PL206763B1 - Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie - Google Patents
Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterieInfo
- Publication number
- PL206763B1 PL206763B1 PL368846A PL36884602A PL206763B1 PL 206763 B1 PL206763 B1 PL 206763B1 PL 368846 A PL368846 A PL 368846A PL 36884602 A PL36884602 A PL 36884602A PL 206763 B1 PL206763 B1 PL 206763B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteria
- mixture
- food
- cfu
- lactobacillus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
- A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
- A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
- A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B2/783—Microorganisms; Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
- A23B4/00—Preservation of meat, sausages, fish or fish products
- A23B4/14—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
- A23B4/18—Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
- A23B4/20—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B4/22—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
- A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
- A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
- A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
- A23L13/45—Addition of, or treatment with, microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Description
Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 368846 (22) Data zgłoszenia: 30.10.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
30.10.2002, PCT/IB02/004521 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
15.05.2003,WO03/040349 (11) 206763 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
A01N 63/00 (2006.01) A23K 3/00 (2006.01) A23L 3/3571 (2006.01) C12R 1/245 (2006.01)
| (54) Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, (54) sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie | |
| (73) Uprawniony z patentu: | |
| (30) Pierwszeństwo: 06.11.2001, EP, 01125464.6 | EIDGENOSSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZϋRICH, Z^ich, CH |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 04.04.2005 BUP 07/05 | (72) Twórca(y) wynalazku: SUSANNE MIESCHER SCHWENNINGER, Z^ich, CH |
| LEO MEILE, Z^ich, CH | |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | |
| 30.09.2010 WUP 09/10 | (74) Pełnomocnik: |
| rzecz. pat. Urszula Bartnik |
PL 206 763 B1
Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie.
Tło wynalazku
Rozwojowi niepożądanych mikroorganizmów w produktach żywnościowych można zapobiegać różnymi drogami. Poza obróbką fizyczną i chemiczną szeroko stosuje się traktowanie biologiczne, takie jak fermentację z wykorzystaniem mikroorganizmów naturalnie występujących w tej żywności i/lub sztucznie wprowadzonych („starterowych”). Mogą one zmieniać właściwości żywności na takie, przy których warunki wzrostu organizmów niepożądanych są mniej korzystne bądź wzrost jest całkowicie zahamowany, jak to się dzieje w przypadku wina, piwa, sera lub jogurtu (Holzapfel i wsp., 1995; Vogel, 1936). Innym systemem indukowanego biologicznie konserwowania żywności jest suplementacja „kulturami ochronnymi” pełniącymi rolę „biokonserwantów”. Uważa się, że kultury te:
a) albo rosną i konkurencyjnie tłumią organizmy niepożądane,
b) albo rosną i wytwarzają substancje przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze (np. bakteriocyny, kwasy organiczne, diacetyl, nieznane metabolity),
c) bądź też wchodzą w reakcję z psującymi żywność mikroorganizmami według nieznanych mechanizmów.
Jako że kultury ochronne, będące kulturami starterowymi z reguły nie uczestniczą w specyficznych procesach modyfikacji żywności, ich zastosowanie można również rozciągnąć na produkty nie żywnościowe.
Właściwości przeciwbakteryjne pałeczek Propionibacterium i pałeczek kwasu mlekowego sprawiają, że znajdują one zastosowanie w przemyśle jako biokonserwanty. Bio Profit (Valio Ltd., Helsinki,
Finlandia; Wiesby GmbH & Co., Nieb^l, Niemcy) jest dostępną w handlu ko-kulturą Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061) (wcześniej Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) i Propionibacterium freudenreichii subsp., shermanii J3 (DSM 7067), oferowaną do kontrolowania drożdży i pleśni (Soumalainen i Mayra-Makinen, 1999). Obydwa organizmy podano razem i sugerowano, że mogą być stosowane jako zawierająca komórki brzeczka fermentacyjna hamująca wzrost pleśni i drożdży w żywności. Szczep Lactobacillus rhamnosus LC705 został zastrzeżony w 1993 roku w patencie europejskim EP 0 576 780 do użycia jako pojedynczy szczep albo w połączeniu z bakterią z rodzaju Propionibacterium albo z innym szczepem bakteryjnym gatunku Lactobacillus casei. W drugim patencie (DE 19917715) opisane są ochronne kultury zawierające bakterie kwasu mlekowego, hamujące wzrost bakterii powodujących toksyczność w temperaturach powyżej 7-8°C. Kultury te są przeznaczone do konserwowania żywności i paszy dla zwierząt (karmy) o krótkim okresie składowania w temperaturze poniżej 7-8°C. W przypadkach wzrostu temperatury składowania, kultury te mają hamować wzrost bakterii powodujących psucie. Odwrotnie, MicrogardTM (Wesman Foods, Inc., Beaverton, Oregon, USA) jest dostępnym w handlu produktem mlecznym fermentowanym przez szczep P. freudenreichii ssp. shermanii, następnie poddanym procesowi pasteryzacji. Deklarowana jest skuteczność produktu w hamowaniu wybranych organizmów powodujących psucie żywności oraz mikroorganizmów patogennych, o których wiadomo, że wywołują choroby pochodzenia pokarmowego (Daeschel, 1989; Al-Zoreky i wsp., 1991). MicrogardTM jest dopuszczony do obrotu przez amerykańską agencję Food and Drug Administration.
Ujawnienie wynalazku
Generalnym celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonego, opartego na bakterii, inhibitora hamującego wzrost grzybów (drożdży, pleśni) i/lub bakterii oraz ich mieszanin.
Przedmiotem wynalazku jest zatem mieszanina bakterii, charakteryzująca się tym, że mieszanina ta jest kulturą nie starterową, wolną od metabolitów i zawierającą co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus.
Tą mieszaninę bakterii będąca kulturą nie starterową według wynalazku wytwarza się sposobem obejmującym następujące etapy:
- wprowadzenia mieszaniny bakterii zawierającej co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus, która to mieszanina jest wolna od metabolitów, do pożywki albo na powierzchnię pożywki zawartej w pierwPL 206 763 B1 szym pojemniku w takiej ilości, aby uzyskać stężenie co najmniej 1 x 108 cfu/ml albo 1 x 108 cfu/g albo 1 x 107 cfu/cm2 każdej powyższej pierwszej i drugiej bakterii;
- wprowadzenia czynników skaż ają cych do poż ywki i/lub na powierzchni ę poż ywki zawartej w pierwszym pojemniku;
- wprowadzenia do pożywki i/lub naniesienie na powierzchnię pożywki zawartej w drugim pojemniku tych samych czynników skażających jakie wprowadzono do i/lub naniesiono na powierzchnię pożywki w pierwszym pojemniku, która to pożywka jest identyczna z pożywką zawartą w pierwszym pojemniku lecz nie zawiera mieszaniny bakterii;
- oznaczenia hamowania powyższych czynników skażających przez tę mieszaninę bakterii przez przechowywanie pierwszego i drugiego pojemnika w odpowiedniej temperaturze w odpowiednim czasie przechowywania i porównania ilości i/lub stężenia czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym i w drugim pojemniku, przy czym powyższa mieszanina hamująca działa w ten sposób, że ilość i/lub stężenie czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest wyższe od ilości i/lub stężenia w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po przynajmniej części tego okresu przechowywania, przy czym wspomnianą mieszaninę bakterii uznaje się za posiadającą właściwości hamujące, jeśli ilość czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest o co najmniej log 1 wyższa, korzystnie o co najmniej około log 2 wyższa, bardziej korzystnie o co najmniej około log 3 wyższa, jeszcze korzystniej o co najmniej około log 4 wyższa, a nawet jeszcze korzystniej o co najmniej około log 5 wyższa, najkorzystniej o co najmniej około log 6 wyższa, od ilości czynników skażających na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po okresie co najmniej 3 dni, korzystnie okresie co najmniej 7 dni, bardziej korzystnie w okresie co najmniej 14 dni, jeszcze korzystniej okresie co najmniej 21 dni a najkorzystniej po okresie 25 dni. W tak otrzymywanej mieszaninie bakterii według wynalazku, korzystną pożywkę przy wytwarzaniu stanowi żywność bądź karma lub pożywka agarowa. Natomiast odpowiednią temperaturą jest temperatura około 6-25°C, korzystnie, odpowiednią temperaturą jest temperatura wybrana co najmniej z grupy około 6°C, około 12°C, około 25°C a odpowiednim czasem przechowywania jest czas 7-28 dni, korzystnie czas przechowywania jest wybrany przynajmniej z grupy 7 dni, 14 dni, 21 dni, 28 dni.
W mieszaninie bakterii wedł ug wynalazku wytwarzanej powyż ej opisanym sposobem wspomnianymi czynnikami skażającymi są grzyby lub bakterie albo ich mieszaniny.
Korzystna proporcja bakterii w mieszaninie według wynalazku pomiędzy wspomnianymi bakteriami wynosi od 1:100 do 100:1, korzystnie od 1:10 do 10:1.
W korzystnym wykonaniu wynalazku mieszanina bakterii charakteryzuje się tym, że bakteria z rodzaju Lactobacillus wybrana jest z grupy obejmują cej Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum lub ich mieszanin, jeszcze bardziej korzystnie bakteria ta jest wybrana spośród jednego lub kilku szczepów Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.
W mieszaninie bakterii według wynalazku bakteria z rodzaju Lactobacillus jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 i ich mieszaniny, a wspomniana bakteria Propionibacterium jensenii korzystnie stanowi Propionibacterium jensenii SM11.
Przedmiotem wynalazku jest również żywność, karma lub lek, charakteryzująca się tym, że wspomniana żywność, karma lub lek zawiera mieszaninę bakterii jak zdefiniowane powyżej.
W korzystnej realizacji wynalazku ż ywność jest wybrana z grupy obejmującej produkty mleczne, korzystnie zakwaszone produkty mleczne i/lub produkty mięsne.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania żywności, karmy lub leku, zwłaszcza żywności zdefiniowanej w powyżej, polegający na tym, że zawiera etapy:
- dodania mieszaniny bakterii zdefiniowanej powyż ej podczas wytwarzania ż ywnoś ci, karmy lub leku w takiej ilości, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus w tej żywności, karmie lub leku osiągnęło dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/ml albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy lub leku albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku;
- kontrolowania parametrów wytwarzania podczas procesu wytwarzania, tak, aby stężenie mieszaniny bakterii pozostawało na stałym poziomie.
Korzystnie stężenie bakterii Propionibacterium jensenii w tej żywności, karmie lub leku wynosi przynajmniej 1 x 109 cfu/ml albo przynajmniej 1 x 109 cfu/g żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 108 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku a stężenie bakterii z rodzaju Lactobacillus wy4
PL 206 763 B1 nosi przynajmniej 1 x 108 cfu/ml żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku lub vice versa.
W korzystnej odmianie wynalazku sposób obejmuje jedną lub wię kszą ilość etapów fermentacji i polega na tym, że mieszaninę bakterii dodaje się przed tym jednym lub większą ilością etapów fermentacji i/lub pomiędzy większą ilością etapów fermentacji i/lub po jednym lub większej ilości etapów fermentacji.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób przechowywania żywności, karmy lub leku zdefiniowanych powyżej albo żywności, karmy lub leku zdefiniowanych powyżej, polegający na tym, że zawiera etap kontrolowania parametrów przechowywania podczas okresu przechowywania, tak aby stężenie bakterii pozostawało na stałym poziomie.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie mieszaniny bakterii zdefiniowanej powyżej do hamowania rozwoju mikroorganizmów, wybranych z grupy obejmującej grzyby, bakterie i ich mieszaniny, które to grzyby i bakterie są chorobotwórcze i/lub powodują psucie, zwłaszcza żywności, karmy lub leków.
Kolejnym przedmiotem wynalazku są bakterie wybrane z grupy obejmującej D3M14513 (Propionibacterium jensenii SM11), DSM14514 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20), DSM14515 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29), DSM14516 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63) lub ich mieszaniny.
Nieoczekiwanie okazało się, że bakterie wybrane z gatunku Propionibacterium jensenii i/lub rodzaju Lactobacillus, będące kulturami nie-starterowymi i wolnymi od metabolitów są dogodnymi inhibitorami niepożądanych mikroorganizmów. Szczególnie mieszanina bakterii (nazywana mieszaniną hamiującą albo kulturą ochronną), będąca kulturą nie starterową, wolną od metabolitów i zawierającą co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus, ma zdolność hamowania co najmniej jednego mikroorganizmu wybranego spośród grzybów i/lub bakterii a także mieszanin grzybów i bakterii, które między innymi są odpowiedzialne za psucie się żywności i karmy.
Ta mieszanina bakterii posiada wielką zaletę, że jakkolwiek nie występują w niej metabolity uważane za czynniki odpowiedzialne za aktywność ochronną - ochrona jest równie dobra a nawet lepsza niż w dotychczas znanych kulturach a niepożądane efekty uboczne związane z obecnością metabolitów (np. metabolity mogą być toksyczne lub również wpływać ujemnie na smak, barwę i inne cechy żywności) są znacznie zmniejszone bądź całkowicie wyeliminowane.
Taką mieszaninę bakterii wprowadza się do i/lub nanosi się na powierzchnię żywności poddawanej zabezpieczeniu.
Termin „metabolity” obejmuje wszystkie produkty pochodzące z metabolizmu bakteryjnego zawarte w mieszaninie.
W niniejszym zgłoszeniu, bakterie i grzyby mogące powodować psucie się żywności, karmy lub leków są również nazywane „mikroorganizmami niepożądanymi”.
Termin „mieszanina bakterii wolna od metabolitów” oznacza, że tylko mieszaninę bakterii (np. oddzieloną od metabolitów przynajmniej przez odwirowanie, korzystnie przez odwirowanie i przynajmniej jednoetapowe odmywanie), ewentualnie razem z nośnikiem, wprowadza się do i/lub nanosi na powierzchnię produktu (żywności, karmy, leku) przeznaczonego do zabezpieczenia przed psuciem.
Poza tym, w niniejszym zgłoszeniu patentowym terminy „być hamowanym”, „hamować” i podobne oznaczają przykładowo, że wzrost ale również ilość lub stężenie niepożądanych mikroorganizmów, np. w żywności i/lub na powierzchni żywności zawierającej tę mieszaninę jest niższa niż w ż ywnoś ci i/lub na powierzchni ż ywnoś ci, która nie zawiera tej mieszaniny.
Termin „mieszanina będąca kulturą nie-starterową” oznacza mieszaninę zawierającą bakterie, które nie są lub nie są zasadniczo dostosowane do produktu - szczególnie żywności, karmy, leków, przeznaczonych do zabezpieczenia przez tę mieszaninę, a zatem nie wykazują one wzrostu lub wykazujące jedynie minimalny wzrost. Minimalny wzrost oznacza wzrost najwyżej około 10-krotny.
Korzystną mieszaniną jest mieszanina bakterii opisana powyżej, dająca się uzyskać sposobem złożonym, z następujących etapów:
Na początku, mieszaninę hamującą, zawierającą co najmniej jedną bakterię Propionibacterium. jensenii i co najmniej jedną bakterię z rodzaju Lactobacillus, która to mieszanina jest wolna od metabolitów, wprowadza się do pożywki i/lub nanosi się na powierzchnię pożywki zawartej w pierwszym pojemniku, w takiej ilości, aby uzyskać w tej pożywce i/lub na powierzchni tej pożywki, minimalne stężenie (szczegółowo zdefiniowane poniżej), każdej z wspomnianych bakterii.
PL 206 763 B1
Pożywką zawartą w pierwszym i w drugimi pojemniku (drugi pojemnik jest opisany poniżej), w której to pożywce lub na powierzchni której to pożywki testuje się czynniki skażają ce, jest korzystnie żywność lub karma bądź lek albo najkorzystniej zestalona pożywka agarowa.
Bakterie wybiera się z gatunku Propionibacterium jensenii i z rodzaju Lactobacillus.
Jako ślepą próbę przygotowuje się drugi pojemnik zawierający tę samą pożywkę, jaka znajduje się w pierwszym pojemniku ale nie zawierającą mieszaniny bakterii.
Następnie do pożywek zawartych w pierwszym i w drugim pojemniku wprowadza się lub nanosi się na ich powierzchnię taką samą ilość czynników skażających.
Termin „czynniki skażające” ma takie samo znaczenie jak termin „niepożądane mikroorganizmy” i obejmuje grzyby i/lub bakterie a takż e mieszaniny grzybów i bakterii.
Hamujące działanie mieszaniny wobec czynników skażających oznacza się przez przechowywanie w odpowiednim czasie pierwszego i drugiego pojemnika w odpowiedniej temperaturze.
Zasadniczo, odpowiednia temperatura, w której prowadzi się postępowanie tym sposobem zależy od temperatury, w której określony produkt, zwłaszcza żywność, karma lub lek jest normalnie przechowywany i/lub produkowany.
Temperaturą, w której zazwyczaj utrzymuje się pierwszy i drugi pojemnik jest temperatura od 5 do 26° C, korzystnie tą temperaturą jest temperatura wybrana co najmniej z grupy obejmują cej okoł o 6°C i/lub około 12°C i/lub około 25°C.
Termin „około” oznacza 6 ± 1°C, 12 ± 1°C, 25 ± 1°C.
Czas przechowywania w tej temperaturze zależy od czasu, w którym jest normalnie przechowywany dany produkt (żywność, karma lub lek).
Czas przechowywania wynosi zwykle 7-28 dni, korzystnie czas przechowywania jest wybrany przynajmniej z grupy 7 dni i/lub 14 dni i/lub 21 dni i/lub 28 dni.
Podczas takiego okresu przechowywania w określonej temperaturze porównuje się ilość lub stężenie czynników skażających wprowadzonych do pożywki i/lub naniesionych na powierzchnię pożywki zawartej w pierwszym i w drugim pojemniku.
