ES2319345T3 - Fosfofructocinasa inducible y efecto de warburg. - Google Patents
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Abstract
Ensayo de diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o tejido corporal o tumoral para buscar la presencia de secuencias específicas de la fosfofructocinasa-2 inducible, seleccionadas de entre el grupo que consiste en las SEC ID N.º 2, 4 y 11.
Description
Fosfofructocinasa inducible y efecto de
Warburg.
La presente invención proporciona una nueva
isoenzima fosfofructocinasa (iPFK-2) que se
transcribe y se traduce preferentemente en las células tumorales.
El descubrimiento de dicho isoenzima, junto con su función, llevó
al descubrimiento de su utilización como herramienta de diagnóstico,
como herramienta de identificación sistemática de fármacos, y la
utilización de compuestos antisentido que inhiben su traducción en
el citosol celular como tratamiento antitumoral.
La vía metabólica glucolítica constituye una vía
anaeróbica fundamental para el metabolismo de los glúcidos en las
células eucariotas. La glucólisis desempeña un doble papel, al
degradar los glúcidos para generar energía (ATP) y al proporcionar
bloques estructurales para las reacciones de síntesis. Se regula la
velocidad de conversión de la glucosa en piruvato para que
satisfaga dichas dos necesidades celulares principales. En la
glucólisis, los enzimas hexocinasa, fosfofructocinasa y piruvato
cinasa catalizan unas reacciones irreversibles y son enzimas
regulados para los puntos de control de la glucólisis. Los enzimas
se regulan mediante el enlace reversible con efectores alostéricos,
mediante la modificación covalente y mediante el control
transcripcional para satisfacer las necesidades metabólicas
cambiantes. De los tres enzimas de control, la fosfofructocinasa
constituye el punto de control más importante de la glucólisis en
los mamíferos.
En 1930, Warburg indicó que los tumores
presentan un índice elevado de glucólisis anaeróbica y que no
presentan un índice glucolítico disminuido a concentraciones
relativamente elevadas de O_{2}. Dicha pérdida del control
regulador (es decir, el efecto Pasteur) ha llegado a denominarse el
efecto Warburg. Al suministrar células tumorales con glucosa se
obtiene como resultado una inhibición del consumo de oxígeno, lo que
aumenta la dependencia de la glucosa en lo que respecta a la
energía. Otros tipos celulares no presentan habitualmente dicho
efecto debido a que mantienen la respiración a partir de otras
sustancias, incluso en presencia de glucosa. El tema de por qué
los tumores que crecen rápidamente presentan una tendencia clara a
convertir el piruvato originado mediante la glucólisis en ácido
láctico en el citosol en vez de transportarlo hacia las mitocondrias
para su oxidación total ha desconcertado a los bioquímicos durante
años. Resultan claras las consecuencias fisiológicas de dicho
comportamiento metabólico alterado. El tejido tumoral genera un
nivel elevado de ineficiencia metabólica en el anfitrión, mediante
un mayor funcionamiento de los procesos que consumen energía, tales
como el ciclo de Cori entre el tumor y el hígado. Como resultado
del elevado índice glucolítico, se genera una gran cantidad de
piruvato, junto con un incremento en la proporción NADH/NAD^{+} en
el citosol, lo que favorece la reducción del piruvato a lactato
mediante la acción de la lactato deshidrogenasa. Ello se ve
respaldado por el bajo contenido mitocondrial en las células
tumorales lo que dificulta la posibilidad de gastar el NADH mediante
la acción de la cadena respiratoria y los bajos niveles de los
sistemas de transporte del NADH que son muy numerosos en los
tumores. La célula tumoral se convierte en una exportadora de
lactato de un modo similar al de algunas fibras musculares en
situaciones de anoxia. A pesar de que no se ha determinado
completamente el papel preciso que desempeña un ciclo de Cori
incrementado en los estados tumorales, aporta ineficiencia al
anfitrión de un modo que, en vez de la formación de 36 a 38
moléculas de ATP durante la oxidación completa de la glucosa a
CO_{2}, se puede esperar una pérdida neta de 4 ATP cuando dos
moléculas de tres carbonos se convierten en una molécula de
glucosa.
Se ha descrito un ambiente metabólico distintivo
de pacientes con cáncer (Argilés & Azcón-Bieto,
Mol. Cell. Biochem. 81: 3-17, 1988). La
invasión tumoral en un anfitrión se ha caracterizado metabólicamente
por una reducción de la eficiencia metabólica del anfitrión, la
reducción de las proteínas musculares, un incremento en la
gluconeogénesis y el desacoplamiento de la fosforilación oxidativa.
El resultado neto es un desequilibrio energético que provoca
caquexia y una eventual inanición.
La presente invención proporciona un ensayo de
diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un
análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o
tejido corporal comprendiendo, por ejemplo, una muestra de tejido
tumoral, para buscar la presencia de secuencias específicas
iPFK-2 (SEC ID N.º 11). Preferentemente, el ensayo
de identidad de la secuencia se selecciona de entre el grupo que
consiste en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), la prueba
de inmunoabsorción enzimática (ELISA), pruebas de hibridación y
combinaciones de las mismas. La presente invención proporciona
además una composición farmacéutica antineoplásica, antinflamatoria
y para la caquexia que comprende un oligonucleótido específico
antisentido de la secuencia de la iPFK-2 aislada
inventiva y un excipiente de un oligonucleótido farmacéuticamente
aceptable. Preferentemente, el oligonucleótido antisentido es un
oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia de
oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en:
5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID
N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'
[SEC ID N.º 4], y combinaciones de las mismas. La presente invención
proporciona además un ensayo de detección sistemática de un agente
terapéutico para seleccionar compuestos con actividad
antineoplásica, que comprende: (a) obtener iPFK-2
recombinante que presenta una actividad que forme
fructosa-2,6-bisfosfato a partir de
un sustrato fructosa-6-fosfato; (b)
añadir el candidato terapéutico con diversas concentraciones o el
vehículo de control sin fármaco; y (c) analizar la
fructosa-26-bisfosfato como
determinación de la actividad enzimática. Preferentemente, el
análisis del producto se realiza mediante una prueba
enzimática.
La presente invención proporciona además un
polipéptido de iPFK-2 recombinante expresado
mediante la secuencia de ADNc proporcionada en la SEC ID N.º 11. La
utilización del polipéptido de iPFK-2, con técnicas
conocidas de anticuerpos, entre ellas técnicas conocidas de
anticuerpos monoclonales, proporciona además anticuerpos que se
enlazan específicamente con la iPFK-2.
Preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos
monoclonales.
La figura 1 representa la secuencia de
aminoácidos prevista y la alineación del nuevo ADNc de la
iPFK-2 con las secuencias de PFK-2
obtenidas a partir de la placenta humana (Sakai, Kato, Fukusawa
et al., J. Biochem. 119: 506-511,
1996) y clon de ADNc del hígado humano (Lange & Pilkis, Nuc.
