ES2320228T3

ES2320228T3 - Insercion mejorada direccionada de dna en las plantas.

Info

Publication number: ES2320228T3
Application number: ES04797993T
Authority: ES
Inventors: Kathleen D'halluin; Chantal Vanderstraeten; Rene Ruiter
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2003-11-18
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2024-11-17
Also published as: PT2025756E; AU2010212264B2; US7598365B2; ATE514782T1; SI2025756T1; JP2007511232A; PL2025756T3; AU2004291692A1; AU2004291692B2; JP2011177191A; JP5913833B2; EP2025756A1; ATE419367T1; EP1689870A2; CA2545564C; PL1689870T3; DK2025756T3; US8653326B2; ES2368962T3; EP2025756B1

Abstract

Un fragmento de DNA aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa I-SceI en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 o cualquier secuencia de nucleótidos obtenida por reemplazamiento de 1 a 20 nucleótidos de SEQ ID No. 4 por cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, de tal manera que el contenido de GC de dicha secuencia de nucleótidos es aproximadamente 50 a aproximadamente 60%, con la condición de que a) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 121 a la posición 123 es GAG, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 124 a la 126 no es CAA; b) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 253 a la posición 255 es GAC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 256 a 258 no es CAA; c) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 279 es CAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 280 a 282 no es AAA; d) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 340 a la posición 342 es AAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 343 a la posición 345 no es CAT; e) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 490 a la posición 492 es TCA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 493 a la posición 495 no es ACC; f) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 499 a la posición 501 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 502 a 504 no es TCA o AGC; g) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 es ACC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a 525 sea TCN; h) si la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 es ATT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA; i) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 7 a la posición 15 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; j) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 61 a la posición 69 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; k) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 130 a la posición 138 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; l) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 268 a la posición 279 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; m) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 322 a la posición 333 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; n) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 460 a la posición 468 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; o) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 13 a la posición 27 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; p) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 48 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; q) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 184 a la posición 192 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; r) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 214 a la posición 219 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; s) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 285 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; t) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 388 a la posición 396 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; u) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 466 a la posición 474 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; v) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 484 a la posición 489 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; w) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 571 a la posición 576 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; x) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 598 a la posición 603 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 604 a la posición 609 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; z) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 613 a la posición 621 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; aa) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 646 a la posición 651 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; bb) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 666 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y cc) los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 706 a la posición 714 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T.

Description

Inserción mejorada direccionada de DNA en las plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más específicamente al campo de la ingeniería genómica de las plantas. Se proporcionan métodos para la introducción dirigida de un fragmento de DNA extraño en un sitio de inserción preseleccionado en el genoma de una planta. Plantas que contienen el DNA extraño insertado en un sitio particular pueden obtenerse ahora con una mayor frecuencia y con mayor exactitud que lo que es posible con los métodos de inserción DNA direccionada de DNA disponibles actualmente. Además, en una gran proporción de las plantas resultantes, el DNA extraño se ha insertado solamente en el sitio de inserción preseleccionado, sin que el DNA extraño se haya insertado aleatoriamente en otras localizaciones en el genoma de la planta. Los métodos de la invención son por consiguiente una mejora, tanto cuantitativa como cualitativamente, con respecto a los métodos de la técnica anterior. Se proporcionan también genes quiméricos, plásmidos, vectores y otros medios para utilización en los métodos de la invención.

Antecedentes de la invención

La primera generación de plantas transgénicas al principio de los años 80 del siglo pasado por tecnología de transformación mediada por Agrobacterium, ha estimulado el desarrollo de otros métodos para introducir un DNA extraño de interés o un transgén en el genoma de una planta, tales como la incorporación de DNA mediada por PEG en protoplastos, bombardeo con microproyectiles, transformación mediada por triquitas de silicio, etc.

