ES2247783T3 - Diagnosis y tratamiento de transtornos relacionados con aur1 y/o aur2. - Google Patents
Diagnosis y tratamiento de transtornos relacionados con aur1 y/o aur2.Info
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Abstract
Un oligonucleótido antisentido en donde el oligonucleótido antisentido está comprendido por una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada del grupo formado por ID DE SEC NO:30, ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC.
Description
Diagnosis y tratamiento de trastornos
relacionados con AUR1 y/o AUR2.
Esta solicitud es una continuación en parte de la
Solicitud de Patente Estadounidense de número de serie por asignar
(Lyon & Lyon Docket No. 229/022), archivada el 9 de Enero de
1998, por Plowman et al., y titulada "Trastornos
relacionados con AUR1 y/o AUR2" la cuál es en parte una
continuación de Solicitud de Patente Estadounidense de número de
serie 08/755, 728 (Lyon & Lyon Docket No. 223/113), archivada el
25 de noviembre de 1996, por Plowman et al., y titulada
"Diagnosis y Tratamiento de los trastornos relacionados con AUR1
y/o AUR2", y se relaciona con la aplicación estadounidense
patentada con número de serie 60/008, 809 archivada el 18 de
diciembre de 1995, y la Solicitud de Patente estadounidense con
número de serie 60/023, 943, archivada el 14 de agosto de 1996,
todas la cuáles han sido incorporadas aquí por referencia en su
totalidad, incluyendo las figuras.
La presente invención se relaciona con las
novedosas proteínas llamadas AURORA UNO y AURORA DOS ("AUR1 y
AUR2"), las secuencias de nucleótidos que codifican AUR1 y/o
AUR2, así como también varios productos y métodos útiles para la
diagnosis y tratamiento de varias dolencias y enfermedades
relacionadas con AUR1 y/o AUR2.
La siguiente descripción del marco de la
invención se proporciona para ayudar a entender la invención pero no
se admite como un arte anterior a ésta.
La transducción de la señal celular es un
mecanismo fundamental a través del cuál los estímulos externos que
regulan diversos procesos celulares son transmitidos al interior de
las células.
Uno de los mecanismos bioquímicos clave de
transducción de señal implica la fosforilación reversible de
proteínas, el cuál permite la regulación de la actividad de las
proteínas maduras mediante la alteración de su estructura y
fun-
ción.
ción.
Las proteínas quinasa mejor conocidas en
eucariotas fosforilan proteínas en algunos de los alcoholes de los
residuos de serina, treonina y tirosina. Estas quinasas
mayoritariamente se incluyen en dos grupos, aquéllas específicas
para la fosforilación de serinas y treoninas, y aquéllas específicas
para la fosforilación de tirosinas. Algunas quinasas, llamadas
quinasas de "doble especificidad", son capaces de fosforilar
residuos de tirosina así como también de serina/treonina.
Las proteínas quinasa pueden ser caracterizadas
también por su localización en la célula. Algunas quinasas son
proteínas de tipo de receptor transmembranal capaces de alterar
directamente su actividad catalítica en respuesta al ambiente
externo tal como el cierre de un ligando. Otras son proteínas de
tipo no-receptor careciendo de ningún dominio
transmembrana. Se pueden encontrar en varios compartimentos
celulares, desde la superficie interna de la membrana celular hasta
el núcleo.
Muchas quinasas están involucradas en cascadas
reguladoras dónde sus sustratos pueden incluir otras quinasas, las
actividades de las cuáles están reguladas por su estado de
fosforilación. En última instancia la actividad de algún causante
del efecto cascada está modulada por la fosforilación resultante de
la activación de una vía como ésta.
La familia serina/treonina quinasa incluye
miembros encontrados en todos los pasos de varias cascadas de señal,
incluyendo aquellas involucradas en el control del crecimiento de la
célula, migración, diferenciación y secreción de hormonas,
fosforilación de factores de transcripción dando como resultado la
expresión alterada del gen, contracción muscular, metabolismo de la
glucosa, control de la síntesis de proteínas celulares, y regulación
del ciclo celular.
Las anormalidades cromosómicas son un sello del
cáncer humano, reflejando las perjudiciales consecuencias de la
ganancia o pérdida de información genética (Mitelman et al.,
Nature Genet. 15:417-474, 1997; Hartwell et
al., Science 266:1821-1828, 1994). Algunos de
estos defectos podrían tener una función causal en la transformación
celular debido a la pérdida de un regulador negativo del
crecimiento, pérdida de un gen responsable del mantenimiento de la
integridad del genoma, o a través de la amplificación o activación
de un oncogen (Kinzler et al., Nature
386:761-763, 1997; Hunter Cell
88:333-346, 1997). Otra posibilidad sería que estas
anormalidades pudieran ser una consecuencia de la progresión tumoral
dónde los controles mitóticos han sido perturbados, causando núcleos
anormales, cromosomas perdidos en la segregación, y aneuploidia
(Elledge Science 274:1664-1672, 1996; Ser Science
274:1672-1677, 1996).
La presente invención está relacionada en parte
con lospolipéptidos AUR1 y/o AUR2, ácidos nucleicos codificadores
de tales polipéptidos, células, tejidos y animales que contienen
tales ácidos nucleicos, anticuerpos para dichos polipéptidos,
ensayos utilizando tales polipéptidos, y métodos relacionados con
todos los anteriores. La utilidad de la presente invención incluye
la capacidad para investigar si hay inhibidores del crecimiento
celular y terapias con pequeñas moléculas para tratar los
cánceres.
Así, en primer término, la invención destaca un
ácido nucleico aislado, enriquecido, o purificado, que codifica un
polipéptido AUR1 y/o AUR2.
Por "aislado" en referencia a un ácido
nucleico se entiende un polímero de 6 o más nucleótidos
(preferiblemente 21, aun mejor 39, y más preferiblemente 75)
conjugados uno al otro, incluyendo DNA y RNA que está aislado de una
fuente natural o que está sintetizado. En ciertas realizaciones de
la invención, son preferibles ácidos nucleicos más largos, por
ejemplo aquellos de 300, 600, 900 o más nucleótidos y/o aquellos que
tienen al menos un 50%, 60%, 75%, 90%, 95% o un 99% de identidad en
relación con la secuencia de longitud completa mostrada en ID DE SEC
NO:1 o ID DE SEC NO:2. El ácido nucleico aislado de la presente
invención es único en el sentido que no se encuentra en estado puro
o separado en la naturaleza. El uso del término "aislado"
indica que una secuencia ocurrida de forma natural ha sido extraída
de su ambiente celular normal (por ejemplo, cromosómico). Así, la
secuencia podría estar en una solución sin células o colocada en un
ambiente celular diferente. El término no implica que la secuencia
sea la única cadena nucleótida presente, pero sí que es
esencialmente libre (al menos sobre un 90-95% de
pureza) de material no nucleótido naturalmente asociado con ésta, y
así se diferencia de cromosomas aislados.
Por el uso del término "enriquecido" en
referencia a ácido nucleico significa que la secuencia específica de
DNA o RNA constituye una fracción significativamente mayor
(2-5 veces) en el DNA o RNA total presente en las
células o la solución de interés que en células normales o enfermas
o en las células de las cuáles se extrajo la secuencia. Esto podría
ser causado por una persona por reducción preferencial en la
cantidad de otro DNA o RNA presente, o por un incremento
preferencial en la cantidad de la secuencia del DNA o RNA
específico, o por una combinación de las dos. Sin embargo, se debe
comentar que enriquecido no implica que no haya presentes otras
secuencias de DNA o RNA, sólo que la cantidad relativa de la
secuencia de interés ha sido incrementada significativamente. El
término significativo aquí es usado para indicar que el nivel de
incremento es útil para la persona que está haciendo tal incremento,
y generalmente significa un incremento relativo a otros ácidos
nucleicos de aproximadamente al menos el doble, preferiblemente de
al menos de 5 a 10 veces o incluso más. El término tampoco implica
que no haya DNA o RNA de otras fuentes. La otra fuente de DNA podría
comprender, por ejemplo, DNA de un genoma de levadura o bacteriano,
o un vector de clonación como el pUC19. Este término se diferencia
de acontecimientos ocurridos naturalmente, tales como infección
viral, o crecimientos tipo tumorales, en los cuáles el nivel de un
mRNA puede ser incrementado naturalmente en relación a otras
especies de mRNA. Es decir, el término cubre sólo aquellas
situaciones en las que una persona ha intervenido para elevar la
proporción del ácido nucleico deseado.
Es también ventajoso para algunos propósitos que
la secuencia nucleotídica esté en forma purificada. El término
"purificado" en referencia a ácido nucleico no requiere
absoluta pureza (tal como una preparación homogénea). En lugar de
esto, representa una indicación de que la secuencia está
relativamente más pura que en el medio natural (comparado con el
nivel natural este nivel sería de al menos 2-5 veces
mayor, por ejemplo, en términos de mg/mL).
Clones individuales aislados de una biblioteca de
cDNA pueden purificarse hasta homogeneidad electroforética. Dichas
moléculas de DNA obtenidas a partir de estos clones podrían ser
obtenidas directamente a partir de DNA total o de RNA total. Los
clones de cDNA no se dan naturalmente, pero mejor dicho son
preferiblemente obtenidos mediante la manipulación de una sustancia
naturalmente producida (RNA mensajero) parcialmente purificada. La
construcción de una biblioteca de cDNA a partir de mRNA implica la
creación de una sustancia sintética (cDNA) y los clones de cDNA
puros e individuales pueden ser aislados de la biblioteca sintética
por selección clonal de las células que portan la biblioteca cDNA.
Así, el proceso que incluye la construcción de una biblioteca de
cDNA a partir de mRNA y el aislamiento de diferentes clones de cDNA
da como resultado una purificación del mensaje original de
aproximadamente 106 veces.
De esta manera, la purificación de al menos un
orden de magnitud está expresamente contemplada, preferiblemente de
dos o tres órdenes, y aun mejor de cuatro o cinco órdenes de
magnitud.
Por "un polipéptido AUR1 y/o AUR2" se
entienden 25 (preferiblemente 30 o 35 o aun mejor 40) o más
aminoácidos contiguos expuestos en la totalidad de la longitud de la
secuencia de aminoácidos de ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4, o una
derivación funcional de la misma como se describe aquí. En ciertos
aspectos, se prefieren polipéptidos de 100, 200, 300 o más
aminoácidos. El polipéptido AUR1 y/o AUR2 puede estar codificado por
una secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa o alguna
porción de la secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa,
tan larga que tiene la actividad funcional del polipéptido.
También se incluyen mutantes activados e
inactivos de AUR1 y/o AUR2, incluyéndose, pero no limitados a
aquellos definidos en el Ejemplo 11. Por "inactivo" se entiende
un polipéptido AUR1 y/o AUR2 que carece de actividad quinasa. En
algunas realizaciones, la lisina esencial (residuo 162) está mutada.
Preferiblemente el polipéptido se mantiene, de lo contrario,
invariable. Por "activado" se entiende un polipéptido AUR1 y/o
AUR2 que tiene actividad quinasa in vitro, preferiblemente en
situaciones donde el polipéptido no mutado no la tiene.
Preferentemente, el polipéptido AUR1 y/o AUR2 es
mutado para limitar la fosforilación constitutiva. En algunas
realizaciones, la treonina del residuo 288 en la región de
activación está modificada a un ácido aspártico.
La secuencia de aminoácidos será sustancialmente
similar a la secuencia mostrada en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4,
o fragmentos del mismo. Una secuencia que es sustancialmente similar
tendrá preferentemente al menos un 90% de identidad (mejor de al
menos un 95% y aun mejor de un 99-100%) con la
secuencia de ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4.
Por "identidad" se entiende una propiedad de
las secuencias que mide su similitud o relación. La identidad se
mide dividiendo el número de residuos idénticos entre el número
total de residuos y multiplicando el producto por 100. De esta
manera, dos copias exactamente con la misma secuencia tienen una
identidad del 100%, pero secuencias que no son tan altamente
conservadas, y tienen deleciones, adiciones, o reemplazos, tendrían
un menor grado de identidad. Aquellos expertos en el tema
reconocerán que se pueden conseguir diversos programas de ordenador
para determinar la identidad de la secuencia.
En una realización preferente, la invención
presenta una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia
nucleotídica que: (a) codifica un polipéptido que tiene la secuencia
de aminoácidos de longitud completa expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID
DE SEC NO:4; (b) es el complemento de la secuencia nucleotídica de
(a); (c) se hibrida bajo condiciones muy estrictas a la molécula de
ácido nucleico de (a) y codifica un polipéptido AUR1 y/o AUR2 que se
produce naturalmente; (d) codifica un polipéptido AUR1 y/o AUR2
teniendo la secuencia de aminoácidos de longitud completa expuesta
en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4 excepto que le faltan uno o más
de los siguientes segmentos de residuos de aminoácidos:
1-73, 74-271, o
272-344 de ID DE SEC NO:3, o 1-129,
130-274, o 275-403 de ID DE SEC
NO:4; (e) es el complemento de la secuencia nucleotídica de (d); (f)
codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos
expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4 desde los residuos de
aminoácidos 1-73, 74-271, o
272-344 de ID DE SEC NO:3, o 1-129,
130-274, 275-403 de ID DE SEC NO:4;
(g) es el complemento de la secuencia nucleotídica de (f); (h)
codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de
longitud completa mostrada en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4
excepto que le faltan uno o más de los dominios seleccionados desde
el grupo consistente en un dominio C-terminal, un
dominio catalítico, y un dominio N-terminal; o (i)
es el complemento de la secuencia nucleotídica de (h).
El término "complemento" se refiere a dos
nucleótidos que pueden formar múltiples interacciones favorables el
uno con el otro. Por ejemplo, la adenina es complementaria a la
timina de manera que pueden formar dos enlaces de hidrógeno.
Similarmente, la guanina y la citosina son complementarias ya que
pueden formar tres enlaces de hidrógeno. Una secuencia nucleotídica
es el complemento de otra secuencia nucleotídica si todos los
nucleótidos de la primera secuencia son complementarios a todos los
nucleótidos de la segunda secuencia.
El término "dominio" se refiere a una región
de un polipéptido que contiene una función particular. Por ejemplo,
los dominios N-terminal o C-terminal
de las proteínas de transducción de señal pueden cumplir funciones
incluyendo, pero no exclusivamente, unión de moléculas que localizan
la molécula de transducción de señal en diferentes regiones de la
célula o unión de otras moléculas señal directamente responsables de
la propagación de una señal celular particular. Algunos dominios
pueden ser expresados separadamente del resto de la proteína y
funcionan por sí mismos, mientras otros deben quedarse parte de la
proteína intacta para conservar la función. Éstos últimos son
llamados regiones funcionales de las proteínas y también están
relacionados con los dominios.
El término "dominio
N-terminal" se refiere a una porción de la
longitud total de la secuencia de aminoácidos que abarca desde el
amino terminal hasta el principio del dominio catalítico. El dominio
N-terminal abarca los residuos de aminoácidos
1-73 de la secuencia expuesta en ID DE SEC NO:3 o
los aminoácidos 1-130 de la secuencia mostrada en ID
DE SEC NO:4.
El término "dominio catalítico" se refiere a
una porción de la secuencia de aminoácidos de longitud completa que
no contiene el dominio N-terminal o el dominio
C-terminal y tiene actividad catalítica. El dominio
catalítico abarca residuos de aminoácidos 73-271 de
la secuencia mostrada en ID DE SEC NO:3 o residuos
130-274 de la secuencia mostrada en ID DE SEC
NO:4.
El término "dominio
C-terminal" se refiere a una porción de la
secuencia de aminoácidos de longitud completa que empieza al final
del dominio catalítico y acaba en el aminoácido carboxilo terminal,
el cuál es el último aminoácido codificado antes del codón de parada
en la secuencia de ácidos nucleicos. El dominio
C-terminal abarca los residuos de aminoácidos
272-344 de la secuencia mostrada en ID DE SEC NO:3 o
los aminoácidos 275-403 de la secuencia expuesta en
ID DE SEC NO:4.
En realizaciones preferentes, el ácido nucleico
aislado comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una
secuencia de aminoácidos expuesta en ID DE SEC NO:1 o ID DE SEC
NO:2, codifica la secuencia de aminoácidos de longitud completa de
ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4, una derivación funcional de la
misma, o al menos 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200 o 300 aminoácidos
contiguos de la misma. Los polipéptidos AUR1 y/o AUR2 comprenden,
consisten esencialmente en, o están formados por al menos 25, 30,
35, o 40 aminoácidos contiguos de un polipéptido AUR1 y/o AUR2. El
ácido nucleico puede ser aislado de una fuente natural por clonación
de cDNA o por hibridación sustractiva. La fuente natural podría ser
sangre, semen o tejido de mamífero, preferiblemente humano, y el
ácido nucleico podría ser sintetizado por el método triéster o
usando un sintetizador de DNA automatizado.
En otras realizaciones preferentes, el ácido
nucleico es una región conservada o única, por ejemplo aquellos
útiles para: el diseño de pruebas de hibridación para facilitar la
identificación y clonación de polipéptidos adicionales, el diseño de
pruebas PCR para facilitar la clonación de polipéptidos adicionales,
obtención de anticuerpos para regiones polipeptídicas, y diseño de
oligonucleótidos antisentido. Ejemplos de secuencias de aminoácidos
de la presente invención incluyen las secuencias de aminoácidos
siguientes (los ácidos nucleicos aislados, purificados o
enriquecidos que los codifican están también dentro del espectro de
la presente invención): ENSYPWPYGRQ (ID DE SEC NO:5), CISGP (ID DE
SEC NO:6), QFPQ (ID DE SEC NO:7), VNSGQ (ID DE SEC NO:8),
RKEPVTPSA-LV (ID DE SEC NO:9), LMSRSNVQPTAAP (ID DE
SEC NO:10), VQNQKQKQLQATSVPH (ID DE SEC NO:11), PVSRPLNNTQK (ID DE
SEC NO:12), VMENSSGTPD (ID DE SEC NO:13), ILTRHFTID (ID DE SEC
NO:14), y SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK (ID DE SEC NO:15).
Por "regiones de ácido nucleico
conservadas", se entienden regiones presentes en dos o más ácidos
nucleicos que codifican un polipéptido AUR1 y/o AUR2, al cuál se
puede hibridar una secuencia de ácidos nucleicos particular bajo
condiciones de baja severidad. Ejemplos de condiciones de baja
severidad adecuadas para la investigación de ácidos nucleicos que
codifican polipéptidos AUR1 y/o AUR2 pueden encontrarse en Abe et
al. J. Biol. Chem. 19:13361-13368, 1992 (por la
presente incorporado por referencia aquí en su totalidad, incluyendo
las figuras). Preferentemente, las regiones conservadas difieren en
no más de 5 a 20 nucleótidos.
Por "región única de ácidos nucleicos" se
entiende una secuencia presente en una ácido nucleico de longitud
completa que codifica un polipéptido AUR1 y/o AUR2 que no está
presente en una secuencia que codifica cualquier otro polipéptido de
producción natural. Estas regiones comprenden preferentemente de 30
a 45 nucleótidos contiguos presentes en la cadena de longitud
completa de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido AUR1 y/o
AUR2. En particular, una región de ácido nucleico única es
preferentemente de origen mamífero.
En una realización preferente, la molécula de
ácido nucleico aislado, enriquecido o purificado que codifica el
polipéptido AUR1 y/o AUR2, comprende un vector o promotor efectivo
para iniciar la transcripción en una célula huésped.
La invención también presenta una sonda de ácido
nucleico para la detección del ácido nucleico que codifica un
polipéptido AUR1 y/o AUR2 en una muestra. La sonda de ácido nucleico
contiene una secuencia nucleotídica base que se hibridará con una
secuencia expuesta en ID DE SEC NO:1 o ID DE SEC NO:2 o una
derivación funcional de la misma.
En realizaciones preferentes la sonda de ácido
nucleico se hibrida a un ácido nucleico que codifica al menos 12,
75, 90, 105, 120, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos contiguos de
la secuencia de longitud completa expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE
SEC NO:4 o un derivado funcional de la misma. Varias condiciones de
hibridación de severidad baja o alta podrían ser utilizadas
dependiendo de la especificidad y selectividad deseadas. Bajo
estrictas condiciones de hibridación sólo se hibridan secuencias de
ácidos nucleicos altamente complementarias. Preferentemente, tales
condiciones previenen de la hibridación de ácidos nucleicos con 1 o
2 desajustes por cada 20 nucleótidos contiguos.
Por condiciones estrictas del ensayo de
hibridación se entienden condiciones de ensayo de hibridación al
menos tan estrictas como las siguientes: hibridación en formamida
50%, 5X SSC, 50 mM NaH2PO4, pH 6,8, 0,5% SDS, 0,1 mg/mL de DNA de
esperma de salmón sonicado, y 5X solución de Denhart a 42ºC durante
toda la noche; lavado con 2X SSC, 0,1% SDS a 45ºC; y lavado con 0,2X
SSC, 0,1% SDS a 45ºC.
Los métodos para usar las sondas incluyen la
detección de la presencia o la cantidad de AUR1 y/o AUR2 en una
muestra por contacto de la muestra con una sonda de ácido nucleico
bajo condiciones tales que se de la hibridación y detectando la
presencia o la cantidad de la sonda ligada al RNA de AUR1 y/o AUR2.
El dúplex de ácido nucleico formado entre la sonda y una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AUR1 y/o AUR2 podría
utilizarse en la identificación de la secuencia del ácido nucleico
detectado (Nelson et al., en Nonisotopic DNA Probe
Techniques, Academia Press, San Diego, Kricka, ed., p. 275, 1992,
incorporado por la presente por referencia aquí en su totalidad,
incluyendo las figuras). Los kits para llevar a cabo tales métodos
podrían ser construidos para incluir un recipiente destinado a tener
depositado una sonda de ácido nucleico.
La invención también presenta el ácido nucleico
recombinante, preferentemente en una célula o un organismo. El ácido
nucleico recombinante podría contener una secuencia expuesta en ID
DE SEC NO:1 o ID DE SEC NO:2 o un derivado funcional de la misma y
un vector o un promotor efectivo para iniciar la transcripción en
una célula huésped. El ácido nucleico recombinante puede contener
alternativamente una región de iniciación transcripcional funcional
en una célula, una secuencia complementaria a una secuencia de RNA
que codifica un polipéptido AUR1 y/o AUR2 y una región de
terminación transcripcional funcional en una célula.
Por otro lado, la invención describe una célula
recombinante o tejido que contiene ácidos nucleicos que codifican un
polipéptido AUR1 y/o AUR2. En tales células, el ácido nucleico
podría estar bajo el control de sus elementos reguladores del genoma
incluyendo un promotor exógeno. Por "exógeno" se entiende un
promotor que normalmente in vivo no está unido
transcripcionalmente a la secuencia codificante del polipéptido AUR1
y/o AUR2.
El polipéptido es preferentemente un fragmento de
la proteína codificada por la secuencia de longitud completa de
aminoácidos expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4. Por
"fragmento" se entiende una secuencia de aminoácidos presente
en un polipéptido AUR1 y/o AUR2 de longitud completa que no está
presente en ningún otro polipéptido de producción natural.
Preferentemente, dicha secuencia comprende 12 aminoácidos contiguos
presentes en la secuencia completa. Incluso más preferentemente,
dicha secuencia comprende 18 aminoácidos contiguos presentes en la
secuencia completa.
En otro aspecto la invención presenta un
polipéptido AUR1 y/o AUR2 aislado, enriquecido o purificado.
Por "aislado" en referencia a un polipéptido
se entiende un polímero de 2 (preferiblemente 7, mejor 13 y aun
mejor 25) o más aminoácidos conjugados unos con los otros,
incluyendo polipéptidos que han sido aislados de una fuente natural
o que son sintéticos. En ciertos aspectos se prefieren los
polipéptidos más largos, como aquellos con 402, 407, 413, o 425
aminoácidos contiguos expuestos en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4.
Los polipéptidos aislados de la presente invención son únicos en el
sentido que no se encuentran en estado separado o puro en la
naturaleza. El uso del término "aislado" indica que una
secuencia creada de manera natural ha sido extraída de su entorno
celular normal. Así, la secuencia podría estar en una solución libre
de células o puesta en un ambiente celular diferente. El término no
implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos
presente, pero sí que ésta es esencialmente libre (de al menos un
90-95% de pureza aproximadamente) de material no
aminoacídico naturalmente asociado con éste.