Acids Res. 18: 3652, 1990). Los residuos encuadrados indican
identidad.
Las figuras 2A-C representan
cómo los LPS provocan que los monocitos de la sangre periférica
expresen rápidamente el ARNm del iPFK-2 y la
proteína. La figura 2A representa un análisis mediante
RT-PCR. La figura 2B representa un análisis de
inmunoelectrotransferencia de tipo Northern. La figura 2C representa
un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western, en el
que el antisuero anti iPFK-2 utilizado en el panel
derecho se absorbió previamente con el péptido específico
iPFK-2 contra el cual creó el antisuero.
Las figuras 3A-B representan la
expresión del ARNm del iPFK-2 por parte de unas
estirpes celulares cancerosas humanas. La figura 3A representa un
análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern de diversas
estirpes celulares cancerosas humanas. La figura 3B representa un
análisis mediante RT-PCR de las células
K-562 con respecto a la
\beta-actina, el iPFK-2 y el
PFK-2 del hígado humano.
Las figuras 4A-C representan
como un oligonucleótido antisentido antagonista del
iPFK-2 inhibe la proliferación de las células
K-562 específicas del iPFK-2 in
vitro. Específicamente, la figura 4A representa un análisis de
inmunoelectrotransferencia de tipo Western de la actividad
antagonista del iPFK por parte del oligonucleótido antisentido. La
figura 4B representa una prueba con la
fructosa-2,6-bisfosfato para la
actividad antagonista del iPFK por parte del oligonucleótido
antisentido (AS) con respecto a la secuencia transcrita (S). La
figura 4C representa una prueba con
5-fosforribosil-1-pirofosfato
y una prueba de proliferación de las células K-562
de la actividad antagonista del iPFK por parte del oligonucleótido
antisentido (AS) con respecto a la secuencia transcrita (S).
La figura 5 representa los datos in vivo
que proporcionan pruebas de la actividad antagonista del
iPFK-2 de los oligonucleótidos antisentido y
representa además la actividad terapéutica antineoplásica de los
antagonistas del iPFK-2.
La figura 6 representa cómo la endotoxinemia
in vivo provoca la expresión del ARNm de la
iPFK-2 de ratón en el bazo y el tejido muscular. Se
inyectaron ratones de 10 semanas de edad del tipo BALB/c
(19-20 g) por vía i. p. con LPS (12,5 mg/kg) o
disolución salina como control. Tras 6 y 24 horas se sacrificaron
los ratones mediante asfixia con CO_{2} y se retiraron el
cerebro, el hígado, los músculos de las extremidades inferiores y
el bazo mediante disección. Se realizó la extracción del ARN total y
un análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern
utilizando una sonda de ADNc específica de la iPFK-2
de ratón (amplificada a partir de un ADNc de macrófago peritoneal
de ratón mediante 30 ciclos de RT-PCR utilizando los
siguientes iniciadores específicos de la iPFK-2
humana: 5'-TGAGGCAGACGTGTCGGTTC-3'
[SEC ID N.º 5],
5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3' [SEC ID
N.º 6]. Dichos datos in vivo demuestran que los LPS provocó
la expresión del ARNm de la iPFK-2 de los ratones
en los tejidos del cerebro, del hígado, muscular y del bazo.
La figura 7 representa como la
iPFK-2 se superexpresa en las PBMC (células
mononucleares de la sangre periférica) de pacientes HIV+. Se aisló
el ARN total a partir de 3 pacientes sin infectar (carriles 1 a 3) y
5 pacientes HIV+ (carriles 4 a 8) y se analizaron mediante
RT-PCR con iniciadores específicos de la
\beta-actina
(5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID
N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'
[SEC ID N.º 8], 19 ciclos) e iniciadores específicos de la
iPFK-2
(5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID
N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'
[SEC ID N.º 10], 23 ciclos).
La figura 8 representa un esquema metabólico
propuesto para el papel metabólico de la iPFK-2,
particularmente en células cancerosas que se dividen rápidamente en
las que se produce una concentración de lactato a partir del
metabolismo anaeróbico y la producción de nucleótidos para soportar
una división celular rápida.
La figura 9 representa los resultados de los
oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2 en la
inhibición de la proliferación de la estirpe tumoral de linfocitos
T MOLT-4. Resultaron efectivos dos oligonucleótidos
antisentido de la iPFK-2 distintos y presentaron
una actividad antineoplásica farmacológica in el presente ensayo de
pronóstico.
La presente invención proporciona un ensayo de
diagnóstico de una neoplasia maligna que comprende realizar un
análisis de identidad de una secuencia en una muestra de un fluido o
tejido corporal para buscar la presencia de secuencias específicas
iPFK-2. Preferentemente, el ensayo de identidad de
la secuencia se selecciona de entre el grupo que consiste en la PCR
(reacción en cadena de la polimerasa), pruebas de inmunoabsorción
enzimática (ELISA), pruebas de hibridación y combinaciones de las
mismas. La presente invención proporciona además una composición
farmacéutica antineoplásica, antinflamatoria y para la caquexia que
comprende un oligonucleótido específico de la secuencia de la
iPFK-2 aislada inventiva y un excipiente de un
oligonucleótido farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el
oligonucleótido se selecciona a partir de un oligonucleótido con 15
a 50 bases que incorpora una secuencia de oligonucleótido
seleccionada de entre el grupo que consiste en:
5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID
N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'
[SEC ID N.º 4], y combinaciones de las mismas.
La presente invención comprende además un
polipéptido de la iPFK-2 recombinante expresado
mediante la secuencia de ADNc proporcionada en la SEC ID N.º 11. La
utilización del polipéptido de la iPFK-2, con
técnicas conocidas de anticuerpos, entre ellas técnicas conocidas
de anticuerpos monoclonales, proporciona además anticuerpos que se
enlazan específicamente con la iPFK-2.
Preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos
monoclonales.
La presente invención proporciona además una
secuencia de ADNc aislado que codifica un enzima
fosfofructocinasa-2 inducible
(iPFK-2) humano. La secuencia de ADNc se indica como
SEC ID N.º 11. La SEC ID N.º 11 proporcionan un codón de iniciación
y de terminación de la región de codificación incorporados. Además,
se destacan los pares de bases de la región carboxiterminal de la
región de codificación que proporciona unos aminoácidos adicionales
que no se encuentran en otros isotipos de PFK-2. La
secuencia inventiva de ADNc de la iPFK-2 resulta
útil para producir un polipéptido de la iPFK-2
recombinante, para diseñar oligonucleótidos antisentido y para que
las células sometidas a transfección (tanto procariotas como
eucariotas) produzcan iPFK-2 recombinante y
fragmentos de la misma. El polipéptido iPFK-2
recombinante, que presenta la actividad enzimática del
PFK-2, resulta útil para realizar la detección
sistemática de inhibidores que presenten actividad terapéutica como
agentes antineoplásicos, específicamente contra la isoforma
inducible iPFK-2 de la presente invención. La
actividad terapéutica antineoplásica se puede atribuir a los
inhibidores de la iPFK-2 ya que se requiere un
nuevo gen de respuesta precoz rico en AU para el desarrollo de la
leucemia. Dicho gen parece ser el gen de la iPFK-2
inducible, el producto genético más frecuente en las células
tumorales.
