ES2221006T3 - Determinacion del antigeno especifico de la prostata complejado (psac)`. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETEMINACION DE LAS FORMAS COMPLEJADAS DEL ANTIGENO ESPECIFICO DE LA PROSTATA INMUNOLOGICAMENTE DETERMINABLE (CPSA) EN UNA MUESTRA DE SANGRE, POR EJEMPLO MEDIANTE DOS ENSAYOS INMUNOMETRICOS DE SITIO, EN EL CUAL LA MUESTRA DE SANGRE SE TRATA PARA QUE PRESENTE PSA LIBRE (FPSA) INMUNOLOGICAMENTE NO DETECTABLE. UN PROCEDIMIENTO DE ENSAYO INMUNOMETRICO PARTICULARMENTE PREFERIDO EMPLEA TRES ANTICUERPOS ANTI - PSA: UN ANTICUERPO QUE SE UNE A CPSA Y A FPSA (ANTI - FPSA), UN SEGUNDO ANTICUERPO ANTI - TPSA QUE SE CARACTERIZA POR LA PROPIEDAD EXCLUSIVA DE QUE LA UNION A FPSA ES BLOQUEADA POR LA UNION DE ANTICUERPOS ESPECIFICOS FRENTE A FPSA, Y UN TERCER ANTICUERPO QUE ES UN ANTICUERPO ESPECIFICO FRENTE A FPSA. POR TANTO, LA UNION DEL ANTICUERPO ESPECIFICO FRENTE A FPSA AL PSA EN UNA MUESTRA PERMITE QUE SOLO EL CPSA PUEDA SER MEDIDO EN EL ENSAYO INMUNOMETRICO. SE HA DESCUBIERTO QUE LAS MEDIDAS DE LOS NIVELES EN SANGRE DE CPSA SUMINISTRAN UN PROCEDIMIENTO QUE ES MUYSENSIBLE Y ESPECIFICO PARA AYUDAR EN EL DIAGNOSTICO Y EL CONTROL DEL CANCER DE PROSTATA, Y QUE ELIMINA LA NECESIDAD DE SOMETERSE A UNA BIOPSIA DE PROSTATA INNECESARIA A UN NUMERO IMPORTANTE DE PACIENTES.

Description

Determinación del antígeno específico de la próstata complejado (PSAc).

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la determinación de las formas complejadas del antígeno específico de próstata (PSA), determinable inmunológicamente en una muestra de sangre. Más particularmente, la invención se refiere a la determinación del PSA complejado por un ensayo inmunométrico de dos sitios y la importancia clínica de los valores del ensayo de PSA complejado.

El antígeno específico de próstata humano (PSA) es una glicoproteína de aproximadamente 30.000 daltons con una elevada homología aminoacídica con la familia de las kalikreínas humanas (1, 2) y se ha visto que es una serín proteasa con actividad del tipo tripsina y quimotripsina (3, 4, 5). El PSA es secretado por las células epiteliales de la glándula prostática y es una de las mayores proteínas encontradas en el fluido seminal (6). Después del descubrimiento de que la concentración de PSA aumenta en el suero de pacientes con cáncer de próstata, numerosos informes han establecido esta proteína como un importante y clínicamente útil biomarcador para el tratamiento de los pacientes de cáncer de próstata (7, 8, 9, 10). Esfuerzos recientes se han centrado en determinar el PSA en suero para una determinación temprana del cáncer de próstata en pacientes asintomáticos. De hecho, la Sociedad Americana del Cáncer y la Sociedad Americana de Urología han recomendado recientemente que se controle anualmente a todos los hombres de más de 50 años de edad usando el PSA en suero junto con un examen rectal digital (ERD) (11).

El valor clínico de la detección temprana del cáncer de próstata provoca controversia por varias razones. En primer lugar, no queda claro si el tratamiento del cáncer de próstata en las primeras etapas aumentará la supervivencia en la población afectada. Actualmente se llevan a cabo pruebas cínicas diseñadas para tratar este asunto. En segundo lugar, una prueba clínica midió recientemente la efectividad de las medidas de PSA en suero junto con el examen rectal digital (ERD) para una detección temprana de cáncer de próstata en hombres con más de 50 años de edad (12). De los 1060 pacientes que tuvieron un ERD anormal o una prueba con un PSA elevado, solamente el 22% tenía cáncer de próstata. Estos datos demuestran que un 70-80% de las biopsias de próstata se llevan a cabo en hombres que no tienen cáncer. Ya que hay evidencia de que un 30-50% de hombres de más de 50 años de edad tienen cáncer de próstata en la autopsia, el número de biopsias innecesarias de próstata provocadas por pruebas con PSA elevado podría ser muy elevado. Esto tiene consecuencias en unos costes médicos elevados y en una elevada morbididad asociada con el procedimiento de la biopsia.

Varios laboratorios han mostrado de forma independiente que PSA forma complejos con inhibidores de proteasas como por ejemplo \alpha_{1}-antiquimotripsina (ACT, \alpha_{1}-antychymotripsin), \alpha_{2}-macroglobulina y \alpha_{1}-antitripsina (13-19). El PSA formando complejo con ACT o \alpha_{1}-antitripsina o en forma libre no complejada se puede detectar en suero por técnicas de ensayo inmunológico. De hecho, la mayoría de los PSA inmunorreactivos en suero están complejados con ACT y se ha establecido una correlación significativa entre la proporción de PSA unido a ACT y la concentración total de PSA en suero (13). El PSA unido a \alpha_{2}-macroglobulina, sin embargo, no se puede medir en suero debido al impedimento estérico de la unión del anticuerpo a PSA que sigue a la formación del complejo con esta proteasa. En los primeros trabajos, se sugirió que los niveles de PSA-ACT y la proporción de PSA-ACT respecto al PSA total resultaban útiles en la diagnosis del cáncer de próstata (13, 15, 16, 17), sin embargo, por una serie de razones (algunas de las cuales se discuten posteriormente), ha sido difícil extraer conclusiones sobre la utilidad clínica de la medida en suero de PSA-ACT.

Lilja, Stenman y colaboradores publicaron en 1991 que el PSA en suero existe en forma libre y en complejos con ACT y \alpha_{1}-antitripsina (13-18). En trabajos posteriores, Stenman et al. demostraron que la medida de PSA-ACT junto con la medida de PSA libre mas PSA complejado (denominado PSA total, aunque el PSA complejado con \alpha_{2}-macroglobulina no se mide por ensayos convencionales de PSA) puede aumentar la discriminación entre hombres con cáncer de próstata y aquellos con una enfermedad prostática benigna como por ejemplo la hipertrofia prostática benigna (HPB). Sin embargo, no se ha logrado la medida exacta de los complejos PSA-ACT debido a problemas técnicos en la medida exacta del complejo. Stenman et al. encontraron que la correlación de los valores de PSA-ACT con la medida de PSA total no fue buena en el extremo inferior, y que la intercepción con y resultó elevada, indicando una subida de PSA complejado (13 y patente de EE.UU. nº 5.501.983). De hecho, encontraron que para la mayoría de los pacientes sometidos a las pruebas, la concentración de PSA-ACT era más elevada que la de PSA total (patente de EE.UU. nº 5.501.983). Análisis de correlación posteriores para PSA complejado y libre mostraron un descenso de 1,12 indicando una subida del complejo PSA-ACT (16). Petterson et al. trataron esta subida cuando encontraron valores elevados de PSA-ACT en sueros de mujeres (20). Mientras que la adición de heparina redujo la incidencia de valores positivos falsos en sueros de mujeres, continúan intentos más recientes de medir complejos PSA-ACT en pacientes con cáncer de próstata y con HPB, para mostrar una subida significativa de complejos (21).

Como consecuencia de la dificultades encontradas en la medida de complejos PSA-ACT, la atención de la bibliografía cambió a la medida de PSA libre no complejado junto con la medida de PSA total. Queda claro ahora que se necesita una mayor especificidad cuando los valores de PSA total se extienden desde aproximadamente 4 a 10 ng/ml. Cuando el PSA total en suero es < 4,0 ng/ml, el riesgo de cáncer de próstata es bajo; de forma similar, cuando el PSA total es > 10 ng/ml, el riesgo de cáncer de próstata es mayor de un 50% y se recomienda la biopsia de próstata. Dentro de la zona intermedia de diagnóstico (generalmente entre 2 y 20 ng/ml, más comúnmente entre 4 y 10 ng/ml) el riesgo de cáncer es elevado, pero la tasa de positivos falsos es también elevada. La aplicación retrospectiva de una proporción de PSA libre/PSA total ha mostrado que la especificidad de PSA total en la zona intermedia de 4 a 10 ng/ml podría aumentar desde aproximadamente un 50-60% a un 70-80% (22-26). Esta especificidad aumentada podría dar lugar a una disminución de un 20-30% en biopsias innecesarias. Los documentos del PCT WO 96-26441 y WO 97-12245 describen de forma similar el uso de la relación PSA libre/PSA total para aumentar la discriminación entre HPB y cáncer respectivamente, en pacientes con niveles de PSA total entre 2,5 y 20 ng/ml.

