ES2318050T3 - Mezcla de propionibacterium jensenii y lactobacillus sp. con actividades antimicrobianas para su utilizacion como sistema de conservacion natural. - Google Patents
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Abstract
Mezcla de bacterias, caracterizada porque dicha mezcla de bacterias es un cultivo no iniciador que está exento de metabolitos y comprende por lo menos una primera bacteria seleccionada de entre la especie Propionibacterium jensenii y por lo menos una segunda bacteria seleccionada de entre el género Lactobacillus.
Description
Mezcla de Propionibacterium jensenii y
Lastobacillus sp. con actividades antimicrobianas para su
utilización como sistema de conservación natural.
La presente solicitud reivindica la prioridad de
la solicitud de patente europea nº 01 125 464.6, presentada el 6 de
noviembre de 2001.
La invención se refiere a bacterias adecuadas
para la conservación de artículos, en particular a una mezcla de
bacterias según la reivindicación 1. Además, la invención se refiere
a alimento, a producto alimenticio o a un medicamento según la
reivindicación 11 que comprende dicha mezcla, a un procedimiento
para la preparación de dicho alimento, producto alimenticio o
medicamento según la reivindicación 13, a un procedimiento para el
almacenamiento de dicho alimento, producto alimenticio o medicamento
según la reivindicación 16 y a la utilización de dicha mezcla según
la reivindicación 17.
La excrecencia de los microorganismos indeseados
en los productos alimenticios puede contrarrestarse de diferentes
maneras. Además de los tratamientos físicos y químicos, se utilizan
extensamente los tratamientos biológicos tales como fermentaciones
por microorganismos residentes naturales y/o artificiales
("iniciadores"). Éstos pueden cambiar las condiciones del
alimento en las que el crecimiento de organismos no deseados es
menos favorable o está completamente inhibido como es el caso en el
vino, cerveza, queso o yogur (Holzapffel et al. 1995; Vogel,
1996). Otro sistema de conservación de alimentos provocada
biológicamente es el enriquecimiento de "cultivos protectores"
que actúan como "bioconservantes". Dichos cultivos están
concebidos
- a)
- para desarrollar y suprimir completamente los organismos indeseados
- b)
- o para desarrollar y producir agentes antimicrobianos y antimicóticos (por ejemplo bacteriocinas, ácidos orgánicos, diacetil, metabolitos desconocidos)
- c)
- o para interactuar por mecanismos desconocidos con microorganismos que estropean los alimentos.
Dado que los cultivos protectores generalmente
no participan en procesos de modificación de alimentos específicos
como cultivos iniciadores, su aplicación puede también extenderse a
materiales que no son alimentos.
Las actividades antimicrobianas de las
propionibacterias y las bacterias del ácido láctico las hacen
apropiadas para su aplicación industrial como bioconservantes. Bio
Profit (Valio Ltd., Helsinki, Finlandia; Wiesby GmbH & Co.,
Niebüll, Alemania), es un cultivo conjunto disponible en el mercado
de Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061)
(Lactobacillus casei subesp. rhamnosus anterior) y
Propionibacterium freudenreichii subesp. shermanii JS
(DSM 7067), que se sugiere para un control de levaduras y mohos
(Soumalainen y Mäyrä-Mäkinen, 1999). Ambos organismos se han
cultivado conjuntamente y se supone que se utilizan como una célula
que contiene caldo de fermentación que inhibe el crecimiento de
mohos y levaduras en los alimentos. La cepa Lactobacillus
rhamnosus LC705 fue protegida en 1993 mediante una patente
europea (EP 0 576 780) para ser utilizada como una cepa individual
o en combinación con una bacteria del género
Propionibacterium u otra cepa de la especie bacteriana
Lactobacillus casei. Una segunda patente alemana (DE 199 17
715) describe cultivos protectores constituidos por bacterias de
ácido láctico y que inhiben el crecimiento de bacterias tóxicas a
temperaturas superiores a 7 a 8ºC. Los cultivos se sugieren para la
conservación de alimentos y de alimentos animales (producto
alimenticio) presentando solamente un periodo de conservación corto
inferior a 7 a 8ºC. Tan pronto como la temperatura de
almacenamiento aumenta, los cultivos no cumplen con la inhibición
del crecimiento de bacterias de descomposición. En contraposición,
Microgard^{TM} (Wesman Foods, Inc., Beaverton, Oregón, EUA) es un
producto lácteo disponible en el mercado, fermentado por una cepa de
P. freudenreichii subesp. shermanii, seguido de un
proceso de pasteurización. El producto cumple la eficacia en la
inhibición de organismos degradadores de alimentos seleccionados
así como los microorganismos patógenos que es conocido que producen
enfermedades transmitidas por alimentos (Daeschel, 1989;
Al-Zoreky et al., 1991). Microgard^{TM}
está aprobado por la U.S. Food and Drug Administration.
Por lo tanto, un objetivo general de la
invención consiste en proporcionar un inhibidor a base de bacterias
mejoradas para el desarrollo de hongos (levaduras, mohos) y/o
bacterias así como una mezcla de los mismos.
Actualmente, con el fin de desarrollar este y
otros objetivos de la invención, que resultarán más evidentes como
procedimientos de descripción, la invención se pone de manifiesto a
partir de las propiedades que se mencionan en cada una las
reivindicaciones independientes.
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Se descubrió de manera inesperada que las
bacterias seleccionadas de la especie Propionibacterium
jensenii y/o el género Lactobacillus que son cultivos no
iniciadores y exentos de metabolismos son inhibidores adecuados de
microorganismos no deseados. En particular una mezcla de bacterias
(denominada también mezcla inhibidora o cultivo de protección) -que
es un cultivo no iniciador- y que está exento de metabolismos y que
comprende por lo menos una primera bacteria seleccionada de la
especie Propionibacterium jensenii y por lo menos una
segunda bacteria seleccionada del género Lactobacillus, es
capaz de inhibir por lo menos un microorganismo seleccionado de
entre hongos y/o bacterias así como mezclas de hongos y bacterias
que por ejemplo son responsables del deterioro de alimentos y
productos alimenticios.
Esta mezcla de bacterias presenta la gran
ventaja de que -aunque los metabolismos que hasta ahora se dice que
son responsables de la actividad protectora están ausentes- la
protección es tan buena o incluso mejor que con los cultivos
conocidos hasta ahora y los efectos secundarios no deseados debidos
a los metabolitos (por ejemplo los metabolitos pueden ser tóxicos o
también influir negativamente en el sabor, color del alimento,
etc.) se han reducido notablemente o incluso se han eliminado
completamente.
La mezcla de bacterias se incorpora en la
superficie del artículo y/o se aplica sobre la misma para
protegerlo.
El término "metabolitos" comprende todos
los productos que se originan en el metabolismo de las bacterias
comprendidas por la mezcla.
En la presente solicitud, las bacterias y los
hongos que pueden deteriorar los alimentos, los productos
alimenticios o los medicamentos se denominan también
"microorganismos no deseados".
La expresión "mezcla de bacterias exenta de
metabolitos" significa que solamente la mezcla de bacterias (por
ejemplo separadas de los metabolitos por lo menos por
centrifugación, preferentemente por centrifugación y por lo menos
una etapa de lavado), opcionalmente junto con un vehículo, se
incorpora en y/o se aplica sobre la superficie del artículo
(alimento, producto alimenticio o medicamento) que va a ser
protegido del deterioro.
Además, en relación con la presente solicitud de
patente, la expresión "que va a inhibirse, inhibir, etc.",
significa por ejemplo que el crecimiento o también el número o la
concentración de microorganismos no deseados, por ejemplo en el
alimento y/o sobre la superficie del alimento que comprende la
mezcla, es inferior a la del alimento y/o sobre la superficie del
alimento que no comprende dicha mezcla.
La expresión "mezcla que es un cultivo no
iniciador" significa una mezcla que comprende bacterias que no se
adaptan o no están adaptadas esencialmente al artículo (en
particular alimento, producto alimenticio o medicamento) que va a
ser protegido por la mezcla de modo que no se desarrollan o
solamente se desarrollan mínimamente. Crecimiento mínimo significa
un crecimiento de hasta como mucho aproximadamente diez veces.
Una mezcla preferida es una mezcla de bacterias
como la descrita anteriormente que puede obtenerse por el
procedimiento que comprende las etapas siguientes:
En primer lugar, una mezcla inhibidora que
comprende por lo menos una primera y por lo menos una segunda
bacteria y cuya mezcla está exenta de metabolitos se incorpora en
un medio y/o se aplica sobre la superficie de un medio contenido en
un primer recipiente de modo que resulta una concentración mínima
como la definida con mayor detalle a continuación de cada uno de
dichas por lo menos primera y por lo menos segunda bacterias en
este medio y/o sobre la superficie de este medio.
El medio contenido en los primer y segundo
recipientes (el segundo recipiente se describe a continuación) en o
sobre el que se prueba la inhibición de los contaminantes
preferentemente es alimento, producto alimenticio o medicamento o
muy preferentemente medio de agar-agar sólido.
Por lo menos una primera bacteria se selecciona
de entre la especie Propionibacterium jensenii y por lo
menos una segunda bacteria se selecciona de entre el género
Lactobacillus.
Como blanco, se prepara un segundo recipiente
que comprende el mismo medio y dicho primer recipiente pero ninguna
mezcla de bacterias.
A continuación se incorporan el mismo número de
contaminantes en el medio y/o se aplican sobre la superficie del
medio contenido en dichos primer y segundo recipientes.
El término "contaminantes" es igual a la
expresión "microorganismos no deseados" y comprende hongos y/o
bacterias así como mezclas de hongos y bacterias.
El efecto inhibidor de la mezcla contra los
contaminantes se determina almacenando los primer y segundo
recipientes a una temperatura adecuada durante un tiempo de
almacenamiento adecuado.
En general, dicha temperatura adecuada a la cual
se realiza este procedimiento depende de la temperatura a la que
normalmente se almacena y/o se prepara un artículo específico, en
particular alimento, producto alimenticio o medicamento.