La presente invención proporciona además una
secuencia de ADNc aislado que codifica un enzima
fosfofructocinasa-2 inducible
(iPFK-2) humano. Los ejemplos posteriores detallan
los proyectos que condujeron al aislamiento, purificación y
expresión del isoenzima. Se descubrió que la secuencia del isoenzima
aislado se expresaba preferentemente en las células tumorales y
provocaba un incremento en la actividad glucolítica.
La presente invención se basa en la
identificación y a comprensión de un nuevo gen para la
PFK-2/FBPasa
(6-fosfofructo-2-cinasa
(PFK-2)/fructosa-2,6-bifosfatasa
(FBPasa)) o "iPFK-2" que se activa mediante
estímulos proinflamatorios y que se distingue de otros genes
similares que codifican enzimas del tipo PFK mediante la presencia
de una pluralidad de copias de un fragmento de inestabilidad de
ARNm AUUUA en su extremo 3' sin traducir. Dicho elemento rico en AU
es característico de los ARNm que codifican diversas citocinas
inflamatorias (por ejemplo, TNF\alpha, IL-1,
IFN-\gamma y GM-CSF) y
oncoproteínas (por ejemplo, c-Fos,
c-Myc, y c-Sis) (Greenberg &
Belasco, en Control of Messenger RNA Stability ("Control
de la estabilidad del ARN mensajero"), Belasco and Brawerman
eds., pág. 199-218, Academic Press, New York, 1993).
Los datos presentados en la presente memoria demuestran que la
iPFK-2 se expresa de un modo constitutivo en
diversas estirpes celulares cancerosas humanas y se descubrió que
resultaba esencial ara el crecimiento de las células tumorales in
vivo. La inhibición del nivel de la expresión de la proteína
iPFK-2 (mediante la utilización de antagonistas
antisentido) disminuye los niveles intracelulares del
5-fosforribosil-1-pirofosfato
(PRPP), un precursor importante en la biosíntesis de purinas y de
pirimidinas. Por consiguiente, la iPFK-2 constituye
un isoenzima regulador importante que parece es esencial para el
crecimiento tumoral, cuyos antagonistas desempeñan una actividad
importante en los tratamientos antineoplásicos, y proporciona una
explicación para las observaciones tradicionales por lo que se
refiere a la relación aparente entre la glucólisis y la
proliferación de células cancerosas.
Se ha indicado que los ARNm de diversas
citocinas y protoncogenes que forman parte de la familia de genes
de respuesta precoz contiene el fragmento de secuencia AUUUA en su
región 3' sin traducir (3'UTR). Dicho elemento rico en AU confiere
inestabilidad a la molécula de ARNm y desempeña un papel en la
regulación de su semivida fisiológica (Caput et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83: 1670-1674,
1986; y Shaw et al., Cell 46: 659 - 667, 1986). En
una base de datos de etiquetas de secuencias expresadas (EST) se
buscaron secuencias de ADNc que contenían los fragmentos de
secuencia AUUUA conservados. Se identificaron EST ricas en AU, sin
guardar relación con genes descritos anteriormente, y se clonó y
secuenció el ADNc. Se descubrió que la secuencia de ADN de dicho
nuevo gen compartía un 29% de identidad con el PFK-2
del hígado humano (figura 1), que no contiene elementos ricos en
AU. LA secuencia de aminoácidos prevista presentó un 69% de
identidad y frecuentes sustituciones conservadoras (figura 1)
(Lange & Pilkis, Nucl. Acids Res. 18: 3652, 1990).
La expresión de muchos protoncogenes y citocinas
que presentan el fragmento AUUUA aumenta en las células como
consecuencia de una estimulación mitógena o proinflamatoria. Por lo
tanto, se detectaron únicamente unos niveles muy bajos de expresión
de la iPFK-2 mediante inmunoelectrotransferencia de
tipo Northern de tejidos humanos normales (es decir, corazón,
cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón,
páncreas, bazo y ganglio linfático). El análisis de tipo Northern
de monocitos humanos estimulados con lipopolisacáridos (LPS),
mediante contraste, demostraron que se provocaba rápidamente la
expresión de dicho nuevo gen iPFK-2 (figura 2A), de
aquí el término "iPFK-2". La inducción y el
incremento del nivel de la expresión de la iPFK-2
resultó similar al observado para la citocina
IL-1\beta (que contiene asimismo elementos ricos
en AU) (figura 2B). La expresión de la isoforma hepática
(constitutiva) del PFK-2 no se vio afectada por la
estimulación con LPS. La inducción del ARNm de la
iPFK-2 iba acompañada del incremento correspondiente
de la proteína inmunorreactiva iPFK-2, tal como se
determinó mediante inmunoelectrotransferencia de tipo Western
utilizando un anticuerpo específico anti iPFK-2
(figure 2C). Dichos datos demuestran que la iPFK-2,
al igual que otros genes con elementos ricos en AU en su 3'UTR, se
induce en los monocitos primarios humanos con la activación
proinflamatoria in vitro. En un experimento independiente se
examinó la expresión de la iPFK-2 en leucocitos de
la sangre periférica de 5 pacientes infectados con HIV. En cada
caso, el nivel de ARN de la iPFK-2 resultó superior
que el observado en el control, pacientes sin infectar (n = 3).
Dichos datos sugieren que la iPFK-2 se induce
mediante la activación in vivo de los leucocitos.
Un incremento del nivel de la expresión estable
de protoncogenes con 3'UTR ricos en AU constituye un aspecto
característico de muchas células transformadas y puede ser
directamente oncógeno (Lee et al., Mol. Cell. Biol.
8: 5521-5527, 1988; Rabbitts et al., EMBO
J. 4: 3727-3733, 1985; y Piechaczyk et
al., Cell 42: 589-597, 1985). Se
examinaron ocho estirpes celulares tumorales humanas con respecto al
ARNm de la iPFK-2 mediante
inmunoelectrotransferencia de tipo Northern y se hallaron unos
niveles de expresión elevados (figure 3A). Las intensidades de las
señales de hibridación de la iPFK-2 resultaron
comparables a las señales de la iPFK-2 observadas
en el ARN obtenido a partir de monocitos primarios humanos
estimulados con LPS (figura 2B). Un examen más detallado de la
estirpe celular de leucemia mielógena crónica K562 demostró que la
expresión de la iPFK-2 era muy superior que la de la
isoforma hepática PFK-2 (figura 3B). Dichos datos
sugieren que la expresión de la iPFK-2 es importante
en la regulación de la vía glucolítica durante el crecimiento de la
célula tumoral.