W oparciu o takie porównanie (ilość/stężenie czynników skaż ają cych w pierwszymi pojemniku w określonym czasie względem ilości/stężenia czynników skażających w drugim pojemniku w określonym czasie), można wykreślić pierwszy i drugi wykres w układzie współrzędnych, gdzie np. oś X oznacza czas przechowywania a oś Y oznacza ilość i/lub stężenie czynników skażających. Pierwszy wykres przedstawia ilość lub stężenie czynników skażających wprowadzonych do pożywki i/lub naniesionych na powierzchnię pożywki w pierwszym pojemniku a drugi wykres przedstawia ten sam pomiar w poż ywce i/lub na powierzchni poż ywki zawartej w drugimi pojemniku.
Jeśli badaniom poddaje się tylko pojedyncze szczepy lub mieszaninę szczepów w obrębie tego samego gatunku lub rodzaju, można odpowiednio zastosować powyższy sposób.
Uznaje się, że mieszanina ma właściwości hamujące jeśli w etapach czasu przechowywania, krzywa na drugim wykresie przewyższa krzywą z pierwszego wykresu.
Korzystnie, uznaje się, że mieszanina ma właściwości hamujące jeśli ilość czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest o co najmniej log 1 wyższa, korzystnie o co najmniej około log 2 wyższa, bardziej korzystnie o co najmniej około log 3 wyższa, jeszcze korzystniej o co najmniej około log 4 wyższa, a nawet jeszcze korzystniej o co najmniej około log 5 wyższa, najkorzystniej o co najmniej około log 6 wyższa, od ilości czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku w czasie co najmniej 3 dni, korzystnie w czasie co najmniej 7 dni, bardziej korzystnie w czasie co najmniej 14 dni, jeszcze korzystniej w czasie co najmniej 21 dni a najkorzystniej w czasie 25 dni.
W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, co najmniej jedną bakterią Propionibacterium jensenii jest Propionibacterium jensenii SM11.
W innym korzystnym rozwiązaniu wynalazku, co najmniej jedna wspomniana powyżej bakteria z rodzaju Lactobacillus jest wybrana z grupy obejmują cej Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum i ich mieszaniny.
W kolejnym, bardziej korzystnymi rozwiązaniu, co najmniej jedna bakteria z rodzaju Lactobillus jest wybrana z jednego lub większej ilości szczepów Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei.
W jeszcze bardziej korzystnym rozwiązaniu wynalazku, tą wspomnianą co najmniej jedną bakterią jest Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20 i/lub Lactobacillus paracasei podgatunek SM29 i/lub Lactobacillus paracasei podgatunek paraicasei SM63 i ich mieszaniny.
PL 206 763 B1
Proporcja pomiędzy co najmniej jedną bakterią Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterią z rodzaju Lactobacillus w tej mieszaninie - czyli wzajemny stosunek stężenia lub ilości tych bakterii - wynosi korzystnie od 1:100 do 100:1, korzystnie od 1:10 do 10:1.
Opisane powyżej mieszaniny mają tę zaletę, że można nimi hamować rozwój mikroorganizmów wybranych z grupy obejmującej grzyby, bakterie i mieszaniny grzybów i bakterii, które są lub mogą być chorobotwórcze dla ludzi i/lub dla zwierząt i/lub które powodują lub mogą powodować psucie np. żywności, karmy i leków.
Przykładowo, w przypadku żywności, można ograniczyć lub całkowicie wyeliminować sposoby konserwowania takie jak procesy chemiczne (stosowanie środków konserwujących żywność, wysalanie) i/lub procesy fizyczne (np. działanie ciepłem, promieniowaniem UV, promieniami gamma, promieniami X), pakowanie z użyciem, gazów ochronnych (np. N2, CO2) lub pakowanie próżniowe, bez skracania czasu przechowywania/czasu składowania żywności.
W konsekwencji zwłaszcza, żywność o nikim stopniu przetworzenia lub substancje dodatkowe o niskim stopniu przetworzenia dodawane do wysoko-przetworzonej ż ywnoś ci mogą być przechowywane przez dłuższe okresy czasu bez rozkładu biologicznego a także, mogą być lepiej eksportowane do innych krajów.
O ile to potrzebne, mieszaninę można również stosować w połączeniu z wymienionymi powyżej sposobami konserwowania.
Podstawowym warunkiem zastosowania takich sposobów konserwowania w połączeniu z tą mieszaniną jest aby mieszanina zachowała właściwości ochronne.
Przykładowo, oznacza to, że po zastosowaniu wspomnianego sposobu konserwowania, w zabezpieczanym produkcie powinny w dalszym ciągu być obecne przynajmniej podane poniżej stężenia żywych komórek (cfu = jednostka tworząca kolonie).
Minimalne stężenie bakterii w żywności jako stężenie zabezpieczające powinno wynosić przynajmniej około 1 x 107 cfu/ml, korzystnie przynajmniej około 1 x 108 cfu/ml, bardziej korzystnie przynajmniej około 1 x 109 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 107 cfu/g, korzystnie przynajmniej około 1 x 108 cfu/g, bardziej korzystnie przynajmniej około 1 x 109 cfu/g, i/lub na powierzchni żywności powinno wynosić przynajmniej około 1 x 106 cfu/cm2, korzystnie przynajmniej około 1 x 107 cfu/cm2, bardziej korzystnie przynajmniej około 1 x 108 cfu/cm2 a jeszcze korzystniej przynajmniej około 1 x 109 cfu/cm2.
Jeśli pożądana jest wyższa aktywność przeciw czynnikom skażającym, możliwe są stężenia osiągające przynajmniej około 1 x 1010 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 1010 cfu/g i/lub przynajmniej około 1 x 1010 cfu/cm2.
Wymienione powyżej wartości stężeń minimalnych pochodzą z obserwacji eksperymentalnych wykazujących, że im wyższe stężenie lub ilość kultury ochronnej tym silniejsze jest hamowanie wzrostu grzybów i/lub bakterii oraz ich mieszanin.
Chociaż obserwuje się już pewien poziom zabezpieczenia jeśli bakterie w mieszaninie według wynalazku występują w ilościach 1 x 107 cfu/ml albo cfu/g to ochrona jest znacznie lepsza jeśli co najmniej jedna bakteria Propionibacterium jensenii i co najmniej jedna bakteria z rodzaju Lactobacillus, połączone ze sobą w mieszaninę bakterii stanowią około przynajmniej 5 x 107 cfu/ml albo przynajmniej około 5 x 107 cfu/g i/lub przynajmniej 5 x 106 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i przynajmniej około 1 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej około 1 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus. Wysoce zadawalające wyniki uzyskano przy stężeniach przynajmniej około 1 x 108 cpfu/ml albo przynajmniej około 1 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej okoł o 1 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i przynajmniej około 1 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 1 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej około 1 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus. W realizacji wynalazku korzystne są stężenia przynajmniej około 5 x 108 cfu/ml albo przynajmniej około 5 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej około 5 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i przynajmniej okoł o 5 x 108 cfu/ml albo przynajmniej okoł o 5 x 108 cfu/g i/lub przynajmniej okoł o 5 x 107 cfu/cm2 dla co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus.
Wymienione powyżej minimalne stężenia i stężenia korzystne stosują się również do leków i karmy.
Oznaczenie stężenia powierzchniowego można przeprowadzić dwiema metodami:
(i) przez pomiar naniesionej ilości, np. naniesionej przez opryskanie albo korzystnie, (ii) przez pomiar stężenia określonej objętości o dobrze zdefiniowanej powierzchni naniesienia i stanowią cej cał kowitą strefę dyfuzji tej mieszaniny bakterii.
PL 206 763 B1
Termin „co najmniej jedna bakteria Propionibacterium jensenii w stężeniu 1 x 107 cfu/ml” oznacza, że ta bakteria i ewentualnie jedna lub większa ilość innych bakterii różniących się od siebie ale należących do rodzaju Propionibacterium jensenii występują jednocześnie, przy czym wszystkie te bakterie łącznie dają stężenie 1 x 107 cfu/ml.
Zdefiniowane powyżej minimalne stężenia powinny być stosowane w dowolnym etapie po zakończeniu procesu wytwarzania żywności, karmy lub leku.
W każdym przypadku, st ężenie mieszaniny musi być wyż sze od albo przynajmniej takie samo jak stężenie minimalne przed rozpoczęciem okresu przechowywania.
Korzystnie, żywność, karma lub leki zawierają takie stężenie mieszaniny bakterii, przy którym stężenie bakterii i/lub grzybów lub mieszaniny bakterii i grzybów utrzymuje się na poziomie niższym od wymagań określonych w przepisach dotyczących żywności w danym kraju, gdzie stosowany jest wynalazek.
Korzystnie ale nie koniecznie, te minimalne stężenia stosują się również do procesu produkcji.
Jeśli stężenie bakterii tej mieszaniny w produkcie i/lub na powierzchni produktu zabezpieczanego spada poniżej stężenia minimalnego podczas prowadzenia procesu produkcji z powodu np. zastosowania procesów konserwowania, które zmniejszają ilość żywych komórek (wysoka temperatura, promieniowanie UV i podobne) albo w rezultacie zmian stężenia podczas wytwarzania (np. przez dodanie dalszych składników i podobnych) wówczas komórki można dodać podczas prowadzenia procesu produkcji. W sposobach wytwarzania zawierających etap długotrwały ważne jest, aby minimalne stężenie było utrzymane już podczas tego etapu, takiego jak np. dojrzewanie kiełbasek.
Jeśli podczas przechowywania zmniejsza się stężenie żywych komórek, tak, że już nie jest utrzymane wymagane minimalne stężenie, wówczas, o ile to możliwe należy dodać dodatkowe żywe komórki.
W zasadzie, stężenie mieszaniny bakterii w żywności, karmie i w lekach może być wyższe od stężeń minimalnych podanych powyżej. Jednakże stężenia należy dobrać tak, aby ta żywność, karma lub lek nie uległy niepożądanemu pogorszeniu. Przykładowo, oznacza to, że mieszanina nie wpłynie na własności organoleptyczne lub inne cechy jakościowe żywności (np. odbarwienie lub podobne).
Poza opisanymi powyżej mieszaninami, wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania np. karmy, leków i korzystnie żywności zawierającej takie mieszaniny.
Ten sposób wytwarzania uniemożliwia wzrost niepożądanych mikroorganizmów,
W dalszej części opisu, sposób ten jest opisany w odniesieniu do ż ywności, nie wyklucza to jednak zastosowania podanych wyjaśnień do wytwarzania innych produktów, np. karmy i leków.
Sposób ten zawiera następujące etapy:
Na początku, mieszaninę dodaje się podczas wytwarzania żywności w takiej ilości, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus w tej żywności osiągnęło dla każdej bakterii przynajmniej stężenie minimalne wyrażone w jednostkach cfu/ml albo cfu/g i/lub przynajmniej stężenie minimalne wyrażone w jednostkach cfu/cm2 na powierzchni tej żywności.
Generalnie, mieszaninę należy dodać na etapie procesu wytwarzania albo przed przechowywaniem w taki sposób, aby była ona równomiernie rozprowadzona w produkcie i/lub na powierzchni produktu poddawanego zabezpieczeniu.
Mieszaninę korzystnie stosuje się na etapie przed znaczącym skażeniem niepożądanym mikroorganizmami.
W drugim etapie wytwarzania, czyli po dodaniu mieszaniny, nale ży kontrolować jeden lub kilka parametrów sposobu wytwarzania, między innymi to, czy stężenie mieszaniny spada czy korzystnie pozostaje na stałym poziomie. O ile spadek stężenia można „wyrównać” w sposób opisany powyżej, to znaczącego wzrostu należy unikać.
Do powyższych parametrów należą przykładowo temperatura, ciśnienie jak również dodatkowe składniki żywności i podobne.
Termin „na stałym poziomie” oznacza, że po dodaniu mieszaniny do produktu, np. żywności, karmy lub leku, jej stężenie pozostaje stałe. Tę mieszaninę dodaje się korzystnie w takiej ilości aby uzyskać przynajmniej stężenie minimalne, zdefiniowane w opisie. Pod terminem „na stałym poziomie” należy również rozumieć wzrost ilości lub stężenia bakterii tej mieszaniny w wyniku wzrostu tych bakterii co najwyżej 10-krotnie.
W przypadku, gdy sposób wytwarzania zawiera jeden lub kilka etapów fermentacji, mieszanina, o ile jest dodawana przed fermentacją, nie powinna mieć ujemnego wpływu na mikroorganizmy (np.
PL 206 763 B1 bakterie, pleśnie, drożdże lub ich mieszaniny) odpowiedzialne za tę jedną lub kilka fermentacji (nie powinna obniżać aktywności fermentacyjnej).
Jeśli mieszanina wywiera taki negatywny wpływ na te mikroorganizmy, dodaje się ją po jednym lub po kilku krytycznych etapach fermentacji albo po zakończeniu procesu produkcji.
Również w sposobach wytwarzania zawierających etapy, w których może zaznaczać się wpływ tej mieszaniny bakterii, bakterie te dodaje się po tym jednym, lub po tych kilku etapach.
Poza tym, wynalazek dostarcza sposobu przechowywania produktów, zwłaszcza karmy, leków i korzystnie żywnoś ci, w którym to sposobie hamuje się wzrost niepożądanych mikroorganizmów podczas przechowywania.
Ten sposób przechowywania może być zastosowany do przechowywania np. żywności, karmy lub leków wytwarzanych sposobem według wynalazku albo znanymi sposobami produkcji.
Tylko podczas sposobu wytwarzania według wynalazku, kontroluje się parametr lub parametry procesu wytwarzania, tak, aby stężenie tej mieszaniny pozostawało na stałym poziomie.
Jeśli stosuje się inne, np. powszechnie przyjęte sposoby produkcji, wówczas kontrola ta nie jest prowadzona lub jest prowadzona jedynie częściowo. Dlatego w takim. sposobie produkcji, mieszaninę należy dodać w takim etapie, po którym stężenie jej pozostanie stałe.
Sposób przechowywania zawiera etap kontrolowania parametru lub parametrów przechowywania w czasie przechowywania, tak, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus pozostawało stałe.
Możliwymi parametrami przechowywania są przykładowo temperatura, atmosfera przechowywania wokół produktu, atmosfera przechowywania w opakowaniu produktu i podobne.
Termin „przechowywanie” oznacza czas po zakończeniu produkcji produktu, np. żywności, karmy lub leku, a więc termin ten może przykładowo obejmować również transport.
Mieszanina bakterii według wynalazku korzystnie jest zawarta w i/lub naniesiona na powierzchnię żywności, karmy lub leków.
Taką żywność stanowią korzystnie produkty mleczne, bardziej korzystnie zakwaszone produkty mleczne.
Poza tym, korzystne są również mięso i produkty mięsne.
Do produktów mlecznych należą przykładowo mleko nieprzerobione, mleko traktowane ciepłymi albo mleko poddane mikrofiltracji, masło, mleko zsiadłe, kwaśna śmietana, mleko odtłuszczone, śmietanka, jogurt, maślanka, twaróg, ser, kefir, kumys, budynie, kwaśne mleko, mleko zakwaszone bakterią acidophilus, langfil (mleko ciągnące się), mleko zakwaszone bakteriami bifidus, twaróg z serwatką, masło z kwaśnej śmietany.
Mięsem jest przykładowo porcjowana świeża wołowina, mięso drobiowe lub mięso siekane.
Do produktów mięsnych należą korzystnie gotowe do spożycia kiełbasy, karma dla zwierząt domowych, mięso traktowane azotynami i azotanami (surowe mięso peklowane), gotowane mięso solone, surowe kiełbaski i podobne.
Mieszaniną można zabezpieczać takie produkty jak np. sałatki delikatesowe sporządzone z mięsa, ryb, mięczaków, skorupiaków, warzyw, pasty i ich mieszaniny a także ryby, produkty rybne, mięczaki, skorupiaki, owoce, produkty owocowe, orzechy, produkty z orzechów oraz warzywa takie jak ziemniaki, produkty warzywne, kukurydzę, produkty z kukurydzy.
Zakresem, wynalazku objęte są też możliwe kombinacje żywności wymienionej powyżej, zawierające mieszaninę według wynalazku.
Karmę korzystnie stanowią produkty na bazie orzechów, kukurydzy i trawy.
Lekami, które mogą być zabezpieczane mieszaniną są leki naturalne i organiczne.
Zgodnie z wynalazkiem, żywność, karmę lub leki traktuje się proszkiem, zawierającym mieszaninę, który to proszek zawiera ewentualnie odpowiednie substancje nośnikowe. Odpowiednimi substancjami nośnikowymi są przykładowo sacharydy, korzystnie monosacharydy, disacharydy i ich pochodne.
Zgodnie z dalszym korzystnym rozwiązaniem według wynalazku, żywność, karmę lub leki traktuje się ciekłym medium zawierającym tę mieszaninę. To ciekłe medium musi być tak zaprojektowane, aby gwarantowało przeżywalność mieszaniny. Może to być przykładowo medium wodne, takie jak ciekły produkt mleczny albo fizjologiczny roztwór chlorku sodu.
Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem według wynalazku, mieszaninę wprowadza się do żywności, karmy lub leku przez mieszanie, opryskanie lub w podobny sposób, przy czym przez opryskanie
PL 206 763 B1 lub inny odpowiedni typ aplikacji, taki jak zanurzenie, mieszaninę nanosi się na powierzchnię żywności, karmy lub leku.
W przypadku produktów mleczarskich, mieszanina jest korzystnie zawarta w cieczy, przy czym ciecz tę dodaje się do produktu przeznaczonego do zabezpieczenia. Mieszaninę można również dodać w postaci głęboko zamrożonego lub liofilizowanego koncentratu.