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La temperatura a la que normalmente se almacenan
los primer y segundo recipientes es de 5 a 26ºC, preferentemente
dicha temperatura se selecciona por lo menos de entre el grupo de
aprox. 6ºC y/o aprox. 12ºC y/o aprox. 25ºC.
El término "aprox." significa 6 \pm 1ºC,
12 \pm 1ºC, 25 \pm 1ºC.
El tiempo de almacenamiento a dicha temperatura
depende del tiempo durante el que el artículo (alimento, producto
alimenticio o medicamento) se almacena normalmente.
El tiempo de almacenamiento normalmente es de 7
a 28 días, preferentemente dicho tiempo de almacenamiento se
selecciona por lo menos de entre el grupo de 7 días y/o 14 días y/o
21 días y/o 28 días.
Durante dicho periodo de almacenamiento a una
temperatura específica, se compara el número o la concentración de
contaminantes incorporados en el medio y/o aplicados sobre la
superficie del medio contenido en los primer y segundo
recipientes.
Basándose en esta comparación
(número/concentración de contaminantes en dicho primer recipiente en
un periodo específico frente al número/concentración de
contaminantes en dicho segundo recipiente en este periodo
específico), un primer y un segundo gráfico pueden dibujarse en un
sistema de coordenadas en el que por ejemplo el eje x representa el
periodo de almacenamiento y el eje y representa el número y/o la
concentración de contaminantes. El primer gráfico presenta el
número o concentración de contaminantes incorporados en el medio y/o
aplicados sobre la superficie del medio en el primer recipiente y
el segundo gráfico presenta la misma medición en el medio y/o en la
superficie del medio contenido en el segundo recipiente.
Si se investigaran solamente cepas individuales
o mezclas de cepas de la misma especie o género, podría utilizarse
por consiguiente el procedimiento mencionado anteriormente.
La mezcla se considera que se inhibe durante las
etapas del periodo de almacenamiento, si dicho segundo gráfico es
dicho primer gráfico anterior.
Preferentemente, se considera que la mezcla se
inhibe si el número de contaminantes en el medio y/o en la
superficie del medio contenido en el segundo recipiente es por lo
menos aproximadamente superior a log 1, preferentemente por lo
menos de aproximadamente log 2, muy preferentemente por lo menos de
aproximadamente log 3, más preferentemente por lo menos de
aproximadamente log 4, incluso más preferentemente por lo menos de
aproximadamente log 5, aún más preferentemente por lo menos de
aproximadamente log 6 que el número de contaminantes en el medio
y/o en la superficie del medio contenido en dicho primer recipiente
durante por lo menos 3 días, preferentemente por lo menos 7 días,
muy preferentemente por lo menos 14 días, más preferentemente por lo
menos 21 días y aún más preferentemente 25 días.
Según una forma de realización preferida de la
invención, por lo menos una primera bacteria mencionada
anteriormente es Propionibacterium jensenii SM11.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, por lo menos una segunda bacteria mencionada
anteriormente se selecciona de entre el grupo constituido por
Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus
casei, Lactobacillus plantarum y mezclas de las mismas.
Según otra forma de realización, más preferida
de la invención, por lo menos la segunda bacteria se selecciona de
una o más cepas de Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei.
Según una forma de realización aún más preferida
de la invención, por lo menos una segunda bacteria es
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM20 y/o
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM29 y/o
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM63 y
mezclas de las mismas.
La proporción entre por lo menos una primera
bacteria y por lo menos una segunda bacteria de la mezcla (por
ejemplo la proporción de la concentración o número de por lo menos
la primera bacteria y la concentración o número de por lo menos una
segunda bacteria) preferentemente asciende entre 1:100 y 100:1,
preferentemente entre 1:10 y 10:1.
Las mezclas descritas anteriormente proporcionan
la ventaja de que los microorganismos seleccionados de entre el
grupo constituido por hongos, bacterias y mezclas de hongos y
bacterias que son o pueden ser patógenos para los seres humanos y/o
los animales y/o que tienen o pueden tener un efecto de
descomposición (por ejemplo un alimento, un producto alimenticio o
medicamentos) puede ser inhibido.
Por ejemplo en el caso de alimento (los medios
de conservación tales como los procedimientos químicos (por ejemplo
la aplicación de conservantes de alimentos, salazón) y/o los
procedimientos físicos (por ejemplo, calor, rayos UV, rayos gamma,
rayos X), envasado utilizando gases protectores (por ejemplo
N_{2}, CO_{2} o envasado al vacío pueden reducirse u omitirse
totalmente sin reducción del periodo de almacenamiento/periodo de
conservación del alimento.
Como consecuencia de esto, especialmente el
alimento poco procesado o también los ingredientes poco procesados
que por ejemplo se añaden al alimento muy procesado pueden
almacenarse durante un periodo más prolongado sin deterioro
biológico o pueden también ser mejor exportados a otros países.
Si se desea, la mezcla puede utilizarse también
junto con los procedimientos de conservación mencionados
anteriormente.
La utilización de dichos procedimientos de
conservación en combinación con la mezcla, es un requisito previo
para que la mezcla pueda todavía realizar su finalidad
protectora.
Esto significa por ejemplo que después de la
aplicación de dicho procedimiento de conservación, el artículo que
debe protegerse todavía tiene que cumplir por lo menos las
concentraciones mínimas siguientes de células viables (cfu = unidad
formadora de colonias).
La concentración mínima de por lo menos una
primera o por lo menos una segunda bacteria en el alimento desde el
punto de vista de la protección asciende a por lo menos 1 \times
10^{7} cfu/ml, preferentemente por lo menos a aproximadamente 1
\times 10^{8} cfu/ml, aún más preferentemente por lo menos a
aproximadamente 1 \times 10^{9} cfu/ml o por lo menos a
aproximadamente 1 \times 10^{7} cfu/g, preferentemente por lo
menos a aproximadamente 1 \times 10^{8} cfu/g, aún más
preferentemente por lo menos a aproximadamente 1 \times 10^{9}
cfu/ml y/o en la superficie del alimento por lo menos a
aproximadamente 1 \times 10^{6} cfu/cm^{2}, preferentemente
por lo menos a aproximadamente 1 \times 10^{7} cfu/cm^{2}, muy
preferentemente por lo menos a aproximadamente 1 \times 10^{8}
cfu/cm^{2}, aún más preferentemente por lo menos a aproximadamente
1 \times 10^{9} cfu/cm^{2}.
Si se desea una actividad mayor frente a los
contaminantes, son posibles concentraciones de por lo menos
aproximadamente 1 \times 10^{10} cfu/ml o por lo menos
aproximadamente 1 \times 10^{10} cfu/g y/o por lo menos
aproximadamente 1 \times 10^{10} cfu/cm^{2}.
Las concentraciones mínimas mencionadas
anteriormente se apartan de la observación experimental que consiste
en que cuanto mayor es la concentración o el número de cultivo
protector, mayor es la inhibición de los hongos y/o las bacterias
así como de las mezclas de los mismos.
Aunque se observa ya alguna protección si la
primera y la segunda bacteria están presentes en cantidades de 1
\times 10^{7} cfu/ml o cfu/g, la protección es mucho mejor si
por lo menos una primera bacteria y por lo menos una segunda
bacteria combinadas entre sí con la mezcla de bacterias suponen por
lo menos aproximadamente 5 \times 10^{7} cfu/ml o por lo menos
aproximadamente 5 \times 10^{7} cfu/g y/o por lo menos
aproximadamente 5 \times 10^{6} cfu/cm^{2} para por lo menos
una primera bacteria y por lo menos aproximadamente 1 \times
10^{8} cfu/ml o por lo menos aproximadamente 1 \times10^{8}
cfu/g y/o por lo menos aproximadamente 1 \times 10^{7}
cfu/cm^{2} para por lo menos una segunda bacteria. Se consiguieron
resultados muy satisfactorios con por lo menos aproximadamente 1
\times 10^{8} cfu/ml o por lo menos aproximadamente 1 \times
10^{8} cfu/g y/o por lo menos aproximadamente 1 \times 10^{7}
cm^{2} para por lo menos una primera bacteria y por lo menos
aproximadamente 1 \times 10^{8} cfu/ml o por lo menos
aproximadamente 1 \times 10^{8} cfu/g y/o por lo menos
aproximadamente 1 \times 10^{7} cm^{2} para por lo menos una
segunda bacteria. Actualmente resultan preferidos por lo menos
aproximadamente 5 \times 10^{8} cfu/ml o por lo menos 5 \times
10^{8} cfu/g y/o por lo menos aproximadamente 5 \times 10^{7}
cfu/cm^{2} para por lo menos una primera bacteria y por lo menos
aproximadamente 5 \times 10^{8} cfu/ml o por lo menos
aproximadamente 5 \times 10^{8} cfu/g y/o por lo menos
aproximadamente 5 \times 10^{7} cfu/cm^{2} para por lo menos
una segunda bacteria.
Las concentraciones mínimas y las
concentraciones preferidas mencionadas anteriormente se aplican
también a medicamentos y productos alimenticios.
La determinación de la concentración en la
superficie puede realizarse por dos procedimientos:
- (i)
- midiendo la cantidad aplicada, por ejemplo en aplicación por atomización, o preferentemente
- (ii)
- midiendo la concentración de un volumen específico con la superficie de aplicación bien definida y que comprende la zona de difusión global de la mezcla de bacterias.
La expresión "por lo menos una bacteria de 1
\times 10^{7} cfu/ml" significa que una primera bacteria y
opcionalmente una u otra primera bacteria más que son diferentes
entre sí y que pertenecen todas al género Propionibacterium
jensenii están presentes simultáneamente, por lo que todas las
primeras bacterias conjuntamente forman una concentración de 1
\times 10^{7} cfu/ml. Esta definición se aplica también a
atenuaciones equivalentes en la solicitud.
Las concentraciones mínimas definidas
anteriormente han de darse en cualquier etapa después de la
terminación del proceso de preparación del alimento, producto
alimenticio o medicamento.
En cualquier caso, la concentración de la mezcla
debe ser superior o por lo menos igual a la concentración mínima
antes del comienzo del almacenamiento.