Se realizó la transfección de células de
leucemia K562 con oligonucleótidos antisentido específicos de la
iPFK-2. Tanto los niveles de la proteína
iPFK-2 como de F2,6BP disminuyeron
significativamente si se comparan con las células sometidas a
transfección con oligonucleótidos de control (figure 4A). Dichos
datos indican que la actividad como cinasa de la
iPFK-2 contribuye significativamente a los niveles
intracelulares de F2,6BP. El flujo glucolítico aumentado de las
células transformadas facilita la biosíntesis de
5-fosforribosilpirofosfato (PRPP), un precursor
crítico en la biosíntesis de las purinas y las pirimidinas
(Eifenbrody et al., Trends Pharmacol. Sci. 1:
24-245, 1980). Se descubrió que la inhibición de la
iPFK-2 disminuía significativamente los niveles de
PRPP en las células K562 y se asoció dicha disminución con el
descenso correspondiente de la síntesis del ADN K562 y la
proliferación celular (figura 4B). Se observó un nivel similar de
inhibición de la síntesis del ADN tras la transfección de
oligonucleótidos antisentido de iPFK-2 en estirpes
celulares HL-60, MOLT-4, SW480,
G361 y KG1A. Dichas observaciones indican que la producción de
F2-6BP catalizada con la iPFK-2
puede aumentar el flujo glucolítico (mediante la estimulación del
PFK-1) y permite incrementar la canalización del
metabolismo de la glucosa en la dirección de la síntesis de
PRPP.
Se examinó el papel de la iPFK-2
en la oncogénesis in vivo mediante la administración de
oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2
específicos de ratones atímicos que presentan el tumor K562. Al cabo
de 2 días de tratamiento, los tumores de los ratones tratados con
los oligonucleótidos antisentido de la iPFK-2 eran
significativamente más pequeños que los tumores de los ratones
tratados con oligonucleótidos homosentido de la
iPFK-2 o con PBS (figura 4C).
Se han desarrollado procedimientos y reactivos
para analizar los inhibidores de la iPFK-2
utilizando análisis rápidos in vitro apropiados para
realizar una detección sistemática de alto rendimiento de compuestos
o genotecas de compuestos. Mediante la homología con dominios
funcionales PFK-2, el polipéptido
iPFK-2 comprende dos dominios distintos: la parte
aminoterminal del péptido comprende el dominio cinasa (responsable
de la fosforilación de la
fructosa-6-fosfato para obtener
fructosa-2,6-bisfosfato) y la parte
carboxiterminal comprende el dominio fosfatasa (responsable de la
hidrólisis de la
fructosa-2,6-bisfosfato para obtener
fructosa-6-fosfato).
Se clonó el marco de lectura abierto de la iPFK2
completa realizando la detección sistemática en una genoteca de
ADNc EST utilizando una sonda específica de la
iPFK-2, y a continuación se clonó en el plásmido
pT7T3D-Pac (Pharmacia). Se confirmó la secuencia de
dicho inserto como correcta mediante la digestión de restricción y
secuenciación. El vector que presentaba el inserto se utilizó para
realizar la transformación de bacterias y se detectaron las
colonias positivas realizando un análisis de restricción y de
secuenciación. Por último, se extrajo el inserto y se volvió a
clonar en el vector de expresión pET11b (Novagen) y se expresó
siguiendo el procedimiento general descrito a continuación.
Se obtuvo el dominio de la
iPFK-2 cinasa mediante clonación por PCR.
Resumidamente, un conjunto de ADNc, obtenido mediante la
transcripción inversa del ARNm de monocitos humanos estimulados con
LPS se utilizó como molde para la amplificación mediante PCR. Se
sintetizaron especialmente unos iniciadores, que contenían las zonas
de restricción NdeI y BamHI en la extensión 5': P1,
5'-ACATATGCCGTTGGAACTGACGCAGAGC-3'
[SEC ID N.º 27], P2,
5'-TGGATCCTCACAGGTAGATGGTACGCGGCT-3'
[SEC ID N.º 28]. Se descubrió que el producto amplificado presentaba
el tamaño previsto y que correspondía a la secuencia de nucleótidos
del dominio de la iPFK-2 cinasa (que corresponde a
las posiciones 47-797 del marco de lectura abierto
de la iPFK-2). Dicho producto de amplificación del
ADN se purifica mediante un equipo de purificación de ADN GENECLEAN
(BIO101) y a continuación se clonó tanto en el vector t de
clonación pT7Blue (Novagen) como en el vector de expresión pET14b
(Novagen), que contiene una etiqueta de histidina. Los clones que
presentaban el inserto se detectaron mediante un procedimiento de
detección sistemática por PCR, y se verificó la secuencia del
inserto mediante secuenciación. Se inoculó una colonia positiva
para el inserto pET14b en 2 ml de caldo de cultivo LB y se incubó a
37ºC durante 3 horas. El cultivo bacteriano se transfirió a un
frasco mayor, que contenía 100 ml de caldo de cultivo de LB y se
incubó a 37ºC. una vez el OD_{600} alcanzó 0,7, se realizó la
inducción del cultivo añadiendo IPTG (1 mM) y se dejó proliferar
sometiéndose a agitación durante la noche a 25ºC. Por último, se
centrifugó el cultivo, se aspiró el sobrenadante y se congeló el
sedimento a -70ºC. Dichas células depositadas se volvieron a
suspender en una disolución amortiguadora de lisis
(B-PER, Pierce), se centrifugaron y se almacenó el
sobrenadante para utilizar posteriormente como proteínas solubles a
-20ºC. Se purificó el péptido del dominio cinasa utilizando un
equipo de purificación etiquetado para la histidina (Novagen) y se
analizó con respecto a su actividad enzimática tal como se
describirá a continuación. Dicho procedimiento se puede utilizar
para producir polipéptidos etiquetados con histidina con respecto
al dominio cinasa o al dominio fosfatasa.