Sin embargo, todos los métodos de transformación de plantas tienen en común que los transgenes incorporados en el genoma de la planta se integran de una manera aleatoria y en número de copias impredecible. Con frecuencia, los transgenes pueden integrarse en la forma de repeticiones, sea del transgén entero o de partes del mismo. Un patrón de integración compleja de este tipo puede influir en el nivel de expresión de los transgenes, v.g. por destrucción del DNA transcrito por mecanismos de silenciación de genes posteriores a la transcripción o por inducción de metilación del DNA introducido, regulando con ello en sentido decreciente la actividad de transcripción en el transgén. Asimismo, el sitio de integración per se puede influir en el nivel de expresión del transgén. La combinación de estos factores da como resultado una gran variación en el nivel de expresión de los transgenes o DNA extraño de interés entre células de plantas y líneas de plantas transgénicas diferentes. Además, la integración del DNA extraño de interés puede tener un efecto disruptivo en la reacción del genoma en la que ocurre la integración, y puede influir o perturbar la función normal de dicha región diana, conduciendo con ello a efectos secundarios a menudo indeseables.

Por esta razón, siempre que se investiga el efecto de introducción de un DNA extraño particular en una planta, se requiere que se generen y se analicen un gran número de líneas de plantas transgénicas a fin de obtener resultados significativos. Análogamente, en la generación de plantas de cosecha transgénicas, en las que se introduce un DNA de interés particular en las plantas para proporcionar a la planta transgénica un fenotipo deseado conocido, se crea una gran población de líneas de plantas transgénicas creadas independientemente o los denominados sucesos, para permitir la selección de aquellas líneas de plantas que exhiben una expresión óptima de los transgenes, y con efectos secundarios mínimos o inexistentes, en cuanto al fenotipo global de la planta transgénica. Particularmente en este campo, sería ventajoso si este proceso de tanteos pudiera reemplazarse por un método más directo, teniendo en cuenta los requisitos reguladores engorrosos y los costes elevados asociados con las pruebas en campo repetidas necesarias para la eliminación de los sucesos transgénicos no deseados. Adicionalmente, estará claro que la posibilidad de inserción de DNA direccionado podría ser también beneficiosa en el proceso de la denominada superposición de
transgenes.

La necesidad de controlar la integración del transgén en plantas ha sido pronto reconocida, y se han desarrollado varios métodos en un esfuerzo para satisfacer esta necesidad (para una revisión véase Kumar y Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, pp. 155-159). Estos métodos están basados fundamentalmente en integración de transgenes basada en recombinación homóloga, una estrategia que ha sido aplicada con éxito en procariotas y eucariotas inferiores (véase v.g. EP 0317509 o la publicación correspondiente por Paszkowski et al., 1988, EMBO J., 7, pp. 4021-4026). Sin embargo, para las plantas, el mecanismo predominante para la integración de transgenes está basado en la recombinación ilegítima que implica poca homología entre las cadenas de DNA recombinantes. Un desafío importante en esta área es por consiguiente la detección de los sucesos raros de recombinación homóloga, que se ven enmascarados por la integración mucho más eficiente del DNA extraño introducido por recombinación ilegítima.

Una forma de resolver este problema es por selección contra los sucesos de integración que se han producido por recombinación ilegítima, tal como se ilustra en WO 94/17176.

Otra forma de resolver el problema por activación del locus diana y/o del DNA de reparación donante por la introducción de roturas de DNA bicatenario por medio de endonucleasas de restricción rara, tales como I-SceI. Se ha demostrado que esta técnica aumenta la frecuencia de recombinación homóloga al menos en dos órdenes de magnitud utilizando Agrobacterias para suministrar el DNA de reparación a las células de las plantas (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 93, pp5055-5060; Chilton y Que, Plant Physiol., 2003).

WO 96/14408 describe un DNA aislado que codifica la enzima I-SceI. Esta secuencia de DNA puede incorporarse en vectores de clonación y expresión, líneas de células transformadas y animales transgénicos. Los vectores son útiles en mapeado génico e inserción orientada de genes.

