ES2318006T3 - Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta-amiloide. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento inmunológicamente eficaz del mismo, que comprende la secuencia dada por SEC ID N.º 9 y la secuencia dada por SEC ID N.º 10.
Description
Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido
\beta-amiloide.
Esta solicitud reivindica la prioridad del
documento US 60/287.539 presentado el 30 de abril de 2001.
La invención se refiere a anticuerpos
humanizados útiles para tratar y prevenir enfermedades humanas
asociadas con el \beta-amiloide (A\beta), tales
como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía
amiloide cerebral. El anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 ha sido
ampliamente usado en procedimientos analíticos. Tras administrar el
3D6 a un grupo de ratones PDAPP transgénicos heterocigóticos de
11,5-12 meses de edad (APP^{V717F}) a una dosis
intraperitoneal semanal de aproximadamente 10 mg/kg durante seis
meses, se publicó que los ratones habían reducido
significativamente la carga de la placa, aunque no se reveló la
ubicación específica de la reducción. [Bard, F., et al., Nature
Med. 6: 916-919 (2000); WO 00/72876 y WO
00/72880, 7 de diciembre de 2000]. Se afirmó que el anticuerpo
accedió al sistema nervioso central en suficientes cantidades como
para "empapelar" las placas de
\beta-amiloide. Finalmente, se afirmó que el 3D6
de ratón induce a la fagocitosis de la placa de amiloide en
estudios
in vitro.
in vitro.
En la publicación PCT W099/27944, publicada el
10 de junio de 1999, se describen procedimientos para administrar
A\beta1-42 agregado para provocar una respuesta
inmunológica y reducir los depósitos de amiloide. La descripción
postula que el péptido A\beta agregado de longitud completa sería
un inmunogén útil. La solicitud también indica que sería posible
usar los anticuerpos que se unen al péptido A\beta como agentes
terapéuticos alternativos. Sin embargo, esto parece ser una
especulación, pues los datos en los que se apoya esta teoría
reflejan protocolos que implican una inmunización activa mediante
el uso de, por ejemplo, A\beta1-42.
El documento WO 99/60024, publicado el 25 de
noviembre de 1999, se dirige a procedimientos para la eliminación
de amiloides mediante el uso de anticuerpos
anti-amiloides. Sin embargo, se establece que el
mecanismo utiliza la capacidad de los anticuerpos
anti-A\beta para unirse a depósitos de amiloide
pre-formados (i.e., placas) y da como resultado el
posterior aclaramiento microglial de las placas localizadas. Este
mecanismo no fue probado in vivo. Esta publicación establece
además que para que sean eficaces frente a las placas de A\beta,
los anticuerpos anti-A\beta deben ser
administrados directamente en el cerebro, porque los anticuerpos no
pueden atravesar la barrera hematoencefálica.
Queen et al. describen procedimientos
para humanizar anticuerpos [p. ej., las patentes estadounidenses
n.º
5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 6.180.370].
5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 6.180.370].
Las formas humanizadas de 3D6 son necesarias
para su uso en seres humanos que padecen el síndrome de Down o la
enfermedad de Alzheimer pre-clínica o clínica, o la
angiopatía amiloide cerebral (AAC). Sin embargo, no se sabe si es
posible humanizar los 3D6, tal que el anticuerpo humanizado conserve
las propiedades de unión del anticuerpo de ratón.
Esta invención proporciona formas humanizadas de
3D6. Estos anticuerpos humanizados tienen propiedades de unión
(afinidad y localización de epítopos) que son aproximadamente las
mismas que las del anticuerpo 3D6 de ratón. La invención incluye
anticuerpos, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos.
La invención incluye anticuerpos en los que las CDR sean las del
anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 (secuencias de SEC ID N.º 1 a
SEC ID N.º 6), y anticuerpos que conservan aproximadamente las
propiedades de unión del anticuerpo de ratón y tienen propiedades
in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las
del anticuerpo de ratón. En otro aspecto, esta invención
proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en
los que las regiones variables tienen secuencias que comprenden la
CDR del anticuerpo de ratón 3D6 y secuencias marco humanas
específicas (secuencias de SEC ID N.º 7-SEC ID N.º
10), y son anticuerpos que conservan aproximadamente las
propiedades de unión del anticuerpo de ratón y tienen propiedades
in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las
del anticuerpo de ratón 3D6. En otro aspecto, esta invención
proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en
los que la cadena ligera es la SEC ID N.º 11 y la cadena pesada es
la SEC ID N.º 12.
También forman parte de la invención las
secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos
humanizados o los fragmentos de los mismos revelados anteriormente,
vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos
codificantes de los anticuerpos humanizados o los fragmentos de los
mismos, células huésped transformadas con los vectores o que
incorporan los polinucleótidos que expresan los anticuerpos
humanizados o fragmentos de los mismos, formulaciones farmacéuticas
de los anticuerpos humanizados y de los fragmentos de los mismos
revelados en la presente memoria, y procedimientos para elaborar y
usar las mismas.
Tales anticuerpos humanizados y fragmentos de
los mismos son útiles para, entre otras cosas, tratar y prevenir
enfermedades y condiciones caracterizadas por las placas de A\beta
o la toxicidad del A\beta en el cerebro, tales como la enfermedad
de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral
en seres humanos.
La invención también incluye el uso de un
anticuerpo humanizado de la presente invención para la fabricación
de un medicamento, incluyendo la expresión prolongada de las
secuencias recombinantes del anticuerpo o del fragmento de
anticuerpo en tejidos humanos, para tratar, prevenir o invertir la
enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down o la angiopatía
amiloide cerebral, o para inhibir la formación de placas de amiloide
o los efectos de las especies de A\beta solubles tóxicas en seres
humanos.
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Hemos descubierto que, sorprendentemente, los
anticuerpos humanizados, en los que las CDR surgen del anticuerpo
monoclonal de ratón 3D6, y las partes marco y otras partes de los
anticuerpos surgen de una línea germinal humana, se unen a
A\beta-40 y a A\beta1-42 al
menos con la afinidad con la que el 3D6 de ratón se une al
A\beta. De este modo, tenemos bases razonables para creer que los
anticuerpos humanizados de esta especificidad, modificados para
reducir su inmunogenicidad mediante su conversión en una forma
humanizada, ofrecen la oportunidad de tratar, tanto profiláctica
como terapéuticamente, las condiciones en seres humanos que están
asociadas con la formación de placas de
beta-amiloide. Estas condiciones incluyen, como se
indica anteriormente, la enfermedad de Alzheimer
pre-clínica o clínica, el síndrome de Down y la
angiopatía amiloide cerebral pre-clínica y
clínica.
Como se usa en la presente memoria, la palabra
"tratar" incluye el tratamiento terapéutico, con el
conocimiento de que la condición que se va a tratar ya está
presente, y la profilaxis, i.e., la prevención, o la mejoría, de la
posible aparición en el futuro de una condición.
El término "anticuerpo" pretende significar
un anticuerpo monoclonal per se, o un fragmento
inmunológicamente eficaz del mismo, tal como un fragmento Fab, Fab'
o F(ab')_{2} del mismo. En algunos contextos, en la
presente memoria, el término "fragmentos" se mencionará
específicamente para enfatizar; no obstante, se entenderá que
independientemente de si se especifica el término "fragmentos"
o no, la palabra "anticuerpo" incluye tales fragmentos, así
como las formas monocatenarias. Siempre y cuando la proteína
conserve la capacidad para unirse específicamente a la diana
deseada, ésta está incluida en el término "anticuerpo". También
se incluyen en la definición de "anticuerpo" las formas
monocatenarias. Preferiblemente, pero no necesariamente, los
anticuerpos útiles en la invención se producen recombinantemente.