Preferentemente, el alimento, el producto
alimenticio o los medicamentos comprenden una concentración tal de
las bacterias de la mezcla que la concentración de bacterias y/o
hongos o la mezcla de bacterias y hongos se mantiene por debajo de
los requisitos mencionados en la reglamentación de alimentos del
respectivo país en el que se utiliza la invención.
Preferentemente, pero no necesariamente, estas
concentraciones mínimas se aplican también durante la realización
del procedimiento de preparación.
Si la concentración de bacterias de la mezcla en
el artículo y/o en la superficie del artículo que debe protegerse
cae por debajo de la concentración mínima durante la realización del
procedimiento de preparación a causa por ejemplo de la aplicación
de procedimientos de conservación que reducen las células viables
(calor, rayos UV, etc.) o como consecuencia de los cambios de
concentración durante la preparación (por ejemplo por adición de
más ingredientes, etc.) pueden añadirse células durante la
realización de la preparación. En el caso del procedimiento de
preparación que comprende una etapa de larga duración, es importante
que la concentración mínima esté ya presente durante dicha etapa,
tal como, por ejemplo durante la maduración de las salchichas.
Si tiene lugar una reducción de la concentración
de las células viables durante el almacenamiento de modo que la
concentración mínima requerida ya no se da más, tienen que añadirse
células viables adicionales si es posible.
En general, la concentración de la mezcla de
bacterias en el alimento, el producto alimenticio y los medicamentos
puede ser superior a las concentraciones mínimas mencionadas
anteriormente. Pero las concentraciones han se seleccionarse de
modo que el alimento, el producto alimenticio o el medicamento no
esté afectado por deterioros no deseadas. Esto significa por
ejemplo que la mezcla no influye en las propiedades organolépticas o
en otras calidades del alimento (por ejemplo decoloración,
etc.).
Además de las mezclas descritas anteriormente,
la invención proporciona asimismo un procedimiento para la
preparación por ejemplo del producto alimenticio, de los
medicamentos, y preferentemente del alimento, que comprende dichas
mezclas.
El procedimiento de preparación permite que no
puedan desarrollarse los microorganismos no deseados.
A continuación, el procedimiento se describe por
medio de alimento, pero no excluye que lo que se da a conocer a
continuación pueda también ser aplicado a la preparación, de otros
artículos, por ejemplo, producto alimenticio y medicamentos.
El procedimiento comprende las etapas
siguientes: En primer lugar, la mezcla se añade durante la
preparación del alimento en una cantidad tal que la concentración
de por lo menos una primera bacteria y por lo menos una segunda
bacteria en cada alimento asciende por lo menos a la concentración
mínima cfu/ml o cfu/g del alimento y/o por lo menos a la
concentración mínima cfu/cm^{2} de la superficie del alimento.
En general, la mezcla ha de añadirse en la etapa
del procedimiento de preparación o antes del almacenamiento de modo
que pueda distribuirse uniformemente en el artículo y/o en la
superficie del artículo que debe protegerse.
La mezcla preferentemente se aplica en una etapa
antes de una contaminación significativa con microorganismos no
deseados.
En una segunda etapa de la preparación, por
ejemplo después de la adición de la mezcla, uno o más parámetros
del procedimiento de preparación han de controlarse de modo que la
concentración de la mezcla disminuye o, preferentemente permanece
constante. Aunque la disminución en la concentración puede
"solucionarse" tal como se describió anteriormente, debe
evitarse el crecimiento significativo.
Dichos parámetros son por ejemplo la
temperatura, la presión o también los ingredientes del alimento,
etc.
Por el término "constante" se entiende (una
vez la mezcla se añade al artículo, por ejemplo alimento o producto
alimenticio o medicamento) que la concentración de la mezcla
permanece constante. Dicha mezcla constante preferentemente se
añade en una cantidad tal que se produce por lo menos la
concentración mínima definida en la presente solicitud. Por el
término "constante", se entiende también un aumento del número
o de la concentración de bacterias de la mezcla mediante el
crecimiento de las bacterias hasta como mucho diez veces.
En caso de que el procedimiento de preparación
comprenda una o más etapas de fermentación, la mezcla (si se añade
antes de la fermentación) no debe tener una influencia negativa en
los microorganismos (por ejemplo bacterias, mohos, levaduras o
mezclas de los mismos) responsable de una o más de dichas
fermentaciones (por ejemplo reducción de la actividad de
fermentación).
Si la mezcla presenta dicha influencia negativa
en estos microorganismos, la mezcla se añade después de una o más
de dichas etapas de fermentación críticas o después de la
terminación del procedimiento de preparación.
Asimismo en los procedimientos de preparación
que comprenden etapas que pueden ser afectadas por la mezcla de
bacterias, dichas bacterias se añaden después de una o más de dichas
etapas.
Además, la invención proporciona un
procedimiento para el almacenamiento de artículos, en particular de
productos alimenticios, medicamentos y preferentemente alimentos en
los que el desarrollo de microorganismos no deseados está inhibido
durante el almacenamiento.
Este procedimiento de almacenamiento puede
utilizarse para el almacenamiento de por ejemplo alimentos,
productos alimenticios o medicamentos que se preparan según el
procedimiento de preparación de la invención o por procedimientos
de preparación conocidos.
Solamente durante el procedimiento de
preparación según la invención, el parámetro o parámetros del
procedimiento de preparación se controlan de modo que la
concentración de la mezcla permanece constante.
Utilizando por ejemplo otros procedimientos de
preparación habituales, no existe ningún control o solamente un
control parcial. Por consiguiente, la mezcla debería añadirse en
dicho procedimiento de preparación en una etapa después de la cual
la concentración de la mezcla permanece constante.
El procedimiento de almacenamiento comprende la
etapa de control del parámetro de almacenamiento o de los
parámetros de almacenamiento durante el almacenamiento de modo que
la concentración de por lo menos la primera y por lo menos una
segunda bacteria permanece constante.
Los parámetros de almacenamiento posibles son
por ejemplo la temperatura, la atmósfera de almacenamiento en torno
al artículo, la atmósfera de almacenamiento dentro del envase del
artículo, etc.
El término "almacenamiento" significa el
periodo después de la terminación de la preparación del artículo,
por ejemplo del alimento, producto alimenticio o medicamento y por
consiguiente dicho término por ejemplo puede también comprender el
transporte.
La mezcla de bacterias según la invención
preferentemente está contenida en la superficie del alimento,
producto alimenticio o medicamentos y/o aplicada sobre la
misma.
Dichos alimentos preferentemente son productos
lácteos, más preferentemente productos lácteos agrios.
Además, resultan asimismo preferidos la carne y
los productos cárnicos.
Los productos lácteos son por ejemplo leche
entera, leche tratada térmicamente o microfiltrada, mantequilla,
leche cuajada, crema agria, leche desnatada, crema, yogur, suero de
leche, cuajada, queso, kéfir, kumiss, pudin, leche agria, leche
agria con acidophilus, langfil (leche viscosa), leche agria
con bifidus, leche cuajada, manteca de crema agria.
La carne se divide por ejemplo en carne de vaca
o de pollo fresca o carne picada.
Los productos cárnicos preferentemente se
preparan para salchichas, alimentos para animales de compañía, carne
curada con nitrito y nitrato (carne cruda picada), carne con sal
cocinada, salchichas crudas, etc.
Los productos como por ejemplo ensaladas
preparadas con carne, pescado, moluscos, crustáceos, vegetales,
pasta y mezclas de los mismos, pero también con pescado, productos
de pesca, moluscos, crustáceos, frutas, productos de frutas, frutos
secos, productos de frutos secos y vegetales tales como patatas,
productos vegetales, maíz y productos del maíz pueden estar
protegidos por la mezcla.
Las combinaciones posibles de alimentos
mencionadas anteriormente que comprenden la mezcla según la
invención también se sienten o están comprendidas en la presente
invención.
Los productos alimenticios preferentemente son
productos derivados de frutos secos, maíz, grasas.
Los medicamentos que pueden ser protegidos por
la mezcla son remedios naturales y orgánicos.
Según una forma de realización de la invención,
el alimento, el producto alimenticio o los medicamentos se tratan
con un polvo que comprende la mezcla cuyo polvo opcionalmente
comprende sustancias transportadoras adecuadas. Las sustancias
transportadoras adecuadas son por ejemplo sacáridos, preferentemente
monosacáridos, disacáridos o sus derivados.
Según otra forma de realización preferida de la
invención, el alimento, el producto alimenticio o los medicamentos
se tratan con un medio líquido que comprende la mezcla. Dicho medio
líquido debe concebirse de modo que garantice la supervivencia de
la mezcla. Puede ser por ejemplo un medio acuoso tal como un
producto lácteo líquido o una solución fisiológica de cloruro
sódico.
Según una forma de realización preferida de la
invención, la mezcla se incorpora en el alimento, en el producto
alimenticio o en el medicamento mediante mezcla, pulverización,
etc., con lo que mediante pulverización u otro tipo adecuado de
aplicación tal como inmersión, la mezcla se aplica sobre la
superficie del alimento, producto alimenticio o medicamento.
En el caso de los productos lácteos, la mezcla
preferentemente está compuesta por un líquido, con lo que el
líquido se añade al artículo que va a ser protegido. La mezcla puede
añadirse también como un concentrado muy congelado o
liofilizado.
La mezcla según la invención que está
incorporada preferentemente en la superficie del alimento, producto
alimenticio o medicamentos y/o aplicada en la misma, más
preferentemente dentro de los especificados anteriormente y/o sobre
los mismos, permite en particular la inhibición de bacterias tales
como Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Salmonella
typhimurium, Staphylococcus aureaus, Escherichia coli, Serratia
liquefaciens, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis,
Bacillus cereus, Bacillus anthracis y mezclas de estas
bacterias, eucariotas inferiores tales como algas y mezclas de
eucariotas inferiores, hongos tales como Candida magnoliae,
Candida parapsilosis, Candida silvicola, Candida valida, Candida
pulcherrima, Candida reukaufii, Candida krusei, Candida sp.,
Sporobolomyces salmonicolor, Zygosaccharomyces bailii,
Penicillium sp., mezclas de estos hongos así como mezclas de las
bacterias y hongos mencionados anteriormente así como mezclas de
las bacterias y hongos y eucariotas inferiores mencionados
anteriormente.