Resumidamente, se siguió el procedimiento de
Sakata et al. (J. Biol. Chem. 266:
15764-15770, 1991). Se analizó adecuadamente la
actividad enzimática del péptido iPFK-2 o del
dominio de la iPFK-2 cinasa (a partir de fuentes
naturales o recombinantes) determinando la producción del
metabolito Fru 2,6BP a partir de Fru 6-P y ATP. Una
unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que
cataliza la formación de 1 \mumol de metabolito por minuto. Se
realizó apropiadamente la reacción a 30ºC en un volumen final de 200
\mul, que contenía Tris-HCl 100 mM, a un pH de
7,5, DTT 2 mM, EDTA 0,1 mM, ATP 5 mM, F6-P 1 mM,
fosfato potásico 5 mM y MgCl_{2} 10 mM. A intervalos programados,
se transfirieron alícuotas de 20 \mul a 180 \mul de NaOH 50 mM,
y las disoluciones diluidas se calentaron hasta 90ºC para detener la
reacción. Se añadió un alícuota apropiado de las disoluciones
calentadas con respecto al F2,6-BP tal como se
describirá posteriormente. Los agentes del ensayo se analizaron
como inhibidores de la actividad de la iPFK-2 cinasa
mediante la inclusión de la incubación anterior, seguido por el
análisis de la producción de F2,6BP; se utilizaron experimentos de
control para determinar que los agentes del ensayo no interfirieran
pos sí mismos con el siguiente ensayo con la
fructosa-2,6-bisfosfato.
Resumidamente, se siguió el procedimiento de Van
Schaftingen et al. (Eur. J. Biochem. 129:
191-195, 1982). Se realizó apropiadamente el ensayo
con F2,6BP en placas de 96 pocillos, a un volumen final de 300
\mul. En cada pocillo, se añadieron 30 \mul de la disolución
enzimática (4,5 U/ml de aldolasa, 17 U/ml de
glicerol-3-P-deshidrogenasa,
50 U/ml de triosa isomerasa, 0,1 U/ml de fructosa bisfosfato cinasa
dependiente del 1-pirofosfato, en BSA al 0,2%) a
150 \mul de disolución amortiguadora del pH (Tris 100
mM/disolución amortiguador de acetato, acetato magnésico 4 mM,
fructosa-6-fosfato, en presencia de
NADH 0,3 mMNADH). A continuación se dispensaron unas muestras (o
unas cantidades estándar) (105 \mul) en cada pocillo y se
mezclaron por pipeteo. Dicha mezcla de reacción se incubó a
temperatura ambiente durante 5 minutos y a continuación se añadieron
simultáneamente 15 \mul de pirofosfato 10 mM a cada pocillo de
las muestras y de control, mezclando dos veces mediante pipeteo. La
reacción tuvo como resultado la oxidación del NADH, realizándose el
seguimiento de la misma mediante la lectura de la absorbancia de
las muestras a intervalos de 1 minuto durante 10 minutos a 340 nm,
obteniéndose unos valores de OD/min. La velocidad del cambio en la
absorbancia por unidad de tiempo es una función hiperbólica de la
concentración del F2,6BP presente en la muestra. Los valores
experimentales se determinaron por interpolación de una curva
normal apropiada de la
fructosa-2,6-bisfosfato.
El presente ejemplo ilustra la clonación inicial
de la secuencia de la iPFK-2. Se identificó una
etiqueta de la secuencia expresada (EST) que contenía un elemento
rico en AU en la base de datos dbEST en el National Center for
Biotechnology Information (Centro Nacional de Información en
Biotecnología) al realizar una búsqueda TBLASTN utilizando la
secuencia de consulta ATTTATTTATTTA [SEC ID N.º 12]. La EST rica en
AU (GenBank ID F00287) se había obtenido a partir de una genoteca
de ADNc de músculo esquelético de Homo sapiens y que no
estaba relacionado con las secuencias identificadas anteriormente.
La amplificación rápida 5'- y 3'- de los extremos del ADN
complementario (RACE) se realizó utilizando el equipo RACE Human
Skeletal Muscle Marathon cDNA-ready (Clontech
Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Los oligonucleótidos específicos
del gen utilizados para la secuencia del RACE en la dirección 5'
comprenden
5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID
N.º 19],
5'-GATTGTACCATACCTGAAGCACAGCCTC-3'
[SEC ID N.º 13],
5'-TCTCCTGCCGCTCCAGCTCCATGATCAC-3'
[SEC ID N.º 14] y
5'-GTCAGCTTCTTGGAGATGTAGGTCTTGC-3'
[SEC ID N.º 15]. Los oligonucleótidos específicos del gen
utilizados para la secuencia del RACE en la dirección 3' comprenden
5'-TTGGTTTGGGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'
[SEC ID N.º 16] y
5'-TTGGCGTCTACTGATTCCTCCAACTCTC-3'
[SEC ID N.º 17]. Los productos de la amplificación del ADN se
purificaron con un equipo de extracción de ADN en gel QIAEX
(Qiagen, Germany) y a continuación se clonaron en el vector T
pT7Blue (Novagen, Madison, WI). Para cada producto de
amplificación, se aislaron cinco clones recombinantes y se
secuenciaron los insertos de ADN en las dos direcciones utilizando
el equipo de secuenciación Taq DyeDeoxy Terminator Cycle y un
secuenciador de ADN ABI Modelo 373A (Applied Biosystems, Foster
City, CA). En la figura 1 se presenta la secuencia de aminoácidos
completa prevista para la iPFK-2 humana, que
presenta una comparación con las secuencias relacionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra como los LPS
provocan que los monocitos de la sangre periférica expresen
rápidamente el ARNm de la iPFK-2 y la proteína. Se
aislaron PBMC mediante centrifugación por gradiente de densidad de
la sangre entera con Ficoll (Ficoll-Paque, analizado
con respecto a endotoxinas, Pharmacia, Piscataway, NJ) y a
continuación se cultivaron en placas de 6 pocillos (2 x 10^{6}
células/ml/pocillo de RPMI con suero bovino fetal al 10%, Hyclone
Labs, Logan, UT). Se retiraron las células no adherentes cambiando
el medio después de 24 horas y los monocitos restantes, adherentes,
se incubaron solos como control o en presencia de 1 mg/ml de LPS
(E. coli 0111: B4; Sigma Chemical Co., S. Luis, MO). Tras la
incubación durante 1,5, 3, 6, 12, o 24 horas, se separaron las
células, se recogieron por centrifugación a 300 g durante 10 minutos
y se analizaron inmediatamente. Se aisló el ARN celular total
mediante el un procedimiento modificado con isotiocianato de
guanidinio (RNAzol, Cinna Biotecx, Friendswood, TX). En el caso del
análisis mediante RT-PCR, se preparó ADNc a partir
de 1,0 mg del ARN total utilizando 0,25 ng de oligo-(dT) y
Superscript II siguiendo el protocolo del fabricante (Gibco/BRL,
Grand Island, NY). A continuación se amplificaron alícuotas de ADNc
de dos \mul mediante la PCR en un ciclador térmico
Perkin-Elmer modelo 9600 utilizando los iniciadores
que se indican a continuación y la siguiente programación del
ciclo: desnaturalización durante 15 segundos a 95ºC, hibridación
durante 20 segundos a 55ºC, y extensión durante 30 segundos a 72ºC
durante los ciclos indicados con una extensión final durante 5
minutos a 72ºC. Se sintetizaron especialmente los siguientes
iniciadores de ARNm humano: \beta-actina,
5'-TAAGGAGAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID
N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'
[SEC ID N.º 8]; IL-1\beta,
5'-CTGTACCTGTCCTGCGTGTT-3' [SEC ID
N.º 18], 5'-AGCTCTCTTTAGGAAGACAC-3'
[SEC ID N.º 19]; iPFK-2,
5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID
N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGTGACT-3'
[SEC ID N.º 10]; PFK-2 hepático,
5'-GAAGTCAAACTGAATGTGTC-3' [SEC ID
N.º 20], 5'-CCTCTTGTAGGCAGTAAGTC-3'
[SEC ID N.º 21] (y
5'-AGGCAGTAAGTCTTTATTCG-3' [SEC ID
N.º 22], 5'-AAGTCAAACTGCCTGTGTCC-3'
[SEC ID N.º 23], datos no representados) (Gibco/BRL). Para el
análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Northern, se realizó
la electroforesis del ARN (7.5 \mug) a través de geles de agarosa
- formaldehído al 1.5%, se transfirió a unas membranas de nilón
(Schleicher & Schuell), y se realizó la hibridación secuencial
con sondas de ADNc para la iPFK-2 y la
\beta-actina humanas. Las sondas se produjeron
mediante PCR utilizando los iniciadores descritos anteriormente y a
continuación se marcaron con ^{32}P mediante el procedimiento de
cebado aleatorio (Megaprime kit, Amersham). Se realizó la
autorradiografía a temperatura ambiente durante 2 a 6 horas
utilizando películas DuPont Reflection y filtros de intensificación.
Para el análisis de inmunoelectrotransferencia de tipo Western, se
lisaron las células en una disolución amortiguadora para muestras 2X
Laemle durante 5 minutos a 95ºC y se obtuvieron las proteínas
celulares totales mediante electroforesis a través de geles de SDS
de poliacrilamida al 18% en unas condiciones reductoras y se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher &
Schuell). Se incubaron las membranas con suero policlonal de conejo
anti iPFK-2 humana (producido mediante la
inmunización de conejos con un péptido carboxiterminal de la
iPFK-2
([NH_{2}]-GQPLLGQACLT-[COOH]) [SEC ID N.º 24] que
se conjugó con KLH. Dicho péptido comprende una región única de la
iPFK-2 (aminoácidos 505-515) que
difiere de la parte correspondiente del PFK-2
placentario en una eliminación parcial de 5 aminoácidos y 8 errores
en los aminoácidos. A continuación se visualizó la
iPFK-2 inmunorreactiva (M_{r} = 59 kD)
desarrollando membranas con un anticuerpo anti IgG de conejo
conjugado con peroxidasa de asno (1:8.000) seguido por la reacción
con reactivos ECL (Amersham International, Buckinghamshire,
Inglaterra) (véase la figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra la expresión del
ARNm de la iPFK-2 por parte de células cancerosas
humanas. Una inmunoelectrotransferencia de tipo Northern, que
contenía 2 \mug de poliA ARN por carril de 8 estirpes celulares
humanas distintas (Clontech Labs), se hibridó de un modo secuencial
con sondas de ADNc para GADPH (Clontech Labs) y la
iPFK-2 tal como en el ejemplo 2 anterior. Las
estirpes celulares eran: leucemia promielocítica
HL-60, células HeLa S3, leucemia mielógena crónica
K562, leucemia linfoblástica MOLT-4, linfoma de
Burkitt Raji, adenocarcinoma colorrectal SW480, carcinoma de pulmón
A549 y melanoma G361. Para el análisis con RT-PCR
se amplificaron alícuotas de ADNc de dos \mul mediante la PCR en
un ciclador térmico Perkin-Elmer modelo 9600
utilizando los iniciadores específicos para la
\beta-actina, la iPFK-2 o
PFK-2 hepática (las secuencias de iniciadores
indicadas en el ejemplo 2 anterior). Dichos datos (que se presentan
en la figura 3) demuestran que el iPFK-2 se expresa
mediante una gran variedad de estirpes celulares cancerosas humanas
y es probablemente una secuencia enzimática marcadora de tumores
que se puede utilizar para determinar el progreso del tratamiento
contra el cáncer, para identificar inicialmente células como
cancerosas o para identificar si un paciente presenta tumores.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra cómo los
oligonucleótidos antisentido específicos de la
iPFK-2 inhiben la proliferación de las células K562
in vitro. Se cultivaron células K562 (ATCC) en fase de
crecimiento exponencial por triplacado en placas de 96 pocillos (5
x 10^{3} células/pocillo) en RPMI (Gibco/BRL) enriquecidas con FBS
al 10%. Se incubaron las células con PBS como control o se
sometieron a transfección mediante el procedimiento de la
lipofectina (Gibco/BRL) durante 20 horas con los siguientes
oligonucleótidos de fosforotioato:
S-iPFK-2 (A) (homosentido, posición
35-55):
5'-AGCCGCGAAGATGCCGTTGG-3' [SEC ID
N.º 1]; AS-iPFK-2 (A) (antisentido,
posición 35-55):
5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID
N.º 2]; S-IPFK-2 (B) (homosentido,
posición 42-62):
5'-AAGATGCCGTTGGAACTGAC-3' [SEC ID
N.º 3]; AS-iPFK-2 (B) (antisentido,
posición 42-62):
5'-GTCAGTTC
CAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4]. Se realizó la inmunoelectrotransferencia de tipo Western tal como en el ejemplo 2. Se determinaron la fructosa-2,6-bisfosfato y el 5-fosforribosil-1-pirofosfato celulares totales utilizando los procedimientos descritos en Van Schaftingen, Methods. Enz. Anal. 6: 335-341, 1984 y en Sant et al., J. Biol. Biochem. 16: 11038-11045, 1992, respectivamente. La actividad proliferativa de las K562 se determinó mediante la incorporación de [^{3}H]timidina (4 \muCi/ml) (DuPont, Boston, MA) en ADN durante las últimas 14 horas de incubación/transfección realizándose la determinación cuantitativa mediante el recuento del centelleo en líquido. Los datos de la figura 4 se expresan como la media \pm desviación típica (n = 3). El nivel de significación estadística se calculó mediante pruebas T con dos muestras (asumiendo unas varianzas no iguales) (*, p < 0,05) (Taetle et al., Cancer Trmt. Reports 71: 297-304, 1987). La figura 4 representa cómo un grupo de oligonucleótidos antisentido presentan una actividad antagonista de la iPFK-2 y probablemente presentarán una actividad terapéutica antineoplásica significativa en vista de la amplia prevalencia de la iPFK-2 y del efecto Warburg conocidos para el tejido tumoral.
CAACGGCATCTT-3' [SEC ID N.º 4]. Se realizó la inmunoelectrotransferencia de tipo Western tal como en el ejemplo 2. Se determinaron la fructosa-2,6-bisfosfato y el 5-fosforribosil-1-pirofosfato celulares totales utilizando los procedimientos descritos en Van Schaftingen, Methods. Enz. Anal. 6: 335-341, 1984 y en Sant et al., J. Biol. Biochem. 16: 11038-11045, 1992, respectivamente. La actividad proliferativa de las K562 se determinó mediante la incorporación de [^{3}H]timidina (4 \muCi/ml) (DuPont, Boston, MA) en ADN durante las últimas 14 horas de incubación/transfección realizándose la determinación cuantitativa mediante el recuento del centelleo en líquido. Los datos de la figura 4 se expresan como la media \pm desviación típica (n = 3). El nivel de significación estadística se calculó mediante pruebas T con dos muestras (asumiendo unas varianzas no iguales) (*, p < 0,05) (Taetle et al., Cancer Trmt. Reports 71: 297-304, 1987). La figura 4 representa cómo un grupo de oligonucleótidos antisentido presentan una actividad antagonista de la iPFK-2 y probablemente presentarán una actividad terapéutica antineoplásica significativa en vista de la amplia prevalencia de la iPFK-2 y del efecto Warburg conocidos para el tejido tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra como los
oligonucleótidos antisentido específicos de la
iPFK-2 inhiben el crecimiento de tumores
K-562 in vivo. A unos ratones con tumores
K562 se les implantó durante los días indicados (figura 5) unas
bombas microosmóticas que contenían PBS, (o);
S-iPFK-2 (B), (\Box); o
AS-iPFK-2 (B), (\sqbullet). Se
recogieron las células K562 del cultivo en fase de crecimiento
exponencial en medio RPMI enriquecido con FBS al 10% y a
continuación se lavaron y se volvieron a suspender en PBS (1 x
10^{7} células/ml). Se inyectaron grupos de 5 ratones atímicos
hembra BALB/c (20 g) (Harlan Labs) por vía s. c. con 0,10 ml de la
suspensión de K562 (1 x 10^{6} células). Se dejaron crecer los
tumores durante 7 días hasta un peso medio de 0,4 g antes de
iniciar el tratamiento. Se implantaron unas bombas microosmóticas
Alzet (Alza Corporation, Palo Alto, CA) cargadas con 0,1 ml de PBS
o los oligonucleótidos de fosforotioato
S-iPFK-2 (B) o
AS-iPFK-2 (B) (3,0 mM en PBS, véase
el ejemplo 4 para las secuencias) por vía s. c. en los ratones que
presentaban tumores. Se determinó el tamaño de los tumores tras 0,
1, 2, 3 y 4 días con un pie de rey según la fórmula siguiente: peso
(mg) = (anchura, mm^{2} x (longitud, mm^{2}) (Taetle et
al., Cancer Trmt. Reports 71: 297-304,
1987). La figura 5 muestra cómo los oligonucleótidos antisentido
que presentaban una actividad antagonista de la
iPFK-2 presentaban asimismo una actividad
terapéutica antineoplásica. Por lo tanto, los antagonistas de la
iPFK-2 resultan útiles en el tratamiento del
cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra cómo la
endotoxinemia provoca la expresión del ARNm de la
iPFK-2 de ratones en el bazo y el músculo. Se
inyectaron unos ratones BALB/c (19-20 g) de 10
semanas de edad por vía i. p. con LPS (12,5 mg/kg) o disolución
salina como control. Tras 6 y 24 horas se sacrificaron los ratones
mediante asfixia con CO_{2} y se retiraron el cerebro, el hígado,
los músculos de las extremidades inferiores y el bazo mediante
disección. Se realizó la extracción del ARN total y un análisis de
inmunoelectrotransferencia de tipo Northern utilizando una sonda de
ADNc específica de la iPFK-2 de ratón (amplificada a
partir de un ADNc de macrófago peritoneal de ratón mediante 30
ciclos de RT-PCR utilizando los siguientes
iniciadores específicos de la iPFK-2 humana:
5'-TGAGGCA
GACGTGTCGGTTC-3' [SEC ID N.º 25], 5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3' [SEC ID N.º 26]).
GACGTGTCGGTTC-3' [SEC ID N.º 25], 5'-CAGCAGCTCCAGGAAAGTGT-3' [SEC ID N.º 26]).
Los resultados se presentan en la figura 6 y
demuestran que los LPS provocan la expresión del ARNm de la
iPFK-2 en los tejidos del ratón. Dichos datos
ilustran la importancia farmacológica en el pronóstico de la
iPFK-2 como marcador terapéutico de procesos
inflamatorios.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra cómo la
iPFK-2 se superexpresa en las células mononucleares
de la sangre periférica (PBMC) de pacientes HIV+. Se aisló el ARN
total de tres pacientes sin infectar (carriles 1 a 3) y 5 pacientes
HIV+ (carriles 4 a 8) y se analizaron mediante
RT-PCR con iniciadores específicos de la
\beta-actina (5'-TAAGGA
GAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3' [SEC ID N.º 8], 19 ciclos) e iniciadores específicos de la iPFK-2 (5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGT
GACT-3' [SEC ID N.º 10], 23 ciclos).
GAAGCTGTGCTACG-3' [SEC ID N.º 7], 5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3' [SEC ID N.º 8], 19 ciclos) e iniciadores específicos de la iPFK-2 (5'-ATTGGTCTGGCAACTGCAAA-3' [SEC ID N.º 9], 5'-GGAGCCTCCTATGTGT
GACT-3' [SEC ID N.º 10], 23 ciclos).
Los resultados se presentan en la figura 7 y
demuestran que la iPFK-2 se superexpresa en las PBMC
de pacientes HIV+.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo ilustra la actividad
terapéutica antineoplásica de los antagonistas de la
iPFK-2. Los compuestos a analizar, tales como el
antagonista potencial de la iPFK-2
2,5-anhidro-D-manitol
se utilizan en la inhibición de la actividad enzimática (es decir,
cinasa) de la iPFK-2 utilizando el polipéptido
recombinante de la iPFK-2 tal como se proporciona
en la presente memoria. El
2,5-anhidro-D-manitol,
u otros compuestos a analizar se pueden analizar adicionalmente en
un ensayo in vitro de la actividad terapéutica antineoplásica
que correlaciona la inhibición de la iPFK-2 de la
actividad enzimática cinasa de la iPFK-2 con la
actividad farmacológica antineoplásica. Las células tumorales K562
(1 x 10^{4} células cultivadas en RPMI enriquecido con FBS al
10%) se expusieron a distintas concentraciones de
2,5-anhidro-D-manitol
u otros compuestos a analizar para controlar el azúcar (glucosa)
durante 12 horas. A continuación se utiliza un ensayo de
proliferación celular, por ejemplo, determinando la asimilación de
timidina tritiada, para estimar la proliferación de las células
tumorales. Por lo tanto, este procedimiento ayuda a determinar si un
compuesto a analizar es un antagonista de la
iPFK-2, siendo un antagonista un agente que actúa en
la iPFK-2 para disminuir F2,6 P y/o incrementar el
F6P en el ensayo.
Se realizó asimismo un ensayo adicional de
proliferación de las células tumorales, tal como se ha descrito en
el ejemplo 4, con dos oligonucleótidos antisentido distintos de la
iPFK-2 utilizando la estirpe de células tumorales
de linfocitos T MOLT-4. Tal como se representa en
la figura 9, ambos oligonucleótidos antisentido inhibieron la
proliferación celular y presentaron una actividad terapéutica
antineoplásica en el presente ensayo de pronóstico in
vitro.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Bucala, Richard J. et al.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fosfofructocinasa inducible y el efecto Warberg
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: DAVIS WRIGHT TREMAIN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1501 Fourth Avenue 2600 Century Square
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98101
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- SOPORTE INFORMÁTICO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: a asignar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Oster, Jeffrey B.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 32.585
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 0902WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 206 628 7711
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 206 628 7699
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCGCGAAG ATGCCGTTGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAACGGCAT CTTCGCGGCT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGATGCCGT TGGAACTGAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: oligonucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: hiPFK-2 antisentido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAGTTCCA ACGGCATCTT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGGCAGAC GTGTCGGTTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGCTCC AGGAAAGTGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAGGAGAAG CTGTGCTACG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTCCTTCT GCATCCTGTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTGGTCTGG CAACTGCAAA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGCCTCCT ATGTGTGACT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4121 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iPFK-2 humana
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: secuencia de consulta
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTTATTTAT TTA
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTGTACCA TACCTGAAGC ACAGCCTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCCTGCCG CTCCAGCTCC ATGATCAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAGCTTCT TGGAGATGTA GGTCTTGC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGTTTGGG AGCCTCCTAT GTGTGACT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGCGTCTA CTGATTCCTC CAACTCTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTACCTGT CCTGCGTGTT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTCTCTTT AGGAAGACAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGTCAAAC TGAATGTGTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTCTTGTAG GCAGTAAGTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGCAGTAAG TCTTTATTCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTCAAACT GCCTGTGTCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: polipéptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGQPLLGQACL T
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGGCAGAC GTGTCGGTTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCAGCTCC AGGAAAGTGT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACATATGCCG TTGGAACTGA CGCAGAGC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N.º 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: iniciador de PCR
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N.º 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGATCCTCA CAGGTAGATG GTACGCGGCT
\hfill30
Claims (14)
1. Ensayo de diagnóstico de una neoplasia
maligna que comprende realizar un análisis de identidad de una
secuencia en una muestra de un fluido o tejido corporal o tumoral
para buscar la presencia de secuencias específicas de la
fosfofructocinasa-2 inducible, seleccionadas de
entre el grupo que consiste en las SEC ID N.º 2, 4 y 11.
2. Ensayo de diagnóstico de una neoplasia
maligna según la reivindicación 1, seleccionándose el ensayo de
entre el grupo que consiste en los ensayos de la reacción en cadena
de la polimerasa, las pruebas de inmunoabsorción enzimática
(ELISA), las pruebas de hibridación y combinaciones de las
mismas.
3. Composición farmacéutica antineoplásica que
comprende un oligonucleótido específico antisentido de por lo menos
10 bases complementarias de la secuencia de ADNc de la
fosfofructocinasa-2 [SEC ID N.º 11] y un excipiente
de un oligonucleótido farmacéuticamente aceptable.
4. Composición farmacéutica antineoplásica según
la reivindicación 3, en la que el oligonucleótido antisentido es un
oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia de
oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en:
5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID
N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'
[SEC ID N.º 4].
5. Procedimiento de detección sistemática de
agentes terapéuticos antineoplásicos que inhiben la actividad
enzimática como cinasa de la fosfofructocinasa-2,
que comprende:
- (a)
- expresar un enzima fosfofructocinasa-2 inducible o dominio cinasa del mismo a partir de la secuencia de ADNc [SEC ID N.º 11];
- (b)
- purificar y aislar el enzima fosfofructocinasa-2 inducible o dominio cinasa del mismo expresado;
- (c)
- proporcionar un candidato terapéutico y un sustrato de fructosa-6-fosfato; y
- (d)
- determinar la formación del producto de fructosa-2,6-bisfosfato como medida de la actividad enzimática como cinasa.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, que
comprende además la etapa de determinar que el agente terapéutico
no inhibe la actividad enzimática como cinasa de la
fosfofructocinasa-2 inducible hepática.
7. Anticuerpo que se enlaza con un epítopo de
fosfofructocinasa-2 inducible, comprendiendo el
epítopo una secuencia de aminoácidos que corresponde a los
aminoácidos 505 a 515 de la fosfofructocinasa-2
inducible, descrita en la SEC ID N.º 24.
8. Polipéptido de la
fosfofructocinasa-2 inducible aislado expresado
mediante la secuencia de ADNc descrita en la SEC ID N.º 11.
9. Secuencia de ADN aislada que codifica un
dominio cinasa de un polipéptido de la
fosfofructocinasa-2 inducible que comprende los
pares de bases 47 a 797 de la SEC ID N.º 11.
10. Polipéptido del dominio cinasa de la
fosfofructocinasa-2 inducible aislada expresado
mediante los pares de bases 47 a 797 de la SEC ID N.º 11.
11. Composición farmacéutica antinflamatoria que
comprende un oligonucleótido antisentido específico de por lo menos
10 bases complementarias de dicha secuencia de ADNc de la
fosfofructocinasa-2 inducible [SEC ID N.º 11] y un
excipiente de un oligonucleótido farmacéuticamente aceptable.
12. Composición farmacéutica antinflamatoria
según la reivindicación 11, en la que el oligonucleótido antisentido
es un oligonucleótido con 15 a 50 bases que incorpora una secuencia
de oligonucleótido seleccionada de entre el grupo que consiste en:
5'-CCAACGGCATCTTCGCGGCT-3' [SEC ID
N.º 2], 5'-GTCAGTTCCAACGGCATCTT-3'
[SEC ID N.º 4].
13. Utilización de un antagonista de la
fosfofructocinasa-2 inducible para la realización de
un medicamento para tratar enfermedades inflamatorias,
seleccionándose el antagonista de entre un oligonucleótido
antisentido según las reivindicaciones 11 ó 12 o un anticuerpo
según la reivindicación 7.
14. Utilización de un antagonista de la
fosfofructocinasa-2 inducible para la realización de
un medicamento para tratar el cáncer, seleccionándose el
antagonista de entre un oligonucleótido antisentido según las
reivindicaciones 11 ó 12 o un anticuerpo según la reivindicación
7.
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