Los anticuerpos pueden estar o no glicosilados, aunque se prefieren
los anticuerpos glicosilados. Los anticuerpos están entrecruzados
adecuadamente mediante enlaces tipo disulfuro, como se sabe.
Se sabe que la unidad estructural básica del
anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto
por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par
una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena
"pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La
parte amino-terminal de cada cadena incluye una
región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos
fundamentalmente responsables del reconocimiento antigénico. La
parte carboxi-terminal de cada cadena define una
región constante fundamentalmente responsable de la función
efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican en kappa y
lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa o
épsilon, y definen el isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD
e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas pesadas y ligeras,
las regiones variables y constantes están unidas por una región
"J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo además
la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 3 o más
aminoácidos.
Las regiones variables de cada par de cadenas
ligera/pesada forman el sitio de unión de los anticuerpos. De este
modo, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Todas las
cadenas presentan la misma estructura general de regiones marco
(FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones
hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la
complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par
están alineadas por las regiones marco, lo que permite la unión a
un epítopo específico. Desde el terminal N al terminal C, tanto las
cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1,
FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada
dominio se hace conforme a las convenciones conocidas [Rabat,
"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Institutos
Nacionales de Sanidad, Bethesda, MD, 1987 y 1991; Chothia, et
al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia,
et al, Nature 342: 878-883 (1989)].
"Anticuerpo humanizado" pretende significar
un anticuerpo que está compuesto parcial o completamente por
secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de
anticuerpos humanos mediante la modificación de la secuencia de un
anticuerpo que tenga regiones determinantes de la complementariedad
no humanas (CDR). Una inmunoglobulina humanizada no engloba un
anticuerpo quimérico que tenga una región variable de ratón y una
región constante humana. Sin embargo, la región variable del
anticuerpo e incluso la CDR se humanizan mediante técnicas que son
por el momento conocidas por la técnica. Se sustituyen las regiones
marco de las regiones variables por las correspondientes regiones
marco humanas dejando la CDR no humana sustancialmente intacta. Como
se menciona anteriormente, para su uso en los procedimientos de la
invención basta con emplear un fragmento inmunológicamente
específico del anticuerpo, incluyendo los fragmentos que representan
formas monocatenarias.
Los anticuerpos humanizados tienen al menos tres
posibles ventajas frente a los anticuerpos no humanos y quiméricos
para su uso en una terapia en seres humanos:
- 1)
- como la parte efectora es humana, puede interactuar mejor con el resto de las partes del sistema inmune humano (p. ej., destruir las células diana más eficazmente mediante una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).
- 2)
- el sistema inmune humano debería reconocer la región marco o la región C del anticuerpo humanizado como foránea, y por tanto, la respuesta del anticuerpo frente a tal anticuerpo inyectado debería ser menor que la producida frente a un anticuerpo no humano totalmente foráneo o un anticuerpo quimérico parcialmente foráneo.
- 3)
- se ha publicado que los anticuerpos no humanos inyectados tienen una vida media en la circulación humana mucho más corta que la vida media de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados inyectados tendrán una vida media esencialmente idéntica a los anticuerpos humanos naturales, lo que permite la administración de dosis más bajas y menos frecuentes.
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El diseño de las inmunoglobulinas humanizadas
puede llevarse a cabo como se explica a continuación. Como para la
región marco humana, se compara una secuencia de aminoácidos de la
región marco o la región variable de una inmunoglobulina no humana
que proporciona una CDR con las secuencias correspondientes de una
colección de secuencias de región variable de inmunoglobulina
humana, y se selecciona una secuencia que tenga un porcentaje
elevado de aminoácidos idénticos. Cuando un aminoácido cae a la
siguiente categoría, se reemplaza el aminoácido de la región marco
de una inmunoglobulina humana por ser usada (inmunoglobulina
aceptora) por un aminoácido de la región marco de una
inmunoglobulina no humana que proporciona una CDR (inmunoglobulina
donante):
- (a)
- el aminoácido de la región marco humana de la inmunoglobulina aceptadora es poco habitual para la inmunoglobulina humana en esa posición, mientras que el correspondiente aminoácido en la inmunoglobulina donante es común para la inmunoglobulina humana en esa posición;
- (b)
- la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o
- (c)
- cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido de la región marco está a aproximadamente 5-6 ángstrom (de centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de la CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional [Queen, et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 86: 10029-10033 (1989), y Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88,2869 (1991)]. Cuando cada aminoácido de la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora y un aminoácido correspondiente de la inmunoglobulina donante son poco habituales para la inmunoglobulina humana en esa posición, se reemplaza tal aminoácido por un aminoácido común para la inmunoglobulina humana en esa posición.
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Un anticuerpo humanizado preferido es una forma
humanizada del anticuerpo de ratón 3D6. Las CDR del 3D6 humanizado
tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:
CDR1 de la cadena ligera:
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CDR2 de la cadena ligera:
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\vskip1.000000\baselineskip
CDR3 de la cadena ligera:
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CDR1 de la cadena pesada:
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CDR2 de la cadena pesada:
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CDR3 de la cadena pesada:
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Una región variable de la cadena ligera
preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene
la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la región marco
surge del segmento de Vk DPK19 y del segmento de J Jk4 de la línea
germinal humana:
en la
que:
el Xaa de la posición 1 es Asp o Tyr;
el Xaa de la posición 7 es Ser o Thr;
el Xaa de la posición 10 es Ser o Thr;
el Xaa de la posición 15 es Leu, IIe o Val;
el Xaa de la posición 50 es Arg o Lys;
el Xaa de la posición 88 es Val o Leu; y
el Xaa de la posición 109 es Val o Leu.
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Una región variable de la cadena pesada
preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene
la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la región marco
surge del segmento de VH DP-45 y del segmento de J
JH4 de una línea germinal humana, con varias sustituciones de
aminoácidos con respecto a los aminoácidos consenso del mismo
subgrupo humano para reducir la posible inmunogenicidad:
en la
que:
el Xaa de la posición 3 es Gln, Lys o Arg;
el Xaa de la posición 78 es Ser o Thr;
el Xaa de la posición 87 es Arg o Lys;
el Xaa de la posición 88 es Ala, Ser o Thr;
y
el Xaa de la posición 114 es Leu, Thr, lle o
Val.
Una región variable de la cadena ligera
particularmente preferida de un anticuerpo humanizado de la presente
invención tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la
región marco surge del segmento de Vk DPK19 y del segmento de J Jk4
de la línea germinal humana:
Una región variable de la cadena pesada
particularmente preferida de un anticuerpo humanizado de la presente
invención tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la
región marco surge del segmento de VH DP-45 y del
segmento de J JH4 de la línea germinal humana:
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siguiente)
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Una cadena ligera preferida para un anticuerpo
humanizado de la presente invención tiene la secuencia de
aminoácidos:
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siguiente)
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Una cadena pesada preferida para un anticuerpo
humanizado de la presente invención tiene la secuencia de
aminoácidos:
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Hay otras secuencias posibles para las cadenas
ligeras y pesadas para el 3D6 humanizado. Las inmunoglobulinas
pueden tener dos pares de complejos de cadena ligera/cadena pesada,
comprendiendo al menos una de las cadenas una o más regiones
determinantes de la complementariedad de ratón unidas funcionalmente
a los segmentos de la región marco humana.