La invención no se considera que está limitada a
las bacterias, hongos, alimentos, productos alimenticios y
medicamentos mencionados de forma explícita en la presente
solicitud.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto y los objetivos distintos a los expuestos anteriormente
resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente
de los mismos. Dicha descripción hace referencia a los dibujos
adjuntos, en los que:
La figura 1 presenta una composición de 82 cepas
en agar-agar MARS que se origina en leche entera,
queso, yogur, aceitunas negras, salami así como maíz y forraje
graso que presenta actividades antimicóticas en un ensayo puntual
con agar-agar y que está identificado con API 50
CHL. ^{a} identificado como Lactobacillus paracasei
subesp. paracasei analizando el gen 16S ARNr.
La figura 2 presenta un gel de agarosa al 2% de
la ampliación de un producto de 290 bp obtenido utilizando
oligonucleótidos específicos del grupo casei junto con el
cebador Y2 (Tabla 2). (A) Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei SM20; (B) Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei SM29; (C) Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei SM63; (D) Lactoacillus casei DSM
20011^{T}; (E) Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei DSM 5622^{T} y (F) Lactobacillus rhamnosus
DSM 20021^{T}; 1, 4, 7, 10, 13, 16, casei/Y2, 2, 5, 8, 11, 14,
17, para/Y2; 3, 6, 9, 12, 15, 18, rham/Y2; 19,
referencia negativa; kb, escala kb de ADN lineal; pUC,
pUC19-ADN/marcador MspI(HpaII).
Figura 3: Concentraciones de levaduras
(Candida pulcherrima 1-50/13) en 5 lotes
diferentes de un modelo de alimento con diferentes cultivos
protectores, almacenado a 6ºC. (\blacklozenge) 4,9 \times
10^{8} cfu/g de Propionibacterium jensenii SM11 y 1,2
\times 10^{8} cfu/g de Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei SM20; (\ding{115}) 3,2 \times 10^{8} cfu/g
Propionibacterium jensenii SM11 y 1,1 \times 10^{8}
cfu/g Lactobacillus paracasei ssp. paracasei SM29;
(\blacksquare) 4,1 \times 10^{8} cfu/g Propionibacterium
jensenii SM11 y 9,1 \times 10^{7} cfu/g Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM63; (\Box) 2,7 \times
10^{8} cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 y 2,1 \times
10^{8} cfu/g Lactobacillus plantarum SM17; (\lozenge)
2,7 \times 10^{8} cfu/g Propionibacterium jensenii SM11
y 9,3 \times 10^{7} cfu/g Lactobacillus plantarum SM39;
(\medbullet) sin cultivo protector. El número de levaduras son
valores medios de los duplicados.
Figura 4: Concentraciones de levaduras
(Candida pulcherrima 1-50/13, Candida
magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis
4-5/1 y Zygosaccharomyces bailii
1-48/1) en 7 lotes diferentes de un modelo de yogur
con diferentes cultivos protectores almacenados a 6ºC. (\lozenge)
1,5 \times 10^{7} cfu/g de Propionibacterium jensenii
SM11 y 4,3 \times 10^{7} cfu/g de Lactobacillus paracasei
ssp. paracasei SM20; (\blacklozenge) 5,5 \times 10^{7}
cfu/g de Propionibacterium jensenii SM11 y 1,7 \times
10^{8} cfu/g de Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei SM20; (\Box) 2,0 \times 10^{7} cfu/g
Propionibacterium jensenii SM11 y 3,8 \times 10^{7}
cfu/g Lactobacillus paracasei ssp. paracasei SM29;
(\blacksquare) 2,8 \times 10^{8} cfu/g Propionibacterium
jensenii SM11 y 1,7 \times 10^{8} cfu/g Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM29; (\Delta) 1,6
\times 10^{7} cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 y 1,7
\times 10^{7} cfu/g Lactobacillus paracasei ssp.
paracasei SM63; (\ding{115}) 8,1 \times 10^{7} cfu/g
Propionibacterium jensenii SM11 y 1,6 \times 10^{8} cfu/g
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei SM63;
(\medbullet) sin cultivo protector. El número de levaduras son
valores medios de los duplicados.
Las cepas bacterianas y los hongos utilizados en
este estudio se presentan en la Tabla 1.
Se cultivaron cepas de Propionibacterium
en caldo de cultivo NLB que consistía en caldo de cultivo de soja
con 1% de tripticasa sin dextrosa (BBL Microbiology Systems,
Cockeysville, MD, EUA), extracto de levadura al 1% y jarabe de
lactato sódico al 1% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA)
descrito por Grinstead y Barefoot (1992). Los lactobacilos se
propagaron en caldo de cultivo MRS con Tween 80 al 0,1% (Biolife,
Italia). Todas las demás cepas se desarrollaron en caldo de cultivo
BHI (Biolife, Italia) en condiciones de cultivo dadas en la Tabla
1. Los cultivos bacterianos se mantuvieron como soluciones madre
congeladas a -80ºC en caldo de cultivo que contiene glicerol al
30%. Las levaduras y los mohos se cultivaron en medio YM (Difco,
Detroit, MI, EUA) y se mantuvieron a 4ºC en medio sólido de
agar-agar.
Los iniciadores comerciales para la fermentación
del yogur se adquirieron en Danisco Cultor Niebüll GmbH, Alemania,
que consistían en diferentes cepas de Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermophilus.
\newpage
Se produjeron cultivos protectores cultivando
las cepas por separado en permeato de suero enriquecido (SWP1) que
estaba constituido por permeato de suero al 5,5% (Emmi, Suiza),
extracto de levadura al 1% (Becton Dickinson, MD, EUA) e
hidrolizado de caseína al 2% (Merck, Alemania) durante 72 h. a 32ºC.
Se recogieron las células por centrifugación, se lavaron una vez o
dos veces en NaCl al 0,85% y se volvieron a poner en suspensión en
leche desnatada liofilizada (Difco, Detroit, MI, EUA) o en NaCl al
0,85% a una concentración necesaria que oscila entre 10 y 100
veces. La leche desnatada liofilizada se trató térmicamente con
anterioridad tres veces a 90ºC durante 30 min. los tres días
siguientes.
Un aumento a escala y un procedimiento de
optimización se realizó cultivando las células independientemente
en un biorreactor 8-1 o 19-1 (tipo
L1523; Bioengineering, Suiza) a 32ºC, con una agitación de 250 rpm
utilizando 2% de inóculo. La fermentación se realizó en permeato de
suero enriquecido (SWP2) que estaba constituido por permeato de
suero al 5,5%, extracto de levadura al 1% y glucosa al 2%. El pH se
controló a 6,0 añadiendo NaOH 3 M. Simultáneamente al control de
pH, se consiguió un alimento de nutrientes con extracto de levadura
al 20% y glucosa al 20%. El inóculo se cultivó en permeato de suero
enriquecido (SWP1) a 32ºC durante 72 h. sin agitación. Se retiraron
las muestras de las fermentaciones periódicamente y se analizaron
las concentraciones celulares y la densidad óptica a 650 nm. Se
cultivaron lactobacillus durante 72 h, propionibacterias durante 90
h. Se recogieron las células, se lavaron y se concentraron como se
describió anteriormente.
Se digirieron 10 g de muestra de alimento
durante 2 minutos con 90 ml de tampón de dilución (NaCl al 0,85%,
peptona al 0,1%), se diluyeron en serie y se colocaron en placas en
agar-agar MRS con Tween 80 al 0,1%. Las muestras de
leche se diluyeron directamente y se colocaron en placas. Las placas
se incubaron en condiciones anaeróbicas a 37ºC durante 3 días. De
cada muestra de alimento, se seleccionó una variedad de colonias
diferentes para una identificación para actividades
antimicrobianas.
Se utilizaron dos procedimientos:
(1) Ensayo con puntos en
agar-agar: El cultivo productor se inoculó con
puntos en una placa de agar-agar según Grinstead y
Barefoot (1992) y se incubó en condiciones de crecimiento óptimo
(Tabla 1). Cada placa se cubrió con 6 ml de
agar-agar blando templado (0,6%) que contenía 0,2 ml
de un cultivo indicador que se había cultivado hasta una densidad
de 0,2. Se midió la densidad óptica de las bacterias a 650 nm, la de
las levaduras y mohos a 580 nm. El medio de
agar-agar, el medio de agar-agar
blando y la incubación de las placas se seleccionaron apropiados
para la prueba y los organismos indicadores. La inhibición del
césped indicador se controló después de 24 a 48 h. para las
bacterias, la inhibición de los hongos se puntuó diariamente,
después de 3 días a 25ºC.
(2) Ensayo de difusión en pocillos: Se
cortaron pocillos de un diámetro de 7 mm para placas con
agar-agar y se rellenaron con sobrenadantes exentos
de células y de cultivos bacterianos como describe Daeschel (1992).
Después de la difusión completa del líquido, el
agar-agar blando que contenía un organismo indicador
se vertió sobre las placas para demostrar la actividad inhibidora
tal como se describió anteriormente. El medio de
agar-agar, el medio de agar-agar
blando y la incubación de las placas se seleccionaron de manera
apropiada para la prueba y organismos indicadores.
Se tiñeron con Gram cepas cultivadas en
agar-agar con MRS que presentan actividades
antimicrobianas y se examinó al microscopio su morfología celular.
Además se determinó la actividad de la catalasa salpicando las
colonias con peróxido de hidrógeno al 30% y se realizó una tinción
de las esporas. Se realizó una identificación preliminar de la cepa
utilizando API 50 CHL (bioMérieux SA, Marcy l'Etoile, Francia).
Además, se determinó la proteólisis en agar-agar
con MRS con leche desnatada al 5% y 10% y se analizó mediante
enzimas la producción de ácidos orgánicos (Boehringer Mannheim,
Alemania; kit utilizado para D/L-ácido láctico: E1 112 821/kit
utilizado para ácido acético: E0 148 261). Además, se determinaron
las condiciones del cultivo en el caldo de cultivo con MRS a
diferentes temperaturas durante 72 h. y con salinidades del 5% y 10%
a 32ºC durante 72 h.