El uso del término "enriquecido" en
referencia a un polipéptido significa que la secuencia de
aminoácidos específica constituye una fracción significativamente
mayor (de 2 a 5 veces) del total de aminoácidos presentes en las
células o de la solución de interés que en células normales o
enfermas o que en las células de las cuáles fue extraída la
secuencia. Esto podría ser causado por una persona por reducción
preferencial en la cantidad de otros aminoácidos presentes, o por un
incremento preferencial en la cantidad de la secuencia específica de
aminoácidos de interés, o por una combinación de las dos. Sin
embargo, se debe comentar que enriquecido no implica que no haya
otras secuencias de aminoácidos presentes, sólo que la cantidad
relativa de la secuencia de interés ha sido incrementada
significativamente. El término significativo aquí es usado para
indicar que el nivel de incremento es útil para la persona que está
haciendo tal incremento, y generalmente significa un incremento
relativo a otros aminoácidos de aproximadamente al menos el doble,
preferiblemente de al menos de 5 a 10 veces o incluso más. El
término tampoco implica que no haya aminoácidos de otras fuentes. La
otra fuente de aminoácidos podría comprender, por ejemplo,
aminoácidos codificados por un genoma de levadura o bacteriano, o un
vector de clonación como el pUC19. El término cubriría tan sólo
aquellas situaciones en las que el hombre ha intervenido para elevar
la proporción del aminoácido deseado.
También es ventajoso para algunos propósitos el
que una secuencia de aminoácido esté en forma purificada. El término
"purificado" en referencia a un polipéptido no requiere
absoluta pureza (tal como una preparación homogénea). En lugar de
esto, representa una indicación de que la secuencia está
relativamente más pura que en el medio natural. Comparado con el
nivel natural este nivel sería de al menos 2-5 veces
mayor, por ejemplo, en términos de mg/mL. Una purificación al menos
de un orden de magnitud, preferentemente dos o tres órdenes, y aun
mejor de cuatro o cinco órdenes de magnitud está expresamente
contemplado. La sustancia está preferentemente libre de
contaminación a un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo
de un 90%, 95%, o 99% de pureza.
En realizaciones preferidas, el polipéptido AUR1
y/o AUR2 contiene al menos 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250,
300, o 350 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud
completa expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4, o una
derivación funcional de la misma.
También se incluyen mutantes activados e
inactivos de AUR1 y/o AUR2, incluyéndose, pero no limitados a
aquellos definidos en el Ejemplo 11. Por "inactivo" se entiende
un polipéptido AUR1 y/o AUR2 que carece de actividad quinasa. En
algunas realizaciones, la lisina esencial (residuo 162) está mutada.
Preferiblemente el polipéptido se mantiene, de lo contrario,
invariable.
Por "activado" se entiende un polipéptido
AUR1 y/o AUR2 que tiene actividad quinasa in vitro,
preferiblemente en situaciones donde el polipéptido no mutado no la
tiene.
Preferentemente, el polipéptido AUR1 y/o AUR2
está mutado para imitar una fosforilación constitutiva. En algunas
realizaciones, la treonina del residuo 288 en la región de
activación está modificada a un ácido aspártico.
El polipéptido puede ser aislado de una fuente
natural por métodos conocidos. La fuente natural podría ser sangre,
semen o tejido de mamífero, preferiblemente humano, y el polipéptido
podría ser sintetizado utilizando un sintetizador de polipéptidos
automatizado.
En una realización preferente, la invención
presenta un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos de longitud completa
expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4; (b) la secuencia de
aminoácidos de longitud completa expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE
SEC NO:4 excepto que le faltan uno o más de los siguientes segmentos
de residuos de aminoácidos: 1-73,
74-271, o 272-344 de ID DE SEC
NO:3, o 1-129, 130-274, o
275-403 de ID DE SEC NO:4; (c) la secuencia de
aminoácidos expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4 desde los
residuos de aminoácidos 1-73,
74-271, o 272-344 de ID DE SEC NO:3,
o 1-129, 130-274,
275-403 de ID DE SEC NO:4; o (d) la secuencia de
aminoácidos de longitud completa expuesta en ID DE SEC NO:3 o ID DE
SEC NO:4 excepto que le faltan uno o más de los dominios
seleccionados desde el grupo consistente en un dominio
C-terminal, un dominio catalítico, y un dominio
N-terminal.
En algunas realizaciones la invención incluye un
polipéptido AUR1 y/o AUR2 recombinante. Por "polipéptido AUR1 y/o
AUR2 recombinante" se entiende un polipéptido producido por
técnicas de DNA recombinante de manera que éste es diferente de un
polipéptido producido naturalmente tanto en su localización (por
ejemplo, presente en una célula o tejido diferente del que se
encuentra en la naturaleza), como en su pureza o en su estructura.
Generalmente, dicho polipéptido recombinante estará presente en una
célula en una cantidad diferente de la que normalmente se observa en
la naturaleza.
Por otro lado, la invención presenta un
anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal) que
tiene afinidad para la unión específica con un polipéptido AUR1 y/o
AUR2 o un fragmento o dominio del polipéptido AUR1 y/o AUR2. Por
"afinidad de unión específica" se entiende que el anticuerpo se
une al polipéptido blanco (AUR1 y/o AUR2) con mayor afinidad que con
la que se une a otros polipéptidos bajo condiciones específicas.
El término "policlonal" se refiere a
anticuerpos que son poblaciones heterogéneas de moléculas de
anticuerpo derivadas de suero de animales inmunizados con un
antígeno o una derivación antigénica funcional del mismo. Para la
producción de anticuerpos policlonales, varios animales huésped
deben ser inmunizados mediante inyección con el antígeno. Pueden ser
utilizados varios adyuvantes para incrementar la respuesta
inmunológica, dependiendo de las especies huésped.
Los "anticuerpos monoclonales" son
poblaciones sustancialmente homogéneas de anticuerpos para un
antígeno particular. Éstos pueden obtenerse por cualquier técnica
que asegure la producción de moléculas de anticuerpo a través de
líneas celulares continuas en cultivo. Los anticuerpos monoclonales
pueden obtenerse por métodos conocidos por los expertos en el tema.
(Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975, y
Patente Estadounidense No. 4.376.110).
El término "fragmento de anticuerpo" se
refiere a una porción de un anticuerpo, frecuentemente la región
hipervariable y porciones de las cadenas pesada y ligera
circundantes, que manifiesta una afinidad de unión específica para
una molécula en particular. Una región hipervariable es una porción
de un anticuerpo que se une físicamente al polipéptido blanco.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con
afinidad de unión específica a un polipéptido AUR1 y/o AUR2 pueden
ser utilizados en métodos para detectar la presencia y/o cantidad de
polipéptido AUR1 y/o AUR2 en una muestra sondeando la muestra con el
anticuerpo bajo condiciones apropiadas para la formación del
inmunocomplejo AUR1 y/o AUR2-anticuerpo y detectando
la presencia y/o cantidad del anticuerpo conjugado al polipéptido
AUR1 y/o AUR2. Los kits de diagnóstico para llevar a cabo dichos
métodos pueden construirse para incluir anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo específicos para AUR1 y/o AUR2, así como también un
conjugado de una pareja de unión de los anticuerpos o los mismos
anticuerpos.
Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con
afinidad de unión específica a un polipéptido AUR1 y/o AUR2 puede
ser aislado, enriquecido o purificado de un organismo procariota o
eucariota. Los métodos rutinarios conocidos por los expertos en la
materia permiten la producción de anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo, tanto en organismos procariotas como en eucariotas. La
purificación, enriquecimiento, y aislamiento de anticuerpos, que son
moléculas polipeptídicas, se han descrito anteriormente.
Los anticuerpos que tienen afinidad de unión
específica por un polipéptido AUR1 y/o AUR2 pueden ser usados en
métodos para detectar la presencia y/o cantidad de polipéptido AUR1
y/o AUR2 en una muestra mediante el contacto de la muestra con el
anticuerpo bajo condiciones para la formación de un inmunocomplejo y
detectando la presencia y/o cantidad del anticuerpo conjugado con el
polipéptido AUR1 y/o AUR2. Los kits de diagnóstico para llevar a
cabo dichos métodos deben ser construidos para incluir un primer
recipiente que contenga el anticuerpo y un segundo recipiente que
contenga un conjugado de una pareja de unión del anticuerpo y una
marca, como por ejemplo un radioisótopo. El kit de diagnóstico
también puede incluir notificación de uso aprobado por la FDA e
instrucciones para ello.
En otro aspecto, la invención presenta un
hibridoma que produce un anticuerpo que tiene afinidad de unión
específica a un polipéptido AUR1 y/o AUR2 o a un dominio
polipeptídico AUR1 y/o AUR2. Por "hibridoma" se entiende una
línea celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo,
por ejemplo un anticuerpo para AUR1 y/o AUR2. En realizaciones
preferentes el anticuerpo para AUR1 y/o AUR2 comprende una secuencia
de aminoácidos que es capaz de unirse específicamente a un
polipéptido AUR1 y/o AUR2.
Por otro lado, la invención muestra un método
para examinar en busca de células humanas que contengan un
polipéptido AUR1 y/o AUR2 o una secuencia equivalente. El método
implica identificar el polipéptido original en células humanas
usando técnicas que son rutinarias y estándares, como aquellas
descritas aquí para identificar AUR1 y/o AUR2 (por ejemplo,
clonación, análisis por Southern o Northern blot, hibridación in
situ, amplificación por PCR, etc.).
Por otro lado, la invención proporciona un método
para identificar una sustancia capaz de modular la actividad de AUR1
y/o AUR2, que comprende los pasos de (a) contacto del polipéptido
AUR1 y/o AUR2 con una sustancia test; (b) medida de la actividad de
dicho polipéptido; y (c) determinación de si la dicha sustancia
modula la actividad de dicho polipéptido.
El término "modula" se refiere a la
capacidad de un compuesto para alterar la función de AUR1 y/o AUR2.
Preferentemente un modulador activa o inhibe la actividad de AUR1
y/o AUR2 dependiendo de la concentración del compuesto expuesto a
AUR1 y/o AUR2.
El término "activa" se refiere a incrementar
la actividad celular de AUR1 y/o AUR2. El término "inhibir" se
refiere a disminuir la actividad celular de AUR1 y/o AUR2. La
actividad de AUR1 y/o AUR2 es preferentemente la interacción con una
pareja de unión natural.
El término "modula" también se refiere a
alterar la función de AUR1 y/o AUR2 incrementando o disminuyendo la
probabilidad de que se forme un complejo entre AUR1 y/o AUR2 y la
pareja de unión natural. Preferentemente un modulador aumenta la
probabilidad de que dicho complejo se forme entre AUR1 y/o AUR2 y la
pareja de unión natural, más preferentemente incrementa o disminuye
la probabilidad de que se forme un complejo entre AUR1 y/o AUR2 y la
pareja de unión natural dependiendo de la concentración del
compuesto expuesto a AUR1 y/o AUR2, y aún más preferiblemente
disminuye la probabilidad de que se forme un complejo entre AUR1 y/o
AUR2 y la pareja de unión natural.
El término "complejo" hace referencia a un
ensamblaje de al menos dos moléculas unidas una a la otra. Los
complejos de transducción de señal a menudo contienen al menos dos
moléculas proteicas unidas una a la otra. Por ejemplo, una proteína
quinasa receptora de proteína tirosina, GRB2, SOS, RAF, y RAS se
unen para formar un complejo de transducción de señal en respuesta a
un ligando mitógeno.
El término "pareja de unión natural" se
refiere a polipéptidos o ácidos nucleicos que se unen a AUR1 y/o
AUR2 en células. Un cambio en la interacción entre AUR1 y/o AUR2 y
una pareja de unión natural puede manifestarse por sí mismo como una
concentración incrementada o disminuida del complejo AUR1 y/o
AUR2/pareja de unión natural.
El término "contactar" tal y como se usa
aquí se refiere a mezclar una solución que contiene el compuesto
test con un medio líquido que baña las células de los métodos. La
solución que contiene el compuesto debería también contener otro
componente, como dimetilsulfóxido (DMSO), el cuál facilita la
absorción del compuesto o compuestos test hacia el interior de las
células de los métodos. La solución que contiene el compuesto test
puede ser añadida al medio que baña las células mediante el uso un
aparato liberador, como un dispositivo basado en pipeta o un
dispositivo basado en una jeringuilla.
Por otra parte, la invención es útil para el
tratamiento de enfermedades mediante la administración a un paciente
que necesita como tratamiento una sustancia que module la actividad
de AUR1 y/o AUR2. Tales sustancias muestran preferentemente
resultados positivos en uno o más ensayos in vitro para una
actividad correspondiente al tratamiento de la enfermedad o el
trastorno en cuestión (tales como los ensayos descritos en el
ejemplo 13, de más adelante). Ejemplos de sustancias que pueden ser
chequeadas para una actividad favorable se proporcionan en la
sección XI de más abajo. Las enfermedades que pueden ser tratadas
por un modulador de la actividad de AUR1 y/o AUR2 preferentemente
incluyen los cánceres de colon, mama, renal, de ovario, de vejiga,
de cabeza y de cuello, y gliomas, meduloblastomas, condrosarcomas, y
tumores pancreáticos, y preferentemente incluye cánceres de mama, de
colon y renales y aun con mayor preferencia cáncer de colon. Las
sustancias que modulan la actividad de AUR1 y/o AUR2 incluyen
preferentemente, pero no exclusivamente, oligonucleótidos
antisentido, como los descritos aquí, e inhibidores de proteínas
quinasa, como se determinan por los métodos y chequeos descritos
aquí en los Ejemplos.
Otro aspecto de la invención presenta un método
para la detección de aur1 y/o aur2 en una muestra como herramienta
de diagnóstico de enfermedades que comprende los pasos de (a)
contacto de dicha muestra con una sonda de ácido nucleico que se
hibrida, bajo condiciones de ensayo de hibridación, a una región
diana del ácido nucleico de aur1 y/o aur2, dicha sonda comprende la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido AUR1 y/o
AUR2, un fragmento de la misma, o el complemento de dicha secuencia
o fragmento; y (b) detección de la presencia o cantidad de la sonda:
región diana híbrida como una indicación de dicha enfermedad.
La "región diana" de aur1 y/o aur2 es la
secuencia de bases nucleotídicas mostrada en ID DE SEC NO:1 o ID DE
SEC NO:2, un derivado funcional de la misma, o un fragmento de la
misma al cuál la sonda de ácido nucleico se hibridará
específicamente. La hibridación específica indica que en presencia
de otros ácidos nucleicos la sonda sólo se hibrida detectablemente
con la región blanco de aur1 y/o aur2.
Las supuestas regiones diana pueden identificarse
por métodos bien conocidos que consisten en la alineación y
comparación de las secuencias más estrechamente relacionadas en la
base de datos.
En realizaciones preferentes la sonda de ácido
nucleico se hibrida a una región diana de aur1 y/o aur2 que codifica
al menos 12, 75, 90, 105, 120, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos
contiguos de la secuencia de longitud completa mostrada en ID DE SEC
NO:3 o ID DE SEC NO:4 o un derivado funcional de las mismas. Las
condiciones de hibridación deberían ser tales que la hibridación
tuviera lugar sólo con aur1 y/o aur2 en presencia de otras moléculas
de ácidos nucleicos. Bajo condiciones estrictas de hibridación sólo
se hibridan las secuencias de ácidos nucleicos altamente
complementarias. Preferentemente, tales condiciones previenen la
hibridación de ácido nucleicos que tienen 1 o 2 errores por cada 20
aminoácidos contiguos. Tales condiciones se definen como
supra.
Las enfermedades que podrían ser diagnosticadas
mediante la detección de aur1 y/o aur2 en una muestra incluyen
enfermedades en las cuáles el ácido nucleico aur1 y/o aur2 (DNA y/o
RNA) está amplificado en comparación con las células normales. Por
"amplificación" se entiende números incrementados de DNA o RNA
de aur1 y/o aur2 en una célula comparado con células normales. En
células normales, aur1 y aur2 se encuentran como genes copia solos.
En enfermedades seleccionadas, la localización cromosómica de aur1
y/o aur2 está amplificada, resultando en múltiples copias del gen, o
amplificación. La amplificación genética puede llevar a la
amplificación de RNA de aur1 y/o aur2, o el RNA de aur1 y/o aur2
puede ser amplificado en ausencia de amplificación de DNA de aur1
y/o aur2.
"Amplificación" referente a RNA puede ser la
presencia detectable de RNA de aur1 y/o aur2 en células, ya que en
algunas células normales no hay expresión básica de RNA de aur1 y/o
aur2. En otras células normales, existe un nivel básico de expresión
de aur1 y/o aur2, por tanto en estos casos la amplificación es la
detección de al menos 1 o 2 veces, y preferiblemente más, RNA de
aur1 y/o aur2, comparado con el nivel basal.
Las enfermedades que pueden ser diagnosticadas
mediante la detección de aur1 y/o aur2 en una muestra incluyen
preferentemente cánceres de colon, de mama, renal, de ovario, de
vejiga, de cabeza y de cuello, y gliomas, meduloblastomas,
condrosarcomas, y tumores pancreáticos, y con preferencia incluyen
cánceres de mama, de colon y renal, y más preferentemente cáncer de
colon.
Las muestras test apropiadas para los métodos de
sondeo de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, por
ejemplo, células o extractos de ácidos nucleicos de células, o
fluidos biológicos. Las muestras usadas en los métodos descritos
anteriormente variarán según el formato del ensayo, el método de
detección y la naturaleza de los tejidos, las células o extractos a
ser estudiados. Los métodos para preparar extractos de ácidos
nucleicos de células son bien conocidos y pueden ser fácilmente
adaptados para obtener una muestra que sea compatible con el método
utilizado.
Otro aspecto de la invención pone de manifiesto
oligonucleótidos antisentido respecto a las secuencias de ácidos
nucleicos que codifican polipéptidos AUR1 y/o AUR2 expuestos en ID
DE SEC NO:1 y/o ID DE SEC NO:2, y fragmentos de las mismas. En una
invención preferida los oligonucleótidos antisentido son
sintetizados como fosforotionatos. En una realización preferente los
oligonucleótidos antisentido comprenden las siguientes secuencias
5'-3': nucleótidos 1743-1763 de
aur2: CAGGGCAGAGTGGTCACTTTC (ID DE SEC NO:30), nucleótidos
42-62 de aur2: CGTCCGCCACTCCGACCAGCC (ID DE SEC
NO:31), nucleótidos 1654-1674 de aur2:
TGCAGTC
GAACCTTGCCTCCA (ID DE SEC NO:32).
GAACCTTGCCTCCA (ID DE SEC NO:32).
Los oligonucleótidos antisentido de la invención
se usan preferentemente para inhibir la expresión in vivo de
la proteína AUR1 y/o AUR2 en células normales y tumorales. Los
oligonucleótidos antisentido pueden usarse tanto por separado como
en combinación. En una realización preferente, tanto ID DE SEC NO:30
y ID DE SEC NO:32 o ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC NO: 32 se usan
conjuntamente. En una realización preferible, la expresión de AUR2
es significativamente reducida, y más preferiblemente reducida por
debajo de los límites de detección. En otras realizaciones
preferentes, el tratamiento como ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC NO:32
inhibe el crecimiento y/o induce a la apoptosis en células. Los
oligonucleótidos antisentido pueden usarse también para inhibir la
expresión de la proteína AUR1 y/o AUR2 en injertos de células
tumorales humanas en ratones desnudos. Los oligonucleótidos
antisentido pueden ser usados preferentemente como tratamiento en
varios tumores humanos sobreexpresando AUR2.
Oligonucleótidos antisentido adicionales y
combinaciones efectivas pueden ser identificadas por métodos bien
conocidos. Brevemente, las células o tejidos que sobreexpresan aur1
y/o aur2 pueden ser puestos en contacto con oligonucleótidos
antisentido, tanto solos como en combinación, y la expresión del RNA
de aur1 y/o aur2, y/o el polipéptido AUR1 y/o AUR2 puede
determinarse por métodos aquí descritos. Preferentemente, el
tratamiento con aur1 y/o aur2 causa una disminución en la expresión
de RNA de aur1 y/o aur2 y/o el polipéptido AUR1 y/o AUR2,
preferiblemente la expresión es disminuida significativamente (de 1
a 2 veces), y lo más preferible es disminuir la expresión a un nivel
indetectable.
El resumen de la invención descrita anteriormente
no está limitado y otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferibles, y a partir de las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra las secuencias para aur1 y
aur2 humanos deducidas de los clones de cDNA de longitud completa
aislados de bibliotecas normales de duodeno normal, carcinoma
pancreático y carcionoma colorrectal primario. p46B de
Xenopus (PIR:S53343), aurora de Drosophila
(PIR:A56220) e IPL1 de S. cerevesiae
(SWISS-PROT:P38991) están incluidos en el
alineamiento. El alineamiento se generó incluyendo las dos
secuencias murinas (DDBJ:D21099 y GB:U80932), un xenopus
adicional (PIR:S53342), y dos C. Elegans (GB: U53336 y
GB:U97196) como entrada al msa, un programa de alineamiento
paralelo de múltiple secuencia codificada que se ejecutó en el
superordenador MasPar MP2216. Los residuos encajonados son comunes
en tres o más de las secuencias, los residuos ensombreados
representan regiones de aminoácidos de forma similar entre dos o
más secuencias, las líneas de encima corresponden a las secuencias
conservadas Aurora Box1 y Aurora Box2, la flecha denota el
principio del dominio quinasa C-terminal de
serina/treonina, los residuos con un círculo indican la localización
de un polimorfismo simple del nucléotido descrito en el texto,
círculos sólidos corresponden a la localización de varios hongos y
Drosophila mutantes, y las estrellas denotan el sitio de la
quinasa inactivando y activando los puntos mutantes descritos en el
texto.
La presente invención se refiere en parte a los
polipéptidos AUR1 y/o AUR2, ácidos nucleicos que codifican tales
polipéptidos, células que contiene tales ácidos nucleicos,
anticuerpos contra tales polipéptidos, ensayos que utilizan tales
polipéptidos, y métodos relacionados con todo lo anterior.
La presente invención se basa en el aislamiento y
caracterización de nuevas proteínas que hemos designado AUR1 y/o
AUR2. Los polipéptidos y ácidos nucleicos pueden ser producidos
usando técnicas de síntesis estándar y bien conocidas cuando se dan
las secuencias presentadas aquí.
Los equivalentes funcionales de las moléculas de
ácido nucleico aisladas aquí descritas se incluyen en el objetivo de
esta invención son. La degeneración del código genético permite la
sustitución de ciertos codones por otros codones que especifican el
mismo aminoácido y por lo tanto darían ascenso a la misma proteína.
La secuencia de ácidos nucleicos puede variar sustancialmente puesto
que, con la excepción de metionina y triftófano, los aminoácidos
conocidos pueden ser codificados por más de un codón. Así, porciones
o todo el gen AUR1 y/o AUR2 podría ser sintetizado para dar una
secuencia de ácido nucleico significativamente diferente de la que
se muestra en ID de SEC NO:1 o ID de SEC NO:2. La secuencia de
aminoácidos codificada de los mismos, sin embargo, sería
preservada.
Además, la secuencia de ácidos nucleicos puede
comprender una secuencia nucleotídica que resulta de la adición,
supresión o sustitución de al menos un nucleótido al extremo 5' y/o
al extremo 3' de la fórmula de ácido nucleico mostrada en ID de SEC
NO:1 o ID de SEC NO:2 o un derivado de las mismas. Cualquier
nucleótido o polinucléotido puede ser usado en esta consideración, a
condición que su adición, supresión o sustitución no altere la
secuencia de aminoácidos de ID de SEC NO:3 o ID de SEC NO:4 que es
codificada por la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la presente
invención pretende incluir cualquier secuencia de ácido nucleico
resultante de la adición de ATG como un codón de iniciación al
extremo 5' de la secuencia del ácido nucleico inventivo o su
derivado, o de la adición de TTA, TAG o TGA como un codón de
terminación al extremo 3'de la secuencia del ácido nucleico o su
derivado. Además, la molécula de ácido nucleico de la presente
invención puede, como es necesario, tener sitios de restricción de
reconocimiento de endonucleasas adicionados en sus extremos 5' y/0
3'.
Tales alteraciones funcionales de la secuencia de
ácido nucleico dada ofrecen una oportunidad para promocionar la
secreción y/o procesar las proteínas heterólogas codificadas por
secuencias de ácido nucleico fusionadas a ellas. Todas las
variaciones de la secuencia nucleotídica de los genes AUR1 y/o AUR2
y fragmentos de la misma permitidos por el código genético son, en
consecuencia, incluidas en esta invención.