En otro aspecto, la presente invención se dirige
a polinucleótidos recombinantes codificantes de anticuerpos que,
cuando se expresan, comprenden las CDR de las cadenas pesadas y
ligeras procedentes de un anticuerpo de la presente invención. En
la presente memoria, se ofrecen polinucleótidos ejemplares, que al
ser expresados codifican las cadenas polipeptídicas que comprenden
las CDR de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal
3D6. Debido a la degeneración de los codones, se pueden sustituir
fácilmente otras secuencias de polinucleótidos por aquellas
secuencias. Los polinucleótidos particularmente preferidos de la
presente invención codifican anticuerpos, que cuando se expresan,
comprenden las CDR de las SEC ID N.º 1-SEC ID N.º 6,
o cualquiera de las regiones variables de SEC ID N.º
7-SEC ID N.º 10, o las cadenas ligeras y pesadas de
SEC ID N.º 11 y SEC ID N.º 12.
Los polinucleótidos incluirán además comúnmente
una secuencia de polinucleótidos de control de la expresión ligada
operativamente a las secuencias codificantes de inmunoglobulina
humanizada, incluyendo las regiones promotoras asociadas de manera
natural o heterólogas. Preferiblemente, las secuencias de control de
la expresión serán sistemas promotores eucariotas de vectores
capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas,
pero también se pueden usar secuencias control para huéspedes
procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en la línea
celular huésped apropiada, se propaga la célula huésped en
condiciones adecuadas para la expresión de las secuencias de
nucleótidos y, si se desea, se puede proseguir con la recogida y la
purificación de las cadenas ligeras, las cadenas pesadas, los
dímeros o los anticuerpos intactos de cadena ligera/pesada, los
fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina.
Es posible formar las secuencias de ácidos
nucleicos de la presente invención capaces de expresar en última
instancia los anticuerpos humanizados deseados a partir de una
variedad de polinucleótidos diferentes (ADN genómico o ADNc, ARN,
oligonucleótidos sintéticos, etc.) y componentes (p. ej., regiones
V, J, D y C), usando cualquiera de una variedad de técnicas
conocidas. La unión de secuencias genómicas y sintéticas apropiadas
es un procedimiento de producción común, pero también se pueden
utilizar secuencias de ADNc.
A continuación, se presenta una secuencia de
ADNc (SEC ID N.º 17), a partir de la cual se puede expresar la
cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º
19.
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\newpage
A continuación, se presenta una secuencia de
ADNc (SEC ID N.º 18), a partir de la cual se puede expresar la
cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º
20.
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\newpage
A continuación, se presenta la secuencia
completa de un gen de la cadena ligera de 3D6 humanizado con
intrones (localizada entre los sitios Mlul y BamHI, como en
pVk-Hu3D6) (SEC ID N.º 15). El número de nucleótido
indica su posición en pVk-Hu3D6. Los exones Vk y Ck
están traducidos en un código de una sola letra; el punto indica el
codón de terminación de la traducción. La cadena ligera madura
comienza en el ácido aspártico doblemente subrayado (D). La
secuencia del intrón está en cursiva. La señal de poli(A)
está subrayada. La cadena ligera expresada corresponde a SEC ID N.º
11 cuando madura.
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(Secuencia pasa a página
siguiente)
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A continuación, se presenta la secuencia
completa de un gen de la cadena pesada de 3D6 humanizado con
intrones (localizada entre los sitios Mlul y BamHI, como en
pVg1-Hu3D6) (SEC ID N.º 16). El número de nucleótido
indica su posición en pVg1-Hu3D6. Los exones
V_{H} y C_{H} están traducidos en un código de una sola letra;
el punto indica el codón de terminación de la traducción. La cadena
pesada madura comienza en la glutamina doblemente subrayada (Q).
Las secuencias de los intrones están en cursiva. La señal de
poli(A) está subrayada. La cadena pesada expresada
corresponde a SEC ID N.º 12 cuando madura.
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\newpage
Es posible aislar las secuencias de ADN de la
región constante humana según procedimientos conocidos a partir de
una variedad de células humanas, pero preferiblemente, a partir de
células-B inmortalizadas. Las células fuente
adecuadas para las secuencias de polinucleótidos, y las células
huésped para la expresión y la secreción de inmunoglobulina se
pueden obtener a partir de un número de fuentes conocidas en la
técnica.
Además de las inmunoglobulinas humanizadas
descritas específicamente en la presente memoria, se pueden diseñar
y fabricar otras inmunoglobulinas modificadas "sustancialmente
homólogas" utilizando diversas técnicas de ADN recombinante
conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las regiones
marco pueden variar con respecto a las secuencias nativas en el
nivel de estructura primaria mediante varias sustituciones de
aminoácidos, adiciones y eliminaciones terminales e intermedias, y
similares. Además, se puede usar una variedad de diferentes
regiones marco humanas individualmente o en combinación como base
para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención. En
general, las modificaciones de los genes se pueden realizar
fácilmente mediante una variedad de técnicas conocidas, tales como
mutagénesis de sitio dirigida.
Alternativamente, se pueden producir fragmentos
polipeptídicos que sólo comprendan una parte de la estructura
primaria del anticuerpo; fragmentos que poseen una o más actividades
de la inmunoglobulina (p. ej., actividad de fijación de
complementos). Se pueden producir estos fragmentos polipeptídicos
mediante la escisión proteolítica de anticuerpos intactos mediante
procedimientos conocidos en la técnica, o insertando codones de
terminación en las puntos deseados de los vectores usando una
mutagénesis de sitio dirigida, tales como detrás de CH1 para
producir fragmentos Fab o detrás de la región bisagra para producir
fragmentos F(ab')2. Se pueden producir anticuerpos
monocatenarios uniendo VL y VH con un ligador de ADN.
Según lo afirmado anteriormente, los
polinucleótidos serán expresados en huéspedes una vez que las
secuencias hayan sido ligadas operativamente a (i.e., colocadas
para garantizar el funcionamiento de) una secuencia de control de
la expresión. Estos vectores de expresión son comúnmente duplicables
en los organismos huésped bien como episomas o como una parte
integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores
de expresión contendrán marcadores de selección, p. ej.,
tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas
células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
E. coli es un huésped procariota
particularmente útil para la clonación de los polinucleótidos de la
presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para su
uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilus, y otras
enterobacteriáceas tales como Salmonella, Serratia y
diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas,
es posible hacer también vectores de expresión, que comúnmente
contendrán las secuencias de control de la expresión compatibles
con la célula huésped (p. ej., un origen de replicación). Además,
puede estar presente cualquiera de entre un número de promotores
conocidos, tales como el sistema promotor de la lactosa, un sistema
promotor del triptófano (trp), un sistema promotor de la
beta-lactamasa o un sistema promotor del fago
Lambda. Los promotores controlarán comúnmente la expresión,
opcionalmente, con una secuencia operadora, y tendrán secuencias de
sitio de unión al ribosoma, y similares, para iniciar y completar
la transcripción y la traducción.
También se pueden usar para la expresión otros
microbios tales como la levadura. Saccharomyces es un huésped
preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control
de la expresión, tales como promotores, incluyendo la
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, y un origen de replicación, secuencias de terminación
y similares según lo deseado.