Se realizó la ampliación de 16S ADNr utilizando
directamente una colonia de la cepa correspondiente. Se realizó la
PCR con oligonucleótidos universales bak4 (Goldenberger, 1997) y
bakllw (Greisen et al., 1994 modificado por Dasen et
al. 1998) utilizando 40 ciclos. Se consiguió la hibridación a
56ºC durante 30 s. y se produjo la extensión con Taq ADN polimerasa
(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) a 72ºC durante 2 min.,
la separación de la cadena de ADN se realizó a 95ºC durante 5 s. Se
purificó el ADN ampliado utilizando GFX^{TM} PCR ADN y el kit de
purificación de bandas en gel (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia). Se realizó el secuenciado del ciclo automático con la
Terminator Ready Reaction Mix (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia) y los oligonucleótidos que se dirigen a 16S ADNr (Tabla
2).
Se llevaron a cabo 35 ciclos de la forma
siguiente: 96ºC durante 10 s., 50ºC durante 30 s. y 60ºC durante 4
min. El secuenciado de nucleótidos de ambas cadenas del ADN clonado
se realizó por el procedimiento de terminación de la cadena de
didesoxi (Sanger et al., 1977) con un cebador errante
utilizando el BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
y el aparato analizador genético ABI PRISM ABI 310 (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA) para análisis. El análisis de la
secuencia del ADN, las alineaciones de la secuencia y la
investigación de la base de datos de la secuencia se realizaron con
los programas contenidos en el Sequence Analysis Software Package
(versión 10.0) con licencia del Genetics Computer Group (University
of Wisconsin, Madison, WI, EUA).
Se compararon las secuencias mediante el
algoritmo de Pearson y Lipman (1988) (FastA y TFastA) con las
secuencias en la copia de la base de datos GenEMBL.
Se llevó a cabo la ampliación de 16S ADNr tal
como describen Ward y Timmins (1999) con algunas modificaciones. Se
amplió un fragmento de 290 bp del 16S ADNr utilizando cebadores
específicos para la especie (casei, para, rham) junto con el
cebador Y2 correspondiente a la zona conservada del 16S ADNr (Tabla
2). Cada 50 \mul de reacción contenían 2,5 U de Taq polimerasa,
Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50
mM, dNTP Set 1 mM, 1 \muM de cada cebador y una colonia de la cepa
correspondiente. La Taq polimerasa, los tampones y dNTP Set se
adquirieron en Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). Los
oligonucleótidos fueron sintetizados por Microsynth (Balgach,
Suiza). El programa de temperatura fue el descrito por Young et
al. (1991): 300 s a 93ºC, 35 ciclos de (45 s a 93ºC, 45 s a
62ºC y 120 s a 72ºC) y 300 s a 72ºC con un enfriamiento final a
4ºC. Se separaron los productos de la ampliación en un gel de
agarosa al 2%.
Se prepararon placas con
agar-agar, enriquecidas con Propionibacterium
jensenii SM11 o un Lactobacillus antimicrobiano o una
combinación de ambos. Los cultivos se cultivaron previamente por
separado durante 72 h a 32ºC en permeato de suero enriquecido
(SWP1), se centrifugaron, se lavaron una vez y se volvieron a poner
en suspensión (1:1) en NaCl al 0,85% y a continuación se diluyeron
en serie en tampón de dilución (NaCl al 0,85%, peptona al 0,1%). Se
prepararon porciones de 20 ml de agar-agar con 10%
de cada dilución para proporcionar una concentración final de
10^{5}, 10^{6}, 10^{7} y 10^{8} cfu/ml. Las placas con
agar-agar se vertieron y después de la
solidificación, se inocularon en puntos porciones de aproximadamente
2 a 5 \mul de los caldos de cultivo de las cepas indicadoras en
las placas. Se utilizó agar-agar YM para las
levaduras y mohos y agar-agar BHI para las
bacterias. Placas de agar-agar en tripletes se
almacenaron a 6ºC, 12ºC y 25ºC durante hasta 4 semanas y el
crecimiento de los organismos indicadores se controló semanalmente
para 6ºC o diariamente para 12ºC y 25ºC. Como referencia, se
prepararon placas de agar-agar sin enriquecimiento
de lactobacilos y propionibacterias así como las placas con
agar-agar con una adición de 1 g/l de
Ka-Sorbat (EU-Richtlinie, nº
95/2/EG).
Se montó un modelo de alimento con porciones de
50 g de leche desnatada liofilizada (Difco, Detroit, MI, EUA) que
fermentaron con un cultivo de yogur comercial. Se inocularon además
las muestras de ensayo con un cultivo de protección (1% de un
cultivo concentrado 100 veces de Propionibacterium jensenii
SM11 y 1% de un cultivo concentrado de 1% de un cultivo concentrado
100 veces de un Lactobacillus antimicótico para proporcionar
una concentración de 10^{8} células/g de cada uno. Se lavaron
previamente dos veces los cultivos y se volvieron a poner en
suspensión en leche desnatada liofilizada. Para obtener resultados
comparables, la muestra de referencia se mezcló con leche desnatada
liofilizada al 2%. Se realizó la fermentación durante 5 horas
aproximadamente a 42ºC hasta que se alcanzó el pH de 4,6. Se
contaminaron todas las muestras con Candida pulcherrima
1-50/13 a una concentración final de 10^{2}
cfu/g. Además se preparó una muestra de referencia sin contaminación
de levaduras. Se almacenaron las muestras a 6ºC durante 7 semanas y
se enumeraron semanalmente las propionibacterias y lactobacilos
protectores así como las levaduras. Simultáneamente, se controló el
pH semanalmente.
Se trataron térmicamente a 90ºC durante 10 min.
porciones de 200 g de leche enriquecida con 5% de crema (35% de
grasa, 2,5% de proteínas), 2% de leche desnatada en polvo y 5% de
azúcar y a continuación se fermentó con un cultivo de yogur
comercial. Se inocularon además muestras de ensayo con un cultivo de
protección (0,1% o 1% de un cultivo concentrado 100 veces de
Propionibacterium jensenii SM11 y 0,1% o 1% de un cultivo
concentrado 100 veces de una cepa de Lactobacillus
antimicótica) para proporcionar una concentración de 10^{7} o
10^{8} cfu/g de cada uno. Se lavaron previamente dos veces los
cultivos de protección y se volvieron a poner en suspensión en
leche desnatada liofilizada. La fermentación se realizó durante
aproximadamente 5 horas a 42ºC hasta que el pH alcanzó 4,6. El
yogur se contaminó con una mezcla de Candida pulcherrima
1-50/13, Candida magnoliae
1-35/1, Candida perapsilosis
4-5/1 y Zygosaccharomyces bailii
1-48/1 a una concentración final de 10^{2} cfu/g.
Además se preparó una muestra de referencia sin contaminación de
levaduras. Se almacenó el yogur a 6ºC durante 4 semanas y se
enumeraron las levaduras semanalmente. Simultáneamente, se controló
el pH semanalmente. El día 1 y después de 3 semanas de
almacenamiento, se enumeraron las propionibacterias y los
lactobacilos de protección y además después de 3 semanas se
determinó enzimáticamente el lactato y el acetato (Boehringer
Mannheim, Alemania; kit utilizado para ácido láctico D/L: E1 112
821/kit utilizado para ácido acético E0 148 261).
Se realizaron asimismo pruebas a escala en
aumento con yogur que comprende el cultivo de protección como se
describió anteriormente.
Se prepararon cubetas iguales (2,5 \times 4,8
\times 8 cm) de 100 g de queso duro (Gruyère). Para evitar una
contaminación con microorganismos de la superficie del queso, se
cortaron previamente 3 a 5 mm de la corteza del queso. Un lote de
queso se empapó con cada uno de los lados de la cubeta en un cultivo
de protección (5 ml de un cultivo concentrado 20 veces de
Propionibacterium jensenii SM11 y 5 ml de un cultivo
concentrado 20 veces de una cepa antimicótica de
Lactobacillus) para proporcionar una concentración de
10^{8} cfu/g de la superficie del queso de cada uno. Los cultivos
de protección se lavaron previamente dos veces y se volvieron a
poner en suspensión en NaCl al 0,85%. Otros dos lotes de queso se
prepararon con cultivos protectores diluidos 10 veces y 100 veces.
En la superficie de las cubetas de los tres lotes, se aplicaron de
este modo aproximadamente 3 ml del cultivo de protección
concentrado respectivo. A continuación se contaminaron los quesos
con 1 ml (10^{4} cfu/ml) de una mezcla de Candida
pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae
1-35/1, Candida parapsilosis
4-5/1 y Zygosaccharomyces bailii
1-48/1 hasta alcanzar una concentración final de
10^{2} cfu/g de la superficie del queso. La superficie de los
quesos se definió como una capa de aproximadamente 3 mm desde el
exterior del cubo. Se preparó una muestra de referencia sin adición
de levaduras. Se sellaron los quesos en bolsas de plástico
estériles y se almacenaron durante 3 semanas a 6ºC. El día 1 y
después de 3 semanas de almacenamiento, se determinó la
concentración de propionibacterias y lactobacilos de protección así
como el número de levaduras.
Se montaron dos modelos de alimento para
actividades antibacterianas de ensayo de un cultivo de protección
contra Listeria.
Se inocularon 200 g de leche semidesnatada
pasteurizada (25% de grasa, 2,5% de proteína) con Listeria
innocua L17 o Listeria monocytogenes M1,
respectivamente, a una concentración final de 10^{3} cfu/g y a
continuación se dividieron en dos porciones de 100 g en frascos
esterilizados. Se inoculó una muestra con cultivo de protección (5%
de un cultivo concentrado 20 veces de Propionibacterium
jensenii SM11 y 5% de un cultivo concentrado 20 veces de
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM20) hasta
proporcionar una concentración de 10^{8} cfu/g de cada uno. Se
lavaron previamente dos veces los cultivos de protección y se
volvieron a poner en suspensión en leche desnatada liofilizada.