Mieszanina według wynalazku, którą korzystnie wprowadza się do i/lub nanosi na powierzchnię żywności, karmy lub leku, korzystniej do i/lub na powierzchnię produktów wymienionych powyżej, umożliwia zwłaszcza hamowanie wzrostu bakterii takich jak Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Serratia liquefaciens, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus anthracis i mieszanin tych bakterii, niższych organizmów eukariotycznych, takich jak algi i mieszaniny niższych organizmów eukariotycznych, grzybów, takich jak Candida magnoliae, Candida parapsilosis, Candida silvicola, Candida valida, Candida pulcherrima, Candida reukaufii, Candida krusei, Candida sp., Sporobolomyces salmonicolor, Zygosaccharomyces bailii, Penicillium sp., mieszanin tych grzybów a także mieszanin bakterii i grzybów wymienionych powyżej oraz mieszanin wymienionych powyżej bakterii, grzybów i niższych organizmów eukariotycznych.
Wynalazek nie ogranicza się tylko do bakterii, grzybów, żywności, karmy i leków wymienionych z nazwy w niniejszym zgłoszeniu.
Krótki opis rysunków
Wynalazek jest zilustrowany załączonymi rysunkami, na których:
Fig. 1 przedstawia kompozycję 82 izolatów na agarze MRS, pochodzących z surowego mleka, sera, jogurtu, czarnych oliwek, salami oraz z kiszonek kukurydzy i paszowych, wykazujących aktywność przeciw grzybom w teście punktowym na agarze i identyfikowanych metodą API 50 CHL a jako Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei, na podstawie analizy genu 16S rRNA.
Fig. 2 przedstawia 2% żel agarozowy z amplifikacją produktu o długości 290 par zasad uzyskanego przy użyciu oligonukleotydów swoistych dla grupy casei w połączeniu z primerem Y2 (tabela 2). (A) Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20; (B) Lactobacillus paracasei podgatunek paraqasei SM29; (C) Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (D) Lactobacillus casei DSM 20011T; (E) Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei DSM 5522T i (F) Lactobacillus rhamosus DSM 20021T; 1, 4, 7, 10, 13, 16, casei/Y2; 2, 5, 8, 11, 14, 17, para/Y2; 3, 6, 9, 12, 15, 18, rham/Y2; 19 - kontrola negatywna; kb - drabina liniowych DNA uszeregowanych według ilości par zasad; pUc - marker pUC19-DNA/MspI (Hpall).
Fig. 3 przedstawia poziomy drożdży (Candida pulcherrima 1-50/13) w pięciu różnych partiach m.odelu żywnościowego z dodatkiem różnych kultur ochronnych, przechowywanych w temperaturze 6°C. (υ) 4.9 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,2 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20; (σ) 3,2 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,1 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM29; (ν) 4,1 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 9,1 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (□) 2,7 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 2,1 x 108 cfu/g Lactobacillus plantarum SM17; (◊) 2,7 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 9,3 x 107 cfu/g Lactobacillus plantarum SM39; (λ) brak kultury ochronnej. Ilości drożdży są wartościami średnimi z dwóch prób.
Fig. 4 przedstawia poziomy drożdży (Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 4-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1) w siedmiu różnych partiach jogurtu z różnymi kulturami ochronnymi, przechowywanych w temperaturze 6°C. (◊) 1,5 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 4,3 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei asei SM20; (υ) 5,5 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,7 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM20; (□) 2,0 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 3,8 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM29; (ν) 2,8 x 108 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,7 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM29; (Δ) 1,6 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,7 x 107 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (σ) 8,1 x 107 cfu/g Propionibacterium jensenii SM11 i 1,6 x 108 cfu/g Lactobacillus paracasei podgatunek paracasei SM63; (λ) brak kultury ochronnej. Ilości drożdży są wartościami średnimi z dwóch prób.
Sposoby prowadzenia wynalazku
Przykłady
Materiały i metody
Szczepy bakteryjne i pożywki
PL 206 763 B1
Szczepy bakteryjne i grzyby użyte w niniejszym, badaniu są podane w tabeli: T a b e l a 1. Szczepy bakteryjne użyte w badaniu
| Szczep | Istotne cechy charakterystyczne | Warunki hodowli | Źródło | |
| Temp. (°C) | Pożywka | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Pałeczki Propionibacterium i pałeczki mlekowe Propionobacterium | Aktywność | 32 | NLB | LMEa |
| jensenii SM11 | przeciwbakteryjna | |||
| Lactobacillus casei | Szczep | 30 | MRS | DSMb |
| DSM 200011T | typowy | |||
| Lactobacillus paracasei | ||||
| Subsp. paracasei | ||||
| SM20 | Aktywność przeciwbakteryjna | 32 | MRS | To badanie |
| SM29 | Aktywność przeciwbakteryjna | 32 | MRS | To badanie |
| SM63 | Aktywność przeciwbakteryjna | 32 | MRS | To badanie |
| DSM 5622T | Szczep typowy | 30 | MRS | DSM |
| Lactobacillus plantarum | ||||
| SM17 | Aktywność przeciwbakteryjna | 32 | MRS | To badanie |
| SM39 | Aktywność przeciwbakteryjna | 32 | MRS | To badanie |
| Lactobacillus rhamnosus | ||||
| DSM 20021T | Szczep typowy | 37 | MRS | DSM |
| Inne szczepy | ||||
| Bacillus cereus | ||||
| DSM 31T | Szczep typowy | 30 | BHI | DSM |
| Bacillus subtilis | ||||
| 168 | 30 | BHI | LME | |
| Enterococcus faecalis | ||||
| DS5 | 37 | BHI | LME | |
| Staphylococcus | ||||
| aureus | ||||
| VF4 | 37 | BHI | LME | |
| Listeria innocua | ||||
| L17 | 37 | BHI | LME |
PL 206 763 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Listeria monocytogenes M1 | 37 | BHI | LME | |
| Citrobacter freundii SG84 | 30 | BHI | LME | |
| Enterobacter cloacae SG95 | 30 | BHI | LME | |
| Escherichia coli B | 37 | BHI | LME | |
| SG63 | 37 | BHI | LME | |
| Klebsiella pneumoniae SG89 | 30 | BHI | LME | |
| Salmonella typhimurium ATCC 14028 | 37 | BHI | ATCCc | |
| Serratia liquefaciens SG64 | 30 | BHI | LME | |
| Candida sp. 1-50/15 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida kruse 3-69/2 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida magnoliae 1-35/1 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida parapsilosis 4-5/1 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida pulcherrima 1-50/13 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida reukaufii 4-73/4 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida silvicola 4-42/1 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Candida valida 1-48/8 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Sporobolomyces salmonicolor 3-46/2 | 25 | YM | Miescher (1999) |
PL 206 763 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| Penicillium sp. 2-21/7 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| 2-21/12 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| 2-52/2 | 25 | YM | Miescher (1999) | |
| 3-58/3 | 25 | YM | Miescher (1999) |
a - Laboratorium Mikrobiologii Żywności, Zurich, Szwajcaria b - Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych, Brunschweig, Niemcy c - Muzeum American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA T - szczep typowy
Wzrost szczepów Propionibacterium prowadzono na pożywce NLB, która zawierała 1% bulionu sojowego z tryptykazą bez glukozy (BBL Microbiology Systems, Cookeysville, MD, USA), 1% wyciągu drożdżowego i 1% syropu mleczanu sodu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), zgodnie z przepisem podanym przez Grinstead'a i Barefoot'a (1992). Pałeczki mlekowe namnażano w pożywce MRS z dodatkiem 0,1% Tween'u 80 (Biolife, Włochy). Wzrost wszystkich innych szczepów prowadzono w poż ywce BHI (Biolife, Wł ochy) w warunkach podanych w tabeli 1. Kultury bakteryjne utrzymywano jako zamrożone kultury podstawowe w temperaturze -80°C, w pożywce zawierającej 30% glicerolu. Drożdże i pleśnie hodowano w pożywce YM (Difco, MI, USA) i utrzymywano w temperaturze 4°C na pożywce zestalonej agarem.
Handlowe szczepy wyjściowe do fermentacji jogurtu uzyskano z Danisco Cultor Nieb^l GmbH, Niemcy. Zawierały one różne szczepy Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus.
Kultury ochronne wyprodukowano przez prowadzenie wzrostu szczepów oddzielnie, w czasie 72 godzin w temperaturze 32°C we wzbogaconym płynie uzyskanym przez filtrację serwatki przez błony półprzepuszczalne (SWP1), który to płyn zawierał 5,5% filtratu z serwatki (Emmi, Szwajcaria), 1% wyciągu drożdżowego (Becton Dickinson, MD, USA) i 2% hydrolizatu kazeiny (Merck, Niemcy). Komórki zbierano przez odwirowanie, przemywano raz lub dwa razy w 0,85% roztworze NaCl i zawieszano w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku (Difco, Detroit, MI, USA) albo w 0,35% NaCl w stosownym stężeniu, w granicach od 10- do 100-krotnego. Tyndalizowane odtłuszczone mleko poddawano uprzednio działaniu wysokiej temperatury trzy razy w 90°C przez 30 minut przez 3 kolejne dni.
Powiększenia skali i optymalizacji procesu dokonano prowadząc wzrost komórek osobno w bioreaktorze 8-1 albo 19-1 M (typ L1523; Bioengineering, Szwajcaria), w temperaturze 32°C, przy szybkości mieszania 250 obrotów/minutę, stosując 2% inoculum. Fermentację prowadzono we wzbogaconym, filtracie serwatki (SWP2) zawierającym. 5,5% filtratu serwatki, 1% wyciągu drożdżowego i 2% glukozy. Utrzymywano wartość pH 6,0 dodając 3M roztwór NaOH. Jednocześnie z kontrolą pH dodawano składniki odżywcze, 20% wyciąg drożdżowy i 20% roztwór glukozy. Inokulum hodowano we wzbogaconym filtracie serwatki (SWP1) w temperaturze 32°C przez 72 godziny, bez mieszania. Z partii fermentacyjnych okresowo pobierano próbki i analizowano je pod względem stężenia komórek i gęstości optycznej przy 650 nm. Szczepy pałeczek mlekowych hodowano przez 72 godziny, pałeczki Propionibacterium przez 90 godzin. Komórki zbierano, przemywano i zatężano w sposób opisany powyżej.
Izolacja bakterii kwasu mlekowego
Próbki po 10 g żywności trawiono przez 2 minuty w 90 ml buforu do rozcieńczania (0,85% NaCl, 0,1% peptonu), wykonano rozcieńczenia seryjne i posiano na płytki z agarem MRS z dodatkiem 0,1% Tween'u 80. Próbki mleka bezpośrednio rozcieńczano i posiano na płytki. Płytki inkubowano w warunkach anaerobowych w temperaturze 37°C, przez 3 dni. Z każdej próbki żywności pobrano wiele różnych kolonii do prób przesiewowych na aktywność przeciw-drobnoustrojową.
Metody przesiewowe na aktywność przeciw-drobnoustrojową
PL 206 763 B1
Stosowano dwie metody:
(1) Test punktowy na agarze: Kulturę bakteryjną zaszczepiano punktowo na płytce agarowej metodą Grinstead'a i Barefoot'a (1992) i inkubowano w optymalnych warunkach wzrostu (tabela 1). Na każdą płytkę wylewano po 6 ml hartowanego półmiękkiego agaru (0,6%) zawierającego 0,2 ml kultury indykatorowej, której wzrost prowadzono uprzednio do gęstości 0,2. Gęstość optyczną bakterii oznaczano przy 650 nm a gęstość optyczną drożdży i pleśni przy 530 nm. Pożywkę agarową, półmiękką pożywkę agarową i warunki inkubacji płytek dobierano stosownie do wymagań organizmów testowanych i indykatorowych. Hamowanie pasma organizmu indykatorowego monitorowano po 24 do 48 godzin dla bakterii, hamowanie grzybów oznaczano codziennie, po 3 dniach utrzymywania w temperaturze 25°C.
(2) Test dyfuzji w studzienkach agarowych: Z płytek agarowych wycinano studzienki o średnicy 7 mm i wypełniano je wolnymi od komórek supernantami kultur bakteryjnych w sposób opisany przez Daechel'a (1992). Po zakończeniu dyfundowania cieczy, na płytki nalewano półmiękki agar zawierający organizm indykatorowy w celu oznaczenia aktywności hamującej, jak opisano powyżej. Pożywkę agarową, półmiękką pożywkę agarową i warunki inkubacji płytek dobierano stosownie do wymagań organizmów testowanych i indykatorowych.
Charakteryzacja i identyfikacja izolatów bakteryjnych
Izolaty rosnące na agarze MRS, wykazujące aktywność przeciw-drobnoustrojową barwiono metodą Grama i badano mikroskopowo, określając morfologię komórek. Poza tym, badano je na aktywność katalazy przez nakraplanie na kolonie 30% nadtlenku wodoru i barwienie zarodników. Wstępnej identyfikacji szczepów dokonywano stosując test API 50 CHL (BioMerieux, S.A., Marcy l'Etoile, Francja). Dodatkowo oznaczano proteolizę w agarze MRS, stosując 5% i 10% odtłuszczone mleko i enzymatycznie oznaczano produkcję kwasów organicznych (Boehringer Mannheim, Niemcy; zestaw do oznaczania kwasu D/L-mlekowego; E1 112 821/zestaw do oznaczania kwasu octowego: E0 148 261). Ponadto oznaczano warunki wzrostu w pożywce MRS w różnych temperaturach w czasie 72 godzin i przy zawartości soli 5% i 10% temperaturze 32°C przez 72 godziny.
Identyfikacja wybranych szczepów przez sekwencjonowanie 16S rDNA
Amplifikację 16S rDNA przeprowadzono stosując bezpośrednio kolonię odpowiedniego szczepu. Przeprowadzono reakcję PCR z uniwersalnymi oligonukleotydami bak4 (Goldenberger, 1997) i bak11w (Greisen i wsp., 1994 z modyfikacją Dasen'a i wsp., 1998). Wykonano 40 cykli. Zgrzewanie prowadzono w temperaturze 56°C przez 30 sekund a wydłużanie z użyciem. Taq DNA polimerazy (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja) w temperaturze 72°C przez 2 minuty. Rozdzielenie nici DNA prowadzono w 95°C przez 5 sekund. DNA po amplifikacji oczyszczano z użyciem GFX™ PCR DNA i zestawu Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja). Automatyczne cykliczne sekwencjonowanie prowadzono w zestawie analitycznym. Terminator Ready Reaction Mix (Amersham pharmacia Biotech, Upsala, Szwecja) wobec oligonukleotydów celowanych na 16S rDNA (tabela 2).
T a b e l a 2. Oligonukleotydy celowane na 16S rDNA
| Nazwa | Sekwencja | Komentarz | Odnośnik |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Y2 | 5'-TGGCTCAGAACGAACGCTAGGCCCG-3' | Konserwatywna 16S rDNAa | Young i wsp. (1991) |
| casei | 5'-TGCACTGAGATTCGACTTAA-3' | 16S rDNA z Lactobacillus casei | Ward i Timmins (1999) |
| para | 5'-CACCGAGATTCAACATGG-3' | 16S rDNA z Lactobacillus paracasei subsp. paracasei | Ward i Timmins (1999) |
| rham | 5'-TGCATCTTGATTTAATTTTG-3' | 16S rDNA z Lactobacillus rhamnosus | Ward i Timmins (1999) |
| bak4 | 5'-AGGAGGTGATCCARCCGCA-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Greisen i wsp. (1994) |
| bakllw | 5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Goldenberger (1997) |
PL 206 763 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| eub338 | 5'-ACTCCTACGGGAGGCAGG-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Amann i wsp. (1995) |
| uni515 | 5'-ACCGCGGCTGCTGGCAC-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Lane (1991) |
| uni785 | 5'-GGMTTAGATACCCTGGTAFTCC-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Amann i wsp. (1995) |
| uni1088 | 5'-CGRRAAGTCCCGCAACGAGC-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Amann i wsp. (1995) |
| uni1392 | 5'-GTACACACCGCCCGTCA-3' | Konserwatywna 16S rDNA | Lane (1991) |
a - odpowiada konserwatywnemu regionowi większości znanych bakteryjnych sekwencji 16S rDNA
Trzydzieści pięć cykli wykonane w następujących warunkach: temperatura 96°C przez 10 sekund, 50°C przez 30 sekund, 60°C przez 4 minuty. Sekwencjonowanie nukleotydów obydwu nici z klonowanego DNA prowadzono metodą zakań czania dideoksy-ł a ń cucha (Sanger i wsp., 1977) z „wędrowaniem primerem” (primer walking) w zestawie BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, wykonując analizy w analizatorze ABI PRISM ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Analizę sekwencji DNA, przyrównywanie sekwencji i poszukiwanie sekwencji w bazie danych prowadzono wykorzystując oprogramowanie zawarte w pakiecie Sequence Analysis Software Package (wersja 10.0) uzyskane w ramiach licencji z Genetic Computer Group z Uniwersytetu Wisconsin, Madison, WI, USA).
Do porównywania sekwencji z sekwencjami występującymi w bazie danych GenEMBL użyto algorytm Pearsona i Lipmana (1988) ((TastA and TfastA).