Además de microorganismos, también se puede usar
cultivo celular de tejido de mamíferos para expresar y producir los
polipéptidos de la presente invención. Las células eucariotas son
las realmente preferidas, porque se ha desarrollado un número de
líneas celulares huéspedes adecuadas capaces de secretar
inmunoglobulinas intactas en la técnica, e incluyen las líneas
celulares CHO, diversas líneas celulares COS, las líneas de células
de ovario de hámster sirio, las células HeLa, preferiblemente,
líneas celulares de mieloma, células B transformadas, líneas
celulares de riñón embrionario humano o hibridomas. Los vectores de
expresión para estas células pueden incluir secuencias de control
de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor,
un potenciador y los sitios de procesamiento de la información
necesarios tales como los sitios de unión al ribosoma, los sitios
de corte y empalme del ARN, los sitios de poliadenilación y las
secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de
control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes
de inmunoglobulina, SV40, los adenovirus, el virus del papiloma
bovino, el citomegalovirus y similares.
Los vectores que contienen las secuencias de
polinucleótidos de interés (p. ej., las secuencias codificantes de
las cadenas pesadas y ligeras, y las secuencias de control de la
expresión) se pueden transferir a la célula huésped mediante
procedimientos conocidos, que varían en función del tipo de huésped
celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se
utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el
tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden
usar para otros huéspedes celulares.
Una vez expresados, los anticuerpos se pueden
purificar mediante procedimientos estándar, incluyendo la
precipitación en sulfato de amonio, el intercambio iónico, la
afinidad, la fase inversa, la cromatografía en columna mediante
interacción hidrófoba, la electroforesis sobre gel y similares. Se
prefieren las inmunoglobulinas sustancialmente puras de una
homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95%, siendo lo más
preferido una homogeneidad del 98 al 99%, para usos farmacéuticos.
Una vez purificados, parcialmente o hasta su homogeneidad según lo
deseado, ya se pueden usar los polipéptidos terapéuticamente o
profilácticamente, como se indica en la presente memoria.
Se administran los anticuerpos (incluyendo los
fragmentos inmunológicamente reactivos) a un sujeto en riesgo de
presentar o que presenta síntomas o una patología relacionados con
el A\beta, tales como la enfermedad de Alzheimer clínica o
pre-clínica, el síndrome de Down o la angiopatía
amiloide clínica o pre-clínica, usando técnicas de
administración estándar, preferiblemente, periféricamente (i.e., no
mediante una administración en el sistema nervioso central)
mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea,
pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal,
sublingual o mediante un supositorio. Aunque es posible administrar
los anticuerpos directamente en el sistema ventricular, el fluido
espinal o el parénquima cerebral, y las técnicas para acceder a
estas zonas son conocidas en la técnica, no es necesario utilizar
estos procedimientos tan complejos. Los anticuerpos de la invención
son eficaces cuando se administran mediante las técnicas más
simples basadas en el sistema circulatorio periférico. Las ventajas
de la presente invención incluyen la capacidad del anticuerpo para
ejercer sus efectos beneficiosos incluso aunque no se proporcione
directamente en el propio sistema nervioso central. De hecho, se ha
demostrado que la cantidad de anticuerpo que atraviesa la barrera
hematoencefálica es de < 0,1% de los niveles en plasma.
Las composiciones farmacéuticas por ser
administradas están diseñadas para que sean apropiadas para el modo
de administración seleccionado, y se usan según lo apropiado
excipientes farmacéuticamente aceptables tales como, tampones,
tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes
isotónicos, agentes estabilizantes y similares. "Remington's
Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton PA, última
edición, incorporado en la presente memoria por referencia,
proporciona un compendio de técnicas de formulación conocidas por
los profesionales en general.
La concentración del anticuerpo humanizado en
las formulaciones puede variar de una concentración tan baja como
el 0,1% hasta una tan elevada como el 15 o el 20% en peso, y será
seleccionada fundamentalmente en base a los volúmenes, las
viscosidades de los fluidos, etcétera, según el modo de
administración particularmente seleccionado. De este modo, una
composición farmacéutica para inyección podría ser elaborada para
contener en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de 1 a
100 mg del anticuerpo humanizado de la presente invención. La
formulación podría ser filtrada en condiciones estériles tras su
elaboración, o convertida en microbiológicamente aceptable de otro
modo. Una composición típica para una infusión intravenosa podría
tener un volumen de tanto como 250 ml de fluido, tal como la
solución de Ringer estéril, y 1-100 mg por ml o más
de concentración de anticuerpo. Los agentes terapéuticos de la
invención se pueden congelar o liofilizar para su almacenamiento, y
reconstituirlos en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La
liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados
variables de pérdida de actividad del anticuerpo (p. ej., con
globulinas inmunes convencionales, los anticuerpos IgM tienden a
tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Puede
que sea necesario ajustar las dosis para compensar. El pH de la
formulación será seleccionado para equilibrar la estabilidad de los
anticuerpos (química y física) y para la comodidad del paciente
cuando se administre. Generalmente, se tolera un pH de entre 4 y
8.
Aunque los siguientes procedimientos parecen ser
los más convenientes y más apropiados para la administración de
proteínas tales como los anticuerpos humanizados, mediante una
adaptación adecuada, se pueden emplear otras técnicas de
administración, tales como la administración transdérmica y la
administración oral, siempre y cuando el diseño de la formulación
sea el adecuado. Además, puede ser deseable emplear formulaciones de
liberación controlada usando películas y matrices biodegradables, o
mini-bombas osmóticas, o sistemas de administración
basados en perlas de dextrano, alginato o colágeno. En resumen, hay
formulaciones disponibles para la administración de los anticuerpos
de la invención y son conocidas en la técnica, y pueden ser
seleccionadas de entre una variedad de opciones. Es posible
optimizar los niveles de dosificación más comunes usando técnicas
clínicas estándar, y dependerá del modo de administración y del
estado del paciente.
Como los ejemplos de la presente memoria
describen experimentos llevados a cabo en sistemas murinos, el uso
de anticuerpos monoclonales murinos resulta satisfactorio. Sin
embargo, en los procedimientos de tratamiento de la invención
destinados al uso humano, se prefieren las formas humanizadas de los
anticuerpos con la inmunoespecificidad correspondiente a la del
anticuerpo 3D6.
Ejemplo
1
Células y anticuerpos. Se obtuvo línea
celular de mieloma de ratón Sp2/0 de ATCC (Manassas, VA) y se
mantuvo en medio de DME que contenía SBF al 10% (n.º de cat.
SH30071.03, HyClone, Logan, UT) en una incubadora de CO_{2} a
37ºC. Primero se cultivaron células de hibridoma de 3D6 de ratón en
medio RPMI-1640 que contenía SBF al 10% (HyClone),
HEPES 10 mM, glutamina 2 mM; aminoácidos no esenciales 0,1 mM;
piruvato de sodio 1 mM; y 25 \mug/ml de gentamicina, y luego se
expandieron en medio libre de suero (SFM de hibridoma, n.º de cat.
12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) que
contenía SBF de Ig bajo al 2% (n.º de cat. 30151.03, HyClone) hasta
un volumen de 1,5 litros en frascos rotativos. Se purificó el
anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 (Mu3D6) a partir del
sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad usando
una columna de sefarosa-proteína G. Se preparó
Mu3D6 biotinilado usando
Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina
EZ-Link (n.º de cat. 21338ZZ, Pierce, Rockford,
IL).
Clonación de ADNc de la región variable.
Se extrajo ARN total de aproximadamente 10^{7} células de
hibridoma usando reactivo de TRIzol (n.º de cat.
15596-026 Life Technologies), y se aisló ARN de
poli(A)^{+} con el sistema de aislamiento de ARNm
PolyATract (n.º de cat. Z5310, Promega, Madison, WI) según los
protocolos del proveedor. Se sintetizó ADNc bicatenario usando el
equipo de amplificación de ADNc SMART^{TM}RACE (n.º de cat.