Para obtener concentraciones comparables, se añadió 10% de leche
desnatada liofilizada a la muestra de referencia. Todas las muestras
se guardaron a 6ºC durante 4 semanas. El pH y el crecimiento de
Listeria se controlaron semanalmente, después de 1 día y
después de 4 semanas, se comprobó la concentración del cultivo de
protección también. Se preparó un segundo lote tal como se describe
y se almacenó a 25ºC durante 3 semanas. Asimismo, se determinaron
los números de cultivos protectores y de Listeria al
comienzo y al final del almacenaje.
Se mezclaron porciones de 100 g de carne picada
con un cultivo de protección (5% de un cultivo concentrado 20 veces
de Propionibacterium jensenii SM11 y 5% de un cultivo
concentrado 20 veces de una cepa antimicrobiana de
Lactobacillus) hasta proporcionar una concentración de
10^{8} cfu/g de cada uno. Los cultivos protectores se lavaron dos
veces previamente y se volvieron a poner en suspensión en NaCl al
0,85%. La carne se contaminó con Listeria innocua L17 a una
concentración final de 10^{3} cfu/g y a continuación se guardó a
6ºC durante 8 semanas. Además se preparó una muestra de referencia
sin cultivo de protección. Para obtener concentraciones
comparables, se añadieron a esta muestra 10% de NaCl al 0,85%. Las
propionibacterias y lactobacilos de protección así como Listeria
innocua L17 se numeraron semanalmente, se controló el pH al
final del periodo de almacenaje.
Se realizó una identificación preliminar de las
actividades antimicrobianas con 1424 cepas en
agar-agar MRS procedente de leche entera, queso,
yogur, aceitunas negras, pasta agria, salami, así como maíz y
forraje graso. Un total de 82 cepas presentaban actividades en un
ensayo con puntos en agar-agar frente a los hongos
listados en la Tabla 1. Estas cepas se caracterizaron más por
tinción Gram, actividad de catalasa, examen microscópico y
formación de esporas. Como se representa en la Figura 1 las especies
que pertenecen al grupo de Lactobacillus casei presentaban
principalmente actividades antimicóticas con una compartición del
24%. Una identificación preliminar con API 50 CHL clasificó estas
cepas como Lactobacillus casei, Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei y Lactobacillus
rhamnosus. Además las especies de Lactobacillus plantarum
presentaban elevadas actividades inhibidoras para con los hongos
ensayados. Un total del 6% de las cepas antimicóticas parecía ser
de cocos y el 18% permaneció sin identificar utilizando patrones de
fermentación.
Se continuó identificando tres cepas con grandes
actividades antimicóticas utilizando análisis secuencial del ADNr
de 16S. Estudiando los metabolismos de los carbohidratos, se
identificaron previamente como Lactobacillus paracasei
subesp. paracasei (SM20 y SM29) y Lactobacillus
curvatus (SM63). El análisis secuencial del 16S ADNr de estas
cepas puso de manifiesto la especie Lactobacillus paracasei
subesp. paracasei para la cepa SM20 con una identidad del
100% en 1519 nucleótidos solapantes con la secuencia parcial del 16S
ADNr de Lactobacillus paracasei JCM8130 (D79212) y con la
secuencia parcial de 16S ADNr de un Lactobacillus casei
(D86517). Se identificaron un total de 1520 nucleótidos del 16S ADNr
de la cepa SM20. Los 1528 nucleótidos secuenciados procedentes de
la cepa SM29 presentaron una identidad del 99,9% en 1520 nucleótidos
solapantes con la secuencia parcial del gen 16S de ARNr de un
Lactobacillus casei (D86517) y con la secuencia parcial de
16S de ADNr de Lactobacillus paracasei JCM8130 (D79212).
Sorprendentemente, los 1515 nucleótidos identificados del gen 16S
de ARNr de la cepa SM63 presentaban también una identidad del 99,9%
en 1493 nucleótidos solapantes con el gen 16S de ARNr de un
Lactobacillus casei (D86517) y con la secuencia parcial del
16S de ADNr de Lactobacillus paracasei JCM8130 (D79212).
Ya que los miembros del grupo casei
forman un grupo muy homólogo en relación con los criterios
fenotípicos así como con los datos de la secuencia del gen 16S de
ARNr, Ward y Timmins (1999) desarrollaron un método sencillo de PCR
para diferenciar las especies Lactobacillus casei,
Lactobacillus paracasei y Lactobacillus rhamnosus
basándose en la reclasificación de Collins et al. (1989). La
Figura 2 presenta un producto específico de 290 bp para las cepas
SM20, SM29 y SM63 ampliadas en una reacción en cadena de la
polimerasa con el cebador específico para Lactobacillus
paracasei utilizado junto con el cebador Y2, que se dirigen
ambos al gen 16S de ARNr. Las cepas típicas de Lactobacillus
casei (DSM 20011^{T}) y Lactobacillus paracasei
subesp. paracasei (DSM 5622^{T}) pusieron de manifiesto
también una banda de 290 bp con los correspondientes cebadores.
Sorprendentemente, Lactobacillus rhamnosus (DSM 20021^{T})
no presentaban la banda específica después de la reacción en cadena
de la polimerasa con Y2 y rham. Además, no se observaban
productos si este primer par (Y2/rham) se utilizaba con las
cepas que han de identificarse. De este modo, se identificaron las
cepas SM20, SM29 y SM63 como Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei. La Tabla 3 presenta un resumen de la
identificación de las tres cepas así como de su caracterización.
Collins et al. (1989) describieron otra
subespecie de Lactobacillus paracasei, a saber
Lactobacillus paracasei subesp. tolerans. Con
respecto a la producción de ácido observada por Collins et
al. (1989), las cepas SM20, SM29 y SM63 pertenecen a la
subespecie paracasei.
Se examinó la capacidad para segregar sustancias
inhibidoras en el medio del caldo de cultivo de Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM20, Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM29, Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM63, Lactobacillus
plantarum SM17 y Lactobacillus plantarum SM39. Por
consiguiente las cepas se cultivaron en caldo de cultivo MRS o en
medio SWP1. No se detectó ninguna actividad antagonística en los
sobrenadantes exentos de células utilizando una prueba de difusión
buena. Incluso una etapa de concentración por ultrafiltración
(corte a un peso molecular de 3.000 Da) no puso de manifiesto
ninguna actividad detectable (datos no
representados).
representados).
Se determinaron las actividades antimicóticas de
un total de 18 lactobacilos solos o en combinación con la SM11 de
Propionibacterium jensenii muy antimicótica. Por
consiguiente, se incorporaron las cepas, tras la centrifugación y
una etapa de lavado en concentraciones de 10^{5} a 10^{8} cfu/ml
en placas con YM agar-agar en las que los hongos
listados en la Tabla 1 se sembraron con puntos en las
concentraciones correspondientes desde 10^{1} a 10^{7} cfu/ml.
Las placas se guardaron en diferentes lotes a 6ºC, 12ºC y 25ºC. Se
controló semanalmente o a diario el crecimiento de las levaduras,
respectivamente. Aunque, los lactobacilos así como la cepa de
Propionibacterium presentaban solamente actividades
inhibidoras débiles utilizándolas solas (datos no mostrados) su
combinación puso de manifiesto valores antagonísticos elevados a
6ºC. Las mayores actividades se detectaron con los siguientes
lactobacilos en combinación con Propionibacterium jensenii
SM11: de Lactobacillus paracasei subesp. paracasei
SM20, Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM29,
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM63. Se
observaron actividades débiles con Lactobacillus plantarum
SM17 y Lactobacillus plantarum SM39 junto con la cepa SM11.
Un número de células de 10^{8} cfu/ml de la cepa de
Lactobacillus y 10^{8} cfu-ml de la cepa
Propionibacterium fue necesario para actividades inhibidoras
altas. La Tabla 4 indica cinco ejemplos de actividades antimicóticas
observadas a 6ºC con una concentración de 10^{8} cfu/ml (10^{7}
cfu/ml para Lactobacillus plantarum SM17) contra cepas
inoculadas con puntos en una densidad de 10^{6} cfu/ml y contra
cultivos de mohos de 3 días inoculados con puntos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Resulta interesante que utilizando
Ka-Sorbat, se observó una actividad inhibidora más
débil a 6ºC que con los cultivos antimicrobianos de este estudio
(cepas SM20, SM29 o SM63 en combinación con la cepa SM11). La Tabla
4 representa además, que tras un almacenaje de 7 días a 12ºC se
observó una clara actividad inhibidora para las cepas SM20, SM29 y
SM63 de Lactobacillus paracasei subesp. paracasei y
una actividad débil para las cepas SM17 y SM39 de Lactobacillus
plantarum junto con la cepa SM11 de Propionibacterium
jensenii. A 25ºC sólo se observaron actividades inhibidoras
débiles que desaparecieron después de unos pocos días (datos no
mostrados). Experimentando las actividades antimicóticas de dos o
tres lactobacilos (cepas SM20, SM29 y SM63 de Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei) junto con la cepa SM11 de
Propionibacterium jensenii, se observó un aumento de la
inhibición (Tabla 5) en comparación con las pruebas en las que se
utilizó 1 cepa de Lactobacillus en combinación con SM11
(Tabla 4). Se alcanzó una inhibición total de las levaduras
utilizando las cepas SM20, SM29 o SM63 de Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei junto con la SM11 de
Propionibacterium jensenii y 1 g/l de
Ka-Sorbat (Tabla 5). La actividad antimicótica de
las cepas bacterianas aumentó con el conservante del alimento.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se continuó determinando la capacidad de las
cepas SM20, SM29 y SM63 de Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei para inhibir las bacterias
gram-positivas y gram-negativas
solas o en combinación con la SM11 de Propionibacterium
jensenii. Por consiguiente, se incorporaron las cepas tras la
centrifugación y una etapa de lavado en una concentración de
10^{8} cfu/ml en placas con BHI agar-agar en las
que los cultivos de toda la noche de las bacterias correspondientes
se sembraron con puntos. Se almacenó a 6ºC un lote de las placas y
se controló el crecimiento de las bacterias semanalmente, se incubó
una segunda a 25ºC y se puntuó diariamente su inhibición. De nuevo,
los lactobacilos así como la cepa Propionibacterium
presentaban actividades inhibidoras débiles utilizándolas solas
(datos no mostrados) pero su concentración puso de manifiesto
valores antagonísticos altos (Tabla 6).
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Con el fin de determinar la capacidad para
almacenar los cultivos de protección, éstos se mantuvieron por
separado a una concentración de 100 veces (resuspendidos en leche
desnatada liofilizada) a -80ºC durante 15 semanas. A continuación,
se incorporaron las cepas a una concentración de 10^{8} cfu/ml en
placas con YM agar-agar en las que las levaduras
listadas en la Tabla 1 se sembraron en puntos a concentraciones
entre 10^{4} y 10^{7} cfu/ml. Se almacenaron las placas a 6ºC y
se controló semanalmente el crecimiento de las levaduras. Como
referencia, se preparó una placa con agar-agar con
adición de una cantidad apropiada de leche desnatada. La Tabla 7
presenta un resumen, que los cultivos protectores están constituidos
por SM11 de Propionibacterium jensenii y una cepa de
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei (SM20, SM29
o SM63) todavía presentaba actividades antimicóticas inalteradas
después de un almacenaje de 15 semanas a -80ºC.
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\vskip1.000000\baselineskip
Para una prueba preliminar, se montó un modelo
de alimento con diferentes cultivos de protección. Se añadieron
cepas antagonísticas a leche desnatada liofilizada a concentraciones
iniciales de 10^{8} cfu/g. Éstas eran Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM20, Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM29, Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei SM63, Lactobacillus
plantarum SM17 y Lactobacillus plantarum SM39 en
combinación con Propionibacterium jensenii SM11. Además se
inocularon las muestras con Candida pulcherrima
1-50/13 a concentraciones de 10^{2} cfu/g y a
continuación se almacenaron a 6ºC. Tal como se indica en la Figura
3, las concentraciones de levaduras aumentaron constantemente hasta
10^{7}-10^{8} cfu/g en las muestras con las
cepas SM17 y SM39 de Lactobacillus plantarum así como en la
muestra de referencia que presenta los valores mayores. Las
muestras que contienen Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei (SM20, SM29 o SM63) presentaban diferencias
significativas. En estas muestras, Candida pulcherrima
1-50/13 aumentó hasta un nivel de 10^{4} cfu/g y a
continuación permaneció casi estable durante siete semanas. Después
de cuatro semanas las muestras con SM63 de Lactobacillus
paracasei subesp. paracasei presentaba un aumento en las
levaduras. La concentración de propionibacterias y lactobacilos ni
aumentó ni disminuyó durante el almacenaje. El pH de las muestras
con cultivos protectores no presentó ninguna diferencia
significativa con respecto a la muestra de referencia (datos no
mostrados).
\newpage
Se montó una prueba más con yogur y cultivos de
protección consistentes en las cepas SM20, SM29 o SM63 de
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei en
combinación con la SM11 de Propionibacterium jensenii. Por
consiguiente, se utilizó una leche enriquecida con nutrientes que
debería favorecer el crecimiento de levaduras contaminantes. Esta
leche se fermentó con un cultivo de yogur comercial en presencia de
un cultivo de protección. Los cultivos de protección se utilizaron
a concentraciones de 10^{7} cfu/g o de 10^{8} cfu/g,
respectivamente. Después de la fermentación y enfriamiento, se
inocularon las muestras con una mezcla de Candida
pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae
1-35/1, Candida parapsilosis
4-5/1 y Zygosaccharomyces Baily
1-48/1 a una concentración de 10^{2} cfu/g y a
continuación se almacenaron a 6ºC. La Figura 4 demuestra que las
concentraciones de levaduras en las muestras con cultivos de
protección a una concentración de 10^{7} cfu/g, así como en la
muestra de referencia, aumentaba constantemente. No obstante, la
muestra de referencia siempre presentaba los mayores valores de
levaduras contaminantes. En todas las muestras que contienen los
cultivos protectores a una concentración de 10^{8} cfu/g no se
observó ningún aumento de levaduras. La concentración de levaduras
permaneció estable durante un periodo de 4 semanas. El mismo
fenómeno se observó con concentraciones de 1,7 \times 10^{8}
cfu/g de lactobacilos y de 5,5 \times 10^{7} cfu/g de
propionibacterias (Tabla 11). En todas las muestras, las
concentraciones de cultivo de protección ni aumentaron ni
disminuyeron durante el almacenamiento. El pH de las muestras con
cultivos de protección no presentó ninguna diferencia significativa
con la muestra de referencia (datos no mostrados). Como se muestra
en la Tabla 8, en las muestras con cultivos de protección se
determinaron con enzimas 60 a 70 mg/100 g de acetato, mientras que
solamente se detectaron 4,43 mg/100 g en la muestra de referencia
sin cultivo de protección.
\vskip1.000000\baselineskip
En cambio, el cultivo de protección no influyó
en el contenido de D-lactato,
L-lactato así como en el lactato total (Tabla
8).
Utilizando diferentes pruebas organolépticas,
los yogures con cultivos de protección y las muestras de referencia
sin cultivo adicional no presentaban diferencias perceptibles tras
periodos de almacenamiento de 5 y 15 días.
Las pruebas a escala en aumento con yogur
proporcionaron resultados similares a los obtenidos mediante las
pruebas a escala de laboratorio.
La Tabla 9 presenta la inhibición de una mezcla
de levaduras en las superficies de quesos, tratados con tres
cultivos de protección diferentes a distintas concentraciones. Todos
los quesos se contaminaron con levaduras hasta alcanzar una
concentración final en la superficie de 10^{2} cfu/g. La
superficie de los quesos estaba definida como una capa de
aproximadamente 3 mm desde el exterior de la cuba.
A las concentraciones de 10^{8} y 10^{7}
cfu/g de superficie, los cultivos de protección podían inhibir la
excrecencia de levaduras totalmente durante un almacenamiento de 21
días a 6ºC. El número de levaduras disminuyó uniformemente (K1,
K2). Una concentración de 3,0 \times 10^{6} cfu/g de la
superficie de lactobacilos y 3,0 \times 10^{6} cfu/g de la
superficie de las propionibacterias parecía ser el límite para
alcanzar una inhibición mínima de las levaduras. La muestra K3A de
queso presentaba concentraciones inferiores de cultivo de
protección y de este modo no inhibió la excrecencia de las levaduras
contaminantes. Las concentraciones de cultivos de protección en la
superficie de los quesos estaban en el mismo intervalo que los
números de células de las soluciones en las que los quesos se
habían impregnado previamente (datos no mostrados).
La Tabla 10 resume la inhibición de
Listeria con cultivos de protección en carne picada y
crema.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se seleccionaron los dos modelos de alimento
para representar alimento con humedad elevada con diferentes
contenidos de grasa y proteína y un pH óptimo para Listeria.
Aunque Listeria innocua L17 presentó buen desarrollo después
de 21 días en agar-agar con BHI almacenado a 6ºC
(Tabla 6), no se detectó en los modelos de alimento. Las cantidades
viables del organismo indicador, sin embargo, disminuyeron en
presencia de un cultivo de protección. Además, estas muestras
presentaban todavía un bonito color rojo de sangre después de un
almacenamiento de 56 días y la muestra de referencia era verde a
parda y claramente deteriorada. El pH de la muestra de referencia
fue de 6,20 después de 56 días, la de una de las muestras con
cultivos de protección estaba comprendida en un intervalo entre
5,50 y 5,81. La concentración de propionibacterias y lactobacilos
permaneció inalterada durante el almacenamiento a 6ºC durante un
periodo de 56 días. Una segunda carga de carne picada con y sin
cultivos protectores se almacenó a 25ºC. Después de un
almacenamiento de 5 días, L17 de Listeria innocua se mantuvo
en comprobación en las muestras con cultivos de protección (3,2 a
5,9 \times 10^{3} cfu/g) mientras que la cantidad viable del
organismo indicador aumentó hasta 6,8 \times 10^{4} cfu/g en la
muestra de referencia. Además, la muestra de referencia había
evolucionado completamente mal. La crema almacenada a 6ºC
presentaba el mismo fenómeno después de 28 días. En la muestra de
referencia, la cantidad de Listeria innocua L17 estaba
todavía en el mismo intervalo que al comienzo (10^{3} cfu/g) pero
en la muestra con cultivo de protección, la cantidad viable de
organismo indicador disminuyó hasta inferior a 10^{2} cfu/g. La
concentración de lactobacilos y propionibacterias ni aumentó ni
disminuyó durante el almacenamiento. Los valores de pH en las
muestras con o sin cultivo de protección estaban comprendidos en el
mismo intervalo. Después de un almacenamiento de 28 días a 6ºC el
fenómeno de la crema ha disminuido hasta 4,78 en la muestra sin
cultivo de protección y hasta 4,60 en la muestra con cultivo de
protección. En las muestras de crema almacenadas a 25ºC en L17 de
Listeria innocua disminuyó por debajo de 10^{2} cfu/g en
presencia de cultivos protectores pero aumentó hasta un número de
células entre 10^{7} y 10^{8} cfu/g en la muestra de
referencia. Asimismo el pH de estas muestras cambió claramente. Las
muestras con cultivos de protección estaban comprendidas en un
intervalo entre 3,56 y 3,68, mientras que la muestra de referencia
todavía presentaba un pH de 5,80. Tras 21 días de almacenamiento a
25ºC, el número de células de lactobacilos y propionibacterias
estaba todavía en el mismo intervalo que al comienzo. Las
concentraciones de cultivos de protección ni aumentaron ni
disminuyeron. En las muestras con M1 de Listeria
monocytogenes como organismo indicador se observó una clara
diferencia en la cantidad viable del patógeno en presencia o
ausencia del cultivo protector. Después de un almacenamiento de 14
días a 6ºC, la muestra sin cultivo protector contenía 3,0 \times
10^{8} cfu/g de M1 de Listeria monocytogenes mientras que
en la muestra con el cultivo protector el número del organismo
protector había disminuido hasta 7,5 \times 10^{2} cfu/g (Tabla
10).
Para alcanzar una actividad antimicrobiana
suficiente, era necesario una determinada concentración de
lactobacilos y propionibacterias. Las Tablas 11 y 12 presentan las
diferentes pruebas de este estudio y las concentraciones
correspondientes de cultivo de protección.
\vskip1.000000\baselineskip
Para alcanzar de este modo una actividad
antimicótica óptima del cultivo de protección era necesario una
concentración de por lo menos 1,7 \times 10^{8} cfu/g o cfu/ml
de lactobacilos junto con 5,5 \times 10^{7} cfu/g o cfu/ml de
propionibacterias (Tabla 11). En la superficie del queso, una
concentración de 1,0 \times 10^{7} cfu/g de superficie de
lactobacilos y 5,0 \times 10^{6} cfu/g de superficie de
propionibacterias parecía ser la concentración mínima que debe
alcanzar una actividad antimicótica constante satisfactoria (datos
no mostrados). Para una actividad antibacteriana suficiente, la
concentración inferior determinada fue de 1,2 \times 10^{8}
cfu/g o cfu/ml de lactobacilos junto con 3,0 \times 10^{8} cfu/g
o cfu/ml de propionibacterias que presentan todavía buenas
propiedades inhibidoras (Tabla 12). Según las investigaciones
conocidas las actividades antimicrobianas están comprendidas en el
mismo intervalo que las antimicóticas.
Aunque en la presente memoria se han mostrado y
descrito las formas de realización preferidas de la invención, debe
apreciarse que la invención no se limita a las mismas, pudiendo
materializarse de manera variada y ponerse en práctica dentro del
alcance de las reivindicaciones siguientes.
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2000. Eidgenössisches Departement des Innern: Dreifuss. EDMZ,
Bern.
Las cepas siguientes se han depositado el
20.09.2001 en el DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganisment und Zellkulturen GmbH (DSMZ).
- -
- La cepa Propionibacterium jensenii SM11 ha sido depositada con el número DSM 14513
- -
- La cepa Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 ha sido depositada con el número DSM 14514.
- -
- La cepa Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 ha sido depositada con el número DSM 14515.
- -
- La cepa Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 ha sido depositada con el número DSM 14516.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Eidgenössische Technische Hochschule
Zürich
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo sistema biológico con
actividades antimicrobianas para su utilización como sistema de
conservación natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Mezcla de bacterias
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctcagaa cgaacgctag gcccg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcactgaga ttcgacttaa
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccgagatt caacatgg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcatcttga tttaattttg
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipaggaggtgat ccarccgca
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipagtttgatcm tggctcag
\hfill18
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<210> 7
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactcctacgg gaggcagc
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipaccgcggctg ctggcac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggmttagata ccctggtagt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
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<400> 10
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\hfill20
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtacacaccg cccgtca
\hfill17
Claims (18)
1. Mezcla de bacterias, caracterizada
porque dicha mezcla de bacterias es un cultivo no iniciador que está
exento de metabolitos y comprende por lo menos una primera bacteria
seleccionada de entre la especie Propionibacterium jensenii
y por lo menos una segunda bacteria seleccionada de entre el género
Lactobacillus.
2. Mezcla de bacterias que es un cultivo no
iniciador según la reivindicación 1, que puede obtenerse por el
procedimiento que comprende las etapas que consisten en:
- -
- Incorporación de una mezcla de bacterias que comprende por lo menos una primera bacteria seleccionada de entre la especie Propionibacterium jensenii y por lo menos una segunda bacteria seleccionada de entre el género Lactobacillus y que está exenta de metabolitos en un medio o sobre la superficie de un medio contenido en un primer recipiente de modo que resulta una concentración de por lo menos 1 x 10^{8} cfu/ml o 1 x 10^{8} cfu/g o 1 x 10^{7} cfu/cm^{2} de cada una de dichas primera y segunda bacterias;
- -
- Incorporación de contaminantes en el medio y/o aplicación sobre la superficie del medio de dicho primer recipiente;
- -
- Incorporación en el medio y/o aplicación sobre la superficie del medio contenido en un segundo recipiente de los mismos contaminantes que los incorporados en el medio y/o aplicados sobre la superficie del medio de dicho recipiente, siendo dicho medio idéntico al medio de dicho primer recipiente pero careciendo de dicha mezcla de bacterias;
- -
- Determinación de la inhibición de dichos contaminantes por dicha mezcla de bacterias almacenando dichos primer y segundo recipientes a una temperatura adecuada durante un periodo de almacenamiento adecuado y comparando el número y/o la concentración de contaminantes en el medio y/o sobre la superficie del medio contenido en dichos primer y segundo recipientes, en la que dicha mezcla de inhibición es tal que el número y/o la concentración de dichos contaminantes en el medio y/o sobre la superficie del medio contenido en dicho segundo recipiente es mayor que el número y/o la concentración en el medio y/o sobre la superficie del medio contenido en dicho primer recipiente durante por lo menos parte de dicho periodo de almacenamiento; en la que dicha mezcla de bacterias se considera que se inhibe si el número de contaminantes en el medio y/o sobre la superficie del medio contenido en dicho segundo recipiente es por lo menos log 1, preferentemente por lo menos log 2, muy preferentemente por lo menos log 3, más preferentemente por lo menos log 4, aún más preferentemente por lo menos log 5, todavía más preferentemente por lo menos log 6 mayor que el número de contaminantes sobre la superficie del medio contenido en dicho primer recipiente durante por lo menos 3 días, preferentemente por lo menos 7 días, muy preferentemente por lo menos 14 días, más preferentemente por lo menos 21 días, y aún más preferentemente 25 días.
3. Mezcla de bacterias según la reivindicación
2, caracterizada porque dicho medio es alimento o producto
alimenticio o preferentemente medio de
agar-agar.
4. Mezcla de bacterias según la reivindicación 2
ó 3, caracterizada porque dicha temperatura adecuada es de
aprox. 6 a 25ºC, preferentemente dicha temperatura adecuada es por
lo menos una seleccionada de entre el grupo de aprox. 6ºC, aprox.
12ºC, aprox. 25ºC y dicho periodo de almacenamiento adecuado es de 7
a 28 días, preferentemente dicho periodo de almacenamiento adecuado
es por lo menos uno seleccionado de entre el grupo de 7 días, 14
días, 21 días y 28 días.
5. Mezcla de bacterias según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque dichos
contaminantes son hongos o bacterias o mezclas de los mismos.
6. Mezcla de bacterias según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la
proporción entre dicha primera bacteria y dicha segunda bacteria
asciende a entre 1:100 y 10:1, preferentemente 1:10 y 10:1.
7. Mezcla de bacterias según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha
segunda bacteria se selecciona de entre el grupo constituido por
Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus,
Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum y mezclas
de las mismas.
8. Mezcla de bacterias según la reivindicación
7, caracterizada porque dicha segunda bacteria se selecciona
de entre una o más cepas de Lactobacillus paracasei,
subesp. paracasei.
9. Mezcla de bacterias según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha
segunda bacteria se selecciona de entre el grupo constituido por
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM20,
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM29,
Lactobacillus paracasei subesp. paracasei SM63, y
mezclas de las mismas.
10. Mezcla de bacterias según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha
primera bacteria es Propionibacterium jensenii SM11.
11. Alimento, producto alimentario o medicamento
caracterizado porque dicho alimento, producto alimentario o
medicamento comprende la mezcla de bacterias según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores.
12. Alimento según la reivindicación 11,
caracterizado porque dicho alimento se selecciona de entre el
grupo de productos lácteos, preferentemente productos lácteos
agrios y/o productos cárnicos.
13. Procedimiento para la preparación del
alimento, producto alimenticio o medicamento, en particular el
alimento según la reivindicación 11 ó 12, que comprende las etapas
que consisten en:
- -
- Adición de la mezcla de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 durante la preparación del alimento, producto alimenticio o medicamento de modo que la concentración de dicha por lo menos una primera bacteria y dicha por lo menos una segunda bacteria en el alimento, producto alimenticio o medicamento asciende cada una a por lo menos 1 \times 10^{8} cfu/ml o cada una a por lo menos 1 \times10^{8} cfu/g del alimento, producto alimenticio o medicamento o cada una a por lo menos 1 \times 10^{7} cfu/cm^{2} de la superficie del alimento, producto alimenticio o medicamento;
- -
- Control de los parámetros de preparación durante la preparación de modo que dicha concentración de dicha mezcla de bacterias permanece constante.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque la concentración de dicha primera
bacteria en el alimento, producto alimenticio o medicamento
asciende a por lo menos 1 \times 10^{9} cfu/ml o por lo menos 1
\times10^{9} cfu/g del alimento, producto alimenticio o
medicamento o por lo menos 1 \times 10^{8} cfu/cm^{2} de la
superficie del alimento, producto alimenticio o medicamento y dicha
segunda bacteria asciende a por lo menos 1 \times 10^{8} cfu/ml
de dicho alimento, producto alimenticio o medicamento o por lo
menos 1 \times10^{8} cfu/g de dicho alimento, producto
alimenticio o medicamento o por lo menos 1 \times 10^{7}
cfu/cm^{2} de la superficie de dicho alimento, producto
alimenticio o medicamento o viceversa.
15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó
14, que comprende una o más etapas de fermentación,
caracterizado porque dicha mezcla de bacterias se añade
antes de dichas una o más etapas de fermentación y/o entre dichas
más etapas de fermentación y/o después de dichas una o más etapas de
fermentación.
16. Procedimiento para almacenar el alimento,
producto alimenticio o medicamento según la reivindicación 11 ó 12
o el alimento, producto alimenticio o medicamento preparado según
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende la etapa
que consiste en controlar los parámetros de almacenamiento durante
el almacenamiento de modo que dicha concentración de dichas primera
y segunda bacterias permanece constante.
17. Utilización de la mezcla de bacterias según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para inhibir
microorganismos seleccionados de entre el grupo constituido por
hongos, bacterias y mezclas de los mismos que son patógenos y/o
descomponedores, en particular en alimento, producto alimenticios o
medicamentos.
18. Bacterias seleccionadas de entre el grupo
constituido por DSM 14513 (Propionibacterium jensenii SM11)
DSM 14514 (Lactobacillus paracasei subesp. paracasei
SM20), DSM 14515 (Lactobacillus paracasei subesp.
paracasei SM29), DSM 14516 (Lactobacillus paracasei
subesp. paracasei SM63), o mezclas de los mismos.
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