-28 | Washington State University Research Foundation | 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerases and method of use |
| EP1033405A3 (en) | 1999-02-25 | 2001-08-01 | Ceres Incorporated | Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby |
| AU4231600A (en) | 1999-04-12 | 2000-11-14 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants containing altered levels of sterol compounds and tocopherols |
| JP2003527077A (ja) * | 1999-04-15 | 2003-09-16 | カルジーン エルエルシー | トコフェロール合成に関与するタンパク質の核酸配列 |
| DE19918949A1 (de) | 1999-04-27 | 2000-11-23 | Basf Ag | Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in Pflanzen |
| BR0010318A (pt) | 1999-05-07 | 2002-05-28 | Pioneer Hi Bred Int | ácidos nucléicos de fitil/prenil-transferase, polipeptìdeos e uso dos mesmos |
| ATE417932T1 (de) | 1999-06-22 | 2009-01-15 | Korea Kumho Petrochem Co Ltd | Farnesylpyrophosphat-synthase (fps) aus setzlingen der sonnenblume (helianthus annus) |
| DE19931834A1 (de) | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Identifizierung und Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase in Pflanzen |
| DE19935967A1 (de) | 1999-07-30 | 2001-02-01 | Bayer Ag | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reduktionsomerase und 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Synthase |
| JP2003506046A (ja) | 1999-07-30 | 2003-02-18 | バイエル アクチェンゲゼルシャフト | １−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼおよび１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ活性の決定方法 |
| DE19937957A1 (de) | 1999-08-11 | 2001-02-15 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Homogentisat-Dioxygenase |
| US6645747B1 (en) | 1999-09-21 | 2003-11-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Cis-prenyltransferases from plants |
| BR0016432A (pt) | 1999-12-16 | 2002-09-17 | Basf Plant Science Gmbh | Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, descendentes, sementes ou material celular reproduzìvel, método de produção de um ou mais polipeptìdeo(s), tcmrp isolada, polipeptìdeo isolado, anticorpo, kit de teste, método para produzir um produto quìmico fino, produto quìmico fino, e, uso de um produto quìmico fino ou de polipeptìdeo(s). |
| DE10009002A1 (de) | 2000-02-25 | 2001-08-30 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Homogentisatphytyltransferase |
| DE60129011T2 (de) | 2000-04-14 | 2008-02-28 | Calgene Llc, Davis | Nukleinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind |
| WO2001088169A2 (en) | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Monsanto Technology Llc | Method for producing carotenoid compounds in plants |
| AR030430A1 (es) * | 2000-06-29 | 2003-08-20 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Procedimiento para la obtencion de quimicos finos por cultivo de organismos que presentan una via de shiquimato modificada, composicion de acido nucleinico, uso de dicho acido nucleinico para la obtencion de plantas transgenicas, organismo geneticamente modificado, procedimiento para la produccion d |
| AR030124A1 (es) | 2000-08-07 | 2003-08-13 | Monsanto Technology Llc | Genes de la via del fosfato de metil-d-eritritol |
| DE10046462A1 (de) | 2000-09-19 | 2002-05-29 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Verbesserte Verfahren zur Vitamin E Biosynthese |
| EP1383864B1 (en) | 2000-09-29 | 2008-01-16 | Cargill Incorporated | Isoprenoid production |
| AU2001296577A1 (en) | 2000-10-05 | 2002-04-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Chlorophyllases |
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