K1811-1, Clontech, Palo Alto, CA), siguiendo el
protocolo del proveedor. Se amplificaron los ADNc de las regiones
variables para las cadenas ligeras y pesadas mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores 3' que se aparearon
respectivamente con las regiones constantes de la cadena kappa y
gamma de ratón, y un cebador universal 5' proporcionado en el equipo
de amplificación de ADNc SMART^{TM}RACE. Para la PCR de las VL,
el cebador 3' tiene la secuencia:
| 5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3' | [SEC ID N.º 13] |
con los residuos 17-46 en
hibridación con la región Ck de ratón. Para la PCR de las VH, los
cebadores 3' tienen la secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
con los residuos
17-50 en hibridación con la región CH1 de la cadena
gamma de ratón. Se subclonaron los ADNc de las VL y VH en el vector
pCR4Blunt-TOPO (n.º de cat. 45-0031,
Invitrogen, Carlsbad, CA) para la determinación secuencial. La
secuenciación del ADN se llevó a cabo mediante reacciones de
secuenciación de ciclos de PCR con terminadores de cadena dideoxi
fluorescentes (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las
instrucciones del fabricante. Se analizaron las reacciones de
secuenciación sobre un secuenciador de ADN modelo 377 (Applied
Biosystems).
Construcción de regiones variables de 3D6
humanizado (Hu3D6). La humanización de las regiones V del
anticuerpo de ratón se llevó a cabo como se explica resumidamente
en Queen et al., (1989), op. cit. Se eligió el marco
de la región V humana usado como aceptor para las CDR de Mu3D6 en
base a la homología secuencial. Se usaron los programas
informáticos ABMOD y ENCAD [Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:
595-620 (1983)] para construir un modelo molecular
de las regiones variables. Se sustituyeron los aminoácidos de las
regiones V humanizadas de los que se predijo que estaban en
contacto con las CDR por los residuos correspondientes de Mu3D6.
Esto se hizo en los residuos 49, 73 y 98 de la cadena pesada y en el
residuo 41 de la cadena ligera. Los aminoácidos de la región V
humanizada que se encontraron poco comunes en el mismo subgrupo de
la región V fueron cambiados a los aminoácidos consenso para
eliminar una posible inmunogenicidad. Esto se hizo en los residuos
6 y 91 de la cadena pesada.
Se construyeron los genes de las regiones
variables de las cadenas ligeras y pesadas, y se amplificaron usando
ocho oligonucleótidos sintéticos solapantes con una longitud
variable de aproximadamente 65 a 80 bases [He, X. Y., et al., J.
Immunol. 160: 029-1035 (1998)]. Se aparearon los
oligonucleótidos por parejas y se prolongaron con el fragmento de
Klenow de la ADN polimerasa I, produciendo cuatro fragmentos
bicatenarios. Se desnaturalizaron los fragmentos resultantes, se
aparearon por parejas y se prolongaron con Klenow, produciendo dos
fragmentos. Se desnaturalizaron estos fragmentos, se aparearon por
parejas y se prolongaron una vez más, produciendo un gen de
longitud completa. Se amplificó el producto resultante mediante PCR
usando el sistema de PCR de alta fidelidad Expand (n.º de cat. 1
732 650, Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN). Se
purificaron sobre gel los fragmentos amplificados mediante PCR y se
clonaron en el vector pCR4Blunt-TOPO. Tras la
confirmación secuencial, se digirieron los genes de VL y VH con
Mlul y Xbal, se purificaron sobre gel y se subclonaron
respectivamente en vectores de expresión de cadenas ligeras y
pesadas para formar pVk-Hu3D6 y
pVg1-Hu3D6 [Co, M. S., et al., J. Immunol.
148: 1149- 1154 (1992)]. El anticuerpo 3D6 humanizado maduro
expresado a partir de estos plásmidos tiene la cadena ligera de SEC
ID N.º 11 y la cadena pesada de SEC ID N.º 12.
Transfección estable. Se realizó una
transfección estable a una línea celular de mieloma de ratón Sp2/0
mediante electroporación usando un aparato Gene Pulser (BioRad,
Hercules, CA) a 360 V y 25 \muF según lo descrito (Co, et
al., 1992, op. cit.). Antes de realizar la transfección,
se linealizaron los ADN de los plásmidos pVk-Hu3D6
y pVg1-Hu3D6 usando Fsp1 y BstZ171, respectivamente.
Se transfectaron aproximadamente 10^{7} células Sp2/0 con 20
\mug de pVk-Hu3D6 y 40 \mug de
pVg1-Hu3D6. Se suspendieron las células
transfectadas en medio de DME que contenía SBF al 10% y se
emplacaron en varias placas de 96 pocillos. Tras 48 h, se aplicó
medio de selección (medio de DME que contenía FBS al 10%,
complemento de medio de HT; 0,3 mg/ml de xantina y 1 \mug/ml de
ácido micofenólico). Se analizaron los sobrenadantes de los cultivos
en cuanto a la producción de anticuerpo mediante ELISA
aproximadamente 10 días después del inicio de la selección, como se
muestra a continuación. Se prolongaron los clones de producción
elevada en medio de DME que contenía SBF al 10% y se analizaron una
vez más en cuanto a la expresión de anticuerpo. Entonces se
adaptaron los clones seleccionados al cultivo en SFM de
hibridoma.
Medición de la expresión de anticuerpo
mediante ELISA. Se revistieron pocillos de una placa para ELISA
de 96 pocillos (placa Nunc-Immuno, n.º de cat.
439454, NalgeNunc, Naperville, IL) con 100 \mul de 1 \mug/ml
IgG de cabra anti-humana, Fc y fragmento específico,
anticuerpos policlonales (n.º de cat.
109-005-098, Jackson
ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón de
bicarbonato-carbonato de sodio 0,2M (pH 9,4) durante
una noche a 4ºC. Tras lavar con tampón de lavado (PBS que contenía
Tween 20 al 0,1%), se bloquearon los pocillos con 400 \mul de
tampón de bloqueo Superblock (n.º de cat. 37535, Pierce) durante 30
min y luego se lavaron con tampón de lavado. Se diluyeron
adecuadamente las muestras que contenían Hu3D6 en tampón de ELISA
(PBS que contenía ASB al 1% y Tween 20 al 0,1%) y se aplicaron
sobre placas de ELISA (100 \mul por pocillo). Como anticuerpo
monoclonal IgG1 anti-CD33 humanizado estándar, se
usó HuM195 (Co, et al., 1992, op. cit.). Se incubó la
placa de ELISA durante 2 h a temperatura ambiente y se lavaron los
pocillos con tampón de lavado. Luego se aplicaron a cada pocillo
100 \mul de anticuerpos policlonales kappa
anti-humanos de cabra conjugados con HRP diluidos
1/1.000 (n.º de cat. 1050-05, Southern
Biotechnology, Birmingham, AL) en tampón de ELISA. Tras incubar
durante 1 h a temperatura ambiente y lavar con tampón de lavado, se
añadieron a cada pocillo 100 \mul de sustrato de ABTS (n.º de
cat. 507602 y 506502, Kirkegaard and Perry Laboratories,
Gaithersburg, MD). Se detuvo el desarrollo del color añadiendo 100
\mul de ácido oxálico al 2% por pocillo. Se leyó la absorbancia a
415 nm usando un lector de microplacas OPTImax (Molecular Devices,
Menlo Park, CA).
