ES2320115T3 - Ensayos para monitorear a un paciente con cancer con base en los niveles de los componentes analitos del sistema activador de plasminogeno en muestras de fluido corporal. - Google Patents

Abstract

Un método para monitorear el avance del cáncer, o la eficacia del tratamiento o la terapia contra el cáncer, en un paciente con cáncer, que comprende: (a) medir los niveles de uno o más de los siguientes componentes del sistema activador de plasminógeno (uPA) en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer antes de, o al inicio de, la terapia o el tratamiento contra el cáncer: (i) uPA en una muestra de suero, (ii) PAI-1 en una muestra de plasma; y (iii) complejo uPA:PAI-1 en una muestra de plasma; (b) determinar si los niveles en la muestra de uno o más del uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 en el paciente con cáncer son mayores comparados con los niveles normales de cada uno de los componentes respectivos del sistema activador de plasminógeno en controles normales para obtener un primer valor para los analitos del sistema PA en el paciente; (c) medir los niveles de uno o más de (i) uPA en una muestra de suero del paciente con cáncer; (ii) PAI- 1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer; o (iii) el complejo uPA:PAI-1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer durante y/o después del transcurso de un tratamiento o una terapia contra el cáncer; (d) determinar si los niveles en la muestra del paciente de uno o más del uPA, de los componentes de sistema se incrementa comparado con los niveles normales de cada uno de los respectivos componentes del sistema activador de plasminógeno en controles normales durante y/o después del transcurso de la terapia o del tratamiento contra el cáncer; y (e) establecer que el tratamiento o la terapia contra el cáncer es o no efectiva; en donde un incremento o elevación en los niveles de la muestra del paciente con cáncer de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 durante o después del tratamiento o la terapia contra el cáncer comparado con los niveles de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en controles normales y con relación al primer valor de (a) indica que el tratamiento o la terapia contra el cáncer no es efectiva o que el paciente no está respondiendo al tratamiento o a la terapia; y además en donde una disminución en los niveles de la muestra de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1durante o después del tratamiento o la terapia contra el cáncer comparado con los niveles de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en controles normales y comparado con el primer valor de (a) indica un tratamiento o una terapia efectivos, o una respuesta favorable por parte del paciente con cáncer; en donde el nivel normal de uPA en controles normales es un valor de 459-1924 pg/ml; en donde el nivel normal de PAI-1en controles normales es un valor superior a 63 ng/ml; y en donde el nivel normal de uPA en controles normales es un valor del complejo uPA:PAI-1 superior a 293 pg/ml.

Description

Ensayos para monitorear a un paciente con cáncer con base en los niveles de los componentes analitos del sistema activador de plasminógeno en muestras de fluido corporal.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con ensayos para monitorear o evaluar el progreso de pacientes con cáncer durante el transcurso de la enfermedad o del tratamiento de la enfermedad o de la terapia para determinar los niveles de uno o más analitos del cáncer, esto es, de los componentes del sistema activador de plasminógeno (PA), comparado con los niveles de uno o más de estos componentes del sistema PA en individuos normales de control. De acuerdo con los métodos descritos aquí, la determinación de los incrementos en los niveles de uno o más entre el activador de plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), el inhibidor 1 de PA (PAI-1), o un complejo de uPA y PAI-1 (el complejo uPA:PAI-1), comparados con los niveles de estos analitos respectivos en controles normales es indicativa de los pobres resultados del paciente y/o del tratamiento con relación al estado de la enfermedad.

Antecedentes de la invención

El sistema activador de plasminógeno (PA) involucra a la plasmina del tipo de las serina proteasas y al activador de plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA); a las serpinas \alpha_{2}-antiplasmina, al inhibidor tipo 1 del activador de plasminógeno (PAI-1) y al inhibidor tipo 2 del activador de plasminógeno (PAI-2); y al receptor del uPA (uPAR). Durante la década pasada aumentó la evidencia de la intervención de componentes del sistema PA en la metástasis del cáncer y se cree que la ruta mediada por uPA de activación del plasminógeno es activa en el proceso del cáncer. (P. A. Andreasen y colaboradores, 1997, Int. J. Cancer, 72: 1-22).

Las enzimas proteolíticas, tal como aquellas del sistema PA, están involucradas en la metástasis e invasión por el cáncer en virtud de su habilidad para invadir y degradar membranas basales y proteínas de la matriz extracelular que rodean el tejido normal (J. H. DeWitte y colaboradores, 1999, Br. J. Cancer, 79: 1190-1198; L. A. Liotta y colaboradores, 1982 Cancer Metastasis Rev., 1: 277-297; K. Dano y colaboradores, 1985, Adv. Cancer Res., 44: 139-266; P. Mignatti y D.B. Rifkin, 1993, Physiol. Rev., 73: 161-195; y P. A. Andreasen y colaboradores, 1997, Ibid.). Las observaciones inmunohistoquímicas e in situ del uPA, del plasminógeno y la distribución del PAI-1 en adenocarcinomas muestran que la degradación de la proteinasa de la matriz extracelular se presenta como focos invasivos localizados (J. Grøndahl-Hansen y colaboradores, 1991, Am. J. Pathol., 138: 111-117; C. Pyke y colaboradores, 1991, Proc. Third Intl. Workshop on the Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation: Elsinore, 45; C. Pyke y colaboradores, 1991, Cancer Res., 51: 4067-4071). En el caso de angiogénesis, existe también una interacción funcional entre uPA y PAI-1 (E. Bacharach y colaboradores, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10686-10690).

El activador de plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA) es una serina proteasa de 52 kilodaltons (kDa) que es secretada por las células como un precursor inactivo, de cadena sencilla llamado pro-uPA. La escisión enzimática de pro-uPA en la lisina 158 produce un heterodímero activo, llamado un uPA de alto peso molecular (HMW-uPA), que contiene dos subunidades A y B. Cuando se secreta pro-uPA de las células, se enlaza a uPAR sobre la superficie de la célula a través de un dominio tipo EGF sobre la cadena A. El enlazamiento posterior de plasmina a uPA puede convertir pro-uPA en el heterodímero proteolíticamente activo. A su vez, uPA activo convierte rápidamente al precursor inactive de plasmina, plasminógeno, en plasmina enzimáticamente active, que está directamente involucrada en la degradación de la matriz extracelular, así como en la activación de otras procolagenasas, algunas prometaloproteasas y factores latentes de crecimiento (K. Dano y colaboradores, 1985, Ibídem; M. J. Duffy, 1992, Clin. Exp. Metastasis, 10: 145-155; J. R. Pollanen y colaboradores, 1991, Adv. Cancer Res., 57: 273-282; L. Ossowski, 1992, Cancer Res., 52:D: 6754-6760; P. Mignatti y D. B. Rifkin, 1993, Ibídem; y P. A. Andreasen y colaboradores, 1997, Ibídem). La escisión adicional de uPA después de la lisina 135 libera al fragmento amino términal de 17 kDa (ATF), dejando al uPA de bajo peso molecular del terminal carboxilo (LMW-uPA, 33 kDa), que retiene toda la actividad catalítica. (F. Blasi y colaboradores, 1990, Seminars in Cancer Biology, 1: 117-126).

Tanto PAI-1 como PAI-2 se enlazan a la cadena B catalíticamente activa de uPA para regular su actividad enzimática. Por medio de la formación de complejos con uPA enlazado a uPAR sobre la superficie de la célula, PAI-1 promueve el despeje de actividades proteolíticas de las superficies de las células, así como el reciclaje de uPAR no enlazado nuevamente a la superficie de la célula, regulando así el comportamiento total invasivo y metastático de las células cancerosas. (P. A. Andreasen y colaboradores, 1997, Ibídem y H. A. Chapman y colaboradores, 1997, Curr. Op. Cell Biol., 9: 714-724). PAI-1 es un inhibidor de la glicoproteína serina proteasa de 50 kDa que es el principal inhibidor fisiológico de ambas formas de los activadores de plasminógeno PA y del activador de plasminógeno del tejido (TPA). PAI-1 es segregado en una forma activa que espontáneamente se convierte en una forma latente (G. Deng y colaboradores, 1995, Thrombosis and Haemostasis, 74: 66-70), pero se la puede estabilizar en la forma activa por medio del enlazamiento con la proteína vitronectina del plasma (D. A. Lawrence y colaboradores, 1994, J. Biol. Chem., 269: 15223-15228). Tanto las células tumorales como las células endoteliales capilares expresan niveles más altos de PAI-1 que otros tipos de células (K. Bajou y colaboradores, 1998, Nature Medicine, 4: 923-928). Se cree que altos niveles de PAI-1 protegen al estroma tumoral de la degradación por las grandes cantidades de uPA segregado por las células. (E. Bacharach y colaboradores, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10686-10690; P. Kristensen y colaboradores, 1990, Histochemistry, 93: 559-566). Niveles elevados de PAI-1 pueden contribuir también a la angiogénesis tumoral inducida protegiendo la matriz extracelular que rodea al tumor de la degradación proteolítica (C. Pyke y colaboradores, 1991, Cancer Res., 51: 4067-4071). Cuando uPA activo se enlaza a su receptor, el enlazamiento posterior de PAI-1 resulta en la internalización y degradación del complejo uPA:uPAR:PAI-1. (M. V. Cubellis y colaboradores, 1990, The EMBO J., 9: 1079-1085). Esta reducción de la expresión de uPA disminuye la cantidad de uPA activo sobre la superficie de la célula.

El uPA segregado se puede originar a partir de diferentes tipos de células, incluidas las células tumorales (G. Markus y colaboradores, 1983, Cancer Res., 43: 5517-5525), las células estromales adyacentes y fibroblastos (C. Pyke y colaboradores, 1991, Am. J. Pathol., 138: 1059-1067). Los primeros estudios de PAI-1 y de los complejos de uPA:PAI-1 en oncogénesis involucraron el uso de lisados tumorales y citosoles; se encontró que niveles de PAI-1 en lisados tumorales tenían una correlación con el pronóstico del cáncer de seno. Se analizaron también los niveles tumorales de PAI-1 en cáncer de pulmón, cáncer de colon y en carcinoma de células renales; este inhibidor se ha convertido en un marcador de pronóstico poco prometedor en tejido tumoral para metástasis de cáncer. (P. A. Andreasen y colaboradores, 1997, Ibídem).

Debido a que los componentes del sistema PA están involucrados intrincadamente en el proceso del cáncer y en la diseminación del cáncer en una variedad de tipos de cáncer, que aqueja a ambos géneros, se trata de un problema en el arte el poder seleccionar en forma precisa y sensible en el transcurso del tiempo para determinar y monitorear a aquellos individuos que probablemente respondan, y/o que están respondiendo a, (o que no responden a), o se benefician de (o no se benefician de), una terapia(s) anticáncer, o combinación de terapias, particularmente, terapias dirigidas molecularmente al sistema de activación de plasminógeno. La presente invención resuelve tal problema proveyendo un método de ensayo sensible y confiable, preferiblemente un inmunoensayo, para determinar los niveles de los componentes analitos en el sistema PA en muestras de fluido corporal de pacientes con cáncer comparado con los niveles de estos componentes en el respectivo sistema PA en individuos normales. Además, la presente invención es conveniente en que se la emplea para monitorear a pacientes con cáncer que experimentan terapias contra el cáncer o antineoplásicas para tratar cánceres asociados con la actividad de los componentes del sistema PA para ayudar en la determinación y el examen de los regímenes de tratamiento contra el cáncer y el progreso del paciente y/o las repercusiones durante el transcurso de la enfermedad y/o la(s) terapia(s) anticáncer.

US2002/0012950 divulga métodos en los cuales se determinan complejos uPA:PAI-1 pero no se formulan valores de corte.

PEDERSEN Y COLABORADORES: "Determination of the complex between urokinase and its type-I inhibitor in plasma from healthy donors and breast cancer patients" CLINICAL CHEMISTRY vol. 45, no. 8, 1999, páginas 1206-1213, XP002968350 divulga unos ensayos para diagnosticar pacientes con cáncer pero no define valores claros de corte.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona ensayos (métodos) para el análisis de muestras de fluido corporal de pacientes con cáncer para detectar y medir los niveles de analitos del sistema PA, especialmente, uPA, PAI-1 y el complejo de uPA:PAI-1, para determinar si los niveles de uno o más se estos analitos se incrementan en pacientes con cáncer comparados con sus niveles respectivos en individuos normales. La determinación de un incremento mensurable en los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA en una muestra de fluido corporal de un paciente con cáncer, por ejemplo, una muestra de plasma o de suero, comparado con los niveles de estos analitos del sistema PA en controles normales, ofrece un medio de monitorear el estatus de la enfermedad de un paciente, y/o la respuesta de un paciente o el beneficio de una terapia contra el cáncer, tanto de tratamientos y terapias convencionales anticáncer como para una enfermedad antineoplásica, por ejemplo, fármacos, hormonas, y similares, y tratamientos y terapias que se dirigen más particularmente a uno o más de los componentes del sistema PA.

Un aspecto particular de la presente invención proporciona un método de monitoreo en el cual se monitorean los niveles en suero o en plasma de uPA, PAI-1, y el complejo uPA:PAI-1 en pacientes que tienen cáncer o una enfermedad neoplásica, por ejemplo, del colon, de la próstata, del seno (mama), o de pulmón, durante el transcurso del tratamiento antineoplásico o contra el cáncer, y preferiblemente antes de, o justo al inicio del tratamiento. La determinación de un incremento en los niveles en plasma o en suero de uno o más de estos analitos del sistema PA en el paciente con cáncer comparado con los niveles normales de uno o más de los analitos del sistema PA le permiten al médico tratante poder evaluar el progreso de la enfermedad del paciente y/o el desenlace de la enfermedad. Por ejemplo, con base en el monitoreo de los niveles de analito del sistema PA del paciente durante el transcurso del tiempo comparado con los niveles normales de los analitos, así como los niveles previamente determinados del mismo paciente, puede hacerse la determinación de si un régimen de tratamiento debe ser cambiado, esto es, para que sea más agresivo o menos agresivo; para determinar si el paciente está respondiendo favorablemente a su tratamiento: y/o para determinar el estado de la enfermedad, tal como una fase o etapa avanzada del cáncer, o una remisión, reducción o regresión del cáncer o enfermedad neoplásica.

Otro aspecto de la presente invención provee valores normales en plasma o en suero para uPA, PAI-1 y el complejo uPA:PAI-1 en individuos sanos. De acuerdo con la invención, se han establecido rangos normales de niveles en plasma o suero para uPA, PAI-1 y un complejo de uPA:PAI-1 para machos normales, hembras normales y tanto machos normales como hembras normales. (Tablas 1-3). Se proporcionan los niveles normales de uPA en suero; se proporcionan los niveles normales de PAI-1 y del complejo uPA:PAI-1 en plasma.

En aún otros aspectos de la presente invención, se proporcionan y se llevan a cabo los métodos para monitorear el cáncer o una enfermedad neoplásica para seleccionar a aquellos pacientes que probablemente se beneficien más de las terapias anticáncer o de enfermedades antineoplásicas, incluidas aquellas terapias que se dirigen específicamente a los componentes del sistema PA, como se describe aquí. De acuerdo con la invención, los métodos involucran el monitoreo de los componentes individuales del sistema PA, particularmente, uPA, PAI-1, y el complejo uPA:PAI-1, ya sea solos, o combinados entre sí, para proporcionar la valoración individualizada del estado del paciente antes, durante y después del tratamiento contra el cáncer; y tratamiento especializado del cáncer para el paciente canceroso, con base en la determinación de los niveles de uno o más de los componentes del sistema PA con relación a los niveles de esos componentes en controles normales.

Los aspectos adicionales, características y ventajas de la presente invención se entenderán mejor por la lectura detallada de la descripción de la invención cuando se los considere en conexión con las figuras/dibujos acompañantes.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 ilustra los niveles de PAI-1 en plasma humano normal. Para el operador 1, se determinó que el nivel de PAI-1 en plasma de una hembra normal era de 33,29 ng/ml y se determinó que el nivel I de PAI-1 en plasma de un macho normal era de 23,82 ng/ml; para el operador 2, se determinó que el nivel de PAI-1 en el plasma de una hembra normal era de 30,13 ng/ml y se determinó que el nivel I de PAI-1 en plasma de un macho normal era de 23,18 ng/ml. Para el operador 3, se determinó que el nivel de PAI-1 en plasma de una hembra normal era de 30,12 ng/ml y se determinó que el nivel I de PAI-1 en plasma de un macho normal era de 23,46 ng/ml.

