ES2318452T3

ES2318452T3 - Extraccion de lipidos mediante disolvente de perna canaliculus.

Info

Publication number: ES2318452T3
Application number: ES05702079T
Authority: ES
Inventors: Anthony Michael Chandler; Peter Andrew Whitton; Andre Ka-Chun Lau
Original assignee: Bionovate Ltd
Current assignee: Bionovate Ltd
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: EP1716221A1; ATE413447T1; DE602005010826D1; AU2005209480A1; US20070270600A1; NZ549432A; EP1716221B1; AU2005209480B2; CA2554932A1; WO2005073354A1; US7572464B2

Abstract

Un procedimiento para la extracción de lípidos que incluyen ácidos grasos procedentes de sólidos de Perna canaliculus que comprende mezclar dichos sólidos con acetona, hexano o acetato de etilo para disolver los lípidos de los mismos para formar un extracto de disolvente, eliminando el disolvente de dicho extracto por nanofiltración para producir un extracto lipídico concentrado y un disolvente recuperado, y eliminar el disolvente adicional del extracto de concentrado para dejar los lípidos extraídos.

Description

Extracción de lípidos mediante disolvente de Perna canaliculus.

Esta invención se refiere a un método para extraer lípidos tales como ácidos grasos esenciales del Mejillón de Labios Verdes de Nueva Zelanda (Perna canaliculus).

Aplicación farmacológica de los ácidos grasos poli-insaturados de la serie omega-3 derivados de lípido procedentes del Perna canaliculus

Las propiedades anti-artríticas del Mejillón de Labios Verdes de Nueva Zelanda (Perna canaliculus) se han estudiado durante casi 30 años. Más recientemente la gama de PUFA de la serie omega-3 presente de forma natural en el Perna canaliculus se ha evaluado por sus propiedades anti-inflamatorias y anti-asmáticas. Estos lípidos derivados de animales marinos se ha demostrado que poseen potentes propiedades anti-inflamatorias inhibiendo la acción de las dos enzimas, ciclo-oxigenasa y lipoxigenasa.

La presentación de producto más común es un comprimido sólido que contiene material en polvo derivado de los tejidos del Mejillón de Labios Verdes. La mayoría del comprimido es proteína y el contenido en PUFA es, por consiguiente, bajo. Así, con un consumo típico de uno o dos comprimidos por día, la dosis diaria eficaz cae por debajo de lo que se considera que es eficaz en mamíferos. La extracción de los PUFA como un aceite y la presentación del producto como una cápsula, o como un comprimido que contiene aceite absorbido en un vehículo, es una forma más eficaz de asegurar una dosis adecuada.

El documento US 5707673 describe un procedimiento de extracción de lípidos con disolventes para así formar una miscela que se filtra mediante la ultrafiltración para formar un filtrado rico en disolvente y un concentrado rico en extracto. El disolvente se licua por presión y es un hidrocarburo C_{3} o C_{4}, y se sugiere que el proceso entero es una mejora en la extracción convencional con hexano seguido por eliminación del disolvente mediante destilación, evaporación térmica o extracción.

El documento US 63462278 describe un método de tratamiento anti-inflamatorio de un paciente humano o animal que comprende la administración de un extracto lipídico de Perna canaliculus. El documento US 6596303 describe el alivio de los síntomas artríticos en animales mediante la administración de Perna canaliculus en polvo en la alimentación. El documento WO03043570A2 describe formulaciones y métodos de tratamiento de procesos inflamatorios que comprenden un ácido graso omega-3, tal como DHA, o un flavonoide con un tocoferol distinto de alfa. El documento WO03011873A2 describe un extracto de fosfolípidos procedente de una biomasa marina que comprende una variedad de fosfolípidos, ácidos grasos, metales y un nuevo flavonoide. El documento WO02092450A1 describe la producción y uso de fracciones ricas en compuestos polares que contienen EPA, DHA, AA, ETA y DPA procedentes de organismos marinos y otros y su uso en la alimentación humana, la alimentación animal, aplicaciones farmacéuticas y cosméticas.