Purificación de Hu3D6. Se adaptó uno de
los transfectantes estables de Sp2/0 que expresaban Hu3D6 (clon n.º
40) al cultivo en SFM de hibridoma y se amplió hasta 2 litros en
frascos rotativos. Se cosechó el sobrenadante del cultivo agotado
cuando la viabilidad de las células alcanzó el 10% o menos, y se
cargó sobre una columna de sefarosa-proteína A. Se
lavó la columna con PBS antes de eluir el anticuerpo con clorhidrato
de glicina 0,1M (pH 2,5) y NaCl 0,1M. Se sometió a diálisis la
proteína eluída frente a 3 cambios de 2 litros de PBS, y se filtró
a través de un filtro de 0,2 \mum antes de su almacenamiento a
4ºC. Se determinó la concentración de anticuerpo midiendo la
absorbancia a 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A_{280}). Se realizó una
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en
tampón de tris-glicina según los procedimientos
estándar sobre un gradiente de gel de 4-20% (n.º de
cat. EC6025, Novex, San Diego, CA). Se reduce el anticuerpo 3D6
humanizado purificado y se ejecuta sobre un gel de electroforesis
en gel de poliacrilamida-SDS. El anticuerpo entero
muestra dos bandas de pesos moleculares aproximados de 25 kDa y 50
kDa. Estos resultados coinciden con los pesos moleculares de la
cadena ligera y la cadena pesada, o con el peso molecular de las
cadenas que comprenden un fragmento, calculados a partir de las
composiciones de sus aminoácidos.
Ejemplo
2
Se comparó la eficacia de unión del anticuerpo
3D6 humanizado, sintetizado y purificado según lo descrito
anteriormente, con el anticuerpo 3D6 de ratón usando anticuerpo 3D6
de ratón biotinilado en un ELISA comparativo. Se revistieron
pocillos de una placa para ELISA de 96 pocillos (placa
Nunc-Immuno, n.º de cat. 439454, NalgeNunc) con 100
\mul de péptido \beta-amiloide
(1-42) en tampón de
bicarbonato-carbonato de sodio 0,2M (pH 9,4) (0,3
\mug/ml) durante una noche a 4ºC.
Tras lavar los pocillos con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween 20 al 0,1% (tampón
de lavado) usando un lavador de placas de ELISA, se bloquearon los
pocillos añadiendo 300 \mul de reactivo SuperBIock (Pierce) por
pocillo. Tras 30 minutos de bloqueo, se lavaron los pocillos con
tampón de lavado y se retiró el exceso de líquido.
Se añadieron por triplicado una mezcla de Mu3D6
biotinilado (0,2 \mug/ml de concentración final) y anticuerpo
competidor (Mu3D6 o Hu3D6; partiendo de una concentración final de
300 \mug/ml y haciendo diluciones en serie por triplicado) en
tampón de ELISA en un volumen final de 100 \mul por pocillo. Como
control no competidor, se añadieron 100 \mul de 0,2 \mug/ml de
Mu3D6 biotinilado. Como control de fondo, se añadieron 100 \mul
de tampón de ELISA. Se incubó la placa de ELISA a temperatura
ambiente durante 90 min. Tras lavar los pocillos con tampón de
lavado, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de 1 \mug/ml de
estreptavidina conjugada con HRP (n.º de cat. 21124, Pierce). Se
incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 min y se lavó con
tampón de lavado. Para el desarrollo del color, se añadieron 100
\mul/pocillo de sustrato de peroxidasa ABTS (Kirkegaard &
Perry Laboratories). Se detuvo el desarrollo del color añadiendo 100
\mul/pocillo de ácido oxálico al 2%. Se leyó la absorbancia a 415
nm. Se representaron las absorbancias frente al logaritmo de la
concentración de competidor, se ajustaron las curvas hasta los
puntos de datos (usando Prism) y se determinó la CI_{50} para
cada anticuerpo usando procedimientos conocidos en la técnica.
La CI_{50} media para el 3D6 de ratón fue de
2,7 \mug/ml (tres experimentos separados, desviación estándar =
0,6 \mug/ml) y para el 3D6 humanizado fue de 3,3 \mug/ml (tres
experimentos separados, desviación estándar = 0,8 \mug/ml). Se
llevó a cabo una segunda serie de tres experimentos, esencialmente
según lo descrito anteriormente, y se determinó la CI_{50} media
para el 3D6 de ratón en 3,97 \mug/ml (DE = 0,15 \mug/ml) y para
el 3D6 humanizado, se determinó la CI_{50} en 3,97 \mug/ml (DE =
0,20 \mug/ml). En base a estos resultados, se concluye que el 3D6
humanizado tiene propiedades de unión que son muy similares a las
del anticuerpo 3D6 de ratón. Por lo tanto, se espera que el 3D6
humanizado tenga actividades in vitro e in vivo muy
similares en comparación con el 3D6 de ratón y que presente en seres
humanos los mismos efectos demostrados en ratones con el 3D6 de
ratón.
Ejemplo
3
Se determinó la afinidad de los anticuerpos (KD
= Kd/Ka) usando el biosensor 2000 de BIAcore, y se analizaron los
datos con el programa informático BIAevaluation (v. 3.1). Se acopló
un anticuerpo de captura (IgG de conejo anti-ratón
o anti-humano) por los grupos amino libres a los
grupos carboxilo sobre una celda de flujo 2 de un chip biosensor
(CM5) usando
N-etil-N-dimetilaminopropil
carbodiimida y N-hidroxisuccinimida (EDC/NHS). Se
acopló IgG de conejo inespecífica a la celda de flujo 1 como control
de fondo. Se capturaron los anticuerpos monoclonales hasta producir
300 unidades de resonancia (UR). Se hizo fluir entonces
beta-amiloide 1-40 o
1-42 (Biosource International, Inc.) sobre el chip
a concentraciones decrecientes (KD de 1.000 a 0,1 veces). Para
regenerar el chip, se eluyó anticuerpo anti-A\beta
unido desde el chip usando un lavado con clorhidrato de glicina (pH
2). Una inyección de control que no contenía
beta-amiloide sirvió como control para la
sustracción de línea de base. Los diagramas del sensor que
demostraban las fases de asociación y disociación fueron analizados
para determinar la Kd y la Ka. Se determinó la afinidad (KD) del
anticuerpo de ratón 3D6 por el A\beta 1-42 en 2,4
nM, y la afinidad del 3D6 humanizado, preparado esencialmente según
lo descrito en el ejemplo 1, se determinó en 2,3 nM.
Ejemplo
4
El BIAcore es un sistema biosensor automático
para medir las interacciones moleculares [Karlsson R., et al. J.
Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)]. La
ventaja del BIAcore frente a otros análisis de unión es que se
puede medir la unión del antígeno sin tener que marcar ni
inmovilizar el antígeno (i.e., el antígeno mantiene una
configuración más nativa). La metodología BIAcore se usó para
evaluar la unión de diversos fragmentos de péptido
beta-amiloide con bien 3D6 de ratón o 3D6 humanizado
(preparados sustancialmente según lo descrito en el ejemplo 1).
Todas las diluciones se realizaron con solución salina tamponada con
HEPES que contenía Tween 20. Se usó una sola concentración de una
variedad de fragmentos de A\beta humano o A\beta
1-40 de ratón (BioSource International). Los
fragmentos de beta-amiloide humano
1-10 y 1-20 se unieron con el 3D6
de ratón y con el 3D6 humanizado, mientras que los fragmentos de
A\beta humano 10-20 y 16-25 no se
unieron con ningún anticuerpo. Ni el 3D6 de ratón ni el 3D6
humanizado se unieron con el A\beta 1-40 de ratón.