Różnicowanie Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus w łańcuchowej reakcji polimerazy
Amplifikację 16S rDNA przeprowadzono w sposób opisany przez Warda i Timminsa (1999) z pewnymi modyfikacjami. Amplifikowano fragment 16S rDNA o dł ugoś ci 290 par zasad, stosując primery swoiste dla gatunku (casei, para, rham) w połączeniu z primerem Y2 odpowiadającym regionowi konserwatywnemu, 16S rDNA (tabela 2). Każda m.ieszanina reakcyjna w objętości 50 μΐ zawierała 2,5 jednostki Taq polimerazy, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, po 1 mM zestawia dNTP, po 1 μM każdego primera i jedną kolonię odpowiedniego szczepu. Polimerazę Tag, bufory i zestaw dNTP do reakcji PCR uzyskano z Amersham Pharmacia Biotech (Upsala, Szwecja). Oligonukleotydy zsyntetyzowano w firmie Microsynth (Balgach, Szwajcaria). Ustawiono program, temperatury według Young'a i wsp. (1991): 300 s w 93°C 35 cykli po (45 s w 93°C, 45 s w 62°C i 120 s w 72°C), następnie 300 s w 72°C i końcowe schłodzenie do 4°C. Produkty amplifikacji rozdzielano w 2% żelu agarozowym.
Badanie aktywności przeciw-drobnoustrojowej na płytkach agarowych
Przygotowano płytki agarowe z dodatkiem Propionibacterium jensenii SM11 lub przeciwdrobnoustrojowego Lactobacillus albo obydwu bakterii. Kultury uprzednio hodowano oddzielnie przez 72 godziny w temperaturze 32°C we wzbogaconym filtracie z serwatki (SWP1), wirowano, przemyto raz i zawieszono (1:1) w 0,85% NaCl po czym sporządzono rozcieńczenia seryjne w buforze do rozcieńczania (0,85% NaCl, 0,1% peptonu). Przygotowano porcje po 20 ml agaru z dodatkiem 10% każdego rozcieńczenia, uzyskując końcowy poziom 105, 106, 107 i 108 cfu/ml. Agar rozlano na płytki i po zestaleniu płytki szczepiono punktowo porcjami po około 2-5 μl hodowli bulionowych szczepów indykatorowych. Do drożdży i pleśni użyto agar YM a do bakterii użyto agar BHI. Po trzy jednakowe płytki agarowe utrzymywano w temperaturze 6°C, 12°C i 25°C w czasie do 4 tygodni, kontrolując wzrost organizmów indykatorowych raz na tydzień na płytkach utrzymywanych w temperaturze 6°C albo codziennie na płytkach utrzymywanych w 12°C i 25°C. Jako kontrolę nastawiono płytki agarowe bez dodatku pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium oraz płytki agarowe z dodatkiem 1 g/litr Ka-Sorbatu (EU-Richtlinie, nr. 95/2/EG).
Badanie aktywności przeciw grzybom na modelu żywnościowym
Ustawiono model żywnościowy na porcjach po 50 g tyndalizowanego, odtłuszczonego mleka (Difco, Detroit, MI, USA) poddanego fermentacji z użyciem handlowej kultury jogurtowej. Badane próbki dodatkowo szczepiono kulturą ochronną (1% 100-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 1% 100-krotnie zatężonej kultury przeciwgrzybowego Lactobacillus), otrzymując poziom 108 komórek/g każdej bakterii. Kultury uprzednio dwukrotnie przemyto i zawieszono w tyndalizoPL 206 763 B1 wanym odtłuszczonym mleku. Dla uzyskania porównywalnych wyników, próbkę kontrolną mieszano z 2% tyndalizowanego, odtł uszczonego mleka. Prowadzono fermentację przez około 5 godzin w temperaturze 42°C do czasu osiągnięcia pH 4,6. Wszystkie próbki zakażano szczepem Candida pulcherrima 1-50/13 dodanym w ilości odpowiadającej końcowemu poziomowi 102 cfu/g. Dodatkowo ustawiono próbkę kontrolną bez skażenia drożdżami. Próbki utrzymywano w temperaturze 6°C przez 7 tygodni, zliczając ilość ochronnych pałeczek Propionibacterium, pałeczek mlekowych i drożdży co tydzień. Jednocześnie, co tydzień oznaczano wartość pH.
Hamowanie wzrostu grzybów w jogurcie przez kultury ochronne
Ilości po 200 g mleka z dodatkiem 5% śmietanki (35% tłuszczu, 2,5% białka), 2% odtłuszczonego mleka w proszku i 5% cukru utrzymywano w temperaturze 90°C przez 10 minut i następnie prowadzono fermentację handlową kulturą jogurtową. Badane próbki dodatkowo zaszczepiano kulturą ochronną (0,1% albo 1% 100-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 0,1% albo 1% 100-krotnie zatężonej kultury przeciw-grzybowego szczepu Lactobacillus) uzyskując poziom każdej bakterii 107 albo 108 cfu/g. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto i zawieszono w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku. Prowadzono fermentację przez około 5 godzin w temperaturze 42°C do czasu osiągnięcia pH 4,6. Jogurt skażono mieszaniną Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 3-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 do końcowego poziomu 102 cfu/g. Dodatkowo przygotowano próbkę kontrolną bez skażenia drożdżami. Jogurt utrzymywano w temperaturze 6° C przez 4 tygodnie, ilość droż d ż y oznaczano raz w tygodniu. Jednocześ nie, co tydzień oznaczano wartość pH. W dniu 1 i po 3 tygodniach przechowywania oznaczano ilość ochronnych pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych oraz po 3 tygodniach oznaczano mleczany i octany enzymatycznie (Boehringer Mannheim, Niemcy; zestaw uż ywany do oznaczania kwasu D/L-mlekowego: E1 112 321 / zestaw użyty do oznaczania kwasu octowego: E0 143 261).
Powiększenie skali w zastosowaniu kultury ochronnej w jogurcie
Próby powiększenia skali badań jogurtu zawierającego kultury ochronne przeprowadzono w sposób opisany powyż ej. Hamowanie rozwoju dro ż d ż y na powierzchni sera przez kultury ochronne
Przygotowano jednakowe sześciany (2,5 x 4,8 x 8 cm) po 100 g twardego sera (Gruyere). W celu uniknięcia skażenia mikroorganizmami powierzchni sera, uprzednio ścięto z sera skórkę o grubości 3-5 mm. Jedną partię sera namoczono z każdej strony sześcianu w kulturze zabezpieczającej (5 ml 20-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 5 ml 20-krotnie zatężonej kultury przeciw-grzybowego szczepu Lactobacillus, uzyskując poziom każdej z tych bakterii na powierzchni sera równy 108 cfu/g powierzchni sera. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto i zawieszono w 0,85% roztworze NaCl. Przygotowano dwie inne partie sera z 10-krotnym i 100-krotnym rozcieńczeniem kultur ochronnych. Na powierzchnię sześcianów we wszystkich trzech partiach naniesiono po około 3 ml odpowiednich zatężonych kultur. Następnie sery skażono ilościami po 1 ml (104 cfu/ml) mieszaniny Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 3-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 do końcowego poziomu 102 cfu/g powierzchni sera. Powierzchnię sera zdefiniowano jako warstwę o grubości około 3 mm od zewnątrz sześcianu. Przygotowano próbkę kontrolną bez dodatku drożdży. Sery szczelnie pakowano w sterylne worki plastikowe i przechowywano przez 3 tygodnie w temperaturze 6°C. W pierwszymi dniu i po 3 tygodniach przechowywania oznaczano poziom ochronnych pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych oraz ilość drożdży. Hamowanie wzrostu Listeria przez kulturę ochronną na modelu żywności.
W celu przetestowania aktywności przeciw-bakteryjnej kultury ochronnej przeciw Listeria ustawiono dwa modele na żywności.
(1) Hamowanie Listeria innocua L17 i Listeria monocytogenes
M1 przez kulturę ochronną w śmietanie
Ilość 200 g pasteryzowanej półtłustej śmietanki (25% tłuszczu, 2,5% białka) zaszczepiono odpowiednio bakterią Listeria innocua L17 lub Listeria monocytogenes M1 do końcowego poziomu 103 cfu/g i podzielono na dwie porcje po 100 g w sterylnych kolbach. Jedną próbkę zaszczepiono kulturą ochronną (5% 20-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 5% 20-krotnie zatężonej kultury Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20), uzyskując poziom każdej bakterii 108 cfu/g. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto i zawieszono w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku. Dla uzyskania porównywalnych stężeń, do próbki kontrolnej dodano 10% tyndalizowanego odtłuszczonego mleka. Wszystkie próbki utrzymywano w temperaturze 6°C przez 4 tygodnie. Wartość pH i wzrost Listeria kontrolowano raz na tydzień a poziom kultury ochronnej oznaczano po 1 dniu i po 4 tygodniach. Przygotowano drugą partię w powyższy sposób i utrzymywano ją w temperaturze
PL 206 763 B1
25°C przez 3 tygodnie. W tej partii podobnie, oznaczano ilość kultur ochronnych i Listeria na początku i pod koniec okresu przechowywania.
(2) Hamowanie Listeria innocua L17 przez kultury ochronne w siekanym mięsie
Porcje po 100 g siekanego mięsa mieszano z kulturą ochronną (5% 20-krotnie zatężonej kultury Propionibacterium jensenii SM11 i 5% 20-krotnie zatężonej kultury przeciwdrobnoustrojowego szczepu Lactobacillus), uzyskując poziom, każdej bakterii 108 cfu/g. Kultury ochronne uprzednio dwa razy przemyto i zawieszono w 0,85% roztworze NaCl. Mięso skażono bakterią Listeria innocua L17 do końcowego poziomu 103 cfu/g i następnie utrzymywano w temperaturze 6°C przez 8 tygodni. Dodatkowo przygotowano próbkę kontrolną nie zawierającą kultury ochronnej. Dla uzyskania porównywalnych stężeń, do tej próbki dodano 10% 0,85% NaCl. Ilość ochronnych pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych oraz Listeria innocua L17 oznaczano raz na tydzień, wartość pH oznaczano na końcu okresu przechowywania.
Wyniki
Aktywność Lactobacillus sp. przeciw grzybom
Przeprowadzono wstępne przesiewowe badania na aktywność przeciw drobnoustrojom na agarze MRS 1424 izolatów pochodzących z surowego mleka, sera, jogurtu, czarnych oliwek, zakwasu, salami oraz kukurydzy i paszy kiszonej. Ogółem 82 szczepy wykazały aktywność w próbie punktowej na agarze przeciw grzybom wymienionym, w tabeli 1. Te izolaty charakteryzowano następnie poprzez barwienie metodą Grama, na aktywność katalazy, mikroskopowo i pod względem tworzenia zarodników. Jak przedstawiono na fig. 1, gatunki należące do grupy Lactobacillus casei wykazały głównie aktywność przeciw grzybom z udziałem 24%. Po wstępnej identyfikacji metodą API 50 CHL sklasyfikowano te izolaty jako Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei i Lactobacillus rhamnosus. Poza tym, wysoką aktywność hamowania testowanych grzybów wykazały gatunki Lactobacillus plantarum. Ogółem 6% przeciw-grzybowych izolatów okazało się być ziarniakami a 18% pozostało nie zidentyfikowanych przy użyciu prób fermentacji.
Identyfikacja i charakteryzacja trzech pałeczek mlekowych o wysokiej aktywności przeciw grzybom
Trzy izolaty o wysokiej aktywności przeciw grzybom identyfikowano dalej stosując analizę sekwencji 16S rDNA. Na podstawie badania metabolizmu węglowodanów zidentyfikowano je poprzednio jako Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (SM20 i SM29) oraz Lactobacillus curvatus (SM63). Analiza sekwencji 16S rDNA tych szczepów ujawniła gatunek Lactobacillus paracasei subsp. paracasei dla szczepu SM20 ze 100 procentową identycznością w 1519 nukleotydach nakładających się na częściową sekwencję 16S rDMA Lactobacillus paracasei JCM8130 (D79212) i na częściową sekwencję 16S rDNA Lactobacillus casei D36517). W szczepie SM20 zidentyfikowano ogółem 1520 nukleotydów z 16S rDNA. 1528 nukleotydów sekwencjonowanych ze szczepu SM29 wykazało 99,9 procentową identyczność w 1520 nukleotydach nakładających się na częściową sekwencję 16S rRNA genu Lactobacillus casei (D86517) i na częściową sekwencję 16S rDNA Lactobacillus paracasei JCM8130 (D79212). Nieoczekiwanie, 1515 nukleotydów zidentyfikowanych w genie 16S rRNA szczepu 3M63 wykazało również 99,9 procentową identyczność z 1493 nukleotydami pokrywającymi się z 16S rRNA genu Lactobacillus casei (D86517) i z częściową sekwencją 16S rDNA Lactobacillus paracasei JCM3130 (D79212).
Ponieważ przedstawiciele grupy casei stanowią bardzo homologiczną grupę pod względem kryteriów fenotypowych i danych dotyczących sekwencji genu 16S rRNA, Ward i Timmins (1999) opracowali proste podejście łańcuchowej reakcji polimerazy w celu zróżnicowania gatunków Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus w oparciu o reklasyfikację dokonaną przez Collinsa i wsp. (1939). Na fig. 2 jest przedstawiony specyficzny produkt o długości 290 bp dla szczepów SM20, SM29 i 3M63 zamplifikowany w łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem primera specyficznego dla Lactobacillus paracasei w połączeniu z primerem Y2. Oba te primery osiągają gen 16S rRMA. Szczepy typowe Laotobacilius casei (DSM 20011T) i Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (DSM 5622T) również wykazały pasmo o długości 290 bp z odpowiednimi primerami. Nieoczekiwanie, Lactobacillus rhamnosus (DSM 20021T) nie dawał specyficznego pasma po reakcji PCR z użyciem Y2 i rham. Poza tym, nie zaobserwowano żadnych produktów jeśli tę parę primerów Y2/rham użyto ze szczepami poddawanymi identyfikacji. Tak więc, izolaty SM20, SM29 i SM63 zidentyfikowano jako Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. W tabeli 3 podano podsumowanie identyfikacji tych trzech izolatów oraz ich charakterystykę.
PL 206 763 B1
1—i cn po <0
CO
C\]
CO
O
CN
S cn
Ό a
φ
N υ
N
CZ) (Ό
Ί”Ί υ
N >.
M
CU
P
P
Π3
Ci
P υ
•H jr^= υ
P
H
P >,
P
U o
T3
HI
PO —i CU P 05 H
| Identyfikacja | £X O cl | Lactobacillus paracasei subsp paracasei | |||
| Sekwencjo- . c ' nowanie ; | _ ... —Ί Lactobacillus | paracasei I | SUbSD. | paracasei1 i | Lactobacillus casei |
| API50CHL | -1 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei | ||||
| Aktywność katalazy | Negatywna | ||||
| Aktywność proteolitycz na | Negatywna | ||||
| Tolerancja NaCl | 10% 9 | ||||
| Warunki wzrostu | 15-45°C (opt. 3237°C) | ||||
| Produkty fermenta ..b Cjl | D,L- mleczan | ||||
| Kwasy wytwarzane ϊ . | Rybozy, galaktozy, D- glukozy, D-fruktozy, D- mannozy, mannitolu, sorbitolu, N-acetylo- glukozaminy, amigdaliny, arbutyny, eskuliny, salicyny, cellobiozy, maltozy, laktozy, sacharozy, trahalozy, inuliny, melezytozy, β- gentiobiozy, D-turanozy, D- tagatozy | ||||
| ; Zarodniki | Brak | ||||
| Badanie mikroskopowe | Krótkie pałeczki w łańcuchach, Gram- dodatniee | ||||
| Źródło | Surowe mleko | ||||
| Szczep | O CM S GO |
PL 206 763 B1
- oznaczono metodą API 50 CHL
- oznaczono enzymatycznie (Boehringer Mannheim, Niemcy; zestaw użyty do oznaczania kwasu D/L-mlekowego: E1 112 821 / zestaw uż yty do oznaczania kwasu octowego: E0 148 261)
- analiza sekwencji 16S rDNA
PL 206 763 B1 d - podejście w reakcji PCR zmodyfikowane według Warda i Timminsa (1999) e - dł ugie pał eczki w ł a ń cuchach w kulturach z bioreaktora f - Miescher (1999) g - dobry wzrost przy zawartości soli 5% i dość wzrost przy 10% NaCl h - dobry wzrost przy zawartości 5% NaCl i bardzo słaby wzrost przy 10% NaCl i - dobry wzrost przy zawartości soli 5% i słaby wzrost przy 10% NaCl k - dość dobry wzrost przy zawartości soli 5% i bardzo słaby wzrost przy 10% NaCl l - podkreślone gatunki wskazują na końcową identyfikację odpowiedniego szczepu
Collins i wsp. (1939) opisali inny podgatunek Lactobacillus paracasei, a mianowicie, Lactobacillus paracasei, subsp. tolerans. Biorąc pod uwagę produkcję kwasu obserwowaną przez Collinsa i wsp. (1989), izolaty SM20, SM29 i SM63 należą do podgatunku paracasei.
Wydzielanie substancji hamujących do pożywki bulionowej
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei
SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63, Lactobacillus plantarum SM17 i Lactobacillus plantarum SM39 badano na zdolność wydzielania substancji hamujących do pożywki bulionowej. Tak więc, wzrost szczepów prowadzono albo w bulionie MRS albo w pożywce SWP1. Nie wykryto aktywności antagonistycznej w wolnych od komórek supernatantach w teście dyfuzyjnym w studzienkach. Nawet po etapie zatężania przez ultrafiltrację (odcięcie masy cząsteczkowej 3000 Da) nie wykazało żadnej wykrywalnej aktywności (nie podano danych).