WO 00/46386 describe métodos de modificación, reparación, atenuación y desactivación de un gen u otro DNA cromosómico en una célula por rotura de las dobles cadenas con I-SceI. Se describen también métodos de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo que se encuentra en necesidad de ello. Se describen adicionalmente endonucleasas de restricción quiméricas.

Sin embargo, persiste todavía necesidad de mejorar la frecuencia de la inserción direccionada de un DNA extraño en el genoma de una célula eucariota, particularmente en el genoma de una célula vegetal. Estos y otros problemas se resuelven como se describe más adelante en esta memoria en las diferentes realizaciones detalladas de la invención, así como en las reivindicaciones.

Sumario de la invención

En una realización, la invención re refiere a un método para la introducción de un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de

(a): inducir una rotura de DNA bicatenario en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula;

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal;

\quad: caracterizado porque la rotura del DNA bicatenario se introduce por una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa I-SceI en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 o cualquier secuencia de nucleótidos obtenida por reemplazamiento de 1 a 20 nucleótidos de SEQ ID No. 4 por cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, de tal manera que el contenido de GC de dicha secuencia de nucleótidos es aproximadamente 50 a aproximadamente 60%, con la condición de que

a): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 121 a la posición 123 es GAG, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 124 a la 126 no es CAA;

b): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 253 a la posición 255 es GAC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 256 a 258 no es CAA;

c): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 279 es CAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 280 a 282 no es AAA;

d): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 340 a la posición 342 es AAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 343 a la posición 345 no es CAT;

e): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 490 a la posición 492 es TCA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 493 a la posición 495 no es ACC;

f): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 499 a la posición 501 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 502 a la posición 504 no es TCA o AGC;

g): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 es ACC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a 525 sea TCN;

h): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 es ATT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA;

i): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 7 a la posición 15 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

j): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 61 a la posición 69 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

k): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 130 a la posición 138 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

l): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 268 a la posición 279 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

m): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 322 a la posición 333 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

n): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 460 a la posición 468 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

o): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 13 a la posición 27 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

p): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 48 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

q): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 184 a la posición 192 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

r): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 214 a la posición 219 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

s): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 285 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

t): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 388 a la posición 396 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

u): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 466 a la posición 474 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

v): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 484 a la posición 489 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

w): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 571 a la posición 576 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

x): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 598 a la posición 603 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

y): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 604 a la posición 609 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

z): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 613 a la posición 621 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

aa): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 646 a la posición 651 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

bb): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 666 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y

cc): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 706 a la posición 714 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T.

La invención proporciona también un fragmento de DNA aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa I-SceI en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 o cualquier secuencia de nucleótidos obtenida por reemplazamiento de 1 a 20 nucleótidos de SEQ ID No. 4 por cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, de tal manera que el contenido de GC de dicha secuencia de nucleótidos es aproximadamente 50 a aproximadamente 60%, con la condición de que

b): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 253 a la posición 255 es GAC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 256 a 258 no es CAA;

f): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 499 a la posición 501 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 502 a 504 no es TCA o AGC;

g): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 es ACC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a la 525 sea TCN;

k): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 130 a la posición 138 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

l): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 268 a la posición 279 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

m): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 322 a la posición 333 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

n): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 460 a la posición 468 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C;

o): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 13 a la posición 27 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

p): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 48 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

q): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 184 a la posición 192 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

r): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 214 a la posición 219 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

s): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 285 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

t): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 388 a la posición 396 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

u): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 466 a la posición 474 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

v): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 484 a la posición 489 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

w): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 571 a la posición 576 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

x): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 598 a la posición 603 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

y): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 604 a la posición 609 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

z): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 613 a la posición 621 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

aa): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 646 a la posición 651 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T;

bb): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 666 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y

cc): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 706 a la posición 714 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de 5 nucleótidos contiguos del grupo de A o T.