Además, es posible eliminar codones o sustituir
uno o más codones con codones a parte de codones degenerados para
producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero uno que
tenga sustancialmente la misma utilidad o actividad que el
polipéptido producido por la molécula de ácido nucleico no
modificado. Como se ha reconocido en el campo, los dos polipéptidos
son funcionalmente equivalentes, ya que son las dos moléculas de
ácido nucleico que dan ascenso a su producción, aunque las
diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no están
relacionadas con la degeneración del código genético.
Análisis Southern con sondas derivadas de
regiones N-terminales exclusivas de aur1 y aur2
indica que existen como copias de genes individuales en células
humanas. Sin embargo, bajo condiciones poco estrictas, se detectaron
los fragmentos SacI de 1,3 kb y 3,2 kb que hibridan ligeramente a la
sonda aur1.
Una sonda de ácido nucleico de la presente
invención puede ser usada para sondear una biblioteca cromosomal
apropiada o de cDNA mediante métodos de hibridación usuales para
obtener otra molécula de ácido nucleico de la presente invención.
Una biblioteca de DNA cromosomal o cDNA puede ser preparada a partir
de células apropiadas de acuerdo con los métodos reconocidos en el
campo (cf. "Molecular cloning: A laboratory manual", second
edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Sambrook, Fritsch, &
Maniatis, eds., 1989).
Como alternativa, se lleva a cabo la síntesis
química con el fin de obtener sondas de ácido nucleico que tienen
secuencias de nucleótidos que corresponden a porciones N- y
C-terminales de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido de interés. Las sondas de ácido nucleico sintetizadas
pueden ser usadas como cebadores en una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) llevada a cabo de acuerdo con las técnicas de PCR
reconocidas, esencialmente de acuerdo con los protocolos de PCR,
"A guide to Methods and Applications", Academic Press, Michael
et al., eds., 1990, utilizando la biblioteca de cromosomal
apropiada o de cDNA para obtener el fragmento de la presente
invención.
Un experto en el campo puede diseñar
inmediatamente tales pruebas basadas en la secuencia aquí descrita
usando métodos de alineamiento y análisis de secuencia conocidos en
el campo ("Molecular cloning: A laboratory manual", 1989,
supra). Las sondas de hibridación de la presente invención
pueden ser marcadas por técnicas de marcación estándar tales como
radiomarcación, marcación enzimática, marcación fluorescente,
marcación con avidina-biotina, quimioluminiscencia,
y similares. Tras la hibridación, las sondas pueden ser visualizadas
usando métodos conocidos.
Las sondas de ácido nucleico de la presente
invención incluyen RNA, así como sondas de DNA, tales como sondas
que se generan usando técnicas conocidas en el campo. La sonda de
ácido nucleico puede ser inmovilizada en un soporte sólido. Ejemplos
de tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, plásticos
tales como policarbonato, complejo de carbohidratos tales como
agarosa y sefarosa, y resinas acrílicas, tales como poliacrilamida y
cubiertas de látex. Técnicas para el acoplamiento de sondas de ácido
nucleico a tales soportes sólidos son bien conocidos en el
campo.
Las muestras de prueba adecuadas para métodos de
prueba de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, por
ejemplo, células o extractos de ácido nucleico de células, o fluidos
biológicos. Las muestras usadas en los métodos descritos
anteriormente variarán según el formato de ensayo, el método de
detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos a ser
ensayados. Los métodos para preparar extractos de ácidos nucleicos
de células son bien conocidos en el campo y pueden ser
inmediatamente adaptados con el fin de obtener una muestra que sea
compatible con el método utilizado.
El RNA de Aur1 se expresa rápidamente en la
división de células derivadas de ambos tejidos normales y tumorales.
El RNA de Aur2 se expresa en un patrón más restringido, siendo bajo
o ausente en la mayoría de tejidos normales, y abundante solamente
en un subconjunto de líneas celulares derivadas de un tumor,
particularmente aquéllos de origen de colon, renal, melanoma, y de
pecho en que el transcrito aur2 de 2,4 kb se expresa en el 96% (24
de 25). El transcrito aur1 de 1,4 kb se co-expresó a
niveles similares como aur2 en las mismas 24 líneas celulares
tumora-
les.
les.
La expresión del RNA de Aur2 también se
incrementó en aproximadamente el 54% (22/41) de los 41 tumores
colorrectales humanos comparado con los controles colorrectales
normales relacionados. El RNA de Aur2 mostraron 4-28
veces más de sobreexpresión en tumores frente al tejido normal.
Aur1 humano se localiza en el cromosoma 17p13.1 y
aur2 humano en el cromosoma 20q13.2. Los mapas de Aur2 adyacentes al
gen de la hidroxilasa de la vitamina D (CYP 24) y la sonda cósmida
RMC20C001 que se encuentra en Flpter 0,825-0,83
(longitud fraccional del pter) en el cromosoma 20 (Tanner et
al., Cancer res. 54:4257-4260, 1994; Tanner
et al., Cancer Res. 56:3441-3445, 1996).
Ambos de estos marcadores han sido caracterizados por su presencia
en el amplicón 20q13 común a cualquiera de las malignidades humanas,
particularmente aquéllas del pecho, vejiga, y colon (Tanner 1994,
supra; Tanner 1996, supra; Kallioniemi et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2156-2160, 1994;
Yassen et al., Cancere Genet. Cytogenet.
44:83-97, 1990; Muleris et al., Cancer Genet.
Cytogenet. 29 :289-301, 1987; Schlegel et
al., Cancer Res. 55 :6002-6005, 1995; James
et al., Oncogene 14 :1059-1065, 1997;
Solinas-Toldo et al., Cancer Res. 56
:3803-3807, 1996; Larramendy et al., Am. J.
Pathol. 150 :685-691, 1997; Reznikoff et al.,
Semin. Oncol. 23 :571-584, 1996; Courjal et
al., Br. J. Cancer 74 :1984-1989, 1996; Iwabuchi
et al., Cancer Res. 55 :6172-6180, 1995;
Binger et al., Cancer Genet. Cytogenet. 30
:91-101, 1988). Las bandas específicas de aur2
mostraron amplificación en las muestras tumorales.
El DNA de AUR2 se amplificó en 41 de 79 (52%) de
los tumores colorrectales primarios para los que el DNA estaba
disponible para genotipar. Nueve de doce muestras demostraron una
amplificación del DNA de AUR2 2-8 veces mayor en los
tumores comparado con los tejidos normales. Doce de las muestras
mostraron una correlación directa entre la amplificación del DNA y
la sobrepresión del RNA.
Las regiones más comunes de alta amplificación de
la copia en cáncer de mama humano han sido localizadas en 17q22 y
20q13,2 (Tanner 1994, supra, Tanner 1996, supra;
Kallioniemi 1994, supra). La amplificación a bajo nivel de
20q ha sido descrita en 6-18% de cáncer de mama
primario y 40% de líneas celulares de cáncer de mama. La incidencia
incrementa hasta el 60% en cánceres de mama BRCA2 positivos (Tanner
1994, supra; Tanner 1996, supra; Kallioniemi 1994,
supra; Tirkkonen et al., Cancer Res.
57:1222-1227, 1997). Los altos niveles de
amplificación de 20q se correlacionan con la pobre prognosis para
pacientes con cáncer de mama de nódulo negativo (Isola et
al., Am. J. Pathol. 147:905-911, 1995). También
se ha demostrado un nivel de amplificación bajo de 20q en cáncer de
colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, gliomas, meduloblastomas,
condrosarcomas, tumores pancreáticos, y cánceres de cabeza y cuello.
(Yaseen 1990, supra; Muleris 1987, supra; Schlegel
1995, supra; James 1997, supra;
Solinas-Toldo 1996, supra; Bockmuhl 1996,
supra; Larramendy 1997, supra; Reznikoff 1996,
supra; Courjal 1996, supra; Iwabuchi 1995,
supra; Bigner 1988, supra). Varios estudios también
han encontrado ganancias cromosómicas de 20q en aproximadamente el
60% de los carcinomas colorrectales primarios (Yacen, 1990,
supra; Muleris 1987, supra; Schlegel 1995,
supra). Los modelos de cultivo celular han sugerido que el
bajo nivel de amplificación de 20q se asocia con la inmortilización
y el subsiguiente nivel alto de amplificación se correlaciona con la
inestabilidad cromosomal (Savalieva et al., Oncogens
14:551-560, 1997).
El DNA de AUR2 se amplificó en 41 de 79 (52%) de
los tumores colorrectales. El gen CYP24 se coamplificó con aur2 en
37 de 41 (90%) pares relacionados y solamente fue amplificado una
vez en ausencia de amplificación de aur2. La amplificación del DNA
de Aur2 y la sobreexpresión del RNA están altamente correlacionados
(r=0,695). La amplificación del DNA puede ser un mecanismo para la
activación de aur2 y aur2 puede ser el oncogen en 20q13 cuyo alto
nivel de amplificación se correlaciona con el resultado clínico
pobre en una variedad de tumores sólidos (Isola 1995,
supra).
Un método para detectar la presencia de aur1 y/o
aur2 en una muestra comprende (a) contactar dicha muestra con la
sonda de ácido nucleico antes descrita bajo condiciones tales que
tenga lugar la hibridación, y (b) detectar la presencia de dicha
sonda unida a dicha molécula de ácido nucleico.
Un experto en el campo seleccionaría la sonda de
ácido nucleico de acuerdo con técnicas conocidas en el campo como se
ha descrito antes. Muestras para ser probadas incluyen pero no
deberían estar limitadas a muestras de RNA de tejidos humanos.
Un kit para detectar la presencia de aur1 y/o
aur2 en una muestra comprende al menos una forma de envase que tiene
la sonda de ácido nucleico descrita anteriormente dispuesta allí
dentro. El kit además puede comprender otros envases que comprenden
uno o más de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces
de detectar la presencia de la sonda de ácido nucleico unida.
Ejemplos de los reactivos de detección incluyen, pero no se limitan
a sondas marcadas radioactivamente, sondas marcadas enzimáticamente
(peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina), y sondas
marcadas de afinidad (biotina, avidina, o estreptavidina).
Con detalle, un kit compartimentado incluye
cualquier kit en que los reactivos están dispuestos en recipientes
separados. Tales recipientes incluyen recipientes pequeños de
vidrio, recipientes de plástico o bandas de plástico o papel. Tales
recipientes permiten la transferencia efectiva de reactivos de un
compartimento a otro compartimento de forma que las muestras y los
reactivos no se contaminan de manera cruzada y los agentes o
soluciones de cada recipiente se pueden añadir de modo cuantitativo
de un compartimento a otro. Tales recipientes incluirán un
recipiente que aceptará la muestra del test, un recipiente que
contenga la sonda o cebadores usados en el ensayo, recipientes que
contengan reactivos de lavado (tales como fosfatos salinos
tamponados, tampones Tris, y similares), y recipientes que contengan
los reactivos usados para detectar la sonda hibridada, el anticuerpo
unido, el producto amplificado, o similares. Un experto en el campo
rápidamente reconocerá que las sondas de ácido nucleico descritas en
la presente invención pueden ser rápidamente incorporadas en uno de
los formatos del kit que son bien conocidos en el campo.
La presente invención también se refiere a una
molécula de DNA recombianante que comprende, de 5' a 3', un
promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula
huésped y las moléculas de ácido nucleico antes descritas. Además,
la presente invención se refiere a una molécula de DNA recombinante
que comprende un vector y una molécula de ácido nucleico antes
descrita. La presente invención además se refiere a una molécula de
ácido nucleico que comprende una región trasncripcional funcional en
una célula, una secuencia complementaria a una secuencia de RNA que
codifica una secuencia aminoacídica que corresponde al polipéptido
antes descrito, y una región de terminación transcripcional
funcional en dichas células. Las moléculas antes descritas pueden
ser moléculas de DNA aisladas y/o purificadas.
La presente invención se refiere a una célula un
organismo que contiene una molécula de ácido nucleico antes descrita
y por lo tanto es capaz de expresar el péptido. El polipéptido puede
ser purificado a partir de células que han sido alteradas para
expresar el polipéptido. Se dice que una célula es "alterada para
expresar un polipéptido deseado" cuando la célula, a través de
manipulación genética, se hace para producir una proteína que
normalmente no produce o que la célula normalmente produce a niveles
bajos. Un experto en el campo puede adaptar rápidamente
procedimientos para introducir y expresar tanto secuencias
genómicas, de cDNA, con secuencias sintéticas en células eucariotas
y procariotas.
Una molécula de ácido nucleico, tal como DNA, se
dice que es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene
secuencias nucleotídicas que contengan información regulatoria
transcripcional y translacional tales secuencias son
"operablemente unidas" a secuencias de nucleótidos que
codifican el polipéptido. Una unión operable es una unión en que las
secuencias de DNA regulatorias y la secuencia de DNA que pretenden
ser expresadas se unen de manera que permiten la expresión de la
secuencia del gen. La naturaleza precisa las regiones regulatorias
necesarias para la expresión de la secuencia de genes puede variar
de un organismo a otro, pero en general incluirá una región
promotora que, en procariotas, contiene ambas el promotor (que
dirige la iniciación de la transcripción de RNA) así como las
secuencias de DNA que, cuando son transcritas en el RNA, señalarán
la iniciación de la síntesis. Tales regiones normalmente incluirán
aquellas secuencias no codificantes en 5' implicadas en la
iniciación de la transcripción y translación, tales como la TATA
box, secuencias cappa, secuencia CAAT, y similares.
Si se desea, la región 3' no codificante hasta la
secuencia que codifica un polipéptido AUR1 y/o AUR2 puede obtenerse
por métodos antes descritos. Esta región puede ser retenida para sus
secuencias regulatorias de terminación transcripcional, tales como
terminación y poliadenilación. Así, reteniendo la región 3'
naturalmente contigua a la secuencia de DNA que codifica un
polipéptido AUR1 y/o AUR2, se pueden proporcionar señales de
terminación transcripcional. Donde las señales de terminación
transcripcional no son satisfactoriamente funcionales en la
expresión de la célula huésped, entonces se puede sustituir una
región 3' funcional en la célula huésped.
Dos secuencias de DNA (tales como una secuencia
de la región promotora y una secuencia de aur1 y/o aur2) se dice que
están operablemente unidas si la naturaleza de la unión entre las
dos secuencias de DNA no (1) resulta en la introducción de una
mutación de franja conmutada, (2) interfieren con la capacidad de
una secuencia de genes aur1 y/o aur2, o (3) interfieren con la
capacidad de la secuencia de genes aur1 y/o aur2 para ser
transcritas por la secuencia de la región promotora. Así, una región
promotora estaría operablemente unida a una secuencia de DNA si el
promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esta secuencia
de DNA. Así, para expresar un gen aur1 y/o aur2, se necesitan
señales transcripcionales y translacionales reconocidas por un
huésped apropiado.
La presente invención abarca la expresión del gen
aur1 y/o aur2 (o un derivado funcional del mismo) tanto en células
procariotas como eucariotas.
Los huéspedes procariotas son, generalmente, muy
eficientes y convenientes para la producción de proteínas
recombinantes y son, en consecuencia, un tipo de sistema de
expresión preferido para el gen aur1 y/o aur2. Los procariotas más
frecuentemente se representan por varias variedades de
E.coli. Sin embargo, también se pueden usar otras variedades
de microbios, incluyendo otras variedades bacterianas.
En sistemas procariotas, se pueden usar vectores
plásmidos que tengan sitios de replicación y secuencias control
derivadas de una especie compatible con el huésped. Ejemplos de
vectores plásmidos adecuados pueden incluir pBR322, pUC118, pUC119 y
similares; los vectores fago o bacteriófago pueden incluir
pMAM-neo, pKRC y similares.
Preferiblemente, el vector seleccionado de la
presente invención tiene la capacidad par replicarse en la célula
huésped seleccionada.
Los huéspedes procariotas reconocidos incluyen
bacterias tales como E.coli, Bacillus, Streptomyces,
Pseudomonas, Salmonella, Serratia, y similares. Sin embargo, bajo
tales condiciones, el péptido no será glicosilado. El huésped
procariota puede ser compatible con el replicón y secuencias control
en el plásmido de expresión.
Para expresar aur1 y/o aur2 (o un derivado
funcional de los mismos) en una células procariota, es necesario
unir operablemente la secuencia de aur1 y/o aur2 al promotor
funcional procariota. Tales promotores pueden ser tanto
constitutivos como, más preferiblemente, regulables (es decir,
inducibles o no reprimible). Ejemplos de promotores consitutivos
incluyen el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla
de la secuencia del gen \beta-lactamasa de pBR322,
y el promotor CAT de la secuencia del gen transferasa de pPR325, y
similares. Ejemplos de promotores procariotas inducibles incluyen
los principales promotores de derecha e izquierda del bacteriófago
\lambda (P_{L} y P_{R}), el trp, recA, \lambdaacZ,
\lambdaacI, y promotores gal de E.coli, la
\alpha-amilasa (Ulmanen et al., J.
Bacteriol. 162:176-182, 1985) y los promotores
específicos \zeta-28 de B.subtilis (Gilman
et al., Gen Séquense 32:11-20, 1984), los
promotores de bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, In: The Molecular
Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY, 1982), y
promotores de Streptomyces (Ward et al., Mol. Gen. Genet.
203:468-478, 1986). Los promotores de procariotas
son revisados por Glick (Ind. Microbiot. 1:277-282,
1987), Cenatiempo (Biochimie 68:505-516, 1986), and
Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18:415-442, 1984).
La expresión conveniente en una célula procariota
también requiere la presencia de un sitio de unión al ribosoma
corriente arriba de la secuencia codificante de la secuencia del
gen. Tales sitios de unión al ribosoma son revelados, por ejemplo,
por Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol.
35:365-404, 1981). La selección de secuencias
control, vectores de expresión, métodos de transformación, y
similares, dependen del tipo de célula huésped usado para expresar
el gen. Como se usa aquí, "célula", "línea celular", y
"cultivo celular" se pueden usar intercambiablemente y todas
estas designaciones incluyen progenie. Así, las palabras
"transformantes" o "células transformadas" incluyen la
célula sujeto primaria y cultivos derivados de la misma sin
considerar el número de transferencias. También se entiende que
todas las progenies puede que no sean idénticas en contenido de DNA,
debido a las mutaciones intencionadas o inadvertidas. Sin embargo,
como se ha definido, la progenie mutante tiene la misma
funcionalidad que la célula transformada originalmente.
Las células huésped que se pueden usar en los
sistemas de expresión de la presente invención no están
estrictamente limitadas, a condición que sean adecuadas para el uso
en la expresión del péptido AUR1 y/o AUR2 de interés. Huéspedes
adecuados a menudo pueden incluir células eucariotas. Huéspedes
eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, células de levadura,
hongo, células de insecto, células de mamífero tanto in vivo
como en cultivos de tejidos. Las células de mamífero que pueden ser
útiles como huéspedes incluyen células HeLa, células de origen
fibroblástico tales como VERO o CHO-K1, o células de
origen linfoide y sus derivados. Células huésped de mamífero
preferidas incluyen SP2/0 y J558L, así como líneas celulares de
neuroblastoma tales como IMR 332, que pueden proporcionar mejores
capacidades para el proceso correcto
post-transcripcional.
Además, también están disponibles células de
plantas como huéspedes, y están disponibles secuencias control
compatibles con células de plantas, tales como el virus del mosaico
de la coliflor 35S y el 19S, y el promotor de la sintasa nopalina y
las secuencias señal de poliadenilación. Otro huésped preferido es
un células de insecto, por ejemplo la larva de Drosophila. Usando
células de insecto como huéspedes, se puede usar el promotor de la
alcohol deshidrogenasa de Drosophila (Rubin, Science
240:1453-1459, 1988). Alternativamente, los vectores
de baculovirus pueden ser diseñados para expresar grandes cantidades
de AUR1 y/o AUR2 en células de insectos (Jasny, Science 238:1653,
1987; Miller et al., In: genetic Engineering, Vol. 8, Plenum,
Setlow et al., eds., pp. 277-297, 1986).
Cualquiera de la serie de sistemas de expresión
de la levadura pueden ser utilizados los cuales incorporan elementos
promotores y de terminación de las secuencias activamente expresadas
que codifican para enzimas glicolíticos que se producen en grandes
cantidades cuando la levadura ha crecido en medio rico en glucosa.
Las secuencias genéticas glicolíticas también pueden proporcionar
señales de control transcripcional muy eficientes. La levadura
proporciona ventajas sustanciales en que también puede llevar a cabo
modificaciones transcripcionales. Existe un número de estrategias de
DNA recombinante utilizando secuencias promotoras fuertes y un
número alto de copias de plásmido que pueden ser utilizadas para la
producción de proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce
secuencias líder en genes de mamífero clonados y secreta péptidos
que soportan secuencias líder (p.ej., pre-péptidos).
Varios posibles sistemas vector están disponibles para la expresión
de aur1 y/o aur2 en un huésped mamífero.
Se pueden emplear una amplia variedad de
secuencias regulatorias transcripcionales y translacionales,
dependiendo de la naturaleza del huésped. Las señales regulatorias
transcripcionales y translacionales pueden ser derivadas de fuentes
virales, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino,
citomegalovirus, virus simian, o similares, donde las señales
regulatorias se asocian con una secuencia genética particular que
tienen un nivel alto de expresión. Alternativamente, pueden ser
empleados los promotores de los productos de expresión de
mamífieros, tales como actina, colágeno, miosina, y similares.
Pueden ser seleccionadas las señales regulatorias de iniciación
transcripcionales que permitan la represión o activación, de manera
que la expresión de las secuencias genéticas pueda ser modulada. Las
señales regulatorias De interés son las que son sensibles a la
temperatura de manera que variando la temperatura, la expresión
puede ser reprimida o iniciada, o son sujeto para la regulación
química (como metabolito).
La expresión de aur1 y/o aur2 en huéspedes
eucariotas requiere el uso de regiones regulatorias eucariotas.
Tales regiones, en general, incluirán una región promotora
suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de RNA.
Promotores eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, el promotor
de las secuencias genéticas de metalotioneina de ratón (Hamer et
al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288, 1982); el
promotor TK de Herpes virus (McKnight, Cell
31:355-365, 1982); el promotor anterior SV40
(Benoist et al., Nature (London) 290:304-31,
1981); y el promotor de la secuencia del gen gal4 de levadura
(Johntson et al., Proc. Natk. Acad. Sci. (USA)
79:6971-6975, 1982; Silver et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955, 1984).
La translación de mRNA eucariótico se inicia en
el codón que codifica la primera metionina. Por esta razón, se
prefiere asegurar que la unión entre un promotor eucariota y una
secuencia de DNA que codifica AUR1 y/o AUR2 (o un derivado funcional
de los mismos) no contiene ningún codón interviniendo que sea capaz
de codificar una metionina (p.ej., AUG). La presencia de tales
codones resulta en la formación de una proteína de fusión (si el
codón AUG está en la misma franja de lectura como la secuencia que
codifica aur1 y/o aur2) o una mutación de conmutación (si el codón
AUG no está en la misma franja de lectura como la secuencia que
codifica aur2 y/o aur2).
Una molécula de ácido nucleico de aur1 y/o aur2 y
un promotor operablemente unido puede ser introducido en una célula
receptora procariota o eucariota así como una molécula de DNA o RNA
no replicativa, ó bien puede ser una molécula lineal o, más
preferiblemente, una molécula circular covalente cerrada. Puesto que
tales moléculas son incapaces de la replicación autónoma, la
expresión del gen puede tener lugar a través de la expresión
transitoria de la secuencia introducida. Alternativamente, la
expresión permanente puede tener lugar a través de la integración de
la secuencia de DNA introducida en el cromosoma huésped.
Un vector puede ser empleado de manera que sea
capaz de integrar las secuencias de genes deseadas en el cromosoma
de las células huésped. Las células que tienen el DNA introducido
establemente integrado en sus cromosomas pueden ser seleccionados
introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de
células huésped que contienen el vector de expresión. El marcador
puede proporcionar a un huésped auxotrófico para la prototrofia,
resistencia biocida, p.ej., antibióticos, o metales pesados, así
como cobre, o similares. La secuencia del gen marcador seleccionable
se puede unir directamente a las secuencias genéticas de DNA para
ser expresada, o introducida en la misma célula por
co-transfección. También se pueden necesitar
elementos adicionales para la síntesis óptima de mRNA. Estos
elementos pueden incluir señales de empalme, así como promotores de
la transcripción, estimulantes, y señales de terminación. La
expresión de vectores cDNA que incorporan tales elementos incluyen
aquéllos descritos por Okayama (Mol. Cell. Biol. 3:280-?, 1983).