Aktywność przeciw grzybom na płytkach agarowych
Ogółem 18 bakterii pałeczek kwasu mlekowego testowano na aktywność przeciw grzybom, pojedynczo albo w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11 o wysokiej aktywności przeciw grzybom. Po etapie odwirowania i przemycia, szczepy wprowadzano w stężeniach od 105 do 108 cfu/ml na płytki z agarem YM, do którego nanoszono punktowo grzyby wymienione w tabeli 1 w odpowiednich stężeniach od 105 do 107 cfu/ml. Płytki przechowywano w różnych partiach w temperaturze 6°C, 12°C i 25°C. Wzrost drożdży kontrolowano odpowiednio raz na tydzień albo codziennie. Chociaż pałeczki mlekowe a także szczep Propionibacterium mają słabą aktywność hamowania jeśli stosuje się je pojedynczo: (nie podano danych) to ich kombinacja wykazuje wysokie wartości aktywności antagonistycznej w temperaturze 6°C. Najwyższe aktywności wykryto dla następujących pałeczek mlekowych w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63. Słabą aktywność obserwowano przy połączeniu Lactobacillus plantarum SM17 i Lactobacillus plantarum SM39 ze szczepem SM22. Do uzyskania wysokiej aktywności hamującej była potrzebna ilość komórek 108 cfu/ml szczepu Lactobacillus i 108 cfu/ml szczepu Propionibacterium. W tabeli 4 podano pięć przykładów aktywności przeciw grzybom, obserwowanej w temperaturze 6°C dla stężenia 108 cfu/ml (107 cfu/ml dla Lactobacillus plantarum SM17) przeciw drożdżom, zaszczepionym punktowo z gęstością 106 cfu/ml i przeciw zaszczepionym punktowo 3-dniowym kulturom pleś ni.
T a b e l a 4. Aktywność przeciw grzybom wybranych kultur ochronnych wprowadzonych na płytki agarowe, po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C albo przez 7 dni w temperaturze 12°C
| Organizmy indykatorowea | Kultury ochronneb | Kontrola (pH 5,88) | Kasorbat (1 g/litr)d | ||||
| SM20/ /SM11 (pH 3,83)c | SM29/ /SM11 (pH 3,98) | SM63/ /SM11 (pH 3,93) | SM17/ /SM11 (pH 4,53) | SM38/ /SM11 (pH 4,59) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Przechowywanie w 6°C przez 21 dni Candidda magnoliae 1-35/1 Candida parapsilosis 4-5/1 Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 Candida silvicola 4-42/1 | + (+/-) | +/- (+/-) | + (+/-) | ++ ++ | ++ ++ | ++ (+/-) ++ | ++ ++ |
PL 206 763 B1 cd. tabeli 4
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Candida valida 1-48/8 Candida pulcherrima 1-50/13 Candida reukaufii 4-73/4 Candida sp. 1- 50/15 Sporobolomyces salmonicolor 3-46/2 Candida krusei 3-69/2 Penicillium sp. 2- 21/7 Penicillium sp. 2-21/12 Penicillium sp. 2- 52/2 Penicillium sp. 3- 58/3 Przechowywanie w 12°C przez 7 dni Candidda magnoliae 1-35/1 Candida parapsilosis 4-5/1 Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 Candida silvicola 4-42/1 Candida valida 1-48/8 Candida pulcherrima 1-50/13 Candida reukaufii 4-73/4 Candida sp. 1-50/15 Sporobolomyces salmonicolor 3-46/2 Candida krusei 3-69/2 | (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) + | (+/-) (+/-) + (+/-) (+/-) (+/-) + ++ + ++ ++ | (+/-) (+/-) (+/-) + (+/-) (+/-) + + ++ ++ | ++ ++ ++ ++ (+/-) n.d. n.d. n.d. n.d. + +/- (+/-) (+/-) ++ ++ ++ ++ + ++ | ++ ++ ++ ++ (+/-) n.d. n.d. n.d. n.d. + +/- (+/-) + ++ ++ ++ +/- ++ | + ++ ++ ++ ++ (+/-) ++ ++ ++ ++ ++ ++ +/- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ | ++ ++ ++ n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. |
SM20 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 (108 cfu/ml) SM29 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 (108 cfu/ml) SM63 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 (108 cfu/ml)
PL 206 763 B1
SM17
SM39
SM11
n.d.
a b
c d
++ +
+/(+/-)
Lactobacillus plantarum SM17 (107 cfu/ml)
Lactobacillus plantarum SM39 (107 cfu/ml)
Propionibacterium jensenii SM11 (108 cfu/ml) nie oznaczano zaszczepienie punktowe iloś cią 106 cfu/ml wprowadzone na pł ytki agarowe pH oznaczane na płytkach agarowych po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C stężenie według EU-Richtlinie, nr 95/2/EG silna kolonia (~ 0% hamowania) normalna kolonia (~ 25% hamowania) sł aba kolonia (~ 50% hamowania) bardzo słaba kolonia (~ 75% hamowania) brak kolonii (~ 100% hamowania)
Jest interesujące, że jeśli użyto Ka-Sorbat to obserwowano słabszą aktywność hamującą w temperaturze 6°C niż dla kultur przeciwdrobnoustrojowych użytych w niniejszym badaniu (szczepy SM20, SM29 albo SM63 w kombinacji ze szczepem SM11). W tabeli 4 przedstawiono ponadto, że po przechowywaniu przez 7 dni w temperaturze 12°C obserwowano wyraźną aktywność hamującą szczepów Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 i SM63 a słabą aktywność szczepów Lactobacillus plantarum SM17 i SM39 w połączeniu z Propionibacterium jensenii SM11. W temperaturze 25°C obserwowano jedynie słabe aktywności hamujące, które zanikały po kilku dniach (nie podano szczegółowych danych). Testując aktywności przeciw grzybom dwóch albo trzech pałeczek mlekowych (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 i SM63) w połączeniu z Propionibacterium jensenii SM11, obserwowano wzrost hamowania (tabela 5) w porównaniu do prób, w których użyto jeden szczep Lactobacillus w połączeniu z SM11 (tabela 4). Całkowite hamowanie wzrostu drożdży uzyskano stosując szczepy Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 albo SM63 w połączeniu z Propionibacterium jensenii SM11 i 1 g/litr Ka-sorbatu (tabela 5). Aktywność przeciw-grzybowa tych szczepów bakteryjnych zwiększała się przy dodaniu tego konserwanta żywności.
PL 206 763 B1
-Η
| λ: 3 > 3 CL | |
| (0 3 3 U >, c o N '0 (0 > 0 3 3. 3 u c c o | O |
| 3 | o |
| 3 | 3 |
| u o | (1) |
| 3 | N X |
| 3 | |
| 4-> | 3 |
| .3 | 3 |
| X | |
| .44 | Φ |
| 3 | a, £ |
| U | OJ |
| >Ί | 3 |
| c 3 | s |
| 3 3 | •H |
| 3 | |
| 3 | |
| £ | t—1 |
| o | CM |
| 3 | N |
| N | Φ |
| 3 | N |
| CD | |
| •H | CU 3 |
| υ | * r~1 |
| Φ | 3 |
| N | 3 |
| 3 | S |
| CL | >1 |
| O | 3 O |
| 'W | 3 |
| o | U |
| 3 | OJ |
| 4 | N |
| >, | 3 |
| 4-) | CL |
| 44 | O |
| LJ) | CL |
| 3 | 0) 3 |
| 3 | O |
| lU | 3 |
| X) | 3 |
| 3 | CP |
| E-i | 3 |
n.d.
a b
c d
| Kontrola (pH 6,04) i l_ | + . . + -i. + + 4. <. , | |
| Kultury ochronne13 | SM63/SM11 Ka-sorbat (pH 4,75) | l t - 1 1 t 1 1 1 1 1 |
| SM29/SM11 Ka-sorbat (pH 4,80) | 1 1 1 1 1 1 1 1 > « | |
| -> ra £2 ω -S ° £ X 2 a -S ω x | 1 1 1 1 ł 1 1 < 1 1 | |
| SM20/SM29/ SM63/ SM11 (pH 4,10) | 1 1 1 · 1 1 1 1 · | |
| CO Sg To 2 >- co 55 5 a s ω | + ‘ 1 1 i. i. 1 i 1 1 | |
| SM20/SM63/ SM11 (PH 4,32) | 1 | |
| O 5 _ D- ω - 3 2 * S ω i 2 S ω | Φ· 1 ( 1 1 1 1 1 1 1 | |
| Organizmy indykatorowe a | Candida magnoliae 1-35/1 Candida parapsilosis 4-5/1 Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 Candida silvicola 4-42/1 Candida valida 1-48/8 Candida pulcherrima 1-50/13 Candida reukaufii 4-73/4 Candida sp. 1-50/15 Sporobolomyces salmonicolor 3- 46/2 Candida krusei 3-69/2 |
| 1—i £ | 1—! £ | rH £ |
| 3 | 3 | 3 |
| 44 | 44 | 3 |
| u | U | G |
| 03 | 00 | CD |
| 0 | O | O |
| i—l | t—1 | 1—1 |
| —' | ||
| 0 | σ | m |
| CM | t\l | 3 |
| 2 | 2 | 2 |
| ω | ω | Ul |
| •H | •H | Ή |
| Φ | Φ | Φ |
| OT | OT | cn |
| 3 | 3 | 3 |
| U | G | G |
| 3 | 3 | 3 |
| 3 | 3 | 3 |
| 3 | 3 | 3 |
| CL | CL | CL |
| CL | CL | CL |
| tn | cn | W |
| 3 | 3 | 3 |
| 3 | 3 | 3 |
| tn | tn | OT |
| H | •H | •H |
| Φ | Φ | Φ |
| tn | cn | tn |
| 3 | 3 | 3 |
| u | u | G |
| 3 | 3 | 3 |
| 3 | 3 | 3 |
| 3 | 3 | 3 |
| CL | CL | CL |
| tn | cn | cn |
| 3 | 3 | 3 |
| >—i | 1—1 | 1—1 |
| (—1 | 1—1 | 1—1 |
| Ή | -3 | Ή |
| u | G | G |
| 3 | 3 | 3 |
| 3 | 3 | 3 |
| O | 0 | O |
| 44 | 4-1 | 3 |
| u | G | G |
| 3 | 3 | 3 |
| 31 | 3 | 3 |
| 0 | σι | η |
| CN | CM | 3 |
| 2 | 2 | 2 |
| ω | ω | ω |
SMll - Propionibacterium jensenii SM11 (10 cfu/ml)
- nie oznaczano
- zaszczepienie punktowe iloś cią 106 cfu/ml
- wprowadzone na pł ytki agarowe
- pH oznaczane na płytkach agarowych po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C
- 1 g/litr, stężenie wedł ug EU-Richtlinie, nr 95/2/EG
PL 206 763 B1 ++ - silna kolonia (~ 0% hamowania) + - normalna kolonia (~ 25% hamowania) +/- - słaba kolonia (~ 50% hamowania) (+/-) - bardzo słaba kolonia (~ 75% hamowania)
- - brak kolonii (~ 100% hamowania)
Aktywność przeciwbakteryjna kultur ochronnych w próbie na płytkach agarowych Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, SM29 i SM63 testowano dalej na zdolność hamowania bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, pojedynczo i w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11. Po etapie odwirowania i przemycia, szczepy wprowadzano w stężeniu 108 cfu/ml na płytki z agarem BHI, na których rosły przez dobę naniesione punktowo kultury odpowiednich bakterii. Jedną partię płytek utrzymywano w temperaturze 6°C i wzrost bakterii kontrolowano raz na tydzień a drugą partię inkubowano w temperaturze 25°C i hamowanie wzrostu obserwowano codziennie. W tym doświadczeniu również, pałeczki mlekowe oraz szczep Propionibacterium miały słabą aktywność hamującą użyte osobno (nie podano danych) ale ich połączenie odznaczało się wysokimi wartościami aktywności antagonistycznej (tabela 6).
T a b e l a 6. Aktywność przeciwbakteryjna wybranych kultur ochronnych wprowadzonych na płytki agarowe, po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C i 25°C.
| Organizmy indykatorowea | Kultury ochronneb | Kontrola (pH 6,70) | ||
| SM20/ /SM11 (pH 5,45)c | SM29/ /SM11 (pH 5,48) | SM63/ /SM11 (pH 5,40) | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Przechowywanie w 6°C/21 dni Listeria innocua L17 | ++ | |||
| Staphylococcus aureus VF4 | - | - | - | (+/-) |
| Escherichia coli B | - | - | - | (+/-) |
| Escherichia coli SG63 | - | - | - | +/- |
| Serratia liquefaciens SG64 | - | (+/-) | + | ++ |
| Citrobacter freundii SG84 | (+/-) | (+/-) | (+/-) | ++ |
| Klebsiella pneumoniae SG89 | (+/-) | (+/-) | +/- | ++ |
| Enterobacter cloacae SG95 | (+/-) | (+/-) | (+/-) | + |
| Enterococcus faecalis DS5 | - | - | - | + |
| Bacillus subtilis 168 | - | - | - | - |
| Bacillus cereus DMS 31T | - | - | - | - |
| Salmonella typhimurium ATCC 14058 | - | - | - | ++ |
| Listeria monocytogenes M1 | - | - | - | ++ |
| Przechowywanie w 25°C/21 dni Listeria innocua L17 | ++ | |||
| Staphylococcus aureus VF4 | - | +/- | +/- | ++ |
| Escherichia coli B | + | (+/-) | (+/-) | ++ |
| Escherichia coli SG63 | +/- | - | - | ++ |
| Serratia liquefaciens SG64 | +/- | + | +/- | ++ |
| Citrobacter freundii SG84 | (+/-) | +/- | (+/-) | ++ |
| Klebsiella pneumoniae SG89 | (+/-) | +/- | + | ++ |
| Enterobacter cloacae SG95 | (+/-) | + | + | ++ |
| Enterococcus faecalis DS5 | (+/-) | (+/-) | (+/-) | ++ |
PL 206 763 B1 cd. tabeli 6
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Bacillus subtilis 168 | - | - | - | ++ |
| Bacillus cereus DMS 31T | - | (+/-) | (+/-) | ++ |
| Salmonella typhimurium ATCC 14058 | - | - | - | ++ |
| Listeria monocytogenes M1 | - | - | - | ++ |
SM20
SM29
SM63
SM11 a
b c
++ +
+ /(+/-)
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 (108 cfu/ml)
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 (108 cfu/ml)
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 (108 cfu/ml)
Propionibacterium jensenii SM11 (108 cfu/ml) zaszczepienie punktowe, kultura dobowa wprowadzone na pł ytki agarowe pH oznaczane na płytkach agarowych po przechowywaniu przez 21 dni w temperaturze 6°C silna kolonia (~0% hamowania) normalna kolonia (~ 25% hamowania) sł aba kolonia (~ 50% hamowania) bardzo sł aba kolonia (~ 75% hamowania) brak kolonii (~ 100% hamowania)
Aktywność przeciw grzybom przechowywanych kultur ochronnych
W celu określenia możliwości przechowywania kultur ochronnych, przechowywano je oddzielnie w 100-krotnym stężeniu (zawieszone w tyndalizowanym odtłuszczonym mleku) w temperaturze -80°C przez 15 tygodni. Następnie, szczepy te wprowadzano w stężeniu 108 cfu/ml na płytki z agarem YM, na którym uprzednio zaszczepiono punktowo drożdże wymienione w tabeli 1 w ilości od 104 do 107 cfu/ml. Płytki inkubowano w temperaturze 6°C obserwując raz w tygodniu wzrost drożdży. Jako kontrolę przygotowano płytkę agarową z dodatkiem odpowiedniej ilości odtłuszczonego mleka. Jak przedstawiono sumarycznie w tabeli 7, kultury ochronne Propionibacterium jensenii SM11 i szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (SM20, SM29 i SM63) po przechowywaniu przez 15 tygodni w temperaturze -80°C w dalszym ciągu wykazują aktywność przeciw grzybom.
T a b e l a 7. Aktywność przeciw grzybom wybranych kultur ochronnych po ich przechowywaniu przez 15 tygodni w temperaturze -30°C, wprowadzonych na płytki agarowa
| Organizmy indykatorowea | Kultury ochronneb | Kontrola | ||
| SM20/ /SM11 | SM29/ /SM11 | SM63/ /SM11 | ||
| Candida magnoliae 1-35/1 | +/- | +/- | +/- | ++ |
| Candida parapsilosis 4-5/1 | - | - | - | (+/-) |
| Zygosaccharomyces bailli 1-48/1 | - | - | - | - |
| Candida silvicola 4-42/1 | - | - | - | ++ |
| Candida valida 1-48/8 | + | + | + | + |
| Candida pulcherrima 1-50/13 | +/- | +/- | + | ++ |
| Candida reukaufii 4-73/4 | - | - | - | ++ |
| Candida sp. 1-50/15 | + | + | + | + |
| Sporobolomyces salmonicolor 3-46/2 | - | - | - | +/- |
| Candida krusei 3-69/2 | - | - | - | - |
SM20 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 (108 cfu/ml) SM29 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 (108 cfu/ml) SM63 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 (108 cfu/ml) SM11 - Propionibacterium jensenii SM11 (108 cfu/ml) n.d. - nie oznaczano a - zaszczepienie punktowe iloś cią 106 cfu/ml b - wprowadzone na pł ytki agarowe ++ - silna kolonia (~ 0% hamowania) + - normalna kolonia (~ 25% hamowania)
PL 206 763 B1 +/- - słaba kolonia (~ 50% hamowania) (+/-) - bardzo słaba kolonia (~ 75% hamowania)
- - brak kolonii (~100% hamowania)
Aktywność przeciw grzybom kultur ochronnych na modelu żywnościowym.