La invención proporciona también una secuencia de DNA aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4, así como un gen quimérico que comprende el fragmento de DNA aislado de acuerdo con la invención enlazado operativamente a un promotor expresable en plantas y el uso de un gen quimérico de este tipo para insertar un DNA extraño en un sitio de reconocimiento de I-SceI en el genoma de una planta.

En otra realización adicional de la invención, se proporciona un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal que comprende los pasos de

a): inducir una rotura de DNA bicatenario en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula por una endonucleasa de restricción rara

b): introducir el DNA extraño de interés en la célula de la planta;

caracterizado porque dicha endonucleasa comprende una señal de localización nuclear.

Breve descripción de las figuras

La Tabla 1 representa las opciones posibles de trinucleótidos (codones) para una región codificante de I-SceI sintética (véase también la secuencia de nucleótidos en SEQ ID No. 2).

La Tabla 2 representa las opciones posibles preferidas de trinucleótidos para una región codificante de I-SceI sintética (véase también la secuencia de nucleótidos en SEQ ID No. 3).

Figura 1: Representación esquemática del locus diana (A) y el DNA de reparación (B) utilizado en el ensayo para la inserción de DNA direccionada mediada por recombinación homóloga. Se representa también el locus diana después de recombinación (C). Sitio DSB: sitio de rotura del DNA bicatenario; 3'g7: señal de terminación de la transcripción y poliadenilación del gen 7 de A. tumefaciens; neo: neomicin-fosfotransferasa expresable en plantas; 35S: promotor del transcrito 35S de CaMV; 5' bar: región de DNA que codifica la porción amino-terminal de la fosfinotricin-acetiltransferasa; 3'nos: señal de terminación de la transcripción y poliadenilación del gen de nopalina-sintetasa de A. tumefaciens; Pnos: promotor del gen de nopalina-sintetasa de A. tumefaciens; 3'ocs: señal 3' de terminación de la transcripción y poliadenilación del gen de octopina-sintasa de A. tumefaciens.

Descripción detallada

Se ha encontrado que:

a): La introducción en las células de la planta del DNA extraño a insertar por transferencia directa de DNA, particularmente bombardeo con microproyectiles, aumentaba inesperadamente la frecuencia de sucesos de inserción direccionados. La totalidad de los sucesos de inserción obtenidos eran sucesos de inserción de DNA direccionados, que ocurrían en el sitio de la rotura de DNA bicatenario inducida. Además, la totalidad de estos sucesos de inserción direccionadas parecían ser sucesos de recombinación exacta entre la homología de secuencia proporcionada que flanqueaba la rotura del DNA bicatenario. Sólo aproximadamente la mitad de estos sucesos tenían una inserción adicional del DNA extraño en un sitio diferente del sitio de la rotura del DNA bicatenario inducida.

b): La inducción de la rotura del DNA bicatenario por expresión transitoria de una endonucleasa de restricción rara inductora de rotura bicatenaria, tal como I-SceI, codificada por un gen quimérico que comprendía una región codificante sintética para una endonucleasa de restricción rara tal como I-SceI diseñada de acuerdo con un conjunto preseleccionado de reglas, aumentaba sorprendentemente la calidad de los sucesos de inserción del DNA direccionado resultantes (es decir la frecuencia de sucesos de inserción de DNA perfectamente direccionados). Adicionalmente, la endonucleasa se había equipado con una señal de localización nuclear.

c): La preincubación de las células diana en un compuesto fenólico vegetal, tal como acetosiringona, aumentaba adicionalmente la frecuencia de inserción direccionada en roturas de DNA bicatenario inducidas en el genoma de una célula vegetal.

Cualquiera de los descubrimientos anteriores, aislados o en combinación, mejora la frecuencia con la cual pueden obtenerse sucesos de inserción direccionados basados en recombinación homóloga, así como la calidad de los sucesos recuperados.

Como se utiliza en esta memoria, "transferencia di-recta de DNA" es cualquier método de introducción de DNA en células vegetales que no implica el uso de Agrobacterium spp. natural que es capaz de introducir DNA en células vegetales. Esto incluye métodos bien conocidos en la técnica tales como la introducción de DNA por electroporación en protoplastos, introducción de DNA por electroporación en células de plantas intactas o tejidos parcialmente degradados o células de plantas, introducción en protoplastos de DNA por la acción de agentes tales como PEG y análogos, y particularmente bombardeo con microproyectiles recubiertos con DNA. La introducción de DNA por transferencia directa en células de plantas difiere de la introducción de DNA mediada por Agrobacterium al menos en que el DNA bicatenario entra en la célula de la planta, en que el DNA de entrada no está recubierto con ninguna proteína, y en que la cantidad de DNA que entra en la célula de la planta puede ser considerablemente mayor. Adicionalmente, el DNA introducido por métodos de transferencia directa, tales como el gen quimérico introducido que codifica una endonucleasa inductora de una rotura del DNA bicatenario, puede ser más susceptible de transcripción, dando como resultado una mejor sincronización de la introducción de la rotura del DNA bicatenario. Aunque no se pretende limitar la invención a un modo de acción particular, se cree que la inserción eficiente basada en homología-recombinación del DNA de reparación o DNA extraño en el genoma de una célula vegetal puede ser debida a una combinación de cualquiera de estos parámetros.

Así pues, en un aspecto, la invención se refiere a un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal, que comprende los pasos de:

1): inducción de una rotura de DNA bicatenario en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula;

2): introducción al DNA extraño de interés en la célula de la planta;

caracterizado porque la rotura del DNA bicatenario es introducida por una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa I-SceI en donde dicha secuencia de nucleófilos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 o cualquier secuencia de nucleótidos obtenida por reemplazamiento de 1 a 20 nucleótidos de SEQ ID No. 4 por cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, de tal manera que el contenido de GC de dicha secuencia de nucleótidos es aproximadamente 50 a aproximadamente 60%, con la condición de que

a): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 121 a la posición 123 es GAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 124 a 126 no es CAA;

g): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 es ACC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a 525 sea TCN;

h): si la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 es ATT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA;

j): los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 61 a la posición 69 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o G;

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Convenientemente, la rotura del DNA bicatenario puede inducirse en el sitio preseleccionado por expresión transitoria después de la introducción de un gen expresable en plantas que codifica una enzima de escisión rara inductora de la rotura de las dos cadenas. Como se expone en otro lugar de este documento, puede utilizarse I-SceI para dicho propósito a fin de introducir un DNA extraño en un sitio de reconocimiento por I-SceI. Sin embargo, resultará inmediatamente evidente para las personas expertas en la técnica que pueden utilizarse también otras enzimas inductoras de rotura de las dos cadenas (DSB) para insertar el DNA extraño en sus sitios de reconocimientos respectivos. Una lista de enzimas de escisión raras inductoras de DSB y sus sitios de reconocimiento respectivos se proporciona en la Tabla I del documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20). Adicionalmente, están disponibles métodos para diseñar endonucleasas de escisión raras fabricadas por encargo que reconocen básicamente cualquier secuencia de nucleótido diana de elección. Tales métodos han sido descritos p.ej. en WO 03/080809, WO 94/18313 o WO 95/09933, y en Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530).

Así pues, como se utiliza en esta memoria, "un sitio preseleccionado" indica una secuencia de nucleótidos particular en el genoma nuclear de la planta en cuya localización se desea insertar el DNA extraño. Una persona experta en la técnica sería perfectamente capaz de seleccionar una enzima inductora de rotura del DNA bicatenario ("DSBI") que reconozca la secuencia del nucleótido diana seleccionada o modificar por ingeniería genética una endonucleasa DSBI de este tipo. Alternativamente, un sitio de reconocimiento por una endonucleasa DSBI puede introducirse en el genoma de la planta utilizando cualquier método de transformación convencional o por mejora genética convencional utilizando una línea de plantas que tenga un sitio de reconocimiento por una endonucleasa DSBI en su genoma, y cualquier DNA extraño deseado puede introducirse después de ello en dicho sitio diana preseleccionado introducido previamente.