La Fig. 2 muestra el incremento en plasma de los niveles de PAI-1 por tipo de cáncer, esto es, el porcentaje de pacientes que tienen niveles en plasma de PAI-1 por encima del corte normal, en pacientes que tienen cáncer de colon, de pulmón, o de próstata. En este análisis, para pacientes con cáncer de seno, se encontró que los niveles de PAI-1 en plasma en 24% de los pacientes estaban por encima de los niveles de PAI-1 en plasma en controles normales; para pacientes con cáncer de colon, se encontró que los niveles de PAI-1 en plasma en 30% de los pacientes estaban por encima de los niveles normales de PAI-1 en plasma; y para pacientes con cáncer de próstata, se encontró que los niveles de PAI-1 en plasma en 12% de los pacientes estaban por encima de los niveles normales de PAI-1 en plasma.

La Fig. 3 ilustra los niveles promedio del complejo uPA:PAI-1 en plasma normal de macho y en plasma normal de hembra.

La Fig. 4 muestra el incremento en los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma por tipo de cáncer, esto es, el porcentaje de pacientes que tienen niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma por encima del corte normal, n pacientes que tienen cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de pulmón y cáncer de próstata. En este análisis, para los pacientes con cáncer de seno, se encontró que los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma en 52% de los pacientes estaban por encima de los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma en controles normales; para los pacientes con cáncer de colon, se encontró que los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma en 16% de los pacientes estaban por encima de los niveles normales del complejo uPA:PAI-1 en plasma; para los pacientes con cáncer de pulmón, se encontró que los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma en 16% de los pacientes estaban por encima de los niveles normales del complejo uPA:PAI-1 en plasma; y para los pacientes con cáncer de próstata, se encontró que los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma en 20% de los pacientes estaban por encima de los niveles normales del complejo uPA:PAI-1 en plasma.

La Fig. 5 describe una gráfica que muestra el tiempo de progresión (TTP) versus la probabilidad de progresión de la enfermedad con base en la determinación de niveles elevados de uPA en suero en pacientes con cáncer de seno. (Ejemplo 4).

La Fig. 6 describe una gráfica que muestra el tiempo de supervivencia de un paciente con cáncer en función de la probabilidad de supervivencia con base en la determinación de niveles elevados de uPA en suero en pacientes con cáncer de seno. (Ejemplo 4).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona con un método sensible y preciso para examinar un cáncer o un estado de enfermedad neoplásica, así como la detección con el transcurso del tiempo y el monitoreo, de pacientes con cáncer por medio de la medición de los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA, uPA, PAI-1, y el complejo uPA:PAI-1en una muestra de fluido corporal de un paciente para determinar si el paciente tiene niveles mayores de esos analitos del sistema PA con relación, o comparados con los niveles de esos analitos en individuos normales. La determinación de niveles superiores o incrementados en plasma o en suero de uno o más de los analitos uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 en una muestra de un paciente con cáncer comparado con los niveles de uno o más de esos analitos en individuos normales, (esto es, una comparación con un rango normal, un valor normal, o un valor normal de corte), informa al paciente, al médico, y/o al personal clínico acerca de uno o más de los siguientes parámetros: del estatus del estado de enfermedad del paciente; de la respuesta del paciente al cáncer o el tratamiento o la terapia antineoplásica; del beneficio o la eficacia de un tratamiento o terapia para el paciente; del progreso o no de la terapia; y/o del curso clínico y/o de la respuesta de la enfermedad.

Preferiblemente, de acuerdo con esta invención, se determina el analito uPA en una muestra de fluido corporal de un paciente humano; los ejemplos no limitantes de tales muestras incluyen muestras de fluido pleural, muestras de fluido pulmonar o de fluido de lavado bronquial, muestras de fluido sinovial, muestras de fluido peritoneal, muestras aspiradas de médula ósea, linfa, fluido cerebroespinal, muestras de fluido de ascitis, muestras de fluido amniótico, muestras de esputo, lavados de vejiga, semen, orina, saliva, lágrimas, sangre, y sus componentes suero y plasma, y similares. El suero es una muestra preferida de fluido corporal para la determinación de uPA, ya que el suero permite la evaluación en tiempo real del estado de activación del plasminógeno de un paciente con cáncer, permite un análisis repetido para monitorear al paciente y se puede realizar en una forma estandarizada y cuantitativa.

También, de acuerdo con esta invención, se pueden determinar en forma óptima los analitos PAI-1 y el complejo uPA:PAI-1 utilizando muestras de plasma. Por lo tanto, se entiende que en los métodos descritos aquí, se utiliza en forma óptima una muestra de plasma para la determinación/medición tanto del analito PAI-1 como del complejo uPA:PAI-1, mientras que el suero, u otra muestra de fluido corporal, es adecuada para la determinación/medición del analito uPA. Para el análisis de uPA de acuerdo con la presente invención, los niveles en pasma y en suero del analito uPA en la misma muestra, son equivalentes. Para los analitos PAI-1 y el complejo uPA:PAI-1 de acuerdo con la presente invención, se utiliza plasma como un tipo válido de muestra. Se debe entender también que las muestras de fluido corporal de otros mamíferos, por ejemplo, primates no humanos, y otros animales grande y pequeños, también pueden ser analizados y monitoreados por medio de métodos como los descritos aquí.

De acuerdo con la presente invención, un paciente cuya muestra va a ser monitoreada o evaluada puede experimentar, o estar cerca de experimentar, una terapia convencional contra el cáncer y/o más terapias no convencionales del sistema anti-PA, tal como aquellas descritas aquí. Los presentes métodos también comprenden un método para determinar la respuesta de un paciente o la severidad de una enfermedad, con base en el hallazgo de niveles mayores en plasma o en suero de los analitos del sistema PA en pacientes con cáncer comparado con los niveles en plasma de esos analitos en individuos normales. Los métodos son particularmente útiles a la luz de la llegada de más terapias no convencionales contra el cáncer, por ejemplo, inhibidores de moléculas pequeñas de componentes del sistema PA, que están especialmente dirigidos al sistema de activación del plasminógeno.

Como un ejemplo no limitante, un inhibidor WX-UK1 de uroquinasa/plasmina (un fármaco inhibidor de la serina proteasa del tipo de la amidino fenilalanina sintética), ya sea utilizado solo o en combinación con epirubicina (un citostático del tipo de la antraciclina) comúnmente utilizado en el tratamiento de cánceres de mama en humanos), se ha mostrado que tiene actividad antimetastática y antitumoral. (Wilex Biotechnology, Munich, Germany; B. Setyono-Han y colaboradores, 2001, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 42: 69 (Resumen #371), de la Reunión de 2001 de la AACR). Como otro ejemplo, que no significa que sea limitante, se encontraron otros inhibidores de molécula pequeña que inhiben a los componentes del sistema PA. Se encontró que una de tales moléculas, un antagonista del receptor de uPA con base en un péptido (WX-360), interviene con el proceso uPA/uPAR requerido para angiogénesis tumoral; se encontró que una segunda molécula, WX-UK1, un inhibidor de la serina proteasa sintética con base en la 3-amidino-fenilalanina, reduce la velocidad de crecimiento de tumores primarios y el número de focos metastáticos en sitios distantes en modelos de rata singenéica de cánceres pancreáticos y de mama; una tercera molécula, WX-293 mostró que era un inhibidor altamente selectivo de uPA. (Wilex Biotechnology, Múnich, Alemania; J. C. Probst y colaboradores, 2001, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 42:69 (Resumen #370), de la Reunión del 2001 de la AACR).

La presente invención abarca el uso de los métodos de análisis descritos in vitro para evaluar los niveles de uPA, PAI-1 y del complejo uPA:PAI-1 en pacientes que tienen una variedad de cánceres o de enfermedades neoplásicas, particularmente aquellos cánceres o enfermedades neoplásicas que están asociadas con la expresión o actividad anormales de uno o más de los componentes del sistema PA. Los ejemplos no limitantes de cánceres y de enfermedades neoplásicas abarcadas por esta invención incluyen cánceres de tumores sólidos, y cánceres de piel, de pulmón, de tráquea, de seno (mama), de próstata, cánceres ginecológicos, tales como aquellos de la cérvix, ovario, vulva, vagina y endometrio, cánceres del tracto urinario, tal como aquel de la vejiga; y cánceres del páncreas, vesícula biliar, tiroides, esófago, cabeza y cuello, cerebro, riñón, hígado, estómago (gástrico), gastrointestinal, recto y colon (colorectal).

De acuerdo con esta invención, se pueden medir los analitos del sistema PA, uPA, PAI-1 y el complejo uPA:PAI-1 en una muestra, por ejemplo, una muestra de plasma o de suero dependiendo del analito, utilizando ensayos que detecten específicamente esos componentes, por ejemplo, inmunoensayos radio isotópicos o inmunoensayos no isotópicos, por ejemplo, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos enzimáticos, tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), como los que se encuentran comercialmente disponibles, conocidos y practicados en el arte. (Ver, por ejemplo, la patente estadunidense No. 5.422.245 de Lars S. Nielsen y colaboradores; la solicitud estadounidense de patente No. 20020012950 A1 de Lars S. Nielsen y colaboradores; Microtitulador de ELISA para uPA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA); Microtitulador de ELISA para PAI-1 (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA); ELISA Cuantitativo del Complejo uPA:PAI-1 Humano (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA); y ensayos de ELISA para uPA, PAI-1, y uPA:PAI-1 (American Diagnostica, Greenwich, CT). A manera de ejemplo, otros medios para determinar y medir los niveles de analitos del sistema PA en una muestra incluyen cromatografía de afinidad, ensayos de enlazamiento de ligando y ensayos de enlazamiento de lectina. Con inmunoensayos, se prefieren especialmente inmunoensayos no radio isotópicos enzimáticos. El rango normal y los valores promedio normales se pueden determinar por medio del ensayo que se está llevando a cabo, como se sabe y se practica en el estado del arte, con base en muestras de poblaciones normales (sanas).

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Los anticuerpos dirigidos contra los analitos del sistema PA, o los epítopos antigénicos o inmunogénicos de los mismos, esto es, uPA, PAI-1, y el complejo uPA:PAI-1, pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos adecuados para uso en los ensayos de la presente invención también incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla, y humanizados, así como fragmentos Fab, F(ab')_{2}, o Fv, o el producto de una biblioteca desplegada por fagos, por ejemplo, una biblioteca de expresión de Fab. Se pueden utilizar diferentes procedimientos conocidos en el arte para la producción de tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de métodos para desplegar fagos que pueden ser utilizados para la elaboración de anticuerpos para uso en la presente invención incluyen a aquellos divulgados en Brinkman y colaboradores, 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Ames y colaboradores, 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177-186; Kettleborough y colaboradores, 1994, Eur. J. Immunol., 24: 952-958; Persic y colaboradores, 1997, Gene, 187: 9-18; Burton y colaboradores, 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; y en las patentes estadounidenses Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.

Los anticuerpos generados contra los analitos del sistema PA se pueden obtener por medio de inyección directa de una preparación inmunogénica de uPA, PAI-1, o uPA:PAI-1 en un animal, o por medio de la administración de toda, o de una porción, del polipéptido analito a un animal, preferiblemente un animal no humano. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de una línea celular. Los ejemplos incluyen a la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y colaboradores, 1983, Immunol. Today, 4: 72), y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y colaboradores, 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente estadounidense No. 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla para los analitos del sistema PA, uPA, PAI-1, y/o uPA:PAI-1. También, se pueden utilizar ratones transgénicos para que expresen anticuerpos humanizados con uPA, PAI-1 o el complejo uPA:PA-1, inmunogénicos.

Los métodos para la producción y detección para anticuerpos específicos de analitos del sistema anti-PA que utilizan tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en el arte. En un ejemplo no limitante, se pueden inmunizar ratones con un inmunógeno, esto es, un polipéptido de uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 o un péptido de los mismos, o con una célula que expresa al polipéptido o al péptido. Una vez se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en los sueros de ratones inmunizados, se recoge el bazo y se aíslan los esplenocitos. Se fusionan luego los esplenocitos por medio de técnicas conocidas a cualquiera de las células adecuadas de mieloma, por ejemplo células de la línea celular SP2/0 o P3X63-AG8.653 disponibles a partir de la ATCC. Se seleccionan los hibridomas y se clonan por medio de técnicas limitantes de la dilución. Se analizan luego los clones de hibridoma por medio de métodos conocidos en el arte para determinar y seleccionar aquellas células que segregan anticuerpos capaces de enlazarse con un polipéptido de la invención. Se puede generar un fluido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, inyectando ratones con clones de hibridoma positivo.

Los polipéptidos analito del sistema PA que contienen uno o más epítopos inmunogénicos de los analitos del sistema PA que producen como respuesta un anticuerpo se pueden introducir junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, a un animal huésped (tal como un conejo, ratón, rata, oveja, o cabra). Alternativamente, si el polipéptido es lo suficientemente largo (por ejemplo, al menos aproximadamente de 25 aminoácidos), el polipéptido se puede presentar sin un portador. Sin embargo, los epítopos inmunogénicos que tienen tan pocos aminoácidos como entre 5 y 10 han mostrado que son suficientes para elevar los anticuerpos capaces de enlazarse a, por lo menos, epítopos lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en transferencias Western).

Se pueden utilizar los analitos del sistema PA, o péptidos de los mismos, para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte incluyendo, pero sin limitarse a, inmunización in vivo, inmunización in vitro, y métodos que despliegan fagos. Ver, por ejemplo, Sutcliffe y colaboradores, 1983, Science, 219: 660-666; Wilson y colaboradores, 1984, Cell, 37: 767-778; y Bittle y colaboradores, 1985, J. Gen. Virol., 66: 2347-2354). Si se utiliza inmunización in vivo, se pueden inmunizar los animales con un péptido libre; sin embargo, el título del anticuerpo anti-péptido puede ser reforzado por medio del acoplamiento del péptido a un portador macromolecular, tal como la hemocianina de la lapa ojo de cerradura (KLH), o un toxoide contra el tétanos (TT). Por ejemplo, los péptidos que contienen residuos de cisteína se pueden acoplar a un portador utilizando un enlazador tal como el éster maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros péptidos se pueden acoplar a portadores utilizando un agente más general de enlazamiento, tal como glutaraldehído.

Se pueden producir anticuerpos específicos para los analitos del sistema PA por medio de cualquier método conocido en el arte para la síntesis de anticuerpos, en particular, por medio de síntesis química, por medio de inmunización intracelular (esto es, tecnología intracorporal), o por medio de técnicas de expresión recombinante. Los métodos para la producción de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, tecnología de hibridoma, transformación EBV, así como a través del uso de tecnología de ADN recombinante. La expresión recombinante de un anticuerpo, o de un fragmento, o de un derivado, de una variante o de un análogo de los mismos, (por ejemplo, una cadena liviana o pesada de un anticuerpo para el analito del sistema PA), requiere de la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica al anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica a una molécula de anticuerpo o a una cadena pesada o liviana de un anticuerpo, o una porción del mismo (preferiblemente que contenga al dominio variable de la cadena liviana o pesada), se puede producir el vector para la producción de la molécula de anticuerpo por medio de tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Se pueden utilizar técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis, y métodos de recombinación genética in vivo, que son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte, para la construcción de vectores de expresión que contienen secuencias que codifican anticuerpos y señales apropiadas de control transcripcional y de traducción. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (ver, por ejemplo, la Publicación PCT WO 86/05807; la Publicación PCT WO 89/01036; y la patente estadounidense No. 5.122.464) y la región variable del anticuerpo clonado dentro de tal vector para la expresión de la cadena liviana o pesada completa.