W badaniu wstępnym ustawiono model żywieniowy z różnymi kulturami ochronnymi. Szczepy posiadające aktywność hamującą dodano do tyndalizowanego, odtłuszczonego mleka w początkowej ilości 108 cfu/g. Były to: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63, Lactobacillus plantarum SM17 i Lactobacillus plantarum SM39 w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11. Dodatkowo próbki zaszczepiano Candida pulcherrima 1-50/13 w ilości 102 cfu/g i następnie przechowywano w temperaturze 6°C. Jak to jest widoczne na fig. 3, poziomy drożdży ciągle wzrastały do poziomu 107 - 108 cfu/g w próbkach zawierających szczepy Lactobacillus plantarum SM17 i SM39 i w próbce kontrolnej, w której wartości te były najwyższe. Próbki zawierające Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (SM20, SM29 albo SM63) wykazywały znaczące różnice. W tych próbkach, Candida pulcherrima 1-50/13 wzrastała do poziomu 104 cfu/g i następnie poziom ten był prawie stały przez 7 tygodni. Po 4 tygodniach, w próbkach zawierających Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 obserwowano zwiększenie ilości drożdży. Podczas przechowywania poziom pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych ani nie wzrastał ani nie spadał. Wartości pH próbek zawierających kultury ochronne nie wykazywały znaczących różnic w stosunku do próbki kontrolnej (nie przytoczono danych).
Aktywność przeciw grzybom w jogurcie
Ustawiono dalsze badanie z użyciem, jogurtu i kultur ochronnych zawierających Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, szczepy SM20, SM29 albo SM63 w kombinacji z Propionibacterium jensenii SM11. Użyto mleko wzbogacone w składniki odżywcze, co powinno korzystnie wpływać na wzrost zakażających drożdży. Mleko to fermentowano handlową kulturą jogurtową w obecności kultury ochronnej. Kultury ochronne stosowano w stężeniach odpowiednio 107 cfu/g albo 108 cfu/g. Po przeprowadzeniu fermentacji i schłodzeniu, próbki zaszczepiano mieszaniną Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 4-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1 w ilości 102 cfu/g, po czym przechowywano je w temperaturze 6°C. Jak to jest przedstawione na fig. 4, poziomy drożdży w próbkach z kulturami ochronnymi w stężeniu 107 cfu/g oraz w próbce kontrolnej systematycznie wzrastały. Próbka kontrolna przez cały czas wykazywała najwyższe wartości skażających drożdży. W żadnej próbce zawierającej kultury ochronne w ilości 108 cfu/g nie obserwowano podwyższenia poziomu drożdży. Poziom drożdży utrzymywał się na stałym poziomie przez okres 4 tygodni. To samo zjawisko obserwowano przy stężeniach 1,7 x 108 cfu/g pałeczek mlekowych i 5,5 x 107 cfu/g pałeczek Propionibacterium (tabela 11). We wszystkich próbkach poziom kultury ochronnej ani nie wzrastał ani nie spadał podczas przechowywania. Wartości pH próbek zawierających kultury ochronne nie wykazywały znaczących różnic w stosunku do próbki kontrolnej (nie przytoczono danych). Jak to jest przedstawione w tabeli 8, w próbkach zawierających kultury ochronne oznaczono metodą enzymatyczną 60-70 mg/100 g octanu podczas gdy w próbce kontrolnej nie zawierającej kultury ochronnej ilość ta wynosiła tylko 4,43 mg/100 g.
T a b e l a 8. Enzymatycznie oznaczone stężenia kwasów organicznych metabolizowanych w jogurcie zawierającym kultury ochronne.
| Kultury ochronne | Kwasy organiczne | |||
| Octan (mg/100 g) | D-mleczan (g/100 g) | L-mleczan (g/100 g) | Mleczany ogółem (g/100 g) | |
| SM20/SM11a | 68,84 | 0,01 | 0,61 | 0,62 |
| SM29/SM11b | 60,95 | 0,01 | 0,62 | 0,63 |
| SM63/SM11c | 61,44 | 0,01 | 0,65 | 0,66 |
| Kontrolad | 4,43 | 0,01 | 0,74 | 0,75 |
SM20 - Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20
SM29
SM63
SM11 a
b c
d
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 Propionibacterium jensenii SM11 SM20, 1,7 x 108 cfu/g; SM11, 5,5 x 107 cfu/g SM29, 1,7 x 108 cfu/g; SM11, 2,8 x 108 cfu/g SM63, 1,6 x 108 cfu/g; SM11, 8,1 x 107 cfu/g brak kultury ochronnej
PL 206 763 B1
Kultura ochronna nie wpływała natomiast na zawartość D-mleczanu, L-mleczanu oraz mleczanu całkowitego (tabela 8).
W teście sensorycznym, jogurty z kulturami ochronnymi i próbki kontrolne nie zawierające dodatkowej kultury nie wykazywały jakichkolwiek wyczuwalnych różnic po okresach przechowywania 5 i 15 dni.
Powiększenie skali w zastosowaniu kultury ochronnej w jogurcie
Próby powiększenia skali z użyciem, jogurtu dały podobne wyniki do tych, jakie otrzymano w badaniach prowadzonych na skalę laboratoryjną .
Aktywność przeciw grzybom na powierzchni sera
W tabeli 9 przedstawiono wyniki prób hamowania mieszaniny droż d ż y na powierzchniach sera traktowanych trzema różnymi kulturami ochronnymi użytymi w różnych stężeniach. Wszystkie sery skażono drożdżami do końcowego poziomu na powierzchni wynoszącego 102 cfu/g. Powierzchnię sera definiowano jako warstwę około 3 mm od brzegu sześcianu.
T a b e l a 9. Hamowanie drożdży na powierzchniach sera utrzymywanego w temperaturze 6°C
| Czas (dni) | Drożdże, cfu/ga | |||
| A | B | C | ||
| K1 | 1 | 5,0 x 102 | 3,2 x 102 | 4,1 x 102 |
| 21 | 1,5 x 102 | <102 | <102 | |
| K2 | 1 | 5,5 x 102 | 1,0 x 102 | 4,1 x 102 |
| 21 | 3,5 x 102 | <102 | <102 | |
| K3 | 1 | 2,2 x 103 | 2,7 x 102 | 1,3 x 102 |
| 21 | 1,3 x 104 | <102 | 1,9 x 102 | |
| K4 | 1 21 | 6,3 x 102 8,0 x 103 |
A: zaszczepiono drożdżami i kulturą ochronną SM20/SM11
B: zaszczepiono drożdżami i kulturą ochronną SM29/SM11
C: zaszczepiono drożdżami i kulturą ochronną SM63/SM11
K1: stężenie kultury ochronnej: 107 - 108 cfu/g powierzchni
K2: stężenie kultury ochronnej: 106 - 107 cfu/g powierzchni
K1: stężenie kultury ochronnej: około 106 cfu/g powierzchni
K1: kontrola, zaszczepiono drożdżami, nie dodano kultury ochronnej a - mieszanina Candida pulcherrima 1-50/13, Candida magnoliae 1-35/1, Candida parapsilosis 4-5/1 i Zygosaccharomyces bailii 1-48/1
W stężeniach 108 i 107 cfu/g powierzchni, kultury ochronne zdołały całkowicie hamować rozwój drożdży w czasie 21 dni przechowywania w temperaturze 6°C. Ilość drożdży nawet się obniżała (K1, K2). Poziom 3,0 x 106 cfu/g powierzchni pałeczek mlekowych i 3,0 x 106 cfu/g powierzchni pałeczek Propionibacterium wydaje się być poziomem granicznymi, przy którym osiąga się minimalne hamowanie drożdży. Próbka sera K3A zawierała niższe poziomy kultury ochronnej i z tego powodu nie było hamowania rozwoju skażających drożdży. Poziomy kultur ochronnych na powierzchni serów mieściły się w tym samym zakresie co ilości komórek w roztworach, w których uprzednio moczono sery (nie przytoczono danych).
Hamowanie Listeria przez kultury ochronne na modelu żywnościowym
W tabeli 10 podsumowano hamowanie Listeria przez kultury ochronne w siekanym mię sie i w ś mietance.
T a b e l a 10. Hamowanie Listeria przez kultury ochronne na modelach żywnościowych utrzymywanych w temperaturze 6°C i w temperaturze 25°C
| Układy żywnościowe | Czas (dni) | cfu/g Listeria innocua L17 | |||
| A | B | C | D | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Siekane mięso | 1 | 3,3 x 103 | 2,8 x 103 | 2,6 x 103 | 2,7 x 103 |
| (6°C) | 28 | 6,0 x 102 | 3,7 x 102 | 2,7 x 102 | 4,5 x 102 |
| 42 | 1,7 x 103 | <102 | 1,5 x 102 | <102 | |
| 56 | 5,1 x 103 | 8,2 x 102 | <102 | 1,5 x 102 |
PL 206 763 B1 cd. tabeli 10
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Siekane mięso | 0 | 4,1 x 103 | 4,9 x 103 | 4,0 x 103 | 3,7 x 103 |
| (25°C) | 2 | 4,5 x 104 | 5,5 x 103 | 3,0 x 103 | 7,5 x 103 |
| 5 | 6,8 x 104 | 5,9 x 103 | 3,2 x 103 | 5,5 x 103 | |
| Śmietanka (6°C) | 1 | 2,7 x 103 | 3,2 x 103 | n.d. | n.d. |
| 14 | 1,3 x 103 | 1,2 x 103 | n.d. | n.d. | |
| 21 | 1,1 x 103 | 1,5 x 102 | n.d. | n.d. | |
| 28 | 1,0 x 103 | <102 | n.d. | n.d. | |
| Śmietanka (25°C) | 1 | 2,9 x 102 | 2,6 x 102 | 2,2 x 102 | 3,0 x 102 |
| 21 | 107 - 108 | <102 | <102 | <102 | |
| Cfu/g Listeria monocytogenes M1 | |||||
| A | B | C | D | ||
| Śmietanka (6°C) | 1 | 1,6 x 103 | 1,7 x 103 | n.d. | n.d. |
| 7 | 2,9 x 107 | 1,9 x 103 | n.d. | n.d. | |
| 14 | 3,0 x 108 | 7,5 x 102 | n.d. | n.d. |
A: kontrola, zaszczepiono Listeria, nie dodano kultury ochronnej
B: zaszczepiono Listeria, dodano SM20/SM11 jako kulturę ochronną
C: zaszczepiono Listeria, dodano SM29/3M11 jako kulturę ochronną
D: zaszczepiono Listeria, dodano SM63/3M11 jako kulturę ochronną
n.d. - nie oznaczono
Wybrano dwa modele na żywności reprezentujące żywność o wysokiej zawartości wilgoci, o różnej zawartości tłuszczu i białka, o pH optymalnym dla Listeria. Chociaż Listeria innocua L17 wykazała dobry wzrost po 21 dniach na agarze BHI utrzymywanym w temperaturze 6°C (tabela 6), nie wykryto jej w modelach żywnościowych. Ilość żywych komórek tego organizmu indykatorowego spadała jednakże w obecności kultury ochronnej. Poza tym, próbki te po przechowywaniu przez 56 dni nadal miały przyjemną czerwoną barwę mięsa, podczas gdy próbka kontrolna miała barwę zieloną do brązowej i była wyraźnie zepsuta. Wartość pH próbki kontrolnej po 56 dniach wynosiła 6,20, podczas gdy próbki z kulturami ochronnymi miały pH w zakresie 5,50 do 3,81. Poziom pałeczek Propionibacterium i pałeczek mlekowych pozostał niezmieniony po przechowywaniu w temperaturze 6°C przez okres 56 dni. Drugą partię siekanego mięsa z dodatkiem lub bez dodatku kultur ochronnych przechowywano w temperaturze 25°C. Po 5 dniach przechowywania, wzrost Listeria innocua był hamowany w próbkach z kulturami ochronnymi (od 3,12 do 5,9 x 103 cfu/g) podczas gdy wzrastał a liczba ż ywych komórek tego organizmu indykatorowego do 6,8 x 104 cfu/g w próbce kontrolnej. Poza tym, próbka kontrolna uległa całkowitemu zepsuciu. W śmietance przechowywanej w temperaturze 6°C po 28 dniach obserwowano to samo zjawisko. W próbce kontrolnej, liczba bakterii Listeria innocua L17 utrzymywała się stale w tym samym zakresie jak na początku (103 cfu/g) ale w próbce z kulturą ochronną, liczba żywych komórek tego organizmu indykatorowego spadała do poniżej 102 cfu/g. W okresie przechowywania poziom pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium ani nie wzrastał ani nie spadał. Wartości pH w próbkach z dodatkiem lub bez dodatku kultury ochronnej pozostawały w tym samym zakresie. Po przechowywaniu przez 28 dni w temperaturze 6 ° C, pH ś mietanki spadał o do 4,78 w próbce bez kultury ochronnej i do 4,60 w próbce z kulturą ochronną. W próbkach śmietanki przechowywanych w 25°C, ilość Listeria innocua L17 spadała poniżej 102 cfu/g wobec kultur ochronnych a w próbce kontrolnej wzrastała do ilości komórek 107 - 108 cfu/g. Podobnie, wyraźnie zmieniało się pH w tych próbkach. W próbkach z kulturami ochronnymi, pH zawierało się w zakresie 3,56 do 3,68, podczas gdy w próbce kontrolnej wynosiło przez cały czas 5,80. Po 21 dniach przechowywania w temperaturze 25°C, ilości komórek pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium utrzymywały się ciągle w tym samym zakresie jak na początku. Poziomy kultur ochronnych ani nie wzrastały ani nie spadały. W próbkach zawierających Listeria monocytogenes M1 jako organizm indykatorowy obserwowano wyraźną różnicę w ilości żywych komórek tego patogenu w obecności i w nieobecności kultury ochronnej. Po przechowywaniu przez 14 dni w temperaturze 6°C, próbka bez kultury ochronnej
PL 206 763 B1 8 zawierała 3,0 x 108 cfu/g Listeria monocytogenes M1 a w próbce zawierającej kulturę ochronną ilość komórek tego organizmu indykatorowego spadała do 7,5 x 102 cfu/g (tabela 10). Niezbędne stężenie kultury ochronnej w żywności zapewniające wystarczające działanie przeciw-drobnoustrojowe
Dla osiągnięcia wystarczającego działania przeciw-drobnoustrojowego potrzebny jest pewien poziom pałeczek mlekowych i pałeczek Propionibacterium. W tabelach 11 i 12 są przedstawione różne próby w ramach tego badania i odpowiednie poziomy kultury ochronnej.
φ
Ή c
φ
X '01
Ο!
Μ
X
Ο □
μ φ
υ β
β
JZ υ
>, υ
(tf χ
<0 ε
χ ο
(Ο •Η β
β
Ό β
X χ
υ •Ν
Ό β
| ω μ £τ •Ν £ | |
| ο C | |
| C | σ |
| ο | |
| β | 3 |
| X | Ma |
| ο | υ |
| ο | |
| β | £ |
| β | 0 |
| X | X |
| X | >1 |
| β | Ν |
| χ | β |
| >. £ | cn 3 |
| ο | Ή |
| β | υ |
| Ν | Φ |
| Ο | Ν |
| Cu | Μ |
| ra | α β |
| ΓΗ | Η |
| β | β β |
| ι—i | X |
| ω | β |
| X | •β |
| β | Ν |
| Η | Ό |
| Badanie | ο Ε β σ ο ”5 | PAB | l·. N. O O O V— V* T— XXX in o to T~“ O4~ Χ-* |
| co _1 | r- l·- o O O t— r— t— XXX CO 00 01 co v | ||
| ε □ σ ο η | co < cl | >- 03 ho o o XXX OT CO τ- lO CM co | |
| co _l | ra co do o o o XXX r»._ r-~-_ co_ v- T— T— | ||
| ! Model na żywności | co < CL | ra ra to O O O XXX OT CM t- co 5f | |
| 00 _J | ra ra r- O O O XXX 04 T- t— x— ν- OT | ||
| i Płytki agarowe3 j | CO < CL | oo oo oo O O O | |
| CO _J | » co oo O O O T— X— T“ | ||
| Kultury | SM20/SM11 SM29/SM11 SM63/SM11 |
Ο
OT •Η
Φ η
β α
β β
β cl ά
ω
X β
η
Η
Φ co <0 υ
β
Μ β
CL η
β
X
X
-Η υ
β
Λ
Ο
X υ
β χ
ο
OJ ot
| φ | ||||||||
| •β | ||||||||
| β | ||||||||
| t—I | ||||||||
| β | ||||||||
| Ν | ||||||||
| υ | ||||||||
| Ε | ||||||||
| OT | C0 | β .β | ||||||
| 04 | <χ> | 3 | ||||||
| 2 | 2 | 'ΐη | , | |||||
| OT | Μ | Ο | ||||||
| Ό | ε | |||||||
| •H | •Η | χ*Ί | ||||||
| Φ | Φ | Φ | £ | £ | ||||
| tn | β | •β | μ | |||||
| β | β | β | £ | 0 | ||||
| U | U | >1 | -μ | Μ | ||||
| β | β | Ό | Ο | |||||
| β | β | Φ | μ | 1 | ||||
| β | β | •χ | ο | |||||
| CU | CL | I | ο | |||||
| ra | >1 | Ο | γΗ | |||||
| • | • | X | G | ο | ||||
| CL | α | 2 | Ο | ί—ί | £ | |||
| M | β | OT | Ν | -μ | ||||
| X | χ | U | £ | £ | ||||
| β | β | -Η | β | Ή | Φ | |||
| m | β | β | £ | β | £ | •Ν | ||
| C | β | Ν | Φ | α> | ||||
| •β | •β | Φ | β | Ο | •Ν | μ | ||
| Φ | β | β | α> | CA | ||||
| 01 | β | C | Φ | •χ | -Ρ | |||
| β | β | Φ | X | φ | ω | S | ||
| ο | υ | •η | υ | β | ||||
| β. | β | β | β | £ | ||||
| β | β | £ | Λ | ο | G, | |||
| β | β | β | *β | β | £ | Φ | ||
| CL | CL | •β | β | X | Οι | Ν | ||
| β | Φ | ο | Ο | φ | υ | |||
| « | β | Φ | 3 | •Η | ο | Ν | Ν | |
| β | β | X | 0 | CL | 0 | cn | ||
| X | ι—1 | ο | X | Ο | ο | >, | Ν | |
| X | I—ί | β | φ | β | β | β | C0 | ο |
| •Η | -β | X! | ι-1 | CU | β | β | cn | |
| υ | u | *β | £ | Ν | X | ο | Φ | |
| β | β | β | -β | U | X | Cn | Τ5 | |
| X | X | 0 | •β | X | β | β | φ | •Ν |
| ο | 0 | Η | X | Ν | β | X | Ό | £ |
| +4 | X | CL | Ν | υ | Ν | •Ν | μ: | |
| u | υ | 0 | Ο | φ | Ο | Ε | £ | |
| β | β | β | φ | X | ο | ο\δ | ||
| χ | χ | Cu | X | β | φ | •μ | γΗ | |
| β | CL | •β | Ν | ο\ο | ||||
| I | I | 1 | CL | β | Ο | μ | Ο | |
| 1 | CU | |||||||
| OT | OT | ?—1 | ( | |||||
| 04 | ΜΩ | <~ł | ω | Ό | ! | j | | | |
| 2 | 2 | 2 | CQ | < | • | |||
| OT | OT | OT | X | CU | β | <ΰ | Λ | υ |
PL 206 763 B1
Tabela 12. Poziomy kultur ochronnych, użyte w różnych badaniach mających na celu okre działania przeciwbakteryjnego (cfu/g) -
o σ> c u o o s s s
CO M 0Ί (0 m w
O rsj
O O (0 O (3
Μ M M
C8 - flj f0
A. cr a •H
Η -A -H © 43 03 . w sa vs (0 iB <0 03
O
Λ (0
Π3 ΠΪ rO A Ω, Ar r-t •H
-A o o o -a f0 <0 C
A A A O
Λ Cl
A A Q-t
N N «> rl s s s s w w ω « <0 © -A A « Π3
5) 3C m
03 23
N N N a
o A 3
A 43
M
A A A © © -A A rtS a?