La molécula de ácido nucleico introducida puede
ser incorporada en un plásmido o vector viral capaz de llevar a cabo
la replicación en el huésped receptor. Cualquiera de una amplia
variedad de vectores puede ser empleado para este objetivo. Factores
de importancia en la selección de un plásmido particular o un vector
viral incluyen: facilidad con que las células receptoras que
contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas de
aquéllas células receptoras que no contienen el vector; el número de
copias del vector que se desean en un huésped particular; y si se
desea ser capaz de "transbordar" el vector entre células
huésped de diferentes especies.
Los vectores procariotas preferidos incluyen
plásmidos así como aquéllos capaces de replicarse en E. coli
(así como, por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, \PiVX;
"Molecular cloning: A Laboratory Manual", 1989, supra).
Los plásmidos de Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127, y similares
(Gryczan, In. The molecular Biology of the Bacilli, Academic Press,
NY, pp. 307-329, 1982). Los plásmidos de
Streptomyces adecuados incluyen p1J101 (Kendall et al., J.
Bacteriol. 169:4177-4183, 1987), y bacteriófagos de
streptomyces así como \PhiC31 (Chater et al., In: Sixth
International Symposium on Actinomycetales biology, Akademiai Kaido,
Budapest, Hungary, pp. 45-54, 1986). Los plásmidos
de Pseudomonas son revisados por John et al., Infect. Dis.
8:693-704, 1986), e Izaki (Jpn. J. Bacteriol.
33:729-742, 1978).
Plásmidos eucarióticos preferidos, por ejemplo,
BPV, vaccinia, SV40, círculo 2-micron, y similares,
o sus derivados. Tales plásmidos son bien conocidos en el campo
(Botstein et al., Miami Wntr. Symp.
19:265-274, 1982, Broach, In: "The Molecular
Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance",
Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p. 445-470, 1981;
Broach, Cell 28:203-204, 1982; Bollon et al.,
J. Ctin. Hematol. Oncol. 10:39-48, 1980; Maniatis,
In: Cell biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence
Expression, Academic Press, NY,
pp-563-608, 1980).
Una vez el vector o molécula de ácido nucleico
que contiene el contructo(s) se ha preparado para la
expresión, el contructo(s) de DNA puede ser introducido en
una célula huésped apropiada mediante cualquiera de la variedad de
maneras adecuadas, p.ej., transformación, transfección, conjugación,
fusión de protoplasto, electroporación, tecnología de pistola de
partícula, precipitación de fosfato cálcico, microinyección directa,
y similares. Después de la introducción del vector, las células
receptoras crecen en un medio selectivo, que selecciona las células
en que crece el vector. La expresión del(de los)
gen(es) clonado(s) resulta en la producción de AUR1
y/o AUR2 o fragmentos de los mismos. Esto puede tener lugar en las
células transformadas así como, o siguiendo la inducción de estas
células para diferenciarse (por ejemplo, por administración de
bromodesoxiuracilo a las células del neuroblastoma o similares). Se
pueden usar una variedad de condiciones de incubación para formar el
péptido de la presente invención. Las condiciones más preferidas son
aquéllas que imitan las condiciones fisiológicas.
AUR1 y AUR2 son quinasas relacionadas
serina/treonina con extensiones cortas N-terminales.
Homólogos de Drosophila y levadura parecen estar implicados en el
cáncer y/u otros trastornos de la transducción de señal.
El análisis de la secuencia primaria de los genes
humanos aur1 y aur2 revela que su contiene el dominio
C-terminal de la proteína quinasa altamente
conservado con todos los motivos característicos de una quinasa
serina/treonina. Además, los dominios N-terminales
del aminoácido 73 al 129 de aur1 y aur2 humano contienen dos motivos
distantemente conservados presentes en la región no catalítica de
todos los genes aurora que pueden jugar un papel regulatorio o una
función como un motivo de unión al sustrato.
El primer motivo incluye 10 regiones amino, KENX,
PVK, llamado Aurora Box1. El segundo motivo se centra alrededor de
15 regiones aminoacídicas, QX_{9}AQRVL, llamado Aurora Box 2.
Varios sitios de fosforilación potencial de serina y treonina
también se conservan a lo largo de estas proteínas incluyendo un
motivo de fosforilación de la proteína quinasa A, RRXT, en la región
de activación de la quinasa, que sugiere una vía regulatoria similar
al ciclo celular que regulaba las proteínas relacionadas con
CDC2/CDK.
Un mutante sensible a la temperatura del gen IPL1
de levadura consiste en una sustitución de Thr a Ala en el sitio 2
de activación, sugiriendo que la fosforilación en este sitio puede
ser biológicamente relevante. Mutantes adicionales en la levadura
(Chan et al., genetics 135:677-691, 1993) y
homólogos de aurora de Drosophila (Glover et al. Cell
81:95-105, 1995) han sido mapeados exclusivamente al
dominio quinasa, excepto para un mutante Drosophila individual que
implica una mutación en el Asp47 en el N-terminal de
Aurora Box2. Estas mutaciones resultan en el núcleo anormal,
disgregación de cromosoma, y ejes monopolares.
La expresión de Aur2 está primariamente
restringida al hígado fetal, testículos de adulto, y timo, sugerente
de un papel normal de estas proteínas en la división meiótica. Aur1
humana también se expresa a los niveles más altos en testículos
humanos y timo, con un nivel de expresión moderado en pulmón e
intestino delgado. También se detecta expresión muy débil de Aur2 en
la médula ósea, nódulo linfático, y bazo, y no se detecta expresión
en todos los otros tejidos examinados.
Estudios adicionales demuestran la fuerte
regulación temporal de estos transcritos durante la mitosis (y
Kinura et al., J. Biol. Chem.
272:13766-13771, 1997). Ambos AUR1 y AUR2 parecen
regular la división nuclear, con la interrrupción de su señalización
resultando en células poliploides. Este fenotipo probablemente se
debe a la desagregación cromosomal, como se ha visto con IPL1 del
homólogo de levadura.
AUR2 parece jugar un papel en la transformación
celular. La expresión ectópica de AUR2 activado, que puede
fosforilar la proteína mielina básica in vitro, confiere un
crecimiento ventajoso en células NIH3T3 en suero bajo puesto que se
compara con AUR2 tipo salvaje, AUR2 quinasa inactiva, y el vector.
Además, solamente las células NIH3T3 que expresan grandes colonias
de crecimiento de AUR2 activado en agar suave en consecuencia
resultan en crecimiento dependiente de acoplaje.
Sin embargo, en un sistema de fibroblasto de
rata1, ambas proteínas tipo salvaje y AUR2 activado (T288D) fueron
capaces de fosforilar el sustrato artificial,
\alpha-caseína, sobre los niveles observados en la
línea celular control del vector. Además, las células que expresan
el tipo salvaje así como colonias mutantes AUR2 activadas en agar
suave, en contraste con la falta de crecimiento por las células que
expresan la quinasa AUR2 inactiva.
Una variedad de metodologías conocidas en el
campo puede ser utilizada para obtener el péptido de la presente
invención. El péptido puede ser purificado a partir de tejidos o
células que naturalmente produce el péptido. Alternativamente, los
fragmentos de ácido nucleico aislados descritos anteriormente
podrían ser usados para expresar la proteína AUR1 y/o AUR2 en
cualquier organismo. Las muestras de la presente invención incluyen
células, extractos de proteína o extractos de membrana de células, o
fluidos biológicos. Las muestras variarán según el formato del
ensayo, el método de detección, y la naturaleza de los tejidos,
células o extractos usados como la muestra.
Cualquier organismo eucariota se puede usar como
una fuente para el péptido de la invención, naturalmente siempre y
cuando el organismo fuente contenga tal péptido. Como se usa aquí,
"organismo fuente" se refiere al organismo original a partir
del cual deriva la secuencia aminoacídica de la subunidad,
independientemente del organismo la subunidad se expresa finalmente
de forma aislada.
Un experto en el campo puede seguir métodos
conocidos rápidamente para aislar proteínas con el fin de obtener el
péptido libre de los contaminantes naturales. Esto incluye, pero no
se limita a: cromatografía de exclusión por tamaño, HPLC,
cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de
inmunoafinidad.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
que tiene afinidad de unión a un polipéptido AUR1 y/o AUR2. El
polipéptido puede tener la secuencia aminoacídica publicada en ID DE
SEC NO:3 o ID DE SEC NO:4, o un derivado funcional del mismo, o al
menos 9 aminoácidos contiguos del mismo (preferiblemente, al menos
20, 30, 35, o 40 aminoácidos contiguos del mismo).
La presente invención también se refiere a un
anticuerpo que tiene afinidad de unión específica a un polipéptido
AUR1 y/o AUR2. Así un anticuerpo puede ser aislado comparando su
afinidad de unión al polipéptido AUR1 y/o AUR2 con su afinidad de
unión con otros polipéptidos. Aquellos que se unan selectivamente a
AUR1 y/o AUR2 serían escogidos para el uso en métodos que requieran
una distinción entre AUR1 y/o AUR2 y otros polipéptidos. Tales
métodos podrían incluir, pero no deberían limitarse al análisis de
la expresión de AUR1 y/o AUR2 alteradas en tejidos que contienen
otros polipéptidos.
Las proteínas AUR1 y/o AUR2 de la presente
invención se pueden usar en varios procedimientos y métodos, tales
como para la generación de anticuerpos, para el uso en identificar
composiciones farmacéuticas, y para el estudio de la interacción
DNA/proteína.
El péptido AUR1 y/o AUR2 de la presente invención
se puede usar para producir anticuerpos o hibridomas. Un experto en
el campo reconocerá que si se desea un anticuerpo, como un
polipéptido sería generado como se ha descrito aquí y se usa como un
inmunogen. Los anticuerpos de la presente invención incluyen
anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos de
estos anticuerpos, y formas humanizadas. Se pueden generar formas
humanizadas de los anticuerpos de la presente invención usando uno
de los procedimientos conocidos en el campo tales como la
quimerización o injertar CDR. La presente invención también se
refiere a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal antes
descrito, o fragmento de unión del mismo. Un hibridoma es una línea
celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo
monoclonal específico.
En general, se conocen bien en el campo las
técnicas para preparar anticuerpos monoclonales e hibridomas
(Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science
Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1984; St. Groth et
al., J. Immunol. Methods 35:1-21, 1980).
Cualquier animal (ratón, conejo, y similares) que se conozca que
produce anticuerpos puede ser inmunizado con el polipéptido
seleccionado. Métodos para la inmunización son bien conocidos en el
campo. Tales métodos incluyen inyección subcutánea o intraperitoneal
del polipéptido. Un experto en el campo reconocerá que la cantidad
de polipéptido usado para la inmunización variará según el animal
que se inmunice, la antigenicidad del polipéptido y el sitio de
inyec-
ción.
ción.
El polipéptido puede ser modificado o
administrado con un adyuvante con el fin de incrementar la
antigenicidad del péptido. Métodos para el incremento de la
antigenicidad de un polipéptido son bien conocidos en el campo.
Tales procedimientos incluyen el acoplaje del antígeno con una
proteína heteróloga (tal como globulina o
\beta-galactosidasa) o a través de la inclusión
con un adyuvante durante la inmunización.
Para anticuerpos moclonales, las células del bazo
de los animales inmunizados se eliminaron, se fusionaron con células
del mieloma, tales como las células del mieloma
SP2/0-Ag14, y permitieron que las células del
hibridoma empezaran a producir anticuerpos monoclonales. Cualquiera
de los métodos conocidos en el campo se puede usar para identificar
la célula del hibridoma que produce un anticuerpo con las
características deseadas. Esto incluye el cribado de los hibridomas
con ensayo ELISA, análisis western blot, o radioinmunoensayo (Lutz
et al., Exp. Cell Res. 175:109-124, 1988). Se
clonan los hibridomas que secretan los anticuerpos deseados y se
determinan la clase y subclase usando procedimientos conocidos en el
campo (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular biology", supra,
1984).
Para anticuerpos policlonales, el anticuerpo que
contiene antisuero se aísla a partir del animal inmunizado y se
criba por la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada
usando uno de los procedimientos antes descritos, Los anticuerpos
antes descritos pueden ser marcados para poder ser detectados. Los
anticuerpos pueden ser, marcados de forma detectable mediante el uso
de radioisótopos, marcadores de afinidad (tales como biotina,
avidina, y similares), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa
de rábano picante, fosfatasa alcalina, y similares), átomos
paramagnéticos, y similares. Los procedimientos para el cumplimiento
de tales marcaciones se conocen bien en el campo, por ejemplo, ver
(Stemberger et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315, 1970,
Bayer et al., Meth. Enzym. 62 :308-, 1979; Engval et
al., Immunol. 109 :129-, 1972; Goding, J. Immunol. Meth.
13:215-, 19769. Los anticuerpos marcados de la presente invención se
pueden usar en ensayos in vitro, in vivo, e in
situ para identificar células o tejidos que expresen un péptido
específico.
Los anticuerpos antes descritos también pueden
ser inmovilizados en un soporte sólido. Ejemplos de tal soporte
sólido incluyen plásticos tales como policarbonatos, complejo de
carbohidratos así como agarosa y sefarosa, resinas acrílicas y tales
como poliacrilamidas y cubiertas de látex. Técnicas para acoplar
anticuerpos a estos soportes sólidos son bien conocidas en el campo
(Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4th
Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10,
1986, Jacoby et al., Meth. Enzym. 34, Academic Press, N.Y.,
1974). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención se
pueden usar así como en inmunocromatografía.
Además, un experto en el campo actualmente puede
adaptarse rápidamente a los procedimientos disponibles, así como las
técnicas, métodos y kits descritos anteriormente con consideración a
anticuerpos, para generar péptidos capaces de unirse a secuencias
peptídicas específicas con el fin de generar racionalmente péptidos
antipeptídicos diseñados racionalmente (Hurby et al.,
"Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", In
Synthetic Peptides, A User's guide, W.H. Freeman, NY, pp.
289-307, 1992; Kaspczak et al., Biochemistry
28:9230-9238, 1989).
Los péptidos anti-péptidos se
pueden generar por reemplazamiento de residuos aminoacídicos básicos
encontrados en la secuencia peptídica de AUR1 y/o AUR2 con residuos
acídicos, mientras se mantienen los grupos polares hidrofóbicos y no
cargados. Por ejemplo, residuos de lisina, arginina, y/o de
histidina se reemplazan con ácido aspártico o glutámico y los
residuos de ácido glutámico se reemplazan por lisina, arginina o
histidina.
Los anticuerpos contra la proteína AUR2 detectan
una proteína de aproximadamente 46kDa (el tamaño de la proteína
AUR2) en cánceres primarios de colon humano, pero no en muestras
adyacentes de tejidos normales. AUR2 endógena también se detecta en
líneas celulares tumorales cultivadas.
La presente invención abarca un método de
detección de un polipéptido AUR1 y/o AUR2 en una muestra, que
comprende: (a) contactar la muestra con un anticuerpos antes
descrito, bajo condiciones tales que se formen los inmunocomplejos,
y (b) detectar la presencia de dicho anticuerpo unido al
polipéptido. Con detalle, los métodos comprenden la incubación de
una muestra con uno o más de los anticuerpos de la presente
invención y ensayar si el anticuerpo se une a la muestra del test.
Niveles alterados de AUR1 y/o AUR2 en una muestra comparados con
los niveles normales pueden indicar enfermedad.
Las condiciones de incubación de un anticuerpo
varían con una muestra test. Las condiciones de incubación dependen
del formato empleado en el ensayo, los métodos de detección
empleados, y el tipo y la naturaleza del anticuerpo utilizado en el
ensayo. Un experto en el campo reconocerá que cualquiera de los
formatos de ensayo inmunológicos comúnmente disponibles (tales como
radioinmunoensayos, ensayos inmunosorbentes de unión enzimática,
Ouchterlony basada en la difusión, o proyección inmunofluorescente)
puede adaptarse rápidamente a emplear los anticuerpos de la presente
invención. Ejemplos de tales ensayos pueden ser encontrados en
Chard ("An introduction to Radioimmunoassay and Related
Techniques" Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The
Netherlands, 1986), Bullock et al. ("Techniques in
Immunocytochemestry", Academic Press, Orlando, FL Vol. 1, 1982;
Vol. 2, 1983; Vol. 3, 1985), Tijssen ("Practice and Theory of
Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology", Elsveier Science Publishers, Amsterdam, The
Netherlands, 1985).
Las muestras de prueba del ensayo inmunológico de
la presente invención incluyen extractos de célula, proteína o
membrana de células, o fluidos biológicos tales como sangre, suero,
plasma, u orina. Las muestras de prueba usadas en el método antes
descrito variarán según el formato del ensayo, naturaleza del método
de detección y los tejidos, células o extractos usados como muestra
para ensayar. Métodos para preparar extractos de proteína o
membrana de células se conocen bien en el campo y se pueden adaptar
rápidamente con el fin de obtener una muestra que sea testable con
el sistema utilizado.
Un kit contiene todos los reactivos necesarios
para llevar a cabo los métodos de detección descritos previamente.
El kit puede comprender: (i) una primera forma de recipiente que
contenga un anticuerpo antes descrito, y (ii) una segunda forma de
recipiente que contenga un conjugado que comprenda una pareja de
unión del anticuerpo y una marca. En otra realización preferida, el
kit además comprende uno o más recipientes que comprenden uno o más
de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de
detectar la presencia de anticuerpos unidos.
Ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero
no se limitan a, anticuerpos marcados secundariamente, o de forma
alternativa, si el anticuerpo primario se marca, los reactivos
cromofóricos, enzimáticos, o de unión a anticuerpos que son capaces
de reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit compartimentalizado
puede ser como se ha descrito antes para los kits de sondas para
ácidos nucleicos. Un experto en el campo reconocerá rápidamente que
los anticuerpos descritos en la presente invención pueden ser
incorporados rápidamente en uno de los formatos establecidos del kit
que son bien conocidos en el campo.
\newpage
La presente invención también se refiere a un
método de detección de un compuesto capaz de unirse a un polipéptido
AUR1 y/o AUR2 que comprende incubar el compuesto con AUR1 y/o AUR2 y
detectar la presencia del compuesto unido a AUR1 y/o AUR2. El
compuesto puede estar presente en una mezcla compleja, por ejemplo,
suero, fluidos corporales, o extractos de células.
La presente invención se refiere a un método de
detección de un agonista o antagonista de la actividad de AUR1 y/o
AUR2 o la actividad de la pareja de unión a AUR1 y/o AUR2 que
comprende la incubación de células que producen AUR1 y/o AUR2 en
presencia de un compuesto y cambios de producción en el nivel de la
actividad de AUR1 y/ AUR2 o de la actividad de la pareja de unión a
AUR1 y/o AUR2. Los compuestos identificados así producirían un
cambio en la actividad indicativo de la presencia del compuesto. El
compuesto puede estar presente en una mezcla complejo, por ejemplo,
suero, fluido corporal, o extractos de células. Una vez se
identifica el compuesto se puede aislar usando técnicas bien
conocidas en el campo.
La presente invención también abarca un método
para agonizar (estimular) o antagonizar la actividad asociada a AUR1
y/o AUR2 en un mamífero que comprende la administración a dicho
mamífero de un agonista o antagonista de AUR1 y/o AUR2 en una
cantidad suficiente para efectuar dicho agonismo o antagonismo. Un
método para tratar enfermedades en un mamífero con un agonista o
antagonista de la actividad asociada a AUR1 y/o AUR2 que comprende
la administración del agonista o antagonista a un mamífero en una
cantidad suficiente para agonizar o antagonizar las funciones
asociadas a AUR1 y/o AUR2 también se abarca en la presente
aplicación.
Varios métodos están disponibles para la
producción de animales transgénicos asociados con esta invención. El
DNA puede ser inyectado en el pronúcleo de un huevo fertilizado
antes de la fusión del pronúcleo de macho y hembra, o inyectado en
el núcleo de una célula embrionaria (p.ej., el núcleo de un embrión
de dos células) siguiendo la iniciación de la división celular
(Brinster et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:
4438-4442, 1985). Los embriones pueden ser
infectados con virus, especialmente retrovirus, modificados por
llevar secuencias de nucleótidos del receptor del ion inorgánico de
la invención.
Células madre pluripotenciales derivadas de la
masa celular interior del embrión y estabilizadas en cultivo pueden
ser manipuladas en cultivo para incorporar secuencias nucleotídicas
de la invención. Un animal transgénico puede ser producido a partir
de tales células a través de la implantación en un blastocisto que
se implanta en una madre adoptiva y se permite que se arregle. Los
animales adecuados para experimentos transgénicos se pueden obtener
a partir de fuentes comerciales tales como Charles River
(Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley
(Indianapolis, IN), etc.
Los procedimientos para la manipulación del
embrión roedor y para la microinyección de DNA en el pronúcleo del
zigoto son bien conocidos para aquellos expertos en el campo (Hogan
et al., supra). Los procedimientos de microinyección
para huevos de peces, anfibios, y aves se detallan en Houdebine and
Chourrout (Experientia 47:897-905, 1991). Otros
procedimientos para la introducción de DNA en tejidos de animales
se describen en la Patente Estadounidense No., 4.945.050 (Sandford
et al., July 30, 1990).
De modo de ejemplo solamente, para preparar un
ratón transgénico, se inducen ratones hembra para superovular. Las
hembras se colocan con los machos, y las hembras apareadas se
sacrifican por asfixia de CO_{2} o dislocación vertical y los
embriones se recuperan de los oviductos por incisión. Se eliminan
las células acumuladas circundantes. Los embriones pronucleares
entonces se lavan y se almacenan hasta el tiempo de inyección. Se
aparean aleatoriamente los ratones hembra adultos ovulando con
machos vasectomizados. Se aparean las hembras depositadas al mismo
tiempo que las hembras donantes. Los embriones luego se transfieren
quirúrgicamente. El procedimiento para generar ratas transgénicas
es similar al de los ratones (Hammer et al., Cell
63:1099-1112, 1990).
Los métodos para el cultivo de células madre (ES)
hembionarias y la siguiente producción de animales transgénicos por
la introducción de DNA en células ES usando métodos tales como
electroporación, fosfato cálcico/precipitación de DNA e inyección
directa también son bien conocidos por aquellos expertos en el campo
(Teracarcionomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach,
E.J. Robertson, ed., IRL Press, 1987).
En casos que amplican la integración aleatoria de
genes, un clon que contiene la(s) secuencia(s) de la
invención se contransfecta con un gen que codifica resistencia.
Alternativamente, el gen que codifica la resistencia a neomicina se
une físicamente a la(s) secuencia(s) de la invención.
La transfección y aislamiento de clones deseados se llevaron a cabo
mediante cualquiera de los varios métodos bien conocidos para
aquellos expertos en el campo (E.J. Robertson, supra).
Las moléculas de DNA introducidas en células ES
también se pueden integrar en el cromosoma a través del proceso de
recombinación homóloga (Capecchi, Science
244:1288-1292, 1989). Los métodos para la selección
positiva del evento de recombinación (esto es, resistencia a neo) y
selección dual positiva-negativa (esto es,
resistencia a neo y resistencia a ganciclovir) y la subsiguiente
identificación de los clones deseados mediante PCR han sido
descritos por Capecchi, supra and Joyner et al.
(Nature 338:153-156, 1989), la enseñanza de los que
se incorporan aquí en su integridad incluyendo alguna ilustración.
La fase final del procedimiento es inyectar las células ES
dirigidas a la diana en los blastocistos y transferir los
blastocistos en las hembras pseudoembarazadas. Los animales
quiméricos resultantes proliferan y la descendencia se analiza
mediante Southern blot para identificar individuos que llevan el
transgen. Los procedimientos para la producción de mamíferos no
roedores y otros animales han sido discutidos por otros. (Houdebine
and Chourrout, supra; Pursel et al., Science 244
:1281-1288, 1989; and Simms et al.,
bio/Technology 6:179-183, 1988).
Así, la invención proporciona mamíferos no
humanos transgénicos que codifican un polipéptido AUR1 y/o AUR2 o
un gen que efectúa la expresión de un polipéptido AUR1 y/o Aur2.