Se introduce luego el vector de expresión en una célula huésped por medio de técnicas convencionales y se cultivan las células transfectadas por medio de técnicas convencionales para producir un anticuerpo de analito del sistema PA. Se pueden utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión huéspedes para expresar las moléculas de anticuerpo. Tales sistemas de expresión representan vehículos por medio de los cuales se pueden expresar las secuencias de codificación de interés, sus productos codificados producidos y posteriormente purificados. Estos sistemas también representan células que pueden, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias apropiadas de codificación de nucleótidos, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Los sistemas de expresión celular incluyen, pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN recombinante de bacteriófago, ADN de plásmido o vectores de expresión de ADN de cósmido que contienen secuencias de codificación de anticuerpos; levadura (por ejemplo, Saccharomyces o Pichia) transformada con vectores de expresión recombinante de levadura que contienen secuencias que codifican anticuerpos; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión recombinante de virus (por ejemplo, baculovirus) que contiene secuencias que codifican anticuerpos; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión recombinante de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor (CAMV) o virus del mosaico del tabaco(TMV)), transformados con vectores de expresión recombinante de plásmido (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene secuencias que codifican un anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NSO) que hospedan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, el promotor de metalotioneina) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5K del virus de la vacuna). Preferiblemente, se utilizan células bacterianas tales como E. coli, y más preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de moléculas completas de anticuerpo recombinante, para la expresión de una molécula recombinante de anticuerpo. Por ejemplo, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como el elemento promotor del gen inmediato temprano principal de citomegalovirus humano, es un sistema efectivo de expresión para la producción de anticuerpos (Foecking y colaboradores, 1986, Gene, 45: 101; Cockett y colaboradores, 1990, BioTechnology, 8: 2).

Una vez que se ha producido un anticuerpo de un analito del sistema anti-PA ya sea por medio de un animal, sintetizado químicamente, o expresado en forma recombinante, se pude purificar por medio de cualquier método conocido en el arte para la purificación de una inmunoglobulina o molécula de polipéptido, por ejemplo, por medio de cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por el antígeno específico, Proteína A, y cromatografía de columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por medio de cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

Típicamente, un ensayo de ELISA implica la preparación de un anticuerpo específico para un analito dado del sistema PA, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se utiliza un anticuerpo reportero. En algunos protocolos de ELISA, el anticuerpo reportero reconoce y se enlaza al anticuerpo monoclonal específico para el analito anti-PA. Al anticuerpo reportero se le une un reactivo detectable tal como un isótopo radiactivo, una fracción fluorescente, una fracción quimioluminiscente, o, en un ELISA, una enzima, tal como peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina.

Como lo aprecian aquellos capacitados en el arte, los ELISA se pueden llevar a cabo en una variedad de formatos de ensayo. En un formato de ELISA, una muestra huésped, por ejemplo, se incuba una muestra de fluido corporal de un paciente sobre un soporte sólido, por ejemplo, los pozos de una placa de microtitulación, o una placa de poliestireno, a la cual pueden enlazarse las proteínas presentes en la muestra. Cualquiera de los sitios libres de enlazamiento de proteína sobre la placa se bloquea luego por incubación con una proteína no específica tal como albúmina de suero bovino. Se añade luego el anticuerpo monoclonal al soporte sólido, por ejemplo, los pozos o la placa, y se permite su incubación. Durante el período de incubación, los anticuerpos monoclonales se unen a cualquiera de los polipéptidos del analito del sistema PA que se han unido a la placa de poliestireno. Se retira por lavado todo el anticuerpo monoclonal no enlazado utilizando una solución amortiguadora apropiada. Se añade al soporte el anticuerpo reportero, por ejemplo, enlazado a peroxidasa de rábano, resultando por lo tanto en el enlazamiento del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal que se haya enlazado al analito del sistema PA presente en la muestra. Se retira luego por lavado el anticuerpo reportero que no se encuentre enlazado. Se añade el sustrato de peroxidasa al soporte y la cantidad de color desarrollado en un período de tiempo dado proporciona una medida de la cantidad de analito del sistema PA que está presente en un volumen dado de muestra del paciente cuando se la compara con una curva estándar.

En otro formato de ELISA, como se describe adicionalmente más adelante y se ejemplifica aquí, se une un anticuerpo específico para un analito particular al soporte sólido, esto es, los pozos de una placa de microtitulación o una placa de poliestireno, y se añade una muestra que contiene el analito al sustrato. Se añaden luego los anticuerpos reporteros detectables, que se enlazan al analito que se ha enlazado a los anticuerpos de captura sobre el soporte, después de las incubaciones y los lavados apropiados, y se detectan y cuantifican los complejos analito-anticuerpo.

En modalidades preferidas, los métodos de la presente invención involucran un ELISA tipo sándwich típicamente realizado utilizando placas de microtitulación. En una modalidad particular para la determinación de uPA (ver, por ejemplo, los Ejemplos 1 a 4), la microtitulación por ELISA emplea dos anticuerpos monoclonales para uPA humano como los reactivos de captura. En resumen, los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre la superficie interior de los pozos de la placa de microtitulación. Para llevar a cabo el análisis, se incuba un volumen apropiado de muestra de suero en los pozos recubiertos para permitir el enlazamiento del antígeno, esto es, uPA, en la muestra por medio de los anticuerpos de captura. El antígeno inmovilizado reacciona luego con antisuero de conejo detector de uPA. La cantidad de anticuerpo detector enlazado al antígeno se mide enlazándolo con un conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) con IgG anticonejo de cabra. El desarrollo de color por incubación con un sustrato de o-fenilendiamina (OPD) permite la cuantificación del uPA capturado. Se cuantifica el producto de reacción coloreado por medio de espectrofotometría y se refleja la cantidad del analito uPA que está presente en la muestra de plasma. Un cambio significativo en absorbancia indica un resultado positivo.

En una modalidad particular para la determinación de PAI-1 (ver, por ejemplo, los Ejemplos 2 y 5), la microtitulación por ELISA emplea un anticuerpo monoclonal dirigido contra PAI-1 humano como el reactivo de captura. En resumen, se inmoviliza el anticuerpo de captura sobre la superficie interior de los pozos de la placa de microtitulación. Para llevar a cabo el análisis, se incuba un volumen apropiado de muestra, por ejemplo, plasma, en los pozos recubiertos para permitir el enlazamiento del antígeno por medio del anticuerpo de captura. El antígeno inmovilizado reacciona luego con el antisuero de conejo detector de PAI-1. La cantidad de anticuerpo detector enlazado al antígeno se mide enlazándolo con un conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) con IgG anticonejo de cabra. El desarrollo de color por incubación con un sustrato de o-fenilendiamina (OPD) permite la cuantificación del PAI-1 capturado. Se cuantifica el producto de reacción coloreado por medio de espectrofotometría y se refleja la cantidad del analito PAI-1 que está presente en la muestra de plasma.

En una modalidad particular para la determinación del complejo uPA:PAI-1 (ver, por ejemplo, los Ejemplos 3 y 5), la microtitulación por ELISA emplea dos anticuerpos monoclonales para uPA humano como los reactivos de captura. En resumen, se inmoviliza los anticuerpos de captura sobre la superficie interior de los pozos de la placa de microtitulación. Para llevar a cabo el análisis, se incuba un volumen apropiado de muestra, por ejemplo, plasma, en los pozos recubiertos para permitir el enlazamiento del antígeno por medio de los anticuerpos de captura. El antígeno inmovilizado reacciona luego con el antisuero de conejo detector de PAI-1. La cantidad de anticuerpo detector enlazado al antígeno se mide enlazándolo con un conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) con IgG anticonejo de cabra. Se añaden luego una solución del sustrato y una solución amplificadora, y una vez completada, se apaga la mezcla de reacción por medio de la adición de solución de detención. Se cuantifica el producto de reacción coloreado por medio de espectrofotome-
tría y se refleja la cantidad de analito del complejo de proteína uPA:PAI-1 que está presente en la muestra de plasma.

La producción de anticuerpos monoclonales y policlonales, particularmente de anticuerpos monoclonales, que son específicos para uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 se lleva acabo utilizando técnicas y protocolos que se conocen y practican convencionalmente en el arte, tal como se describe aquí, así como por ejemplo en Lars. S. Nielsen, ver más arriba. También, se encuentran disponibles comercialmente anticuerpos que reconocen a los componentes del sistema PA en formato de kit. (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA; y American Diagnostica, Greenwich, CT).

Se utilizan los estándares para permitir determinaciones cuantitativas precisas de los analitos del sistema PA en las muestras que experimentan el análisis. Una placa lectora de microtitulación mide simultáneamente la absorbancia del producto coloreado en el estándar y en los pozos con la muestra. La correlación de los valores de absorbancia de las muestras con los estándares permite la determinación de los niveles de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en la muestra. Se les puede asignar a las muestras un valor cuantitativo de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1, esto es, en picogramos por mililitro (pg/ml), o en nanogramos por mililitro (ng/ml), de una muestra de suero o de plasma.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método que permite la evaluación y/o el monitoreo de pacientes que probablemente se beneficien de ambos tratamientos y terapias tanto tradicionales como no tradicionales para cánceres y enfermedades neoplásicas, particularmente aquellos cánceres y enfermedades neoplásicas que están asociadas con la actividad de los componentes del sistema PA. La presente invención abarca por lo tanto el análisis, la detección y el monitoreo de pacientes que experimentan tratamientos y terapias anticáncer o antineoplásicas, por ejemplo, aquellas terapias que involucran inhibidores de pequeñas moléculas de uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1; inmunoterapias con base en anti-uPA, ant-PAI-1, o anti-uPA:PAI-1, utilizadas solas, combinadas entre sí, y/o en combinación con fármacos anticáncer, con agentes antineoplásicos, quimioterapéuticos y/o con radiación y/o con cirugía, para tratar pacientes con cáncer.

Una ventaja de la presente invención es la habilidad para monitorear, o detectar en el tiempo, a aquellos pacientes que pueden beneficiarse de una, o de varias, de las terapias disponibles contra el cáncer, y preferiblemente, para monitorear pacientes que reciben un tipo de terapia particular, o una terapia de combinación, con el tiempo, para determinar como le está yendo al paciente que está reviendo el(los) tratamiento(s), si se justifica un cambio, o alteración, o cesación del tratamiento; si se ha reducido, mejorado o disminuido la enfermedad del paciente; o si ha progresado el estado o etapa de enfermedad del paciente, o se ha vuelto metastático o invasivo. Los tratamientos contra el cáncer abarcados aquí también incluyen cirugías para remover o reducir el tamaño de un tumor, o la carga tumoral, en un paciente. Por lo tanto, los métodos de la invención son útiles para monitorear el progreso de un paciente y el estado de la enfermedad después de la cirugía.

La identificación de los pacientes correctos para una terapia contra el cáncer de acuerdo con esta invención puede suministrar un incremento en la eficacia del tratamiento y puede evitar someter a un paciente a los efectos secundarios no deseados de la terapia y que amenacen la vida. Por la misma razón, la habilidad para monitorear a un paciente sometido al proceso de una terapia utilizando los métodos de la presente invención puede determinar si un paciente responde adecuadamente a la terapia con el transcurso del tiempo, para determinar si la dosis o la cantidad o la forma de suministro deben ser alteradas o ajustadas, y para determinar si un paciente mejora durante la terapia, o experimenta una regresión o está entrando a una etapa más severa o avanzada de la enfermedad, incluida invasión o metástasis, como se discute adicionalmente aquí.

Un método para monitorear de acuerdo con esta invención refleja la comprobación o el análisis serial o secuencial de un paciente con cáncer por medio de la comprobación o el análisis de una muestra de un fluido corporal del paciente durante un período de tiempo, tal como durante el transcurso del tratamiento o de la terapia, o durante el transcurso de la enfermedad del paciente. Por ejemplo, en un análisis serial, el mismo paciente proporciona una muestra de un fluido corporal, por ejemplo, suero o plasma, o se ha tomado una muestra, con el propósito de observar, chequear, o examinar los niveles de uPA, PAI-1, o el complejo de uPA:PAI-1 en el paciente midiendo los niveles de uno o más de estos analitos durante el transcurso del tratamiento, y/o durante el transcurso de la enfermedad, de acuerdo con los métodos de la invención.

En forma similar, se puede diagnosticar a un paciente sistemáticamente en el transcurso del tiempo para evaluar los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA en una muestra de fluido corporal con el propósito de determinar es estado de su enfermedad y/o la eficacia, reacción, y respuesta a los tratamientos o las terapias contra la enfermedad neoplásica o el cáncer que él o ella están padeciendo. Se apreciará que se toma(n) en forma óptima una o más muestras previas al tratamiento de un paciente antes del inicio del tratamiento o de la terapia, o al comienzo del tratamiento o de la terapia, para ayudar en el análisis y la evaluación del progreso y/o la respuesta del paciente en uno o más puntos posteriores en el tiempo durante el período en que el paciente está recibiendo tratamiento y experimenta evaluaciones médicas y clínicas.

En el monitoreo de los niveles de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 durante un período de tiempo, que puede ser de días, semanas, meses, y en algunos casos de años, o diferentes intervalos de los mismos, se recolecta una muestra del fluido corporal del paciente, por ejemplo una muestra de suero o de plasma, con intervalos de tiempo determinados por la persona tratante, tal como un médico o un especialista clínico, para determinar los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA en el paciente con cáncer comparado con los niveles respectivos de uno o más de estos analitos en individuos normales durante el transcurso del tratamiento o de la enfermedad. Por ejemplo, se pueden tomar muestras del paciente y monitorearlas cada mes, cada dos meses, o combinaciones de intervalos de uno, dos o tres meses de acuerdo con la invención. Es aconsejable un monitoreo frecuente de las muestras del paciente, en forma trimestral o en forma más frecuente.

Se comparan los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA encontrados en el paciente con los niveles respectivos de uno o más de estos analitos del sistema PA en individuos normales, y con los niveles de analito del sistema PA propios del paciente, por ejemplo, obtenidos de períodos previos de análisis, para determinar el progreso o el resultado de la enfermedad. Por lo tanto, el uso de los niveles de analito del sistema PA propios del paciente y monitoreados en el transcurso del tiempo pueden suministrar, para propósitos de comparación, los valores propios del paciente como un control personal interno para monitoreo durante largo tiempo de los niveles de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1. Como se describe aquí, siguiendo el transcurso del tratamiento o de la enfermedad, la determinación de un incremento en uno o más de los niveles del componente del sistema PA en el paciente con cáncer durante el transcurso del tiempo comparado con los niveles respectivos de uno o más de estos analitos en individuos normales refleja la habilidad para determinar la severidad o la fase de un cáncer de un paciente, o el progreso, o la carencia del mismo, en el curso o el desenlace de la terapia o el tratamiento del cáncer de un
paciente.

Para una variedad de cánceres, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer gástrico, cáncer de colon y cáncer de seno (mamario), un incremento o elevación en los niveles de uno o más de los analitos uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en una muestra de fluido corporal de un paciente con cáncer, por ejemplo, suero o plasma, comparado con los niveles respectivos de uno o más de estos analitos en controles normales siguiendo el desempeño del método de la invención, es indicativo del progreso o la severidad de la enfermedad del cáncer. Las elevaciones o los incrementos en los niveles de los analitos del sistema PA en pacientes con cáncer se determinan comparando los valores obtenidos a partir del análisis de las muestras del paciente con cáncer con los valores en el rango normal de control. En la realización del método de la presente invención, cualquier valor por fuera del rango normal de control es considerado como un incremento o como una disminución, dependiendo del valor. El rango normal es el valor medio normal (esto es, el promedio) más/menos (\pm) dos desviaciones
estándar.

En el monitoreo de un paciente en el transcurso del tiempo, una disminución en los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA del paciente a partir de niveles mayores, comparada con los valores en el rango normal para niveles en o cerca de los niveles de los analitos encontrados en individuos normales es indicativa del progreso o la eficiencia del tratamiento, y/o la mejora de la enfermedad, la remisión, la reducción o la eliminación del tumor, y similares. Asimismo, en todos los métodos descritos en las modalidades de esta invención, una determinación de una disminución de uno o más de los niveles de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 del paciente a partir de un nivel elevado hasta, o aproximadamente hasta, los niveles respectivos de uno o más de estos analitos encontrados en individuos normales proporciona un aspecto adicional de los métodos de la invención, en el cual, una mejora del paciente, una recuperación o remisión, y/o progreso o eficacia del tratamiento, se puede determinar en el tiempo tras la ejecución del método.

En una modalidad, se analiza la muestra del paciente con cáncer de acuerdo con los métodos de esta invención para determinar si existe un incremento en los niveles en suero o en plasma de uno o más entre uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 comparado con los respectivos niveles en suero o en plasma de uno o más de estos analitos del sistema PA que se encontró que estaban en el rango normal de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en individuos normales libres de cáncer. (Tablas 1, 2 y 3). De acuerdo con la presente invención, se han determinado los valores normales de los analitos del sistema PA en suero o en plasma para permitir una comparación estandarizada y confiable entre los niveles de los analitos uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en controles normales y los niveles respectivos de estos analitos en pacientes con cáncer.

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Los valores normales para el analito uPA en suero son presentados en la Tabla 1 de acuerdo con la presente invención:

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TABLA 1

1

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Los valores normales para el analito PAI-1 en plasma se presentan en la Tabla 2 de acuerdo con la presente invención:

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TABLA 2

2

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Los valores normales para el complejo del analito uPA:PAI-1 en plasma se presentan en la Tabla 3 de acuerdo con la presente invención:

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TABLA 3

3

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Otra modalidad de la presente invención abarca un método para monitorear el transcurso de la enfermedad de un paciente con cáncer, o la eficacia de un tratamiento o terapia para una paciente con cáncer, en la cual el paciente tiene preferiblemente un cáncer que involucra la actividad de componentes del sistema PA. Preferiblemente, el paciente tiene un cáncer seleccionado entre cáncer de seno (mamario), de colon, de vejiga, de pulmón y de próstata. El tratamiento o la terapia del paciente pueden involucrar un tratamiento o terapia específicos con el sistema de activación antiplasminógeno, o terapias más tradicionales, tales como terapia hormonal, terapia quimioterapéutica con fármacos, radiación, o una combinación de cualquiera de los anteriores. El método involucra la medición de los niveles de uno o más entre uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer, preferiblemente una muestra de suero para la determinación de uPA, y una muestra de plasma para la determinación de PAI-1 y del complejo uPA:PAI-1, y determinar si los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA en la muestra del paciente se incrementan comparados con los niveles respectivos de uno o más de estos analitos en controles normales durante el transcurso de la enfermedad o del tratamiento contra el cáncer. De acuerdo con el método, un incremento en los niveles de los analitos del sistema PA en el paciente con cáncer comparado con los respectivos niveles de los analitos del sistema PA en controles normales es indicativo de un incremento en la fase, el grado, la severidad o el progreso del cáncer del paciente y/o la carencia de eficiencia o de beneficio del tratamiento o la terapia contra el cáncer suministrados al paciente durante el transcurso del tratamiento, por ejemplo, un tratamiento o un resultado clínico pobres. Los niveles normales, incluidos los valores medios normales promedio y valores en el rango normal de cada uno de los analitos del sistema PA para propósitos de comparación en los métodos de la presente invención son expuestos aquí en las Tablas 1, 2 y 3.

Como lo comprenderá un médico capacitado en el arte, el método de monitoreo de acuerdo con esta invención es preferiblemente realizado en una forma serial o secuencial, utilizando muestras tomadas de un paciente durante el transcurso de la enfermedad, o un régimen de tratamiento de la enfermedad, (por ejemplo, después de un número determinado de días, semanas, meses, u ocasionalmente años, o diferentes múltiplos de estos intervalos) para permitir una determinación del progreso o del desenlace de la enfermedad y/o la eficacia o el resultado del tratamiento. Si la muestra es sensible al almacenamiento bajo congelación o frío, se pueden tomar las muestras de un paciente (o de un individuo normal) y almacenarlas durante un período de tiempo antes del análisis.

En otra de estas modalidades, la presente invención abarca la determinación de las cantidades o de los niveles de uno o más marcadores adicionales de cáncer junto con la determinación de los niveles de uno o más de uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 en una muestra que va a ser analizada. Los ejemplos no limitantes de marcadores adicionales de cáncer cuyos niveles son adecuados para monitoreo junto con los niveles de los analitos del sistema PA en una muestra de un paciente para cánceres particulares como se describe aquí incluyen HER-2/neu, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), PSA acomplejado (cPSA), autoanticuerpo p53, al marcador CA15-3 de cáncer de seno, y al marcador CA19-9 de cáncer de colon. Por medio de la combinación de la determinación de las cantidades de uno o más de estos marcadores adicionales de cáncer con una determinación de los niveles de los analitos del sistema PA comparado con los respectivos valores normales de estos analitos del sistema PA, se puede mejorar y extender la habilidad para determinar y monitorear la severidad de la enfermedad de un paciente, y/o la respuesta de un paciente, y/o el desenlace de la enfermedad.

En un aspecto particular de esta invención, se lleva a cabo el método anterior utilizando una muestra de suero de pacientes que tienen cáncer de seno metastático para determinar los niveles de uPA en los sueros de pacientes con cáncer de seno comparado con los niveles de uPA en el suero de individuos normales. Se encontró que los niveles de uPA se elevaron comparados con el nivel normal en suero de uPA de 1,75 ng/ml ó 1750 pg/ml (promedio \pm 2 SD), (un rango normal de uPA en suero de 459-1924 pg/ml), eran indicativos de una respuesta menor al tratamiento o la terapia para el cáncer, un tiempo más corto para el avance y un tiempo de supervivencia total más corto, proveyendo por lo tanto el estatus que puede ser monitoreado de la enfermedad del paciente y/o la respuesta al tratamiento durante el transcurso de la enfermedad o de un régimen de tratamiento o terapia contra el cáncer o la enfermedad neoplásica. (Ejemplo 4).

Como otro aspecto particular de esta invención, se lleva a cabo el método utilizando una muestra de plasma de pacientes que tienen diferentes cánceres, por ejemplo, cáncer de colon, de próstata, de seno, de vejiga, o de pulmón, para determinar los niveles de cualquiera o de ambos, PAI-1 y el complejo uPA:PAI-1 en el plasma de estos pacientes con cáncer. (Ejemplo 5). Para PAI-1, el plasma de los pacientes que tienen cada uno de los diferentes tipos de cánceres mostrados mostró niveles elevados de este analito del sistema PA comparado con los niveles de PAI-1 encontrados en plasma normal. El monitoreo del nivel del PAI-1 puede ser también indicativo del avance del cáncer, por ejemplo, una etapa o grado avanzado del cáncer. Para cánceres de colon, de seno y de pulmón, los niveles en plasma de PAI-1 fueron más elevados en pacientes con cáncer en etapa avanzada, comparado con los niveles de PAI-1 en controles de plasma normal, que se determinó que tienen un valor de corte normal de < 63 ng/ml.

De acuerdo con la presente invención, una determinación de la cantidad del complejo uPA:PAI-1 en plasma puede ser particularmente benéfico, ya que puede suministrar una indicación de la cantidad de proteólisis activa o real que puede presentarse junto con un cáncer de un paciente o el avance del cáncer, debido a que uPA y PAI-1 está en sus formas activas en el complejo uPA:PAI-1. Para los pacientes con cáncer de próstata, seno y pulmón, como se ejemplifica aquí, los niveles elevados en plasma del complejo uPA:PAI-1 comparados con los niveles del complejo en plasma normal indican la enfermedad y/o la severidad de la enfermedad. Por ejemplo el plasma de pacientes que tienen cánceres en etapa avanzada de colón, de seno y de pulmón mostraron niveles elevados del complejo uPA:PAI-1 comparado con los niveles del complejo en el suero de control de plasma normal, que se determinó que tenia un valor de corte normal de > 293 pg/ml.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método de monitorear un tratamiento contra el cáncer o la respuesta clínica de un paciente con cáncer que experimenta un tratamiento para el cáncer para un cáncer, particularmente un cáncer que está asociado con actividades de componentes del sistema de activación del plasminógeno. El tratamiento o la terapia pueden involucrar dirigir componentes del sistema de activación del plasminógeno a través de moléculas pequeñas o de anticuerpos. Alternativamente, o adicionalmente, el tratamiento o la terapia pueden involucrar más terapias tradicionales contra el cáncer, (por ejemplo, fármacos anticáncer, quimioterapéuticos, radiación, hormonas) o combinaciones de cualquiera de los tipos de terapias. El método comprende la medición de los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA, uPA, PAI-1 o el complejo uPA:PAI-1, en una muestra de suero de plasma del paciente con cáncer, preferiblemente antes, al comienzo de, y durante el transcurso del tratamiento del cáncer del paciente, y determinar si el paciente con cáncer ha incrementado los niveles en suero o en plasma de uno o más de los componentes del sistema PA comparado con los respectivos niveles en suero o plasma de los componentes del sistema PA como se determina para los individuos normales para cada tipo de muestra analizada. Las muestras de suero, u otras muestras de fluido corporal, se monitorean preferiblemente para la determinación del nivel de uPA, mientras que las muestras de plasma se monitorean preferiblemente para la determinación de los niveles de PAI-1 y del complejo uPA:PAI-1.

El resultado del tratamiento contra el cáncer del paciente se determina con base en la medición del incremento en suero o en plasma de los niveles de uPA, PAI-1 y/o del complejo uPA:PAI-1 en el paciente comparado con el suero normal respectivo o los niveles de plasma de estos analitos durante el transcurso del tiempo en que el paciente es monitoreado, donde mayores niveles de uno o más de uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en plasma o en suero en pacientes con cáncer con relación a los niveles normales respectivos de estos analitos en suero o en plasmas normales se correlacionan con un tratamiento o un resultado clínico pobres. El método comprende además determinar los niveles en suero o en plasma de uno o más de uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 después de que el paciente ha experimentado un tratamiento durante un período de tiempo que es considerado por el médico o el especialista clínico, suficiente para permitir una muestra de la eficacia del tratamiento contra el cáncer y/o de la respuesta del paciente, y determinar por medio del desempeño del método de la invención si los niveles de uPA, PAI-1 y/o del complejo uPA:PAI-1 del paciente tratado han disminuido o no hasta, o cerca de aquellos de individuos normales. Una reducción o disminución en los niveles de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 en el paciente, durante o después del transcurso del tratamiento o de la terapia con relación a los niveles respectivos de esos analitos en controles normales, indican el progreso y/o la eficacia del tratamiento o de la terapia contra el cáncer.

En otro de sus aspectos, la presente invención abarca un método de monitorear la severidad o el avance de una enfermedad de un paciente con cáncer. El método comprende la medición de los niveles de uno o más de uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 en una muestra de suero o de plasma del paciente con cáncer y determinar si el paciente con cáncer ha incrementado los niveles en suero o en plasma de uno o más de los analitos uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 comparado con los valores de corte normales respectivos del nivel en plasma o en suero de uno o más de estos analitos en individuos normales, por ejemplo, machos más hembras, son suministrados aquí en las Tablas 1, 2 y 3. En el método, la severidad del cáncer o su avance se monitorean en el paciente con base en niveles elevados o incrementados en la muestra del paciente comparado con los niveles normales respectivos de analito en el sistema PA en individuos normales. De acuerdo con este método, la etapa más severa del cáncer se correlaciona con los niveles más elevados de uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 en plasma o en suero comparado con los niveles de control normales respectivos de esos analitos del sistema PA. También, de acuerdo con este método, se consideran los siguientes valores de corte normales para propósitos de comparación en la determinación de niveles elevados en plasma o en suero en pacientes con cáncer: (i) el nivel normal de uPA en suero está en el rango, aproximadamente desde 459 pg/ml hasta aproximadamente 1924 pg/ml, con un valor promedio normal de uPA en suero de macho de aproximadamente 1064 pg/ml \pm 2 SD, y un valor promedio normal de uPA en suero de hembra de aproximadamente 1124 pg/ml \pm 2 SD; (ii) el corte para el nivel normal en plasma de PAI-1 está en el rango de > 62,71 ng/ml, con un valor promedio normal de PAI-1 en plasma de macho de > 23,52 ng/ml \pm 2 SD (corte > 59,38 ng/ml), y un valor promedio normal de PAI-1 en plasma de hembra de > 24,42 ng/ml \pm 2 SD (corte > 66,61 ng/ml); y (iii) el corte para el nivel normal en plasma del complejo uPA:PAI-1 está en el rango de > 293,25 pg/ml, con un valor promedio normal del complejo uPA:PAI-1 en plasma de macho de > 152,57 pg/ml \pm 2 SD (corte > 347,21 pg/ml), y un valor promedio normal de complejo uPA:PAI-1 en plasma de hembra de > 79,67 pg/ml \pm 2 SD (corte > 206,63 pg/ml).

En aún otra de sus modalidades, la presente invención suministra un método para monitorear un tratamiento contra el cáncer, o la eficacia del mismo, en un paciente con cáncer que experimenta tal tratamiento. El método involucra la medición de los niveles en plasma o en suero de uno o más de uPA, PAI-1, o el complejo uPA:PAI-1 en un paciente con cáncer y determinar si los niveles de uno o más de esos analitos del sistema PA en el paciente se incrementa durante el tratamiento contra el cáncer comparado con los respectivos niveles de uno o más de los analitos determinados en las muestras de suero o de plasma de controles normales, donde una elevación o incremento en uno o más de los niveles de uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 en el paciente con cáncer comparado con los niveles respectivos de uno o más de estos analitos del sistema PA en suero o plasma normal de control durante el período de monitoreo indica uno o más de lo siguiente: (i) avance del cáncer; (ii) una etapa más severa del cáncer; (iii) carencia de respuesta por parte del paciente al tratamiento contra el cáncer, o (iv) un resultado pobre o un tiempo de supervivencia
más corto.

Además, si, durante el transcurso del monitoreo de los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA en el paciente que experimenta el tratamiento, se encuentra un cambio en los niveles de uno o más de estos analitos que están siendo medidos, de tal manera que se determina una disminución en los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA, o se determina una declinación en los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA resultando en valores en o cerca de los valores normales respectivos de uno o más de estos analitos, después de haber monitoreado un incremento o una elevación en esos niveles por un periodo de tiempo durante el tratamiento de un paciente, puede hacerse una evaluación como uno o más de los siguientes eventos: (i) el paciente está progresando bien con el tratamiento, (ii) el tratamiento es efectivo, (iii) el paciente está respondiendo al tratamiento, y/o (iv) el cáncer del paciente no está progresando o ha sido mejorado o eliminado por medio del tratamiento.

De acuerdo con la presente invención, tal método de monitoreo y evaluación de uno o más de los niveles de uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 durante el transcurso del tratamiento o la terapia del paciente, comparado con los valores respectivos de nivel normal de uno o más de esos analitos, puede proveer al médico o al especialista clínico con una determinación de un progreso del paciente, o una regresión, según sea el caso, como consecuencia de un cáncer particular o de un tratamiento o terapia de un cáncer particular o enfermedad antineoplásica. Tal determinación permite confeccionar convenientemente el tratamiento o la terapia para un ataque (o tratamiento) mejor o más agresivo de un cáncer; permite también alterar la dosis, el modo de administración, modificar el régimen, o combinar terapias para lograr un tratamiento y un resultado total más efectivo para el paciente.

Este enfoque suministrado por la presente invención también le permite al médico determinar si se debe alterar la dosis o la vía de administración, o si se debe modificar el régimen del fármaco, por ejemplo, combinando terapias o descontinuándolas, para tratar de lograr un tratamiento y un resultado totales más efectivos para el paciente. Como ejemplo, si se determina por medio de la práctica de la presente invención que un paciente tiene un alto riesgo de recaída (debido al monitoreo de un incremento continuado en los niveles de uno o más de uPA, PAI-1 y/o del complejo uPA:PAI-1 comparado con los niveles normales respectivos de estos analitos del sistema PA durante una serie de pruebas o intervalos de tiempo), se puede tratar más rigurosamente al paciente, por ejemplo por medio del uso de quimioterapia sistémica y/o terapia de radiación, u otras combinaciones de tratamiento. En forma similar, cuando se determina por medio del presente método que los niveles de uno o más de los analitos del sistema PA disminuye con el transcurso del tiempo, esto es, hasta niveles en, o cerca de aquellos de los controles normales, se puede tomar la decisión de terapias menos agresivas. La habilidad para seleccionar un curso personalizado de una terapia o régimen de tratamiento, esto es, la capacidad de escoger un tratamiento menos agresivo en o cerca del inicio del tratamiento, o para alterar el tratamiento desde agresivo hasta menos agresivo en un momento previo al fin convencional de un régimen de tratamiento sobre la base del monitoreo de los métodos de análisis de esta invención, puede permitir menos angustia y sufrimiento para el paciente tanto a nivel emocional como físico.

Otra modalidad de la invención incluye un método para determinar si un paciente con cáncer es un candidato para una terapia contra el cáncer con base en el sistema de activación de antiplasminógeno. En método comprende la medición de los niveles de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer; determinar si los niveles de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en el plasma de un paciente con cáncer son elevados comparados con los respectivos niveles de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en el plasma de controles normales; y seleccionar al paciente que tenga niveles elevados en plasma de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 como candidato para una terapia con el sistema de activación del plasminógeno, con base en la determinación de un nivel elevado de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en el plasma del paciente con cáncer comparado con el nivel en plasma de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en los controles normales. Los niveles de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en individuos normales se presentan aquí en las Tablas 2 y 3. Como un ejemplo no limitante de acuerdo con este método, la terapia con el sistema activador del antiplasminógeno puede ser un inhibidor de proteasa, tal como un inhibidor de serina proteasa del tipo amidino fenilalanina, o un inhibidor con base en fenilguanidina, o un antagonista del receptor de uPA. Además, se puede administrar la terapia en combinación con al menos un agente biológicamente activo, tal como uno o más entre i) fármacos; ii) hormonas; o iii) compuestos sintéticos, tal como epirubicina.

También se puede llevar a cabo el método anterior por medio de la medición de los niveles de uPA en una muestra de fluido corporal de un paciente con cáncer, preferiblemente suero, para detectar una elevación o incremento en el nivel de uPA comparado con el nivel normal de uPA detectado en individuos sanos de control. Un incremento en los niveles de uPA en el paciente es también, o además, indicativo de la probabilidad del paciente para ser un buen candidato para los componentes objetivo del tratamiento o la terapia del sistema PA. Por lo tanto, por medio de la práctica de esta invención, un paciente dado se puede iniciar en un régimen de tratamiento decidido, ser monitoreado durante todo el tratamiento, y experimentar alteración del tratamiento, o no, dependiendo de los resultados del método en cuya detección de niveles elevados o no elevados de uno o más de los analitos del sistema PA comparado con los respectivos niveles en individuos normales determina como una terapia de un paciente se podrá individualizar más benéficamente y controlar en el transcurso del tiempo.

Se entiende que en todas las modalidades que describen los métodos de acuerdo con la presente invención, el monitoreo de un paciente con cáncer para detectar el avance o el desenlace de la enfermedad, o la eficacia o resultado del tratamiento o la terapia contra el cáncer, puede incluir el análisis de una muestra antes del tratamiento, tomada del paciente en un primer momento, y puede incluir también el análisis de las muestras de un paciente tomadas en un segundo, tercero, cuarto momentos, o posteriores, durante el transcurso de la enfermedad o durante un régimen de tratamiento o de terapia antineoplásico o contra el cáncer, una combinación de regímenes de tratamiento o terapia.

En otra modalidad, la presente invención incluye un método para monitorear la respuesta de un paciente a la terapia o el tratamiento contra el cáncer para un paciente que tiene cáncer metastático, particularmente cáncer de seno o cáncer de próstata. El método involucra la medición de uno o más de lo siguiente: el nivel de uPA en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer; el nivel de PAI-1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer; y/o el nivel del complejo uPA:PAI-1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer antes de, o al comienzo de la terapia o el tratamiento contra el cáncer. En diferentes momentos durante el transcurso del tratamiento se examinan respectivamente los niveles de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 en las muestras del paciente para determinar si los niveles de uno o más de estos analitos del sistema PA en el paciente con cáncer se incrementan, disminuyen, o permanecen iguales a los respectivos niveles de estos mismos analitos en individuos normales de control. Si, por la práctica del método, se establece que el paciente que tiene cáncer, por ejemplo, cáncer metastático de seno, tiene mayores o elevados niveles de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 comparado con los niveles de uno o más de estos analitos componentes el sistema PA en controles normales, se puede determinar uno o más de lo siguiente: (i) el paciente tiene una metástasis en curso o en progreso; (ii) existe una probabilidad de disminución o de una pobre respuesta a la terapia o al tratamiento contra el cáncer; (iii) el resultado de la supervivencia del paciente es pobre. Si se encuentra que hay una disminución de los niveles, o los mismos niveles de analitos del sistema en la muestra del paciente comparado con los respectivos niveles de esos mismos analitos en individuos de control normales durante el transcurso del monitoreo del paciente, se puede concluir una evaluación más optimista del progreso del paciente, de la respuesta al tratamiento y a la terapia, y del resultado final de supervivencia.

Una determinación específicamente alentadora para el paciente y para el médico o el especialista clínico es la observación de un cambio en los niveles de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 durante el transcurso del tratamiento de un paciente, esto es, desde el hallazgo de niveles elevados de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 en las muestras del paciente previas al tratamiento o de tratamiento temprano hasta un hallazgo en el paciente de niveles menores de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1, o niveles de uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 que están en, o cerca de, los niveles respectivos de los analitos uPA, PAI-1, y/o del complejo uPA:PAI-1 determinados en individuos normales. Tal hallazgo refleja, entre otras cosas, la mejora del paciente a partir del tratamiento o la terapia, el resultado exitoso del tratamiento, y/o un cambio hasta una etapa o fase menos seria de la enfermedad. En el método, para propósitos de comparación, el rango normal del nivel de uPA es de 459-1924 pg/ml (corte normal promedio: 1192 pg/ml \pm 2 SD); el rango normal del nivel de PAI-1 es mayor a 63 mg/ml (corte normal promedio: 25 ng/ml \pm 2 SD); y el rango normal del nivel del complejo uPA:PAI-1 es superior a 293 pg/ml (corte normal promedio: 115 pg/ml \pm 2 SD). Además, se puede practicar el método incluyendo una medición o determinación de los niveles de uno o más marcadores de oncoproteína seleccionados del grupo que consiste de HER-2/neu, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), PSA acomplejado (cPSA), el marcador CA15-3 de cáncer de seno, el marcador CA19-9 de cáncer de colon, y el autoanticuerpo p53, que también puede ayudar en la determinación del resultado del paciente después del tratamiento, o durante el transcurso de la enfermedad.

En otra de sus modalidades, la presente invención incluye la determinación de niveles de uPA en una muestra de fluido corporal, por ejemplo, suero, en un paciente que tiene cáncer pancreático para evaluar si los niveles de este analito del sistema PA están elevados o incrementados en pacientes con cáncer pancreático comparado con los niveles de uPA en individuos de control normales, particularmente para los propósitos de monitorear el curso de la enfermedad del cáncer pancreático y/o el resultado del tratamiento en los pacientes. El hallazgo de una elevación en los niveles de uPA en fluido corporal, por ejemplo, en suero, muestras tanto de pacientes machos como hembras comparadas con controles sanos del mismo género permite una evaluación del estatus de la enfermedad del paciente con cáncer pancreático con el transcurso del tiempo, y del progreso de un paciente que experimenta un tratamiento para su cáncer de acuerdo con la característica de monitoreo de esta invención. (Ejemplo 7).

Además, en forma similar a las otras modalidades de esta invención, los cambios en los niveles de uPA comparado con los niveles normales, y/o comparado con los niveles de uPA propios del paciente, durante el transcurso del monitoreo del estatus de la enfermedad o del tratamiento del paciente, pueden servir como un indicador del progreso del paciente con cáncer pancreático, o la carencia del mismo, en el avance de la enfermedad y/o del tratamiento. Más específicamente, si durante el transcurso del monitoreo del paciente con cáncer pancreático, los niveles de uPA del paciente disminuyen de modo que los niveles de uPA se aproximan a aquellos de los controles normales, tal resultado puede ser esperanzador sirviendo para evaluar un curso favorable de la enfermedad, o el resultado del tratamiento para el paciente. También, se pueden evaluar los niveles de uPA propios del paciente con relación a cada uno de los otros para evaluar el progreso y la respuesta del paciente, o la carencia de los mismos, en el avance de la enfermedad o el resultado del tratamiento con el transcurso del tiempo durante el período de monitoreo.

Además del monitoreo de los niveles de uPA en una muestra de fluido corporal de pacientes con cáncer pancreático, la medida conjunta y la determinación de los niveles de uno o más de los analitos marcadores de oncoproteína puede ayudar en la determinación de los resultados del paciente derivados de la enfermedad, o del resultado del paciente durante el transcurso de la enfermedad, o durante o después del transcurso de un régimen de terapia para tratar cáncer pancreático. El análisis conjunto de otros marcadores se realiza preferiblemente utilizando una muestra de suero del paciente con cáncer pancreático. Tales otros marcadores incluyen, sin limitación, HER-2/neu, al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), PSA acomplejado (cPSA), al marcador CA15-3 de cáncer de seno, al marcador CA19-9 de cáncer de colon, al antígeno CEA y al autoanticuerpo p53, siendo los marcadores preferidos HER-2/neu, CEA y CA19-9. (Ejemplo 8). El hallazgo de un incremento en uno o más de los marcadores del cáncer, diferentes a los marcadores del analito del sistema PA, tal como uPA, en una muestra de un paciente con cáncer pancreático, puede indicar una mayor severidad de la enfermedad, o un resultado más pobre del tratamiento o de la enfermedad.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen aspectos específicos de la invención para ilustrarla y proporcionar una descripción de los métodos presentes para aquellos capacitados en el arte. Los ejemplos no deben ser considerados como limitantes de la invención, ya que los ejemplos simplemente proporcionan metodología específica útil para la comprensión y la práctica de la invención y sus diferentes aspectos.

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Ejemplo 1 Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) para medir los niveles de uPA en una muestra de fluido corporal

Se centrifugaron muestras de suero y de plasma en una microcentrífuga de mesa para remover todo el material lanudo presente y/o el material en forma de partículas. Después de la centrifugación, se analizaron las muestras sin tratamiento adicional, o se las almacenó a -70ºC para un análisis posterior. La concentración inicial de la muestra de suero analizada no excedió una concentración del 10% (esto es, una dilución 1:10 de la muestra en diluyente de la muestra), (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Microtitulador de ELISA para uPA, manual del kit del ensayo).

El Microtitulador de ELISA para uPA de Bayer Diagnostics/Oncogene Science, detecta 25 pg/ml del analito uPA en una muestra de prueba. La señal del estándar de 25 pg/ml es dos veces mayor a la señal cero (señal de fondo). Además, el ELISA para uPA es específico para la detección de uPA; por ejemplo, no se detecta reactividad cruzada contra tPA y la catepsina D, incluso con dosis retadoras altas.

Protocolo Detallado

El kit del Microtitulador de ELISA para uPA (que puede adquirirse con Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) utilizado en este Ejemplo tiene tiras removibles de los pozos para que se pueda llevar a cabo el ensayo en múltiples ocasiones, y únicamente se utiliza el número de pozos requeridos. Se incluyó una curva estándar cada vez que se analizaron las muestras. La curva estándar realizada para cada ensayo separado requirió de 12 pozos (6 corridas estándar por duplicado). Se corrieron los seis estándares y las muestras de prueba por duplicado. Para una mayor precisión, se analizó cada muestra con más de una concentración. Los contenidos del manual del ensayo del Microtitulador de ELISA para uPA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Los estándares de uPA se alojan en seis viales separados que contienen pro-uPA liofilizado. Se calibraron los niveles de los estándares en unidades de masa (picogramos por ml) utilizando una preparación de pro-uPA purificada por inmunoafinidad. Se cuantificaron luego los estándares de pro-uPA así como HMW-uPA (ambos 52 kDa). Se detecta también por medio del ensayo, uPA de bajo peso molecular (LMW-uPA), pero la medición de esta forma utilizando los estándares puede sobreestimar la cantidad presente. Esto no debe afectar en forma adversa las mediciones más típicas de uPA; sin embargo, en los casos en donde se sabe que está presente LMW-uPA en un nivel significativo, se debe considerar la detección de LMW-uPA. Se reconstituyeron los viales con los estándares con 1 ml de agua desionizada de alta calidad. Como se esperaba, el estándar 6 contenía 350 pg/ml de pro-uPA; el estándar 5 contenía 250 pg/ml de pro-uPA; el estándar 4 contenía 150 pg/ml de pro-uPA; el estándar 3 contenía 75 pg/ml de pro-uPA; el estándar 2 contenía 25 pg/ml de pro-uPA; y el estándar 1 contenía 0 pg/ml de pro-uPA.

Se seleccionó el número apropiado de tiras de 8 pozos de la placa de microtitulación; se recuperaron las tiras no utilizadas restantes para uso posterior. En algunos casos, se utilizó la placa entera. Se preparó una solución 1x de trabajo de amortiguador para lavado de placas, como el suministrado con el kit (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) por medio de la adición de una parte del concentrado para lavado de placas a 19 partes de agua desionizada y mezclando bien. El volumen total requerido depende del método de lavado utilizado, por ejemplo, lavador automático de microplacas, o una jeringa manual. Se requirió aproximadamente de 1 litro del amortiguador de lavado para cebar un lavador automático y correr una placa de microtitulación. Se preparó en forma fresca el amortiguador de lavado de placa, el mismo día del uso, y se lo utilizó a temperatura ambiente (18-27ºC).

Para llevar a cabo un ensayo el mismo día, se calentaron hasta temperatura ambiente las muestras, los estándares y otros reactivos del kit, antes de la adición a los pozos de la placa de microtitulación y el inicio del ensayo. Se recubrieron previamente los pozos de las placas de microtitulación con dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra uPA humano, como reactivos de captura. Se diluyeron las muestras según la necesidad en un diluyente para muestras que contenía BSA y azida sódica al 0,1%, como siempre. (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, kit de ELISA para uPA). Se mezclaron suavemente los estándares y las muestras diluidas sin formación de espuma y se añadieron 100 \mul por duplicado a los pozos de las placas. Se prepararon cuatro pozos con el estándar de 0 pg/ml-dos para medir la absorbancia de fondo y dos para uso como pozos con el blanco del sustrato. Se cubrieron los pozos con plástico o con un sellador de placas y se incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas.

Después de la incubación, se removió el plástico o el sellador de placas, y se lavaron los pozos utilizando 300 \mul por pozo de amortiguador de lavado para placas en seis ciclos, de acuerdo al suministro y las instrucciones del kit. Se lavó la placa durante tres ciclos, se la rotó 180º, y se la lavó durante tres ciclos más. Después de eso, se añadieron 100 \mul de conjugado de trabajo a todos los pozos, excepto al pozo con el blanco del sustrato que permaneció vacío. La placa recibió unos golpecitos en seco sobre una pila de toallas de papel.

Luego, se añadieron 100 \mul de anticuerpo detector (antisuero anti-uPA de conejo en PBS 0,01 M, pH 7,4, un estabilizador de proteína y azida sódica al 0,1% como los suministrados en el kit de ELISA para uPA, Bayer Diagnostics/Oncogene Science) a todos los pozos, excepto a los pozos con el blanco del sustrato. Se incubaron las placas a 37ºC durante 1,5 horas. Durante la incubación con el anticuerpo detector, se preparó el conjugado de trabajo diluyendo el concentrado del conjugado (50x peroxidasa de rábano con IgG anticonejo de cabra en amortiguador) en proporción 1:50 en diluyente del conjugado (PBS 0,01 M, pH 7,4, BSA y cloracetamida al 0,01%) de acuerdo con las instrucciones del kit de ELISA para uPA de Bayer Diagnostics/Oncogene Science. Se dispensó el conjugado de trabajo preparado dentro de un recipiente limpio para reactivos. Después de incubación con el anticuerpo detector, se lavaron las placas de microtitulación (o las tiras) con el lavador de placas y recibieron unos golpecitos en seco sobre una pila de toallas de papel.

Se añadieron 100 \mul del conjugado de trabajo preparado como se describió anteriormente a todos los pozos, excepto a los pozos con el blanco de sustrato. Se incubaron las placas a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 30 minutos. Durante la incubación con el conjugado de trabajo, se preparó el sustrato disolviendo tabletas del sustrato (o-fenilendiamina, OPD, tabletas) en diluyente de sustrato (amortiguador de citrato 0,1 M, pH 5,0 y H_{2}O_{2} al 0,01%) por medio de agitación vigorosa tipo vórtice. Se disolvió una tableta de sustrato en 4 ml de diluyente de sustrato para elaborar el sustrato de trabajo. Una vez preparado, se utilizó el sustrato de trabajo en el transcurso de los siguientes 30 minutos y no se lo expuso a la luz.

Después de la incubación en el conjugado de trabajo, se lavaron nuevamente las placas de microtitulación (o las tiras de los pozos) con solución lavadora de placas y recibieron unos golpecitos en seco sobre una pila de toallas de papel. Después de eso, se añadieron 100 \mul del sustrato de trabajo a todos los pozos, incluidos los pozos con el blanco del sustrato. Se incubaron las placas de microtitulación en la oscuridad a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 45 minutos. Se añadió luego una solución de detención (solución de H_{2}SO_{4} 2,5 N) a cada pozo para detener la reacción enzimática. Se leyó la absorbancia a 490 nm dentro de los siguientes 30 minutos.

Para llevar a cabo un ensayo durante la noche, se añadieron muestras diluidas y estándares por duplicado a los pozos especificados como se describió para el ensayo el mismo día. Después de eso se cubrieron las placas de microtitulación y se incubó a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 12-18 horas. Al segundo día, se utilizó un tiempo de incubación del detector de 1 hora; se utilizó el resto del protocolo del mismo día como se describió anteriormente.

Para evaluar los resultados obtenidos a partir del ELISA para uPA del Ejemplo 1, se sacaron los promedios de los valores de absorbancia para cada una de las diluciones de la muestra y del estándar para llegar a la absorbancia promedio. La concentración de uPA para cada muestra se interpoló a partir de la curva estándar. Una variedad de paquetes de software lector de microplacas están disponibles para análisis de los datos de las microplacas, por ejemplo, SoftmaxPro^{TM} (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA; y KC4^{TM}, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT) que simplifican el proceso. Se utilizó un algoritmo para ajuste de la curva por mínimos cuadrados (polinomio de segundo orden). Los resultados para las muestras se expresaron como pg/ml en la muestra original corrigiendo el valor obtenido a partir de la curva estándar por medio del factor de dilución utilizado en el ensayo, por el manual del kit.

Ejemplo 2 Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) para medir los niveles de PAI-1 en plasma

Se centrifugaron muestras de plasma en una microcentrífuga de mesa para remover todo el material lanudo presente y/o el material en forma de partículas. Se diluyeron típicamente las muestras de plasma 1:50 en un diluyente para muestras como se describe más abajo y de acuerdo con las instrucciones que acompañan al ensayo del Microtitulador de ELISA para PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science. Los contenidos del manual del ensayo del Microtitulador de ELISA para PAI-1 (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

El Microtitulador de ELISA para PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science, detecta 0,10 ng/ml del analito PAI-1 en una muestra de prueba. La señal del estándar de 0,10 ng/ml es dos veces mayor a la señal cero (señal de fondo). Además, el Microtitulador de ELISA para PAI-1 es capaz de cuantificar PAI-1 en las formas activa y latente, así como en el complejo con uPA o tPA. El ensayo ha sido probado por reactividad cruzada retándolo con PAI-2, tPA y ovoalbúmina. No se detectó reactividad cruzada contra estas proteínas con dosis retadoras altas.

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Protocolo Detallado

El kit del Microtitulador de ELISA para PAI-1 (que puede adquirirse con Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) utilizado en este Ejemplo tiene tiras removibles de los pozos para que se pueda llevar a cabo el ensayo en múltiples ocasiones, y únicamente se utiliza el número de pozos requeridos. Se incluyó una curva estándar cada vez que se analizaron las muestras. La curva estándar realizada para cada ensayo separado requirió de 12 pozos (6 corridas estándar por duplicado). Se corrieron los seis estándares y las muestras de prueba por duplicado. Para una mayor precisión, se analizó cada muestra con más de una concentración.

Los estándares de PAI-1 se alojan en seis viales separados que contienen PAI-1. Se calibraron los niveles de los estándares en nanogramos de PAI-1 por ml utilizando una PAI-1 altamente purificada. Como se esperaba, el estándar 6 contenía 1,5 ng/ml de PAI-1; el estándar 5 contenía 1,0n ng/ml de PAI-1; el estándar 4 contenía 0,60 ng/ml de PAI-1; el estándar 3 contenía 0,30 ng/ml de PAI-1; el estándar 2 contenía 0,10 ng/ml de PA-1; y el estándar 1 contenía 0 ng/ml de PAI-1.

Se seleccionó el número apropiado de tiras de 8 pozos de la placa de microtitulación; se recuperaron las tiras no utilizadas restantes para uso posterior. En algunos casos, se utilizó la placa entera. Se preparó una solución 1x de trabajo de amortiguador para lavado de placas por medio de la adición de una parte del concentrado para lavado de placas a 19 partes de agua desionizada y mezclando bien. El volumen total requerido depende del método de lavado utilizado, por ejemplo, lavador automático de microplacas, un lavador manual de microplacas, o una jeringa manual. Se requirió aproximadamente de 1 litro del amortiguador de lavado para cebar un lavador automático y correr una placa de microtitulación. Se preparó en forma fresca el amortiguador de lavado de placa, el mismo día del uso, y se lo utilizó a temperatura ambiente (18-27ºC).

Para llevar a cabo un ensayo el mismo día, se calentaron hasta temperatura ambiente las muestras, los estándares y otros reactivos del kit, antes de la adición a los pozos de la placa de microtitulación y el inicio del ensayo. Se recubrieron previamente los pozos de las placas de microtitulación con anticuerpo monoclonal dirigido contra PAI-1 humano, como reactivo de captura. Se diluyeron las muestras según la necesidad en un diluyente para muestras que contenía BSA y azida sódica al 0,1%, como siempre. (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, instrucciones del kit de ELISA para PAI-1). Se mezclaron suavemente los estándares y las muestras diluidas sin formación de espuma y se añadieron 100 \mul por duplicado a los pozos de las placas. Se prepararon cuatro pozos con el estándar de 0 pg/ml-dos para medir la absorbancia de fondo y dos para uso como pozos con el blanco del sustrato. Se cubrieron los pozos con plástico o con un sellador de placas y se incubaron las muestras y los estándares a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 3 horas.

Después de la incubación, se removió el plástico o el sellador de placas, y se lavaron los pozos utilizando 300 \mul por pozo de amortiguador de lavado para placas en seis ciclos, de acuerdo al suministro y las instrucciones del kit. Se lavó la placa durante tres ciclos, se la rotó 180º, y se la lavó durante tres ciclos más. Después de eso, se añadieron 100 \mul de anticuerpo detector (antisuero anti-PAI-1 de conejo en PBS 0,01 M, pH 7,4, un estabilizador de proteína y azida sódica al 0,1%, como los suministrados en el kit del Microtitulador de ELISA para PAI-1, Bayer Diagnostics/Oncogene Science) a todos los pozos, excepto al pozo con el blanco del sustrato que permaneció vacio. Se incubaron las placas a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 1,5 horas.

Durante la incubación con el anticuerpo detector, se preparó conjugado de trabajo 15-30 minutos antes de usarlo diluyendo el concentrado del conjugado (50x peroxidasa de rábano con IgG anticonejo de cabra en amortiguador) en proporción 1:50 en diluyente del conjugado (PBS 0,01 M, pH 7,4, BSA y cloracetamida al 0,01%) de acuerdo con las instrucciones del kit del ELISA para PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science. Se dispensó el conjugado de trabajo preparado dentro de un recipiente limpio para reactivos. Después de incubación con el anticuerpo detector, se lavaron las placas de microtitulación (o las tiras) con el lavador de placas.

Se añadieron 100 \mul del conjugado de trabajo preparado como se describió anteriormente a todos los pozos, excepto a los pozos con el blanco de sustrato. Se incubaron las placas a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 30 minutos. Durante la incubación con el conjugado de trabajo, se preparó el sustrato disolviendo tabletas del sustrato (o-fenilendiamina, OPD, tabletas) en diluyente de sustrato (amortiguador de citrato 0,1 M, pH 5,0 y H_{2}O_{2} al 0,01%) por medio de agitación vigorosa tipo vórtice para garantizar completa solubilización. Se disolvió una tableta de sustrato en 2 ml de diluyente de sustrato para elaborar el sustrato de trabajo. Durante la resuspensión, se utilizó un tubo opaco oscuro o recubierto con papel de aluminio para evitar fugas de luz. Una vez preparado, se utilizó el sustrato de trabajo en el transcurso de los siguientes 30 minutos y no se lo expuso a la luz.

Después de la incubación en el conjugado de trabajo, se lavaron nuevamente las placas de microtitulación (o las tiras de los pozos) con solución lavadora de placas Después de eso, se añadieron 100 \mul del sustrato de trabajo a todos los pozos, incluidos los pozos con el blanco del sustrato. Se incubaron las placas de microtitulación en la oscuridad a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 45 minutos. Se añadió luego una solución de detención (solución de H_{2}SO_{4} 2,5 N) a cada pozo para detener la reacción enzimática. Se leyó la absorbancia a 490 nm dentro de los siguientes 30 minutos. Si la placa no fue leída inmediatamente después de que fue añadida la solución de detención, se mantuvo la placa en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se leyó la absorbancia.

Para llevar a cabo un ensayo durante la noche, se añadieron muestras diluidas y estándares por duplicado a los pozos especificados como se describió para el ensayo el mismo día. Después de eso se cubrieron las placas de microtitulación y se incubó a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 12-18 horas. Al segundo día, se siguió el resto del protocolo para desarrollar las placas, como se describió anteriormente para el ensayo del mismo día.

Para evaluar los resultados obtenidos a partir del Microtitulador de ELISA para PAI-1 del Ejemplo 2, se sacaron los promedios de los valores de absorbancia para cada una de las diluciones de la muestra y del estándar para llegar a la absorbancia promedio. Utilizando una gráfica sobre papel, se graficó la absorbancia promedio para cada estándar sobre el eje y versus la concentración de PAI-1 (en ng/ml) sobre el eje x. Se determinó la concentración de PAI-1 para cada dilución de la muestra por interpolación a partir de la curva estándar. Una variedad de paquetes de software lector de microplacas están disponibles para análisis de los datos de las microplacas, por ejemplo, SoftmaxPro^{TM} (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA; y KC4^{TM}, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT) que simplifican el proceso. Se utilizó un algoritmo para ajuste de la curva por mínimos cuadrados (polinomio de segundo orden).

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Ejemplo 3 Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) para medir los niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma

El, Microtitulador de ELISA para el Complejo uPA:PAI-1 Humano de Bayer Diagnostics/Oncogene Science detecta 5 pg/ml del complejo uPA:PAI-1 en una muestra de prueba. La señal del estándar de 5 pg/ml es significativamente superior a la señal cero (señal de fondo). Además, se ha analizado el ensayo por ELISA para el complejo uPA:PAI-1 por la especificidad contra PAI-2, tPA, ovoalbúmina, uPA libre y PAI-1 libre y no mostró reactividad cruzada contra esas proteínas con dosis retadoras altas.

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Protocolo Detallado

El kit del Microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1 (que puede adquirirse con Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) utilizado en este Ejemplo tiene tiras removibles de los pozos para que se pueda llevar a cabo el ensayo en múltiples ocasiones, y únicamente se utiliza el número de pozos requeridos. Se incluyó una curva estándar cada vez que se analizaron las muestras. La curva estándar realizada para cada ensayo separado requirió de 12 pozos (6 corridas estándar por duplicado). Se corrieron los seis estándares y las muestras de prueba por duplicado. Para una mayor precisión, se analizó cada muestra con más de una concentración. Los contenidos del manual del ensayo para el Microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1 (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

Los estándares del complejo uPA:PAI-1 se alojan en seis viales separados que contienen al complejo uPA:PAI-1. Se calibraron los niveles de los estándares en picogramos del complejo uPA:PAI-1 por ml. Se reconstituyeron los estándares con 1 ml de agua desionizada de alta calidad antes de usarlos. Como se esperaba, el estándar 6 contenía 200 pg/ml del complejo uPA:PAI-1; el estándar 5 contenía 100 pg/ml del complejo uPA:PAI-1; el estándar 4 contenía 40 pg/ml del complejo uPA:PAI-1; el estándar 3 contenía 10 pg/ml del complejo uPA:PAI-1; el estándar 2 contenía 5 pg/ml del complejo uPA:PAI-1; y el estándar 1 contenía 0 pg/ml del complejo uPA:PAI-1.

Para el ensayo del complejo uPA:PAI-1, se diluyeron las muestras de plasma al menos 1:10 antes de la aplicación a la placa de microtitulación. Las diluciones recomendadas son 1:10, 1:20 ó 1:40; se pueden utilizar diluciones intermedias o supriores para obtener múltiples valores que caen en la curva estándar. Se llevaron a cabo diluciones seriales u otras diluciones en tubos separados y luego se las añadió directamente a los pozos de las placas de microtitulación. También de acuerdo al manual para el ELISA del complejo uPA:PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science, se añaden a las muestras de plasma p-nitrofenil p'-guanidinobenzoato (NPGB), (0,15 ml de patrón 1000x en DMSO) después de la recolección antes de la aplicación a la placa de ELISA para evitar la nueva formación de complejos uPA:PAI-1. Se calienta en forma óptima NPGB a 37ºC al menos durante 10 minutos, con agitación o golpecitos sucesivos, con el propósito de solubilizar de nuevo el DMSO. Se diluyó el patrón de NPGB 1:1000 en la muestra antes de llevar a cabo el ensayo con el complejo uPA:PAI-1.

Se seleccionó el número apropiado de tiras de 8 pozos de la placa de microtitulación; se recuperaron las tiras no utilizadas restantes para uso posterior. En algunos casos, se utilizó la placa entera. Se preparó una solución 1x de trabajo de amortiguador para lavado de placas por medio de la adición de una parte del concentrado para lavado de placas a 19 partes de agua desionizada y mezclando bien. El volumen total requerido depende del método de lavado utilizado, por ejemplo, lavador automático de microplacas, un lavador manual de microplacas, o una jeringa manual. Se requirió aproximadamente de 1 litro del amortiguador de lavado para cebar un lavador automático y correr una placa de microtitulación. Se preparó en forma fresca el amortiguador de lavado de placa, el mismo día del uso, y se lo utilizó a temperatura ambiente (18-27ºC).

Para llevar a cabo un ensayo el mismo día, se calentaron hasta temperatura ambiente las muestras, los estándares y otros reactivos del kit, antes de la adición a los pozos de la placa de microtitulación y el inicio del ensayo. Se recubrieron previamente los pozos de las placas de microtitulación con dos anticuerpos monoclonales uPA antihumanos. Se diluyeron las muestras según la necesidad en un diluyente para muestras que contenía BSA y azida sódica al 0,1%, como siempre. (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, instrucciones del kit para el ELISA del complejo uPA:PAI-1). Se mezclaron suavemente los estándares y las muestras diluidas (invirtiendo los tubos) sin formación de espuma, y se añadieron 100 \mul por duplicado a los pozos de las placas. Se prepararon cuatro pozos con el estándar de 0 pg/ml-dos para medir la absorbancia de fondo y dos para uso como pozos con el blanco del sustrato. Se cubrieron los pozos con plástico o con un sellador de placas y se incubaron las muestras y los estándares a 37ºC durante
3 horas.

Después de la incubación, se removió el plástico o el sellador de placas, y se lavaron los pozos utilizando 300 \mul por pozo de amortiguador de lavado para placas en seis ciclos, de acuerdo al suministro y las instrucciones del kit. Se lavó la placa durante tres ciclos, se la rotó 180º, y se la lavó durante tres ciclos más. Después de eso, se añadieron 100 \mul de anticuerpo detector (antisuero anti-PAI-1 de conejo en PBS 0,01 M, pH 7,4, un estabilizador de proteína, suero normal de ratón (NMS) y azida sódica al 0,1%, como los suministrados en el kit del Microtitulador de ELISA para PAI-1, Bayer Diagnostics/Oncogene Science) a todos los pozos, excepto al pozo con el blanco del sustrato. Se incubaron las placas a 37ºC durante 1 hora.

Durante la incubación con el anticuerpo detector, se preparó conjugado de trabajo diluyendo el concentrado del conjugado (1000x fosfatasa alcalina con IgG anticonejo de cabra en amortiguador) en diluyente del conjugado (PBS 0,01 M, pH 7,4, BSA, NMS al 2% y cloracetamida al 0,01%) de acuerdo con las instrucciones del kit del ELISA para el complejo uPA:PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science. En resumen, en un recipiente limpio para reactivos, se diluyó primero el concentrado del conjugado 1:10 en diluyente de conjugado para elaborar un conjugado intermedio, y luego nuevamente se diluyó 1:100 para elaborar el conjugado de trabajo. Se dispensó el conjugado de trabajo preparado en un recipiente para reactivos limpio. Después de incubación con el anticuerpo detector, se lavaron las placas de microtitulación (o las tiras) con el lavador de placas.

Se añadieron 100 \mul del conjugado de trabajo preparado como se describió anteriormente a todos los pozos, excepto a los pozos con el blanco de sustrato. Se incubaron las placas a 37ºC durante 15 minutos. Durante la incubación con el conjugado de trabajo, se preparó el sustrato reconstituyéndolo en diluyente de sustrato, de acuerdo con el manual de instrucciones del ELISA para el complejo uPA:PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science. Se preparó la solución amplificadora (suministrada por el kit del ELISA para el complejo uPA:PAI-1 de Bayer Diagnostics/Oncogene Science) en la misma forma. Se agitaron vigorosamente tanto la solución del sustrato como la solución amplificadora por medio de agitación tipo vórtice para garantizar la completa disolución. Una vez preparado, se utilizó el sustrato de trabajo en el transcurso de los siguientes 30 minutos y no se lo expuso a la luz.

Después de la incubación en el conjugado de trabajo, se lavaron nuevamente las placas de microtitulación (o las tiras de los pozos) con solución lavadora de placas Después de eso, se añadieron 50 \mul del sustrato de trabajo a todos los pozos, incluidos los pozos con el blanco del sustrato. Se incubaron las placas de microtitulación en la oscuridad a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 20 minutos. A continuación se añadieron 50 \mul del amplificador a todos los pozos, incluyendo los pozos con el blanco del sustrato. Se incubaron las placas de microtitulación a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 15 minutos. Se |añadió luego una solución de detención (solución de ácido fosfórico 1M) a cada pozo para detener la reacción enzimática. Se leyó la absorbancia a 490 nm dentro de los siguientes 60 minutos. Si la placa no fue leída inmediatamente después de que fue añadida la solución de detención, los valores pueden desviarse de las lecturas verdaderas.

Para llevar a cabo un ensayo durante la noche, se añadieron muestras diluidas y los estándares por duplicado a los pozos especificados como se describió para el ensayo el mismo día. Después de eso se cubrieron las placas de microtitulación y se incubó a temperatura ambiente (18-27ºC) durante 12-18 horas. Al segundo día, se siguió el resto del protocolo para desarrollar las placas, como se describió anteriormente para el ensayo del mismo día.

Para evaluar los resultados obtenidos a partir del Microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1 del Ejemplo 3, se sacaron los promedios de los valores de absorbancia para cada una de las diluciones de la muestra y del estándar para llegar a la absorbancia promedio. Utilizando una gráfica sobre papel, se graficó la absorbancia promedio para cada estándar sobre el eje y versus la concentración del complejo uPA:PAI-1 (en pg/ml) sobre el eje x. Se determinó la concentración del complejo uPA:PAI-1 para cada dilución de la muestra por interpolación a partir de la curva estándar. Una variedad de paquetes de software lector de microplacas están disponibles para análisis de los datos de las microplacas, por ejemplo, SoftmaxPro^{TM} (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA; y KinetiCalc^{TM}, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT) que simplifican el proceso. Se utilizó un algoritmo para ajuste lineal de la curva o por mínimos cuadrados (polinomio de segundo orden), dependiendo de cuál dio un coeficiente de correlación más cercano a 1.0. Los resultados para las muestras de plasma fueron expresados como pg/ml en la muestra original corrigiendo el valor obtenido a partir de la curva estándar por el factor de dilución.

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Ejemplo 4 Monitoreo de uPA en suero en pacientes con cáncer de seno metastático

Se obtuvo suero previo al tratamiento de 242 pacientes con cáncer de seno metastático, inscritos en un ensayo en fase III doblemente ciego y controlado de una terapia hormonal de segunda línea (Fadrozole versus Megace). Para la preparación del suero, se retiró sangre por medio de punción en la vena del antebrazo y luego se centrifugó a 500 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se recolectó el sobrenadante del suero, se tomaron alícuotas y se almacenó a -70ºC.

Se determinaron los niveles de uPA en suero utilizando el ensayo del Microtitulador de ELISA para uPA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) como se describe en el Ejemplo 1. Se obtuvo un valor normal de corte de 1,75 ng/ml (promedio \pm 2 SD) a partir del análisis de los sueros de 29 mujeres sanas entre los 40-89 años. Los niveles de uPA en suero por encima de este valor de corte fueron considerados como elevados o superiores al valor normal. Por ejemplo, ya que se determinó a 1,75 ng/mL era el límite superior del valor normal de acuerdo a los ensayos realizados aquí, cualquier valor más alto, por ejemplo, 1,76, 1,77, 1,8, 2, 2,1 y similares, es considerado como un valor superior o elevado.

Los resultados de los análisis revelaron que 33,5% (81/242) de los pacientes analizados tenían niveles elevados de uPA en suero comparado con el nivel de corte normal de uPA en suero en individuos normales. Para estos pacientes que tienen un nivel elevado de uPA en suero, se determinó una tendencia (p = 0,11) hacia una velocidad de respuesta menor (Respuesta Completa (CR) + Respuesta Parcial (PR) + Enfermedad Estable) para la enfermedad. Además, el tiempo de avance de la enfermedad (TTP) fue significativamente más corto para aquellos pacientes tratados con la terapia hormonal de segunda línea y que tienen niveles elevados de uPA en suero comparado con los individuos que tienen niveles normales (p = 0,013). (Fig. 5). (Tabla 4).

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TABLA 4

4

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La supervivencia total fue también significativamente menor para pacientes con niveles elevados de uPA en suero comparado con los niveles de uPA en suero en individuos normales (p = 0,03). (Fig. 6). Estos resultados demuestran el valor de evaluar los niveles de uPA en suero de los pacientes para determinar si la enfermedad del paciente está avanzando hacia una etapa más severa o más seria y para determinar la respuesta del paciente. El hallazgo de un incremento en el nivel de uPA en suero comparado con el nivel normal de uPA en suero durante el transcurso del monitoreo de un paciente que tiene cáncer de seno metastático permitió una determinación de uno o más de los beneficios y de la eficacia del tratamiento del paciente, TTP, y del desenlace de la enfermedad.

Ejemplo 5 ELISA basado en un Microtitulador para examinar los niveles en plasma de PAI-1 y del complejo de uPA:PAI-1 en muestras de plasma de pacientes con cáncer

PAI-1 activo forma un complejo covalente equimolar con uPA activo, pero no con pro-uPA inactivo (P.A. Andreasen y colaboradores, 1986, J. Biol. Chem., 261: 7644-7651). Ya que ambas enzimas deben estar en la forma activa con el propósito de formar complejos, se determina la cantidad del complejo uPA:PAI-1 encontrada en plasma en este ejemplo, así como la cantidad de PAI-1 solo. La detección y la medición del complejo uPA:PAI-1 puede ser más indicativa de proteólisis activa que está ocurriendo in vivo a través del sistema de activación del plasminógeno que la medición ya sea del analito uPA o del analito PAI-1 solos.

En este ejemplo, se establecieron los niveles normales en plasma tanto de PAI-1 como de los complejos uPA:PAI-1. Además, se examinaron muestras de plasma de una cantidad de tipos de cáncer para determinar los niveles relativos en plasma de PAI-1 y de los complejos uPA:PAI-1 en cánceres diferentes. Los resultados son particularmente útiles a la luz del advenimiento de terapias molecularmente dirigidas al sistema de activación del plasminógeno y sus componentes.

Los ensayos de ELISA para PAI-1 y el complejo uPA:PAI-1 empleados en este Ejemplo son los ELISA tipo sándwich estandarizados con base en microtitulador que utilizan la determinación del punto final de los cambios de color enzimáticos. Ver, los Ejemplos 2 y 3 anteriores. El tiempo de corrida del ensayo fue aproximadamente de seis horas para el ELISA de PAI-1 y de cinco horas para el ELISA del complejo uPA:PAI-1.

Se recolectaron directamente las muestras de plasma de individuos sanos en tubos de recolección recubiertos con EDTA como anticoagulante (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se centrifugaron los glóbulos rojos para precipitarlos, dando como resultado un sobrenadante de plasma, utilizado como muestra normal de plasma humano en EDTA. Las muestras de plasma humano normal en EDTA fueron diluidas en un diluyente para muestras del kit de ELISA y luego analizadas ya sea en el ensayo del microtitulador de ELISA para PAI-1 o para el complejo uPA:PAI-1 como se describe en los Ejemplos 2 y 3, respectivamente. Se corrió una curva estándar con los estándares analizados por duplicado en cada ELISA. Se analizaron todas las muestras de plasma normal por duplicado al menos por medio de dos operadores diferentes. Se obtuvieron valores promedio para todas las muestras analizadas. Se analizaron un total de 80 plasmas de machos normales y 80 plasmas de hembras normales con el propósito de determinar un corte normal. Se definió el corte como el valor promedio +/- de dos desviaciones estándar.

Se analizó luego el plasma del paciente con cáncer mediante el ensayo de ELISA tanto para PAI-1 como para el complejo uPA:PAI-1, como se describe en los Ejemplos anteriores 2 y 3, con muestras analizadas por duplicado por al menos dos operadores diferentes. Las muestras analizadas fueron de 50 pacientes que tienen cánceres de seno, de colon, de pulmón o de próstata. Se evaluaron muestras de plasma de 8 pacientes que tienen cáncer de vejiga. Todos los otros parámetros experimentales fueron como los descritos para las muestras de plasma normal.

Se definió la determinación de un valor normal como el valor promedio para las 160 muestras de plasma normal +/- dos desviaciones estándar. Se compararon los resultados de las muestras de plasma con cáncer con el rango normal. Cualquiera de las muestras de plasma con cáncer que estaban por encima del rango normal fueron consideradas como elevadas ya sea para PAI-1 o para los complejos uPA:PAI-1, y cualquiera de las muestras de plasma con cáncer que estaban por debajo del rango normal fueron consideradas como deficientes ya sea para PAI-1 o para los complejos uPA:PAI-1. Se generaron entonces las representaciones gráficas de los resultados. (Fig. 2).

Niveles de PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de colon. Se analizaron un total de 50 muestras de plasma de pacientes con cáncer de colon en el microtitulador de ELISA para PAI-1. Quince de los cincuenta plasmas con cáncer de colon (30%) mostraron niveles elevados de PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (63 ng/mL). De los nueve plasmas con cáncer de colon en etapa IV, todos los nueve (100%) tenían niveles elevados en plasma de PAI-1.

Niveles de PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de próstata. Se analizaron un total de 50 muestras de plasma de pacientes con cáncer de próstata en el microtitulador de ELISA para PAI-1. Seis de los 50 (12%) mostraron niveles elevados de PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (63 ng/mL).

Niveles de PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de seno. Se analizaron un total de 50 muestras de plasma de pacientes con cáncer de seno en el microtitulador de ELISA para PAI-1. Doce de los 50 (24%) mostraron niveles elevados de PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (63 ng/mL). En plasmas con cáncer de seno en etapa III, 4/21 (19%) mostraron niveles de PAI-1 por encima del rango normal, mientras que los plasmas con cáncer de seno en etapa IV, 8/29 (28%) mostraron niveles de PAI-1 por encima del rango normal.

Niveles de PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Se analizaron un total de 50 muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en el microtitulador de ELISA para PAI-1. Veinte de los 50 (40%) mostraron niveles elevados de PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (63 ng/mL). En plasmas con cáncer de pulmón en etapa II, 2/10 (20%) mostraron niveles de PAI-1 por encima del rango normal, en plasmas con cáncer de pulmón en etapa III, 10/32 (31%) mostraron niveles de PAI-1 por encima del rango normal y en plasmas con cáncer de pulmón en etapa IV, 5/7 (71%) mostraron niveles de PAI-1 por encima del rango normal.

Niveles de complejo uPA:PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de colon. Se analizaron un total de 49 muestras de plasma de pacientes con cáncer de colon en el microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1. Ocho de los 49 plasmas con cáncer de colon (16%) mostraron niveles elevados del complejo uPA:PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (293 pg/mL). De los nueve plasmas con cáncer de colon en etapa IV, 6/9 (67%) tenían niveles de uPA:PAI-1. Se encontraron también niveles elevados del complejo uPA:PAI-1 comparado con los niveles en plasma normal del complejo uPA:PAI-1 en el plasma de pacientes que tienen otras etapas de cáncer de colon de la siguiente manera: 1/16 (6%) de plasmas con cáncer de colon en etapa C2 tenían niveles elevados del complejo uPA:PAI-1; 1/1 (100%) de plasmas con cáncer de colon en etapa III tenían niveles elevados del complejo uPA:PAI-1; no se observó una elevación significativa de los niveles del complejo uPA:PAI-1en cáncer de colon en etapa B1 (0/2, 0%); cáncer de colon en etapa B2 (0/6, 0%); y en etapa C1 (0/12, 0%); etapa D (0/2, 0%).

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Niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de próstata

Se analizaron un total de 50 muestras de plasma con cáncer de próstata en el microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1. Ocho de los 50 (20%) mostraron niveles elevados del complejo uPA:PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (293 pg/mL).

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Niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de seno

Se analizaron un total de 50 muestras de plasma con cáncer de seno en el microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1. Veintiséis de los 50 (52%) mostraron niveles elevados del complejo uPA:PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (293 pg/mL). En plasmas con cáncer de seno en etapa III, 8/21 (38%) mostraron niveles del complejo uPA:PAI-1 por encima del rango normal, mientras que los plasmas con cáncer de seno en etapa IV, 18/29 (62%) mostraron niveles del complejo uPA:PAI-1por encima del rango normal.

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Niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de pulmón

Se analizaron un total de 49 muestras de plasma con cáncer de pulmón en el microtitulador de ELISA para el complejo uPA:PAI-1. Ocho de los 49 (16%) mostraron niveles elevados del complejo uPA:PAI-1 cuando se los comparó con el rango normal (293 pg/mL). En plasmas con cáncer de pulmón en etapa II, 0/10 (0%) mostraron niveles del complejo uPA:PAI-1 por encima del rango normal, en plasmas con cáncer de pulmón en etapa III, 7/32 (22%) mostraron niveles del complejo uPA:PAI-1por encima del rango normal; y en plasmas con cáncer de pulmón en etapa IV, 1/7 (14%) mostraron niveles del complejo uPA:PAI-1por encima del rango normal.

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Niveles del complejo uPA:PAI-1 en plasma de pacientes con cáncer de vejiga

Para las muestras analizadas de un paciente con cáncer de vejiga para los niveles del complejo uPA:PAI-1 en las muestras de plasma, se encontró que 25% eran elevadas.

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Ejemplo 6 Análisis serial de los niveles de uPA en sueros de pacientes con cáncer de próstata

Se obtuvieron muestras de suero de 25 pacientes con cáncer de próstata. Se tomaron de 4 a 6 muestras seriales de sangre de cada uno de los pacientes, de las cuales se utilizó el componente del suero. Se obtuvieron las muestras de suero en forma congelada y luego se las descongeló antes del análisis por ELISA, como se describe en el Ejemplo1, para una determinación del nivel de uPA con respecto al tiempo. Se analizaron las muestras en forma serial mensualmente o cada dos o tres meses durante un período de tiempo entre nueve y doce meses. El monitoreo de los niveles de uPA en muestras de suero de pacientes con el transcurso del tiempo de acuerdo con los métodos de la presente invención, proporciona una aproximación conveniente para el chequeo y el examen de la respuesta del paciente a la terapia o el tratamiento contra el cáncer durante un período prolongado de tiempo.

Se apreciará que aunque, como se ejemplifica aquí, se congelaron las muestras de suero, se pueden recolectar en forma serial muestras de sangre obtenidas en forma fresca de pacientes durante intervalos deseados de tiempo, y el suero fresco (o el plasma) obtenido de allí utilizado igualmente bien para los análisis. La Tabla 5 presenta los resultados representativos de los niveles de uPA determinados a partir de 5 pacientes con cáncer de próstata cuyas muestras de suero fueron analizadas en forma serial en seis intervalos de tiempo diferentes durante el período de monitoreo.

TABLA 5

5

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Ejemplo 7 Niveles de uPA en suero en pacientes con cáncer pancreático

En este ejemplo, se determinaron los niveles de uPA en muestras de suero en ensayo clínico en fase III de 188 pacientes con cáncer pancreático avanzado. Se empleo un ELISA tipo sándwich para detectar uPA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA), como se describe en el Ejemplo 1, para determinar los niveles de uPA en suero antes del tratamiento en 188 pacientes con cáncer pancreático (80 hembras y 108 machos) inscritos en un ensayo en fase III controlado por placebo, aleatorio y doblemente ciego. Se utilizó un grupo de control sano de 47 machos y 62 hembras para determinar los niveles de uPA en suero de control. La Tabla 5 resume los resultados.