A .3 a
A
2) 43
| Ύ | •η | 3 | C | ||
| ref | ίΟ | 35 | |||
| <U | Ο | ϊ | 3 | ||
| -P | C | > | >1 | 3 | |
| U | Ο | 3 | ΐ | α | |
| Ν | ο | Ο | 3 | ||
| X | Ο | Α | Α | 3 | |
| Ή | 3 | Ο | Ο | ||
| 3 | © | © | 3 | ||
| O | Ν | Ν | Ν | ο | |
| -H | Ο | Μ | Α | Α | |
| Α | Α | υ | |||
| O | O | >» | ο | ||
| M | £ | Α | φ | 03 | Μ |
| O* | Φ | 3 | C | G | Α |
| Ν | Α | ft} | Φ | Α | |
| Ή | U | Α | Α | Α | |
| X | π5 | 3 | 03 | 23 | 3 |
| N | £ | Α | Ή | •Η | Α |
| υ | Μ | Μ | ω | G | |
| •φ | O | U | 3 | ||
| rM | 0 | Ο | ο | Α | |
| ns | Φ | Ή | Μ | cn | 03 |
| α- | -W | Η | 0> | α> | •d |
| £ | 0 | -ηϊ | Ή | £ | |
| i | Α | e | £ | «s | |
| 9 | *ϋ | ί | t | 1 | I |
| 04 | £ | Λ | u | -5 |
śmietanka przechowywana w. temperaturze 6°C z Listeria monocytogenes Ml
PL 206 763 B1
Dla osiągnięcia optymalnej aktywności kultury ochronnej przeciw grzybom potrzebny jest poziom co najmniej 1,7 x 108 cfu/g albo cfu/ml pałeczek mlekowych w połączeniu z 5,5 x 107 cfu/g albo cfu/ml pałeczek Propionibacterium (tabela 11). Na powierzchni sera, poziom 1,0 x 107 cfu/g powierzchni pałeczek mlekowych i 5,0 x,106 cfu/g powierzchni pałeczek Propionibacterium wydaje się być minimalnym stężeniem potrzebnym do uzyskania stałego zadawalającego działania przeciw grzybom (dane nie są przytoczone). Dla uzyskania zadawalającego działania przeciwbakteryjnego, najniższym testowanym poziomem wykazującym jeszcze dobre właściwości hamujące był poziom 1,2 x 108 cfu/g albo cfu/ml pałeczek mlekowych w połączeniu z 3,0 x 108 cfu/g albo cfu/ml pałeczek Propionibacterium (tabela 12). Według przeprowadzonych doświadczeń, aktywność przeciwbakteryjna mieści się w tym samym zakresie co aktywność przeciw grzybom.
Pomimo tego, że wynalazek został przedstawiony i opisany w jego korzystnych rozwiązaniach, jest zrozumiałe, że nie ogranicza się on do tych rozwiązań lecz może być urzeczywistniony i wykorzystany w praktyce na różne inne sposoby objęte zakresem załączonych zastrzeżeń patentowych.
Piśmiennictwo
Al-Zoreky, M. H., J. W. Ayres i W. E. Sandine, 1991. Antimicrobial activty of MicrogardTM against food spoilage and pathogenic microorganisms (Aktywność przeciw-drobnoustrojowa Microgardu przeciw mikroorganizmom powodującym psucie się żywności i patogennym), J. Dairy Sci., 74: 758-763.
Amann R. I., W. Ludwig, K. H. Schleifer. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation (Filogenetyczna identyfikacja i detekcja in situ komórek mikroorganizmów bez hodowli) Microbiol. Rev. 59: 143-169.
Collins M. D., B. A. Phillips i P. Zanoni, 1939. Deoxy-ribonukleic acid homology studies of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei sp. nov. subsp. paracasei and subsp. tolerans and Lactobacillus rhamnosus sp. nov. comb. nov. (Badania homologii kwasu deoksyrybonukleinowego z Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei gat. nov. podgatunek paracasei i podgatunek tolerans oraz Lactobacillus rhaminosus sp. nov. comb. nov.) Int. J. Syst. Bacteriol, 39: 105-108.
Daeschel M. A., 1989. Antibacterial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives (Substancje przeciw-bakteryjne z bakterii kwasu mlekowego do stosowania jako konserwanty do żywności). Food Technol. 43: 164-167.
Daeschel M. A., 1992. Procedures to detect antimicrobial activities of microorganisms. In food biopreservatives of microbiological origin (Procedury wykrywania aktywności mikroorganizmów. W książce: Biokonserwanty do ż ywnoś ci pochodzenia mikrobiologicznego) (pod red. R. Bibek i M. A. Daeschel). CRC Press, Inc. Boca Raton, Ann Arbor, Londyn i Tokio, 57-80.
Dasen G., J. Smutny, M. Teuber i L. Meile. 1993. Classification and identification of Propionibacteria based on ribosomal RNA genes and PCR. (Klasyfikacja i identyfikacja pałeczek Propionibacteriumi w oparciu o geny ribosomalnego RNA i reakcję PCR). System. Appl. Microbiol. 21: 251-259.
EU-Richtlinie nr. 95/2/EG des Europaischen Parlaments und des Rats vom 20. Februar 1995 uber andere Lebensmittelzusatzstoffe, farbstoffe und Sussungsmittel (Dyrektywa UE nr. 95/2/EG Parlamentu Europejskiego i Wytyczne z 20 lutego 1995 r. dotyczące innych dodatków do żywności, barwników i środków słodzących).
Federal Register. 1988. Nisin preparation: affirmation of GRAS status as a direct humian food ingredient. (Rejestr Federalny. 1988. Preparat nisyny: potwierdzenie statusu GRAS jako bezpośredniego dodatku do żywności dla ludzi. 21 CFR Cz. 134, tom 53: 11247-11251.
Goldenberger D. 1997. Detection of bacterial pathogens in clinical specimen by broad-range PCR amplification and direct sequencing of part of the 16S rDNA gene (Wykrywanie patogenów bakteryjnych w próbkach klinicznych metodą amplifikacji PCR o szerokim zakresie i bezpośrednie sekwencjonowanie części genu 16S rDNA) PhD thesis no. 12219, ETH, Zurich, Szwajcaria.
Greisen K., M. Loeffelholz, A. Purochit i D. Leon. 1994. PCR primers and ptobes for the 16S rDNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid (Primery i sondy PCR dla genu 16S rDNA większości gatunków bakterii patogennych, w tym bakterii znajdowanych w płynie mózgowo-rdzeniowym). J. Clinic. Microbiol. 32: 335-351.
Grinstead D. A. i S. F. Barefoot. 1992. Jenseniin G., a heat-stable bacteriocin produced by Propionibacterium jensenii P126 (Jenseniin G., termostabilna bakteriocyna wytwarzana przez Propionibacterium jensenii P126). Appl. Environ. Microbiol. 58: 213-220.
Holzapfel W.H., R.Geisen i U. Schillinger. 1995. Review Paper. Biological preservation of foods with reference to protective cultures, bacteriocins and food-grade-enzymes (Konserwowanie biologiPL 206 763 B1 czne żywności w odniesieniu do kultur ochronnych, bakteriocyn i enzymów do żywności) Int. J. Food
Microbiol. 24: 343-362.
Jung G. 1991. Lantibiotics: a survey. In Nisin and novel lantibiotics (Lantybiotyki. Przewodnik. Nizyna i nowe lantybiotyki) (pod red. Junga G. i H. G. Sahla). Escom Publishers, Leiden, Holandia, 1-34.
Lane D. J. 1991. Sekwencjonowanie 16S/23S rRNA. W książce: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. (pod red. Stackebrandt E. i M. Goodfellow), John Wiley & Sons, Nowy Jork, USA 115-176.
Miescher S. 1999. Antimicrobial and autolytic systems of dairy propionibacteria (Układy przeciwbakteryjne i autolityczne pałeczek Propionibacterium z produktów mleczarskich) PhD thesis Nr. 13436. ETH, Zurich, Szwajcaria.
Pearson P. W. R. i D. J. Lipman 1938. Improved tools for biological sequence comparison (Ulepszone narzędzia do porównania sekwencji biologicznych). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448.
Sanger F., S. Nicklen i A. R. Coulson 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.
Soumalainen T. H. i A. M. Marya-Makinen. 1999. Propionic acid bacteria as protective cultures in fermented milks and breads (Bakterie kwasu propionowego jako kultury ochronne w fermentowanych mlekach i chlebie). Lait 79: 165-174.
Vogel R. F. 1996. Biotechnology of starter organisms for non-dairy lactic food fermentations (Biotechnologia organizmów starterowych do fermentacji nie-mleczarskich produktów mlecznych) (Mini Review). Adv. Food Sci. 13: 46-51.
Ward L. J. H. i M. J. Timinins. 1999. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction (Różnicowanie Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus w łańcuchowej reakcji polimerazy). Lett. Appl. Microbiol. 29: 90-92.
Young J. P. W., H. L. Downer i B. D. Eardly. 1991. Phylogeny of the phitotrophic rhizobium strain BTAi1 by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA gene segment (Właściwości filogenetyczne fototropowego szczepu rizobium BTAi1 oznaczane przez sekwencjonowanie segmentu genu 16S rRNA w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy). J. Bacteriol. 173: 2271-2277.
Zusatzstoffverordnung ϋber die in Lebensmitteln zulassigen Zusatzstoffe, vom 26. Juni 1995. Stand am. 22. Februar 2000. Eidgenossisches Departement des Innern: Dreifuss. EDMZ. Bern.
Zdeponowane szczepy
W dniu 20.09.2001 w Kolekcji DSMZ-Deutsche Samlung von Mikroorganismen und, Zellkulturen GmbH (DSMZ) zdeponowano następujące szczepy:
- szczep Propionibacterium jensenii SM11 zdeponowano pod numerem DSM 14513
- szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20 zdeponowano pod numerem DSM
14514
- szczep Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29 zdeponowano pod numerem DSM 14515
- Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 zdeponowano pod numerem DSM 15416.
PCT Oryginał (DO ZŁOŻENIA) - wydrukowany 28.10.2002 godz. 01.20.47
| 0-1 0-1-1 | Formularz - PCT/RO/134 (EASY) Dane odnoszące się do zdeponowanych mikroorganizmów lub innego materiału biologicznego (Reg. 13 bis) Przygotowane przy użyciu | PCT-EASY wersja 2.92 (uaktualniona 01.10.2002) |
| 0-2 | Zgłoszenie międzynarodowe nr | |
| 0-3 | Znak Zgłaszającego lub agenta | 05365PC |
| 1 | Poniższe dane odnoszą się do zdeponowanych mikroorganizmów lub innego materiału biologicznego powołanego w opisie | |
| 1-1 | Strona | 57 |
| 1-2 | Wiersz | 7 |
PL 206 763 B1
| 1-3 1-3-1 | Identyfikacja depozytu Nazwa instytucji deponującej | DSMZ-Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH |
| 1-3-2 | Adres instytucji deponującej | Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy |
| 1-3-3 | Data zdeponowania | 20 Wrzesień 2001 (20.09.2001) |
| 1-3-4 | Numer akcesyjny | DSMZ 14513 |
| 1-4 | Dodatkowe dane | Brak |
| 1-5 | Wyznaczenie państw, do których odnoszą się dane | Wszystkie wyznaczone państwa |
| 1-6 | Oddzielne dostarczenie danych Te dane będą dostarczone do Międzynarodowego Biura później | Brak |
| 2 | Poniższe dane odnoszą się do zdeponowanych mikroorganizmów lub innego materiału biologicznego powołanego w opisie | |
| 2-1 | Strona | 57 |
| 2-2 | Wiersz | 7 |
| 2-3 | Identyfikacja depozytu | |
| 2-3-1 | Nazwa instytucji deponującej | DSMZ-Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH |
| 2-3-2 | Adres instytucji deponującej | Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy |
| 2-3-3 | Data zdeponowania | 20 Wrzesień 2001 (20.09.2001) |
| 2-3-4 | Numer akcesyjny | DSMZ 14514 |
| 2-4 | Dodatkowe dane | Brak |
| 2-5 | Wyznaczenie państw, do których odnoszą się dane | Wszystkie wyznaczone państwa |
| 2-6 | Oddzielne dostarczenie danych Te dane będą dostarczone do Międzynarodowego Biura później | Brak |
| 3-3 | Identyfikacja depozytu | |
| 3-3-1 | Nazwa instytucji deponującej | DSMZ-Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH |
| 3-3-2 | Adres instytucji deponującej | Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy |
| 3-3-3 | Data zdeponowania | 20 Wrzesień 2001 (20.09.2001) |
| 3-3-4 | Numer akcesyjny | DSMZ 14515 |
| 3-4 | Dodatkowe dane | Brak |
| 3-5 | Wyznaczenie państw, do których odnoszą się dane | Wszystkie wyznaczone państwa |
| 3-6 | Oddzielne dostarczenie danych Te dane będą dostarczone do Międzynarodowego Biura później | Brak |
| 4 | Poniższe dane odnoszą się do zdeponowanych mikroorganizmów lub innego materiału biologicznego powołanego w opisie | |
| 4-1 | Strona | 57 |
| 4-2 | Wiersz | 16 |
PL 206 763 B1
| 4-3 4-3-1 | Identyfikacja depozytu Nazwa instytucji deponującej | DSMZ-Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH |
| 4-3-2 | Adres instytucji deponującej | Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy |
| 4-3-3 | Data zdeponowania | 20 Wrzesień 2001 (20.09 2001) |
| 4-3-4 | Numer akcesyjny | DSMZ 15416 |
| 4-4 | Dodatkowe dane | Brak |
| 4-5 | Wyznaczenie państw, do których odnoszą się dane | Wszystkie wyznaczone państwa |
| 3-6 | Oddzielne dostarczenie danych Te wskazania będą dostarczone do Międzynarodowego Biura w późniejszym terminie | Brak |
WYKAZ SEKWENCJI <110> Eidgenossische Technische Hochschule Zϋrich <120> Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie <130> Mieszanina bakterii <140>
<141>
<160> 11 <170> PatentIn wersja 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji nienaturalnej: Primer do reakcji PCR <400> 1 tggctcagaa cgaacgctag gcccg <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 2 tgcactgaga ttcgacttaa <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 3 caccgagatt caacatgg <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400>
tgcatcttga tttaattttg
PL 206 763 B1 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 5 aggaggtgat ccarccgca <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 6 agtttgatcm tggctcag <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 7 actcctacgg gaggcagc <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 8 accgcggctg ctggcagc <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 9 ggmttagata ccctggtagt cc <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 10 cgttaagtcc cgcaacgagc <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: Primer do reakcji PCR <400> 11 gtacacaccg cccgtca.
PL 206 763 B1
Claims (18)
- Zastrzeżenia patentowe1. Mieszanina bakterii, znamienna tym, że mieszanina ta jest kulturą nie starterową, wolną od metabolitów i zawierającą co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus.