Sin embargo la medida de PSA libre tiene sus propias dificultades técnicas. En primer lugar, dentro de la zona intermedia de diagnóstico, la proporción de PSA libre es típicamente bastante inferior, en el intervalo de un 5-30%. Una prueba exitosa de PSA debe medir de forma exacta, por lo tanto, en el intervalo de 0,2 a 0,3 ng/ml. La concentración de PSA libre tampoco es significativamente diferente en pacientes con HPB y con cáncer, y la relación de PSA libre/PSA total disminuye debido a un aumento en la proporción de PSA complejado con ACT. Además, el PSA libre no es estable en suero y los niveles de PSA libre se ha sabido que disminuyen en el tiempo, presumiblemente debido a la formación de complejos con \alpha_{2}-macroglobulina.

Mientras tanto, ha habido un reconocimiento adicional de los problemas asociados con la medida exacta de PSA-ACT en sangre, acompañado de intentos para solucionar tales problemas. En 1994, los trabajadores de Hybritech informaron del desarrollo de un ensayo inmunológico tipo sándwich para PSA-ACT empleando anticuerpos anti-PSA y anti-ACT. Concluyeron que los valores medidos de PSA-ACT fallaban a la hora de demostrar una especificidad clínica aumentada en la diagnosis del cáncer de próstata (27). Más tarde, este grupo junto con trabajadores de las Instituciones Médicas Johns Hopkins informó del hallazgo de que el procedimiento de ensayo inmunológico tipo sándwich anti-PSA/anti-ACT padece unión no específica y una subida de PSA-ACT significativas. A menos que se resuelva, concluyeron que estos problemas hacían que la medida de PSA-ACT fuera clínicamente irrelevante. Posteriormente, este grupo de trabajo informó haber solucionado el problema de la unión no específica a través del desarrollo de un ensayo inmunológico tipo sándwich para PSA-ACT basado en un anticuerpo monoclonal específico para el complejo PSA-ACT (29, 30). Sin embargo, sus estudios clínicos fallaron a la hora de mostrar cualquier aumento en la especificidad para el cáncer de próstata midiendo el complejo PSA-ACT solo comparado con la medida de PSA total o con una relación calculada de PSA-ACT respecto a PSA total (29). Se han propuesto otras aproximaciones para solucionar los problemas asociados a la medida de PSA-ACT, incluyendo el uso de agentes bloqueantes (31).

No queda claro por qué la proporción de PSA complejado respecto a ACT aumenta en pacientes con cáncer de próstata, pero puede estar relacionado con la observación de que los anticuerpos frente a ACT no tiñen el epitelio prostático de pacientes con HPB y los tránscritos de ARNm no se encuentran en tal tejido. Por el contrario, la inmunorreactividad y la síntesis de ARNm se detectan en el epitelio prostático de los pacientes con cáncer de próstata (32). Estos resultados sugieren que en los tumores de próstata, el PSA puede formar complejos in situ con ACT antes su liberación en suero. Un mecanismo alternativo puede requerir el acceso de PSA activo al torrente sanguíneo. El PSA libre encontrado en el suero de hombres sanos está proteolíticamente hidrolizado y es enzimáticamente inactivo. Los tumores, sin embargo, sintetizan factores angiogénicos que conducen a una mayor vascularización de tejidos tumorales. Puede ser que en los tumores, una mayor proporción de PSA enzimáticamente activo pase al torrente sanguíneo. Se esperaría que este PSA formara complejos con inhibidores de proteasas como por ejemplo el ACT conduciendo una proporción más elevada de complejo PSA-ACT en suero en pacientes de cáncer de próstata.

Según esto, existe necesidad de un procedimiento preciso para determinar PSA complejado y para valorar la importancia clínica de los niveles en sangre de PSA complejado en relación al seguimiento de pacientes varones para cáncer de próstata.

El documento EP 635.575 describe la preparación de anticuerpos monoclonales que se unen a PSA libre pero no a PSA-ACT.

El documento del PCT WO 95/18381 se refiere a un procedimiento de ensayo inmunométrico monoclonal/policlo-
nal para la determinación de PSA, el cual es capaz de proporcionar una respuesta equimolar respecto al PSA libre y al complejado por la adición de un anticuerpo que se una al PSA libre pero no al PSA complejado.

Los documentos EP 789032 y Zhou Z., Ng P. C., Very D. L., Allard W. J., Yeung K. K., J. Clin. Lab. Anal. (1996), 10: 155-159, describen un procedimiento para preparar un anticuerpo monoclonal que proporcione una respuesta equimolar respecto al PSA libre y al complejado en un ensayo inmunométrico monoclonal/policlonal. El anticuerpo monoclonal descrito tiene la única propiedad de unirse a PSA para volver al PSA sustancialmente incapaz de unirse a anticuerpos que se unan a PSA libre pero no a PSA complejado.

El documento de la patente japonesa publicada 62-46263 describe un procedimiento de ensayo inmunológico tipo sándwich para la determinación de PSA en complejos con un inhibidor de proteasas.

La solicitud de la patente alemana publicada 4.322.342 describe un procedimiento para medir el PSA total y el PSA-ACT en una única prueba con el propósito de proporcionar valores para el cálculo de la proporción de PSA-ACT respecto a PSA total.

Chichibu et al, en el Journal of Medicine and Pharmaceutical Science (Japan, 1996) 36(3): 477-483, describe un ensayo inmunológico tipo sándwich para PSA-ACT empleando anticuerpos anti-PSA unido a una perla y anti-ACT marcado con enzima. Faltan los datos que establecen la capacidad para medir exactamente PSA-ACT en una muestra sanguínea.

Wu J. T., en Journal of Clinical Laboratory Analysis (1995) 9: 25-31 (34) se refiere a procedimientos cromatográficos como por ejemplo la técnica del cromatoenfoque y a los procedimientos cromatográficos de filtración en gel de DEAE Sephacel, Con A Sepharosa 4B y S-200, para el aislamiento y purificación del complejo PSA-ACT para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales de elevada afinidad. Se menciona un ensayo para PSA-ACT usando una combinación de anticuerpos anti-PSA y anti-ACT. Un ensayo tal no mediría PSAc (PSA complejado) ya que PSAc comprende otras formas complejadas de PSA además de PSA-ACT.

Wu J. T., en Journal of Clinical Laboratory Analysis (1994) 8: 51-62 (35) sugiere también un procedimiento para medir PSA-ACT usando una combinación de anticuerpos anti-PSA y anti-ACT.

Tillyier C. R. et al, en Ann. Clin. Biochem. (1994) 31: 501-505 (36) describe un estudio comparativo de dos ensayos inmunológicos para la medida de PSAt (PSA total). Se hace hincapié en que algunos ensayos de PSAt difieren en su capacidad de dar una respuesta a PSAl (PSA libre) frente a PSAc.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para determinar PSA complejado (de aquí en adelante se hace referencia como PSAc) en una muestra sanguínea tratando la muestra sanguínea para hacer que se vuelva no complejado, es decir, PSA libre (PSAl) no detectable por ensayo inmunológico, y para determinar luego el PSA en la muestra sanguínea tratada por ensayo inmunológico donde solamente el PSAc es detectable. El ensayo inmunológico se puede llevar a cabo de un modo convencional, pero más normal es un ensayo inmunológico competitivo o un ensayo inmunométrico de dos sitios. El presente procedimiento puede llevarse a cabo por una serie de caminos tal y como se describe posteriormente con más detalle.

Se ha concebido un procedimiento de ensayo inmunométrico de dos sitios particularmente ventajoso basado en un sistema de reactivos con tres anticuerpos:

(a)

un primer anticuerpo anti-PSA (monoclonal o policlonal) que se une a PSAt y que participa en el ensayo inmunométrico,

(b)

un segundo anticuerpo anti-PSA (monoclonal o policlonal) que se une también a PSAt y que participa también en el ensayo inmunométrico, pero que se selecciona para tener la propiedad de que sea sustancialmente incapaz de unirse a PSA cuando PSA está unido por un anticuerpo específico de PSAl (en esta memoria descriptiva, a veces se hace referencia a este segundo anticuerpo como "MM1"), y

(c)

un tercer anticuerpo anti-PSA que es específico de PSAl, y es preferiblemente monoclonal.