Tales mamíferos no humanos transgénicos son particularmente útiles
como un sistema de prueba in vivo para estudiar los efectos
de la introducción de un polipéptido AUR1 y/o AUR2, o regular la
expresión de un polipéptido AUR1 y/o AUR2 (esto es, a través de la
introducción de genes adicionales, ácidos nucleicos antisentido, o
ribozimas).
Un "animal transgénico" es un animal que
tiene células que contienen DNA que ha sido insertado
artificialmente en una célula, cuyo DNA forma parte del genoma del
animal que se desarrolla a partir de esa célula. Los animales
transgénicos preferidos son primates, ratones, ratas, vacas, cerdos,
caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. El DNA transgénico puede
codificar la expresión en un animal que puede ser reducida por
proporcionar una cantidad efectiva de RNA antisentido o DNA para
reducir la expresión del receptor.
La expresión de la proteína AUR2 en la línea
celular H1299 de tumores humanos es significativamente regulada en
presencia de cualquiera de los tres oligonucleótiods fosfotionato
antisentido (ID DE SEC NO:30, ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC NO:32)
cuyas regiones específicas de la diana de los transcritos de Aur2
del mRNA humano. Cuando se usa en combinación, los oligonucleótidos
ID DE SEC NO:30 y ID DE SEC NO:32, y ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC
NO:32 reducen la expresión de la proteína AUR2 bajo el límite de
detección.
El tratamiento de las células H1299 con la
combinación de ID de SEC NO:31 y ID de SEC NO: 32 inhibió el
crecimiento de esta línea celular tumoral, e indujo la apoptosis
como se había medido por FACs.
AUR1 y/o AUR2 o sus secuencias genéticas serán
útiles en la terapia génica (revisado en Miller, Nature
357:455-460, 1992). Miller afirma que los avances
han resultado en aproximaciones prácticas de la terapia génica
humana que han demostrado resultados iniciales positivos. La
ciencia básica de la terapia génica se describe en Mulligan
(Science 260:926-931, 1993).
En una realización preferida, un vector de
expresión que contiene la secuencia que codifica el AUR1 y/o el
AUR2 se inserta en células, las células crecen in vitro y
entonces se implantan en grandes números a los pacientes. En otras
realizaciones preferidas, un segmento de DNA que contiene un
promotor de elección (por ejemplo, un promotor fuerte) se
transfiere en células que contienen AUR1 y/o Aur2 endógenos de tal
manera que el segmento del promotor estimula la expresión de los
genes Aur1 y/o Aur2 endógenos (por ejemplo, el segmento del
promotor se transfiere a la célula de forma que empieza a unirse
directamente a los genes Aur1 y/o Aur2).
La terapia génica puede implicar el uso de un
adenovirus que contiene cDNA de aur1 y aur2 dirigido a un tumor,
AUR1 y/o AUR2 sistémicas incrementan por la implantación de células
diseñadas, inyección con virus aur1 y/o aur2, o inyección de DNA
desnudo de aur1 y/o aur2 en tejidos apropiados.
Las poblaciones de células diana pueden ser
modificadas por introducción de formas alteradas de uno o más
componentes de los complejos proteicos con el fin de modular la
actividad de tales complejos. Por ejemplo, por reducción o
inhibición de la actividad del complejo del complemento en células
diana, un(os) evento(s) de transducción de señal
dirigidos con una condición pueden ser incrementados, inhibidos, o
reservados. La delección o mutantes sin sentido de un componente,
que tienen la capacidad de interaccionar con otros componentes de
los complejos proteicos pero que no pueden funcionar en la
transducción de señal pueden ser usados para inhibir un evento de
transducción de señal anormal, deletéreo.
Los vectores de expresión derivados de virus
tales como los retrovirus, virus vacuna, adenovirus, virus
adeno-asociados, herpes-virus,
varios virus RNA, o virus del papiloma humano, pueden ser usados
para distribuir secuencias de nucleótidos (p.ej., cDNA) que
codifican las proteínas AUR1 y/o AUR2 recombinantes en la población
de células diana (p.ej., células tumorales). Los métodos que son
bien conocidos por los expertos en el campo pueden ser usados para
construir vectores virales recombinantes que contienen secuencias
codificantes (Maniatis et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989;
Ausubel et al., Current Proteocols in Molecular Biology,
Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989).
Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico recombinantes que
codifican secuencias de proteínas pueden ser usadas como DNA
desnudo o en un sistema reconstituido p.ej., liposomas u otros
sistemas lipídicos para distribuirlas a las células diana (p.ej.,
Felgner et al., Neutre 337:387-8, 1989).
Existen otros métodos para la transferencia directa del DNA del
plásmido a células para el uso en la terapia génica humana e
implica dirigir el DNA a receptores en células por complexación del
DNA del plásmido a proteínas (Miller, supra).
En su forma más simple, la transferencia de genes
se puede llevar a cabo simplemente por inyección de pequeñas
cantidades de DNA en el núcleo de una célula, a través de un
proceso de microinyección (Capecchi, Cell 22:47-88,
1980). Una vez los genes recombinantes se introducen en una célula,
se pueden reconocer por los mecanismos celulares normales para la
transcripción, translación, y se expresará un producto génico.
También se han probado otros productos génicos para la introducción
de DNA en grandes números de células. Estos métodos incluyen:
transfección, en donde el DNA se precipita con CaPO_{4}y se lleva
dentro de células por pinocitosis. (Chen et al., Mol. Cell
Biol. 7 :2745-52, 1987); electroporación, en donde
las células se exponen a grandes pulsos de voltaje para introducir
poros en la membrana (Chu et al., Nucleic Acids Res.
15:1311-26, 1987); lipofección/fusión liposomal, en
donde el DNA se incluye dentro de vesículas lipofílicas que se
fusionan con la célula diana (Felgner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 84:7413-7417, 1987); y bombardeo de
partículas usando DNA unido a proyectiles pequeños (Yang et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9568-9572, 1990).
Otro método para la introducción de DNA en células es acoplar el
DNA a proteínas químicamente modificadas.
También se ha demostrado que proteínas de
adenovirus son capaces de desestabilizar endosomas y estimular la
entrada del DNA en las células. La mezcla de adenovirus en
soluciones que contienen complejos de DNA, o la unión de DNA a
polilisina unido covalentemente a adenovirus utilizando agentes
proteicos de unión cruzada sustancialmente mejora la entrada y
expresión del gen recombianante (Curiel et al., Am. J.
Respir. Cell. Mol. Biol., 6:247-52, 1992).
Como se usa aquí "transferencia del gen"
significa el proceso de introducir una molécula de ácido nucleico
foránea en una célula. La transferencia del gen se lleva a cabo de
manera común para incapacitar la expresión de un producto particular
que codifica para el gen. El producto puede incluir una proteína,
polipéptido, DNA o RNA antisentido, o RNA enzimáticamente activo.
La transferencia del gen se puede llevar a cabo en células
cultivadas o por administración directa en animales. Generalmente la
transferencia de genes implica el proceso de contacto del ácido
nucleico con una célula diana no específica o interacciones
mediadas por el receptor, entrada del ácido nucleico en la célula a
través de la membrana o por endocitosis, y liberación del ácido
nucleico en el citoplasma a partir de la membrana plasmática o
endosoma. La expresión puede requerir, además, la eliminación del
ácido nucleico en el núcleo de la célula y unión de factores
nucleares apropiados para la transcripción.
Como se usa aquí "terapia génica" es una
forma de transferir genes y se incluye en la definición de cómo se
usa aquí y específicamente se refiere a la transferencia de genes
para expresar un producto terapéutico a partir de una célula in
vivo o in vitro. La transferencia de genes se puede
llevar a cabo ex vivo en células que luego se transplantan
al paciente, o se puede lleva a cabo por administración directa del
ácido nucleico o el complejo proteína-ácido nucleico en el
paciente.
En otra realización preferida, un vector que
tiene secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido
AUR1 y/o AUR2 se proporciona en los que la secuencia del ácido
nucleico se expresa únicamente en el tejido específico. Los métodos
para conseguir la expresión del gen específico al tejido se han
publicado en la Publicación Internacional No. WO 93/09236,
archivado el 3 de Noviembre, 1992 y publicado el 13 de Mayo,
1993.
En todos los vectores procesados descritos
anteriormente, un aspecto más de la invención es que la secuencia
del ácido nucleico que contenía el vector puede incluir adiciones,
supresiones o modificaciones a algunas o todas las secuencias del
ácido nucleico, como se ha descrito antes.
En otra realización preferida, se publica un
método para el reemplazamiento del gen. "Reemplazamiento del
gen" como se usa aquí significa suplir una secuencia de ácido
nucleico que es capaz de ser expresada in vivo en un animal y
en consecuencia proporcionar o aumentar la función de un gen
endógeno que es deficiente o defectuoso en el animal.
Con esfuerzo para descubrir nuevos tratamientos
para enfermedades, investigadores biomédicos y químicos han
diseñado, sintetizado, y testado moléculas que inhiben la función de
proteínas quinasa. Ejemplos de moléculas que han sido descritas para
inhibir la función de proteínas quinasa incluyen, pero no se limitan
a, compuestos arilo bis monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos
(PCT WO 92/20642, publicada el 26 de Noviembre, 1992 por Maguire
et al.), derivados de vinileno-azaindol (PCT
WO 94/14808, publicada el 7 de Julio, 1994 por Ballinari et
al.),
1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas
(Patente Estadounidense No. 5.330.992), compuestos estirilos
(Patente Estadounidense No. 5.217.999), compuestos piridil estiril
sustituidos (Patente Estadounidense No. 5.302.606), ciertos
derivados quionozolina (Aplicación de PE No. 0 566 266 A1),
seleoindoles y selénidos (PCT WO 94/03427, publicada el 17 de
Febrero, 1994 por Denny et al.), compuestos polihidroxílicos
tricíclicos (PCT WO 92/21660, publicada el 10 de Diciembre, 1992 por
Dow), y compuestos ácido bencilfosfónicos (PCT WO 91/15495,
publicada el 17 de Octubre, 1991 por Dow et al). Los
compuestos que pueden atravesar membranas y que son resistentes a la
hidrólisis ácida son potencialmente terapéuticos ventajosos puesto
que pueden llegar a ser altamente biodisponibles después de ser
administrados oralmente a pacientes. Sin embargo, algunos de esto
inhibidores de proteínas quinasa solamente inhiben ligeramente la
función de proteína quinasa. Además, algunos inhiben una variedad de
proteínas quinasa y en consecuencia causarán múltiples efectos
adversos como terapéuticos para enfermedades.
Algunos compuestos indolina, sin embargo, forman
clases de moléculas orgánicas resistentes a ácido y permeables a
membrana. WO 96/22976, publicada el 1 de Agosto, 1996 por Ballinari
et al. Describe compuestos indolina hidrosolubles que
albergan tetralina, naftaleno, quinolina, y sustituyentes indol
funsionados al anillo de oxindol. Estos sustituyentes bicíclicos en
consecuencia se sustituyen con fracciones polares incluyendo
alquilo hidroxilado, fosfato, y fracciones de éter. Solicitud de
Patente Estadounidense de serie No. 08/702.232. archivada el 23 de
Agosto, 1996, titulada "Indolinone Combinatorial Libraries of
Disease" por Tang et al. (Lyon & Lyon Docket No.
221/187) y 08/485.323., archivada el 7 de Junio, 1995, titulada
"Benzylidene-Z-indoline Compounds
for the Treatment of Disease" por Tang et al. (Lyon &
Lyon Docket No. 223/298) y la Publicación de Patente Internacional
WO 96/22976, publicada el 1 de Agosto, 1996 por Ballinari et
al., todos incorporados aquí por referencia en su integridad,
incluyendo alguna ilustración, describen bibliotecas químicas de
indolinonas de compuesto de indolinonas que albergan otras
fracciones bicíclicas así como fracciones monocíclicas fusionadas
al anillo oxindol.
Las aplicaciones 08/702.232, archivadas el 23 de
Agosto, 1996, titulada "Indolinone Combinatorial Libraries and
Related Products and Methods for the Treatment of Disease" por
Tang et al. (Lyon & Lyon Docket No. 221/187), 08/485.323,
archivado el 7 de Junio, 1995, titulado
"Benzyldiene-Z- Indoline Compounds for the
treatment of Disease" por Tang et al. (Lyon & Lyon
Docket No. 223/298), y WO 96/22976, publicado el 1 de Agosto, 1996
por Ballinari et al. Métodos para mostrar la síntesis de
indolinona, métodos para comprobar la actividad biológica de los
compuestos de indolinona en células, y patrones de inhibición de
los derivados de indolinona.
Otros ejemplos de sustancias capaces de modular
la actividad de AUR1 y/o AUR2 incluyen, pero no se limitan a,
tirfostinas, quinazolinas, quinolinas y quionoxolinas referidas a
los compuestos incluidos antes bien conocidos tales como aquéllos
descritos en la bibliografía. Por ejemplo, publicaciones
representativas que describen la quinazolina incluyen Barker et
al., Publicación EPO No. 0 520 722 A1; Jones et al.,
Patente Estadounidense No. 4.447.608; Kabe et al., Patente
Estadounidense No. 4.757.072; Kaul and Vougioukas, Patente
Estadounidense No. 5.316.553; kreighbaum and Comer, Patente
Estadounidense No. 4.343.940; Pegg and Wardleworth, Publicación EPO
No. 0 562 743 A1; Barker et al., Proc. Of Am. Assoc. for
Cancer Research 32:327 (1991); Bertino, J.R., Cancer
Research 3:293-304 (1979); Bertino, J.R.,
Cancer Research 9(2 parte 1):293-304
(1979); Curtin et al., Br. J. Cancer
53:361-368 (1986); Fernandes et al., Caner
research 43:1117-1123 (1983); Ferris et al.
J. Org. Chem. 44(2): 173-178; Fry
et al., Science 265:1093-1095 (1994);
Jackman et al., Cancer Research
51:5579-5586 (1981); Jones et al. J. Med.
Chem. 29(6):1114-1118; Lee and Skbo,
Biochemistry 26(23):7355-7362 (1987);
Lemus et al., J. Org. Chem.
54:3511-3518 (1989); Ley and Seng, Synthesis
1975:415-522 (1975); Maxwell et al.,
Magnetic Resonance in Medicine 17:189-196
(1991); Mini et al., Cancer Research
45:325-330 (1985); Phillips and Castle, J.
Heterocyclic Chem. 17(19):1489-1596
(1980); Reece et al., Cancer Research
47(11):2996-2999 (1977); Sculier et
al., Cancer Immunol. and Immunother. 23:A65 (19869;
Sikora et al., Cancer Letters 23:289-295
(1984); Sikora et al., Analytical Biochem. 172
:344-355 (1988); todos incorporados aquí por
referencia en su totalidad, incluyendo las figuras.
La quinoxalina se describe en Kaul and
Vougioukas, Patente Estadounidense No. 5.316.553, incorporada aquí
en su integridad por referencia, incluyendo algunas figuras.
Las quinolinas se describen en Dolle et
al., J.Med.Chem. 37:2627-2629 (1994); MaGuire,
J.Med.Chem. 37:2129-2131 (1994); Burke et
al., J. Med. Chem. Letters 2:1771-1774 (1992),
todos incorporados por referencia en su integridad, incluyendo
algunas figuras.
Las tirfostinas se describen en Allen et
al., Clin. Exp. Immunol. 91:141-156
(1993); Anafi et al., Blood 82 :12
:3524-3529 (1993); Backer et al., J.Cell
Sci. 102 :543-555 (1992); Bilder et al.,
Amer. Physiol. Soc. Pp. 6363-6143
:C721-C730 (1991), Brunton et al.,
Proceedings of Amer. Assoc. Cancer Rsch. 33:558 (1992);
Bryckaert et al., Experimental Cell Research 199
:255-261 (1992); Dong et al., J.
Leukocyte Biology 53:53-60 (1993); Dong et
al., J.Immunol. 151(5):2717-2724
(1993); Gazit et al., J.Med.Chem
32:2344-2352 (1989); Gazit et al.,
J.Med.Chem. 36:3556-3564 (1993), Kaur et
al., Anti-Cancer Drugs 5:213-222
(1994); Kaur et al., King et al., Biochem. J.
275:413-418 (1991); Kuo et al., King et
al., Biochem. J. 275 :413-418 (1991); Kuo
et al., Cancer letters 74 :197-202
(1993); Levitzki, A., the FASEB J. 6
:3275-3282 (1992), Lyaall et al., J. Biol.
Chem. 264 :14503-14509 (1989); Peterson et
al., The Prostate 22 :335-345 (1993);
Pillemer et al., Int. J. Cancer 50
:80-85 (1992); Posner et al., Molecular
Pharmacology 45 :673-683 (1993), Rendu et
al., Biol. Pharmacology 44(5)
:881-888 (1992); Suaro and Thomas, Life
Sicences 53 :371-376 (1993); Sauro and Thomas,
J. Pharm. and Expermiental Therapeutics
267(3):119-1125 (1993); Wolbring et
al., J. Biol. Chem. 269(36):22472 (1994); y
Yoneda et al., Cancer Research
51:4430-4435 (1991); todos incorporados aquí por
referencia en su integridad, incluyendo algunas figuras.
Otros compuestos que podrían ser usados como
moduladores incluyen oxindolinonas tales como aquéllas descritas en
la Serie de la Solicitud de Patente Estadounidense no. 08/702.232
archivada el 23 de Agosto, 1996, incorporada aquí por referencia en
su integridad, incluyendo algunas figuras.
Los siguientes ejemplos no están limitados y son
meramente representativos de varios aspectos y características de la
presente invención. Los ejemplos siguientes demuestran el
aislamiento, y caracterización de las nuevas proteínas AUR1 y
AUR2.
Los RNAs totales se aislaron usando el protocolo
de extracción de sales de Guanidina/Fenol de Chomczynski y Sacchi
(Anal. Biochem. 162:156-159, 1987) de la próstata
humana normal, duodeno, ovario, hígado, pituitaria, cerebro, timo, y
glándula salivar, de células HEPM humanas (mesénquima palatal), del
tumor primario de Wild y carcinoma ovárico, y de líneas tumorales
humanas originadas del colon/recto (HT29, SW480, SW1463, SW1417,
SW837, SW948, SW620, SW403, SW1116, T84, HTC15, LS123, y
Caco-2), riñón (CaKi-1,
CaKi-2), hígado
(SK-HEP-1), páncreas (HS766T, ASPC,
Capan-1), y pecho (MSF7).
Estos RNAs se usaron como plantillas para generar
cDNAs de cadena simple usando el Superscript Preamplification
System for First Strand Síntesis kit obtenido de gibcoBRL (Life
technologies, U.S.A.; Gerard et al. 1989, FOCUS 11, 66) bajo
condiciones recomendadas por el fabricante. Una reacción típica
utiliza 10 \mug de RNA total o 2 \mug de RNA
poli(a)^{+} con 1,5 \mug
oligo(dT)_{12-18} en un volumen de
reacción de 60 \mul. El producto se trató con RnasaH y se diluyó
hasta 100 \mul con H_{2}O. Para la siguiente amplificación por
PCR se usaron 1-4 \mul de estos sscDNAs en cada
reacción.
Los oligonucleótidos se sintetizaron en un
sintetizador de DNA Applied Biosystems 394 usando la química del
fosforamidato establecida y se usaron sin purificar después de la
precipitación con etanol. Los cebadores de los oligonucleótidos
degenerados son:
A=
5'-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3' (ID DE
SEC NO:16) (sentido) y
DVW=
5'-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3' (ID DE
SEC NO:17) (antisentido).
Estos cebadores derivaron de las secuencias
peptídicas EFGEVFLA (ID DE SEC NO.18) (hebra sentido del subdominio
I de la quinasa) y DVW(A/S)FGVL (ID DE SEC NO.29;
hebra antisentido del subdominio IX de la quinasa), respectivamente.
Las designaciones del residuo nucleotídico degenerado son: N= A, C,
G, o T; R= A o G; y Y= C o T. Usando CCK4 como plantilla, estos
cebadores producen un producto de 567 pb.
Se llevó a cabo una reacción por PCR usando
cebadores A y DVW aplicados a las fuentes de cadena simple de la
lista anterior. Los cebadores se añadieron a una concentración final
de 5 \muM a la mezcla que contiene 10 \mum de Tris HCl (pH
8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 200 \muM cada
desoxinucleótido trifosfato, 0,001% de gelatina, y 1,5 U de
AmpliTaq DNA Polymerase (perkin-Elmer/Cetus), y
1-4 \muL de cDNA. Los siguientes 3 minutos tras
la desnaturalización a 95ºC, las condiciones del ciclo fueron 94ºC
durante 30 s, 50ºC durante 1 min, y 72ºC durante 1 min 45 s durante
35 ciclos. Los fragmentos de la PCR que migrando entre
500-600 pb se aislaron a partir de geles de agarosa
al 2% usando GeneClean (Bio101), y T-A se clonó en
el vector pCRII (Invitrogen Corp. U.S.A.) de acuerdo con el
protocolo del fabricante.
Las colonias se seleccionaron para preparaciones
de mini plásmido DNA usando columnas de Qiagen y los DNAs de
plásmidos se secuenciaron usando un kit terminador colorante de
secuencias en ciclos con AmpliTaq DNA polimerasa, FS (ABI, Foster
City, CA). Los productos de la reacción de secuenciación se llevaron
a un Secuenciador de DNA ABI Prism 377, y se analizaron usando el
algoritmo de alineamiento BLAST (Altschul et al., J. Mol.
Biol. 215:403-410, ?). Se aisló un nuevo clon
(#43-43) por PCR con cebadores A y DVW en un cDNA de
cadena simple a partir de mesénquima palatal embriónica humana
(HEPM o CRL1486) como una plantilla. Este clon posteriormente se
designó como un fragmento de aur1 humano.
Una biblioteca de cDNA de ZapII lambda
(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se construyó usando mRNA
a partir de una combinación de líneas celulares de carcinoma
pancreático como una plantilla para la síntesis de la primera cadena
de cDNA. El fago se cribó en filtros de nitrocelulosa con el
inserto marcado con ^{32}P cebado de forma aleatoria a partir de
p43-43 que codifica aur1 humano a 2x10^{6} cpm/mL
en un tampón de hibridación que contiene 6x SSC, reactivo de
Denhardt 1x, SDS 1%, con 0,1 mg/mL desnaturalizado, DNA de esperma
de salmón fragmentado. Tras la hibridación durante toda la noche a
65ºC, los filtros se lavaron en SSC 0,1x, SDS 0,1% a 65ºC. Los
clones de cDNA de longitud completa se secuenciaron en ambas
cadenas usando secuenciación manual con polimerasa T7 y cebadores de
oligonucleótidos (Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 84:4767-4771, 1987).
Se aisló el DNA genómico a partir de una variedad
de líneas humanas transformadas (CaCO_{2}, HTC15, LS147T, KCO4,
SW480, SW403, SWW620, SW948, SW1417, SW1116, MCF7, BT474) usando los
procedimientos estándares (Maniatis et al. supra).
Las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se resuspendieron
a \sim10^{8} células/mL en un tampón de digestión (100 mM NaCl,
10 mM Tris pH8, 25 mM EDTA, pH8, SDS 0,5%, proteinasa K 0,1 mg/mL).
Las células se lisaron por incubación a 50ºC durante 12 horas,
seguido por la extracción con fenol/cloroformo y se precipitaron con
un volumen equivalente de acetato de amonio 7,5 M y EtOH 100%. Los
DNAs se resuspendieron en tampón TE. Aproximadamente 20 \mug/mL de
DNA genómico se digerió con HindIII o XhoII a 37ºC durante al menos
4 horas antes del fraccionamiento en geles de agarosa. Los
fragmentos de DNA se transfirieron a membranas de nitrocelulosa por
el método de transferencia capilar (Southern, J. Mol. Biol. 98:503-,
1975) y se hibridizaron con sondas específicas de aur1 y aur2
humanos como se ha descrito para el análisis Northern Blot más
abajo. Los DNAs se restringieron con Hind III puesto que ambos cDNAs
de aur1 y aur2 contienen un sitio simple para su enzima de
restricción.
Con el fin de identificar homólogos de CCK4, un
receptor que representa una familia distinta de tirosín quinasas, se
diseñaron cebadores degenerados a secuencias conservadas con
subdominios quinasa I y IX de ROS y la familia TRK del receptor de
las tirosín quinasas, puesto que múltiples alineamientos sugirieron
que CCK4 estaba más próximamente relacionado con estos receptores.
El subdominio I está al N-terminal del dominio
quinasa y contiene el motivo consenso GXGXXGXV (ID DE SEC NO:26) que
está implicado en acoplar ATP a la unidad catalítica de toda clase
de quinasas. El subdominio IX contiene un Asp casi invariante que
actúa para estabilizar el lazo catalítico adhiriéndose a los
residuos en el subdominio VIB. Basado en la comparación de todas las
proteínas quinasa conocidas, se diseñaron cebadores degenerados de
oligoucleótidos a los subdominios I y IX que solamente recogería
CCK4 y su homólogo KLG del pollo por PCR.
Los cebadores degenerados A y DVW se diseñaron
basados en los residuos conservados con el dominio quinasa de CCK4,
para usarse para la identificación de nuevas quinasas usando la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cuando se aplicó al
sscDNA de las células HEPM como plantilla, se aislaron múltiples
copias de CCK4 así como un fragmento de DNA nuevo
(43-43) de 567 pb con homología a otras quinasas. La
nueva secuencia era muy similar a la quinasa de aurora de
Drosophila (GeneBank Accesión #X83465) y el clon se designó aur1
humano.
La sonda aur1 se usó para cribar una biblioteca
de cDNA construida a partir de mRNA de la línea celular de cáncer
pancreático humano para aislar clones superpuestos abarcando el
marco de lectura abierto completo de aur1. De múltiples clones
aislados, siete correspondían al aur1 humano. Dos clones adicionales
hibridizándose débilmente también se aislaron durante su cribado y
el análisis de secuencia reveló que correspondían a una quinasa
relacionada, aún distinta, que designamos aur2.
Aur1 mostró un banda de 4,3 kb simple de
intensidad equivalente a partir de todas las fuentes que sugerían
que era una copia simple, gen no reconfigurado en los múltiples
tipos de tumor ensayados. Sin embargo, bajo condiciones de baja
astringencia, fue posible detectar fragmentos de SacI de 1,3 kb y
3,2 kb que se hibridan débilmente a la sonda aur1. Aur2 mostraba
bandas a 7,0 kb y 4,3 kb y una banda de peso molecular algo más
alto a \sim10 kb a partir de todas las fuentes. Este dato sugiere
que aur2 también es una copia simple de un gen. Las bandas
múltiples vistas en los blots sondeados con aur2 son probablemente
debidas al hecho que se usó una sonda de cDNA de longitud
completa.
Las secuencias completas de aur1 y aur2 humanos
se determinaron a partir de clones de longitud completa de cada
uno, aislados de la biblioteca de carcinoma pancreático humano, de
duodeno humano normal, y de aur1 parcial humano aislado de células
HEPM.
La secuencia de nucleótidos de aur1 humana de
1244 pb se muestra en ID DE SEC NO:1 y contiene un marco de lectura
abierto simple que codifica un polipéptido de 344 aminoácidos. El
AUR1 que codifica la región se flanquea por una región 5' no
traducida de 54 nucleótidos y una región 3' no traducida de 132
nucleótidos acabando con una cola de poli(A).
La secuencia de nucleótidos de aur2 humano de
2198 pb se muestra en ID DE SEC NO:2 y contiene un marco de lectura
abierto que codifica un polipéptido de 403 aminoácidos. La región
que codifica UAR2 se flanquea por una región 5' no traducida de 200
nucleótidos y una región 3' no traducida de 768 nucleótidos.
Los cDNAs de aur1 y aur2 se secuenciaron a partir
de ambos tumores pancreáticos humanos y duodeno humano normal, sin
diferencias de secuencia observadas excepto algunos sitios
probablemente polimórficos. Estas ambigüedades incluyen:
| CDNA | nucleótido | Comentario |
| aur1 | 1174 | un clon tiene poli A insertado |
| 873 | T en todos los clones duodenales, C en tumores pancreáticos | |
| 469 | T en un clon, C en los otros | |
| 848 | G en un clon, A en los otros- cambios del aminoácido E al G. | |
| 1097 | G en un clon, A en los otros 2 | |
| 956 | G en un clon, A en los otros 4 | |
| 29 | Empalmar a 103 en 5 clones, no hay corte y empalme (como se muestra) en 5 clones. | |
| Aur2 | 349 | T en un clon, C en otros Múltiples (cambio de aminoácido de P a L) |
| 369 | A en 3 clones, G en otros múltiples (cambio de AA de V a I). |
Las porciones C-terminales de
AUR1 y AUR2 conservan todos los 12 subdominios característicos de
proteínas quinasa de eucariotas. Los dominios quinasa de AUR1 y
AUR2 se preceden por un dominio N-terminal de 74 y
130 aminoácidos respectivamente. La comparación del nucleótidos
aur1 y aur2 y las secuencias de aminoácidos deducidas (ID DE SEC
NO:3 o ID DE SEC NO:4) con el DNA disponible y bases de datos de
secuencias proteicas indicaron que eran únicas con la excepción de
varias secuencias EST que compartían una alta identidad de
secuencia. Sin embargo, hacen que haya una homología notable en
ambos dominios N-terminal y catalítico con los genes
IPL1 aurora de Drosophila y Saccharomyces cerevisiae.
Además, dos entradas de la base de datos no publicadas son
probablemente homólogos cercanos de xenopus laevis
(p46APK-acceso #Z17206 y p46BPK- GB acceso
#Z17207).
Los dominios N-terminales de
aurora de humano, rana, Drosophila, y levadura comparten identidad
de secuencia limitada. La comparación de los dominios catalíticos
de estas proteínas revela que AUR1 comparte el 70% de identidad
aminoacídica con AUR2, el 61% con aurora de Drosophila, y el 45%
con el gen IPL1 de la levadura. La quinasa AUR2 comparte el 60% de
identidad aminoacídica con la proteína de Drosophila y el 45% de
identidad con IPL1 de levadura. Ambos AUR1 y AUR2 comparten menos
del 45% de homología con todas las otras quinasas de mamíferos
conocidas (siendo la más próxima la proteína quinasa A dependiente
de AMPc) sugiriendo que son homólogos de esas quinasas de
Drosophila y levadura.
AUR1 y AUR2 ambos contienen un sitio de
fosforilación de la proteína quinasa dependiente de AMPc (THR232 de
AUR1 y THR288 de AUR2) que se conserva en los homólogos de
Drosophila y levadura y es un sitio regulatorio conocido en la
quinasa p34cdc2 dependiente de ciclina. AUR2 contiene un sitio PKA
adicional en SER342. Ambas proteínas también tienen múltiples
sitios de fosforlilación de caseínas quinasa II (cinco y seis para
AUR1 y AUR2) y proteínas quinasa C (cuatro y diez para AUR1 y AUR2).
AUR2 también tiene un sitio consenso de fosforilación tirosina
simple en TYR334 que también se conserva con aurora de Drosophila,
pero no se presenta en AUR1 o IPL1 de levadura.
Mutantes naturales de aurora AURdm de drosophila
y el gen IPL1 de la levadura resultan en división nuclear
asimétrica llevando a la segregación errónea del cromosoma y ejes
atípicos, monopolares. Este fenotipo aparece como resultado de un
fallo en la separación del centrosoma. La arquitectura asociada del
microtúbulo no aparece afectada. Los mutantes naturales en ambos
residuos aminoacídicos diana de drosophila y levadura que son
estrictamente conservados entre AUR1 y UAR2, además pueden ser
homólogos funcionales. Los residuos correspondientes en AUR1 que se
encuentran en mutantes naturales de Aur_dm o IPL1 son GLU125,
THR232, PRO312, HIS324. Todas estas mutaciones están con el dominio
catalítico, y notablemente, uno representa el sitio de
fosforilación de PKA conservado. Una mutación adicional en AUR_dm en
ASP47 está en un residuo no conservado en el dominio
N-terminal.
Estos descubrimientos sugieren que la actividad
catalítica puede necesitar jugar un papel central en la biología de
la replicación del centrosoma o la segregación en organismos
menores, y sugieren que AUR1 y AUR2 humanos pueden jugar un papel
complementario en células de mamíferos.
Los Northern Blots que contienen 2 \mug de poli
A + Rna por línea de 16 tejidos humanos adultos diferentes (bazo,
timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado, mucosa
colónica, corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo
esquelético, riñón, páncreas, y leucocitos de sangre periférica),
cuatro tejidos fetales humanos diferentes (cerebro, pulmón, hígado
y riñón), y 8 líneas de células de cáncer humano (HL60, HeLa,
K-562, MOLT-4, Raji, SW480, y G361)
en una membrana de nylon modificado por carga se obtuvieron de
Clontech (Palo Alto, CA). Se prepararon Northern blots adicionales
aislando 10 \mug de RNA total de líneas de células tumorales
humanas en un gel de agarosa 1,2% de formaldehído desnaturalizado y
transfiriéndolo en membranas de nylon.
Los filtros se hibridizaron con sondas cebadas
aleatorias marcadas con [^{32}P]dCTP sintetizadas a partir
de cualquier inserto de 527 pb del clon de aur1 humano
43-43 o el fragmento EcoRI de 1162pb de pSG20, y
cualquier fragmento EcoRI de 1kb del clon aur2 humano
11-1A o el fragmento de BamHI-Not I
de 1257pb de pS621. La hibridación se llevó a cabo a 60ºC durante
toda la noche en SSC 6X, SDS 0,1%, la solución de Denhardt 1X, 100
mg/mL de DNA de esperma de arenque desnaturalizado con
1-2 x 10^{6}cpm/mL de sondas de DNA marcadas con
^{32}P. Los filtros se lavaron en SSC 0,1%/SDS 0,1%, 65ºC, y se
expusieron toda la noche en película Kodak
XAR-2.
El RNA se aisló a partir de una variedad de
líneas celulares, tejidos frescos congelados, y tumores primarios.
El cDNA de cadena simple se sintetizó a partir de 10 mg de cada RNA
como se ha descrito anteriormente usando el Superscript
Preamplification System (GibcoBRL). Estas plantillas de cadena
simple luego se usaron en una reacción PCR de 35 ciclos con dos
oligonucleótidos específicos para aur1 (3476:
5'TTTGGCTCGGGAGAAGAAAAGCCAT-3' (ID DE SEC NO:19), y
3506: 5'- CAATCATCTCTGGGGGCAGGTAGT-3' (ID DE SEC
NO:20)). Se hizo una electroforesis de los productos de la reacción
en geles de agarosa 2%, teñidos con bromuro de etidio y
fotografiados en una caja de luz UV. La intensidad relativa de las
bandas específicas para aur1 de \sim475pb se estimó para cada
muestra.
Un transcrito de mRNA de aur1 simple de
aproximadamente 1,4kb se identificó, y se encontró que es más
abundante en el timo e intestino delgado con débiles señales de los
testículos, ovario, colon, placenta, y bazo. La próstata y los
linfocitos de la sangre periférica fueron negativos. El hígado y
riñón fetales humanos también fueron positivos, con una señal
inferior en el pulmón fetal y sin expresión en el cerebro fetal
(Tabla).
Un análisis similar de la expresión humana de
aur2 mostró un perfil de expresión más restringido. Un transcrito
simple de aur2 de 2,4 kb se detectó más fuertemente en los
testículos de un adulto y timo, y débilmente en corazón, placenta,
músculo esquelético y en hígado fetal y riñón mientras que las
otras fuentes de tejido normal fueron negativas (ver tabla).
El perfil de expresión de mRNA de aur1 en varios
tumores primarios y líneas celulares múltiples de diveross orígenes
neoplásicos se determinaron por análisis Northern y por el ensayo
de PCR semi-cuantitativa usando cebadores de
secuencias en el dominio quinasa de aur1. Los resultados se
incluyen en la Tabla. Se detectaron los transcritos de Aur1 en cada
línea tumoral ensayada con la expresión más alta en varias líneas
celulares de cáncer de colon humano (SW480, Colo320, SW620, SW1417,
Caco2, SW12417) y en carcinoma de pulmón (Calu3), carcinoma de mama
(T47D, MCF7), melanoma (A375), carcinoma de riñón
(CaKi-1. CaKi-2), carcinoma de
hígado (SK-HEP-1), y tumores
neurales (SF767, T98G). La expresión menor de aur1 se vio en otros
carcinomas de colon (HTC15, T84, SW948, SW1116, HT29), tumores
neurales (Daoy), carcinoma ovárico (Ovcar3, Tumor Primario),
carcinoma pancreático (HS766T), y un tumor de riñón primario.
El perfil de expresión de aur2 en líneas de
células tumorales era más sorprendentemente restringido que el de
aur1. La fuerte expresión de aur2 se detectó solamente en líneas de
células de carcinoma de colon (Caco2, SW480, SW1417, SW620)
mientras que se vieron señales débiles en otras líneas de células de
tumores de colon (HTC15, Colo320), mama (T47D, MCF7) y pulmón
(Calu3). Varias líneas de tumores no tenían transcritos de aur2
detectables.
| Tipo celular | Origen | AUR1 | AUR2 |
| Timo | Tejido normal | 5 | 4 |
| Hígado fetal | Tejido normal | 4 | 2 |
| Riñón fetal | Tejido normal | 4 | 1 |
| Pulmón | Tejido normal | 3 | 0 |
| Duodeno | Tejido normal | 2 | 1 |
| Colon | Tejido normal | 2 | 0 |
| Pulmón fetal | Tejido normal | 2 | 0 |
| Ovario | Tejido normal | 2 | 0 |
| Testículos | Tejido normal | 2 | 2 |
| Cerebro | Tejido normal | 0 | 0 |
| Cerebelo | Tejido normal | 0 | 0 |
| Glándula salivar | Tejido normal | 0 | 0 |
| Corazón | Tejido normal | 0 | 0 |
| Hígado | Tejido normal | 0 | 0 |
| Páncreas | Tejido normal | 0 | 0 |
| Riñón | Tejido normal | 0 | 0 |
| Bazo | Tejido normal | 0 | 0 |
| Estómago | Tejido normal | 0 | 0 |
| Útero | Tejido normal | 0 | 0 |
| Próstata | Tejido normal | 0 | 0 |
| Músculo esquelético | Tejido normal | 0 | 0 |
| Cerebro fetal | Tejido normal | 0 | 0 |
| PBLs | Tejido normal | 0 | 0 |
| Glándula salivar | Tejido normal | 0 | 0 |
| Placenta | Tejido normal | 0 | 0 |
(Continuación)
| Tipo celular | Origen | AUR1 | AUR2 |
| SF268 | Tumor CNS | 4 | ND |
| CCRF-CEM | Leucemia | 4 | ND |
| K-562 | Leucemia | 4 | ND |
| HCC-2998 | Tumor de colon | 4 | ND |
| SW620 | Tumor de colon | 4 | 2 |
| KM-12 | Leucemia | 4 | ND |
| MCF7/ADR-RES | Tumor de mama | 4 | D |
| MDA-N | Tumor de mama | 4 | ND |
| BT-549 | Tumor de mama | 4 | ND |
| SW480 | Tumor de colon | 4 | 4 |
| SW48 | Tumor de colon | 4 | ND |
| Calu-3 | Tumor de pulmón | 4 | ND |
| Calu3 | Tumor de pulmón | 4 | 2 |
| T47D | Tumor de mama | 4 | 2 |
| A375 | Melanoma | 4 | 0 |
| SF767 | Tumor CNS | 4 | 0 |
| SW1417 | Tumor de colon | 4 | 4 |
| CaKi2 | Tumor de riñón | 4 | 0 |
| CaKi1 | Tumor de riñón | 4 | 0 |
| Caco2 | Tumor de colon | 4 | 4 |
| SW1417 | Tumor de colon | 4 | 0 |
| T98G | Tumor CNS | 4 | 0 |
| SF-539 | Tumor CNS | 3 | ND |
| SK-MEL-2 | Melanoma | 3 | ND |
| SK-MEL-5 | Melanoma | 3 | ND |
| R-48 | Tumor gástrico | 3 | ND |
| RF-1 | Tumor gástrico | 3 | ND |
| SW948 | Tumor de colon | 3 | ND |
| AGS | Tumor gástrico | 3 | ND |
| HFL1 | Tumor de pulmón | 3 | ND |
| OVCAR-8 | Tumor ovárico | 2 | ND |
| HT-29 | Tumor de colon | 2 | ND |
| MDA-MB-231 | Tumor de mama | 2 | ND |
| MDA-MB-435 | Tumor de mama | 2 | ND |
| SK-MEL-5 | Melanoma | 2 | ND |
| Kato-3 | Tumor gástrico | 2 | ND |
| Colo 205 | Tumor de colon | 2 | ND |
| Colo 320DM | Tumor de colon | 2 | 2 |
| WiDr | Tumor de colon | 2 | ND |
| HT-29 | Tumor de colon | 2 | ND |
| SNU-C2B | Tumor de colon | 2 | ND |
| HTC15 | Tumor de colon | 2 | 2 |
| T84 | Tumor de colon | 2 | 0 |
| SW948 | Tumor de colon | 2 | 0 |
| Daoy | Tumor CNS | 2 | 0 |
| OVCAR3 | Tumor ovárico | 2 | 0 |
| HS766T | Tumor de páncreas | 2 | 0 |
| SW1116 | Tumor de colon | 2 | 0 |
| Tumor de Wilms | Tumor de riñón | 2 | 0 |
| UO-31 | Tumor renal | 0 | ND |
Los constructos de expresión se generaron por
mutagénesis asistida por PCR en que los dominios enteros
codificantes de aur1 y aur2 se marcaron en sus extremos
carboxi-terminales con el epitope de la
hemaglutinina (HA) YPYDVPDYAS de hemophilus influenza (ID DE
SEC NO:21)(Pati, Gene 114:285-288,1992). Estos
constructos se introdujeron en dos vectores de expresión de
mamíferos: pLXSN (Miller et al., Biotechniques
7:980-988, 1989) para la generación de líneas
productoras del virus, y pRK5 para el análisis de expresión
transitoria. Los insertos se diseñaron para ser flanqueados por
sitios únicos BamHI y NotI y se clonaron directamente en pLXSN o
pRK5 a los sitios 5'-BmHI y
3'-NotI.
Los constructos de aur1 y aur2 de longitud
completa de BamHI-NotI también se ligaron en pRS316
(Liu et al., genetics 132:665-673, 1992).
Este vector contiene un promotor inducible de galactosa en un
vector lanzadera centromérico para la expresión en Saccharomyces
cerevisiae. Estos sirven para evaluar si los genes humanos
pueden complementar el mutante IPL1 de levadura sensible a
temperatura, que está relacionado de cerca con Aur1. Además, se
generaron los constructos de fusión que contienen el dominio
N-terminal de IPL1 de levadura fusionado a dominios
quinasa C-terminales de aur1 y aur2. Esto se
produjo por inserción de un sitio claI artificial en el extremo 5'
de los dominios quinasa de las quinasas, en la secuencia conservada
Asp-Asp-Phe-Glu.
Los constructos dominantes negativos de aur1 y
aur2 también se hicieron en ambos pLXSN y pRK5 por mutación de la
Lys variante (posiciones aminoacídicas 106 y 162 en AUR1 y AUR2
respectivamente) a un Met por mutagénesis PCR. Los constructos se
llaman AUR1KM y AUR2KM. Formas constitutivamente activas de AUR1 y
AUR2 se generaron por mutación del DNA encabezando el sitio de
fosforilación codificante (232 y 2889 a un Asp resultando en AUR1TD
y AUR2TD.
También se hicieron los constructos de expresión
en ambos pLXSn y pRK5 conteniendo el N-terminal,
dominio no catalítico de AUR1 y AUR2. Estos se generaron por PCR a
partir de constructos parentales y contienen en el
N-terminal 77 aminoácidos de AUR1 y 132 aminoácidos
de AUR2.
Los marcos de lectura abierto completos de aur1 y
aur2 (sin tag-HA) excluyendo las metioninas de
iniciación se generaron por PCR y se ligaron con el vector pGEX
para la producción bacteriana de proteínas de fusión GST para la
inmunización de conejos para la producción de anticuerpos.
Para generar stocks de virus de titulación alta,
se transfectaron constructos recombinantes pLXSN que contienen
cualquiera de los genes aur1 o aur2 en un línea de células
ayudantes anfotrópicas PA317 usando transfección mediada por
CaCl_{2} Después de la selección sobre G418, las células se
colocaron en placas sobre un medio normal sin G418 (500 ug/ml). Los
sobrenadantes de las células resistentes se usaron para infectar la
línea de células ayudantes ecotrópicas GP+E86, y las células se
seleccionaron de nuevo sobre G418. Las células resistentes se
sacaron de G418, y los sobrenadantes se cultivaron cada
8-12 horas y se combinaron como stock de virus
(Redemann et al., Mol. Cell. Biol. 12,
491-498, 1992). Los títulos usuales del stock de
virus eran \sim10^{6}/mL.
Células NIH-3T3, y BALB/3T3
crecieron en placas de 100 mm con DMEM (Gibco) conteniendo suero
fetal de becerro (FCS). Las células se superinfectaron con el
retrovirus aur1 y aur2 adicionando aproximadamente 3 mL de
sobrenadante viral a 15 mL de medio de cultivo durante
aproximadamente 24 horas. Las células que expresan los constructos
retrovirales se seleccionaron después por crecimiento en DMEM/10%
FCS suplementado con 500 \mug/mL de G418.
Los plásmidos de expresión pRK5 (10 \mug
DNA/placa de 100 mm) que contienen los genes aur1 y aur2 marcados
con HA se introdujeron en COS y 293 células con lipofectamina (Gibco
BRL). Después de 72 horas, las células se cultivaron en 0,5 mL de
tampón de solubilización (HEPES 20 mM pH 7,35, NaCl 150 mM, 10%
glicerol, 1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl_{2}, 1 mM
EGTA, 2 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 \mug/mL
aprotinina). Se resolvieron alícuotas de la muestra por
electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE) en 15%
acrilamida/0,5% geles bis-acrilamida y se
transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa. La unión
inespecífica se bloqueó por preincubación de blots en Blotto (sales
tamponadas con fosfato conteniendo 5% p/v de leche desnatada y 0,2%
v/v nonidet P-40 (Sigma)), y la proteína
recombinante se detectó usando un Mab de ratón al tag decapéptido
HA. Alternativamente, la proteína recombianante puede ser detectada
usando varios antisueros específicos para AUR1 o AUR2.
AUR1 y AUR2 recombinados expresados en células
COS migraron con Mr aparente de 39.000 y 46.000, coherentes con sus
pesos moleculares predichos de 39.264 y 46730 basados en su
secuencia primaria de aminoácidos. Este análisis confirma que la
proteína recombinante puede ser establemente producida en células de
mamíferos.
Las formas dominantes negativas y
constitutivamente activas de AUR1 y AUR2 serán útiles para delinear
consecuencias biológicas de cuales oblación o sobrexpresión de
estas serina/treonina quinasas putativas. Estudios iniciales con los
constructos de DNA alterados demostraron que en solo 2 horas
después de la infección de las células NIH3T3 o BALB/d3T3 con
stocks retrovirales de aur1 o aur2, las células pasaron a ser
multinucleadas. Este fenotipo persistió de tal manera que 2 días
después de la infección algunas células se encontró que tenían
hasta 20 núcleos. Las células multinucleadas típicamente tenían el
citoplasma incrementado y los límites celulares difusos.
Inmunomarcando con actina y DAPI, se confirmó que todos estos
núcleos estaban contenidos en una célula simple, y que el
citoesqueleto de actina era aparentemente normal.
Los inmunoreactivos específicos para AUR fueron
aumentados en conejos contra péptidos sintéticos conjugados con KLH
correspondiendo a cualquier región N- terminal de AUR2
(^{104}SAPENNPEEQLASK^{117})(ID DE SEC NO:22) y
(^{90}RPLNNTQKSKQPL^{102}) (ID DE SEC NO:23) o el dominio
N-terminus o N-terminal de AUR1
humano (^{1}MAQKENSYPWPYG^{13}) (ID DE SEC NO:24) y
(^{53}PGQKVMENSSGTP^{65}) (ID DE SEC NO:25). Inmunoreactivos
adicionales se generaron inmunizando conejos con las proteínas de
fusión GST de Aur1 y Aur2 de longitud completa expresadas en
bacterias.
Se generaron inmunoreactivos específicos en
conejos contra la secuencia peptídica a partir de dominios
n-terminales de AUR1 y AUR2 para localizar la
expresión de Aur endógeno y recombinante en las células. Estos
reactivos también pueden ser usados para identificar sustratos para
las AURs.
Se cultivaron las células SW480 de adenocarcinoma
colorectal humano en suero bovino fetal RPMI 1640 más 10%,
L-glutamina, penicilina y estreptomicina. Los
cultivos confluentes de células SW480 se lavaron tres veces con
tampón fosfato salino enfriado (PBS) y luego se rasparon en 1 mL de
PBS helado. Las células se centrifugaron a 1.000 rpm a 4ºC, el PBS
se retiró, y el pellet de células resultantes se almacenan a -80ºC.
Los pellets de 3 placas de 15 cm se lavaron sobre hielo y se
resuspendieron en un total de 1 ml de tampón quinasa de lisis 50 mM
HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 25 mM NaF, 1mM NaVO_{3}, 0,5% NP40, 1
mM DTT, 2 \mug/mL aprotinina, y 1 \mug/mL de leupeptina) y se
rotaron gentilmente durante 20 minutos a 4ºC. Las muestras se
centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos a 4ºC y el
sobrenadante se transfirió a un tubo de centrifugado limpio de 1,5
mL y se almacenó o se mantuvo en hielo. La concentración de proteína
se determinó por análisis Bradford. Un miligramo de proteína total
se pre-aclaró con 10 \mul de proteína
A-Sefarosa (Boheringer) durante 15 minutos a 4ºC
seguido de la adición de 2 \mul de cualquier suero
pre-inmune de conejo, antisuero peptídico AUR2 de
afinidad purificado, antisuero peptídico AUR1 de afinidad
purificado más 6 \mug de péptido AUR1 que compite, antisuero
peptídico AUR2 de afinidad purificado, o, antisuero peptídico AUR2
purificado más 6 \mug de péptido AUR2 que compite y se incubaron
durante 30 minutos a 4ºC.
Subsiguientemente, se añadieron 10 \muL de
proteína A-Sefarosa y se continuó la incubación
durante 45 minutos adicionales a 4ºC. Los tubos se centrifugaron
brevemente para comprimir el complejo
anticuerpo-proteína A-Sefarosa y el
sobrenadante resultante se aspiró. El pellet de
anticuerpo-proteína A-sefarosa se
lavó dos veces con 0,5 mL de tampón quinasa de lisis seguido por un
lavado con 0,5 mL de tampón quinasa (20mM HEPES pH 7,4, 125 mM KCl,
10mM MgCl_{2}, 1 mM NaF, 1 mM NaVO_{3}, y 1mM DTT). El pellet
anticuerpo-proteína A-Sefarosa se
resuspendió en 20\muL de tampón quinasa que contenía 5\muCi de
[\gamma-^{32}P]ATP y 0,5 mg/mL de
proteína básica mielina (Sigma), se incubó durante 20 minutos a
37ºC tras los cuales se añadió 10 \muL de tampón proteico de la
muestra 200 mM Tris-Cl pH 6,8, 40% glicerol, 730 mM
B-mercaptoetanol, 0,4% SDS, y 0,05% de azul
Bromofenol. Los tubos se mezclaron bien y se incubaron durante 5
minutos a 100ºC. Las muestras se resolvieron sobre un gel de
poliacrilamida 18% y se visualizó por autoradiografía.
\newpage
Los inmunocomplejos de Aur1 y Aur2 fueron capaces
de fosforilar la proteína básica de mielina. Cuando el péptido que
compite se usó en las inmunoprecipitaciones ni los inmunocomplejos
antisuero de AUR1 ni AUR2 fueron capaces de fosforilar la proteína
básica de mielina que el control del suero
pre-inmune. Esto sugiere que la actividad quinasa
observada se debe a AUR1 y AUR2 y no a otras proteínas presentes en
el inmunocomplejo.
Esta observación permitirá la purificación de la
quinasa activa de AUR1 y Aur2 usando la proteína básica de mielina
como un sustrato para permitir la actividad quinasa. También
permitirá el desarrollo de un ensayo in vitro de la quinasa
usando proteínas recombinantes de AUR1 y AUR2. Además un ensayo
in vitro de las quinasas de AUR1 y AUR2 permitirá cribar
colecciones de moléculas pequeñas para inhibidores de las quinasas
de AUR1 y AUR2 midiendo la inhibición de fosforilación de la
proteína básica de mielina.
Los cebadores de oligonucleótidos degenerados se
diseñaron para clonaje por PCR basado en los dominios quinasa I y
IX de CCK4 (Genbank:U33635; Cowley et al., Cell
77:841-852, 1994), una tirosín quinasa receptora
expresada en un amplio rango de células epiteliales normales y
transformadas. El cebador sentido fue
5'-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3' (ID DE
SEC NO:16), que codifica los aminoácidos EFGEVFLA (ID DE SEC NO:18)
y el cebador antisentido fue
5'-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3' (ID DE
SEC NO.17), que codifica la cadena complementaria de aminoácidos
DVWAFGVL (ID DE SEC NO:33). Estos cebadores se aplicaron a sscDNA
generado a partir de RNA aislado de varias líneas de células de
cáncerde colon así como de otras fuentes tumorales. Los productos de
la PCR de 500-600pb se subclonaron y se
secuenciaron, revelando el fragmento relacionado con aurora de
Drosophila. Este fragmento se usó para sondear una biblioteca
lambda construida a partir de una combinación de RNAs de la línea
de células de cáncer pancreático humano, levando al aislamiento de
clones de longitud completa para aur1 humano. Dos clones que
hibridaban débilmente también se aislaron y el análisis de la
secuencia reveló que representaban un cDNa distinto pero
relacionado llamado aur2. También se aislaron clones de longitud
completa para ambos genes a partir de cDNA de duodeno humano normal.
Todos los clones se secuenciaron en ambas cadenas con cebadores de
oligonuclóetidos internos usando ambas polimerasa T7 secuenciando
de forma manual y usando el terminador de ciclos colorante que
secuencia con la DNA polimerasa AmpliTaq sobre un ABI Prism 377. La
secuencia completa que codifica aur2 también se confirmó a partir de
10 muestras de tumor primario colorectal. Los cebadores
5'-CGCCTTTGCATCCGCTCCTG-3' (ID DE
SEC NO:34) y
5'-GATTTGCCTCCTGTGAAGAC-3' (ID DE
SEC NO:35) se usaron en una reacción RT-PCR con
sscDNA generado a partir de RNAs tumorales. Los productos de PCR se
purificaron por GeneClean y se secuenciaron directamente por el
terminador de ciclos colorante que secuencia con varios cebadores
oligonucleótidos. Mientras que no se observaron diferencias en la
secuencia entre clones asilados a partir de fuentes normales o
tumorales, se identificó un polimorfismo simple de nucleótidos en 2
muestras tumorales que codificarían un cambio de F a I en el
residuo 31. Abreviaciones para los residuos de nucleótidos
degenerados son: R= A o G; Y= C o T, N= A, C, G o T.
Un cribado basado en PCR se inició para
identificar nuevas quinasas asociadas al cáncer de colon. Uno de
estos clones codificaban una proteína con homología a la proteína
quinasa de aurora de Drosophila melanogaster y la quinasa
IPL1 de Saccharomyces cerevisiae (Francisco et al.,
Mol. Cell. Biol. 14:4731-4740, 1994; Glover et
al., Cell 81:95-105, 1995). Mientras se usa este
fragmento para cribar un clon de cDNA de longitud completa, un clon
débilmente hibridante se encontró para codificar una quinasa
relacionada. Estos genes se refieren como aur1 y aur2, para reflejar
su homología entre ellos y a la quinasa aurora de
Drosophila.
El cDNA de Aur1 contenía un marco de lectura
abierto de 1032pb que codifica un polipéptido de 344 aminoácidos con
una masa molecular predicha de 39,3 kDa. El cDNa de aur2 contenía un
marco de lectura abierto de 1209 pb que codifica un polipéptido de
403 aminoácidos con una masa molecular predicha de 45,8 kDa.
Dos pseudogenes aur humanos adicionales también
se identificaron como transcritos expresados que son contenidos
cada uno en exones simples y que mantienen una fuerte homología del
DNA con cualquiera aur1 o aur2, exhibiendo múltiples cambios del
marco.
Una secuencia parcial de BTAK (Sen et al.,
oncogene 14:2195-2200, 1997), una quinasa asociada
al tumor de mama, ha sido descrito que parece ser un fragmento de
aur2 humano. Un segundo manuscrito describe que la secuencia de
aik humana (Kimura et al., J. Biol.. Chem.
272:13766-13771, 1997), una proteína regulada por el
ciclo celular localizada en los cuerpos de los polos de los ejes,
que comparte el 92% de identidad de secuencia aminoacídica con AUR2
humano pero es probablemente idéntica excepto para la incorporación
de 6 cambios de marco resultantes de los errores de secuenciación.
Un tercer papel proporciona la secuencia de AYK1 (Yanai et
al. Oncogene 14:2943-2950, 1997), un gen
meiótico regulado, que parece ser el ortólogo de ratón de AUR2. La
presente invención describe la primera secuencia completa para
ambos aur1 y aur2 humanos.
Las secuencias aminoacídicas deducidas de aur1 y
aur2 humanos se presentan en la Fig.1 alineados con los homólogos
de la levadura y IPL1 y aurora de Drosophila. La proteína
AUR2 humana comparte el 57%, 43%, Y 41% de identidad sobre su
longitud completa con AUR1 humano, aurora de Drosophila, y
IPL1 respectivamente. Las cuatro secuencias contienen un dominio
C-terminal con todos los motivos característicos de
una serina/treonina quinasa. El dominio quinasa de AUR2 humano
comparte el 74%, 62%, y 49% de identidad aminoacídica con AUR1
humano, aurora y IPL1 de Drosophila y el 83,5% de identidad
con dos homólogos de anfibio presentes en Xenopus [p46Eg22
(PIR:S53342) y p64Eg265 (PIR:S53343)]. La aurora de Drosophila se
relaciona más con AUR1 humano mientras que IPL1 de levadura está
más relacionada con AUR2. Este hecho estructural se soporta por
estudios complementarios en levaduras donde solamente la quinasa de
AUR2 humana puede complementar un mutante IPL1. Mientras que una
sola quinasa similar a aurora está presente en levadura, al menos
dos miembros están presentes en proteínas de C. elegans
(GB:U53336, gen k07C11.2 y GB:U97196, gen B0207.4). Los dominios
catalíticos deducidos de estas proteínas de C.elegans
comparten el 55% y el 64% de identidad de la secuencia aminoacídica
con el dominio quinasa de AUR2 humana. Predecimos que un homólogo de
aurora adicional finalmente será identificado en Drosophila
como caracterización de su genoma cerca de la terminación.
Los dominios N-terminales de los
aminoácidos 129 y 73 de AUR1 y AUR2 humanas comparten homología
limitada entre ellos y con los dominios análogos de los aminoácidos
160 y 100 de aurora de Drosophila y IPL1 de levadura. Las
regiones N-terminales de AUR2 humana o de ratón
comparten el 54% de identidad entre ellos y 28-30%
de identidad con las dos proteínas de Xenopus, y juntos
ayudan a definir dos motivos distantemente conservados presentes en
la región no catalítica de todas las auroras (Fig.1). El primer
motivo incluye 10 regiones amino, KENX_{4}PVK, llamado AUR Box1 y
el segundo motivo se centra alrededor de una región de 15
aminoácidos, QX_{9}AQRVL, llamado AUR Box 2 (ver sobrelíneas en
la Fig.1). La aurora de Drosophila tiene in inserto de 36
aminoácidos en AUR Box2. Varios sitios de fosforilación potenciales
para la serina y treonina también se conservan entre estas
proteínas incluyendo un motivo de fosforilación de la proteína
quinasa A RRXT en la región de activación de la quinasa. Un mutante
sensible a temperatura del gen IPL1 de levadura consiste en una
sustitución de Thr a Ala en el lazo de activación (gopalan et
al., J.Cell. Biol.. 138:643-656, 1997),
sugiriendo que la fosforilación en este sitio puede ser
biológicamente relevante. Mutantes adicionales en los homólogos de
la levadura (Chan 1993, supra) y Drosophila (glover 1995,
supra) de aurora han sido mapeados exclusivamente al dominio
quinasa, excepto para un mutante simple de Drosophila
(Glover 1995, supra) que implica una mutación en Asp47 en el
N-terminal de AUR Box2. Puesto que estas mutaciones
resultan en núcleos anormales, la desintegración del cromosoma, y
ejes monopolares, estos encuentros sugieren que la actividad
catalítica de las auroras puedan jugar un papel importante en la
biología del centrosoma.
Los pellets celulares de líneas de células
tumorales cultivadas se proporcionaron por nick Scuidero
(Developmental Therapeutics Program, NCI), y son parte del panel
tumoral NCI (ver sitio web
\underline{http://epnwsl.ncifcrf.gov:2345/}
\underline{dis3d/cancer\_screen/celllist.html)}. Muestras de tejidos humanos normales se obtuvieron del Cooperative Human Tissue Network (Cleveland, OH). Muestras de tejido colorrectal humano para análisis Northern y Southern se obtuvieron de los hospitales del área de Los Angeles incluyendo UCLA-Harbor, Wadsworth y cedars Sinai del 1988 al 1997. La histología tumoral se confirmó antes de la preparación de RNA, DNA y lisados de proteína de cada muestra. Se aisló células totales o RNA de tejido usando el protocolo de extracción de sales de guanidina/fenol de Chomczynski y Sacchi (Wolf et al., Oncogene 14:543-549, 1997). El Northern blot se llevó a cabo usando técnicas estándar (Mossie et al. Oncogene 11:2179-2184, 1995) con un fragmento de BamHI-SspI de 586 pb marcado de forma aleatoria del cDNA de aur2 humana. Un Northern Blot de varios tejidos y un blot del sistema inmune humano (Clontech) que contiene 2 \mug de poli A mRNA por vía también se probó para la expresión de aur2. Una sonda humana de cDNA b-actina (Clontech) se usó para confirmar la carga equivalente del RNA intacto. El RNA (10 \mug) de la línea de células de adenocarcinoma de hígado SK-HEP-1 (HTB52) servida como un estándar interno para la detección de la expresión de aur2 en cada blott. Los blots se cuantificaron usando un programa de fosforimagenador y ImageQuant (Molecular Dynamics, Mountain View, CA).
\underline{dis3d/cancer\_screen/celllist.html)}. Muestras de tejidos humanos normales se obtuvieron del Cooperative Human Tissue Network (Cleveland, OH). Muestras de tejido colorrectal humano para análisis Northern y Southern se obtuvieron de los hospitales del área de Los Angeles incluyendo UCLA-Harbor, Wadsworth y cedars Sinai del 1988 al 1997. La histología tumoral se confirmó antes de la preparación de RNA, DNA y lisados de proteína de cada muestra. Se aisló células totales o RNA de tejido usando el protocolo de extracción de sales de guanidina/fenol de Chomczynski y Sacchi (Wolf et al., Oncogene 14:543-549, 1997). El Northern blot se llevó a cabo usando técnicas estándar (Mossie et al. Oncogene 11:2179-2184, 1995) con un fragmento de BamHI-SspI de 586 pb marcado de forma aleatoria del cDNA de aur2 humana. Un Northern Blot de varios tejidos y un blot del sistema inmune humano (Clontech) que contiene 2 \mug de poli A mRNA por vía también se probó para la expresión de aur2. Una sonda humana de cDNA b-actina (Clontech) se usó para confirmar la carga equivalente del RNA intacto. El RNA (10 \mug) de la línea de células de adenocarcinoma de hígado SK-HEP-1 (HTB52) servida como un estándar interno para la detección de la expresión de aur2 en cada blott. Los blots se cuantificaron usando un programa de fosforimagenador y ImageQuant (Molecular Dynamics, Mountain View, CA).
El análisis Northern blot de mRNA aislado de
tejidos humanos adultos normales demuestra que la expresión de aur2
esprimariamente restringida a los testículos, timo, e hígado fetal,
con expresión muy débil en médula ósea, nódulo linfático, y bazo y
expresión no detectable en todos los otros tejidos adultos
examinados. Estudios adicionales mostraron una fuerte regulación
temporal de esos transcritos durante la mitosis (y Kimura 1997,
supra). Aur1 humana también se expresó a los niveles más
altos en testículos normales y timo, con un nivel de expresión en
pulmón e intestino delgado.
Puesto que esos genes fueron originalmente
identificados a partir de tumores humanos, realizamos análisis de
Northern Blot con aur2 sobre un panel de líneas de células humanas
de colon, renal, melanoma, y de origen mamario. El transcrito de
aur2 de 2,4kb se expresó en el 96% (24 de 25) de estas líneas de
células transformadas, siendo la única excepción la línea de
células de carcinoma renal UO-31. El transcrito aur1
de 1,4 kb se coexpresó a niveles sorprendentemente similares como
aur2 en las mismas 24 líneas de células tumorales.
El panel híbrido de radiación de Standford G3 se
obtuvo a partir de Research Genetics (Huntsville, Alabama). Los
cebadores usados para el mapeo del híbrido de radiación fueron:
5'-ATGCCTCCGGAAAGAGCCTGT-3' (ID DE
SEC NO:36) y
5'-GTGTCCCACTGCTATTCTCCAT-3' (ID DE
SEC NO:37) para aur1 y
5'-CAGGGCTGCCATAACCTGA-3' (ID DE SEC
NO:38) y 5'-CTAGCACAGGCTGACGGGGC-3'
(ID DE SEC NO:39) para aur2. Los cebadores aur1 se dirigen a la
región N-terminal del gen y generan un fragmento de
247 pb siguiendo PCR de 25 ciclos con una temperatura de hibridación
de 54ºC. Los cebadores de aur2 amplifican un fragmento de 255 pb a
partir de 3'UTR siguiendo una PCR de 25 ciclos con una temperatura
de hibridación de 54ºC. La puntuación natural para aur1 contra el
panel SHGCR G3 es:
00000000000010000000000000000000000000010000000100100100000000000100000000001010101,
y para
aur2:
aur2:
10000000001000101000000100010010000000000010000001100001001001010000010010010010010.
El DNA genómico se aisló de las muestras de
tejido colorectal humano por métodos estándar (digestión con
Proteinasa k, extracción con fenol: cloroformo, y precipitación con
etanol). Los southern blots se prepararon por digestión de 5\mug
de DNA con PstI, separando los fragmentos en geles de agarosa 1%,
tintando sobre las membranas de nylon (Nytran-Plus,
Schelicher & Schuell), y probando secuencialmente con un
fragmento de cDNA de aur2 de 1044pb marcado con un cebador aleatorio
8pSG19) y un fragmento clonado de 1700 pb del gen CYP24
(pKs-h24, de J. Modal, U. of New México). Una sonda
para \beta-globina humana se usó para confirmar la
carga equivalente de la muestra. Los lavados finales fueron a 0,1X
SSC, 0,15 SDS, 60ºC. Se cuantificaron los autoradiógrafos relativos
a \beta-globina usando el programa ImageQuant
(Molecular dynamics, Mountain View, CA).
La expresión de Aur2 fue caracterizada a
continuación por análisis Northern blot en un panel de 41 tumores
primarios colorectales humanos y relacionado con el tejido
colorectal normal de los mismos pacientes. Aproximadamente el 54%
(22/41) de las muestras mostraron expresión incrementada del
transcrito de aur2 de 2,4 kb en el tumor en comparación con el
control de colon normal. El RNA de Aur2 mostró sobrexpresión
4-28 veces más en tejidos tumorales frente a tejidos
normales.
Los genes aur1 y aur2 se mapearon usando el panel
híbrido de radiación de Stanford human genome center G3. Aur1
humana se localiza en el cromosma 17p13.1 (puntación LOD de 9,555
al marcador unido SHGC-35513) y aur2 en el cromosoma
20q13.2 (puntuación LOD de 17,56 para el marcador unido
SHGC-3245). El mapeo también se confirmó por
hibridación de un panel híbrido de células somáticas de
roedores-humanos (Coriell Cell Repository, Camden,
NJ). Los mapas de Aur2 adyacentes al gen de la hidroxilasa de la
vitamina D (CYP24) y la sonda cósmida RMC20C001 que se sitúa en el
Flpter 0,825-0,83 (longitud fraccional de pter) en
el cromosoma 20 (Tanner 1994, supra; Tanner 1996,
supra). Ambos de estos marcadores han sido caracterizados por
su presencia en el amplicón 20q13 común a varias malignidades
humanas, particularmente aquellas de cánceres de mama, vejiga, y
colon.
La hibridación Southern blot se realizó usando
una sonda cDNA de aur2 a lo largo con una sonda control para el gen
CYP24 que sirve como marcador del amplicón (Tanner 1994,
supra; Tanner 1996, supra). La sonda aur2 hibridizada
a los fragmentos PstI de 5,8; 3,7; 3,3; 2,8; 2,5; y 1,3kb. Las
bandas 5,8; 3,3; 2,8; y 2,5kb son específicas para aur2. Solamente
las bandas específicas para aur2 mostraron amplificación en las
muestras tumorales.
El DNA de aur2 se amplificó en 41 de 79 (52%) de
los tumores primarios colorectales para los que el DNA adecuado
estaba disponible para genotipar. Nueve de las doce muestras
mostraron una amplificación 2-8 veces superior del
DNA de aur2 en tumores comparado con el tejido normal. Una de las
muestras mostró sobrexpresión de RNA en ausencia de amplificación
de DNA, mientras que las otras once mostraron una correlación
directa entre la amplificación de DNA y la sobrexpresión de RNA. El
gen CYP24 se encontró que era co-amplificado con
aur2 en 37 de 41 (90%) de las parejas relacionadas, y solamente una
vez se encontró que se amplificaba en ausencia de la amplificación
de aur2.
Hay una gran correlación (\rho= 0,695) entre la
amplificación de DNA de aur2 y la sobreexpresión de RNA con
solamente un resultado discordante. En el caso simple de
amplificación de DNA de aur2 en ausencia de la sobreexpresión de
RNA, el RNA de aur2 realmente se elevó en ambos especímenes normal
y tumoral, comparado con otros pares
normal-tumoral. Concebiblemente, la alta expresión
de RNA de AUR2 en esta muestra de colon normal puede representar
una lesión temprana predispuesta. Inversamente, cinco pares de
muestras mostraron la expresión de RNA incrementada en ausencia de
amplificación de DNA, posiblemente debido a la activación
transcripcional. Si estos cinco pares se excluyen del análisis, la
correlación entre la amplificación del DNA de aur2 y la
sobreexpresión de RNA incrementa hasta \rho=0,939. Este dato
sugiere que la amplificación del DNA es un mecanismo de activación
de AUR'' y también implica aur2 como un oncogen a 20q13 cuyo alto
nivel de amplificación se correlaciona con el pobre resultado
clínico en cáncer de mama (Isola 1995, supra).
Para determinar si la secuencia de aur2 del
amplicón 20q13 fue la misma que las fuentes normales, realizamos la
secuenciación directa de los productos de RT-PCR
abarcando la región codificante completa de aur2 a partir de 10
muestras de tumor primario colorrectal. Ocho muestras, incluyendo
niveles normales y amplificados del amplicón 20q13, confirmaron la
secuencia de aur2. Un polimorfismo simple del nucleótido se
identificó en 2 muestras resultando en un cambio de fenilalanina a
isoleucina en el residuo 31 en el N-terminal Aurora
Box1 (en círculo en la Fig 1). Este análisis demuestra que el
amplicón 20q13 generalmente contiene copias incrementadas de la
región codificante de aur2 no mutado, intacto.
Muestras de tejidos humanos relacionados de
carcinomas primarios colorectales y de tejidos adyacentes normales
se obtuvieron del Cooperative human Tissue Network (Cleveland, OH) y
Pathology Associates International (Frederick, MD). Treinta
secciones de criostato de micra de tejido embebido en OCT se lisaron
directamente en 25 \muL de tampón RIPA enfriado (50 mM
Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0%
NP-40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, 1 mM DDT, e
inhibidores de proteasa) mezclando suavemente sobre hielo durante 20
minutos. El lisado luego se agitó durante 10 minutos a 10.000 x g en
una microcentrifuga a 4ºC. El sobrenadante resultante se transfirió
a un tubo limpio y la concentración de proteína total se determinó
por análisis de Bradford. Cantidades equivalentes de proteína total
de las muestras relacionadas se determinaron en un gel de
poliacrilamida al 12%, transferido en una membrana de nylon
(BioRad), y se sondeó con una dilución 1:2.000 de anticuerpos
purificados de afinidad a AUR2. El inmunoblot se desarrollo con el
reactivo ECL (Amersham). Los lisados de las líneas de células
tumorales se prepararon y se analizaron como se ha descrito
antes.
Para analizar la expresión de la proteína AUR2,
generamos anticuerpos policlonales en conejos contra el marco de
lectura abierto completo en E.coli como proteína de
fusión-GST.
Los anticuerpos anti-AUR2 se
usaron para probar los blots de lisados de proteínas hechos a
partir de secciones de criostato de carcinomas primarios de colon
humano o de tejidos adyacentes normales. Los anticuerpos de AUR2
detectaron una proteína aproximadamente de 46 kDa en dos carcinomas
primarios de colon humano, pero no en muestras derivadas de tejidos
adyacentes normales. Estos anticuerpos también detectaron
sobreexpresión de la proteína AUR2 en varias líneas de células
tumorales cultivadas derivadas de carcinomas colorectales.
Las versiones marcadas con HA de tipo salvaje, la
quinasa muerta (K162M), y aur2 activada (T288D) fueron subclonada en
el vector de expresión pLXSN. Estos constructos se transfectaron en
la línea de células amfotrópicas empaquetadas PA317 y los
sobrenadantes se cultivaron y se usaron para infectar la línea
celular productora GP+E-86 (Markowitz et al.,
virology 167:400-406, 1988). Se seleccionaron clones
resistentes a la Neomicina y se ensayaron para la expresión de la
proteína AUR2. Los sobrenadantes de las líneas celulares productoras
positivas se usaron para infectar células Rat1 y NIH3T3. Los clones
estables se seleccionaron en presencia de Neomicina y se ensayaron
para la expresión de la proteína AUR2 por inmunoblot.
Las células Rat1 y NIH3T3 que expresan el
constructo apropiado de aur2 se solubilizaron en tampón de lisis de
quinasa (50 mM Hepes, pH 7,4, 100 mM KCl, 25 mM NaF, 0,5%
NP-40, 1 mM NaVO_{3}, 1 mM DDT, e inhibidores
proteasa) durante 15 minutos sobre hielo, se agitó a 10.000 x g
durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante resultante se transfirió
a un tubo limpio y la concentración de proteína total se determinó
por análisis de Bradford. Cantidades equivalentes de proteína
(normalmente 2mg) se inmunoprecipitaron con el anticuerpo
monoclonal 12CA anti-HA (Boehringer). Los complejos
inmunes se lavaron tres veces con tampón quinasa (sin
\gamma-^{32}P-ATP y
\alpha-caseína) y se resuspendió en 30\muL de
tampón quinasa 1x (20 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MnCl_{2},
5 mM NaF, 1 mM DDT, 50 \muM ATP, 20 \muCi
\gamma-^{32}P-ATP, y 0,5 mg/mL
\alpha-caseína). Reacciones in vitro de la
quinasa se llevaron a cabo durante 20 minutos a 37ºC y se pararon
por la adición de 30 \muL de tampón de muestra SDS Laemmli 2x. Las
muestras se incubaron durante 5 minutos a 95ºC y se resolvieron
sobre geles de SDS-poliacrilamida 14%.
Una solución al 3% de agar (a 56ºC) se diluyó
hasta una concentración final de 0,6% cn medio de crecimiento (a
56ºC), se pipeteó en placas de tejido de cultivo, y se dejó
solidificar a temperatura ambiente durante 20-30
minutos. En ese momento, se mezclaron 2 x 10^{5} células en un
volumen de 50 \muL con agar 0,3% (diluido con medio de
crecimiento a 40ºC), se pipeteó suavemente sobre la capa de la
superficie del agar, y se dejó solidificar durante
20-25 minutos a temperatura ambiente. Una vez
solidificado, las placas se incubaron a 37ºC en una atmósfera de 5%
CO_{2}. Se añadía agar fresco una vez a la semana. Después de 4
semanas las placas se marcaron con rojo neutro.
Si aur2 es una diana relevante en el amplicón
20q13, podría esperarse que la sobreexpresión de aur2 sería
transformante. Para examinar esta cuestión, establecimos líneas
celulares de Rat1 que expresan aur2 humana. Las células Rat1 se
infectaron con retrovirus que expresan una aur2 se tipo salvaje
marcado con hemaglutinina (HA) (Pati 1992, supra) o un
mutante de quinasa inactiva donde la lisina esencial en el residuo
162 (Fig.1) en la región de activación se cambió a un ácido
aspártico (T288D). Esta mutación se diseñó para imitar la
fosforilación constitutiva a este sitio y en caso de necesidad
activa la quinasa in vitro. Las líneas Rat1 estables
expresaron cantidades similares de la proteína AUR2. Los ensayos
quinasa in vitro se realizaron usando la proteína AUR2
producida por líneas celulares estables. El mutante AUR2 con la
quinasa inactiva (K162M) fue incapaz de fosforilar
\alpha-caseína sobre los niveles observados en la
línea celular control del vector in vitro, mientras que las
proteínas AUR2 de tipo salvaje y activadas (T288D) tenían actividad
incrementada en su sustrato artificial.
Para caracterizar el potencial transformante de
aur2, realizamos ensayos en agar blando con clones de Rat1. El
vector control, K162M, de tipo salvaje, y AUR2 T288D que expresa
células Rat1 se colocaron en placas en agar blando y se evaluaron
para el crecimiento tras 4 semanas. Las células que expresan el tipo
salvaje y las colonias que forman AUR2 T288D en agar blando, en
contraste con la falta de crecimiento por células que expresan AUR2
con la quinasa inactiva. Diez de los trece clones de tipo salvaje y
seis de los doce clones T288D crecieron en agar blando, comparado
con 1 de los once vectores y clones K162M. El número de colonias
formadas en agar blando a partir de dos clones independientes de
cada una de las transfecciones se cuantificó. El número medio de
colonias por 200.000 células que se colocaron en placas fue: K162M,
32 colonias; tipo salvaje, 470 colonias; y T288D, 250 colonias.
Aunque los estables de Rat1 T288D formaron menos colonias que los
estables de Rat1 AUR2 de tipo salvaje, las colonias T288D en general
crecieron hasta un tamaño grande.
El mutante AUR2 T288D también fue capaz de
transformar las células NIH3t3, puesto que midió el crecimiento en
agar blando y el crecimiento como tumores en ratones desnudos. En
contraste, AUR2 de tipo salvaje fue incapaz de transformar células
NIH3T3. La capacidad transformante de estos constructos se
correlación con la actividad catalítica, puesto que AUR2 de tipo
salvaje era catalíticamente inactiva en células NIH3T3 mientras que
el T288D tenían actividad quinasa fuerte. Este dato sugiere que el
fondo genético de las células es importante en determinar el
potencial de transformación de AUR2.
Se establecieron líneas celulares NIH3T3 estables
de ratón que expresan AUR2 humana. Las células NIH3T3 se infectaron
con retrovirus que expresan Aur2 de tipo salvaje marcada con
hemaglutinina (HA) (Chan 1993, supra) o un mutante con la
quinasa inactiva donde la lisina esencial en el residuo 162 (Fig.1)
se cambió a metionina (K162M). Además, una mutación activante se
hizo en que la treonina en el residuo 288 (Fig.1) en la región de
activación se cambió a un ácido aspártico (T288D). Esta mutación se
diseñó para imitar la fosforilación constitutiva en este sitio y en
caso de necesidad activa la quinasa in vitro. Las líneas
estables expresaron cantidades similares de la proteína AUR2. Se
realizaron ensayos in vitro de la quinasa usando la proteína
AUR2 producida por las líneas celulares estables.
El mutante Aur2 de tipo salvaje y con la quinasa
inactiva (K162M) fue incapaz de fosforilar la proteína básica
mielina in vitro, sin embargo el mutante AUR2 activado
(T288D) había presentado actividad en su sustrato artificial. No
está claro porque AUR2 de tipo salvaje parece ser catalíticamente
inactivo en el ensayo quinasa in vitro. Quizás un activador
putativo de AUR2 se limita en las células NIH3T3 o un regulador
negativo, así como una fosfatasa de AUR2, ha incrementado la
actividad en estas células. En caso de necesidad, un mutante
interferente de la fosfatas de S.cerevisiae PP1 puede
exacerbar el fenotipo mutante de IPL2, sugiriendo que IPL1 puede ser
negativamente regulado por su fosfatasa (Francisco et al,
mol. Cell. Biol. 14:4731-4740). También es posible
que mientras AUR2 activado puede utilizar la proteína básica mielina
como un sustrato artificial in vitro, la quinasa de tipo
salvaje tiene una preferencia de sustrato más restringido.
Para determinar si la expresión ectópica de AUR2
activada altera el crecimiento de las células NHI3T3, se generaron
curvas de crecimiento en el medio que contiene poco suero (2%).
Durante las primeras 24 horas bajo estas condiciones, la expresión
de AUR2 activado proporcionó una ventaja en el crecimiento de NIH3T3
comparado con las líneas celulares que expresan AUR2 de tipo
salvaje, AUR2 con la quinasa inactiva, o el vector control. Sin
embargo, después de 48 horas en suero al 2%, todas las líneas
celulares cesaron de dividirse, indicando que AUR2 activada solo es
incapaz de promover la proliferación indefinida de células.
Para caracterizar el potencial de transformación
de AUR2 activada, se realizaron ensayos en agar blando con clones
3T3. El vector control, de tipo salvaje, quinasa inactiva, y AUR2
activada que expresa células NIH3T3 se colocaron en placas en agar
blando y se evaluaron para el crecimiento después de
3-4 semanas. Las células que expresan AUR2 activada
crecieron colonias en agar suave, en contraste con la falta de
crecimiento por células que expresan AUR2 de tipo salvaje y con la
quinasa inactiva. La expresión ectópica de AUR2 activada parece ser
que confiere una ventaja de crecimiento a las células NIH3T3 en
suero bajo y resultados en el crecimiento dependiente de
anclaje.
Se sembraron células humanas H1299 a confluencia
del \sim40-50% en una placa de 6 pocillos
(Falcon). Al día siguiente se mezclaron lipofectina (Gibco) y
oligo(s) con OptiMEM (Gibco) tal que la concentración final
de lipofectina es 100 \mug/mL y la concentración final de cada
oligo es 1 \muM en un volumen de 200\muL. La mezcla
lipofectina/oligo/OptiMEM se incubó a temperatura ambiente
(20-25ºC) durante 15 minutos, se añadieron 800
\muL de OptiMEM a la mezcla lipofectina/oligo/OptiMEM, y se mezcló
suavemente. Se aspiró el OptiMEM, se añadió la mezcla
lipofectina/oligo/OptiMEM, los cultivos se incubaron a 37ºC durante
4 horas. La mezcla lipofectina/oligo/OptiMEM se eliminó y se
reemplazó con medio de crecimiento normal conteniendo
oligo(s) antisentido a una concentración de 200 nM. Las
placas se devolvieron al incubador a 37ºC durante
16-20 horas después que el medio de crecimiento se
eliminara de las células y se lavaron una vez con OptiMEM. Se volvió
a aspirar el OptiMEM y se añadió la mezcla lipofectina/oligo/OptiMEM
(preparado como se ha descrito) y las placas se incubaron otra vez a
37ºC durante 4horas. La mezcla lipofectina/oligo/OptiMEM se eliminó
otra vez y se reemplazó con medio de crecimiento normal conteniendo
oligo(s) antisentido a una concentración de 200 nM. Las
placas se devolvieron al incubador de 37ºC durante
16-20 horas. Las células se recogieron (\sim40
horas tras el tratamiento inicial) y se analizaron para el mRNA de
aur2 por northern blor o la expresión de la proteína aur2 por
inmunoblot.
Tres oligonucleótidos antisentido (ID DE SEC
Nos:16,17, y 18) cuyas regiones específicas diana del transcrito de
mRNA de aur2 humana se encontró para regular significativamente la
expresión de la proteína AUR2 en la línea de células de tumor humano
H1299. Cuando se usa en combinación oligos ID de SEC NO:30 y ID DE
SEC NO:32 y ID DE SEC NO:31 y ID de SEC NO:32 reducen la expresión
de la proteína AUR2 bajo el límite de detección. El tratamiento de
células H1299 con la combinación de ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC
NO:32 inhibió el crecimiento y pareció que inducía la apoptosis
puesto que se midió por FACs.
Secuencias (5'-3'): el número de
oligo así como la localización de la secuencia con el cDNA de aur2
se presentan más abajo. Nota: esto oligonucleótidos se sintetizaron
como fosfotionatos.
ID de SEC NO:30 (nucleótidos
1743-1763): CAGGGCAGAGTGGTCACTTTC
ID DE SEC NO:31 (nucleótidos
42-62): CGTCCGCCACTCCGACCAGCC
ID DE SEC NO:32 (nucleótidos
1654-1674). TGCAGTCGAACCTTGCCTCCA
Estos oligonucleótidos antisentido serían útiles
ara la inhibición de la expresión de AUR2 en células tumorales y
normales con el fin de perfilar los efectos de potencial de las
pequeñas moléculas inhibidoras de AUR2. También se pueden usar para
inhibir la expresión de AUR2 en xenoinjertos de células tumorales
humanas en ratones desnudos para determinar los efectos
antitumorales de los inhibidores de AUR2. Otro uso es como
"fármaco" para inhibir la expresión en varios tumores humanos
que son "conducidos" por sobreexpresión del gen aur2.
Los ensayos pueden realizarse in vitro o
in vivo y se describen en detalle aquí o se pueden obtener
modificando los ensayos existentes, tales como el ensayo de
crecimiento descrito en la Solicitud de Patente de serie No.
08/487.08 (Lyon & Lyon Docket No. 212/276), archivada el 7 de
Junio, 1995, por Tang et al., y titulada "Novel
pharmaceutical Compounds", o los ensayos descritos en la
Solicitud de Patente de serie No. 60/005.167 (Lyon & Lyon Cocket
No 215/256), archivada el 13 de Octubre, titulada "Diagnosis and
Treatment of TKA-1 related disorders", de esta
manera todas incorporadas aquí por referencia en su integridad
incluyendo las figuras. Otro ensayo que podría ser modificado par
usar los genes de la presente invención se describe en la Aplicación
Internacional No. WO 94/23039, publicada el 13 de Octubre, 1994, de
esta manera incorporada aquí por referencia en su integridad
incluyendo algunas figuras. Otras posibilidades incluyen la
detección de la actividad quinasa en un ensayo de autofosforilación
o probando la actividad quinasa en sustratos estándares tales como
histonas, proteína básica mielina, gamma tubulina, o proteínas
centrosomales. Se pueden identificar compañeros de unión poniendo la
porción N-terminal de la proteína en un cribado
híbrido de dos o detectando fosfotirosina de una quinasa de
especificidad dual (Fields and Song, Patente Estadounidense No.
5.283.173, publicada el 1 de febrero, 1994, incorporada por
referencia aquí, incluyendo las figuras).
Una manera por la que los inhibidores de la
actividad de AUR2 puedan ser definidos es un sistema de cribado
usando un mutante de levadura sensible a temperatura como describe
Chan and Botstein (Genetics 135:677-691, 1993); ver
también Francisco et al. (Mol. Cell. Bio.
14:4731-4740, 1994) ambas de la que así se
incorporan por referencia aquí en su integridad incluyendo las
figuras.
Brevemente, la cepa
CCCY72-3D-1 de levadura (ipl
1-2), que expresa una forma sensible a la
temperatura del homólogo de la levadura de AUR2 (ip11), mientras
que las células son viables a 26ºC son incapaces de crecer a 37ºC.
La transfección de esta cepa con un plásmido de expresión que
contiene un gen aurora híbrido que consiste en la porción
N-terminal de ip11, conteniendo el/los dominio/s de
interacción al sustrato putativo, y la porción
C-terminal de AUR2, que contiene el dominio
catalítico, vence esta sensibilidad a la temperatura de
crecimiento. La cepa de levadura que expresa AUR luego crece a 37ºC
en presencia de una sustancia de prueba. El crecimiento no será
evidente en presencia de sustancias que inhiben la función
catalítica de AUR. Inhibidores potenicales incluyen
oligonucleótidos antisentido, productos químicos de bajo peso
molecular, y/o productos naturales aislados de diversos organismos
tales como hongos, organismos marinos, plantas, etc.
Un experto en el campo apreciaría rápidamente que
la presente invención se adapta bien para cumplir los objetivos y
obtener los resultados y ventajas mencionados, así como aquéllos
inherentes en ella. Los complejos moleculares y los métodos,
procedimientos, tratamientos, moléculas, compuestos específicos
descritos aquí actualmente representan realizaciones preferidas
como ejemplo, y no pretenden ser limitaciones en el alcance de la
invención. Los entendidos en la materia encontrarán otros usos y
cambios en ella que estarán dentro del espíritu de la invención
definidos por el alcance de las reivindicaciones.
Será rápidamente evidente para un entendido en el
campo que se pueden hacer varias sustituciones y modificaciones a
la invención descrita aquí sin salir del alcance y objetivo de la
invención.
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en
la especificación son indicativas de los niveles de aquellos
expertos en el campo a la que pertenece la invención. Todas las
patentes y publicaciones se incorporan aquí por referencia a la
misma extensión como si cada publicación individual se indicara
específicamente e individualmente para ser incorporada por
referencia.
La invención ilustrativamente descrita aquí
adecuadamente puede ser practicada en ausencia de cualquier
elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se describen
específicamente aquí. Así, por ejemplo, en cada referencia a
cualquiera de los términos "comprender", "consistir
esencialmente en" y " consistir en" pueden ser reemplazados
con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones
que se han empleado se usan como términos de descripción y no de
limitación, y no hay intención que en el uso de estos términos y
expresiones de excluir ningún equivalente de las características
mostradas y descritas o porciones de los mismos, pero se reconoce
que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la
invención reivindicada.
Además, donde las características o aspectos de
la invención se describen en términos de grupos Markush, aquellos
entendidos en la materia reconocen que la invención también se
describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de
miembros del grupo Markush. Por ejemplo, si x se describe como
selección del grupo que consiste en bromo, cloro, y yodo, se
describen completamente reivindicaciones para que X sea bromo y
reivindicaciones para que x sea bromo y cloro.
En vista de la degeneración del código genético,
otras combinaciones de ácidos nucleicos también codifican los
péptidos reivindicados y proteínas de la invención. Por ejemplo,
todas las secuencias de ácidos nucleicos GCT, GCC, GCA, y GCG
codifican el aminoácido alanina. Así, si para un aminoácido existe
una media de tres codones, un polipéptido de 100 aminoácidos en
longitud, será, de media, codificado por 3^{100}, o 5 x
10^{47}, secuencias de ácido nucleico. Los expertos en el campo
entienden que, por lo tanto, una secuencia de ácidos nucleicos se
puede mordicar para formar una segunda secuencia de ácido nucleico,
codificando el mismo polipéptido codificado por las primeras y
segundas secuencias de ácido nucleico, usando procedimientos
rutinarios y sin demasiada experiencia. Así, todos los ácidos
nucleicos posibles que codifican los péptidos y proteínas
reivindicados también se describen completamente aquí, como si todas
fueran escritas completamente teniendo en cuenta el uso del codón,
especialmente que sean preferidas en humanos.
Además, cambios en las secuencias de aminoácidos
de polipéptidos o en la secuencia correspondiente del ácido nucleico
que codifica tal polipéptido, pueden ser diseñados o seleccionados
por tener lugar en un área de la secuencia donde la actividad
significativa del polipéptido, permanece invariable. Por ejemplo, un
cambio de aminoácido puede tener lugar en una
hoja-\beta, lejos del sitio activo del
polipéptido. También cambios como delecciones (p.ej. supresión de un
segmento del polipéptido o en la secuencia de ácidos nucleicos
correspondiente que codifica tal polipéptido, que no afectan el
sitio activo) y adiciones (p.ej. adición de más péptidos a la
secuencia de polipéptidos sin afectar la función del sitio activo,
así como la formación de proteínas de fusión a GST o adiciones en la
secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica tal
polipéptido sin afectar la función del sitio activo) también se
encuentran dentro del alcance de la presente invención. Estos
cambios a los polipéptidos se pueden realizar por aquellos expertos
en el campo usando procedimientos rutinarios y sin demasiada
experimentación. Así, todas las secuencias de ácidos nucleicos y/o
aminoácidos que puede ser rápidamente determinadas que no afectan
una actividad significativa del polipéptido o proteína de la
invención se describen completamente aquí.
Otras realizaciones están dentro de las
siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Plowman, Gregory, Mossie,Kevin
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Diagnosis y tratamiento de alteraciones relacionadas con AUR1 y/o AUR2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 39
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Lyon & Lyon
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 633 West Fifth Street (Suite 4700)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Angeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: U.S.A
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 90071-2066
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco 3,5'', almacenaje de 1,44Mb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: IBM PC-DOS 5.0
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMAS: FastSEQ para Windows 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: para asignar
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO: adjunto aquí
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA PREVIA DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/755.728
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO: 25 de noviembre, 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/008.809
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO: 18 de diciembre, 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/023.943
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO: 14 de agosto, 1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Warburg, Richard J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.327
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/RÓTULO: 229/022
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (213)489-1600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (213)955-0440
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 67-3510
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1244 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2198 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 344 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 403 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asn Ser Tyr Pro Trp Pro Tyr Gly Arg
Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ile Ser Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Phe Pro Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Asn Ser Gly Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Glu Pro Val Thr Pro Ser Ala Leu
Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Met Ser Arg Ser Asn Val Gln Pro Thr Ala
Ala Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Gln Asn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln Ala
Thr Ser Val Pro His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Met Glu Asn Ser Ser Gly Thr Pro
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Thr Arg His Phe Thr Ile Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn
Asn Pro Glu Glu Gln}
\sac{Leu Ala Ser Lys Gln Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- La letra "R" se presenta como A o G.
\vskip0.500000\baselineskip
- La letra "Y" se presenta como C o T.
\vskip0.500000\baselineskip
- La letra "N" se presenta como A, C, G o T
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA NO:16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGARTTYGGNG ARGTNTTYYT NGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:17
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- La letra "N" se presenta como A, C, G o T
\vskip0.500000\baselineskip
- La letra "R" se presenta como A o G
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA NO:17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGNACNCCRA ANGCCCACAC RTC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Phe Gly Glu Val Phe Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGCTCGG GAGAAGAAAA GCCAT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:20
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATCATCTC TGGGGGCAGG TAGT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:22
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu Gln Leu
Ala Ser Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:23
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ser Lys Gln
Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:24
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Gln Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Trp Pro
Tyr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:25
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Gln Lys Val Met Glu Asn Ser Ser Gly
Thr Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:26
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: "Xaa" en las posiciones 2,4,5 y 7 se presenta como un aminoácido identificado.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:27
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Trp Ser Tyr Phe Gly Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:28
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- "Xaa" en las posiciones 2 y 6 se presenta como un aminoácido identificado
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Xaa Trp Ala Ser Xaa Gly Ile Val}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:29
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- "Xaa" en la posición 4 representa Asp ó Ser
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Trp Xaa Phe Gly Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:30
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGGCAGAG TGGTCACTTT C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:31
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCCGCCAC TCCGACCAGC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:32
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCAGTCGAA CCTTGCCTCC A
\hfill21
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:33
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:34
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCTTTGCA TCCGCTCCTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:35
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTTGCCTC CTGTGAAGAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:36
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCCTCCGG AAAGAGCCTG T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:37
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTCCCACT GCTATTCTCC AT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:38
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGGCTGCC ATATAACCTG A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:39
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGCACAGG CTGACGGGGC
\hfill20
Claims (5)
1. Un oligonucleótido antisentido en donde el
oligonucleótido antisentido está comprendido por una secuencia de
bases nucleotídicas seleccionada del grupo formado por ID DE SEC
NO:30, ID DE SEC NO:31 y ID DE SEC NO:32.
2. Una composición farmacéutica que comprende uno
o más oligonucleótidos antisentido seleccionados del grupo formado
por ID DE SEC NO: 30, ID DE SEC NO: 31 y ID DE SEC NO:32.
3. El uso de un oligonucleótido antisentido de
acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de una enfermedad asociada a AUR1 y/o AUR2.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en
donde dicha enfermedad se selecciona del grupo formado por cáncer de
colon, cáncer de mama, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer de
vejiga, cáncer de cabeza y cuello, gliomas, meduloblastomas,
condrosarcomas y tumores pancreáticos.
5. El uso de la reivindicación 4, en donde dicha
enfermedad se selecciona del grupo formado por cáncer de colon, mama
y renal.
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