Mediante el uso de esta metodología, el epítopo de unión tanto para
el 3D6 de ratón como para el 3D6 humanizado parece estar entre los
aminoácidos 1 y 10 del A\beta humano.
Ejemplo
5
A no ser que se indique lo contrario, todos los
estudios usaron ratones transgénicos APP^{V717F} (PDAPP) y todas
las inyecciones fueron i.p. En general, un grupo control de ratones
recibió inyecciones de solución salina.
Seis semanas de inyección semanal de 360 \mug
de 3D6 en ratones hemicigóticos viejos (24 meses) descendió el
A\beta_{total} insoluble en el hipocampo en un 10% y el A\beta
1-42 en un 1% (N.S., no significativo
estadísticamente) en 9 animales por grupo de control y 10 animales
por grupo de anticuerpo. En el córtex, el A\beta_{total}
insoluble medio fue reducido en un 33% y el A\beta
1-42 en un 47% (p < 0,05), mientras que el
A\beta1-40 aumentó en un 100%.
En ratones de 4 meses de edad hemicigóticos, la
administración de 360 \mug de 3D6 por animal: 1) aumentó los
niveles medios de A\beta 1-40 y A\beta
1-42 en plasma aproximadamente 6 veces más y 9 veces
más, respectivamente, a las 24 horas de la administración; y 2) no
tuvo un efecto significativo sobre el A\beta 1-40
soluble en el córtex tras 24 horas en comparación con el control de
solución salina (5 animales por grupo). En otro estudio con ratones
de 3 meses de edad hemicigóticos, la administración de 360 \mug de
3D6 por animal aumentó los niveles medios de A\beta
1-42 en plasma en aproximadamente 8 veces más a las
24 horas de la administración.
La administración de 360 \mug de 3D6 por
animal (5 animales por grupo, control de solución salina): aumentó
los niveles medios de A\beta 1-40 y A\beta
1-42 en plasma aproximadamente 92 veces más y 32
veces más, respectivamente, a las 24 horas de la administración (p
< 0,05); descendió el A\beta 1-40 insoluble
cortical en un 42% (p < 0,05) y el A\beta 1-42
en un 27% (N.S.), pero aumentó el A\beta_{total} en un 35%
(N.S.); no tuvo un efecto constante o significativo sobre el
A\beta 1-40, el A\beta 1-42 o el
A\beta_{total} soluble o insoluble en el hipocampo tras 24
horas; en el cerebelo, aumentó el A\beta 1-42
soluble en un 80% (p < 0,001) y el A\beta_{total} en un 68%
(N.S.), pero descendió el A\beta 1-40 soluble en
un 6% (N.S.); y en el cerebelo, descendió el A\beta
1-40, el A\beta 1-42 y el
A\beta_{total} insoluble en un 35% (p < 0,01), en un 21%
(N.S.) y en un 12% (N.S.), respectivamente.
En ratones jóvenes, la administración de 360
\mug de 3D6 por animal (5 por grupo): 1) aumentó los niveles
medios de A\beta 1-42 en plasma aproximadamente 3
veces más a las 24 horas de la administración; y 2) en el córtex,
descendió el A\beta 1-40 insoluble en
aproximadamente el 10% y aumentó el A\beta 1-42
insoluble en aproximadamente el 12%.
Se realizaron estudios para evaluar los efectos
del 3D6 sobre la formación de complejos de A\beta:anticuerpo
estables en fluidos biológicos, las concentraciones de A\beta en
plasma exactamente después de la administración, el rendimiento
cognitivo tras una administración aguda o crónica, y la deposición
de A\beta extraído con guanidina y detectado
inmunohistoquímicamente (en el cerebro) tras la administración
crónica.
Se inyectaron 360 \mug de 3D6 a ratones (de 3
meses de edad). Veinticuatro horas después de la administración del
anticuerpo, se recogió plasma y se resolvieron las proteínas
mediante electroforesis sobre gel en condiciones nativas (no
desnaturalizantes) sobre un gel de poliacrilamida. Tras la
transferencia de proteínas partidas a una matriz sólida, se
inmunodetectaron los complejos con anticuerpo biotinilado y se
visualizaron con un aumento de la quimioluminiscencia. A diferencia
de otros ciertos anticuerpos anti-A\beta, no se
detectó ningún complejo con 3D6.
Se inyectó 3D6 a ratones jóvenes (de
2-3 meses de edad). Se recogió plasma en diversos
momentos posteriores a la administración del anticuerpo y se
determinaron diversas especies de A\beta mediante un ELISA de tipo
sándwich. La administración de 3D6 dio como resultado un aumento
dependiente de la dosis y del tiempo de los niveles de A\beta en
plasma. Los niveles de A\beta_{1-40} aumentaron
hasta un mayor grado que los niveles de
A\beta_{1-42} tras la administración de 3D6. En
un estudio adicional, se trataron ratones tg APP^{V717F} jóvenes
con 360 \mug de 3D6 y se midieron los niveles de A\beta en
plasma a la 0,5, 3, 6 y 24 h de la inyección. El 3D6 aumentó los
niveles de A\beta en plasma de una manera dependiente del
tiempo.
Se ha realizado una amplia caracterización del
comportamiento de los ratones tg APP^{V717F} usando varios
paradigmas de la memoria (presión de la barra, laberinto radial de 8
brazos, reconocimiento de objetos). Estos ratones tienen dañadas
varias tareas de aprendizaje y de la memoria, y los déficit en la
tarea de reconocimiento de objetos (RO) empeoran con la edad. Por
lo tanto, se ha usado la tarea de RO para evaluar el aprendizaje y
la memoria en ratones tg APP^{V717F}. El rendimiento de la tarea
de RO depende preferiblemente de la integridad del lóbulo temporal
medio (cortezas perirrinal y entorrinal). El análisis del RO se basa
en la tendencia espontánea de los roedores para explorar
preferiblemente un objeto nuevo frente a uno conocido.
El primer día de la prueba, se dejó que los
ratones se habituaran a una cámara de campo abierto durante 50
minutos. El día siguiente, se volvieron a colocar los ratones en el
campo abierto para dos pruebas de 10 min. Durante la prueba uno, se
dejó que los ratones exploraran el campo abierto en presencia de un
objeto (p. ej., una canica o un dado). Tras un intermedio de 3
horas, se volvieron a colocar los ratones en el campo abierto con
el objeto conocido (el mismo objeto explorado anteriormente durante
la prueba 1), así como con un objeto nuevo. Se registró el tiempo
empleado en explorar el nuevo objeto, así como el empleado en el
objeto conocido, y se calculó un índice de reconocimiento para cada
ratón (la proporción del tiempo empleado en explorar el nuevo
objeto x 100/tiempo total empleado en explorar los dos objetos). La
administración de 360 \mug de 3D6 por animal 24 horas antes de la
sesión de habituación en ratones tg APP^{V717F} de
11-12 meses de edad mejoró el rendimiento del RO en
2 de los 8 ratones analizados
(p < 0,05).
(p < 0,05).
Se administraron inyecciones semanales de PBS y
de 72, 217 y 360 \mug de una IgG inespecífica o 3D6 (n =
19-30) durante 5 meses a ratones tg homocigóticos
(de 5-6 meses de edad). En una necropsia, se
extirparon los cerebros y se procesaron para los análisis de ELISA
para el A\beta y los análisis inmunohistoquímicos de la carga de
A\beta parenquimal. Se homogeneizaron los tejidos corticales y del
hipocampo en PBS. Se extrajo posteriormente A\beta insoluble en
PBS de los sedimentos mediante la homogenización en clorhidrato de
guanidina 5,5M. Tras la homogenización, se sometieron las muestras
a un ligero movimiento de rotación durante al menos 24 horas antes
de la centrifugación y la recogida del extracto de guanidina. Se
almacenaron las preparaciones de tejido solubles en PBS y extraídas
con guanidina a -80ºC para las posteriores determinaciones del
A\beta mediante ELISA. Se llevó a cabo un análisis
inmunohistoquímico (IHC) de la carga de A\beta parenquimal como
se explica a continuación. Se marcaron ocho (8) \mum de tejidos
fijados en paraformaldehído incluidos en parafina con anticuerpo
anti-A\beta policlonal de conejo (frente a
A\beta 15-30), siguiendo con la detección
fluorescente de IgG anti-conejo. Se examinaron ocho
(8) secciones de cerebro (7 IHC, 1 control) de cada animal. El
tratamiento con 3D6 (360 \mug) redujo notable y significativamente
el A\beta1-42 extraído con guanidina cortical
(mediante ELISA) y la carga de la placa de A\beta cortical y del
hipocampo (mediante IHC), pero no se observó ningún efecto a dosis
inferiores de 3D6. Aunque no se observó ningún efecto sobre el
A\beta1-42 extraído con guanidina a dosis
inferiores de 3D6, estas dosis redujeron significativamente la carga
de la placa de A\beta cortical y del hipocampo (mediante
IHC).
Se administró 3D6 radiomarcado (15
\muCi/ratón; 0,5 mg/ratón) a ratones ICR (no transgénicos) para
evaluar las cinéticas y la distribución cerebral del anticuerpo
tras su administración por vía intravenosa. Las cinéticas en plasma
de la inmunorreactividad del 3D6 demostraron una vida media de
eliminación de aproximadamente 5 días. La radiactividad
precipitable en TCA fue mayor del 95% de los recuentos en plasma
totales realizados durante el estudio, y descendió en el
compartimento plasmático con una vida media terminal de
3-4 días. La observación de que la radiactividad
plasmática permaneciera predominantemente precipitable en TCA a lo
largo del estudio sugiere que el anticuerpo radiomarcado no fue
significativamente degradado proteolíticamente, y que el marcador
de 125-I no fue escindido del anticuerpo en el
transcurso del estudio. Las formas de los perfiles de concentración
frente a tiempo medidos mediante ELISA y la radiactividad fueron
generalmente similares, con algunas diferencias en las fases
terminales. No se produjo una acumulación aparente del radiomarcador
en ningún tejido, incluyendo el cerebro. La distribución de la
radiactividad hacia el cerebro fue mínima. No es posible distinguir
claramente la cantidad de radiactividad asociada con las muestras
cerebrales en este experimento de la contaminación generada por el
compartimento sanguíneo durante el procesamiento de los tejidos o
del anticuerpo asociado con las células endoteliales de la
vasculatura
cerebral.
cerebral.
Se administró PBS, una IgG inespecífica o 3D6
(500 \mug/semana) a ratones hemicigóticos de nueve meses de edad
mediante una inyección semanal durante seis meses (PBS, 11 animales,
IgG, 13 animales; y 3D6, 14 animales). Se observó un descenso del
A\beta débil, pero estadísticamente significativo, en el córtex
(en comparación con la IgG) y en el hipocampo (en comparación con
la IgG o los controles con PBS/IgG combinados). El análisis
inmunohistoquímico (IHC) mostró fuertes reducciones en la carga de
la placa de A\beta en el córtex y en el hipocampo de los ratones
tratados con 3D6 (reducciones del 94% y del 85%, respectivamente,
frente al control de PBS; p < 0,05 y p < 0,01,
respectivamente).
\newpage
Ejemplo
6
Se administró una preparación de anticuerpo
anti-A\beta que comprendía una cadena ligera que
tenía la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 11 y una cadena
pesada que tenía la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 12 (un
3D6 humanizado) como una sola inyección en bolo intravenoso a dos
grupos de 12 monos titíes macho a dosis de 1 y 10 mg/kg. Las
concentraciones de anticuerpo anti-A\beta
inmunorreactivo descendieron con una vida media de eliminación de
aproximadamente 4 días. Los parámetros de C_{max} y ABC aumentaron
proporcionalmente entre los niveles de dosis de 1 y 10 mg/kg. La
administración de 3D6 humanizado a los monos titíes dio como
resultado un aumento de 18 o 29 veces mayor de la inmunorreactividad
del A\beta_{1-40} en plasma tras 8 horas, en
comparación con las concentraciones de las dosis previas de los
grupos de dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente. Los animales a
ambos niveles de dosis presentaron concentraciones de
inmunorreactividad del A\beta_{1-40} por encima
de los niveles de la línea de base hasta 2 semanas después de la
administración del anticuerpo. El análisis cinético de las
concentraciones de inmunorreactividad de
A\beta_{1-40} mostró que la vida media de
eliminación de la inmunorreactividad del
A\beta_{1-40} era comparable a la del anticuerpo
(\sim4 días). También se evaluaron las farmacocinéticas del 3D6
humanizado en monos cynomolgus macho tras una sola
administración intravenosa de 1 mg/kg. El análisis de la
inmunorreactividad mostró que el 3D6 humanizado fue eliminado del
plasma con una vida media de aproximadamente 11-12
días.
<110> Eli Lilly y Compañía
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpos humanizados
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X14958
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/287539
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-04-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asp o Tyr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Leu, lle o Val
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Lys
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (88)..(88)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Leu
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (109)..(109)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gln, Lys o Arg
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (78)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (87)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Lys
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (88)..(88)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala, Ser o Thr
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)..(114)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Leu, Thr, lle o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebadador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebadador de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.953
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3.244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<230>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 468
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> anticuerpo humanizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un anticuerpo monoclonal, o un fragmento
inmunológicamente eficaz del mismo, que comprende la secuencia dada
por SEC ID N.º 9 y la secuencia dada por SEC ID N.º 10.
2. Un anticuerpo monoclonal que comprende una
cadena ligera que comprende la secuencia dada por SEC ID N.º 9 y una
cadena pesada que comprende la secuencia dada por SEC ID N.º 10.
3. Un anticuerpo monoclonal que tiene una cadena
ligera de la secuencia dada por SEC ID N.º 11 y una cadena pesada
de la secuencia dada por SEC ID N.º 12.
4. El anticuerpo monoclonal o un fragmento
inmunológicamente eficaz del mismo según la reivindicación 1, en el
que dicho fragmento es un fragmento Fab o F(ab')2.
5. El anticuerpo monoclonal o un fragmento
inmunológicamente eficaz del mismo según la reivindicación 1, en el
que dicho fragmento es una cadena única.
6. Un compuesto polinucleotídico que comprende
una secuencia codificante del anticuerpo o del fragmento de una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
7. Una célula que es capaz de expresar el
anticuerpo o el fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones
1-5.
8. Una composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo o el fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones
1-5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Uso del anticuerpo monoclonal o del fragmento
de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para
la fabricación de un medicamento destinado a tratar la enfermedad
de Alzheimer clínica o preclínica.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28753901P | 2001-04-30 | 2001-04-30 | |
| US287539P | 2001-04-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2318006T3 true ES2318006T3 (es) | 2009-05-01 |
Family
ID=23103359
Family Applications (2)
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