Como participantes en el ensayo inmunométrico, se marca uno del primer y segundo anticuerpos anti-PSA con fines de detección (y se puede hacer referencia al mismo como anticuerpo "marcado" o de "detección") el otro se inmoviliza o es capaz de ser inmovilizado con fines de separación a partir de la mezcla de ensayo (anticuerpo de "captura"). Según esto, se pueden establecer unas condiciones de ensayo bajo las cuales el PSAl en una muestra de sangre se unirá al anticuerpo específico de PSAl (tercero), haciendo que el PSAl de la muestra sea incapaz de unirse al anteriormente mencionado anticuerpo MM1 (segundo). Como el ensayo inmunométrico de dos sitios es dependiente de la unión de dos de los anteriormente mencionados primer y segundo anticuerpos (los anticuerpos "marcado" y de "captura" respecto a PSA, la unión del anticuerpo específico de PSAl hace consecuentemente que la forma de PSAl sea incapaz de ser detectada por el ensayo inmunométrico de dos sitios. Se observará que a pesar del hecho de que los tres anticuerpos usados en este sistema de ensayo particularmente único son todos específicos para una o más formas de PSA (eso es, ninguno va dirigido a ninguno de los inhibidores de proteasas comprendido en PSAc)), las propiedades particulares de los anticuerpos permiten la determinación específica de PSAc.

Se ha encontrado que la medida de los niveles en sangre de PSAc proporciona un procedimiento altamente sensible y específico para detectar cáncer de próstata (CaP). Los ensayos de PSAc tienen también la ventaja de una mayor exactitud analítica comparada con los ensayos que requieren la medida de PSAl, ya que el PSAc es la forma de PSA predominante y los factores ambientales y analíticos (por ejemplo, edad de la muestra) que afectan a la distribución de PSA entre las formas de PSAl y PSAc producen un efecto mucho más bajo sobre la exactitud de las medidas de PSAc en comparación con las medidas de PSAl.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A es una gráfica que muestra la inhibición de la inmunorreactividad de PSAl en un ensayo inmunométrico de dos sitios para PSAt en presencia de tres anticuerpos monoclonales diferentes respecto al epítopo E de PSA. Las muestras que contienen 50 ng/ml de PSAl fueron preincubadas con cada anticuerpo monoclonal anti-PSAl durante 30 a 60 minutos y se desarrollaron en el ensayo de PSAt Immuno 1™ de Bayer. Las muestras que contienen 10 ng/ml de PSAl fueron preincubadas con el anticuerpo PSA 20 o ME2 durante 30 a 60 minutos y se desarrollaron en el ensayo de PSAt Immuno 1™ de Bayer.

La Figura 2A es una gráfica que muestra que la adición del anticuerpo anti-E PSA 20 al ensayo de tPSA proporciona un formato de ensayo inmunológico para la medida de PSAc. Las muestras que contienen aproximadamente 11 ng/ml de PSA total con proporciones que varían de PSA libre y complejado se midieron en presencia de 300 \mug/ml de anticuerpo monoclonal PSA 20 usando el analizador Immuno 1 de Bayer. La Figura 2B es una gráfica similar que muestra que el anticuerpo monoclonal ME2 se puede usar también para proporcionar un formato de ensayo inmunológico para la medida cuantitativa de PSAc. Las muestras que contienen aproximadamente 11 ng/ml de PSA total con proporciones que varían de PSA libre y complejado se midieron en presencia de 25 \mug/ml de anticuerpo monoclonal ME2 usando el analizador Immuno 1 de Bayer.

La Figura 3 es una tabla que muestra que PSA 20 se puede usar para automatizar el ensayo de PSAc en un inmunoanalizador automatizado. El formato de ensayo 1 usó anticuerpo monoclonal PSA 20 añadido al conjugado MM1-fluoresceína (R1) con un tiempo total de incubación de 38 minutos. El formato de ensayo 2 usó una preincubación a bordo de anticuerpo monoclonal PSA 20 con las muestras y un tiempo de incubación total de 78 minutos. Todos los resultados se presentan como velocidad de formación de color.

Las Figuras 4A y 4B son tablas que resumen los resultados de la medida de PSA total, libre y complejado en suero de hombres con cáncer de próstata, HPB o en controles sanos. La población de pacientes no seleccionada designada "Todos" incluye muestras de pacientes derivadas con de hombres con cáncer de próstata, HPB o controles sanos sin considerar los valores de PSAt. Cuando los grupos de pacientes se estratificaron según el valor de PSAt, se incluyeron muestras de pacientes adicionales en el análisis mostrado en la Figura 4A y en la parte de PSAc del análisis mostrado en la Figura 4B, cuyas muestras adicionales se seleccionaron de los valores de PSAt por inclusión en la zona intermedia de diagnóstico tal y como se describe en la especificación posteriormente.

La Figura 4C es un gráfica de un análisis de regresión de unos resultados obtenida usando un ensayo comercial para PSA total comparado con los resultados obtenidos usando el ensayo preferidos de PSAc para muestras de pacientes recogidas de hombres con cáncer de próstata y con una enfermedad prostática benigna.

Las Figuras 5A a 5F son gráficas que muestran la correlación entre los valores del ensayo de PSAc y los valores del ensayo de PSA-ACT obtenidos de someter a ensayo sueros de hombres con cáncer, HPB y en población normal.

La Figura 6 es una tabla que resume los resultados de la medida de PSAc y PSA-ACT en el suero de hombres con cáncer de próstata, HPB o en controles sanos de edad comparable. La población no seleccionada (designada "Todos") y los grupos de pacientes estratificados según el nivel de PSAt resultaron idénticos a aquellos usados en los estudios resumidos en las Figuras 4A y 4B.

La Figura 7 es una tabla que muestra las correlaciones de valores límite (es decir, límites más altos de lo normal) y especificidad a sensibilidades seleccionadas entre los valores de ensayo obtenidos por un ensayo comercial de tPSA, por un ensayo preferido de PSAc y por cálculo de las relaciones PSAl/PSAt.

Descripción de las realizaciones preferidas

Tal y como se usan en esta memoria descriptiva, los siguientes términos tendrán los significados indicados:

PSA se referirá a antígeno específico de próstata.

PSAt o PSA total se referirá a cantidad total de PSA inmunológicamente determinable en una muestra sanguínea, eso es, PSA en las formas complejada y libre que son capaces de responder a la medida por ensayos inmunológicos convencionales. En base al conocimiento actual, se entiende que el PSA en sangre que forma complejos con ciertos inhibidores de proteasas (incluyendo ACT, \alpha_{1}-antitripsina e inhibidor inter-\alpha_{1} tripsina) es inmunológicamente determinable, mientras que PSA no es determinable cuando forma complejos con otros inhibidores de proteasas tales como \alpha_{1}-macroglobulina.

PSAl o PSA libre se referirá a PSA en su forma libre no complejada.

PSAc o PSA complejado se referirá a PSAt que no es PSAl.

Epitopo E se referirá a la colección de epítopos en PSA que son sitios de unión para anticuerpos que se unen a PSAl pero no a PSAc.

Anticuerpos anti-E se referirán a anticuerpos que se unen al epítopo E, y de esta forma son específicos para unirse a PSAl.

Anticuerpo se referirá a una inmunoglobulina completa, por ejemplo, IgG o IgM, o a un fragmento de inmunoglobulina que comprende un sitio de unión a anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab' y F(ab')_{2}, o agregados de los mismos.

La presente invención proporciona medios para determinar PSAc en una muestra de sangre midiendo PSAt por ensayo inmunológico después de que el PSAl se haga indetectable en la muestra de sangre. Será evidente para cualquiera de los expertos en la técnica que se pueden usar una serie de procedimientos de ensayo inmunológico para medir PSAt y que se pueden emplear una serie de medios para hacer que el PSAl no sea detectable en la muestra de sangre.

En general, los procedimientos de ensayo de PSAt son competitivos o no competitivos. Los procedimientos anteriores emplean típicamente un anticuerpo inmovilizado o inmovilizable respecto a PSA (anti-PSA) y una forma marcada de PSA. El PSA muestra y el PSA marcado compiten por unirse a anti-PSA. Después de la separación del PSA marcado resultante que ha comenzado a estar unido a anti-PSA (fracción unida) de aquel que ha permanecido no unido (fracción no unida), se mide la cantidad del marcaje en la fracción unida o no unida y puede estar relacionada con la cantidad de PSA en la muestra de ensayo de cualquier modo convencional, por ejemplo, por comparación con un curva patrón.

Se usan más comúnmente los procedimientos no competitivos para la determinación de PSAt, siendo el procedimiento más común de todos el procedimiento de ensayo inmunométrico de dos sitios (algunas veces se hace referencia al mismo como procedimiento "sándwich"). En los ensayos inmunométricos se emplean dos anticuerpos anti-PSA. Uno de los anticuerpos anti-PSA se marca (algunas veces se hace referencia al mismo como el anticuerpo de "detección") y el otro es inmovilizado o inmovilizable (algunas veces se hace referencia al mismo como el anticuerpo de "captura"). Tal y como se conoce en la técnica, los anticuerpos de captura y detección se pueden poner en contacto simultánea o secuencialmente con la muestra e ensayo. Los procedimientos secuenciales se pueden llevar a cabo incubándole anticuerpo de captura con la muestra, y añadiendo el anticuerpo marcado un tiempo predeterminado después de eso (algunas veces se hace referencia al mismo como procedimiento "hacia adelante"); o el anticuerpo de detección se puede incubar con la primera muestra y después se añade el anticuerpo marcado (algunas veces se hace referencia al mismo como procedimiento "inverso"). Después de que se hayan dado la(s) incubación/incubaciones necesaria(s), para completar el ensayo, el anticuerpo de captura se separa de la mezcla líquida de muestra y el marcaje se mide en al menos una parte de al menos una de las fases de anticuerpos de captura separados o del remanente de la mezcla líquida de muestra, normalmente del último ya que comprende PSA unido (entre el "sándwich") por los anticuerpos de captura y detección.

En los ensayos inmunométricos de dos sitios típicos para PSA, uno o ambos de los anticuerpos de captura y detección son anticuerpos monoclonales. El marcaje usado en el anticuerpo de detección se puede seleccionar de cualquiera de aquellas conocidas de forma convencional en la técnica. Comúnmente, el marcaje es una enzima o un resto quimioluminiscente, pero también puede ser un isótopo radioactivo, un fluoróforo, un ligando detectable (por ejemplo detectable por una unión secundaria por una muestra marcada de unión para el ligando), y similares. La propiedad importante del anticuerpo de captura es que proporciona unos medios para ser separado del remanente de la mezcla de ensayo. Según esto, tal y como se entiende en la técnica, se puede introducir el anticuerpo de captura al ensayo en forma ya inmovilizada o insoluble, o puede estar en forma inmovilizable, eso es, una forma que permite la inmovilización para llevarse a cabo con posterioridad a la introducción del anticuerpo de captura al ensayo. Son ejemplos de anticuerpos de captura inmovilizados los anticuerpos unidos covalente o no covalentemente a una fase sólida, como por ejemplo una partícula magnética, una partícula de látex, un pocillo de placa de microtitulación, una perla, una cubeta u otro recipiente de reacción. Es un ejemplo de anticuerpo de captura inmovilizable un anticuerpo que haya sido modificado químicamente con un resto de ligando, por ejemplo, un hapteno, biotina o similares, y que de esta forma se puede inmovilizar posteriormente por contacto con una forma inmovilizada (tal y como se ha descrito anteriormente para el anticuerpo de captura inmovilizado directamente) de un patrón de unión para el ligando, por ejemplo, un anticuerpo, avidina o similares.

Los procedimientos y formatos de ensayo inmunológico anteriormente descritos se entiende que sirven de ejemplo y que no son limitantes, ya que, en general, se entenderá que en la presente invención se puede usar cualquier procedimiento o formato de ensayo inmunológico.

Un procedimiento particularmente único para determinar PSAc proporcionado por la presente invención requiere una modificación ingeniosa de un ensayo inmunométrico de dos sitios convencional. En este nuevo procedimiento, uno de los anticuerpos de captura y detección se selecciona para ser capaz de unir PSAt (eso es, se une a un epítopo que está disponible en PSAl y en PSAc), pero que es sustancialmente incapaz de unirse a PSA cuando PSA está unido por un anticuerpo específico de PSAl (es decir, un anticuerpo anti- E). De aquí en adelante se hace referencia a este anticuerpo único como MM1. De esta forma, añadiendo anti-E como tercer anticuerpo, PSAl, el cual comienza a estar unido por anti-E se vuelve sustancialmente incapaz de unirse a MM1 y, de esta forma, sustancialmente incapaz de se re detectado en un ensayo inmunométrico de dos sitios basado en MM1.

En este procedimiento particularmente preferido, el segundo anticuerpo (el anticuerpo MM1) y el tercer anticuerpo (el anticuerpo anti-E) son independientemente cada uno preferiblemente un anticuerpo monoespecífico (por ejemplo un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal obtenido por un procedimiento convencional de antisuero, el cual se ha preparado de forma que la fracción de anticuerpo consta solamente de forma esencial de anticuerpos que se unen al epítopo específico de interés), y de la forma más preferible es un anticuerpo monoclonal. Además, el anticuerpo anti-E puede comprender, si se desea, más de un anticuerpo, por ejemplo, más de un anticuerpo monoclonal con el fin de obtener la inhibición deseada de MM1. Se entenderá además que el grado de inhibición deseado de unión del anticuerpo MM1 a PSAl provocado por la unión del anticuerpo anti-E (o anticuerpos) será normalmente mayor de aproximadamente un 90%, más normalmente mayor de aproximadamente un 95% y de la forma más preferible mayor de aproximadamente un 99%.

Los particularmente preferidos anticuerpos monoclonales MM1 se pueden preparar por diversos caminos. Principalmente, el anticuerpo monoclonal se preparará aplicando técnicas convencionales de hibridación de células somáticas usando un procedimiento de pruebas de selección para una selección de líneas celulares de hibridoma que dan lugar al aislamiento de hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal que tiene las propiedades de unión definidas de MM1. La estrategia para tal prueba de selección es seleccionar anticuerpos que bloqueen la unión de otros anticuerpos dirigidos a epítopos accesibles en PSAl pero no en PSAc, por ejemplo, el epítopo-E, pero que ellos mismos tengan unión sustancialmente equivalente a PSAl y a PSAc.

La hibridación de células somáticas es hoy en día una metodología bien conocida y se puede aplicar a la presente invención en la totalidad de sus variaciones tal y como sea apropiado y se desee. En general, se prepara una población de hibridomas por fusión de células de mieloma con células linfocito tomadas de un animal que se ha inmunizado contra el analito. La inmunización del animal huésped, tal y como se usa en esta memoria descriptiva, implica que se ha provocado que el sistema inmunológico del animal produzca anticuerpos que se unirán a uno o más epítopos en el analito de interés. Será evidente para el experto en la técnica que tal resultado se puede obtener por varios caminos, incluyendo, sin limitación, la administración del analito nativo, péptido inmunógeno sintético, células transfectantes que expresan epítopos del analito en su superficie, o similares, al torrente sanguíneo del animal huésped. De forma similar, los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos de producción y recolección de anticuerpos monoclonales de líneas celulares de hibridomas clonados, y en general se puede usar cualquier procedimiento a la hora de llevar a cabo la presente invención.

Tal y como se ha descrito anteriormente, los criterios principales para seleccionar hibridomas para producir un anticuerpo monoclonal que tiene características MM1 son que produzcan un anticuerpo monoclonal que (i) se una equivalente de forma sustancial a PSAl y a PSAc, pero (ii) sea sustancialmente incapaz de unirse a PSA cuando PSA está unido por un anticuerpo específico de PSAl (un anticuerpo anti-E). De forma alternativa, pero menos preferiblemente, los criterios de selección pueden ser de forma que produzcan un anticuerpo monoclonal que (i) se una equivalente de forma sustancial a PSAl y a PSAc, pero (ii) cuando comience a unirse a PSA, PSA se vuelva sustancialmente incapaz de unirse a anticuerpos que son específicos para PSAl, eso es, anticuerpos que pueden unir PSAl, pero no PSAc. El mecanismo por el que el anticuerpo monoclonal MM1 de la presente invención actúa para proporcionar el resultado anterior no queda claramente entendido; sin embargo, se especula que la unión del anticuerpo monoclonal a PSAl (es decir, anticuerpo anti-E) bloquea, enmascara, oculta o altera el/los epítopo(s) que quedan disponibles en PSAl y en PSAc para unirse por un anticuerpo o anticuerpos dirigido(s) a tal(es) epítopo(s). Son representativos del anticuerpo monoclonal MM1 empleado en la presente invención el anticuerpo MM1 usado en el ensayo de PSA Immuno 1™ de Bayer (Bayer Corporation, Tarrytown, Nueva York, EE.UU.); los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridomas 346.7.4 y 346.7.26 depositadas por el solicitante de la presente solicitud (Bayer Corporation) con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, American Type Culture Collection), Rockville, Maryland, EE.UU., el 10 de abril de 1997 y con los números de depósito asignados HB-12338 y HB-12337, respectivamente; y anticuerpos monoclonales que se unen sustancialmente al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados.