Se ha demostrado que los lípidos extraídos del Mejillón de Labios Verdes contienen tipos particulares de ácidos grasos que no se encuentran en la misma proporción en otros organismos. Estos PUFA de la serie omega-3 solo se han caracterizado recientemente debido a los avances en la fabricación. Es esencial que se usen métodos de procesado en frío y métodos de secado adecuados para conservar las delicadas estructuras de estos ácidos grasos particulares. Se sabe que el contenido en serie omega-3 incluye los PUFA: EPA, DHA y los ETA (ácidos eicosatetraenoicos).

Los ETA tienen una estructura similar al ácido araquidónico de la serie omega-6, aunque se ha demostrado que es profundamente más potente que EPA, DHA o a-LNA en la inhibición de la producción de prostaglandinas pro-inflamatorias, tromboxanos y leucotrienos. Se ha demostrado que los ETA son tan potentes como el ibuprofeno y la aspirina en estudios independientes y 200 veces más potentes que el EPA en el ensayo del edema de la pata de ratas (Whitehouse MW et al, Inflammopharmacology 1997; 5:237-246).

Farmacológicamente, se ha demostrado que el lípido derivado de Perna canaliculus inhibe significativamente las rutas de la ciclo-oxigenasa 2 y la lipoxigenasa siguiendo estudios in vitro que determinaron el IC_{50} para cada una:

\bullet: Ciclo-oxigenasa 2 IC_{50}=1,2 \mug/ml

\bullet: Lipoxigenasa IC_{50}=20 a 50 ug/ml

Por lo tanto, los lípidos que se dan de forma natural en Perna canaliculus muestran una significativa actividad anti-inflamatoria in vitro e in vivo.

Métodos de extracción de lípidos

La extracción de ácidos grasos esenciales tales como los ácidos grasos poli-insaturados ETA y EPA procedentes de fuentes de materia prima se ha llevado a cabo de forma rutinaria por extracción sencilla por disolventes, seguido de evaporación y recuperación del disolvente. De forma alternativa, se ha usado dióxido de carbono supercrítico como disolvente, por ejemplo en el documento US6083536. La desventaja en el primer método es que debe usarse calor para evaporar las considerables cantidades de disolvente usado y esto lleva a la degradación del contenido de PUFA activo. La ventaja del último método es que no hay necesidad de eliminar el disolvente al final del procedimiento de extracción, aunque la principal desventaja del dióxido de carbono supercrítico como un disolvente es que es menos adecuado para extraer ácidos grasos. El aceite como producto final contiene niveles significativamente menores de PUFA que las técnicas de extracción por disolvente orgánico habituales.

Las membranas de nanofiltración se han usado en procedimientos de extracción en la industria farmacéutica y de química fina donde la retención de producto es importante, por ejemplo en el documento WO0241978A1. Las membranas se usan para eliminar especies no volátiles tales como disolventes y para recuperar reactivos residuales al final de una reacción. Las membranas de nanofiltración se conocen por reducir la pérdida de rendimiento después de repetidas extracciones y están disponibles normalmente en cuatro límites de peso: 200, 220, 280 y 400 Da. El uso de membranas de nanofiltración no se ha presentado en la extracción de ácidos grasos esenciales procedentes de fuentes de productos naturales.

Descripción de la invención

En consecuencia, la invención proporciona un procedimiento para la extracción de lípidos que incluye ácidos grasos lipídicos procedentes de sólidos de Perna canaliculus, que comprende mezclar dichos sólidos con acetona, hexano o acetato de etilo para disolver los lípidos de los mismos para formar un extracto de disolventes, eliminar el disolvente de dicho extracto por nanofiltración para producir un extracto lipídico concentrado y disolvente recuperado, y eliminar adicionalmente el disolvente del extracto concentrado para dejar los lípidos extraídos, de forma adecuada por evaporación, por ejemplo, evaporación por rotación.

El procedimiento puede aplicarse donde se secan dichos sólidos, por ejemplo tal como carne de mejillón de labios verdes (Perna canaliculus) en polvo, seca por congelación o seca por pulverización. También es factible extraer ácidos grasos directamente del tejido fresco.

La nanofiltración se lleva a cabo preferiblemente como una nanofiltración de corrientes cruzadas que puede realizarse usando un material de nanofiltración que tiene un límite para alcanos normales disueltos en tolueno que da un rechazo del 90% a 300 Da o por debajo, por ejemplo, uno donde dicho límite está por encima de 100 Da. Materiales adecuados incluyen las membranas de nanofiltración STARMEM^{TM} u otras membranas basadas en poliimida. Estas pueden emplearse en módulos de estructura espiral usando típicamente presión en la región de 60 bar.