- 2. Mieszanina bakterii będąca kulturą nie starterową według zastrz. 1, znamienna tym, że wytwarza się ją sposobem zawierającym etapy:- wprowadzenia mieszaniny bakterii zawierającej co najmniej jedną bakterię wybraną z gatunku Propionibacterium jensenii i co najmniej jedną bakterię wybraną z rodzaju Lactobacillus, która to mieszanina jest wolna od metabolitów, do pożywki albo na powierzchnię pożywki zawartej w pierwszym pojemniku w takiej ilości, aby uzyskać stężenie co najmniej 1 x 108 cfu/ml albo 1 x 108 cfu/g albo 1 x 107 cfu/cm2 każdej powyższej pierwszej i drugiej bakterii;- wprowadzenia czynników skaż ają cych do poż ywki i/lub na powierzchni ę poż ywki zawartej w pierwszym pojemniku;- wprowadzenia do pożywki i/lub naniesienie na powierzchnię pożywki zawartej w drugim pojemniku tych samych czynników skażających jakie wprowadzono do i/lub naniesiono na powierzchnię pożywki w pierwszym pojemniku, która to pożywka jest identyczna z pożywką zawartą w pierwszym pojemniku lecz nie zawiera mieszaniny bakterii;- oznaczenia hamowania powyższych czynników skażających przez tę mieszaninę bakterii przez przechowywanie pierwszego i drugiego pojemnika w odpowiedniej temperaturze w odpowiednim czasie przechowywania i porównania ilości i/lub stężenia czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym i w drugim pojemniku, przy czym powyższa mieszanina hamująca działa w ten sposób, że ilość i/lub stężenie czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest wyższe od ilości i/lub stężenia w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po przynajmniej części tego okresu przechowywania, przy czym wspomnianą mieszaninę bakterii uznaje się za posiadającą właściwości hamujące, jeśli ilość czynników skażających w pożywce i/lub na powierzchni pożywki zawartej w drugim pojemniku jest o co najmniej log 1 wyższa, korzystnie o co najmniej około log 2 wyższa, bardziej korzystnie o co najmniej około log 3 wyższa, jeszcze korzystniej o co najmniej około log 4 wyższa, a nawet jeszcze korzystniej o co najmniej około log 5 wyższa, najkorzystniej o co najmniej około log 6 wyższa, od ilości czynników skażających na powierzchni pożywki zawartej w pierwszym pojemniku po okresie co najmniej 3 dni, korzystnie okresie co najmniej 7 dni, bardziej korzystnie w okresie co najmniej 14 dni, jeszcze korzystniej okresie co najmniej 21 dni a najkorzystniej po okresie 25 dni.
- 3. Mieszanina bakterii wedł ug zastrz. 2, znamienna tym, ż e wspomnianą poż ywkę stanowi żywność bądź karma lub pożywka agarowa.
- 4. Mieszanina bakterii według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że odpowiednią temperaturą jest temperatura około 6-25°C, korzystnie, odpowiednią temperaturą jest temperatura wybrana co najmniej z grupy około 6°C, około 12°C, około 25°C a odpowiednim czasem przechowywania jest czas 7-28 dni, korzystnie czas przechowywania jest wybrany przynajmniej z grupy 7 dni, 14 dni, 21 dni, 28 dni.
- 5. Mieszanina bakterii wedł ug zastrz. 2-5, znamienna tym, ż e wspomnianymi czynnikami skażającymi są grzyby lub bakterie albo ich mieszaniny.
- 6. Mieszanina bakterii według zastrz. 1, znamienna tym, ż e proporcja pomiędzy wspomnianymi bakteriami w tej mieszaninie wynosi od 1:100 do 100:1, korzystnie od 1:10 do 10:1.
- 7. Mieszanina bakterii według zastrz. 1, znamienna tym, ż e bakteria z rodzaju Lactobacillus wybrana jest z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum i ich mieszaniny.
- 8. Mieszanina bakterii według zastrz. 7, znamienna tym, ż e bakteria ta jest wybrana spośród jednego lub kilku szczepów Lactobacillus paracasei subsp. paracasei.
- 9. Mieszanina bakterii według zastrz. 8, znamienna tym, ż e bakteria z rodzaju Lactobacillus jest wybrana z grupy obejmującej Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63 i ich mieszaniny.
- 10. Mieszanina bakterii według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniana bakteria Propionibacterium jensenii stanowi Propionibacterium jensenii SM11.
- 11. Żywność, karma lub lek, znamienne tym, że ta żywność, karma lub lek zawiera mieszaninę bakterii jak zdefiniowano w zastrz. 1-10.PL 206 763 B1
- 12. Żywność według zastrz. 11, znamienna tym, że ta żywność jest wybrana z grupy obejmującej produkty mleczne, korzystnie zakwaszone produkty mleczne i/lub produkty mięsne.
- 13. Sposób wytwarzania żywności, karmy lub leku, zwłaszcza żywności zdefiniowanej w zastrz. 11 lub 12, znamienny tym, że zawiera etapy:- dodania mieszaniny bakterii zdefiniowanej w zastrz. 1 - 10 podczas wytwarzania żywności, karmy lub leku w takiej ilości, aby stężenie co najmniej jednej bakterii Propionibacterium jensenii i co najmniej jednej bakterii z rodzaju Lactobacillus w tej żywności, karmie lub leku osiągnęło dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/ml albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy lub leku albo dla każdej bakterii przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku;- kontrolowania parametrów wytwarzania podczas procesu wytwarzania, tak, aby stężenie mieszaniny bakterii pozostawało na stałym poziomie.
- 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stężenie bakterii Propionibacterium jensenii w tej żywności, karmie lub leku wynosi przynajmniej 1 x 109 cfu/ml albo przynajmniej 1 x 109 cfu/g żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 108 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku a stężenie bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosi przynajmniej 1 x 108 cfu/ml żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 108 cfu/g żywności, karmy lub leku albo przynajmniej 1 x 107 cfu/cm2 powierzchni żywności, karmy lub leku i vice versa.
- 15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, obejmujący jeden lub większą ilość etapów fermentacji, znamienny tym, że mieszaninę bakterii dodaje się przed tym jednym lub większą ilością etapów fermentacji i/lub pomiędzy większą ilością etapów fermentacji i/lub po jednym lub większej ilości etapów fermentacji.
- 16. Sposób przechowywania żywności, karmy lub leku zdefiniowanego w zastrz. 11 albo 12 albo żywności, karmy lub leku zdefiniowanych w zastrz. 13 - 15, znamienny tym, że zawiera etap kontrolowania parametrów przechowywania podczas okresu przechowywania, tak, aby stężenie pierwszej i drugiej bakterii pozostawało na stałym poziomie.
- 17. Zastosowanie mieszaniny bakterii zdefiniowanej w zastrz. 1 - 10 do hamowania rozwoju mikroorganizmów wybranych z grupy obejmującej grzyby, bakterie i ich mieszaniny, które to grzyby i bakterie są chorobotwórcze i/lub powodują psucie, zwłaszcza żywności, karmy lub leków.
- 18. Bakterie wybrane z grupy obejmującej DSM14513 (Propionibacterium jensenii SM11), DSM14514 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM20), DSM14515 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM29), DSM14516 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei SM63) lub ich mieszaniny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01125464A EP1308506A1 (en) | 2001-11-06 | 2001-11-06 | Mixtures of Propionibacterium jensenii and Lactobacillus sp. with antimicrobial activities for use as a natural preservation system |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL368846A1 PL368846A1 (pl) | 2005-04-04 |
| PL206763B1 true PL206763B1 (pl) | 2010-09-30 |
Family
ID=8179076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL368846A PL206763B1 (pl) | 2001-11-06 | 2002-10-30 | Mieszanina bakterii, żywność karma lub lek, sposób wytwarzania żywności, sposób przechowywania żywności karmy lub leku, zastosowanie mieszaniny bakterii i bakterie |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7927639B2 (pl) |
| EP (3) | EP1308506A1 (pl) |
| AT (1) | ATE417095T1 (pl) |
| DE (1) | DE60230308D1 (pl) |
| DK (1) | DK1442113T3 (pl) |
| ES (1) | ES2318050T3 (pl) |
| PL (1) | PL206763B1 (pl) |
| WO (1) | WO2003040349A1 (pl) |
Families Citing this family (66)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040121309A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues |
| US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| WO2004060278A2 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
| US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
| US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| JP4521687B2 (ja) | 2002-06-21 | 2010-08-11 | ニューキャッスル イノベーション リミテッド | プロバイオティクス、プロピオニバクテリウム・イエンセニー７０２ |
| US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8242254B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-08-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| ITMI20032391A1 (it) * | 2003-12-05 | 2005-06-06 | Consiglio Nazionale Ricerche | Olive da mensa contenenti microrganismi probiotici. |
| US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
| ES2641832T3 (es) | 2004-05-24 | 2017-11-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Espectrometría de masas con filtración de iones selectiva por establecimiento de umbrales digitales |
| US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
| US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
| WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
| WO2006052135A2 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | Nizo Food Research B.V. | Satiety enhancing compositions |
| US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| US20060205040A1 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| JP2009502137A (ja) | 2005-07-21 | 2009-01-29 | アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | 核酸変種の迅速な同定および定量のための方法 |
| US9149473B2 (en) | 2006-09-14 | 2015-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| EP2126132B1 (en) | 2007-02-23 | 2013-03-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid foresnsic dna analysis |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| FR2924307B1 (fr) * | 2007-12-04 | 2010-08-27 | Gervais Danone Sa | Utilisation de l. casei ssp. paracasei comme antifongique |
| WO2010033625A1 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
| US8550694B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-10-08 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
| US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
| EP2454000A4 (en) | 2009-07-17 | 2016-08-10 | Ibis Biosciences Inc | SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES |
| US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| EP2488656B1 (en) | 2009-10-15 | 2015-06-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| CN102725397B (zh) * | 2010-11-04 | 2014-07-02 | 细胞生物技术公司 | 用于抗菌的死乳酸菌菌体及其制备方法 |
| EA028377B1 (ru) | 2011-04-08 | 2017-11-30 | Кр. Хансен А/С | Противомикробная композиция |
| US20140112889A1 (en) * | 2011-04-26 | 2014-04-24 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Method for reducing methane production in a ruminant animal |
| EP2773431B1 (en) * | 2011-10-25 | 2019-03-20 | Arch Personal Care Products, L.P. | Composition containing an extract of a sequential or simultaneous fermentation |
| DK2836588T3 (en) * | 2012-04-09 | 2017-05-22 | Chr Hansen As | Bioprotection using Lactobacillus paracasei strains |
| MX351628B (es) * | 2012-04-09 | 2017-10-23 | Chr Hansen As | Bioproteccion usando cepas de lactobacillus rhamnosus. |
| RU2640255C2 (ru) * | 2012-05-21 | 2017-12-27 | ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС | Штамм propionibacterium, обладающий ингибирующей активностью против дрожжей и плесневых грибов (варианты) и его применение |
| WO2013174792A1 (en) | 2012-05-21 | 2013-11-28 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Strains of lactobacillus with antifungal properties |
| CZ201327A3 (cs) * | 2013-01-15 | 2014-09-10 | Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s. | Kmen bakterií Lactobacillus paracasei RIBM 2-107 a jeho použití při výrobě nealkoholických a nízkoalkoholických nápojů z ovocných a/nebo obilných substrátů |
| CZ306974B6 (cs) * | 2013-01-15 | 2017-10-25 | Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s. | Kmen bakterií Lactobacillus sp. RIBM 2-108 a jeho použití při výrobě nealkoholických a nízkoalkoholických nápojů z ovocných a/nebo obilných substrátů |
| US11179427B2 (en) | 2013-01-21 | 2021-11-23 | Eth Zurich | Baby food composition comprising viable propionic acid-producing bacteria |
| CA2897363C (en) * | 2013-01-21 | 2016-06-21 | Universitat Zurich | Baby food composition comprising viable propionic acid-producing bacteria |
| EP2777405B1 (en) * | 2013-03-13 | 2018-11-21 | Novozymes A/S | Novel Lactobacillus strains and the uses thereof |
| WO2014209912A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | Starbucks Corporation D/B/A Starbucks Coffee Company | Biopreservation methods for beverages and other foods |
| CA2829344A1 (en) * | 2013-10-02 | 2015-04-02 | Famiantro Lux | Use of probiotics in meat |
| EP3145331A1 (en) * | 2014-04-24 | 2017-03-29 | Molinos Rio De La Plata S.A. | A synergistic composition comprising a mix of bacteria of the genera lactobacillus and propionobacterium freudenreichii ssp shermanii and uses thereof |
| CN104830730B (zh) * | 2015-05-08 | 2016-07-06 | 内蒙古农业大学 | 一株具有抗甜瓜枯萎菌和抗甜瓜疫霉菌活性的植物乳杆菌ab-4及其应用 |
| CN104818232B (zh) * | 2015-05-08 | 2016-07-06 | 内蒙古农业大学 | 一株具有抑菌活性的植物乳杆菌ab-3及其应用 |
| EA201890404A1 (ru) | 2015-08-31 | 2018-09-28 | Кхр. Хансен А/С | Бактерии lactobacillus fermentum с противогрибковой активностью |
| US20180228189A1 (en) | 2017-02-14 | 2018-08-16 | Kraft Foods Group Brands Llc | Process for maintaining freshness of vegetable pieces |
| CN107937290B (zh) * | 2017-12-15 | 2021-01-19 | 北京工商大学 | 一株用于水果采后病害防治的拜耳接合酵母及其制备方法与用途 |
| CN111100802B (zh) * | 2018-10-26 | 2021-10-08 | 中国石油化工股份有限公司 | 一株粪肠球菌及其应用 |
| MX2021012552A (es) * | 2019-04-16 | 2021-11-12 | Locus Ip Co Llc | Aditivos alimentarios emulsionantes basados en microbios. |
| US20200368146A1 (en) * | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Mary Ahern | Method of cosmetic preservation |
| MX2022012743A (es) | 2020-04-16 | 2022-11-07 | Chr Hansen As | Metodo para reducir el crecimiento de listeria en productos alimenticios. |
| BR112022020887A2 (pt) * | 2020-04-16 | 2022-11-29 | Chr Hansen As | Inibição de listeria por depleção de manganês |
| CN113621544B (zh) * | 2021-09-13 | 2023-01-24 | 辽宁省微生物科学研究院 | 一种乳酸菌的保藏方法 |
| CN116555112A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-08 | 金华银河生物科技有限公司 | 用于防腐保鲜的益生菌及其组合物 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5096718A (en) * | 1982-09-17 | 1992-03-17 | The State Of Oregon Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Preserving foods using metabolites of propionibacteria other than propionic acid |
| US4981705A (en) * | 1989-11-06 | 1991-01-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacterial treatment to preserve silage |
| US5186962A (en) * | 1991-03-12 | 1993-02-16 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Composition and method for inhibiting pathogens and spoilage organisms in foods |
| FI92498C (fi) * | 1992-06-10 | 1994-11-25 | Valio Meijerien | Uusi mikro-organismikanta, sitä sisältävät bakteerivalmisteet ja näiden käyttö hiivojen ja homeiden torjuntaan |
| US6577865B2 (en) | 1998-11-05 | 2003-06-10 | Ulysses Holdings, Llc | System for intercept of wireless communications |
| DE19917715A1 (de) | 1999-04-09 | 2000-10-19 | Danisco A S Kopenhagen Koebenh | Neuartige Schutzkulturen und deren Verwendung bei der Konservierung von Lebensmitteln |
-
2001
- 2001-11-06 EP EP01125464A patent/EP1308506A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-10-30 DE DE60230308T patent/DE60230308D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-30 DK DK02777697T patent/DK1442113T3/da active
- 2002-10-30 AT AT02777697T patent/ATE417095T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-30 EP EP08015194A patent/EP1997883A1/en not_active Withdrawn
- 2002-10-30 PL PL368846A patent/PL206763B1/pl unknown
- 2002-10-30 ES ES02777697T patent/ES2318050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-30 WO PCT/IB2002/004521 patent/WO2003040349A1/en not_active Ceased
- 2002-10-30 EP EP02777697A patent/EP1442113B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-30 US US10/493,436 patent/US7927639B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1442113A1 (en) | 2004-08-04 |
| WO2003040349A1 (en) | 2003-05-15 |
| US7927639B2 (en) | 2011-04-19 |
| ATE417095T1 (de) | 2008-12-15 |
| EP1997883A1 (en) | 2008-12-03 |
| EP1308506A1 (en) | 2003-05-07 |
| US20050095318A1 (en) | 2005-05-05 |
| ES2318050T3 (es) | 2009-05-01 |
| EP1442113B1 (en) | 2008-12-10 |
| PL368846A1 (pl) | 2005-04-04 |
| DE60230308D1 (de) | 2009-01-22 |
| DK1442113T3 (da) | 2009-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7927639B2 (en) | Mixture of Propionibacterium jensenii and Lactobacillus sp. with antimicrobial activities for the use as natural preservation system | |
| KR101869498B1 (ko) | 시너지적 항균 효과 | |
| US9504276B2 (en) | Method for reducing the content of pathogenic organisms present in food materials | |
| AU780255B2 (en) | Novel protective cultures and use thereof for preserving foodstuffs | |
| US20140213763A1 (en) | Lactic acid bacteria strain and its use for the protection of food products | |
| Wessels et al. | Suitability ofLactococcus lactissubsp. lactisATCC 11454 as a protective culture for lightly preserved fish products | |
| US9066521B2 (en) | Enhanced preservation of processed food | |
| US11453856B2 (en) | Lactobacillus curvatus strains useful for inhibition of Listeria | |
| Vasilopoulos et al. | Interactions between bacterial isolates from modified-atmosphere-packaged artisan-type cooked ham in view of the development of a bioprotective culture | |
| US20160143302A1 (en) | Use of lactobacillus sakei for the biopreservation of products from the sea | |
| Bilal et al. | Microbes and their role in food sciences | |
| Edima et al. | A selective enumeration medium for Carnobacterium maltaromaticum | |
| Marlida | Antimicrobial Activity of Lactic Acid Bacteria Thermophilic Isolated from Hot Spring Rimbo Panti of West Sumatera for Food Biopreservatives | |
| US20220033859A1 (en) | Increased bioactivity of bioprotective cultures against pathogenic bacteria | |
| Gaare et al. | Potential Use of Lactic Acid Bacteria (LAB): Protective Cultures in Food Biopreservation | |
| TAN et al. | ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF BACTERIOCIN‐PRODUCING MICROORGANISMS FROM AGOS‐OS | |
| KR20230104377A (ko) | 새우젓으로부터 분리된 유산균 및 그의 용도 | |
| Malik et al. | Biopreservation of dairy products: Role of bacteriocins of lactic acid bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |