ES2905311T3 - Anticuerpos anti-transtiretina - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a transtiretina que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-transtiretina

Antecedentes

Se piensa que diversas enfermedades son provocadas por el plegamiento anormal y la agregación de proteínas específicas de la enfermedad. Estas proteínas pueden acumularse en acumulaciones patológicas de diagnóstico, conocidas como amiloides, las cuales se visualizan por ciertas manchas histológicas. Se cree que los amiloides provocan respuestas inflamatorias y tienen múltiples consecuencias negativas para los tejidos involucrados. Además, los agregados más pequeños de proteínas anormalmente plegadas pueden existir y ejercen efectos citotóxicos.

La transtiretina (TTR) es una de las muchas proteínas que son conocidas por plegarse de forma incorrecta y agregar (por ejemplo, se someten a amiloidogénesis). La amiloidosis relacionada con transtiretina engloba dos formas de enfermedad: enfermedad familiar derivada del mal plegamiento de una TTR mutada o variante y una enfermedad esporádica, no genética causada por la mala agregación de TTR de tipo silvestre. El proceso de amiloidogénesis de TTR puede causar patología en el sistema nervioso y/o el corazón, así como en otros tejidos.

Sumario de la invención reivindicada

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a transtiretina que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. Algunos de estos anticuerpos de la invención tienen un isotipo IgG1 humano. Algunos de estos anticuerpos de la invención tienen un isotipo IgG2 o IgG4 humano.

Algunos anticuerpos comprenden tres CDR de cadena pesada Kabat (SEQ ID NO: 10-12, respectivamente) y tres CDR ligeras (SEQ ID NO: 18-20, respectivamente) del anticuerpo 6C1. En algunos anticuerpos, la cadena pesada CDR-H1 es un compuesto Kaba-Chothia CDR-H1 (SEQ ID NO: 63). Algunos de estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Algunos de estos anticuerpos son anticuerpos quiméricos, humanizados, revestidos o humanos. Algunos de estos anticuerpos tienen un isotipo IgG1 humano. Algunos de estos anticuerpos tienen un isotipo IgG2 o IgG4 humano.

Algunos anticuerpos son anticuerpos 6C1 humanizados o quiméricos que se unen específicamente a transtiretina, en donde 6C1 es un anticuerpo de ratón caracterizado por una región variable de cadena pesada madura de SEQ ID NO:1 y una región variable de cadena ligera madura de SEQ ID NO:13.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura humanizada comprende las tres CDR de cadena pesada de 6C1 y la región variable de cadena ligera madura humanizada comprende las tres CDR de cadena ligera de 6C1. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura humanizada comprende las tres CDR de cadena pesada Kabat de 6C1 (SEQ ID NO: 10-12) y la región variable de cadena ligera madura humanizada comprende las tres CDR de cadena ligera Kabat de 6C1 (SEQ ID NO: 18-20).

En anticuerpos de la invención, la región variable de cadena pesada madura humanizada tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 9 y la región variable de cadena ligera madura humanizada tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 17. En algunos de estos anticuerpos, la posición H77 está ocupada por T. En algunos de estos anticuerpos, la posición H49 está ocupada por A. En algunos de estos anticuerpos, las posiciones H76 y H82(a) están ocupadas por S. En algunos de estos anticuerpos, la posición H49 está ocupada por A. En algunos de estos anticuerpos, las posiciones H19, H44, H83 y H89 están ocupadas por K, R, K y M, respectivamente. En algunos de estos anticuerpos, la posición H49 está ocupada por A. En algunos de estos anticuerpos, la posición L45 está ocupada por K. En algunos de estos anticuerpos, la posición L2 está ocupada por V.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En algunos anticuerpos de la invención, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En algunos anticuerpos de la invención, la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En algunos anticuerpos, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16. En anticuerpos de la invención, la región variable de cadena pesada madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y la región variable de cadena ligera madura tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

En algunos anticuerpos de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo intacto (un tetrámero que comprende un par de cadenas ligeras y un par de cadenas pesadas). En algunos anticuerposde la invención, el anticuerpo es un fragmento de enlace. En algunos de estos anticuerpos de la invención, el fragmento de enlace es un anticuerpo de cadena simple, fragmento Fab o Fab'2.

En algunos anticuerpos de la invención, la región variable de cadena ligera madura está fusionada con una región constante de cadena ligera y la región variable de cadena pesada madura está fusionada con una región constante de cadena pesada. En algunos de estos anticuerpos de la invención, la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante de cadena pesada humana natural que ha reducido el enlace a un receptor Fcy en relación con la región constante de cadena pesada humana natural. En algunos de estos anticuerpos de la invención, la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1. En algunos de dichos anticuerpos de la invención, la región variable de cadena pesada madura está fusionada con una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 26 y/o la región variable de cadena ligera madura está fusionada con una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 28.

En algunos anticuerpos, cualquier diferencia en las CDR de la región variable de cadena pesada madura y la región variable de cadena ligera madura de las SEQ ID NO: 1 y 13, respectivamente, residen en las posiciones H60-H65.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos de la invención mencionados anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos de la invención mencionados anteriormente. En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende uno de estos ácidos nucleicos. En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped transformada con uno de estos vectores de expresión recombinante.

También se desvela un método de humanización de un anticuerpo, comprendiendo el método:

(a) seleccionar un anticuerpo aceptor;

(b) identificar los residuos de aminoácidos del anticuerpo de ratón que se retiene;

(c) sintetizar un ácido nucleico que codifica una cadena pesada humanizada que comprende CDR de la cadena pesada del anticuerpo de ratón y un ácido nucleico que codifica una cadena ligera humanizada que comprende CDR de la cadena ligera del anticuerpo del ratón; y

(d) expresar los ácidos nucleicos en una célula hospedadora para producir un anticuerpo humanizado;

en donde el anticuerpo de ratón comprende una región variable de cadena pesada madura que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.

También se desvela un método de producción de un anticuerpo humanizado, quimérico o revestido, comprendiendo el método:

(a) cultivar células transformadas con ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, por lo que las células segregan el anticuerpo; y

(b) purificar el anticuerpo de los medios de cultivo celular;

en donde el anticuerpo es una forma humanizada, quimérica o revestida de 6C1.

También se desvela un método de producción de una línea celular que produce un anticuerpo humanizado, quimérico o revestido, comprendiendo el método:

(a) introducir un vector de codificación de cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo y un marcador seleccionable en las células;

(b) propagar las células en condiciones para seleccionar las células que han incrementado el número de copias del vector;

(c) aislar células individuales de las células seleccionadas; y

(d) colocar las células clonadas en bancos de una sola célula seleccionada en función de la producción de anticuerpos;

en donde el anticuerpo es una forma humanizada, quimérica o revestida de 6C1.

Algunos métodos comprenden además la propagación de las células en condiciones selectivas y cribado de líneas celulares que expresan de forma natural y secretan al menos 100 mg/l/106 células/24 h.

También se desvela un método para inhibir o reducir la agregación de transtiretina en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, inhibiendo o reduciendo de este modo la agregación de transtiretina en el sujeto.

También se desvela un método para inhibir o reducir la formación fibrilar de transtiretina en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, inhibiendo o reduciendo de este modo la acumulación de transtiretina en el sujeto.

También se desvela un método para reducir los depósitos de transtiretina en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, reduciendo de este modo los depósitos de transtiretina en el sujeto.

También se desvela un método para aclarar la transtiretina agregada en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, eliminando de este modo la transtiretina agregada del sujeto en relación con un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina que no ha recibido el anticuerpo.

También se desvela un método para estabilizar una conformación no tóxica de transtiretina en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar una amiloidosis mediada por transtiretina, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente, estabilizando de este modo una conformación no tóxica de transtiretina en el sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para su uso en el tratamiento o para efectuar profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, comprendiendo el uso administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos de la invención mencionados anteriormente.

También se desvela un método para retrasar la puesta en marcha de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un régimen eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos de la invención mencionados anteriormente. Algunos de estos métodos comprenden además la detección del enlace del anticuerpo a la transtiretina, en donde la presencia del anticuerpo enlazado indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. Algunos de estos métodos comprenden además la comparación del enlace del anticuerpo a la muestra biológica con el enlace del anticuerpo a una muestra de control, por lo cual el enlace incrementado del anticuerpo a la muestra biológica en relación con la muestra de control indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina.

En algunos de estos métodos, la muestra biológica y la muestra de control comprenden células del mismo origen de tejido. En algunos de estos métodos, la muestra biológica y/o la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejido sólido. En algunos de estos métodos, el tejido sólido es de corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tubo digestivo.

En algunos usos, la amiloidosis mediada por transtiretina es una amiloidosis de transtiretina familiar o una amiloidosis de transtiretina esporádica. En algunos de estos usos, la amiloidosis de transtiretina familiar es miocardiopatía amiloidea familiar (FAC), polineuropatía amiloidea familiar (FAP) o amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). En algunos de estos usos, la amiloidosis de transtiretina esporádica es amiloidosis sistémica senil (SSA) o amiloidosis cardíaca senil (SCA).

En algunos usos, la amiloidosis mediada por transtiretina se asocia con la acumulación de amiloide en el corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tubo digestivo del sujeto.

También se desvela un método para detectar la presencia o ausencia de depósitos de transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto sospechoso de comprender la acumulación de amiloide con una cantidad eficaz de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. Algunos de estos métodos comprenden además la detección del enlace del anticuerpo a la transtiretina, en donde la detección del anticuerpo enlazado indica que la presencia de depósitos de transtiretina. Algunos de estos métodos comprenden además la comparación del enlace del anticuerpo a la muestra biológica con el enlace del anticuerpo a una muestra de control, por lo cual el enlace incrementado del anticuerpo a la muestra biológica en relación con la muestra de control indica que el sujeto tiene una amiloidosis mediada por transtiretina. En algunos de estos métodos, la muestra biológica y la muestra de control comprenden células del mismo origen de tejido. En algunos de estos métodos, la muestra biológica y/o la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejido sólido. En algunos de estos métodos, el tejido sólido es de corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tubo digestivo.

También se desvela un método para determinar un nivel de depósitos de transtiretina en un sujeto, que comprende administrar cualquiera de los anticuerpos antes mencionados y detectar la presencia del anticuerpo enlazado en el sujeto. En algunos de estos métodos, se determina la presencia de anticuerpo enlazado por tomografía de emisión de positrones (PET).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una alineación de regiones variables de cadena pesada del anticuerpo 6C1 de ratón, anticuerpos modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 6C1.

La Figura 2 muestra una alineación de regiones variables de cadena ligera del anticuerpo 6C1 de ratón, anticuerpos modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones humanizadas del anticuerpo 6C1.

Figuras 3A y 3B: La Figura 3A muestra la curva de enlace de los anticuerpos 5A1, 6C1, 9D5 y 14G8 murinos con TTR tratadas con ph4. La Figura 3B muestra la curva de enlace de los anticuerpos 5A1,6C1, 9D5 y 14G8 murinos con TTR tratadas con ph4 o nativos.

Figuras 4A, 4B y 4C: La Figura 4A muestra la inhibición de la formación de fibra de TTR-Y78F por los anticuerpos mis-TTR. La Figura 4B muestra la inhibición de la formación de fibra de TTR-V122I por 14G8. La Figura 4C muestra la inhibición de la formación de fibra de TTR-V122I por un anticuerpo de control.

Figuras 5A y 5B: La Figura 5A muestra un análisis de densitometría de un análisis de transferencia de Western de muestras de plasma de pacientes confirmados para ATTR V30M (muestra n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25 y n.° 27) y de muestras de sujetos normales (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) usando el anticuerpo mis-TTR 9D5. La Figura 5B muestra un análisis de densitometría de un análisis de transferencia de Western de las mismas muestras utilizando el anticuerpo mis-TTR 5A1.

La Figura 6 muestra un ensayo de placa de MesoScale Discovery (MSD) de muestras de plasma de pacientes confirmados para ATTR V30M (muestra n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y de las muestras de sujetos normales (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) usando el anticuerpo 6C1.

Figuras 7A y 7B: La Figura 7A muestra el efecto del anticuerpo 14G8 en la captación de TTR F87M/L110M por las células THP-1. La Figura 7B muestra el efecto de cada uno de los anticuerpos mis-TTR en la captación de TTR V30M por las células THP-1.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 de ratón.

La SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de aminoácidos del esquema de estructura de la región variable de cadena pesada del ratón.

La SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos del aceptor variable de cadena pesada número de referencia ADX65650.

La SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1 (Hu6C1VHv1).

La SEQ ID NO: 5 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1b (Hu6C1VHv1b).

La SEQ ID NO: 6 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2 (Hu6C1VHv2).

La SEQ ID NO: 7 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2b (Hu6C1VHv2b).

La SEQ ID NO: 8 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 3 (Hu6C1VHv3).

La SEQ ID NO: 9 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 3b (Hu6C1VHv3b).

La SEQ ID NO: 10 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H1 de Kabat del anticuerpo 6C1 de ratón. La SEQ ID NO: 11 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H2 de Kabat del anticuerpo 6C1 de ratón. La SEQ ID NO: 12 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-H3 de Kabat del anticuerpo 6C1 de ratón. La SEQ ID NO: 13 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 de ratón.

La SEQ ID NO: 14 establece la secuencia de aminoácidos del esquema de estructura de la región variable de cadena ligera de ratón.

La SEQ ID NO: 15 establece la secuencia de aminoácidos del aceptor variable de cadena ligera número de referencia ABI74084.

La SEQ ID NO: 16 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 de ratón versión 1 (Hu6C1VLv1).

La SEQ ID NO: 17 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2 (Hu6C1VLv2).

La SEQ ID NO: 18 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L1 de Kabat del anticuerpo 6C1 de ratón. La SEQ ID NO: 19 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L2 de Kabat del anticuerpo 6C1 de ratón. La SEQ ID NO: 20 establece la secuencia de aminoácidos de CDR-L3 de Kabat del anticuerpo 6C1 de ratón. La SEQ ID NO: 21 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 22 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 23 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 24 establece la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 de ratón con péptido señal.

La SEQ ID NO: 25 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada IgG1 ejemplar. La SEQ ID NO: 26 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada IgG1 Glm3 ejemplar.

La SEQ ID NO: 27 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada IgG1 Glm3 ejemplar.

La SEQ ID NO: 28 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera con arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 29 establece la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera sin arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 30 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1.

La SEQ ID NO: 31 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1b.

La SEQ ID NO: 32 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2.

La SEQ ID NO: 33 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2b.

La SEQ ID NO: 34 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 3.

La SEQ ID NO: 35 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 3b.

La SEQ ID NO: 36 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1.

La SEQ ID NO: 37 establece la secuencia de aminoácidos de la región de cadena ligera del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2.

La SEQ ID NO: 38 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de incorporación P02766.1 (UniProt).

La SEQ ID NO: 39 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de referencia AAB35639.1 (GenBank).

La SEQ ID NO: 40 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de incorporación AAB35640.1 (GenBank).

La SEQ ID NO: 41 establece la secuencia de aminoácidos de transtiretina humana establecida en el número de referencia y ABI63351.1 (GenBank).

La SEQ ID NO: 42 establece la secuencia de aminoácidos de residuos 89-97 de transtiretina humana.

La SEQ ID NO: 43 establece la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno

de transtiretina potencial. La SEQ ID NO: 44 establece la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno

de transtiretina potencial. La SEQ ID NO: 45 establece la secuencia de aminoácidos de un inmunógeno

de transtiretina potencial. La SEQ ID NO: 46 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena pesada IgG1 Glm3 ejemplar.

La SEQ ID NO: 47 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera ejemplar con arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 48 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región constante de cadena ligera ejemplar sin arginina N-terminal.

La SEQ ID NO: 49 establece la secuencia de aminoácidos de un péptido señal de región constante de cadena pesada. La SEQ ID NO: 50 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de región constante de cadena pesada.

La SEQ ID NO: 51 establece la secuencia de aminoácidos de un péptido señal de región constante de cadena ligera. La SEQ ID NO: 52 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de región constante de cadena ligera.

La SEQ ID NO: 53 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región de cadena ligera variable 6C1 de ratón.

La SEQ ID NO: 54 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región de cadena pesada variable 6C1 de ratón.

La SEQ ID NO: 55 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1 (Hu6C1VHv1).

La SEQ ID NO: 56 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1b (Hu6C1VHv1b).

La SEQ ID NO: 57 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2 (Hu6C1VHv2).

La SEQ ID NO: 58 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2b (Hu6C1VHv2b).

La SEQ ID NO: 59 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 3 (Hu6C1VHv3).

La SEQ ID NO: 60 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada del anticuerpo 6C1 humanizado versión 3b (Hu6C1VHv3b).

La SEQ ID NO: 61 establece una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 humanizado versión 1 (Hu6C1VLv1).

La SEQ ID NO: 62 establece la secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera del anticuerpo 6C1 humanizado versión 2 (Hu6C1VLv2).

La SEQ ID NO: 63 establece la secuencia de aminoácidos de un CDR-H1 compuesto (residuos 26-35) del anticuerpo 6C1 de ratón.

Definiciones

Los anticuerpos monoclonales u otras entidades biológicas se encuentran normalmente en forma aislada. Esto significa que un anticuerpo u otras entidades biológicas por lo regular son por lo menos 50 % p/p puros de proteínas interferentes y otros contaminantes derivados de su producción o purificación, pero no excluye la posibilidad de que el anticuerpo monoclonal se combine con un exceso de portador(es) farmacéuticamente aceptable(s) u otros vehículos destinados a facilitar su uso. A veces los anticuerpos monoclonales son al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % p/p puros de proteínas y contaminantes que interfieren de la producción o de la purificación. A menudo, un anticuerpo monoclonal aislado u otra entidad biológica es la especie macromolecular predominante que permanece después de su purificación.

El enlace específico de un anticuerpo a su antígeno objetivo significa una afinidad de por lo menos 106, 107, 108, 109 o 1010 M-1. El enlace específico es perceptiblemente mayor en magnitud y distinguible de un enlace no específico que ocurre en al menos un objetivo no relacionado. El enlace específico puede ser el resultado de la formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o un ajuste espacial particular (por ejemplo, tipo llave y cerradura) mientras que el enlace no específico es generalmente el resultado de fuerzas de van der Waals. El enlace específico sin embargo no necesariamente implica que un anticuerpo se une a uno y solo un objetivo.

La unidad estructural básica del anticuerpo es un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más secuencias de aminoácidos principalmente responsables para el reconocimiento del antígeno. Esta región variable se expresa inicialmente vinculado a un péptido señal escindible. La región variable sin el péptido señal se denomina a veces como una región variable madura. Así, por ejemplo, una región variable de cadena ligera madura significa una región variable de cadena ligera madura sin el péptido señal de cadena ligera. La porción carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos. Véase, en general, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2a ed. Raven, Press N.Y., 1989, Cap. 7.

Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (también conocida en el presente documento como “dominio de variable de cadena ligera” (“dominio VL”) o “dominio de variable de cadena pesada” (“dominio VH”), respectivamente) consiste en una región de “marco” interrumpida por tres “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. Las regiones de marco sirven para alinear las CDR para enlazar de manera específica a un epítopo de un antígeno. Las CDR incluyen los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son principalmente responsables del enlace de antígeno. Del extremo amino al extremo carboxilo, los dominios tanto VL como VH comprenden las siguientes regiones de marco (FR) y CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VL también se denominan en el presente documento, respectivamente, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3; Las CDR 1, 2 y 3 de un dominio VH también se denominan en el presente documento, respectivamente, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3.

La asignación de aminoácidos para cada dominio VL y VH se realiza de acuerdo con cualquier definición convencional de las CDR. Las definiciones convencionales incluyen la definición de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991), la definición de Chothia (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); un compuesto de CDR de Chothia Kabat en la cual el CDR-H1 es un compuesto de las CDR de Chothia y Kabat; la definición de AbM utilizada por el software de modelado de anticuerpos de Oxford Molecular; y la definición de contacto de Martin et al (bioinfo.org.uk/abs) (Ver Tabla 1). Kabat brinda una amplia convención de numeración (numeración de Kabat) en donde a los residuos correspondientes entre las diferentes cadenas pesadas o entre las diferentes cadenas ligeras se asigna el mismo número. Cuando se dice que un anticuerpo comprende CDR por una cierta definición de las CDR (por ejemplo, Kabat), esa definición especifica la cantidad mínima de residuos de CDR presente en el anticuerpo (es decir, las CDR de Kabat). Esto no excluye que otros residuos caigan dentro de otra definición de CDR convencional pero también se presenta fuera de la definición especificada. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende CDR definido por Kabat incluye, entre otras posibilidades, un anticuerpo en el cual las CDR contienen residuos de CDR de Kabat y ningún otro residuo de CDR y un anticuerpo en el cual CDR H1 es un compuesto de CDR H1 de Chothia-Kabat y otras CDR contienen residuos de CDR de Kabat y ningún residuo de CDR adicional basado en otras definiciones.

Tabla 1

________________________ (continuación)________________________

Definiciones convencionales de CDR usando numeración de Kabat Bucle Kabat Chothia Chothia y AbM Contacto Kabat

* CDR-H1 por Chothia puede terminar en H32, H33 o H34 (dependiendo de la longitud del bucle). Esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat coloca inserciones de residuos extras en 35A y 35B, mientras que la numeración de Chothia las coloca en 31A y 31B. Si ni H35A ni H35B (numeración de Kabat) están presentes, el bucle de CDR-H1 de Chothia termina en H32. Si solo H35A está presente, termina en H33. Si están presentes tanto H35A como H35B, termina en H34.____________________________________________

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y sus fragmentos de unión. Por lo general, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se obtuvieron para el enlace específico al objetivo incluyendo cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, nanocuerpos y Fv. Los fragmentos se pueden producir por técnicas de ADN recombinante, o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término “anticuerpo” también incluye un anticuerpo biespecífico y/o un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo artificial híbrido con dos pares de cadenas pesadas/ligeras y dos sitios de enlace diferentes (ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). En algunos anticuerpos biespecíficos, los dos pares de cadena pesada/ligera diferentes incluyen un par de cadena pesada/cadena ligera 6C1 humanizado, y un par de cadena pesada/cadena ligera específico para un epítopo sobre transtiretina diferente a los enlazados por 6C1.

En algunos anticuerpos biespecíficos, un par de cadena pesada/cadena ligera es un anticuerpo 6C1 humanizado como se desvela en mayor detalle más adelante y el otro par de cadena ligera/cadena pesada es de un anticuerpo que se une a un receptor expresado en la barrera hematoencefálica, tal como un receptor de insulina, un receptor de factor de crecimiento insulínico (IGF), un receptor de leptina o un receptor de lipoproteína, o un receptor de transferrina (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Tal anticuerpo biespecífico puede transferirse a través de la barrera hematoencefálica por transcitosis mediada por receptor. La captación cerebral del anticuerpo biespecífico puede ser mejorada diseñando el anticuerpo biespecífico para reducir su afinidad al receptor de la barrera hematoencefálica. La afinidad reducida para el receptor dio lugar a una distribución más amplia en el cerebro (ver, por ejemplo, Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med.

3, 84ra44, 2011).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares también pueden ser: (1) un anticuerpo de dominio dual variable (DVD-Ig), en donde cada cadena ligera y cada cadena pesada contiene dos dominios variables en tándem a través de un enlace peptídico corto (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, En: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) un Tandab, que es una fusión de dos diacuerpos que dan lugar a un anticuerpo biespecífico tetravalente que tiene dos sitios de unión para cada uno de los antígenos objetivo; (3) un cuerpo flexible, que es una combinación de scFv con un diacuerpo que da lugar a una molécula multivalente; (4) una de las llamadas moléculas de "anclaje y bloqueo" (dock andlock), basada en el "dominio de dimerización y anclaje" en la Proteína Cinasa A, que, cuando se aplica a Fab, puede producir una proteína de unión biespecífica trivalente que consiste en dos fragmentos Fab idénticos ligados a un fragmento Fab diferente; o (5) una de las llamadas moléculas Escorpión, que comprende, por ejemplo, dos scFv fusionados a ambos terminales de una región de Fc humana. Los ejemplos de plataformas útiles para la preparación de anticuerpos biespecíficos incluyen BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab y Mab2 (F-star), IgG1 diseñado con Fc (Xencor) o DuoBody (basado en el intercambio de rama de Fab, Genmab).

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une un anticuerpo. Un epítopo puede formarse a partir de los aminoácidos contiguos o no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una o más proteínas. Los epítopos formados a partir de los aminoácidos contiguos (también conocidos como epítopos lineales) se conservan normalmente en exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario (también conocido como epítopos conformacionales) normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye por lo menos 3 y, más generalmente, por lo menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nucleares bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). El epítopo puede ser lineal, tal como un epítopo de, por ejemplo, 2-5, 3-5, 3-9 o 5-9 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 38. El epítopo puede ser también un epítopo conformacional que incluye, por ejemplo, dos o más segmentos no contiguos de aminoácidos dentro de los residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 38. Si se dice que un anticuerpo se enlaza a un epítopo dentro de los aminoácidos 89-97 de la transtiretina (TTR), por ejemplo, significa que el epítopo se encuentra dentro del intervalo enumerado de aminoácidos que incluye los que definen los límites externos del intervalo. Esto no significa necesariamente que cada aminoácido dentro del intervalo constituya parte del epítopo. Por consiguiente, por ejemplo, un epítopo dentro de los aminoácidos 89-97 de TTR puede consistir en los aminoácidos 89-97, 89-96, 90-96, 91-96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 u 89-93, dentro de otros segmentos lineales de la SEQ ID NO:42 o, en el caso de los epítopos conformacionales, los segmentos no contiguos de los aminoácidos de la SEQ ID NO:42.

Los anticuerpos que reconocen los mismos epítopos o epítopos superpuestos pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para competir con el enlace de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. El epítopo de un anticuerpo puede definirse también por cristalografía de rayos X del anticuerpo unido a su antígeno para identificar residuos de contacto. Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo reducen o eliminan el enlace del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan el enlace de un anticuerpo, reducen o eliminan el enlace del otro.

La competencia entre anticuerpos se determina por un ensayo en el que un anticuerpo sometido a prueba inhibe el enlace específico de un anticuerpo de referencia a un antígeno común (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Un anticuerpo de prueba compite con un anticuerpo de referencia si un exceso de un anticuerpo de prueba (por ejemplo, por lo menos 2x, 5x, 10x, 20x o 100x) inhibe el enlace del anticuerpo de referencia en al menos el 50 % de acuerdo con lo medido en un ensayo de enlace competitivo. Algunos anticuerpos de prueba inhiben el enlace del anticuerpo de referencia en al menos el 75 %, 90 % o 99 %. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competencia (anticuerpos que compiten) incluyen anticuerpos enlazados al mismo epítopo como el anticuerpo de referencia y los anticuerpos enlazados a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico.

El término "nativo" con respecto a la transtiretina estructural (TTR) se refiere a la estructura plegada normal de TTR en su estado de funcionamiento apropiado (es decir, un tetrámero TTR). Como TTR es un tetrámero en su forma plegada nativa, las formas no nativas de TTR incluyen, por ejemplo, tetrámeros TTR mal plegados, monómeros TTR, formas agregadas de TTR y formas fibrilares de TTR. Las formas no nativas de TTR pueden incluir moléculas que comprenden secuencias de aminoácidos de TTR de tipo silvestre o mutaciones.

La expresión "mal plegado" con respecto a TTR se refiere a la estructura secundaria y terciaria de un monómero o multímero de polipéptido de TTR e indica que el polipéptido ha adoptado una conformación que no es normal para esa proteína en su estado de funcionamiento apropiado. Aunque el mal plegamiento de TTR puede ser causado por mutaciones en la proteína (por ejemplo, eliminación, sustitución o adición), las proteínas de TTR de tipo silvestre también pueden estar mal plegadas en enfermedades, exponiendo epítopos específicos.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que el portador, diluyente, excipiente o auxiliar es compatible con los demás ingredientes de la formulación y no sustancialmente perjudicial para el receptor del mismo.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y de otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Una persona está en mayor riesgo de contraer una enfermedad si el sujeto tiene al menos un factor de riesgo conocido (por ejemplo, genético, bioquímico, historial familiar y exposición situacional) lo que pone a personas con ese factor de riesgo en mayor riesgo estadísticamente significativo de desarrollar la enfermedad que los individuos sin el factor de riesgo.

La expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra de material biológico dentro u obtenible desde una fuente biológica, por ejemplo, un sujeto humano o mamífero. Estas muestras pueden ser órganos, orgánulos, tejidos, secciones de tejidos, fluidos corporales, sangre periférica, plasma sanguíneo, suero de la sangre, células, moléculas tales como proteínas y péptidos y cualquier parte o combinación derivada de los mismos. La expresión muestra biológica también puede abarcar cualquier material derivado por el procesamiento de la muestra. Los materiales derivados pueden incluir células o sus descendientes. El procesamiento de la muestra biológica puede implicar uno o más de la filtración, destilación, extracción, concentración, fijación, inactivación de componentes que interfieren y similares.

La expresión “muestra de control” se refiere a una muestra biológica no conocida o sospechada de incluir formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de transtiretina (TTR), tales como en los depósitos amiloides de TTR. Las muestras de control pueden obtenerse de los individuos no afectados con una amiloidosis de TTR o un tipo elegido específicamente de la amiloidosis de TTR. De manera alternativa, las muestras de control pueden obtenerse de pacientes aquejados de amiloidosis de TTR o un tipo elegido específicamente de la amiloidosis de TTR. Dichas muestras pueden obtenerse al mismo tiempo como una muestra biológica pensada para comprender la amiloidosis de TTR o en una ocasión diferente. Una muestra biológica y una muestra de control pueden obtenerse ambas del mismo tejido (por ejemplo, una sección de tejido que contiene tanto depósitos amiloides de TTR, como tejido normal circundante). Preferiblemente, las muestras de control consisten esencialmente o exclusivamente en tejido libre de depósitos amiloides de TTR y pueden utilizarse en comparación con una muestra biológica pensada para comprender depósitos amiloides de TTR. Preferiblemente, el tejido en la muestra de control es del mismo tipo que el tejido en la muestra biológica (por ejemplo, los cardiomiocitos en el corazón).

El término “enfermedad” se refiere a cualquier condición anormal que impide la función biológica. El término se utiliza ampliamente para abarcar cualquier trastorno, enfermedad, anomalía, patología, afección, padecimiento o síndrome en el cual se impide la función fisiológica, independientemente de la naturaleza de la etiología.

El término “síntoma” se refiere a una evidencia subjetiva de una enfermedad, como la alteración del paso, percibida por el sujeto. Un "signo" se refiere a evidencia objetiva de una enfermedad según lo observado por un médico.

Para efectos de la clasificación de sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras, los aminoácidos se agrupan como sigue: Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofílicas neutrales): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras implican sustituciones entre los aminoácidos de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras constituyen el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra.

La identidad porcentual de secuencias se determina con secuencias de anticuerpo alineadas al máximo por la convención de numeración de Kabat. Después de la alineación, si una región del anticuerpo sujeto (por ejemplo, toda la región variable de una cadena pesada o ligera) se está comparando con la misma región de un anticuerpo de referencia, la identidad de secuencia de porcentaje entre las regiones de anticuerpo sujeto y de referencia es el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido en las regiones del anticuerpo sujeto y el de referencia divididas por el número total de puestos alineados de las dos regiones, con espacios no contados, multiplicados por 100 para convertir a porcentaje.

Las composiciones o métodos “que comprenden” o “que incluyen” uno o más elementos citados pueden incluir otros elementos no citados específicamente. Por ejemplo, una composición que “comprende” o “ incluye” un anticuerpo puede contener el anticuerpo solo o en combinación con otros ingredientes.

La designación de un intervalo de valores incluye todos los enteros dentro de o que definen el intervalo y todos los subintervalos definidos por enteros dentro del intervalo.

A menos que lo contrario sea evidente por el contexto, el término "aproximadamente" abarca valores dentro de un margen de error de medición (por ejemplo, EEM) estándar de un valor declarado.

La significación estadística significa p<0,05.

Las formas singulares de los artículos “un/una”, “uno/una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por ejemplo, la expresión “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

Descripción detallada

I. General

La invención proporciona anticuerpos que enlazan específicamente los residuos 89-97 de transtiretina (TTR). Los anticuerpos tiene la capacidad de enlazarse a formas monoméricas, mal plegadas, agregados o de fibrilla de TTR. Los anticuerpos pueden utilizarse para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de TTR o la acumulación de depósitos de TTR (por ejemplo, amiloidosis de TTR). Los anticuerpos también pueden utilizarse para diagnosticar la amiloidosis de TTR e inhibir o reducir la agregación de TTR, entre otras aplicaciones.

II. Moléculas Objetivo

La transtiretina (TTR) es una proteína de transporte de 127 aminoácidos y 55 kDa de suero y líquido cefalorraquídeo sintetizada principalmente por el hígado. También se ha denominado prealbúmina, prealbúmina que se une a tiroxina, ATTR y TBPA. En su estado nativo, TTR existe como un tetrámero. En los homocigotos, los tetrámeros comprenden subunidades idénticas ricas en láminas beta de 127 aminoácidos. En los heterocigotos, los tetrámeros de TTR se componen de subunidades variantes y/o de tipo silvestre, normalmente combinadas de una manera estadística.

La función establecida de TTR en la sangre es transportar proteína de unión a ho/o-retinol. Aunque TTR es el portador principal de tiroxina (T4) en la sangre de los roedores, que utiliza lugares de enlace que son ortogonales a los utilizados por la proteína de unión a holo-retinol, los sitios de enlace T4 están en la práctica desocupados en los seres humanos.

TTR es una de al menos treinta proteínas humanas diferentes cuyo mal plegamiento y/o mal ensamblaje (amiloidogénesis) extracelular en un espectro de estructuras de agregado se piensa que ocasiona enfermedades degenerativas denominadas enfermedades amiloides. TTR experimenta cambios conformacionales para volverse amiloidogénico. El despliegue parcial expone tramos de residuos hidrofóbicos en su mayoría sin carga en una conformación extendida que se ensambla mal de manera eficiente en agregados esféricos principalmente desestructurados que al final experimentan conversión de conformación en las estructuras amiloides de lámina beta transversal.

A menos que lo contrario sea evidente por el contexto, la referencia a transtiretina (TTR) o sus fragmentos o dominios incluyen las secuencias de aminoácidos humanas naturales que incluyen isoformas, mutantes y variantes alélicas de las mismas. Las secuencias de polipéptidos de TTR ejemplares son designadas por los números de acceso P02766.1(UniProt) (SEQ ID NO: 38), AAB35639.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 39), AAB35640.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 40) y ABI63351.1 (GenBank) (SEQ ID NO: 41). Los residuos se numeran de acuerdo con el Protocolo suizo P02766.1, con el primer aminoácido del residuo de designado 1 de proteína madura (es decir, que no incluye la secuencia de señal de aminoácido 20). En cualquier otra proteína TTR, los residuos están numerados de acuerdo con los residuos correspondientes en P02766.1 de alineación máxima.

III. Amiloidosis de trantiretina

La amiloidosis de transtiretina (TTR) es un trastorno sistémico caracterizado por TTR patógena, mal plegada y la deposición extracelular de fibrillas amiloides compuestas de TTR. La amiloidosis de TTR es causada generalmente por la desestabilización de la forma de tetrámero de TTR nativa (debida a las condiciones ambientales o genéticas), que conducen a la disociación, mal plegamiento y agregación de TTR en fibrillas amiloides que se acumulan en varios órganos y tejidos, causando la disfunción progresiva. Ver, por ejemplo, Almeida y Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

En los seres humanos, tanto los tetrámeros de TTR de tipo silvestre, como los tetrámeros mixtos comprendidos por mutantes y subunidades de tipo silvestre se pueden disociar, plegar mal y agregar, conduciendo el proceso de amiloidogénesis a la degeneración del tejido post-mitótico. Por consiguiente, la amiloidosis de TTR abarca enfermedades causadas por TTR mal plegada patógena que resulta de las mutaciones en TTR o que resulta de TTR mal plegada, no mutada.

Por ejemplo, la amiloidosis sistémica senil (SSA) y la amiloidosis cardíaca senil (SCA) son tipos de amiloidosis relacionados con la edad que resultan de la deposición de amiloide de TTR de tipo silvestre fuera y dentro de los cardiomiocitos del corazón. La amiloidosis de TTR también es la forma más común de amiloidosis hereditaria (familiar), la cual es causada por mutaciones que desestabilizan la proteína TTR. La amiloidosis de TTR asociada con las mutaciones puntuales en el gen TTR incluyen la polineuropatía amiloidótica familiar (FAP), la miocardiopatía amiloidea familiar (FAC) y la amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA) poco frecuente. Los pacientes con amiloidosis de TTR hereditaria (familiar) casi siempre son heterocigotos, lo que significa que los tetrámeros de TTR se componen de subunidades de TTR mutantes y/o de tipo silvestre, generalmente distribuidas de manera estadística. Las versiones hereditarias (familiares) de amiloidosis de TTR son generalmente autosómicas dominantes y habitualmente aparecen antes que las enfermedades esporádicas (SSA y SCA).

Existen más de 100 mutaciones en el gen TTR de codificación que se han implicado en los trastornos autosómicos dominantes FAP y FAC. Ver, por ejemplo, documento US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutate. 17(6):493-503 (2001); Damas y Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet y Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Estas mutaciones causantes de amiloide están distribuidas a lo largo de toda la molécula de TTR. Por lo general, cuanto más desestabilizantes sean las subunidades mutantes para la estructura del tetrámero de TTR, antes se iniciará la enfermedad amiloide. El potencial patógeno de una variante de TTR generalmente se determina por una combinación de su inestabilidad y su eficiencia de secreción celular. La patología inicial causada por algunas variantes de TTR viene de su destrucción selectiva del tejido cardíaco, mientras que la de otras variantes de TTR viene de poner en riesgo el sistema nervioso autónomo y periférico. El daño del tejido causado por la amiloidogénesis de TTR parece surgir en gran medida por la toxicidad de los agregados pequeños, difundibles de TTR, aunque la acumulación de amiloide extracelular puede contribuir y seguramente compromete la estructura del órgano en las etapas tardías de la amiloidosis de TTR.

La amiloidosis de TTR se presenta en muchas formas diferentes, con variación fenotípica considerable entre los individuos y las ubicaciones geográficas. Por ejemplo, la amiloidosis de TTR puede presentarse como una neuropatía progresiva, autónoma sensorial axonal y motora. La amiloidosis de TTR puede también presentarse como una miocardiopatía infiltrativa.

La edad de comienzo de los síntomas relacionados con la enfermedad varía entre la segunda y novena décadas de la vida, con grandes variaciones entre diferentes poblaciones. La implicación multisistémica de la amiloidosis de TTR es una pista para su diagnóstico. Por ejemplo, el diagnóstico de la amiloidosis de TTR se considera cuando uno o varios de los siguientes se encuentran presentes: (1) antecedentes familiares de la enfermedad neuropática, especialmente asociados con la insuficiencia cardíaca; (2) dolor neuropático o alteraciones sensoriales progresivas de etiología desconocida; (3) síndrome del túnel carpiano sin una causa obvia, particularmente si es bilateral y requiere la liberación quirúrgica; (4) alteraciones de la motilidad gastrointestinal o disfunción del sistema nervioso autónomo de etiología desconocida (por ejemplo, disfunción eréctil, hipotensión ortostática, vejiga neurogénica); (5) cardiopatía caracterizada por paredes ventriculares engrosadas en ausencia de hipertensión; (6) bloqueo auriculoventricular avanzado de origen desconocido, particularmente cuando se acompaña de un corazón engrosado; y (6) inclusiones de cuerpo vítreo del tipo algodonoso. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Otros síntomas pueden incluir, por ejemplo, polineuropatía, pérdida sensorial, debilidad en extremidades inferiores, dishidrosis, diarrea, estreñimiento, pérdida de peso e incontinencia/retención urinaria.

El diagnóstico de amiloidosis de TTR se basa habitualmente en las biopsias de órganos objetivo, seguido por tinción histológica del tejido suprimido con el tinte específico de amiloide Rojo Congo. Si se observa una prueba positiva para amiloide, se realiza posteriormente tinción inmunohistoquímica para TTR para asegurar que la proteína precursora responsable de la formación amiloide sea en efecto TTR. Para las formas familiares de la enfermedad, es neesaria, entonces, una demostración de una mutación en el gen que codifica TTR antes de poder hacer un diagnóstico. Esto puede lograrse, por ejemplo, a través de electroforesis de enfoque isoeléctrico, reacción en cadena de la polimerasa o espectrometría de masas en tándem-cromatografía de líquidos/disección láser. Ver, por ejemplo, documento US 2014/0056904; Ruberg y Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).

IV. Anticuerpos

A. Especificidad del enlace y las propiedades funcionales

La invención proporciona anticuerpos monoclonales que enlazan a la proteína transtiretina (TTR), más específicamente, con los epítopos dentro de los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 42) de TTR. Estos epítopos se entierran en el tetrámero de TTR nativo y se exponen en formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR.

Un anticuerpo designado 6C1 es un anticuerpo de ratón ejemplar de este tipo. Este anticuerpo se enlaza específicamente dentro de los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 42) de TTR. Este anticuerpo además se caracteriza por su capacidad de enlazar formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR pero no a formas tetraméricas nativas de TTR. Además, este anticuerpo se caracteriza por su immunorreactividad en el tejido cardíaco de amiloidosis mediada por TTR pero no en el tejido cardíaco sano. La capacidad de enlazarse a proteínas o fragmentos específicos del mismo puede demostrarse utilizando formatos de análisis ejemplares proporcionados en los ejemplos.

Algunos anticuerpos se unen al mismo epítopo o al epítopo superpuesto como un anticuerpo designado 6C1. Las secuencias de las regiones variables maduras de cadena pesada y ligera de 6C1 se designan como SEQ ID NO: 1 y 13, respectivamente. Otros anticuerpos que tienen esta especificidad de enlace pueden ser producidos mediante la inmunización de ratones con TTR, o una porción de la misma que incluye el epítopo deseado (por ejemplo, SEQ ID NO: 42) y el cribado de anticuerpos resultantes para el enlace a TTR monomérica o un péptido que comprende SEQ ID NO: 42, opcionalmente en competición con un anticuerpo que tiene las regiones variables de 6C1 de ratón (IgG1, kappa). Los fragmentos de TTR que incluyen el epítopo deseado pueden enlazarse a un portador que ayuda a obtener respuesta de un anticuerpo al fragmento y/o combinarse con un adyuvante que ayuda a provocar dicha respuesta. Estos anticuerpos pueden seleccionarse para el enlace diferencial a versiones monoméricas de tipo silvestre de TTR o un fragmento de las mismas (por ejemplo, SEQ ID NO: 38) en comparación con los mutantes de residuos especificados. La selección de estos mutantes define con más precisión la especificidad de enlace para permitir la identificación de anticuerpos cuyo enlace es inhibido por mutagénesis de residuos particulares y los cuales pueden compartir las propiedades funcionales de otros anticuerpos ejemplificados. Las mutaciones pueden ser sustitución de reemplazo sistemático con alanina (o serina si una alanina ya está presente) un residuo cada vez, o intervalos separados más ampliamente, a lo largo del objetivo o a lo largo de una sección del mismo en el cual se sabe que reside un epítopo. Si el mismo conjunto de mutaciones reduce el enlace de dos anticuerpos, los dos anticuerpos enlazan el mismo epítopo.

Los anticuerpos con la especificidad de enlace de un anticuerpo murino seleccionado (por ejemplo, 6C1) también pueden producirse usando una variante del método de presentación de fagos. Ver Winter, WO 92/20791. Este método es particularmente conveniente para la producción de anticuerpos humanos. En este método, ya sea la región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo murino seleccionado se utiliza como material de partida. Si, por ejemplo, una región variable de cadena ligera es seleccionada como material de partida, se construye una biblioteca de fagos en la cual los miembros muestran la misma región variable de cadena ligera (es decir, el material murino de partida) y una región variable de cadena pesada diferente. Las regiones variables de cadena pesada pueden obtenerse, por ejemplo, de una biblioteca de regiones variables de cadena pesada humana reordenadas. Se selecciona un fago que muestra fuerte enlace específico (por ejemplo, por lo menos 108 y preferiblemente por lo menos 109 M'1) para TTR monomérica o un fragmento de la misma (por ejemplo, residuos de aminoácidos 89-97). La región variable de cadena pesada de este fago entonces sirve como material de partida para la construcción de otra biblioteca de fagos. En esta biblioteca, cada fago muestra la misma región variable de cadena pesada (es decir, la región identificada a partir de la primera biblioteca de visualización) y una región variable de cadena ligera. Las regiones variables de cadena ligera pueden obtenerse, por ejemplo, de una biblioteca de las regiones de la cadena ligera variable humana reordenadas. De nuevo, se selecciona el fago que muestra enlace específico fuerte para TTR monomérica o un fragmento de la misma (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 89-97). Los anticuerpos resultantes tienen generalmente la especificidad del epítopo idéntica o similar al material murino de partida.

Otros anticuerpos pueden obtenerse mediante mutagénesis del ADNc que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo ejemplar, como 6C1. Anticuerpos monoclonales que son al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticos a 6C1 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera maduras y mantienen sus propiedades funcionales y/o que difieren de los respectivos anticuerpos por un pequeño número de sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), supresiones o inserciones de aminoácidos funcionalmente insignificantes se incluyen también en la invención. Los anticuerpos monoclonales con al menos una o las seis CDR definidas por definición convencional, pero preferiblemente Kabat, que son 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idénticas a las CDR correspondientes de 6C1 también se incluyen.

La invención proporciona también anticuerpos que tienen algunas o todas (por ejemplo, 3, 4, 5 y 6) las CDR completa o sustancialmente de 6C1. Estos anticuerpos pueden incluir una región variable de cadena pesada que tiene al menos dos, y usualmente las tres, CDR completa o sustancialmente de la región variable de cadena pesada de 6C1 y/o una región variable de cadena ligera que tiene al menos dos, y usualmente las tres, CDR completa o sustancialmente de la región de variable de cadena ligera de 6C1. Los anticuerpos pueden incluir tanto cadenas pesadas como ligeras. Una CDR es substancialmente de una CDR 6C1 correspondiente cuando no contiene más de 4, 3, 2 o 1 sustituciones, inserciones o supresiones, excepto que CDR-H2 (cuando se define por Kabat) no puede tener más de 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, inserciones o supresiones. Estos anticuerpos monoclonales pueden tener al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con 6C1 en la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera maduras y mantienen sus propiedades funcionales y/o difieren de 6C1 por un pequeño número de sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), supresiones o inserciones de aminoácidos funcionalmente insignificantes.

Algunos anticuerpos identificados por estos ensayos pueden enlazarse a formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR pero no a formas tetraméricas nativas de TTR, como se describe en los ejemplos o de manera distinta. Asimismo, algunos anticuerpos son inmunorreactivos en tejido de amiloidosis mediada por TTR pero no en tejido sano.

Algunos anticuerpos pueden inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir o despejar los depósitos de TTR o TTR agregadas, o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR en un modelo animal o ensayo clínico. Algunos anticuerpos pueden tratar, efectuar profilaxis de o retrasar la aparición de una amiloidosis de TTR como se muestra en un modelo animal o ensayo clínico. Los modelos animales ejemplares para actividad de prueba contra una amiloidosis de TTR incluyen los descritos en Kohno et al., Am. J. Path.

150(4):1497-1508 (1997); Teng et al., Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al., Proc. Japan Acad.

63B:344-347 (1987); Shimada et al., Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al., J. Biochem. 117:169-175 (1995); Sousa et al., Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); y Santos et al., Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).

B. Anticuerpos No Humanos

La producción de otros anticuerpos no humanos, por ejemplo, murinos, de cobaya, primate, conejo o rata, contra TTR monomérica o un fragmento de la misma (por ejemplo, residuos de aminoácidos 89-97) puede lograrse, por ejemplo, al inocular al animal con TTR o un fragmento de la misma. Ver Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988). Dicho inmunógeno puede obtenerse de una fuente natural, de síntesis de péptidos o por la expresión recombinante. Opcionalmente, puede administrarse el immunógeno fusionado o en complejo de alguna otra manera con una proteína portadora. Opcionalmente, el inmunógeno puede administrarse con un adyuvante. Varios tipos de adyuvantes pueden utilizarse como se describe a continuación. Se prefiere adyuvante completo de Freund seguido por adyuvante incompleto para la inmunización de animales de laboratorio. Los conejos o cobayas se utilizan normalmente para la fabricación de anticuerpos policlonales. Los ratones se suelen utilizar para la fabricación de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se seleccionan para el enlace específico a TTR monomérica o un epítopo dentro de TTR (por ejemplo, un epítopo que comprende uno o más de los residuos de aminoácidos 89-97). Dicha selección puede lograrse al determinar el enlace de un anticuerpo a un conjunto de variantes de TTR monoméricas, tales como variantes de TTR que contienen residuos del aminoácido 89-97 o mutaciones dentro de estos residuos, y determinar qué variantes de TTR se enlazan al anticuerpo. El enlace puede evaluarse, por ejemplo, mediante transferencia de Western, FACS o ELISA.

C. Anticuerpos humanizados

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo genéticamente modificado en el cual las CDR de un anticuerpo no humano "donante" se injertan en secuencias de anticuerpo humano "aceptor" (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.530.101 y 5.585.089; Winter, US 5.225.539, Carter, US 6.407.213, Adair, US 5.859.205 y Foote, US 6.881.557). Las secuencias de anticuerpo aceptor pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo humano maduro, un compuesto de dichas secuencias, una secuencia de consenso de secuencias de anticuerpos humanos o una secuencia de la región de línea germinal. Por lo tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene al menos tres, cuatro, cinco o todas las CDR completa o sustancialmente de un anticuerpo donante y las secuencias de marco de región variable y regiones constantes, si están presentes, completa o sustancialmente de las secuencias de anticuerpo humano. Asimismo, una cadena pesada humanizada tiene al menos una, dos y generalmente las tres CDR completa o sustancialmente de una cadena pesada del anticuerpo donante y una secuencia de marco de región variable de cadena pesada y región constante de cadena pesada, si está presente, sustancialmente del marco de región variable de cadena pesada humana y secuencias de región constante. Asimismo, una cadena ligera humanizada tiene al menos una, dos y generalmente las tres CDR completa o sustancialmente de una cadena ligera de anticuerpo donante y una secuencia de marco de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera, si está presente, sustancialmente de marco de región variable de cadena ligera humana y secuencias de región constante. Aparte de nanocuerpos y dAb, un anticuerpo humanizado comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de un CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos el 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los residuos correspondientes (como se define por cualquier definición convencional pero preferiblemente definida por Kabat) son idénticos entre las CDR respectivas. Las secuencias de marco de la región variable de secuencias de una cadena de anticuerpo o la región constante de una cadena de un anticuerpo son sustancialmente de una secuencia de marco de región variable humana o una región constante humana respectivamente cuando al menos 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los residuos correspondientes definidos por cualquier definición convencional pero preferentemente definidos por Kabat son idénticos.

Aunque los anticuerpos humanizados a menudo incorporan las seis CDR (preferiblemente como las define Kabat) de un anticuerpo de ratón, también pueden hacerse con menos de todas las CDR (por ejemplo, al menos, 3, 4 o 5 CDR) de un anticuerpo de ratón (por ejemplo, Pascalis et al, J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000).

En algunos anticuerpos solo parte de las CDR, a saber, el subconjunto de residuos de CDR requeridos para el enlace, denominados SDR, son necesarias para conservar el enlace de un anticuerpo humanizado. Los residuos de CDR que no están en contacto con el antígeno en los SDR pueden identificarse partiendo de estudios anteriores (por ejemplo, los residuos de H60-H65 en CDR H2 a menudo no son necesarios), de las regiones de CDR de Kabat que están fuera de los bucles hipervariables de Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), por modelado molecular y/o de forma empírico, o como se describe en Gonzales et al., Mol. Immunol. 41: 863, 2004. En dichos anticuerpos humanizados en las posiciones en las que uno o más residuos de CDR donantes están ausentes o en las que una CDR donante completa se omite, el aminoácido que ocupa la posición puede ser un aminoácido que ocupa la posición correspondiente (por numeración de Kabat) en la secuencia de anticuerpo aceptor. El número de tales sustituciones del aceptador para aminoácidos donantes en las CDR que se incluyen refleja un equilibrio de las consideraciones en competencia. Tales sustituciones son potencialmente beneficiosas en la disminución del número de aminoácidos de ratón en un anticuerpo humanizado y en consecuencia la disminución de posible inmunogenicidad. Sin embargo, las sustituciones también pueden causar cambios de afinidad y preferiblemente se evitan reducciones significativas en la afinidad. Las posiciones de sustitución dentro de las CDR y los aminoácidos que se van a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente.

Las secuencias del anticuerpo humano aceptor pueden opcionalmente seleccionarse entre las muchas secuencias de anticuerpo humano conocidas para proporcionar un alto grado en la secuencia de identidad (por ejemplo, 65-85 % de identidad) entre los marcos de región variable de una secuencia aceptora humanoa y los marcos de región variable correspondientes de una cadena de anticuerpo donante.

Un ejemplo de una secuencia aceptora de la cadena pesada es la región variable de cadena pesada madura humana con código de referencia NCBI ADX65650 (SEQ ID NO: 3). Esta secuencia aceptora incluye dos CDR con la misma forma canónica que la cadena pesada de 6C1 de ratón. Un ejemplo de una secuencia aceptora de la cadena ligera es la región variable de cadena ligera madura humana con código de referencia NCBI ABI74084 (SEQ ID NO: 15). Esta secuencia aceptora incluye dos CDR con la misma forma canónica que la cadena ligera de 6C1 de ratón.

Ciertos aminoácidos de los residuos de marco de región variable humana pueden seleccionarse para la sustitución en función de su posible influencia en la conformación de las CDR y/o su enlace al antígeno. La investigación de esas posibles influencias es por modelado, examen de las características de los aminoácidos en ciertas ubicaciones u observación empírica de los efectos de sustitución o de mutagénesis de los aminoácidos particulares.

Por ejemplo, cuando un aminoácido es diferente entre un residuo de marco de región variable murina y un residuo de marco de región variable humana seleccionada, el aminoácido de marco humano puede ser sustituido por el aminoácido de marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando razonablemente se espera que el aminoácido:

(1) se enlace de manera no covalente al antígeno directamente,

(2) sea adyacente a una región CDR o dentro de una CDR definida por Chothia pero no Kabat;

(3) de otra manera interactúe con una región CDR (por ejemplo, está a una distancia de aproximadamente 6 A de una región CDR), (p. ej., identificada por modelado de la cadena ligera o pesada sobre la estructura resuelta de una cadena de inmunoglobulina homóloga conocida); o

(4) sea un residuo que participa en la interfaz VL-VH.

Los residuos del marco de las clases (1) a (3) según lo definido por Queen, documento US 5.530.101, a veces se denominan alternativamente residuos canónicos y de vernier. Los residuos del marco que ayudan a definir la conformación de un bucle de CDR a veces se denominan residuos canónicos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901­ 917 (1987), Thornton y Martin J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Los residuos del marco que respaldan el bucle de enlace a antígeno y juegan un papel en afinar el ajuste de un anticuerpo al antígeno a veces se denominan residuos de vernier (Foote y Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).

Otros residuos de marco que son candidatos para la sustitución son residuos que crean un sitio de glicosilación potencial. Aún otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos de marco humano aceptor que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden ser sustituidos con los aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo del ratón donante o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas.

Los anticuerpos humanizados ejemplares son formas humanizadas del anticuerpo 6C1 de ratón, designado Hu6C1. El anticuerpo de ratón comprende regiones variables de cadena pesada y ligera maduras con secuencias de aminoácidos que comprenden SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 13, respectivamente. La invención proporciona seis regiones variables de cadena pesada madura humanizada ejemplificadas: Hu6C1VHv1 (SEQ ID NO: 4), Hu6C1VHv1b (SEQ ID NO: 5), Hu6C1VHv2 (SEQ ID NO :6), Hu6C1VHv2b (SEQ ID NO: 7), Hu6C1VHv3 (SEQ ID NO: 8) y Hu6C1VHv3b (SEQ ID NO: 9). La invención además proporciona dos regiones variables de cadena ligera madura humana ejemplificadas: Hu6C1VLv1 (SEQ ID NO: 16) y Hu6C1VLv2 (SEQ ID NO: 17). Las Figuras 1 y 2 muestran alineaciones de la región de variable de cadena pesada y región de variable de cadena ligera, respectivamente, de 6C1, anticuerpos modelo de ratón, anticuerpos aceptores humanos y versiones de anticuerpos humanizados de 6C1.

Por razones tales como la posible influencia en la conformación de CDR y/o enlace al antígeno, mediación en la interacción entre las cadenas pesadas y las cadenas ligeras, la interacción con la región constante, que es un sitio para la modificación postraduccional deseada o no deseada, que es un residuo inusual para su posición en una secuencia de región variable humana y por lo tanto potencialmente inmunogénico, que consigue potencial de agregación y otras razones, las siguientes diez posiciones de marco de región variable se consideraron candidatas a sustituciones en las seis regiones de variable de cadena ligera maduras humanas ejemplificadas y las dos regiones variables de cadena pesada maduras humanas ejemplificadas, como se especifica en los ejemplos: L2, L45, H19, H44, H49, H76, H77, H82(a), H83 y H89.

Aquí, como en otros lugares, el residuo mencionado en primer lugar es el residuo de un anticuerpo humanizado formado por injerto de CDR de Kabat o una CDR de Chothia Kabat compuesta en el caso de CDR-H1 en un marco aceptor humano, y el residuo mencionado en segundo lugar es un residuo que se considera para la sustitución de ese residuo. Por consiguiente, dentro de los marcos de región variable, el residuo mencionado en primer lugar es humano y, dentro de las CDR, el residuo mencionado en primer lugar es de ratón.

Los anticuerpos ejemplificados incluyen cualquier permutación o combinación de las regiones variables de cadena pesada y ligera maduras (por ejemplo, Hu6C1VHv1/VLv1 o H1L1, Hu6C1VHv1b/VLv1 o H1bL1, Hu6C1VHv1/VLv2 o H1L2, Hu6C1VHv1b/VLv2 o H1bL2, Hu6C1VHv2/VLv1 o H2L1, Hu6C1VHv2b/VLv1 o H2bL1, Hu6C1VHv2/VLv2 o H2L2, Hu6C1VHv2b/VLv2 o H2bL2, Hu6C1VHv3/VLv1 o H3L1, Hu6C1VHv3b/VLv1 o H3bL1, Hu6C1VHv3/VLv2 o H3L2 y Hu6C1VHv3b/VLv2 o H3bL2).

La invención proporciona variantes de anticuerpos humanizados en los cuales la región variable de cadena pesada madura humanizada muestra al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las SEQ ID NO: 4­ 9 y la región variable de cadena ligera madura humanizada muestra al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 16 o 17. En algunos de estos anticuerpos al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o las 10 retromutaciones u otras mutaciones en las SEQ ID NO: 4-9, 16 y 17 se retienen.

En algunos anticuerpos, al menos una de las posiciones H19, H44, H49, H76, H77, H82(a), H83 y H89 en la región Vh está ocupada por K, R, A, S, T, S, K y V, respectivamente. En algunos anticuerpos, la posición H77 en la región Vh está ocupada por T como en Hu6C1VHv1. En algunos anticuerpos, las posiciones H49 y H77 en la región Vh están ocupadas por A y T, respectivamente, como en Hu6C1VHv1b. En algunos anticuerpos, las posiciones H76, H77 y H82(a) en la región Vh están ocupadas por S, T y S, respectivamente, como en Hu6C1VHv2. En algunos anticuerpos, las posiciones H49, H76, H77 y H82(a) en la región Vh están ocupadas por A, S, T y S, respectivamente, como en Hu6C1VHv2b. En algunos anticuerpos, las posiciones H19, H44, H77, H83 y H89 en la región Vh están ocupadas por K, R, T, K y M, respectivamente, como en Hu6C1VHv3. En algunos anticuerpos, las posiciones H19, H44, H49, H77, H83 y H89 en la región Vh están ocupadas por K, R, A, T, K y M, respectivamente, como en Hu6C1VHv3b. En algunos anticuerpos, la posición L45 en la región Vl está ocupada por K. En algunos anticuerpos, la posición L2 en la región Vl está ocupada por I. En algunos anticuerpos, una o ambas posiciones L2 y L45 en la región Vl están ocupadas por V y K, respectivamente, como en Hu6C1VLv1. En algunos anticuerpos, una o ambas de las posiciones L2 y L45 en la región Vl están ocupadas por I y K, respectivamente, como en Hu6C1VHv2. Las regiones c Dr de dichos anticuerpos humanizados pueden ser idénticas o substancialmente idénticas a las regiones CDR del anticuerpo donante de ratón 6C1. Las regiones CDR pueden ser definidas por cualquier definición convencional (por ejemplo, Chothia, o compuesto de Chothia y Kabat) pero son preferiblemente como se definen por Kabat.

Las posiciones de marco de regiones variables están de acuerdo con la numeración Kabat a menos que se indique lo contrario. Otras de estas variantes por lo general difieren de las secuencias de los anticuerpos Hu6C1 ejemplificados por un pequeño número (por ejemplo, normalmente no más de 1, 2, 3, 5, 10 o 15) de sustituciones, supresiones o inserciones. Estas diferencias se encuentran usualmente en el marco, pero pueden también ocurrir en las CDR.

Una posibilidad de variación adicional en variantes de 6C1 humanizado son retromutaciones adicionales en los marcos de la región variable. Muchos de los residuos de marco que no están en contacto con las CDR en el mAb humanizado pueden alojar sustituciones de aminoácidos de las posiciones correspondientes del mAb de ratón donante u otros anticuerpos humanos o de ratón, e incluso muchos residuos de contacto con CDR potencial también son susceptibles a la sustitución. Incluso los aminoácidos dentro de las CDR pueden alterarse, por ejemplo, con restos encontrados en la posición correspondiente de la secuencia aceptora humana utilizada para suministrar marcos de región variable. Además, secuencias aceptoras humanas alternas pueden utilizarse, por ejemplo, para la cadena pesada y/o ligera. Si se utilizan diferentes secuencias aceptoras, una o más de las retromutaciones recomendadas más arriba no se pueden realizar debido a que los residuos donantes y aceptores correspondientes ya son los mismos sin las retromutaciones.

Preferiblemente, los reemplazos o retromutaciones en variantes de Hu6C1 (si son o no conservadores) no tienen ningún efecto substancial en la afinidad o potencia de enlace del mAb humanizado, es decir, su capacidad para enlazarse a TTR monomérica (por ejemplo, la potencia en todos o algunos de los ensayos descritos en los presentes ejemplo del anticuerpo 6C1 humanizado variante es esencialmente la misma, es decir, dentro del error experimental, que la de 6C1 murino).

D. Anticuerpos quiméricos y revestidos

La invención, además, proporciona formas de anticuerpos quiméricos y revestidos no humanos, particularmente los anticuerpos 6C1 de los ejemplos.

Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el cual las regiones variables maduras de cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un ratón) se combinan con regiones constantes humanas de cadena ligera y pesada. Dichos anticuerpos conservan sustancial o completamente la especificidad de enlace del anticuerpo de ratón y son de aproximadamente dos tercios de la secuencia humana.

Un anticuerpo revestido es un tipo de anticuerpo humanizado que conserva algunos y generalmente todas las CDR y algunos de los residuos de marco no humanos en la región variable de un anticuerpo no humano, pero reemplaza otros residuos marco de región variable que pueden contribuir a epítopos de linfocitos T o B, por ejemplo, los residuos expuestos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) con residuos de las posiciones correspondientes de la secuencia de un anticuerpo humano. El resultado es un anticuerpo en el que las CDR son completa o sustancialmente de un anticuerpo no humano y los marcos de la región variable del anticuerpo no humano se hacen más tipo humanos por las sustituciones. La invención incluye formas revestidas del anticuerpo 6C1.

E. Anticuerpos Humanos

Los anticuerpos humanos contra TTR monomérica o un fragmento de ella (por ejemplo, residuos de aminoácidos 89­ 97 (SEQ ID NO: 42) de TTR) son proporcionados por una variedad de técnicas que se describen a continuación. Algunos anticuerpos humanos son seleccionadoss por experimentos de enlace competitivo, por el método de despliegue de fagos de Winter, citado anteriormente, o de otra manera, porque tienen la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo de ratón particular, como uno de los anticuerpos monoclonales descritos en los ejemplos. Los anticuerpos humanos también pueden seleccionarse para especificidad de epítopo particular mediante el uso de solo un fragmento de TTR, tal como una variante de TTR que contiene solamente residuos de aminoácidos 89-97 de TTR, como el antígeno objetivo y/o por la selección de anticuerpos contra una colección de variantes de TTR, tales como variantes de TTR que contienen varias mutaciones dentro de los residuos de aminoácidos 89-97 de TTR.

Los métodos para la producción de anticuerpos humanos incluyen el método trioma de Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Patente estadounidense n.° 4.634.664; y Engleman et al., Patente estadounidense 4.634.666, uso de ratones transgénicos que incluyen genes de inmunoblobulina humana (ver, por ejemplo, Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); y Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) y métodos de presentación en fagos (ver, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US 5.877.218; US 5.871.907; US 5.858.657; US 5.837.242; US 5.733.743; y US 5.565.332).

F. Selección de Región Constante

Las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, revestidos o humanizados pueden unirse a por lo menos una parte de una región constante humana. La opción de región constante depende, en parte, de si se desea citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos y/o citotoxicidad dependiente de complemento. Por ejemplo, los isotipos humanos IgG1 e IgG3 tienen citotoxicidad dependiente de complemento y los isotipos humanos IgG2 e IgG4 no la tienen. El IgG1 e IgG3 humano también inducen funciones efectoras mediadas por células más fuertes que IgG2 e IgG4 humanos. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa.

Uno o varios aminoácidos en el extremo amino o carboxilo de la cadena ligera y/o pesada, como la lisina C terminal de la cadena pesada, le pueden faltar o derivarse en parte o la totalidad de las moléculas. Se pueden realizar sustituciones en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora como la citotoxicidad mediada por complemento o ADCC (véase, por ejemplo, Winter et al., Patente estadounidense n.° 5.624.821; Tso et al., Patente estadounidense n.° 5.834.597; y Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), o para prolongar la semivida en seres humanos (ver, por ejemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Las sustituciones ejemplares incluyen un Gln en la posición 250 y/o una Leu en la posición 428 (la numeración de EU se utiliza en este párrafo para la región constante) para aumentar la semivida de un anticuerpo. Sustitución en cualquiera o todas de las posiciones, 234, 235, 236 y/o 237 reducen la afinidad para los receptores de Fcy, particularmente receptor FcyRI (véase, por ejemplo, U.S. 6.624.821). Una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de IgG1 humano se puede utilizar para reducir las funciones efectoras. Algunos anticuerpos tienen una sustitución de alanina en las posiciones 234, 235 y 237 de la IgG1 humana para reducir funciones efectoras. Opcionalmente, las posiciones 234, 236 y/o 237 de IgG2 humano son sustituidas con alanina y la posición 235 con glutamina (ver, por ejemplo, US 5.624.821). En algunos anticuerpos, se utiliza una mutación en una o más de las posiciones 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 y 331 por numeración EU de IgG1 humano. En algunos anticuerpos, se utiliza una mutación en una o más de las posiciones 318, 320 y 322 por numeración EU de IgG1 humano. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 y/o 235 son sustituidas con alanina y/o la posición 329 se sustituye con glicina. En algunos anticuerpos, las posiciones 234 y 235 son sustituidas con alanina, tal como en la SEQ ID NO: 27. En algunos anticuerpos, el isotipo es IgG2 o IgG4 humano.

Una región constante ejemplar humana de cadena ligera kappa tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28. La arginina N-terminal de la SEQ ID NO: 28 puede omitirse, en cuyo caso la región constante de cadena ligera kappa tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29. Una región constante ejemplar humana de cadena pesada de IgG1 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 (con o sin la lisina C-terminal). Los anticuerpos pueden ser expresados como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos de cadena única en los cuales los dominios variables maduros de cadena pesada y ligera están vinculados por un espaciador.

Las regiones constantes humanas muestran variación alotípica y variación isoalotípica entre individuos diferentes, es decir, que las regiones constantes pueden variar en diferentes individuos en una o más posiciones polimórficas. Los isoalotipos se diferencian de los alotipos en que los sueros que reconocen un isoalotipo se unen a una región no polimórfica de uno o más isotipos adicionales. Así, por ejemplo, otra región constante de cadena pesada es de alotipo de IgG1 Glm3 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26. Otra región constante de cadena pesada del alotipo de IgG1 Glm3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 (con o sin la lisina C-terminal). La referencia a una región constante humana incluye una región constante con cualquier alotipo natural o cualquier permutación de residuos que ocupan posiciones en alotipos naturales.

G. Expresión de Anticuerpos Recombinantes

Se conocen numerosos métodos para producir anticuerpos quiméricos y humanizados que utilizan una línea celular que expresa anticuerpos (por ejemplo, hibridoma). Por ejemplo, las regiones variables de inmunoglobulina de los anticuerpos pueden clonarse y secuenciarse utilizando los métodos bien conocidos. En un método, la región VH variable de cadena pesada se clona por RT-PCR utilizando ARNm preparado a partir de células de hibridoma. Los cebadores consenso se emplean en el péptido líder de región VH que engloba el codón de inicio de la traducción como el cebador 5' y un cebador 3' específico de regiones constantes g2b. Los cebadores ejemplares se describen en la publicación de patente estadounidense US 2005/0009150 por Schenk et al. (en lo sucesivo “Schenk”). Las secuencias de los clones derivados independientemente, múltiples, pueden compararse para asegurar que no se introduzcan cambios durante la amplificación. La secuencia de la región VH también puede determinarse o confirmarse por la secuenciación de un fragmento VH obtenido por metodología 5' RACE RT-PCR y el cebador específico 3' g2b.

La región VL variable de cadena ligera puede clonarse de manera análoga. En una aproximación, un conjunto de cebadores consenso se diseña para la amplificación de las regiones VL que utiliza un cebador 5' diseñado para hibridar con la región VL que abarca el codón de inicio de traducción y un cebador 3' específico para la región Ck cadena abajo de la región de unión V-J. En una segunda aproximación, se emplea la metodología 5'RACE RT-PCR para clonar un ADNc que codifica VL. Los cebadores ejemplares se describen en Schenk, mencionado anteriormente. Las secuencias clonadas se combinan después con secuencias que codifican regiones constantes humanas (u otras especies no humanas). Las secuencias ejemplares que codifican las regiones constantes humanas incluyen la SEQ ID NO: 46, la cual codifica una región constante IgG1 humana y las SEQ ID NO: 47 y 48, las cuales codifican una región constante de cadena ligera kappa humana.

En una aproximación, las regiones variables de cadena ligera y pesada se rediseñan para codificar secuencias donantes de corte y empalme cadena abajo de las uniones VDJ o VJ respectivas y se clonan en un vector de expresión mamífero, tal como pCMV-hYl para la cadena pesada y pCMV-Mc1 para la cadena ligera. Estos vectores codifican regiones constantes humanas y1 y Ck como fragmentos exónicos cadena abajo del casete de región variable insertado. Después de la verificación de secuencia, los vectores de expresión de cadena ligera y cadena pesada pueden co-transfectarse en las células CHO para producir anticuerpos quiméricos. El medio acondicionado se recoge 48 horas después de la transfección y se analiza por análisis de transferencia de western para la producción de anticuerpo o ELISA para el enlace de antígeno. Los anticuerpos quiméricos se humanizan como se describe anteriormente.

Los anticuerpos quiméricos, revestidos, humanizados y humanos son normalmente producidos por expresión recombinante. Las construcciones polinucleotídicas recombinantes normalmente incluyen una secuencia de control de la expresión operativamente vinculada a las secuencias de codificación de cadenas de anticuerpos, incluyendo elementos de control de expresión heteróloga o asociada naturalmente, tales como un promotor. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores en vectores capaces de transformar o transfectar las células hospedadoras eucariotas o procariotas. Una vez que el vector ha sido incorporado en el hospedador adecuado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de nivel alto de las secuencias de nucleótidos y la recogida y purificación de los anticuerpos de reacción cruzada.

Estos vectores de expresión se replican habitualmente en los organismos hospedadores ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a la ampicilina o resistencia a la higromicina, para permitir la detección de esas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

El E. coli es un anfitrión procariota útil para la expresión de anticuerpos, especialmente fragmentos de anticuerpos. Los microbios, tales como la levadura, también son útiles para la expresión. Las Saccharomyces son un hospedador de levadura con vectores convenientes que tienen las secuencias de control de expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores inducibles de la levadura incluyen, entre otros, promotores de la alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.

Las células de mamíferos pueden utilizarse para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de estas. Ver Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado varias líneas de células hospedadoras adecuadas capaces de secretar proteínas heterólogas intactas e incluyen las líneas celulares CHO, varias líneas de células COS, las células HeLa, células HEK293, células L y mielomas que no producen anticuerpos incluyendo Sp2/0 y NS0. Las células pueden ser no humanas. Los vectores de expresión de estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) y sitios de información de procesamiento necesario, tales como sitios de enlace del ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminador transcripcional. Las secuencias de control de expresión pueden incluir promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino y similares. Ver Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).

Alternativamente, las secuencias de codificación de anticuerpo pueden incorporarse en transgenes para la introducción en el genoma de un animal transgénico y la expresión posterior en la leche del animal transgénico (ver, por ejemplo, Patente estadounidense n.° 5.741.957; Patente estadounidense n.° 5.304.489; y Patente estadounidense n.° 5.849.992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias de codificación para las cadenas ligeras y/o pesadas enlazadas de manera operativa con un promotor y potenciador de un gen específico de glándula mamaria, tal como la caseína o la beta lactoglobulina.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse en la célula hospedadora por los métodos que dependen del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, la transfección de cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procarióticas, mientras que la transfección basada en tratamiento de fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o virus puede utilizarse para otras células hospedadoras. Otros métodos utilizados para transformar células mamíferas incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplasto, liposomas, electroporación y microinyección. Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en los ovocitos fertilizados o puede incorporarse en el genóma de las células madre embriónicas y los núcleos de estas células transferirse en los ovocitos enucleados.

Al introducir vector(es) de codificación de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos en el cultivo celular, los grupos celulares pueden ser seleccionados para productividad de crecimiento y calidad del producto en medios libres de suero. Los grupos celulares de mayor producción pueden entonces ser objeto de la clonación unicelular basada en FACS para generar líneas monoclonales. Pueden utilizarse productividades específicas superiores a 50 pg o 100 pg por célula por día, que corresponden a títulos de producto mayores de 7,5 g/l de cultivo. Los anticuerpos producidos por clones unicelulares también pueden probarse para determinar la turbidez, propiedades de filtración, PAGE, IEF, barrido de UV, HP-SEC, mapeo de carbohidratos-oligosacáridos, espectrometría de masas y ensayo de unión, tal como ELISA o Biacore. Un clon seleccionado puede depositarse en múltiples viales y almacenarse congelado para su posterior uso.

Una vez expresados, los anticuerpos pueden ser purificados según procedimientos estándar de la técnica, incluyendo la captura de proteína A, purificación de HPLC, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares (ver, en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

Puede emplearse la metodología para la producción comercial de anticuerpos, incluyendo optimización de codones, selección de promotores, selección de elementos de transcripción, selección de terminadores, clonación unicelular libre de suero, depósito de células, uso de marcadores de selección para la amplificación del número de copias, terminador CHO o mejora de los títulos de proteína (ver, por ejemplo, los documentos US 5.786.464; US 6.114.148; US 6.063.598; US 7.569.339; WO2004/050884; WO2008/012142; WO2008/012142; WO2005/019442; WO2008/107388; WO2009/027471; y US 5.888.809).

H. Pruebas de cribado de anticuerpos

Los anticuerpos pueden estar sujetos a diversos cribados incluyendo ensayos de enlace, cribados funcionales, cribados en modelos animales de enfermedades asociados con depósitos de t Tr y ensayos clínicos. Los ensayos de enlace analizan el enlace específico y, opcionalmente, afinidad y especificidad de epítopo a TTR monomérica o un fragmento de la misma. Por ejemplo, los ensayos de enlace pueden seleccionar anticuerpos que se enlazan a los residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 42) de TTR, que es un epítopo que está enterrado en el tetrámero TTR nativo y está expuesto en las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR. También puede seleccionarse los anticuerpos por su capacidad de enlazarse a conformaciones pre-fibrilares, no nativas de TTR y fibrillas amiloides de TTR pero no conformaciones TTR nativas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden seleccionarse por su capacidad de enlazarse a las formas monoméricas de TTR creadas por disociación o desagregación de TTR tetramérica nativa y pueden contraseleccionarse contra TTR tetramérica nativa, como se describe en los ejemplos o de alguna otra manera. Asimismo, los anticuerpos pueden seleccionarse por su inmunorreactividad en tejido de amiloidosis mediada por TTR pero no en tejido sano. Estos cribados se realizan en ocasiones en competición con un anticuerpo ejemplar, tal como un anticuerpo que tiene las regiones variables del isotipo IgG1 kappa o 6C1. Opcionalmente, ya sea el anticuerpo o la TTR objetivo, se inmovilizan en este ensayo.

Pueden realizarse ensayos funcionales en los modelos celulares que incluyen las células que expresan naturalmente TTR o se transfectan con ADN que codifica TTR o un fragmento de la misma. Las células adecuadas incluyen células derivadas del tejido cardíaco u otros tejidos afectados por la amiloidogénesis de TTR. Puede seleccionarse las células por los niveles reducidos de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR (por ejemplo, por transferencia de Western o inmunoprecipitación de los extractos y sobrenadantes celulares) o toxicidad reducida atribuible a las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR. Por ejemplo, los anticuerpos pueden probarse para determinar su capacidad para inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir los depósitos de TTR, eliminar la TTR agregada o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR.

Otros ensayos funcionales pueden realizarse en la solución, tales como pruebas de si un anticuerpo es capaz de interrumpir o reducir la formación de fibrillas de TTR cuando los intermedios de TTR monomérica o TTR mal plegada en la solución, están en contacto con el anticuerpo. La magnitud de la formación de fibrillas puede probarse por mediciones de turbidez, por ejemplo, en 400 nm en un espectómetro de UV-visible equipado con una unidad de control de temperatura. La tioflavina T también puede utilizarse para evaluar la magnitud de la formación de fibrillas amiloides. Por ejemplo, un exceso molar de cinco veces más tioflavina T puede añadirse a las muestras TTR y dejarse a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de que se tomen las mediciones. La fluorescencia de la tioflavina T puede supervisarse utilizando un espectrofluorímetro. Ver documento US 2014/0056904.

El cribado de modelos animales analiza la capacidad del anticuerpo para tratar terapéutica o profilácticamente signos o síntomas en un modelo animal que simula una enfermedad humana asociada con la acumulación de TTR o depósitos de TTR. Estas enfermedades incluyen tipos de amiloidosis de TTR, tales como amiloidisis sistémica senil (SSA), amiloidosis cardíaca senil (SCA), polineuropatía amiloide familiar (FAP), miocardiopatía amiloide familiar (FAC) y amiloidosis selectiva del sistema nervioso central (CNSA). Signos o síntomas adecuados que pueden supervisarse incluyen la presencia y la magnitud de los depósitos amiloides en diversos tejidos, tales como el tubo digestivo o corazón. La magnitud de la reducción de los depósitos amiloides puede determinarse por la comparación con un control apropiado, tal como el nivel de depósitos amiloides de TTR en los animales de control que han recibido un anticuerpo de control (por ejemplo, un anticuerpo de control compatible con isotipo), un placebo o sin ningún tratamiento. Un modelo animal ejemplar para evaluar la actividad contra una amiloidosis de TTR es un modelo de ratón que lleva una mutación nula en el locus Ttr de ratón endógeno y el gen TTR mutante humano que comprende una mutación V30M que se asocia con la polineuropatía amiloidótica familiar. Ver, por ejemplo, Kohno et al., Am. J. Path. 150(4):1497-1508 (1997); Cardoso y Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). También existen modelos similares, incluyendo otros modelos para las versiones familiares de amiloidosis de TTR y modelos para las versiones esporádicas de la amiloidosis de TTR. Ver, por ejemplo, Teng et al., Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito y Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, en Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, págs. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Los animales transgénicos pueden incluir un transgén TTR humano, tal como un transgén TTR con una mutación asociada con la amiloidosis de TTR o un transgén TTR de tipo silvestre. Para facilitar la prueba en los modelos animales, pueden utilizarse los anticuerpos quiméricos que tienen una región constante apropiada para el modelo animal (por ejemplo, pueden utilizarse quimeras de ratón-rata para probar los anticuerpos en ratas). Se puede concluir que una versión humanizada de un anticuerpo será eficaz si el anticuerpo de ratón o el anticuerpo quimérico correspondiente es eficaz en un modelo animal apropiado y el anticuerpo humanizado tiene afinidad de enlace similar (por ejemplo, dentro del error experimental, tal como por un factor de 1,5, 2 o 3).

Los ensayos clínicos analizan la seguridad y la eficacia en un ser humano que tiene una enfermedad asociada con amiloidosis de TTR.

I. Ácidos Nucleicos

La invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras descritas anteriormente (por ejemplo, SEQ ID NO: 4-9, 16 y 17). Opcionalmente, estos ácidos nucleicos además codifican un péptido señal y puede expresarse con el péptido señal vinculado a la región constante (por ejemplo, los péptidos señal que tienen secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 49 (cadena pesada) y 51 (cadena ligera) que pueden codificarse por la SEQ ID NO: 50, respectivamente (cadena pesada) y 52, respectivamente (cadena ligera)). Las secuencias de codificación de los ácidos nucleicos pueden estar en vinculación operativa con secuencias reguladoras para asegurar la expresión de las secuencias de codificación, tales como un promotor, potenciador, sitio de enlace a ribosoma, señal de terminación de transcripción y similares. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas pueden ocurrir en forma aislada o pueden ser clonados en uno o más vectores. Los ácidos nucleicos pueden ser sintetizados, por ejemplo, mediante síntesis de estado sólido o PCR de oligonucleótidos superpuestos. Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras se pueden unir como un ácido nucleico contiguo, por ejemplo, dentro de un vector de expresión, o pueden ser separados, por ejemplo, cada uno clonado en su propio vector de expresión.

J. Anticuerpos Conjugados

Los anticuerpos conjugados que se enlazan específicamente a los antígenos expuestos en las formas patógenas de TTR pero no en formas tetraméricas nativas de TTR, tales como residuos de aminoácidos 89-97 (SEQ ID NO: 42) de TTR, son útiles en la detección de la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR; que supervisan o evalúan la eficacia de los agentes terapéuticos que se utilizan para tratar pacientes diagnosticados con una amiloidosis de TTR; que inhiben o reducen la agregación de TTR; que inhiben o reducen la formación de fibrillas de TTR; que reducen o despejan los depósitos de TTR; que estabilizan las conformaciones no tóxicas de TTR; o que tratan o efectúan profilaxis de una amiloidosis de TTR en un paciente. Por ejemplo, dichos anticuerpos pueden ser conjugados con otras fracciones terapéuticas, otras proteínas, otros anticuerpos y/o marcadores detectables. Ver documentos WO 03/057838; U.S. 8.455.622.

Las fracciones terapéuticas conjugadas pueden ser cualquier agente que pueda usarse para tratar, combatir, mitigar, prevenir o mejorar un estado no deseado o enfermedad en un paciente, tal como una amiloidosis de TTR. Las fracciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, inmunomoduladores o cualquier agente biológicamente activo que facilite o mejore la actividad del anticuerpo. Un inmunomodulador puede ser cualquier agente que estimule o inhiba el desarrollo o mantenimiento de una respuesta inmunológica. Si estas fracciones terapéuticas se acoplan a un anticuerpo específico para las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR, tal como los anticuerpos descritos en el presente documento, las fracciones terapéuticas acopladas tendrán una afinidad específica para las formas no nativas, patógenas de TTR sobre las formas tetraméricas nativas de TTR. En consecuencia, la administración de los anticuerpos conjugados apunta directamente a tejidos que comprenden formas patógenas de TTR con daño mínimo al tejido circundante normal, saludable. Esto puede ser particularmente útil para las fracciones terapéuticas que son demasiado tóxicas para ser administradas por sí solas. Además, pueden utilizarse cantidades más pequeñas de las fracciones terapéuticas.

Los ejemplos de las fracciones terapéuticas adecuadas incluyen fármacos que reducen los niveles de TTR, estabilizan la estructura tetramérica nativa de TTR, inhiben la agregación de TTR, interrumpen la formación de fibrillas o amiloide de TTR o contrarrestan la toxicidad celular. Ver, por ejemplo, Almeida y Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg y Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); y Johnson et al., J. Mol. Biol. 421(2-3):185-203 (2012). Por ejemplo, los anticuerpos pueden conjugarse a tafamidis, diflunisal, ALN-TTR01, ALNTTR02, ISIS-TTRRx, doxiciclina (doxi), ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), Doxi-TUDCA, galato de epigalocatequina (EGCG), curcumina o resveratrol (3,5,4'-trihidroxiestilbeno). Otras fracciones terapéuticas representativas incluyen otros agentes conocidos por ser útiles en el tratamiento, gestión o mejora de una amiloidosis de TTR o síntomas de una amiloidosis de TTR. Ver, por ejemplo, Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) para los síntomas clínicos comúnes de la amiloidosis de TTR y los agentes típicos utilizados para tratar estos síntomas.

Los anticuerpos también se pueden acoplar con otras proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser acoplados con finómeros. Los finómeros son proteínas de unión pequeñas (por ejemplo, 7 kDa) derivadas del dominio SH3 de Fyn humano. Pueden ser estables y solubles, y pueden carecer de residuos de cisteína y enlaces disulfuro. Los finómeros pueden diseñarse para unirse a las moléculas objetivo con la misma afinidad y especificidad que los anticuerpos. Son adecuados para la creación de proteínas de fusión multi-específicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, los finómeros pueden ser fusionados a extremos N-terminales y/o C-terminales de anticuerpos para crear FinomAb bi- y tri-específicos con diferentes arquitecturas. Los finómeros pueden seleccionarse utilizando bibliotecas de finómeros a través de tecnologías de selección utilizando FACS, Biacore y ensayos celulares que permiten la selección eficiente de finómeros con propiedades óptimas. Se divulgan ejemplos de finómeros en Grabulovski et al., J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs. 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6):1124-1137 (2013); y Brack et al., Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014).

Los anticuerpos divulgados en el presente documento también pueden ser acoplados o conjugados con uno o más anticuerpos diferentes (por ejemplo, para formar heteroconjugados del anticuerpo). Dichos otros anticuerpos pueden unirse a diferentes epítopos dentro de TTR o una porción de la misma o pueden unirse a un antígeno objetivo diferente.

Los anticuerpos también se pueden acoplar con una etiqueta detectable. Estos anticuerpos pueden utilizarse, por ejemplo, para diagnosticar una amiloidosis de TTR, para supervisar la progresión de una amiloidosis de TTR y/o para evaluar la eficacia del tratamiento. Dichos anticuerpos son particularmente útiles para realizar estas determinaciones en sujetos que tienen o son susceptibles a una amiloidosis de TTR o en muestras biológicas adecuadas obtenidas de estos sujetos. Las etiquetas detectables representativas que pueden ser acopladas o vinculadas a un anticuerpo humanizado 6C1 incluyen varias enzimas, tales como la peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como luminol; materiales bioluminiscentes, tales como luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos, tales como itrio90 (90Y), radioplata-111, radioplata-199, Bismuto213, yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), azufre (5S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; metales que emiten positrones utilizando varias tomografías de emisión de positrones; iones de metal paramagnético no radioactivo; y moléculas que están radioetiquetadas o conjugadas con radioisótopos específicos.

La vinculación de radioisótopos a anticuerpos se puede realizar con quelatos de bifunción convencional. Para la vinculación de radioplata-111 y radioplata-199, pueden utilizarse enlazadores de base de azufre. Ver Hazra etal., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). La vinculación de radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Para radioisótopos tales como el 111In y 90Y, puede utilizarse tiuxetano de ibirtumomab y reaccionará con dichos isótopos para formar tiuxetano de 111In-ibritumomab y tiuxetano de 90Y-ibribumomab, respectivamente. Ver Witzig, Cáncer Chemother. Pharmacol., 48 Supl 1:S91-S95 (2001).

Las fracciones terapéuticas, otras proteínas, otros anticuerpos y/o etiquetas detectables pueden ser acopladas o conjugadas, directa o indirectamente a través de un intermediario (por ejemplo, un enlazador), a un anticuerpo 6C1 murino, quimérico, revestido o humanizado mediante técnicas conocidas en la materia. Ver, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985); y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Los enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores escindibles y no escindibles. Pueden emplearse diferentes enlazadores que liberan las fracciones terapéuticas acopladas, proteínas, anticuerpos y/o etiquetas detectables en condiciones ácidas o reductoras, tras la exposición a las proteasas específicas, o en otras condiciones definidas.

V. Aplicaciones terapéuticas

Los anticuerpos anteriores pueden utilizarse para tratar o efectuar profilaxis de una enfermedad en un paciente que tiene o se encuentra en riesgo de la enfermedad mediada el menos en parte por trastiretina (TTR) y particularmente por las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR. Aunque no se requiere un entendimiento del mecanismo para la práctica, se cree que cualquiera o todos los siguientes mecanismos pueden contribuir al tratamiento de la amiloidosis de TTR que utiliza los anticuerpos antes mencionados: la inhibición mediada por anticuerpos de agregación de TTR y la formación de fibrillas, la estabilización mediada por anticuerpos de las conformaciones no tóxicas de TTR (por ejemplo, las formas tetraméricas) o limpieza mediada por anticuerpos de TTR agregada, TTR oligomérica o TTR monomérica. Los conjugados de anticuerpo-fármaco pueden tener mecanismos adicionales de acción determinada por la fracción conjugada.

Los anticuerpos son administrados en un régimen eficaz, lo que significa una dosis, vía de administración y frecuencia de administración que retrasa el inicio, reduce la gravedad, inhibe el deterioro y/o mejora al menos un signo o síntoma de un trastorno que se trate. Si un paciente ya padece un trastorno, el régimen puede denominarse un régimen terapéuticamente eficaz. Si el paciente está en alto riesgo del trastorno en relación con la población general pero aún no está experimentando los síntomas, el régimen puede ser denominado un régimen profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede observarse en un paciente individual en comparación con controles históricos o con la experiencia pasada en el mismo paciente. En otros casos, la eficacia terapéutica o profiláctica puede demostrarse en un ensayo preclínico o clínico en una población de pacientes tratados en relación con una población de control de pacientes no tratados.

La frecuencia de administración depende de la semivida del anticuerpo en la circulación, la condición del paciente y la vía de administración entre otros factores. La frecuencia puede ser diaria, semanal, mensual, trimestral o a intervalos irregulares en respuesta a los cambios en la condición o el progreso del paciente de la enfermedad que se va a tratar. Una frecuencia ejemplar para la administración intravenosa es entre semanal y trimestral sobre una causa continua de tratamiento, aunque también es posible la dosificación más o menos frecuente. Para administración subcutánea, una frecuencia de dosificación ejemplar es de diaria a mensual, aunque también es posible la dosificación más o menos frecuente.

El número de dosificaciones administradas depende de si el trastorno es agudo o crónico y la respuesta del trastorno al tratamiento. Para trastornos agudos o exacerbaciones agudas de un trastorno crónico, entre 1 y 10 dosis son a menudo suficientes. Algunas veces una dosis en bolo único, opcionalmente en forma dividida, es suficiente para un trastorno agudo o una exacerbación aguda de un trastorno crónico. El tratamiento puede repetirse para la recurrencia de un trastorno agudo o una exacerbación aguda. Para los trastornos crónicos, un anticuerpo puede ser administrado a intervalos regulares, por ejemplo, semanal, quincenal, mensual, trimestral, cada seis meses durante al menos 1, 5 o 10 años, o durante toda la vida del paciente.

VI. Composiciones farmacéuticas y métodos de uso

Se proporcionan en el presente documento diferentes métodos de diagnóstico, supervisión, tratamiento o profilaxis de enfermedades o afecciones mediados por lo menos en parte por la transtiretina (t Tr ) y particularmente por las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR (por ejemplo, amiloidosis de TTR). Los ejemplos de estas enfermedades incluyen amiloidosis de TTR familiares, tales como miocardiopatía amiloide familiar (FAC), polineuropatía amiloide familiar (FAP) o amiloidosis selectiva de sistema nervioso central (CNSA) y amiloidosis de TTR esporádicas, tales como amiloidosis sistémica senil (SSA) o amiloidosis cardíaca senil (SCA). Los anticuerpos descritos anteriormente pueden incorporarse en una composición farmacéutica para el uso en estos métodos. En general, un anticuerpo o composición farmacéutica que contiene un anticuerpo se administra a un sujeto que lo necesite. Los pacientes susceptibles al tratamiento incluyen a personas en riesgo de contraer amiloidosis de TTR, pero que no muestra síntomas, así como pacientes que actualmente muestran síntomas. Algunos pacientes pueden tratarse durante la etapa prodrómica de amiloidosis de TTR.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse profilácticamente a los individuos que tienen un riesgo genético conocido de amiloidosis de TTR. Estos individuos incluyen los que tienen parientes que han experimentado este tipo de enfermedad y cuyo riesgo se determina por el análisis de los marcadores genéticos o bioquímicos (por ejemplo, las mutaciones en la TTR asociada con la amiloidosis de TTR), que incluye utilizar los métodos de diagnóstico proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, existen más de 100 mutaciones en el gen que codifica TTR que ha estado implicado en la amiloidosis de TTR. Ver, por ejemplo, documento US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas y Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet y Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983).

Los individuos que padecen amiloidosis de TTR puede a veces reconocerse de las manifestaciones clínicas de la amiloidosis de TTR, que incluyen uno o más de los siguientes: (1) antecedentes familiares de la enfermedad neuropática, especialmente asociados con la insuficiencia cardíaca; (2) dolor neuropático o disturbios sensoriales progresivos de etiología desconocida; (3) síndrome del túnel carpiano sin una causa obvia, particularmente si es bilateral y requiere la liberación quirúrgica; (4) alteraciones de la motilidad gastrointestinal o disfunción del sistema nervioso autónomo de etiología desconocida (por ejemplo, disfunción eréctil, hipotensión ortostática, vejiga neurogénica); (5) cardiopatía caracterizada por paredes ventriculares engrosadas en ausencia de hipertensión; (6) bloqueo auriculoventricular avanzado de origen desconocido, particularmente cuando se acompaña de un corazón engrosado; y (6) inclusiones de cuerpo vítreo del tipo algodonoso. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). El diagnóstico definitivo de amiloidosis de TTR, sin embargo, se basa normalmente en las biopsias de órganos objetivo, seguido por tinción histológica del tejido suprimido con el tinte específico de amiloide, Rojo Congo. Si se observa una prueba positiva para amiloide, la tinción inmunohistoquímica para TTR se realiza posteriormente para asegurar que la proteína precursora responsable de la formación amiloide sea en verdad TTR. Para las formas familiares de la enfermedad, la demostración de una mutación en el gen que codifica TTR, entonces, es necesario antes de hacer un diagnóstico definitivo.

La identificación del sujeto puede ocurrir en una configuración clínica, o en otro lugar, tal como en el hogar del sujeto, por ejemplo, a través de propio uso del sujeto de un kit de auto prueba. Por ejemplo, el sujeto puede identificarse basado en varios síntomas tales como la neuropatía periférica (sensorial y motora), neuropatía autónoma, disfunción gastrointestinal, miocardiopatía, nefropatía o sedimentación ocular. Ver Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). El sujeto puede también identificarse por los niveles incrementados de formas no nativas de TTR en las muestras de plasma del sujeto comparadas con muestras control, como se divulga en los ejemplos.

Como garantiza la historia familiar, la prueba genética o el cribado médico para la amiloidosis de TTR, el tratamiento puede iniciar a cualquier edad (por ejemplo, 20, 30, 40, 50, 60 o 70 años de edad). El tratamiento normalmente implica múltiples dosis en un período de tiempo y puede supervisarse mediante el ensayo de respuestas de anticuerpos o linfocitos T o linfocitos B activados a un agente terapéutico (por ejemplo, una forma truncada de TTR que comprende residuos de aminoácidos 89-97) a lo largo del tiempo. Si la respuesta no es exitosa, se indica una dosis de refuerzo.

Las aplicaciones profilácticas, un anticuerpo o una composición farmacéutica de la misma se administra a un sujeto susceptible a o en riesgo de contraer una enfermedad (por ejemplo, amiloidosis de TTR) en un régimen (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparición de al menos una señal o síntoma de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, un anticuerpo o inmunógeno para inducir un anticuerpo se administra a un sujeto que se sospecha que, o ya padece una enfermedad (por ejemplo, amiloidosis de TTR) en un régimen (dosis, frecuencia y vía de administración) eficaz para mejorar o al menos inhibir aún más deterioro de al menos una señal o síntoma de la enfermedad.

Un régimen se considera terapéutico o profilácticamente eficaz si un solo sujeto tratado logra un resultado más favorable que el resultado promedio en una población de control de sujetos comparables no tratados por métodos divulgados en el presente documento, o si un resultado más favorable es el demostrado por un régimen en los sujetos tratados contra los sujetos de control en un ensayo clínico controlado (p. ej., un ensayo de fase II, fase N/III o fase III) o un modelo animal en los niveles de p < 0,05 o 0,01 o incluso 0,001.

Un régimen eficaz de un anticuerpo puede utilizarse para, por ejemplo, inhibir o reducir la agregación de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de una afección asociada con la acumulación de TTR; inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR en un sujeto que tiene o está en riesgo de una afección asociada con la acumulación de TTR; reducir o limpiar los depósitos de TTR o TTR agregado en un sujeto que tiene o está en riesgo de una afección asociada con la acumulación de TTR; estabilizar conformaciones no tóxicas de TTR en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de una afección asociada con la acumulación de TTR; inhibir los efectos tóxicos de los agregados, fibrillas o depósitos de TTR en un sujeto que tiene o se encuentra en riesgo de una afección asociada con la acumulación de TTR; diagnosticar la presencia o ausencia de la acumulación de amiloides de TTR en un tejido que se sospecha que comprende de acumulación de amiloides; determinar un nivel de los depósitos de TTR en un sujeto mediante la detección de la presencia del anticuerpo enlazado en el sujeto después de la administración del anticuerpo; detectar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en un sujeto; supervisar y evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos que se utilizan para el tratamiento de pacientes diagnosticados con una amiloidosis de TTR; inducir una respuesta inmunitaria que comprende anticuerpos para TTR en un sujeto; retrasar el inicio de una afección asociada con la acumulación de amiloides de TTR en un sujeto; o tratar o realizar profilaxis de una amiloidosis de TTR en un paciente.

Las dosis eficaces varían dependiendo de muchos factores diferentes, tales como vías de administración, sitio de destino, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico.

Un intervalo de dosis ejemplar para anticuerpos puede ser de aproximadamente 0,1-20 o 0,5-5 mg/kg peso corporal (por ejemplo, 0,5, 1,2, 3, 4 o 5 mg/kg) o 10-1500 mg como una dosis fija. La dosificación depende de la condición del paciente y su respuesta al tratamiento previo, si lo hubiera, si el tratamiento es profiláctico o terapéutico y si el trastorno es agudo o crónico, entre otros factores.

El anticuerpo puede administrarse en estas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, trimestralmente o según cualquier otro calendario determinado por el análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración de dosis múltiples durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplar adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses.

Los anticuerpos pueden administrarse mediante una ruta periférica. Las vías de administración incluyen tópica, intravenosa, oral, subcutánea, intraarterial, intracraneal, intratecal, intraperitoneal, intranasal o intramuscular. Las rutas para la administración de anticuerpos pueden ser intravenosas o subcutáneas. La administración intravenosa puede ser, por ejemplo, por la infusión en un período tal como 30-90 min. Este tipo de inyección se realiza más típicamente en los músculos de los brazos y las piernas. En algunos métodos, los agentes se inyectan directamente en un tejido particular donde los depósitos se han acumulado, por ejemplo, inyección intracraneal.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral pueden ser estériles y sustancialmente isotónicas (250-350 mOsm/kg de agua) y fabricadas en condiciones de GMP. Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse en forma de dosis de unidad (es decir, la dosis de una sola administración). Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables, diluyentes, excipientes o auxiliares. La formulación depende de la vía de administración elegida. Para inyección, los anticuerpos pueden ser formulados en soluciones acuosas, por ejemplo, en tampones fisiológicamente compatibles como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica o tampón de acetato (para reducir las molestias en el sitio de inyección). La solución puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente los anticuerpos pueden estar en forma liofilizada para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Los regímenes pueden administrarse en combinación con otro agente eficaz en el tratamiento o profilaxis de la enfermedad tratada. Estos agentes pueden incluir ARNip para inhibir la expresión de TTR o Vyndaqel, un estabilizador de TTR en la formación de tetrámero.

Después del tratamiento, la afecciónn del sujeto puede evaluarse para determinar el progreso o eficacia de este tratamiento. Estos métodos preferiblemente analizan los cambios en los niveles de amiloides de TTR o los niveles de las formas no nativas de TTR. Por ejemplo, los niveles de amiloides de TTR pueden evaluarse para determinar la mejora relativa a los niveles de amiloides de TTR del sujeto en circunstancias comparables antes del tratamiento. Los niveles de amiloides de TTR del sujeto también pueden compararse con las poblaciones de control en circunstancias comparables. Las poblaciones de control pueden ser sujetos afectados de manera similar, sin tratar, o sujetos sin tratar normales (entre otros sujetos de control). La mejora con respecto a los sujetos afectados de manera similar, sin tratar, o niveles que se aproximan o alcanzan los niveles en los sujetos normales sin tratar, indica una respuesta positiva al tratamiento.

Los niveles de amiloides de TTR pueden medirse por varios métodos, incluyendo técnicas de obtención de imágenes. Los ejemplos de técnicas de obtención de imágenes adecuadas incluyen cribado PET con TTR radiomarcada de fragmentos de las mismas, los anticuerpos de TTR o fragmentos de los mismos, agentes de obtención de imágenes de amiloides basados en Rojo Congo, tales como, por ejemplo, PIB (documento US 2011/0008255), péptido de obtención de imágenes de amiloides p31 (Biodistribution of amyloid-imaging peptide, p31, correlates with amyloid quantitation based on Congo red tissue staining, Wall et al., resumen n.°. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting), y otros marcadores PET. Los niveles de las formas no nativas de TTR pueden medirse, por ejemplo, al realizar ensayos de placa SDS-PAGE/transferencia de Western o Meso Scale Discovery con los anticuerpos divulgados en el presente documento en las muestras de plasma o muestras de biopsias de un sujeto y comparándolos con las muestras de control, como se describe en los ejemplos.

A. Métodos de diagnóstico y supervisión

También se proporcionan métodos de detección de una respuesta inmunitaria contra TTR en un paciente que padece o es susceptible a las enfermedades asociadas con la sedimentación de TTR o formas patógenas de TTR (por ejemplo, formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR). Los métodos pueden utilizarse para supervisar un ciclo de tratamiento terapéutico y profiláctico con los agentes proporcionados en el presente documento. El perfil de anticuerpo después de la inmunización pasiva muestra normalmente un pico inmediato en la concentración de anticuerpo seguido de un deterioro exponencial. Sin otra dosis, el deterioro se aproxima a los niveles de pretratamiento dentro de un período de días o meses que dependen de la semivida del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la semivida de algunos anticuerpos humanos es de aproximadamente 20 días.

En algunos métodos, una medición de referencia del anticuerpo para TTR en el sujeto se realiza antes de la administración, una segunda medición se realiza un poco después para determinar el nivel de anticuerpo superior y se realizan una o más mediciones adicionales en intervalos para supervisar el deterioro de los niveles de anticuerpos. Cuando el nivel de anticuerpo ha decaído a la referencia o un porcentaje predeterminado del pico menos la referencia (por ejemplo, 50 %, 25 % o 10 %), se lleva a cabo la administración de otra dosis de anticuerpo. En algunos métodos, picos o niveles medidos posteriores menos el fondo se comparan con los niveles de referencia previamente determinados para constituir un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico beneficioso en otros sujetos. Si el nivel de anticuerpo medido es significativamente menor que un nivel de referencia (por ejemplo, menor que la media menos uno o, preferentemente, dos desviaciones estándar del valor de referencia en una población de sujetos que se benefician del tratamiento) se indica la administración de una dosis adicional de anticuerpo.

También se proporcionan métodos para la detección de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en un sujeto, por ejemplo, por la medición de amiloides de TTR o formas patógenas de TTR (por ejemplo, formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR) en una muestra de un suejeto o por la obtención de imágenes in vivo de t Tr en un sujeto. Estos métodos son útiles para diagnosticar o confirmar el diagnóstico de enfermedades asociadas con estas formas patógenas de TTR (por ejemplo, amiloidosis de TTR) o susceptibilidad a las mismas. Los métodos pueden usarse también en sujetos asintomáticos. La presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR indica susceptibilidad a la enfermedad sintomática futura. Los métodos también son útiles para seguimiento de la progresión de la enfermedad y/o respuesta al tratamiento en sujetos que han sido previamente diagnosticados con una amiloidosis de TTR.

Las muestras biológicas obtenidas de un sujeto que tiene, se sospecha que tiene o se encuentra en riesgo de tener una amiloidosis de TTR pueden ponerse en contacto con los anticuerpos divulgados en el presente documento para evaluar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR. Por ejemplo, los niveles de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en estos sujetos pueden compararse con los presentes en los sujetos sanos. Alternativamente, los niveles de amiloide de TTR o formas patógenas de TTR (por ejemplo, formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR) en estos sujetos que reciben tratamiento para la enfermedad pueden compararse con los de los sujetos que no han sido tratados para una amiloidosis de TTR. Algunas de estas pruebas involucran una biopsia de tejido obtenido de estos sujetos. Los ensayos ELISA pueden también ser métodos útiles, por ejemplo, para evaluar los niveles de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en las muestras de fluido. Algunos de estos ensayos ELISA implican anticuerpos anti-TTR que preferentemente enlazan las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR con relación a las formas tetraméricas normales de TTR.

Los métodos de obtención de imágenes in vivo pueden actuar por medio de la administración de un reactivo, tal como un anticuerpo que se enlaza a las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en el sujeto, y luego la detección del reactivo después de haberse enlazado. Estos anticuerpos se unen normalmente a un epítopo dentro de los residuos 89-97 de TTR. Si se desea, la respuesta de limpieza puede evitarse mediante el uso de fragmentos de anticuerpos que carecen de una región constante integral, tales como Fab. En algunos métodos, el mismo anticuerpo puede servir como reactivo de diagnóstico y tratamiento.

Los reactivos de diagnóstico pueden administrarse por inyección intravenosa en el cuerpo del sujeto o mediante otras vías consideradas razonables. La dosis del reactivo debe estar dentro de los mismos intervalos en cuanto a los métodos de tratamiento. Normalmente, el reactivo es marcado, aunque, en algunos métodos, el reactivo primario con afinidad para las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR no se marca y un agente secundario marcado se utiliza para unirse al reactivo principal. La elección del marcador depende de los medios de detección. Por ejemplo, un marcador fluorescente es conveniente para la detección óptica. El uso de marcadores paramagnéticos es adecuado para la detección tomográfica sin intervención quirúrgica. Los marcadores radiactivos también pueden ser detectados mediante PET o SPECT.

El diagnóstico se realiza comparando el número, tamaño y/o intensidad de locus marcados con valores de referencia correspondientes. Los valores de referencia pueden representar el nivel medio en una población de individuos no enfermos. Los valores de referencia también pueden representar los niveles anteriores determinados en el mismo sujeto. Por ejemplo, los valores de referencia se pueden determinar en un sujeto antes de iniciar el tratamiento y los valores medidos después de eso en comparación con los valores de referencia. Una disminución en los valores en relación con la referencia generalmente señala una respuesta positiva al tratamiento.

IX. Kits

La invención proporciona además kits (por ejemplo, recipientes) que comprenden los anticuerpos 6C1 humanizados aquí divulgados y materiales relacionados, tales como instrucciones de uso (por ejemplo, prospecto). Las instrucciones de uso pueden contener, por ejemplo, instrucciones para la administración de los anticuerpos y opcionalmente uno o más agentes adicionales. Los recipientes de anticuerpos pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes de dosis múltiples) o dosis subunitarias.

El prospecto se refiere a instrucciones que se incluyen habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos

Los kits también pueden incluir un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina con tampón de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También pueden incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

X. Otras aplicaciones

Los anticuerpos pueden utilizarse para detectar las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de transtiretina (TTR), o fragmentos de las mismas, en el contexto del diagnóstico o tratamiento clínico o en la investigación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en una muestra biológica como una indicación de que la muestra biológica comprende depósitos amiloides de TTR. El enlace de los anticuerpos a la muestra biológica puede comprarse con el enlace de los anticuerpos a una muestra de control. La muestra de control y la muestra biológica pueden comprender células del mismo tejido de origen. Las muestras de control y las muestras biológicas pueden obtenerse del mismo individuo o diferentes individuos y al mismo tiempo o en diferentes momentos. Si se desea, se evalúan múltiples muestras biológicas y múltiples muestras de control en múltiples ocasiones para proteger contra variaciones aleatorias independientes de las diferencias entre las muestras. Puede entonces realizarse una comparación directa entre la(s) muestra(s) biológica(s) y la(s) muestra(s) de control para determinar si el enlace del anticuerpo (es decir, la presencia de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR) a la(s) muestra(s) biológica(s) se incrementa, reduce o es el mismo, con respecto al enlace del anticuerpo a la(s) muestra(s) de control. El enlace incrementado del anticuerpo con la(s) muestra(s) biológica(s) en relación con la(s) muestra(s) de control indica la presencia de formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en la(s) muestra(s) biológica(s). En algunos casos, el enlace de anticuerpo incrementado es estadísticamente significativo. Opcionalmente, el enlace de anticuerpos con la muestra biológica es al menos de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 100 veces mayor que el enlace de anticuerpo con la muestra de control.

Además, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en una muestra biológica para supervisar y evaluar la eficacia de un agente terapéutico que se utiliza para tratar a un paciente diagnosticado de una amiloidosis de TTR. Una muestra biológica de un paciente diagnosticado de una amiloidosis de TTR se evalúa para establecer una referencia para el enlace de los anticuerpos con la mezcla (es decir, una referencia para la presencia de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR en la muestra) antes de comenzar la terapia con el agente terapéutico. En algunos casos, múltiples muestras biológicas del paciente se evalúan en múltiples ocasiones para establecer tanto una referencia, como una medida de variación aleatoria independiente del tratamiento. Después se administra un agente terapéutico en un régimen. El régimen puede incluir múltiples administraciones del agente en un período. Opcionalmente, el enlace de los anticuerpos (es decir, la presencia de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR) se evalúa en múltiples ocasiones en muestras biológicas múltiples del paciente, tanto para establecer una medida de variación aleatoria como para mostrar una tendencia en respuesta a la inmunoterapia. Entonces se comparan las diversas valoraciones del enlace del anticuerpo con las muestras biológicas. Si solo se realizan dos valoraciones, puede realizarse una comparación directa entre las dos valoraciones para determinar si el enlace del anticuerpo (es decir, la presencia de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR) se ha incrementado, disminuido o permanecido igual entre las dos evaluaciones. Si se realizan más de dos mediciones, las mediciones pueden analizarse como un ciclo de tiempo que empieza antes del tratamiento con el agente terapéutico y que proceden a través del transcurso de terapia. En los pacientes para los cuales el enlace de anticuerpo a las muestras biológicas ha disminuido (es decir, la presencia de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR), puede concluirse que el agente terapéutico fue eficaz en el tratamiento de la amiloidosis de TTR en el paciente. La disminución en el enlace de anticuerpo puede ser estadísticamente significativa. Opcionalmente, las disminuciones de enlace en al menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. La evaluación del enlace de anticuerpo puede realizarse en conjunto con la evaluación de otros signos y síntomas de la amiloidosis de TTR.

Los anticuerpos pueden utilizarse como reactivos de investigación para la investigación de laboratorio en la detección de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR, o fragmentos de las mismas. En estos usos, los anticuerpos pueden etiquetarse con moléculas fluorescentes, moléculas con marcaje de espín, enzimas o radioisótopos y pueden proporcionarse en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo de detección. Los anticuerpos también pueden utilizarse para purificar las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR o los compañeros de enlace de las formas monoméricas, mal plegadas, agregadas o en fibrillas de TTR, por ejemplo, por cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos pueden también utilizarse para inhibir o reducir la agregación de TTR, inhibir o reducir la formación de fibrillas de TTR, reducir o despejar los depósitos de TTR o agregados de TTR, o estabilizar las conformaciones no tóxicas de TTR en una muestra biológica. La muestra biológica puede comprender, por ejemplo, sangre, suero, plasma o tejido (por ejemplo, el tejido del corazón, el sistema nervioso periférico, el sistema nervioso autonómico, riñones, ojos o tubo digestivo). En algunos casos, la agregación de TTR, la formación de fibrillas de TTR o los depósitos de TTR se inhiben o reducen en al menos 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 % o 75 %, (por ejemplo, 10 %-75 % o 30 %-70 %). Los ensayos para detectar la formación de fibrillas se describen en otra parte en el presente documento. Ver también US 2014/0056904.

Si diferentes versiones de una secuencia están asociadas con un número de referencia en diferentes momentos, la versión asociada con el número de referencia en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud es la correcta. La fecha de presentación efectiva significa la más temprana de la fecha de presentación real o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiera al número de referencia, en su caso. Asimismo, si se publican diferentes versiones de una publicación, sitio web o similares en diferentes momentos, la versión más recientemente publicada a la fecha de presentación efectiva de la solicitud es la correcta a menos que se indique lo contrario. Cualquier característica, paso, elemento, realización o aspecto de la invención puede utilizarse en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente lo contrario. Si bien la presente invención se ha descrito con cierto grado de detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad y de comprensión, será evidente que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de los anticuerpos monoclonales mis-TTR

Los anticuerpos monoclonales conformacionalmente específicos contra las formas monoméricas, mal plegadas, en fibrillas o agregadas de TTR (mis-TTR) se generaron, cribaron, expresaron y purificaron como se describe en los Materiales y Métodos (a-d). Para generar los anticuerpos monoclonales mis-TTR, la estructura de cristal de TTR tetramérico humano se examinó para encontrar regiones de la proteína que se entierran en el tetrámero, pero expuestas tras la disociación del tetrámero en sus subunidades monoméricas. La región identificada fue los residuos 89-97 (EHAEVVFTA) (SEQ ID NO: 42) localizados dentro de la hebra F de la TTR y secuestrado en la interfaz de dímero de la proteína tetramérica. Una búsqueda BLAST de la base de datos de la proteína no reveló ninguna otra proteína humana que posee esta secuencia.

Se sintetizó un péptido que comprende esta secuencia (ggEHAEVVFTAggkg) (SEQ ID NO: 43). Las letras mayúsculas representan los residuos 89-97 de TTR. Las letras en minúsculas representan los residuos enlazadores adicionales agregadas para incrementar la solubilidad del péptido antigénico y para establecer el fragmento de 9 aminoácidos como una secuencia interna. Este péptido se vinculó a un núcleo dendrítico de poli-lisina, generando un inmunógeno de péptido antigénico múltiple (t TR-MAP) que comprende un núcleo de residuos de lisina con múltiples ramas vinculadas al péptido 89-97 de TTR. Los anticuerpos enlistados en la Tabla 2 se generaron contra TTR-MAP.

Además de este péptido antigénico múltiple, dos otros inmunógenos que contienen el mismo fragmento de TTR se generó al vincular de manera covalente los péptidos TTR 89-97 similares (Ac-cggEHAEVVFTA-amida (SEQ ID NO: 44) y Ac-EHAEVVFTAcgg-amida) (SEQ ID NO: 45) por medio de los residuos de cisteína N y C terminal a la hemocianina de lapa californiana (t Tr 89-97-N-KLH y TTR89-97-C-KLH).

Después de la generación, cribado, expresión y purificación de anticuerpos, los parámetros cinéticos de enlace detallados (tasa de asociación (ka), tasa de disociación (kd) y constante de la afinidad de unión (Kd)) se determinaron para los anticuerpos mis-TTR candidatos por Resonancia de plasmón superficial (RPS) para el TTR F87M/L110M recombinante humana, como se muestra en la Tabla 2. IgG anti-ratón (GE Healthcare) se inmovilizó en un chip sensor C5 (sin cadenas de dextrano) por medio de acoplamiento de amina siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit anti-ratón GE Healthcare y mAb mis-TTR se capturaron a un nivel para asegurar un enlace máximo de analito de 30-50 UR. Diferentes concentraciones de analito (TTR F87M/L110M recombinante humana) se pasaron sobre el ligando capturado a 30 pl/min en el tampón de ejecución (HBS P-200,05 %, 1 mg/ml de BSA) en diluciones triples. Para cada concentración, la reacción continuó durante un marco de tiempo que permitía que las concentraciones de analito altas alcancen el equilibrio durante la asociación, así como que al menos 10 % de la señal decayera durante la disociación. Al menos una concentración (no la más alta ni la más baja) se ejecutó por duplicado. Los intervalos de concentración de analito se seleccionaron basados en la experimentación preliminar para abarcar al menos 10 veces por encima de Kd hasta 10 veces por debajo de Kd.

Los resultados del análisis de RPS de mAb mis-TTR líder se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Ejemplo 2. Enlace de anticuerpos mis-TTR a Antígeno TTR.

Cuatro mAb mis-TTR candidatos (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) se analizaron por ELISA en concentraciones que van de 0,31 a 2,5 pg/ml utilizando tanto TTR tratado con pH 4,0 (pH4-TTR) como TTR nativa como el antígeno de revestimiento. La preparación de antígeno TTR y los protocolos de ELISA se describen en otra parte en Materiales y Métodos (e-g).

Las curvas de enlace resultantes y los valores tabulados Kd y Bmáx se muestran en la Figura 3 y la Tabla 3 a continuación. Los resultados en la Figura 3 se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y. Todos los mAb mostraron enlace significativo a pH4-TTR con valores Kd del intervalo de 16 nM (6C1) a 282 nM (9D5). Los valores Bmáx para enlazarse al pH4-TTR variaron de un mínimo de 0,65 u.a. (14G8) a un máximo de 2,02 (9D5). En contraste con el enlace a pH4-TTR, ninguno de los anticuerpos mostró enlace significativo a las TTR nativas, lo que indica que todos los anticuerpos de TTR generados fueron específicos para las formas no nativas de TTR.

T l

Ejemplo 3. El análisis de los anticuerpos mis-TTR por SDS-PAGE y NativePAGE

9D5 y 14G8 se analizó por SDS-PAGE/Western para demostrar la especificidad de enlace hacia las formas monoméricas/desnaturalizadas de TTR con TTR nativa, no-desnaturalizada. Los protocolos SDS-PAGE, NativePAGE y transferencia de Western se describen en otra parte en los Métodos y Materiales (h-j).

TTR no desnaturalizada o pH4-TTR se procesó en un gel de SDS-PAGE junto a TTR desnaturalizada por calor y pH4-TTR desnaturalizada por calor. Después de la electroforesis, el gel se analizó por transferencia de Western en nitrocelulosa y se tiñó con mAb de TTR 9D5 y 14G8. Ambos anticuerpos reconocieron solo TTR cuando se trató a pH4 o cuando TTR o pH4-TTR primero se desnaturalizó por calor antes de SDS-PAGE. Estas 9D5 y 14G8 por consiguiente muestran una especificidad de confórmeros de TTR generados por desnaturalización de la TTR o por tratamiento de la TTR a pH 4.

6C1 y 5A1 junto con mAb de TTR totales (7G7, 8C3) y el anticuerpo policlonal Sigma comercialmente disponible también se analizaron por SDS-PAGE/Western. Cada transferencia contuvo marcadores de peso molecular teñidos, TTR no desnaturalizada y pH4-TTR.

El gel de SDS-PAGE teñido mostró que la principal especie presente en la muestra de TTR no desnaturalizada fue un dímero ~38 kDa. En contraste, el componente principal presente en la muestra de pH4-TTR se procesó como un dímero ~35 kDa con una pequeña cantidad de dímero de un monómero ~15 kDa. Este dímero de procesó como una proteína ligeramente menor que el dímero presente en la muestra de TTR no desnaturalizada, lo que indica una diferencia conformacional entre estas dos especies de dímero de TTR.

Las transferencias de Western de TTR y pH4-TTR que usan los cuatro anticuerpos mis-TTR mostraron que estos mAb no reconocen la TTR no desnaturalizada, pero se enlazan tanto al monómero como al dímero desnaturalizado presente en la muestra de pH4-TTR. Por consiguiente, los cuatro mAb mis-TTR (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) muestran especificidades similares para las conformaciones no nativas de TTR cuando se analizan por SDS-PAGE/Western.

En contraste con los cuatro mAb mis-TTR, los dos mAb de TTR de control, 7G7 y 8C3 generados a través de la inmunización de ratones con TTR intacta reconocieron todas las especies de TTR presentes en las muestras de TTR y pH4-TTR, incluyendo especies de TTR tetraméricas. Por consiguiente, a diferencia de los mAb mis-TTR, estos mAb de control enlazan TTR pero con ninguna especificidad conformacional. El anticuerpo policlonal Sigma se comportaron de manera semejante a 7G7 y 8C3 de mAb de control.

TTR y pH4-TTR también se procesaron en un gel nativo para ver si las cuatro mAb mis-TTR eran capaces de mostrar la especificidad de la conformación en condiciones de gel no desnaturalizantes. En un gel PAGE nativo teñido, TTR se procesó como un dímero nativo de ~35 kDa con una pequeña cantidad de tetrámero. Por el contrario, pH4-TTR se procesó principalmente como una mancha de peso molecular alto con una cantidad traza del dímero de ~35 kDa. El anticuerpo policlonal Sigma no específico reconoció todas las especies de TTR presentes tanto en la TTR, como en la muestra de pH4-TTR. En contraste, 9D5 solo reconoció las especies de TTR de alto peso molecular presentes en la muestra de pH4-TTR. Como se observa en el estudio de SDS-PAGE/Western, 9D5 no reconoció ninguna de las especies nativas de TTR.

Todos los cuatro mAb mis-TTR se analizaron posteriormente por Native-PAGE/transferencia de Western. Como se espera y similar a 9D5, los otros mAb mis-TTR, 14G8, 6C1 y 5A 1, específicamente enlazados a las formas no nativas de alto peso molecular de TTR presentes en la muestra de pH4-TTR. Ninguno de estos anticuerpos reconoció el dímero de TTR nativa ~35 kDa. Estos resultados indican que los cuatro mAb mis-TTR se comportan de manera similar y reconocen solo las especies de TTR no nativas que son conformacionalmente distintas de la TTR nativa.

Ejemplo 4. La inhibición de la formación de la fibra de TTR por anticuerpos mis-TTR

TTR-Y78F es una variante de TTR que contiene una mutación puntual en la posición 78 en la secuencia de proteína que desestabiliza el tetrámero TTR. Con el tiempo y en condiciones ligeramente ácidas, esta variante de la TTR se disocia en sus subunidades monoméricas que luego pueden agregarse y formar fibras capaces de enlazarse a tioflavina T. De esta manera, el grado de formación de fibra puede supervisarse midiendo la fluorescencia de tioflavina T a 480 nm. La introducción de un anticuerpo mis-TTR específico para los monómeros o agregados de TTR disasociados impedirían que el conjunto de fibras de TTR, que dan lugar a una disminución de la fluorescencia de tioflavina T en relación a una reacción de control sin anticuerpo. Los protocolos para examinar la inhibición de la formación de fibras de TTR se describe en los Materiales y Métodos (k).

Los cuatro anticuerpos mis-TTR inhibieron fuertemente la formación de las fibras de TTR-Y78F reactivas con tioflavina T con respecto al control de isotipo (los resultados se muestran en la Figura 4 y se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y). El anticuerpo mis-TTR 5A1 inhibió casi completamente la formación de fibras. Estos resultados son coherentes con la idea de que los anticuerpos mis-TTR enlazan con las formas monoméricas y/o agregadas de TTR, impidiendo de esta manera la formación de fibras de TTR.

La Tabla 4 resume los datos de caracterización obtenidos para el conjunto de 4 anticuerpos mis-TTR (9D5, 14G8, 6C1 y 5A1) que mostró buena selectividad conformacional para las formas no nativas de TTR. Estos anticuerpos tenían afinidades (Kd) para pH4-TTR en el intervalo de 14,5 nM (6C1) a 257 nM (9D5) y valores Bmáx que van desde 0,65 u.a. (14G8) hasta 2,02 (9D5). Ninguno de estos anticuerpos reconoció TTR nativa, pero se enlazó a pH4-TTR en un SDS-PAGE/Western y a los agregados de TTR de alto peso molecular en un nativa-PAGE/Western. Estos anticuerpos también inhibieron la formación de fibrillas de TTR en el ensayo de formación de fibrillas utilizando Tio-T como la lectura.

Tabla 4

TTR-V122I es una variante de TTR que contiene una sola mutación puntual en la posición 122 que desestabiliza el tetrámero. La formación de fibrillas se asoció con un aumento en fluorescencia de ThT. El aumento de las concentraciones de mAb 14G8 causó una disminución monotónica en la fluorescencia de ThT que indica una inhibición subestequiométrica de fibrilación de TTR (CI50 = 0,028±0,009 mg/ml, n = 3; Figura 4B y Tabla 4a). El mAb de control de isotipo no causó inhibición de fibrilación de TTR (Figura 4C), demostrando así la especificidad de la inhibición mediada por 14G8.

Los valores de CI50 subestequiométricos comparables determinados para 5A1 y 6C1 (Tabla 4a) sugirieron mecanismos análogos de inhibición de fibrillas para cada uno de estos mAb mis-TTR. En contraste, 9D5 inesperadamente no logró inhibir la formación de fibrillas de TTR-V122I, a pesar de mostrar especificidad y afinidad similares para las TTR no nativas. Queda por explorar si 9D5 es más sensible a las condiciones de ensayo utilizadas.

Tabla 4a

Ejemplo 5. La caracterización inmunohistoquímica (IHC) de Tejido ATTR utilizando mAb mis-TTR

Los mAb mis-TTR candidatos inducidos por el fragmento TTR 89-97 de la proteína transtiretina se probaron inmunohistoquímicamente en tejido fresco congelado y procesado con parafina de pacientes de amiloidosis cardíaca de TTR confirmada. Los protocolos de obtención y preparación de muestras de tejido cardíaco, inmunohistoquímica (IHC) y análisis de imagen, se proporcionan en otra parte en los Materiales y Métodos (l-o). Los anticuerpos utilizados para IHC se describen en la Tabla 5.

Tabla 5

Se obtuvieron muestras de tejido cardíaco de pacientes con diagnósticos confirmados de mutaciones ATTR. La demografía para casos examinados inmunohistoquímicamente fueron como sigue y se resume en la Tabla 6: FAC = miocardiopatía amiloidótica familiar; FAP = polineuropatía amiloidótica familiar; 1o A l = amiloidosis de cadena ligera; ATTR = amiloidosis mediada por transtiretina; UNK = desconocido

Tabla 6

continuación

Los anticuerpos monoclonales de ratón (mAb mis-TTR) inducidos para el fragmento 89-97 de la proteína transtiretina se probaron inmunohistoquímicamente en tejido fresco congelado y procesado con parafina de pacientes de amiloidosis cardíaca de TTR confirmada. Cada anticuerpo mis-TTR demostró la inmunorreactividad en el tejido cardíaco ATTR. Se observó tinción oscura en depósitos a través del miocardio y la vasculatura. Cuando se comparó la inmunorreactividad con tinción con rojo Congo de tioflavina T, la mayoría de la inmunorreactividad en el tejido mostró alta congruencia con birrefringencia de rojo Congo y tinción positiva para tioflavina T. Esto confirma la naturaleza de lámina plegada en beta del amiloide de TTR depositado en este tejido. Estos anticuerpos mis-TTR también detectaron TTR pre-amiloide, que fueron localizados en áreas del miocardio que eran inmunopositivas para TTR pero negativas para rojo Congo o Tioflavina T. Las secciones de omisión del anticuerpo de control del isotipo IgG y el anticuerpo primario fueron negativas para la tinción en todos los tejidos examinados. Los anticuerpos reactivos hacia otras proteínas amiloidogénicas (cadenas ligeras lambda y kappa o amiloide A) fueron no reactivas hacia el tejido cardíaco ATTR utilizado en este análisis, indicando que los depósitos fueron TTR específicamente en naturaleza.

El patrón de tinción de anticuerpos mis-TTR se comparó con los obtenidos con un anticuerpo de referencia de TTR comercial bien caracterizado (prealbúmina, A0002; Dako; Carpinteria, CA). El anticuerpo de referencia DAKO tiñó el miocardio enfermo en las mismas zonas que los anticuerpos mis-TTR, pero produjo un patrón de tinción más difuso. El anticuerpo de referencia DAKO no tiñó los depósitos amiloideos de TTR congofílicos presentes en la vasculatura tan fuertemente como los anticuerpos mis-TTR.

Los anticuerpos mis-TTR no tiñeron el tejido normal, sin enfermedad. Además, como era de esperarse, la tinción con un anticuerpo de control de isotipo, 6F10 también fue negativo.

Para determinar si la reactividad de los anticuerpos mis-TTR fue específica para los depósitos de TTR, se examinó la reactividad cruzada de estos anticuerpos hacia el tejido cardíaco derivado de los pacientes diagnosticados con amiloidosis AL primaria. Como se esperaba, no se observó tinción del tejido amiloide AL, lo que confirma que los anticuerpos TTR reaccionan específicamente hacia tejidos enfermos ATTR.

El tejido cardíaco de los pacientes con diagnósticos confirmados de amiloidosis sistémica senil o de pacientes con FAC o FAP confirmada causada por mutaciones puntuales en el gen TTR también se tiñó positivamente con 14G8, 9D5, 6C1 y 5A1. Estos resultados indican que los anticuerpos mis-TTR tienen la capacidad de reconocer los depósitos de TTR en tejido cardíaco sin importar el genotipo ATTR.

Otros tejidos no cardíacos conocidos por expresar TTR también se examinaron para la tinción por 14G8, 9D5, 6C1 y 5A1 y se compararon con la tinción obtenida usando el anticuerpo de referencia DAKO. Como era de esperarse, el hígado, páncreas y plexo coroideo todos se tiñeron positivamente para TTR usando el anticuerpo de referencia Dako. Por el contrario, los anticuerpos mis-TTR solo tiñeron las células pancreáticas alfa en los islotes de Langerhans y el plexo coroideo, que sugieren que algunas de las TTR localizadas en estos órganos son distintos conformacionalmente de TTR expresada en el hígado. La falta de inmunorreactividad de mAb mis-TTR en el hígado sugiere que la gran cantidad de TTR expresada allí es principalmente TTR tetramérica, nativa y no tiene el epítopo mis-TTR expuesto.

Ejemplo 6. Análisis de ATTR frente a Plasma Humano Normal por SDS-PAGE/transferencia de Western y ensayo en placas de Meso Scale Discovery (MSD)

Seis muestras de plasma de pacientes confirmados para ATTR V30M (muestra n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y 6 muestras (muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) de los sujetos normales se obtuvieron de M. Saraiva (Universidad de Oporto, Portugal). La muestra n.° C6 fue una muestra de suero humano normal obtenida de una fuente comercial (BioreclamationlVT). Las muestras fueron analizadas por análisis de placa SDS-PAGE y transferencia de Western, o por ensayo de placa de MesoScale Discovery (MSD). Protocolos de estos ensayos se describen en otra parte en los Materiales y Métodos (p-r). Se generó una curva estándar para el Ensayo de placa MSD utilizando 6C1.

En las transferencias de Western resultantes que usan mAb mis-TTR 9D5 o 5A1, fueron evidentes las diferencias entre las muestras de plasma enfermas TTR-V30M y normales. Todas las muestras de plasma contenían una banda de TTR ~14 kDa que emigraron conjuntamente con el monómero de TTR no nativo presente en la muestra de referencia de pH4-TTR. En general, las muestras de plasma derivadas de los pacientes TTR-V30M (n.° 21, 22, 23, 24, 25 y 27) tenían más de estas especies de mis-TTR. Además, las muestras de plasma procedentes de pacientes V30M también contenían una banda ~30 kDa que migra conjuntamente con el dímero TTR no nativo presente en la muestra de referencia. A excepción de las muestras n.° 12 y n.° 18, las muestras de plasma derivadas de individuos normales poseían menos de esta especie de dímero.

Las transferencias de Western resultantes fueron analizadas y se representaron las intensidades de las bandas de dímeros y monómeros de TTR reactivas a 9D5 o 5A1 combinadas para cada muestra (los resultados se muestran en la Figura 5A (9D5) y 5B (5A1) y se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y). Con la excepción de las muestras de plasma n.° 15 y n.° 18, las muestras de plasma derivadas de los individuos normales (11, 12, 19 y 20) contuvieron menos dímero y monómero reactivo a 9D5 que las muestras derivadas de los pacientes V30M (21-25 y 27).

También se analizaron las 12 muestras de suero analizadas por transferencia de Western de 9D5 y 5A1 por análisis de placa MSD usando 6C1 como el anticuerpo de captura mis-TTR y el anticuerpo Dako-SulfoTag como el anticuerpo de detección. Los resultados de estos ensayos MSD se muestran en la Figura 6 y se presentan en unidades arbitrarias (u.a.) en el eje y. Las muestras 11, 12, 15, 18, 19 y 20 representan el plasma normal. Las muestras 21-25 y 27 representan plasma enfermo V30M.

Con la excepción de las muestras de plasma n.° 15 y n.° 18, la cantidad de TTR reactiva a 6C1 presente en las muestras de plasma procedentes de individuos normales fue menor que la observada en el plasma de individuos enfermos TTR-V30M. Los niveles de reactividad 6C1 medidos por el ensayo MSD se correlacionó muy bien con la cantidad de dímero y monómero reactivo a 9D5 observado anteriormente por SDS-PAGE/Western.

Para determinar la concentración de las especies reactivas de TTR presentes en las muestras de plasma, las mismas muestras fueron nuevamente analizadas utilizando 6C1 como el anticuerpo de captura y 8C3-SulfoTag como el anticuerpo de detección. Las señales MSD fueron convertidas a concentraciones de ng/ml de especies reactivas de TTR usando la curva estándar de TTR F87M/L110M generada anteriormente. Según este análisis, la concentración promedio de TTR reactiva a 6C1 presente en las muestras de control fue 271 /- 185 ng/ml. En contraste, la concentración promedio de TTR reactiva presente en las muestras de plasma enfermas de V30M fue mayor, en 331 /- 95 ng/ml. Tomados en conjunto, estos resultados de MSD indican que los anticuerpos mis-TTR son capaces de distinguir entre la enfermedad ATTR contra el plasma normal. Esto garantiza el desarrollo adicional de anticuerpos mis-TTR para el uso en los ensayos de diagnóstico de la enfermedad ATTR.

Ejemplo 7. Diseño de anticuerpos 6C1 humanizados

El punto de partida o anticuerpo donante para la humanización fue el anticuerpo de ratón 6C1. La secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada de m6C1 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera de m6C1 maduro se proporciona como SEQ ID NO: 13. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada se proporcionan como SEQ ID NO: 10-12, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera se proporcionan como SEQ ID NO: 18-20, respectivamente. La numeración de Kabat se utiliza a lo largo de este Ejemplo.

La variable kappa (Vk) de m6C1 pertenece al subgrupo 2 de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 2 de Kabat humano. La variable pesada (Vh) de m6C1 pertenece al subgrupo 3d de Kabat de ratón, que corresponde al subgrupo 3 de Kabat. Ver Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición. Publicación del NIH n.° 91-3242, 1991. El CDR-L1 de 16 residuos pertenece a la clase canónica 4, el CDR-L2 de 7 residuos pertenece a la clase canónica 1 y el CDR-L3 de 9 residuos pertenece a la clase canónica 1 en Vk. Ver Martin y Thornton, J. Mol. Biol.

263:800-15, 1996. El CDR-H1 de 10 residuos (un compuesto de CDR-H1 de Chothia y Kabat, residuos 26-35 como se muestra en la Tabla 7) pertenece a la clase canónica 1, y el CDR-H2 de 17 residuos pertenece a la clase canónica 1. Ver Martin y Thornton, J. Mol. Biol. 263:800-15, 1996. El CDR-H3 no tiene clases canónicas.

Los residuos en la interfaz entre los dominios de Vk y Vh son los encontrados comúnmente.

Se realizó una búsqueda sobre las secuencias de la proteína en la base de datos PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) para encontrar estructuras que proporcionarían un modelo estructural aproximado de 6C1. La estructura cristalina del anticuerpo fab (código pdb 3EYS) (Gardberg et al., Biochemistry (2009) Vol. 48(23), págs. 5210-5217) se utilizó para la estructura Vk dado que tuvo buena resolución (1,95 A), la similitud de secuencia general con 6C1 Vk y conservó la misma estructura canónica para los bucles que 6C1. Un anticuerpo dimérico (código pdb 2OTU) (Li et al., presentación a GenBank (2007)) fue utilizado para la estructura de Vh, ya que tenía buena similitud y resolución (1,68 A) y contenía las mismas estructuras canónicas para CDR-H1 y CDR-H2 que el 6C1 VH. El software BioLuminate (bajo la licencia de Schrodinger Inc.) fue utilizado para modelar una estructura aproximada de 6C1.

Una búsqueda de la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes del NCBI permitió una selección de marcos humanos adecuados en los cuales injertar las CDR murinas. Para Vh, se eligió la cadena pesada de Ig humana ADX65650 (GI: 323432015) (SEQ ID NO: 3) (Scheel et al., Presentación a GenBank (2010)). Comparte las formas canónicas de 6C1. Para Vk, se eligió una cadena ligera kappa humana con código de referencia del NCBI ABI74084 (GI: 114385652) (SEQ ID NO: 15) (Shriner et al. Presentación a GenBank (2006)). Tiene las mismas clases canónicas para CDR-L1 y L2 que para Vk parental.

Se construyeron seis variantes de región variable de cadena pesada humanizada y dos variantes de región variable de cadena ligera humanizada que contenían diferentes permutaciones de sustituciones (Hu6C1VHv1, Hu6C1VHv1b, Hu6C1VHv2, Hu6C1VHv2b, Hu6C1VHv3 y Hu6C1VHv3b (SEQ ID NO: 4-9, respectivamente) y Hu6C1VLv1-2 (SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente)) (Tablas 7 y 8). Los diseños Vh y Vk humanizados ejemplares, con retromutaciones y otras mutaciones basadas en marcos humanos seleccionados, se muestran en las Tablas 7 y 8, respectivamente. Las áreas sombreadas de gris en la primera columna en las Tablas 7 y 8 indican las CDR definidas por Chothia, y las áreas sombreadas de gris en las columnas restantes en las Tablas 7 y 8 indican las CDR definidos por Kabat. Las SEQ ID NO: 4-9, 16 y 17 contienen retromutaciones y otras mutaciones como se muestran en la Tabla 9. Los aminoácidos en las posiciones L2, L45, H19, H44, H49, H76, H77, H82(a), H83 y H89 en Hu6C1VHv1, Hu6C1VHv1b, Hu6C1VHv2, Hu6C1VHv2b, Hu6C1VHv3 y Hu6C1VHv3b y en Hu6C1VLv1-2, se enumeran en la Tabla 10.

Tabla 7

Regiones Vh 6C1 humanizadas

(continuación)

Tabla 7 Regiones Vh 6C1 humanizadas

(continuación)

Tabla 7 Regiones Vh 6C1 humanizadas

(continuación)

Tabla 7 Regiones Vh 6C1 humanizadas

Tabla 8 Regiones 6C1 Vk humanizadas

(continuación)

Tabla 8 Regiones 6C1 Vk humanizadas

(continuación)

Tabla 8

Regiones 6C1 Vk humanizadas

Tabla 9 Retromutaciones Vh Vl otras mutaciones

Table 10

Kabat Numbering of Framework Residues

for Backmutations and Other Mutations in Humanized 6C1 Antibodies

Una alineación de la secuencia 6C1 Vh murina (SEQ ID NO: 1) con la secuencia del modelo de ratón (2OTU B.pro; SEQ ID NO: 2), la secuencia aceptora humana (ADX65650; Se Q ID NO: 3) y la secuencia Hu6C1VHv1, Hu6C1VHv1b, Hu6C1VHv2, Hu6C1VHv2b, Hu6C1VHv3 y Hu6ciVHv3b (SEQ ID NO: 4-9, respectivamente), se muestra en la Figura 1. Las posiciones en las que los residuos canónicos, de vernier o de interfaz difieren entre las secuencias aceptoras de ratón y humana son candidatas para la sustitución. Los ejemplos de residuos de fundación de vernier/CDR incluyen residuos Kabat 2, 49, 69, 71,75, 78 y 94 en la Tabla 7. Los ejemplos de residuos de interacción canónica/CDR incluyen residuos Kabat 24, 48 y 73 en la Tabla 7. Los ejemplos de residuos (VH+VL) de interfaz/empaquetamiento incluyen residuos Kabat 37, 39, 45, 47, 91, 93 y 103 en la Tabla 7.

Una alineación de la secuencia 6C1 Vk murina (SEQ ID NO: 13) con la secuencia del modelo de ratón (3EYS_L_St.pro; SEQ ID NO: 14), la secuencia aceptora humana (ABI74084; SEQ ID NO: 15) y las secuencias Hu6C1VLv1 y Hu6C1VLv2 (SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente), se muestra en la Figura 2. Las posiciones en las que los residuos canónicos, de vernier o de interfaz difieren entre las secuencias aceptoras de ratón y humano son candidatas para la sustitución. Los ejemplos de residuos de fundación de vernier/CDR incluyen residuos Kabat 4, 35, 46, 49, 66, 68 y 69 en la Tabla 8. Los ejemplos de residuos de interacción canónica/CDR incluyen residuos Kabat 2, 48, 64 y 71 en la Tabla 8. Los ejemplos de residuos (VH+VL) de interfaz/empaquetamiento incluyen residuos Kabat 36, 38, 44, 87 y 98 en la Tabla 8.

Los fundamentos para la selección de las posiciones indicadas en la Tablas 9 y 10 en la región variable de cadena ligera como candidatos para la sustitución son los siguientes.

I2V: Este es un residuo de interacción con CDR canónico. La cadena lateral más voluminosa de Ile podría interferir potencialmente con el empaquetamiento de CDR L1 y L2. Este residuo es retromutado a Val en Hu6C1VH1.

Q45K: Lys es más frecuente en esta posición que Gln en la secuencia humana; por lo tanto, se trata de una retromutación basada en frecuencia.

Los fundamentos para la selección de las posiciones indicadas en la Tablas 9 y 10 en la región variable de cadena pesada como candidatos para la sustitución son los siguientes.

R19K: Lys forma enlaces H con residuos adyacentes mientras que Arg no.

G44R: Arg forma enlaces H con residuo de interfaz Phe98 en la cadena ligera, mientras que Gly no.

S49A: Ser puede formar potencialmente un enlace H con Hys en CDR-H2.

N76S: Hay una exposición alta a la desamidación en este residuo. Ser es el segundo más frecuente en la línea germinal humana en esta posición.

S77T: La serina en esta posición es poco común en los marcos de cadena pesada relevantes humanos, mientras que la Treonina es más frecuente en la posición 77. Esta retromutación se ha hecho para mitigar cualquier potencial de inmunogenicidad.

N82(a)S: Hay una exposición alta a la desamidación en este residuo. Ser es el segundo más frecuente en la línea germinal humana en esta posición.

R83K: Lys en esta posición forma múltiples interacciones con residuos adyacentes y parece ejercer un efecto estabilizador en el bucle, mientras que Arg no.

V89M: Met forma enlaces H con residuo de interferencia Tyr91 y parece estabilizar la interfaz, mientras que Val no interactúa con Tyr91.

Las dos variantes de región de variables de cadena ligera humanizadas y dos variantes de región variable de cadena pesada humanizadas son los siguientes:

Hu6C1VL versión 1 (retromutaciones I2V y Q45K en minúsculas):

DvVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPkLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 16)

Hu6C1VL versión 2 (retromutación Q45K en minúsculas):

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPkLLIYKVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 17)

Hu6C1VH versión 1 (retromutación S77T en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISIDGNNIYHPDSVKGRFTISRDNAKN

tLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4)

Hu6C1VH versión 1b (retromutaciones S49A y S77T en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVaYISIDGNNIYHPDSVKGRFTISRDNAKN tLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSDYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5)

Hu6C1VH versión 2 (retromutaciones N76S, S77T y N82(a)S en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISIDGNNIYHPDSVKGRFTISRDNAKst LYLQMsSLRAEDTAVYYCARDSDYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)

Hu6C1VH versión 2b (retromutaciones S49A, N76S, S77T y N82(a)S en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVaYISIDGNNIYHPDSVKGRFTISRDNAKst LYLQMsSLRAEDTAVYYCARDSDYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7)

Hu6C1VH versión 3 (retromutaciones R19K, G44R, S77T, R83K y V89M en minúsculas): EVQLVESGGGLVQPGGSLkLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKrLEWVSYISIDGNNIYHPDSVKGRFTISRDNAKNt LYLQMNSLkAEDTAmYYCARDSDYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8)

Hu6C1VH versión 3b (retromutaciones R19K, G44R, S49A, S77T, R83K y V89M en minúsculas):

EVQLVESGGGLVQPGGSLkLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKrLEWVaYISIDGNNIYHPDSVKGRFTISRDNAKNtL YLQMNSLkAEDTAmYYCARDSDYGYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 9)

Ejemplo 8. Análisis cinético de enlace de Anticuerpos 6C1 humanizados

La cinética de enlace anticuerpos 6C1 humanizados que comprende una cadena pesada seleccionada de la versión 3b y una cadena ligera de la versión 2 se caracterizaron por Biacore y se muestra a continuación.

Ejemplo 9. Materiales y Métodos

a. Protocolo de Generación de Anticuerpos

Los ratones fueron inmunizados semanalmente con los péptidos antigénicos TTR-MAP, TTR89-97-N-KLH o TTR89-97-C-KLH en adyuvante RIBI o mensualmente en adyuvante TiterMax. Tres a cuatro días antes de la fusión, se les dio a los ratones seleccionados un estímulo IV final con inmunógeno en solución salina. Se homogenizó el bazo para preparar esplenocitos y se fusionó con las células de mieloma SP2/0 usando un protocolo estándar de electrofusión. Células fusionadas en los medios de selección se colocaron en placas de 96 pocillos y se cribaron después de 7-10 días.

b. Protocolo de cribado de anticuerpos

La selección de hibridoma se basó en la siguiente detección ELISA: las placas ELISA de 96 pocillos se cubrieron con anti-His de pollo, 1 pg/ml de PBS y se incubaron durante 1 hora. Las placas fueron bloqueadas con solución de 1 % de BSA/PBS, 200 pl/pocillo durante 15 minutos, después se agregaron 0,5 pg/ml de pH4-TTR, 50 pl/pocillo y se incubaron durante 1 hora. pH4-TTR es TTR que ha sido sometido a pH bajo (acetato de sodio 50 mM, pH 4,0) con el fin de disociar/agregar TTR, exponiendo el epítopo TTR89-97. Las placas se lavaron dos veces con TBS-T. Se agregó sobrenadante de las placas de fusión, 50 pl/pocillo y se incuba durante 1 hora. Las placas se lavaron dos veces con TBS-T. El anticuerpo de detección, cabra anti-ratón (IgG1, 2a, 2b, 3 específicos)-HRP diluido 1:5000 en 0,5 % de BSA/PBS/TBS-T, 50 pl/pocillo se añadió y se incubó durante 1 hora. Finalmente, se lavaron cinco veces las placas con sustrato TBS-T y se agregó TMB, 100 pl/pocillo. Después de 15 minutos, el desarrollo de sustrato se detuvo con el ácido sulfúrico 2 N, 50 pl/pocillo. Se leyeron las placas a 450 nm. Pocillos con un diámetro exterior > 1,0 se seleccionaron y las células se transfirieron a una placa de 24 pocillos. Después de 3 días de crecimiento, se contracribaron los clones con el ensayo anterior para confirmar el enlace y la sustitución de TTR nativa para pH4-TTR como un contracribado negativo, permitiendo la selección de los clones que produce mAb TTR específicos para las formas no nativas de TTR.

c. Protocolos de expresión de anticuerpos

Los plásmidos de cadena ligera y de cadena pesada impulsados por CMV portando secuencias de anticuerpo monoclonal humanizado se transfectaron en las células CHO-S1 (Life Technology). La doble selección se aplicó para hacer un grupo seleccionado. El medio acondicionado fue probado para la titulación, enlace y análisis por SDS-PAGE/transferencia de Western. Los grupos seleccionados se utilizaron para la generación de clon utilizando el sistema Clonepix (Molecular Devices). Los clones fueron clasificados basados en la titulación de anticuerpos. Los clones seleccionados se ampliaron y depositaron.

El clon de producción más alta fue ampliado en matraces de agitación y el cultivo se utilizó para inocular cultivos de bolsa Wave de 10-25 l. Una mezcla de medio de expresión FreeStyle-CHO, CD OptiCHO y FreeStyle F17 complementado con Glutamax (medio y Glutamax de Life Technology) se utilizó para el matraz de agitación así como para los cultivo de bolsa Wave. El cultivo discontinuo se hizo utilizando un Biorreactor Wave (GE Heathcare) a 37 °C, 7 % de CO2 con agitación constante. Se extrajeron las muestras periódicamente para supervisar el número de células, la viabilidad y la producción de anticuerpos. Se realizó complementación con Cell Boost (HyClone) si fue necesario. El cultivo discontinuo se recogió cuando la viabilidad de células comenzó a decaer por debajo del 90 % (5-7 días).

d. Protocolo de purificación de anticuerpos

El cultivo celular se recogió después de primero permitir que las células en suspensión se sedimentaran en la parte inferior de la bolsa Wave por medio de gravedad a 4 °C. El medio recogido se aclaró a través de un filtro de profundidad (Millistak Pod COHC, Millipore), se concentró 10 veces por filtración de flujo tangencial (Pelicon 2PLC 30K, Millipore) y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,2 |jm (Opticap XL, Millipore). El medio acondicionado concentrado se cargó entonces en una columna de Flujo rápido de Sepharose de proteína G (GE Lifesciences) prequilibrada en IxPBS, pH 7,4 utilizando un FPLC (Akta Avant, GE Lifesciences). Las proteínas sin enlazar se lavaron de la columna con 5 -l0 volúmenes de columna de IxPBS, pH 7,4 hasta que la DO280 alcanza la referencia. El anticuerpo enlazado se eluyó de la columna con 2 volúmenes de columna de Tampón de elución IgG (Thermo Scientific). Las fracciones de elución se recogieron y se neutralizó el pH con Tris 2 M, pH 9,0 (60 j l por 1 ml de elución).

Las fracciones que contenían anticuerpos se agruparon y se dializaron durante la noche a 4 °C contra IxPBS, pH 7,4. Luego se esterilizó la muestra dializada por ultrafiltración a través de un filtro PES 0,2 jm y se almacenó a 4 °C. Se determinó la concentración final de ácido bicinconínico (BCA) con gammaglobulina bovina como el estándar de proteína (Thermo Scientific).

e. Protocolos de purificación y expresión de TTR recombinante

Las células de E. coli (BL21-A1) se transformaron con un plásmido pET21a(+) que contiene un inserto de TTR (MethTTR-(His)6 o una variante de TTR que contiene una mutación doble F87M/L110M. Las células fueron cultivadas en caldo 2YT que contiene 100 jg/m l de ampicilina. La expresión de TTR se indujo durante la noche a 20 °C en presencia de IPTG 1 mM y 005 % de arabinosa.

Las células se recogiern por centrifugación a 4000 x g durante 10 min. y se almacenaron a -80 °C hasta utilizarse. Se descongelaron sedimentos de células de 10-15 g y se lisaron en 50 ml de Tampón A (1xPBS que contiene 500 mM de NaCl, 20 mM de imidazol) al procesarlo a través de un procesador de alta cizalla LV-1 (Microfluidics, Inc.). Las células lisadas se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 min, se filtraron a través de un filtro PES de 0,2 jm antes de la purificación en una columna HP His-Trap (GE Lifesciences). Después de cargar, la columna se lavó con 10 c.v. de Tampón A y se eluyó con Tampón B (1xPBS con 500 mM de NaCl, 500 mM de imidazol). Las fracciones pico que corresponden a TTR se recolectaron, se dializaron contra 1xPBS y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

f. Preparación de antígeno TTR

El antígeno TTR nativo se preparó diluyendo un suministro concentrado de TTR-6His recombinante a una concentración final de 2,5 jg/m l en 1x PBS. La TTR tratada con pH4 se generó por incubación de TTR recombinante a una concentración de 0,2 mg/ml en 50 mM de acetato de sodio, pH 3,95 durante 72 horas a temperatura ambiente. En estas condiciones, la TTR se disocia en una mezcla de monómeros y formas agregadas de TTR que son distintas estructuralmente de la TTR nativa. Entonces, se diluyó pH4-TTR a una concentración final de 2,5 jg/m l en 1xPBS inmediatamente antes de utilizar en el ensayo. Se revistieron placas de 96 pocillos (Costar n.° 3690) a temperatura ambiente con 50 j l por pocillo de 1,0 jg/m l de anticuerpo policlonal de pollo anti-his (Abcam n.° Ab9107) en 1xPBS durante 1 h. La solución de revestimiento se descartó y la placa se bloqueó con un volumen de 250 jl/pocillo de 1x BSA que contiene tampón de bloqueo diluido en 1xPBS (G-Biosciences n.° 786-193) durante 1 h.

g. Protocolo ELISA

Las placas de 96 pocillos revestidas y bloqueadas se trataron con 50 j l por pocillo de 2,5 jg/m l de antígeno TTR (ya sea TTR nativa o pH4-TTR) durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces, se lavaron las placas dos veces con 250 j l por pocillo de tampón lavado (1x Solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05 % de Tween-20). Las placas lavadas se trataron después con 50 j l por pocillo del anticuerpo monoclonal anti-TTR apropiado a concentraciones en el intervalo de 0,31 a 2,5 jg/ml, durante 1 h.

Las placas tratadas se lavaron 3 veces con 250 j l por pocillo de tampón de lavado. Después del lavado, las placas se trataron durante 1 h con 50 j l por pocillo de anticuerpo de detección que comprende una dilución de 1:5000 de conjugado de peróxido con cabra anti-ratón (Jackson ImmunoResearch n.° 115-035-164) en 1xPBS. Luego, la placa se lavó 3 veces antes de la adición de 100 j l por pocillo de sustrato TMB (Rockland). Se permitió que la reacción HRP continuara a temperatura ambiente durante 15 min antes de detenerla con un volumen de 50 j l por pocillo de H2SO4 1 N. La absorbancia espectroscópica se midió a una longitud de onda de 450 nm.

h. SDS-PAGE

La electroforesis en los geles SDS de poliacrilamida se llevó a cabo de la siguiente manera. 0,1-1 jg de TTR o pH 4,0-TTR en tampón de muestra de 1xLDS (Life Technologies) se cargó en un 10 % de gel NuPAGE bis-tris y se sometió a electroforesis en tampón MES a 90 V constantes durante 105 minutos. Después de la electroforesis, el gel se tiñó en Instant Blue (Expedeon) o se transfirió a filtros de nitrocelulosa para el análisis de transferencia de Western.

i. NativePAGE

La electroforesis en los geles de tris-glicina nativa se llevó a cabo de la siguiente manera. 0,1-1 jg de TTR o pH 4,0-TTR en tampón de muestra de 1xTris-glicina (Life Technologies) se cargó en un 10-20 % de gel Tris-glicina y se sometió a electroforesis en tampón de ejecución de Tris-glicina 1x nativa a 120 V constantes durante 105 minutos.

Después de la electroforesis, el gel se tiñó en Instant Blue (Expedeon) o se transfirió a filtros de nitrocelulosa para el análisis de transferencia de Western.

j. Transferencia de Western

Los geles SDS- o Native-PAGE se transfirieron en papel de filtro de nitrocelulosa (iBlot, Programa P7) y se bloquearon con tampón de bloqueo (Licor) durante 30 minutos. Los filtros se incubaron entonces en 0,5 pg/ml de anticuerpo primario en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (o durante una noche a 4 °C), seguido de tres lavados de 10 minutos con IxTBS. Los filtros se colocaron en anticuerpo secundario de cabra conjugado con IRDye 800CW anti-ratón diluido 1:20.000 en tampón de bloqueo. Después de incubar los filtros en solución de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, los filtros se lavaron y se obtuvieron imágenes en una cámara infrarroja Odyssey CLx (Licor).

k. Protocolo de ensayo de formación de fibra TTR

Una solución de 3,6 pM (0,2 mg/ml) de TTR-Y78F en 50 mM de acetato de sodio, pH 4,8 se incubó a 37 °C durante 72 horas en la presencia de 1,4 pM (0,2 mg/ml) de anticuerpo mis-TTR o un isotipo de control. Después de la incubación, un exceso molar 5X de tioflavina T se añadió a la mezcla y se permitió que se enlazara durante 30 minutos. Las mediciones fluorométricas se midieron en una longitud de onda de emisiones de 480 nm con una longitud de onda de excitación establecida a 440 nm. La inhibición del 0 % se estableció como la intensidad de fluorescencia en presencia de un anticuerpo de control de isotipo (83 u.a.) y el punto de inhibición de 100 % se estableció como la fluorescencia en ausencia de la proteína TTR-Y78F (38 u.a.).

l. Muestras de tejido cardíaco

Los bloques frescos congelados y procesados con parafina del tejido cardíaco con los diagnósticos confirmados de las mutaciones de ATTR se obtuvieron del Dr. Merrill Benson en la Universidad de Indiana. Las muestras incluyeron ocho muestras frescas congeladas y seis muestras FFPE y cada muestra se diagnosticó con ATTR o alguna otra amiloidosis cardíaca. El diagnóstico del tejido se confirmó adicionalmente en Prothena por medio de la tinción IHC con anticuerpos para las cadenas ligeras kappa y lambda y el amiloide A antes de la caracterización con los anticuerpos TTR.

m. Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se realizó en criosecciones montadas deslizantes de 10 pm ligeramente fijadas en paraformaldehído y en secciones de parafina de 5 pm. El método de inmunoperoxidasa fue el sistema de detección principal, el cual se realizó en el Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL) que utiliza el kit de detección de refinamiento de polímero de enlace (DS980, Leica Biosystems). Los anticuerpos principales se incubaron durante una hora (de acuerdo con las concentraciones en la Tabla 2) después de la incubación con conjugados de anticuerpo de enlazador HRP polimérico anti-ratón y anti-conejo. Se visualizó la tinción con un cromógeno DAB, el cual produjo un depósito marrón. Los deslizamientos se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron en una serie ascendente de alcoholes, se aclararon en xilenos y se taparon con cubreobjetos con CytoSeal 60 (Richard Allen Scientific; Kalamazoo, MI). El control negativo consistió en realizar el procedimiento inmunohistoquímico completo en secciones adyacentes con un control de isotipo IgG no inmune o una omisión del anticuerpo primario.

n. Demostración del amiloide: Método de tinción con rojo Congo y Tioflavina T

Se realizó tinción rojo Congo para demostrar el amiloide TTR en el tejido que utiliza un kit de American MasterTech (Lodi, California). La tinción se realiza de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Se tiñeron los portaobjetos en la solución de rojo Congo durante 1 hora seguido de la diferenciación en 1 % de hidróxido de sodio durante aproximadamente 15 segundos. Los portabobjetos después se enjuagaron en agua corriente, se deshidrataron a través de una serie de alcohol de concentraciones crecientes y se despejaron a través de tres cambios de xilenos y se taparon con cubreobjetos con CytoSeal 60.

Un protocolo de tinción de tioflavina T modificada (Schmidt et al 1995.) se empleó para determinar la presencia del amiloide TTR en el tejido. Brevemente, los portaobjetos se contratiñeron con una hematoxilina Mayers, se enjuagaron en agua corriente y se tiñeron con una solución filtrada de 0,015 % de Tioflavina T (T3516-25G; Sigma-Aldrich, San Luis, MO) in 50 % de etanol durante diez minutos. Los portaobjetos se enjuagaron después en agua corriente y se diferenciaron en ácido acético al 1 % (v/v) durante 10 minutos y se enjuagaron tres veces en agua. Se les permitió a los portaobjetos secarse al aire antes de taparse con cubreobjetos con ProLong Gold (Life Technologies).

o. Análisis de imagen

Los portaobjetos se fotografiaron con un microscopio Olympus BX61, escáner de portaobjetos digita1Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT o un sistema confocal espectral Leica SPE. Se obtuvieron imágenes y se almacenaron como archivos TIFF.

p. Análisis de muestras de plasma humana por SDS-PAGE/Western

Seis muestras de plasma de pacientes confirmados para V30M ATTR (Muestra n.° 21, n.° 22, n.° 23, n.° 24, n.° 25, n.° 27) y 6 muestras (Muestra n.° 11, n.° 12, n.° 15, n.° 18, n.° 19, n.° 20) de los sujetos normales se obtuvieron de M. Saraiva (Universidad de Oporto, Portugal). La muestra n.° C6 fue una muestra de suero humano normal obtenida de una fuente comercial (BioreclamationlVT). Estas muestras de plasma se separaron por SDS-PAGE y se les realizó transferencia de Western con 9D5 como sigue. Un volumen de 1,4 j l de plasma se diluyó 1:8 en tampón de muestra 1xLDS en ausencia del agente de reducción (Life Technologies). Las muestras se sometieron a la separación de SDS-PAGE y transferencia de Western con 0,5 jg/m l de 9D5 como se describió previamente.

q. El análisis de las muestras de plasma humano por Ensayo de Placa de MesoScale Discovery (MSD)

Las placas MSD de 96 pocillos se revistieron con anticuerpo monoclonal 6C1 a una concentración de 4 jg/m l en PBS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación o durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST antes de que se bloquearan con solución de Bloqueador A MSD al 3 %, 150 j l por pocillo durante 1 hora de agitación. Un volumen de 30 j l por pocillo de muestras de plasma humano diluido 1:10 en un tampón de muestra que comprende 0,6 % de seroalbúmina bovina libre de globulina, 1,5 mM de fosfato de sodio monobásico, 8 mM de fosfato de sodio dibásico, 145 mM de cloruro de sodio, 0,05 % de Triton X-405 y 0,05 % de timerosal se agregó a las placas MSD bloqueadas durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con 1xTBST. Un volumen de 50 j l por pocillo de 1 jg/m l de anticuerpo de detección sulfo-etiquetado (cualquier anticuerpo TTR total 8C3 del anticuerpo policlonal Dako) en tampón de muestra se agregó durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST seguido de la adición de 150 j l por pocillo de solución T de Tampón de lectura IX (Meso Scale Discovery). Las placas se leyeron entonces en el aparato de captura de imágenes Sector MSD.

r. Generación de una curva estándar MSD

Para cuantificar la cantidad de proteína TTR no nativa, reactiva a 6C1 presente en las muestras de plasma humanas, se generó una curva estándar MSD que usa TTR-F87M/L110M recombinante como un estándar de TTR reactiva a 6C1. Estas variantes de TTR contienen dos sustituciones de aminoácidos que evitan la formación de tetrámero y mantienen la proteína en el estado de monómero (Jiang et al. (2001) Biochemistry 40, 11442-11452). De esta forma, esta variante de TTR es reconocida por todos los mAb mis-TTR y es por lo tanto adecuada para el uso como un estándar de referencia en el ensayo MSD.

Para generar la curva estándar, las placas MSD de 96 pocillos se revistieron con anticuerpo mis-TTR 6C1 a una concentración de 4 jg/m l en PBS y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación o durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con 1xTBST antes de que se bloquearan con solución de Bloqueador A MSD de 3 %, 150 j l por pocillo durante 1 hora de agitación. Las placas bloqueadas se trataron entonces durante 1 hora con 50 j l por pocillo de 25 jg/m l de TTR-F87M/L110M diluido en serie 1:5 siendo la última dilución un tampón en blanco. Las placas se lavaron 3 veces con 1xTBST antes de la adición de un volumen de 50 j l por pocillo de 1 jg/m l de anticuerpo de detección SulfoTag (8C3-SulfoTag o Dako pAb-SulfoTag) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Tanto mAb 8C3 como el anticuerpo Dako se acoplaron con el SulfoTag y pudo utilizarse en el anticuerpo de detección dado que se enlaza a la TTR total y no fueron específicos de conformación.

Después del tratamiento con el anticuerpo de detección, las placas se lavaron tres veces con un volumen de 150 j l por pocillo de 1xTBST, seguido de la adición de 150 j l por pocillo de 1x Tampón de lectura T (MSD). Las placas se leyeron en el aparato de captura de imágenes Sector MSD y se generó una curva de calibración F87M/L110M de TTR resultante.

Ejemplo 10. La evaluación de los Anticuerpos mis-TTR en el Modelo de Ratón Transgénico

Los estudios in vivo se realizan en un modelo de ratón transgénico humanizado V30M hTTR (Inoue et al., (2008) Specific pathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mouse models. Transgenic Research 17:817-826) para valorar la eficacia de los anticuerpos anti-TTR en el enlace y eliminación de la hTTR agregada.

Los ratones transgénicos se crían utilizando procedimientos estándar y sus niveles hTTR de circulación se evalúan por ELISA. Los ratones con un nivel de suero de 200-400 j g/ml de hTTR se utilizan para los estudios de eficacia posteriores. El primer conjunto de estudios examina la sedimentación natural de hTTR en los ratones transgénicos. La detección de los depósitos hTTR se inicia a los 12 meses de edad y se repite cada 3-6 meses después de eso. Una vez que el nivel aceptable de agregados se observa en los ratones transgénicos, se inician los estudios de eficacia. Los animales se dividen en tres grupos de tratamiento (n=10/grupo) y se tratan semanalmente durante cuatro semanas con una dosis IP de vehículo, anticuerpo de control (isotipo de control, 10 mpk) o un anticuerpo anti-hTRR (10 mpk). Una semana después del último tratamiento los ratones son sacrificados, se recolectan los tejidos y se procesan y luego se tiñen para evaluar el número y tamaño de los depósitos de TTR restantes. Se emplean métodos cuantitativos y estadísticas para determinar el grado de eliminación visto entre los grupos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une específicamente a transtiretina que comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera madura que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que tiene un isotipo IgG1 humano o tiene un isotipo IgG2 o IgG4 humano.

3. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que es un tetrámero que comprende un par de cadenas ligeras y un par de cadenas pesadas.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que es un fragmento de unión, opcionalmente en donde el fragmento de unión es un anticuerpo monocatenario, fragmento Fab o Fab'2.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la región variable de cadena ligera madura se fusiona con una región constante de cadena ligera y la región variable de cadena pesada madura se fusiona con una región constante de cadena pesada.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región constante de cadena pesada es una forma mutante de una región constante de cadena pesada humana natural que tiene unión reducida a un receptor Fcy en relación con la región constante de cadena pesada humana natural.

7. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región constante de cadena pesada es de isotipo IgG1 humano.

8. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la región variable de cadena pesada madura está fusionada con una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 26 con o sin la lisina C-terminal y/o la región variable de cadena ligera madura está fusionada con una región constante de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 28.

9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo cualquier reivindicación anterior y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Un ácido nucléico o ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

11. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10 o vectores de expresión recombinantes que comprenden los ácidos nucleicos de la reivindicación 10.

12. Una célula hospedadora que comprende el vector o vectores de expresión recombinantes de la reivindicación 11 transformados en la célula hospedadora.

13. Un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en el tratamiento o efecto de profilaxis de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto.

14. Un método de diagnóstico de una amiloidosis mediada por transtiretina en un sujeto, que comprende poner en contacto una muestra biológica del sujeto con una cantidad eficaz del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la muestra biológica y/o la muestra de control es sangre, suero, plasma o tejido sólido, opcionalmente en donde el tejido sólido es de corazón, sistema nervioso periférico, sistema nervioso autónomo, riñones, ojos o tubo digestivo.