La evaporación se lleva a cabo preferiblemente por evaporación por rotación, que se hace preferiblemente a una temperatura de o por debajo de ambiente, por ejemplo, a una temperatura de o por debajo de 20ºC.

El disolvente preferido es acetona de calidad farmacéutica. El material en polvo se agita preferiblemente en el disolvente y el disolvente que contiene el aceite extraído se bombea después a través de una membrana de nanofiltración de tamaño de poro definido que retiene los ácidos grasos esenciales mientras permite que las moléculas de disolvente pasen a través suyo. Una de las principales ventajas de la invención es que el procedimiento de extracción y filtración puede llevarse a cabo a, o por debajo, de temperatura ambiente para asegurar el mejor rendimiento de los PUFA activos. No hay necesidad de evaporar grandes volúmenes de disolvente a partir del aceite extraído usando calor, ya que el disolvente se elimina en su mayor parte en el procedimiento de membrana en un procedimiento de flujo continuo. Así que el procedimiento total de extracción es de muy bajo consumo.

El disolvente orgánico extraerá un amplio intervalo de compuestos, tales como fosfolípidos y triglicéridos además de los ácidos grasos libres. Una ventaja adicional del procedimiento de extracción en que los lípidos y ácidos grasos de menor peso molecular pasan a través del filtro y por lo tanto no forman un componente significativo del aceite concentrado final. Así, el producto está enriquecido en los beneficiosos ácidos grasos insaturados de cadena larga y está empobrecido en los ácidos grasos saturados de cadena corta en comparación con los aceites preparados por otros métodos de extracción.

Los análisis han demostrado que el contenido en PUFA del aceite extraído mediante el procedimiento de nanofiltración es considerablemente mayor que el obtenido con el procedimiento de dióxido de carbono supercrítico (véase Tabla 1). Así, el procedimiento de extracción por membrana de nanofiltración repartirá un producto procedente de polvo de Mejillón de Labios Verdes que es mucho más biológicamente activo.

Un aspecto opcional de la invención es el uso de dos membranas de nanofiltración con diferentes límites de peso molecular. Esto permite la selección de una fracción de peso molecular más estrecha de los ácidos grasos esenciales. Por ejemplo, usando un primer filtro de límite de 400 Da en el cartucho de filtro seguido por un filtro de 200 Da dará un producto oleoso recuperado de entre estas dos membranas que está enriquecido de forma selectiva en compuestos con peso molecular entre 200 y 400 Da.

Los dibujos adjuntos muestran los resultados obtenidos en el Ejemplo 3 para la mejora en el contenido en PUFA usando un procedimiento de extracción mediante membrana en comparación con el polvo de mejillón de partida.

Ejemplos Ejemplo 1

Se suspendieron 100 g de polvo seco de Mejillón de Labios Verdes en 200 ml de acetona de calidad farmacéutica y se agitó durante una hora. La suspensión se filtró a través de un filtro grueso para eliminar el polvo no disuelto y después el filtrado que contenía ácidos grasos esenciales se bombeó de manera continua a través de una membrana de nanofiltración de poro controlado (Starmem 400, Grace Divison, EE.UU.). El aceite retenido por la membrana de nanofiltración se recogió y se devolvió al recipiente de extracción de polvo de mejillón. Después de 60 minutos de bombeo, el aceite retenido por la membrana de nanofiltración se colocó en un rotavapor y el disolvente residual se eliminó a vacío a temperatura ambiente (22ºC).

El análisis del aceite extraído fue:

Contenido en PUFA 15,7%

Como comparación, la especificación presentada de un extracto de dióxido de carbono supercrítico disponible comercialmente es:

Contenido en PUFA 5,8%.

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Ejemplo 2 Extracción de PUFA a partir de polvo de Mejillón de Labios Verdes

El procedimiento experimental fue:

1): Pesar la masa conocida (1 kg) de polvo de mejillón en un envase resistente a la luz.

2): Añadir 10 L de acetona al envase

3): Insertar un agitador de montaje por la zona superior y mezclar durante 60 min. a temperatura ambiente (22ºC)

4): Después de 60 min., apagar el agitador y dejar que los sólidos se depositen durante 60 min.

5): Decantar la disolución de PUFA del envase, mientras se retienen los sólidos

6): Transferir la disolución de PUFA al recipiente de alimentación de la filtración del sistema de filtración de corrientes cruzadas

7): Filtrar la disolución de PUFA a 30 bar, 20ºC usando un STARMEM 122 (Grace Davison Inc.), de límite nominal de 220 Da.

8): Continuar hasta que el volumen de disolución de PUFA se haya reducido un 80%

9): Transferir el concentrado (disolución concentrada de PUFA) al recipiente de un rotavapor

10): Llevar a cabo la evaporación en el rotavapor a temperatura ambiente (22ºC) (sin adición de calor al sistema, por lo que el recipiente se enfría de forma significativa ya que la acetona se evapora inicialmente) y vacío máximo, usando un condensador de agua y una trampa de vacío de nitrógeno líquido.

11): Una vez alcanzado el punto final de la evaporación (esencialmente la no ebullición y espumado del aceite de PUFA), liberar el vacío y transferir el aceite a un envase resistente a la luz para el almacenaje.

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Se muestra un análisis del aceite extraído en la Tabla 1.

TABLA 1 Perfil analítico de ácidos grasos en todo el polvo seco de Perna canaliculus y extractos lipídicos

Los resultados mostrados posteriormente confirman que los lípidos extraídos por acetona son ricos en PUFA de serie omega-3 que incluyen ácidos octadecatetraenoicos (C18:4n2) y ácidos eicosatetraenoicos (C20:4n3). El CO_{2} supercrítico produce un extracto pobre en lípidos en términos de rendimiento de la serie omega-3.

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Para cada ácido enumerado anteriormente, las cifras en las siguientes tres columnas representan el porcentaje de material total extraído constituido por ese ácido, no presentándose todos los componentes del material. Los rendimientos de los ácidos grasos pueden determinarse por la inclusión con el material de partida de polvo de mejillón de una cantidad conocida de patrón de lípido y cuantificando la recuperación del patrón. El procedimiento de la invención ha producido un rendimiento del 45%.

Ejemplo 3 Capacidad de Reproducción de la Extracción de PUFA a partir de polvo de Mejillón de Labios Verdes

La Tabla 2 muestra datos experimentales de tres marchas de extracción por membrana diferentes llevada a cabo según el Ejemplo 2. Los resultados demuestran que el método es reproducible en el rendimiento de PUFA obtenido en el aceite. El % de mejora en el rendimiento del procedimiento por membrana se resume en la Figura 1.

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Ejemplo 4 Supresión de la Producción de Óxido Nítrico (NO) en Macrófagos de Murina estimulados por LPS mediante Extracto Lipídico GLM

Una preparación de macrófagos de murina o células RAW264 se desafió con lipopolisacárido (LPS). Las células se estimularon para secretar óxido nítrico (NO) y éste se midió con un equipo disponible comercialmente. La secreción de este compuesto de señalización celular es una indicación de la respuesta inflamatoria de las células al agente de desafío. La adición de extracto de aceite de PUFA hecho según el Ejemplo 2 inhibió la secreción de NO por las
células.

En este ejemplo, suero fetal bovino (FBS), Lipopolisacárido (Escheria coli, 0111:B4) (LPS), Azul de Tripano, y L-glutamina suplementada con 100 U/ml de penicilina y 100 \mul/ml de estreptomicina, se obtuvieron de Sigma Aldrich (Gillingham, Dorset, RU). La solución salina tamponada de fosfato (PBS) (Ca y Mg libres), L-glutamina, y RPMI 1640 (fenol libre) se compraron de Invitrogen (Paisley, RU). Se obtuvieron raspadores celulares de Greiner Bio-One (Gloucester, RU) y se obtuvieron pipetas y artículos de plástico de VWR (Poole, RU). Los Sistemas de Reactivos de Griess se suministraron por Promega (RU). Las células RAW 264.7 fueron amablemente donadas por el Dr. Nicola Dalbeth del Imperial Collage London.

Las células RAW264.7 (Fang et al, 2004, Patel et al., 1999), se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con FBS al 10% y L-glutamina al 1% (con penicilina/estreptomicina), a 37ºC en una incubadora humidificada con CO_{2} al 5%. Las células se sub-cultivaron al 70-80% de confluencia. Las células se pusieron en placas en bandejas de seis pocillos y las células crecieron al 90% de confluencia. Los medios se aspiraron y se añadió LPS a concentraciones de 0,01 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 1 \mug/ml, 10 \mug/ml y 100 \mug/ml. Las células se incubaron durante unas 24 horas adicionales antes de que se leyeran los resultados. Este experimento se realizó y se hizo el ensayo por triplicado.

Para experimentos de NO, las células se pusieron en placas a 6 x 10^{2} por ml de medios de cultivo en placas de 24 pocillos y se incubaron durante aproximadamente 48 horas o hasta que alcanzaron el 90% de confluencia. El extracto lipídico GLM se mezcló 1:1 en etanol al 99% y se diluyó en los medios, por consiguiente. Los medios se aspiraron de las células y se reemplazaron con medios que contenían 1 \mug/ml de LPS y concentraciones variables de extracto lipídico GLM (0-5 \mug/ml). El etanol se llevó a un 1% del volumen final en los medios antes de administrarse a las células. Las células se incubaron durante unas 24 horas adicionales antes de aspirarse los medios y congelarse (-80ºC). Éste experimento se repitió seis veces y se hizo el ensayo por duplicado. Un equipo de reactivo de Griess se usó para probar la producción de nitrito (producto de descomposición, no volátil, estable, de NO). Las muestras celulares se descongelaron en un baño de agua a 37ºC y se hicieron girar a 3000 rpm durante 10 minutos para eliminar las partículas. Las muestras a una concentración de extracto lipídico GLM de 5 \mug/ml se filtraron para eliminar el aceite en exceso. Los resultados anteriores indican que éste no tiene efecto en la concentración de NO. Después de la preparación de una curva patrón (0-100 \muM), se dispensaron 50 \mul de cada muestra, por duplicado, en una placa de 96 pocillos. La disolución de sulfanilamida, 50 \mul, se añadió a cada pocillo. Las placas se incubaron, en la oscuridad, durante 7,5 minutos y se añadieron 50 \mul de disolución de dihidrocloruro de N-1-naftiletilendiamina, seguido de una segunda incubación. Las placas se leyeron entonces a 492 nm. La absorbancia entre los duplicados no iba a tener un valor crítico por debajo de 0,5, o el ensayo se repitió.

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TABLA 3 Producción de NO (promedio del triplicado) con concentración variable de LPS repetido por triplicado

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TABLA 4 Supresión del extracto lipídico GLM de la producción de NO por RAW264.7 bajo el desafío de LPS (experimentos duplicados, promedio de seis muestras)

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Referencias

Regulation of nitric oxide and prostaglandin E_{2} production by CSAIDS^{TM} (SB203580) in murine macrophages and bovine chondrocytes stimulated with LPS) R. Patel, M.G. Attur, M.N. Dave, S. Kumar, J.C. Lee, S.B. Abramson y A.R. Amin. Inflamm. Res. 48 (1999) 337-343.

Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response id regulated by SHIP H. Fang, R.A. Pengal, X. Cao, L.P. Ganesan, M.D. Wewers, C.B. Marsh, S. Tridandapani. J. Inmmunol. 173 (2004).

Claims

1. Un procedimiento para la extracción de lípidos que incluyen ácidos grasos procedentes de sólidos de Perna canaliculus que comprende mezclar dichos sólidos con acetona, hexano o acetato de etilo para disolver los lípidos de los mismos para formar un extracto de disolvente, eliminando el disolvente de dicho extracto por nanofiltración para producir un extracto lipídico concentrado y un disolvente recuperado, y eliminar el disolvente adicional del extracto de concentrado para dejar los lípidos extraídos.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos sólidos animales son carne de mejillón de labios verdes (Perna canaliculus) en polvo, seca por congelación o fresca.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la nanofiltración se lleva a cabo usando un material de nanofiltración que tiene un límite para alcanos normales disueltos en tolueno que da un 90% de rechazo a 300 Da o por debajo.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho límite está por encima de 100 Da.

5. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha eliminación de disolvente adicional se lleva a cabo por evaporación.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha evaporación se lleva a cabo por evaporación por rotación.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que la evaporación por rotación se lleva a cabo a una temperatura de o por debajo de la ambiente.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que la evaporación por rotación se lleva a cabo a una temperatura de o por debajo de 20ºC.