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TABLA 5

6

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Los resultados mostraron que los niveles de uPA en suero fueron significativamente superiores en las hembras (1,37 ng/ml) comparado con los individuos machos (1,15 ng/ml) de control sanos (p = 0,0002). Dentro del grupo de control de las hembras, no hubo diferencia significativa en los niveles de uPA en suero entre las mujeres premenopáusicas (1,39 ng/ml, n = 47) y las mujeres posmenopáusicas (1,31 ng/ml, n = 15), (p = 0,39). Los análisis de punto de corte se realizaron en forma separada utilizando el promedio \pm 2 SD para las hembras (1,94 ng/ml) y los machos (1,74 ng/ml) de control. En pacientes con cáncer pancreático, los niveles de uPA en suero se elevaron en 28 de 80 (35%) de los pacientes hembra, y en 53 de 108 (49%) de los pacientes machos. Además, los niveles promedio de uPA en suero fueron significativamente más altos tanto en pacientes con cáncer pancreático hembras (1,80 ng/ml, p < 0,00001) como machos (2,00 ng/ml, p < 0,00001) comparado con los controles normales. Estos datos demuestran que los niveles de uPA en suero están significativamente elevados tanto en pacientes machos como hembras con cáncer pancreático comparado con los controles sanos del género correspondiente.

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Ejemplo 8 Niveles en suero de los marcadores de oncoproteína HER-2/neu, CEA y CA19-9 en pacientes con cáncer pancreático

En este ejemplo, se determinaron los niveles en suero de los marcadores de oncoproteína HER-2/neu, antígeno carcinoembrionario (CEA) y CA 19-9 en muestras tomadas de 195 pacientes con cáncer pancreático utilizando un ensayo de ELISA para detectar específicamente a los antígenos de los marcadores HER-2/neu, CEA y CA 19-9. Se cuantificaron los niveles de HER-2/neu utilizando el kit del ensayo diagnóstico in vitro del Sistema Bayer Immuno 1® (Bayer Corporation, Tarrytown, NY) usando un formato de ELISA tipo sándwich, como se describe en la Publicación de Bayer No. DA4-1242M00, Clinical Method, Diciembre, 2000 (Producto No. T01-4189-51). Se cuantificaron los niveles de CEA utilizando el kit del ensayo diagnóstico in vitro del Sistema Bayer Immuno 1® usando un formato de ELISA tipo sándwich, como se describe en la Publicación de Bayer No. DA4-1205C99, Clinical Method, Marzo, 1999 (Producto No. T01-3184-51). Se cuantificaron los niveles de CA 19-9 utilizando el kit del ensayo diagnóstico in vitro del Sistema Bayer Immuno 1® usando un formato de ELISA tipo sándwich, como se describe en la Publicación de Bayer No. DA4-1212K95, Clinical Method, Octubre, 1995 (Producto No. T01-3561-51).

Los valores obtenidos para estos marcadores en el suero de pacientes con cáncer pancreático se presentan en la Tabla 6. Para comparación con los niveles de control normales de los marcadores respectivos, el corte normal para los niveles en suero de HER-2/neu es de 15 ng/mL, como se cuantifico utilizando el kit de ensayo de ELISA para HER-2/neu (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA). Se entiende que se obtienen resultados similares utilizando tanto las plataformas de inmunoensayo de ELISA tipo sándwich de Bayer Diagnostics/Oncogene Science como del Sistema de Bayer/Technicon Immuno®.

El rango normal aceptado de CEA en el suero de no fumadores es típicamente < 2,5 hasta 4,0 ng/mL, y < 10 ng/mL en el suero de fumadores. (Methods in Clinical Chemistry, Eds. A. J. Pesce y L. A. Kaplan, The C. V. Mosby Company, Washington, DC, Capítulo sobre CEA por A. H. Rule, páginas 702-713). El corte normal en suero para CA 19-9 es típicamente de 37,0 U/mL. (B. C. Del Villano y colaboradores, 1983, Clin. Chem., 29: 549-552; y R. I. Ritts Jr. y colaboradores, 1984, Int. J. Cancer, 33: 339-345). Una observación de los valores que aparecen enlistados en la Tabla 6 muestra que 21/195 (11 %) de los pacientes con cáncer pancreático tienen niveles elevados en suero de HER-2/neu comparado con los valores de control normales de HER-2/neu en suero; 111/195 (57%) de los pacientes con cáncer pancreático parecen tener niveles elevados de CEA comparado con el rango normal de control para no fumadores, mientras que 71/195 (36%) de los pacientes con cáncer pancreático tienen niveles elevados de CEA comparado con el rango normal de control para fumadores; y 162/195 (83%) de los pacientes con cáncer pancreático parecen tener niveles elevados de CA 19-9 comparado con el valor normal de corte del control.

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TABLA 6

7

TABLA 6 (continuación)

8

TABLA 6 (continuación)

9

TABLA 6 (continuación)

10

TABLA 6 (continuación)

11

TABLA 6 (continuación)

12

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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Claims (31)

1. Un método para monitorear el avance del cáncer, o la eficacia del tratamiento o la terapia contra el cáncer, en un paciente con cáncer, que comprende:

(a)

medir los niveles de uno o más de los siguientes componentes del sistema activador de plasminógeno (uPA) en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer antes de, o al inicio de, la terapia o el tratamiento contra el cáncer: (i) uPA en una muestra de suero, (ii) PAI-1 en una muestra de plasma; y (iii) complejo uPA:PAI-1 en una muestra de plasma;

(b)

determinar si los niveles en la muestra de uno o más del uPA, PAI-1, o del complejo uPA:PAI-1 en el paciente con cáncer son mayores comparados con los niveles normales de cada uno de los componentes respectivos del sistema activador de plasminógeno en controles normales para obtener un primer valor para los analitos del sistema PA en el paciente;

(c)

medir los niveles de uno o más de (i) uPA en una muestra de suero del paciente con cáncer; (ii) PAI-1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer; o (iii) el complejo uPA:PAI-1 en una muestra de plasma del paciente con cáncer durante y/o después del transcurso de un tratamiento o una terapia contra el cáncer;

(d)

determinar si los niveles en la muestra del paciente de uno o más del uPA, de los componentes de sistema se incrementa comparado con los niveles normales de cada uno de los respectivos componentes del sistema activador de plasminógeno en controles normales durante y/o después del transcurso de la terapia o del tratamiento contra el cáncer; y

(e)

establecer que el tratamiento o la terapia contra el cáncer es o no efectiva; en donde un incremento o elevación en los niveles de la muestra del paciente con cáncer de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 durante o después del tratamiento o la terapia contra el cáncer comparado con los niveles de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en controles normales y con relación al primer valor de (a) indica que el tratamiento o la terapia contra el cáncer no es efectiva o que el paciente no está respondiendo al tratamiento o a la terapia; y además en donde una disminución en los niveles de la muestra de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1durante o después del tratamiento o la terapia contra el cáncer comparado con los niveles de uno o más del uPA, PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en controles normales y comparado con el primer valor de (a) indica un tratamiento o una terapia efectivos, o una respuesta favorable por parte del paciente con cáncer;

en donde el nivel normal de uPA en controles normales es un valor de 459-1924 pg/ml; en donde el nivel normal de PAI-1en controles normales es un valor superior a 63 ng/ml; y en donde el nivel normal de uPA en controles normales es un valor del complejo uPA:PAI-1 superior a 293 pg/ml.

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2. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el paciente tiene un cáncer de tumor sólido.

3. El método de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el cáncer de tumor sólido se seleccionan entre cáncer de piel, de pulmón, de tráquea, de seno (mama), de próstata, de cérvix, de ovario, de vulva, de vagina, de endometrio, de vejiga, de páncreas, de vesícula biliar, de tiroides, de esófago, de cabeza y cuello, de cerebro, de riñón, de hígado, de estómago, de recto, o de colon.

4. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el cáncer es cáncer de seno, cáncer pancreático, o cáncer de próstata.

5. El método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el nivel de uPA en la muestra del paciente con cáncer se considera elevado o incrementado si está por encima de un valor normal de uPA de 1924 pg/ml; en donde el nivel de PAI-1 en la muestra del paciente con cáncer se considera elevado o incrementado si está por encima de un valor normal de PAI-1 de 63 ng/ml; y en donde el nivel del complejo uPA:PAI-1 en la muestra del paciente con cáncer se considera elevado o incrementado si está por encima de un valor normal del complejo uPA:PAI-1 de
293 pg/ml.

6. Un método para monitorear el tratamiento contra el cáncer, o la eficacia del mismo, en un paciente con cáncer que experimenta tal tratamiento, que comprende:

(a)

medir los niveles de un complejo del activador de plasminógeno (uPA) y de PAI-1 inhibidor de uPA (complejo uPA-PAI-1) en muestras de plasma de los pacientes con cáncer; y

(b)

determinar si los niveles en plasma del complejo uPA:PAI-1 incrementa durante el tratamiento del cáncer comparado a los niveles en plasma del complejo uPA:PAI-1en controles normales; en donde un incremento en los niveles en plasma del complejo uPA:PAI-1 en los pacientes con cáncer comparado a los niveles en plasma del complejo en controles normales durante el período de monitoreo indica uno o más de los siguiente: (i) progresión del cáncer, (ii) un estado más severo del cáncer, o (iii) carencia de respuesta por medio del paciente al tratamiento del cáncer;

en donde los niveles en plasma del complejo uPA:PAI-1 en controles normales es un valor mayor a 293 pg/ml

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7. El método de acuerdo a la reivindicación 6, en donde el paciente con cáncer tiene un cáncer tumoral sólido.

8. El método de acuerdo a la reivindicación 6, en donde el paciente con cáncer tiene un cáncer seleccionado entre cáncer de piel, de tráquea, de seno (mama), de próstata, de cérvix, de ovario, de vulva, de vagina, de endometrio, de vejiga, de páncreas, de vesícula biliar, de tiroides, de esófago, de cabeza y cuello, de cerebro, de riñón, de hígado, de estómago, de recto, o de colon.

9. El método de acuerdo a la reivindicación 6, en donde los niveles en plasma del complejo uPA:PAI-1 se determinan por medio de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

10. Un método para monitorear un tratamiento contra el cáncer, o la eficacia del mismo, en un paciente con cáncer que experimenta tal tratamiento, que comprende:

(a)

medir los niveles del inhibidor-1 activador de plasminógeno (par-1) en una muestra de plasma del paciente con cáncer; y

(b)

determinar si los niveles en plasma de PAI-1se incrementan durante el tratamiento contra el cáncer comparado con los niveles en plasma de PAI-1 en controles normales; en donde un incremento en los niveles en plasma de PAI-1 en el paciente con cáncer comparado con los niveles en plasma de PAI-1 en controles normales durante el período de monitoreo indica uno o más de lo siguiente: (i) avance del cáncer, (ii) una fase más severa del cáncer, o (iii) la carencia de respuesta por parte del paciente al tratamiento contra el cáncer;

en donde el nivel en plasma de PAI-1 en controles normales es un valor mayor a 63 ng/ml.

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11. El método de acuerdo a la reivindicación 10, en donde el paciente con cáncer tiene un cáncer tumoral sólido.

12. El método de acuerdo a la reivindicación 10, en donde el paciente con cáncer tiene un cáncer seleccionado entre cáncer de piel, de pulmón, de tráquea, de seno (mama), de próstata, de cérvix, de ovario, de vulva, de vagina, de endometrio, de vejiga, de páncreas, de vesícula biliar, de tiroides, de esófago, de cabeza y cuello, de cerebro, de riñón, de hígado, de estómago, de recto, o de colon.

13. El método de acuerdo a la reivindicación 10, en donde los niveles de PAI-1 en plasma se determinan por medio de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

14. Un método para monitorear la respuesta de un paciente a la terapia o el tratamiento contra el cáncer para un paciente que tiene cáncer metastático, que comprende:

(a)

medir los niveles del activador de plasminógeno (uPA) en una muestra de suero del paciente con cáncer antes de la terapia o del tratamiento contra el cáncer;

(b)

determinar si los niveles de uPA del paciente se incrementan comparados con los niveles de uPA en controles normales; estando el rango del control normal de los niveles de uPA entre 459-1924 pg/ml; y

(c)

establecer que el paciente con cáncer metastático que tiene mayores niveles de uPA comparado con los niveles de uPA de controles normales tiene uno o más de (i) metástasis progresiva o en curso; (ii) una probabilidad de una respuesta pobre o disminuida a la terapia o el tratamiento contra el cáncer; y (iii) una probabilidad de supervivencia más corta.

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15. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el cáncer metastático es un cáncer tumoral sólido metastático.

16. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el cáncer metastático se selecciona del grupo que consiste de cáncer metastático de piel, de pulmón, de tráquea, de seno (mama), de próstata, de cérvix, de ovario, de vulva, de vagina, de endometrio, de vejiga, de páncreas, de vesícula biliar, de tiroides, de esófago, de cabeza y cuello, de cerebro, de riñón, de hígado, de estómago, de recto, o de colon.

17. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el cáncer metastático es cáncer metastático de seno o cáncer metastático de próstata.

18. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde el nivel de uPA se determina utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

19. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde los niveles de uPA en la muestra de un paciente se determinan junto con la determinación de los niveles de uno o más marcadores de oncoproteína, y en donde además los niveles de uno o más marcadores están correlacionados con el resultado del paciente.

20. El método de acuerdo a la reivindicación 19, en donde uno o más de los marcadores de oncoproteína se seleccionan del grupo que consiste de HER-2/neu, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), PSA acomplejado (cPSA), autoanticuerpo p53, el marcador CA15-3 de cáncer de seno, y al marcador CA19-9 de cáncer de colon.

21. Un método para determinar si un paciente con cáncer es un candidato para una terapia contra el cáncer con el sistema de activación de antiplasminógeno, que comprende:

(a)

medir los niveles del inhibidor-1 activador de plasminógeno (PAI-1) o un complejo del activador de plasminógeno y el inhibidor-1 activador de plasminógeno (complejo uPA:PAI-1) en una muestra de plasma del paciente con cáncer;

(b)

determinar si los niveles de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en el plasma del paciente con cáncer son elevados comparados con los niveles en el rango normal de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en el plasma de controles normales; y

(c)

seleccionar al paciente que tiene niveles elevados en plasma de PAI-i o del complejo uPA:PAI-1 como un candidato para la terapia con el sistema de activación de antiplasminógeno, con base en la determinación de los niveles elevados de PAI-1 o de uPA:PAI-1 en el plasma del paciente con cáncer comparado con los niveles en plasma en el rango normal de PAI-1 o del complejo uPA:PAI-1 en los controles normales;

en donde el nivel normal de PAI-1 en controles normales es un valor mayor a 63 ng/ml; y en donde el nivel normal del complejo uPA:PAI-1 en controles normales es un valor superior a 293 pg/ml.

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22. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde la terapia con el sistema del activador de antiplasminógeno se seleccionan entre los inhibidores de la serina proteasa o los antagonistas del receptor de uPA.

23. El método de acuerdo a la reivindicación 22, en donde el inhibidor de la serina proteasa es un inhibidor de la serina proteasa del tipo amidino fenilalanina.

24. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 10, 14 ó 21, en donde el tratamiento anticáncer o la terapia se administran en combinación con al menos un agente biológicamente activo, y en donde además el agente biológicamente activo es seleccionado entre uno o más de i) fármacos; ii) hormonas; o iii) compuestos sintéticos.

25. El método de acuerdo a la reivindicación 24, en donde el fármaco es epirubicina.

26. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde los niveles de PAI-1 en plasma se determinan por medio de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

27. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el paciente con cáncer tiene un cáncer tumoral sólido.

28. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde el paciente con cáncer tiene un cáncer seleccionado entre cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, o cáncer de próstata.

29. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde los niveles en plasma del complejo uPA:PAI-1 se determinan por medio de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

30. El método de acuerdo a la reivindicación 21, en donde se determina además los niveles en plasma del activador de plasminógeno (uPA) en pacientes con cáncer, y en donde un nivel elevado de uPA en plasma de pacientes con cáncer comparado con los niveles en el rango normal de uPA en controles normales de suero indica una probabilidad adicional de beneficio para el paciente con cáncer por los componentes objetivo de la terapia del sistema activador del plasminógeno.

31. El método de acuerdo a la reivindicación 30, en donde el rango normal del nivel de uPA es de 459-1924 pg/ml.