Los reactivos y otros componentes del ensayo necesarios para la práctica del procedimiento particularmente preferido anteriormente descrito para determinar PSAc se proporcionan convenientemente en forma de equipo de ensayo, eso es, una colección o combinación envasada tal y como sea apropiado para las necesidades del usuario y cualquier instrumentación analítica requerida. El equipo de ensayo comprenderá mínimamente los anticuerpos de captura y detección particularmente caracterizados y uno o más anticuerpos anti-E.

Los valores en sangre de PSAc en pacientes varones se ha encontrado ahora que proporcionan una importancia clínica a tener en cuenta en comparación con los valores de PSAt y los valores de la relación PSAl/PSAt de la técnica anterior. Específicamente, se llevó a cabo un estudio inicial usando muestras de suero de 216 pacientes, incluyendo 53 pacientes con cáncer de próstata, 75 pacientes con HPB y 88 controles varón sanos con una edad superior a 50 años (posteriormente, los datos presentados en la Figura 4A). En este estudio inicial, el límite superior normal del ensayo de PSAc se estableció para proporcionar una sensibilidad equivalente para la detección del cáncer de próstata cuando se compara con la medida de PSAt (un 85% frente a un 88% respectivamente). Para todos los pacientes del ensayo, la especificidad en las poblaciones normal y con HPB fue también comparable para PSAc comparado con la relación PSAl/PSAt. Estos hallazgos se confirmaron en un estudio posterior usando muestras de sueros de 300 pacientes a los que se les realizó una biopsia a partir de una población referencial de urología, incluyendo 75 pacientes con cáncer de próstata y 225 pacientes que se encontró por biopsia que no tenían cáncer de próstata (posteriormente, los datos presentados en la Figura 4B). El hallazgo de que la sensibilidad y especificidad del ensayo de PSAt usado junto con una relación PSAl/PSAt es equivalente a aquel del PSA c solo, mantenido como verdadero cuando la población de pacientes se estratificó en la zona intermedia de diagnóstico. El intervalo preciso de la zona intermedia de diagnóstico no se ha definido, pero en todos los intervalos comparados en este estudio, la sensibilidad y especificidad del ensayo de PSAc fue comparable a aquel obtenido usando los ensayos de PSA total y libre. Estos datos demuestran que un único ensayo, PSAc, puede detectar cáncer de próstata de forma tan eficiente como con PSA total y, además, tiene la especificidad aumentada que se ha demostrado se puede obtener usando dos ensayos, PSAl y PSAt.

En los estudios a los que se ha hecho referencia anteriormente, el límite superior del valor normal (algunas veces se hace referencia al mismo como valor límite) seleccionado para los datos del ensayo de PSAc fue 3,75 ng/ml (expresado como concentración equivalente de PSA). Este límite superior del valor normal se seleccionó con el fin de alcanzar una sensibilidad para la detección de cáncer de próstata en el grupo de hombres con cáncer histológicamente confirmado sustancialmente similar a aquella proporcionada usando un valor límite de 4,0 ng/ml con el ensayo de PSAt (un 85% comparado con un 88% en el estudio inicial y un 81% comparado con un 83% en el estudio posterior). Se entenderá por supuesto en la técnica que como se someten a ensayo muestras de población más grandes, el límite superior óptimo del valor normal para valores de PSAc puede cambiar en algún grado, sin embargo, se anticiparía que tal límite superior óptimo del valor normal caerá, en cualquier caso, aproximadamente entre 3 y 4 ng/ml (equivalente aproximadamente a 9 a 12 ng/ml de PSA-ACT). La selección de un límite superior óptimo del valor normal por encima de 4 ng/ml se entendería generalmente para dar lugar a un nivel de sensibilidad clínicamente inaceptable, mientras que algunos médicos pueden considerar la selección de un límite superior óptimo del valor normal por encima de 3 ng/ml para obtener una mayor sensibilidad con una pérdida aceptable en la especificidad. Sin embargo, se reconocerá que para cualquier dado de sensibilidad, el procedimiento de PSAc para la presente invención proporcionará, en un único resultado de ensayo, un nivel de especificidad significativamente mayor cuando se compara con los procedimientos convencionales de PSAt, y un nivel de especificidad equivalente o mayor cuando se compara con procedimientos recientemente publicados basados en el establecimiento de una relación entre dos resultados de ensayo, por ejemplo PSAl/PSAt. Se contempla adicionalmente que la detección del cáncer de próstata en un paciente varón asintomático será reforzada por medidas en serie de PSAc en el tiempo tal y como se mostrado para medidas de PSAt en serie (29).

Además del uso anteriormente discutido en la detección del cáncer de próstata, la medida de PSAc será útil en el seguimiento del curso de la enfermedad en pacientes a los que se les haya diagnosticado cáncer de próstata, particularmente después de haber recibido una terapia de primera línea para cáncer de próstata. El seguimiento longitudinal de tales pacientes por medida de PSAt se ha probado que resulta útil en la detección temprana del cáncer de próstata recurrente. Se entiende que el PSAc es la forma específica de cáncer del PSA y es la forma que se esperaría que aumentara en suero cuando las células cancerosas crípticas establecen sitios metastáticos distantes y crecen. Según esto, los cambios en los niveles de PSAc en sangre en el tiempo se correlacionarán con cambios en el estado de la enfermedad, y particularmente, el incremento de los niveles de PSAc en sangre después de la terapia indicará recurrencia de la enfermedad.

Además, ya que se entiende que el PSAc está comprendido fundamentalmente por PSA-ACT, la importancia y las ventajas clínicas de las medidas de PSAc se extienden también a las medidas de PSA-ACT (tal y como se ha demostrado en el estudio que produjo los datos presentados en la Figura 6). En principio, los procedimientos de ensayo inmunológico para la determinación de PSA-ACT que resultarían los más sensibles para llevar a cabo en la instrumentación disponibles actualmente serían ensayos inmunométricos de dos sitios usando anticuerpo anti-PSA junto con un anticuerpo anti-ACT o un anticuerpo que es específico para el complejo PSA-ACT. Un procedimiento para obtener el último anticuerpo es por selección clonal de un anticuerpo que va dirigido a un epítopo conformacional en el complejo PSA-ACT, por ejemplo en o cerca del punto sobre la superficie del complejo donde se encuentran los componentes ACT y PSA. Actualmente, sin embargo, tales procedimientos no están bien desarrollados y/o padecen de problemas analíticos en la realización, y según esto, hasta que se consigan mejoras adicionales, la medida de PSA-ACT requerirá más técnicas de volumen. Por ejemplo, tal y como se muestra en Leinonen et al., los complejos PSA-ACT se pueden separar por cromatografía de filtración en gel (exclusión molecular) y medir en ensayos que detectan PSAt o son específicos para PSA-ACT (15).

Los siguientes ejemplos ilustrarán ahora la presente invención, pero no se tiene la intención de que sean limitantes de la misma.

Ejemplos Materiales

Los anticuerpos anti-PSA usados en estos estudios incluyen MM1, un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo expresado en PSA libre y en PSA complejado con inhibidores de proteinasas. El anticuerpo se produjo en fluidos ascíticos de ratón y se purificó por cromatografía de afinidad con proteína A usando procedimientos convencionales. MP2 es un anticuerpo policlonal anti-PSA que se produjo en cabras y se purificó por cromatografía de afinidad sobre PSA inmovilizado. PSA 10, PSA 20, PSA 30 (CanAg Diagnostics AB, Goteborg, Suecia) y ME2 (Biospacific, Emeryville, CA, EE.UU.) son anticuerpos monoclonales que reconocen el epítopo-E de PSA. ACT 53 (CanAg Diagnostics) es un anticuerpo monoclonal específico de ACT. El antígeno específico de próstata libre (Scripps Laboratories, San Diego, CA, EE.UU.) se purificó a partir de fluido seminal humano con una pureza de un 98% por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio/poliacrilamida y se almacenó en un tampón que contenía Tris 10 mM, azida de sodio al 0,1%, a pH 8,0. PSA-ACT (Scripps Laboratories, San Diego, CA, EE.UU.) mostró una pureza superior a un 96% por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio/poliacrilamida y se almacenó en un tampón que contenía acetato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM y azida de sodio al 0,1%, a pH 5,6.

Ensayo de PSA Immuno 1™ de Bayer

El ensayo de PSA total (PSAt) Immuno 1 de Bayer es un ensayo sándwich que usa un anticuerpo monoclonal para la captura y un anticuerpo policlonal para la detección de PSA. El anticuerpo monoclonal anti-PSA (MM1) está conjugado con fluoresceína (R1) y el anticuerpo policlonal purificado por afinidad-afinidad (MP2) está conjugado con fosfatasa alcalina (R2). Los anticuerpos se diluyen a 1,5 \mug/ml para R1 y a 6,15 \mug/ml para R2 en un tampón que contiene Tris-HCl 100 mM, pH 7,4 y un 5% de suero normal de cabra inactivado por calor (Biocell Laboratories, Carson, CA, EE.UU.). Se incuba un volumen de 65 \mul de cada uno de los dos anticuerpos con 20 \mul de la muestra de ensayo en una cubeta de reacción durante 20 minutos a 37ºC, y el inmunocomplejo resultante (R1-PSA-R2) se captura por la adición de partículas magnéticas revestidas con anticuerpos monoclonales anti-fluoresceína (20 \mul). Después de una etapa de lavado para eliminar el exceso de reactivos y de componentes de muestra, se añaden 300 \mul de p-nitrofenilfosfato 23 mM. La tasa de formación de color se sigue por medidas de absorbancia a 405 y a 450 nm y la tasa de formación de color es directamente proporcional a la concentración de PSA en la muestra de ensayo. Se proporcionan detalles adicionales en J. Clin. Lab. Anal. (1996), 10: 155-159. La calibración del analizador Immuno 1 de Bayer se lleva a cabo usando los patrones Immuno 1 de Bayer, preparados a partir de PSA libre a concentraciones de 0, 2, 10, 25, 50 y 100 ng/ml. Se usa un algoritmo de corrección cúbico que pasa por cero para generar una curva de calibrado estándar.

Ensayo de PSA libre Immuno 1 de Bayer

El protocolo usado para el ensayo de PSA total Immuno 1 de Bayer descrito anteriormente se adaptó para las medidas de PSA libre mediante la sustitución de un anticuerpo monoclonal específico para PSA libre (PSA 19, CanAg) conjugado con fluoresceína como el anticuerpo de captura R1. El anticuerpo monoclonal anti-PSA libre R1 se usó con el mismo conjugado anticuerpo policlonal anti PSA-fosfatasa alcalina (R2) como aquel usado en el ensayo de PSA total. El conjugado R1 se diluyó a 2,5 \mug/ml y el R2 se usó a 6,15 \mug/ml. Otras condiciones fueron similares a aquellas usadas en el ensayo de PSAt excepto que el volumen de muestra fue de 35 \mul por ensayo y el volumen de partículas magnéticas añadidas fue de 15 \mul por ensayo.

Procedimiento de PSA-ACT Immuno 1 de Bayer

El formato de ensayo de PSA-ACT Immuno 1 de Bayer es el mismo que el del ensayo de PSAt Immuno 1 de Bayer excepto por los siguientes cambios: (1) un anticuerpo monoclonal específico para ACT, ACT 53, se conjuga con fosfatasa alcalina y se usa para detección a razón de 2 \mug/ml; se usa PSA-ACT como patrón y antígeno control con el tampón MES 50 mM, BSA al 6%, pH 5,8; y (3) se usa un protocolo de dos lavados de forma que el antígeno se incuba primero con el anticuerpo de captura, el complejo resultante se lava para eliminar el antígeno no unido y otros componentes del suero, y entonces se añade el anticuerpo de detección.

Resultados Selección y optimización de anticuerpos específicos para la inhibición de la inmunorreactividad de PSA libre en el ensayo de PSA total

La presente invención se basa en la observación de que el ensayo de PSA total se puede hacer específico para complejos PSA-inhibidor de proteasas por la adición de un anticuerpo al epítopo E de PSA. Se sometieron a ensayo cuatro anticuerpos monoclonales, PSA 19, PSA 20, PSA 30 y ME2, específicos para el epítopo E en la molécula de PSA, por su capacidad para disminuir la reactividad de PSA libre en el ensayo de PSA total. Los patrones usados en el ensayo de PSA total se prepararon usando PSA libre al 100% purificado de fluido seminal. Se añadieron anticuerpos anti-E, PSA 19, PSA 20 y PSA 30 a 50 ng/ml de patrón PSA en concentraciones de 0, 10, 25, 50, 100 y 200 \mug/ml. Después de incubación a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos, estas muestras se desarrollaron como muestras desconocidas usando el ensayo de PSA total y se determinó la recuperación de PSA. Tal y como se muestra en la Figura 1A, cada uno de los tres anticuerpos monoclonales, PSA 19, PSA 20 y PSA 30 mostró una inhibición significativa de la reactividad de PSA libre en el ensayo de PSa total. Esta inmunorreactividad disminuida de PSA libre resultó dependiente de la concentración para cada uno de los anticuerpos, pero solamente PSA 20 se aproximó a la saturación. De estos tres anticuerpos, PSA 20 dio la mayor disminución en la señal para PSA libre.

En un experimento diferente, se compararon PSA 20 y ME2 para ver su capacidad de inhibir la unión de PSA libre en el ensayo de PSAt. Se añadieron anticuerpos monoclonales a 10 ng/ml de patrón en concentraciones que variaban de 0 a 400 \mug/ml. Tal y como se puede ver en la Figura 1B, el anticuerpo monoclonal ME2 inhibe cuantitativamente la unión de PSA libre en el ensayo de PSA total y alcanza la saturación a una concentración de menos de 6,125 \mug/ml. Estos datos demuestran que varios anticuerpos de epítopo-E tienen la capacidad de inhibir la unión del anticuerpo MM1 a PSA libre. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal ME2 inhibe la unión de PSA libre en el ensayo de PSA total a una concentración mucho más baja y en una extensión mucho mayor que otros anticuerpos de epítopo-E. la inhibición podría ser debida a una afinidad más elevada del anticuerpo ME2 por el epítopo-E. De forma alternativa, el epítopo-E puede representar una colección de epítopos con diferentes especificidades correctas de epítopo.

Medida del PSA complejado en el analizador Immuno 1 de Bayer

La adición de anticuerpos monoclonales PSA 20 y ME2 al ensayo de PSA total elimina la mayoría de la inmunorreactividad asociada con el PSA libre. Para demostrar una medida cuantitativa del PSA complejado, se prepararon mezclas con diferentes proporciones de PSA libre y complejado con ACT a una concentración de PSA total de aproximadamente 11 ng/ml. Las mezclas contenían relaciones de PSA libre:complejado de 100:0, 80:20, 50:50,20:80 y 0:100. Estas mezclas se midieron usando tres formatos de ensayo inmunológico en el analizador Immuno 1 de Bayer: el ensayo comercial para PSA total (PSAt), el ensayo de PSA libre (PSAl) Immuno 1 de Bayer y el ensayo de PSA complejado (PSAc) Immuno 1 de Bayer. El ensayo de PSA complejado Immuno 1 de Bayer fue idéntico al ensayo de PSAt excepto que para los resultados mostrados en la Figura 2A, se añadió anticuerpo monoclonal PSA 20 a cada muestra a una concentración final de 300 \mug/ml y el conjugado MM1-fluoresceína disminuyó de 1,5 \mug/ml a 0,5 \mug/ml. Para el experimento mostrado en la Figura 2B, se añadió anticuerpo monoclonal ME2 a cada muestra a una concentración final de 25 \mug/ml y se usó de nuevo el conjugado MM1-fluoresceína a razón de 0,5 \mug/ml. Para la medida de PSA total y PSA libre, se calibró el analizador Immuno 1 de Bayer con el set de patrones puntuales de PSA SET Immuno 1 de Bayer que se usa comercialmente para el ensayo de PSA total Immuno 1 de Bayer. Para medir el PSA complejado (PSAc), se prepararon patrones en el intervalo de 0 a 100 ng/ml usando PSA complejado con ACT en MES 50 mM, BSA al 6%, pH 5,8.

La adición del anticuerpo monoclonal PSA 20 al ensayo de PSA total proporciona un procedimiento con una reactividad casi cuantitativa con PS Acomplejado (Figura 2A). La respuesta para las diferentes mezclas en el ensayo de PSAc fue lineal, y la concentración medida de PSA total y PSA complejado dio recuperaciones consistentes de aproximadamente 10 ng/ml para todas las muestras sometidas a ensayo, tal y como se esperaba. De forma similar, el anticuerpo monoclonal ME2 proporciona un procedimiento con una reactividad cuantitativa con PSA complejado a lo largo del intervalo completo de proporciones de PSA libre y complejado (Figura 2B). Además, el ensayo de PSA complejado con el anticuerpo monoclonal ME2 usa una concentración significativamente más baja de anticuerpo monoclonal ME2 (25 \mug/ml) comparado con la requerida para el anticuerpo monoclonal PSA 20 (300 \mug/ml). Estos datos demuestran que se puede usar una combinación de tres anticuerpos que reaccionan con diferentes epítopos en la molécula de PSA (MM1, MP2 y PSA 20 ó ME2) para producir un procedimiento que mida exactamente el PSA complejado.

Automatización del ensayo de PSAc

Un tratamiento previo de muestras de pacientes con anticuerpos monoclonales hacia el epítopo-E no resulta práctico para una aplicación en el ambiente de laboratorio clínico. Dispersar de forma exacta un anticuerpo monoclonal en la muestra resulta difícil y lleva mucho tiempo, y conduce a una inaceptablemente elevada probabilidad de inexactitud en el resultado. Por lo tanto, se desarrollaron los procedimientos para una automatización completa del ensayo de PSAc.

Procedimientos automatizados con anticuerpo monoclonal PSA 20

En el formato de ensayo 1, se añadió anticuerpo monoclonal PSA 20 a R1, MM1-fluoresceína, reactivo a una concentración de 500 \mug/ml y se desarrolló el ensayo como para el procedimiento de PSAt usando PSA-ACT para la calibración. Este ensayo requiere 38 minutos para finalizar. En el formato de ensayo 2, la muestra se trata previamente en presencia de anticuerpo monoclonal PSA 20. En este formato, el anticuerpo PSA 20 se añadió a la cubeta de reacción con la muestra del paciente y se incubó durante 50 minutos. Se añadieron entonces MM1- fluoresceína a una concentración de 0,5 \mug/ml, MP2-ALP a una concentración de 6,15 \mug/ml y partículas magnéticas revestidas con anticuerpos anti-fluoresceína y se incubaron durante 28 minutos más. Después de eliminar por lavado los reactivos en exceso y el suero que no reaccionó, se añadió sustrato y se siguió la formación de color del mismo modo que para el ensayo de PSAt. Se usaron muestras que contenían PSA libre a lo largo de un intervalo de concentración de 2 ng/ml a 25 ng/ml. Los resultados en la Figura 3 muestran que se puede reducir de forma efectiva la señal con PSA libre a niveles muy bajos usando cualquiera de estas aproximaciones. Estos resultados sugieren que este procedimiento se puede automatizar completamente en el analizador Immuno 1 de Bayer.

Procedimiento automatizado con anticuerpo monoclonal ME2

El anticuerpo monoclonal ME2 inhibe la unión del anticuerpo monoclonal MM1 a PSAl en el ensayo de PSAt a una concentración significativamente más baja y en un mayor grado que el anticuerpo monoclonal PSA 20. Adicionalmente, el formato de ensayo 2 requiere más tiempo y necesita dos módulos de reactivos. Por lo tanto, se seleccionó el anticuerpo monoclonal ME2 para usarse como tercer anticuerpo para la automatización del ensayo de PSAc por adición en el ensayo de PSAt por medio de dos caminos: ME2 a una concentración de 50 y 100 ng/ml se añadió en el reactivo 1 (R1) o en el reactivo 2 (R2). Los resultados mostraron que se inhibió la reactividad de PSAl en un 97% y un 98% cuando se añadió ME2 en R1 y R2 respectivamente. En base a estos datos, que el ensayo de PSAc se formularía usando anticuerpo monoclonal ME2 en el reactivo R2 a una concentración final de 100 \mug/ml.

Medida de PSA complejado en suero

Estudio piloto.- Se analizaron muestras de suero de 53 pacientes con cáncer de próstata, 75 pacientes con HPB y 88 muestras de sujetos control sanos de edad comparable usando los tres ensayos: de PSAt, PSAl y PSAc. Las muestras sometidas a ensayo en el ensayo de PSAc fueron tratadas previamente con 25 \mug/ml de anticuerpo ME2, y las muestras sometidas a los ensayos de PSAl y PSAt no se trataron. Los ensayos se calibraron usando PSA libre o complejos PSA-ACT tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 4A. El límite superior del valor normal de 3,75 ng/ml (expresado como concentración equivalente de PSA) se seleccionó con el fin de alcanzar una sensibilidad para la detección del cáncer de próstata en el grupo de hombres con cáncer histológicamente confirmado sustancialmente similar a aquel proporcionado usando un valor límite de 4,0 ng/ml con el ensayo de PSAt (un 85% comparado con un 88%). Con este límite superior del valor normal, la especificidad en las poblaciones normal y afectada por HPB sometidas a ensayo en este estudio fue comparable también para PSAc comparado con un ensayo en dos etapas en el que un resultado positivo de PSAt iba seguido del desarrollo de un ensayo de PSAl y del cálculo de la relación PSAl/PSAt. El hallazgo de que la sensibilidad y especificidad del ensayo de PSAt usado junto con una relación PSAl/PSAt es equivalente a aquel de PSAc solo, mantenido también como verdadero cuando la población de pacientes se estratificó en la zona intermedia de diagnóstico. El intervalo preciso de la zona intermedia de diagnóstico no se ha definido, pero en todos los intervalos comparados en este estudio, la sensibilidad y especificidad del ensayo de PSAc fue comparable a aquel obtenido los ensayos de PSA total y PSA libre. Estos datos demuestran que un único ensayo, de PSAc, puede detectar el cáncer de próstata tan eficazmente como el de PSA total y, además, tiene la especificidad aumentada que se ha mostrado se puede obtener usando dos ensayos, de PSAl y de PSAt.

Estudio clínico.- Se analizaron muestras de suero de 300 pacientes a los que se les hizo una biopsia (75 con cáncer de próstata confirmado) en el hospital Seattle VA Hospital, Seattle, Washington, EE.UU., usando los tres ensayos: de PSAt (usando el ensayo de PSA Hybritech Tandem®, San Diego, California,EE.UU.), de PSAl (usando el ensayo de PSA libre Hybritech Tandem®, San Diego, California,EE.UU.) y de PSAc (usando el procedimiento automatizado con el anticuerpo monoclonal ME2 descrito anteriormente). Los ensayos se calibraron usando PSA libre o complejos PSA-ACT tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados de estos ensayos se muestran en forma de tabla en la Figura 4B y como análisis de regresión en la Figura 4C. El límite superior del valor normal de 3,75 ng/ml (expresado como concentración equivalente de PSA) se seleccionó de nuevo con el fin de alcanzar una sensibilidad para la detección del cáncer de próstata en el grupo de hombres con cáncer histológicamente confirmado sustancialmente similar a aquel proporcionado usando un valor límite de 4,0 ng/ml con el ensayo de PSAt (un 81% comparado con un 83%). Con este límite superior del valor normal, la especificidad en las poblaciones normal y con HPB sometidas a ensayo en este estudio fue comparable también paraPSAc comparado con el ensayo de dos etapas (anteriormente, PSAt + PSAl/PSAt). En la Figura 4C, los datos puntuales en forma de círculo pequeño que aparecen en el cuadrante inferior derecho del gráfico representan aquellos pacientes sin cáncer (34 de 117, o un 29%) que evitarían el riesgo, inquietud y el gasto de una biopsia, habiéndose usado su valor de PSAc, mejor que el de su PSAt, como base de esta decisión médica. También, del mismo modo que en el estudio piloto, el hallazgo de que la sensibilidad y especificidad del ensayo de PSAt usado junto con una relación de PSAl/PSAt es equivalente a aquel de PSAc solo, mantenido como cierto cuando la población de pacientes se estratificó en la zona intermedia de diagnóstico (anterior-
mente).

Los datos de los estudios independientes piloto y clínico demuestran que un único ensayo, de PSAc, puede detectar cáncer de próstata tan eficientemente como el de PSA total y, además, tiene la especificidad aumentada que se ha mostrado se puede conseguir usando dos ensayos, de PSAl y de PSAt.

Correlación entre PSAc y PSA-ACT

Para determinar qué especies de PSA complejados se miden en el ensayo de PSAc, se desarrolló un ensayo para medir PSA complejado con ACT. Esta especie de PSA complejado se ha visto que representa la forma predominante en suero de PSA complejado. Intentos previos para medir PSA-ACT usando procedimientos manuales han experimentado dificultades técnicas tal y como se ha discutido anteriormente. Según esto, se desarrolló un ensayo inmunológico automatizado para medir complejos PSA-ACT en el sistema Immuno 1™ de Bayer. Se sometió a ensayo a la misma población de pacientes descrita anteriormente en el estudio piloto usando el ensayo automatizado para PSA-ACT. Los resultados se muestran en la Figura 6A a 6F, donde se hace una regresión con los resultados obtenidos usando el ensayo automatizado para PSA-ACT frente a los resultados obtenidos usando el ensayo automatizado para PSAc. Para cada población de pacientes, es decir, normales, con cáncer de próstata y con la enfermedad benigna de próstata (HPB), se hizo un análisis de regresión para todas las muestras de pacientes, y a lo largo de un intervalo que contenía la mayor parte de los resultados de los ensayos de los pacientes. Esto se hizo para eliminar el sesgo en el análisis de regresión debido a un pequeño número de valores elevados. En cada caso, las pendientes de las regresiones variaban de 0,93 a 0,98. Estos datos sugieren que aproximadamente un 93 a un 98% de las sustancias medidas por el ensayo para PSAc es PSA-ACT. La naturaleza bioquímica del 2 a 7% de PSAc que queda no se conoce en este
momento.

Especificidad de los ensayos de PSA a sensibilidades seleccionada

El límite superior del valor normal usado para el ensayo de PSAc se determinó para dar una sensibilidad similar del mismo modo que en el ensayo de PSAt. Usando este valor límite, se demostró que el ensayo de PSAc proporciona una mayor especificidad que los procedimientos actualmente usados en l práctica médica, es decir, el de PSAt. La especificidad del ensayo de PSAc se midió también usando diferentes valores para el límite superior del valor normal. Todos los resultados derivados del estudio clínico descritos anteriormente se usaron en un análisis de característica operativa del receptor (análisis ROC). La especificidad se determinó entonces a partir del análisis ROC a niveles variantes de sensibilidad que variaban de un 80 a un 100%. Las sensibilidades de menos de un 80% tienen un escaso valor médico ya que los procedimientos de diagnóstico en la práctica actual proporcionan al menos este nivel de sensibilidad. Los resultados mostrados en la Figura 7 demuestran que a todos los niveles de sensibilidad, el ensayo de PSAc proporciona una sensibilidad adicional sobre PSAt y aproximadamente una especificidad equivalente o ligeramente mejor que el uso de dos ensayos, de PSAt y de PSAl. Además, se mantiene veraz la mejora en la especificidad incluso cuando las muestras de pacientes se estratifican en la zona intermedia de diagnóstico. Estos resultados demuestran además que el límite superior del valor normal para el ensayo de PSAc se puede elegir a lo largo de un amplio intervalo, dependiendo del nivel de sensibilidad y especificidad deseados, pero para todos los valores del límite superior del nivel normal que varían entre aproximadamente 3 y 4 ng/ml, el PSAc da una mayor especificidad sobre PSAt, y aproximadamente una especificidad equivalente a la de la relación PSAl/PSAt.

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Claims (18)

1. Un procedimiento para determinar el antígeno específico de próstata complejado (PSAc), en una muestra de sangre, comprendiendo la etapa de:

(a)

tratar PSA total (PSAt) en una muestra de sangre con un anticuerpo que se une a PSA libre (PSAl) pero no a PSAc para hacer sustancialmente no detectable al menos un 90% del PSA libre (PSAl) por ensayo inmunológico, y

(b)

determinar PSA en la muestra de sangre tratada por inmuoensayo, en la que sustancialmente solo PSAc es detectable en dicho ensayo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) se lleva a cabo separando PSAl del remanente de la muestra de sangre, y en el que la etapa (b) se lleva a cabo sobre dicho remanente de la muestra de sangre.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho ensayo inmunológico es un ensayo inmunométrico de dos sitios.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los dos anticuerpos empleados en el ensayo inmunométrico de dos sitios son monoclonales.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(a)

poner en contacto dicha muestra de sangre con tres anticuerpos anti-PSA para formar una mezcla líquida de ensayo:

(i)

un primer anticuerpo anti-PSA que se une a PSA total (PSAt),

(ii)

un tercer anticuerpo anti-PSA, el cual se une a PSAl pero no a PSAc, donde la unión de dicho tercer anticuerpo de PSAl vuelve a PSAl sustancialmente incapaz de ser detectado en el procedimiento, y

(iii)

un segundo anticuerpo anti-PSA que se une a PSAt pero que es sustancialmente incapaz de unirse a PSA cuando PSA está unido por anticuerpo que se une a PSA libre (PSAl) pero no a PSAc, en el que uno de dichos primer y segundo anticuerpos está marcado ("anticuerpo marcado") y el otro se inmoviliza o es capaz de ser inmovilizado con fines de separación de la mezcla líquida de ensayo ("anticuerpo de captura"),

(b)

separar dicho anticuerpo de captura de la mezcla líquida de ensayo, y

(c)

medir el marcaje en la fase separada de anticuerpo de captura o en el remanente de la mezcla líquida de ensayo.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho segundo anticuerpo anti-PSA es un anticuerpo monoclonal.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho tercer anticuerpo anti-PSA es un anticuerpo monoclonal.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho tercer anticuerpo anti-PSA monoclonal se une sustancialmente al mismos epítopo que el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular HB-12337 ó HB-12338 de la ATCC.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que dicho primer anticuerpo anti-PSA es un anticuerpo monoclonal.

10. Un procedimiento para ayudar en la detección del cáncer de próstata en pacientes humanos varones, que comprende las etapas de:

(a)

medir la cantidad de antígeno específico de próstata (PSAc) en una muestra de sangre obtenida de tal paciente por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y

(b)

determinar si el nivel de PSAc en sangre del paciente es mayor del límite superior del valor normal de aproximadamente 3 a 4 ng/ml.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el límite superior del valor normal es aproximadamente 3,75 ng/ml.

12. Un procedimiento para supervisar el curso de la enfermedad en un paciente varón al que se le ha diagnosticado un cáncer de próstata, comprendiendo la realización de una serie de ensayos inmunológicos en el tiempo según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para determinar cambios en el nivel del antígeno específico de próstata complejado (PSAc) en muestras de sangre obtenidas de tal paciente, donde los cambios en el nivel de PSAc en sangre se correlacionan con los cambios en el estado de la enfermedad.

13. Un procedimiento para supervisar el curso de la enfermedad en un paciente varón que ha sido tratado de cáncer de próstata, comprendiendo la realización de una serie de ensayos inmunológicos en el tiempo según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para determinar cambios en el nivel del antígeno específico de próstata complejado (PSAc) en muestras de sangre obtenidas de tal paciente, donde los aumentos en los niveles de PSAc en sangre indican recurrencia de la enfermedad.

14. Un equipo de ensayo para usar en la determinación del antígeno específico de próstata complejado (PSAc) en una muestra de sangre, comprendiendo:

(1)

un primer anticuerpo anti-PSA que se une a PSA total (PSAt),

(2)

un segundo anticuerpo anti-PSA que se une a PSAt pero que es sustancialmente incapaz de unirse a PSA cuando PSA está unido por anticuerpo que se une a PSA libre (PSAl) pero no a PSAc, en el que uno de dichos primer y segundo anticuerpos está marcado y el otro se inmoviliza o es capaz de ser inmovilizado con fines de separación de la mezcla líquida de ensayo, y

(3)

un tercer anticuerpo anti-PSA, el cual se une a PSAl pero no a PSAc.

15. El equipo de ensayo de la reivindicación 14, en el que dicho segundo anticuerpo anti-PSA es un anticuerpo monoclonal.

16. El equipo de ensayo de la reivindicación 15, en el que dicho tercer anticuerpo anti-PSA es un anticuerpo monoclonal.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que dicho tercer anticuerpo anti-PSA monoclonal se une sustancialmente al mismos epítopo que el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular HB-12337 ó HB-12338 de la ATCC.

18. El equipo de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que dicho primer anticuerpo anti-PSA es un anticuerpo monoclonal.