La rotura del DNA bicatenario puede inducirse convenientemente por introducción transitoria de un gen quimérico expresable en plantas que comprende una región promotora expresable en plantas enlazada operativamente a una región de DNA que codifique una enzima inductora de rotura en las dos cadenas. La región de DNA que codifica una enzima inductora de rotura en las dos cadenas puede ser una región de DNA sintético, tal como, pero sin carácter limitante, una región de DNA sintético en la cual los codones se seleccionan de acuerdo con el esquema de diseño que se describe en otro lugar de esta solicitud para las regiones codificantes de I-SceI.

La enzima inductora de rotura en las dos cadenas puede comprender, pero no comprende necesariamente, una señal de localización nuclear (NLS) [Raikhel, Plant Physiol. 100:1627-1632 (1992) y las referencias citadas en dicho lugar], tales como la NLS del antígeno T largo de SV40 [Kalderon et al. Cell 39:499-509 81984]. La señal de localización nuclear puede localizarse en cualquier lugar de la proteína, pero convenientemente está localizada en el extremo N-terminal de la proteína. La señal de localización nuclear puede reemplazar uno o más de los aminoácidos de la enzima inductora de la rotura en las dos cadenas.

Como se utiliza en esta memoria, "DNA extraño de interés" indica cualquier fragmento de DNA que pueda desearse introducir en el sitio preseleccionado. Aunque no se requiere estrictamente, el DNA extraño de interés puede estar flanqueado por al menos una región de secuencia de nucleótidos que tenga homología para una región de DNA flanqueante del sitio preseleccionado. El DNA extraño de interés puede estar flanqueado en ambos sitios por regiones de DNA que tengan homología para las dos regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado. Así, la o las moléculas de DNA de reparación introducidas en la célula de la planta pueden comprender un DNA extraño flanqueado por una o dos secuencias flanqueantes que tengan homología para las regiones de DNA situadas respectivamente aguas arriba o aguas abajo del sitio preseleccionado. Esto permite un mejor control de la inserción del DNA extraño. De hecho, la integración por recombinación homóloga permitirá la unión precisa del fragmento de DNA extraño al genoma nuclear de la planta hasta el nivel de los nucleótidos.

Las secuencias de nucleótidos flanqueantes pueden variar en longitud, y deberían tener una longitud de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. En cambio, la región flanqueante puede ser tan larga como sea prácticamente posible (v.g. hasta aproximadamente 100-150 kb tales como cromosomas artificiales bacterianos (BACs) enteros). Preferiblemente, la región flanqueante será aproximadamente de 50 pb a aproximadamente 2000 pb. Además, las regiones que flanquean el DNA extraño de interés no precisan ser idénticas a las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado, y pueden tener entre aproximadamente 80% y aproximadamente 100% de identidad de secuencia, con preferencia aproximadamente 95% a aproximadamente 100% de identidad de secuencia con las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado. Cuanto más larga sea la región flanqueante, cuanto menos severo será el requisito de homología. Además, se prefiere que la identidad de secuencia sea tan alta como sea prácticamente posible en la proximidad de la localización de inserción exacta del DNA extraño.

Además, las regiones que flanquean el DNA extraño de interés no precisan tener homología con las regiones que flanquean inmediatamente el sitio preseleccionado, pero pueden tener homología para una región de DNA del genoma nuclear situada más lejos de dicho sitio preseleccionado. La inserción del DNA extraño dará entonces como resultado una eliminación del DNA diana entre el sitio de inserción preseleccionado y la región de homología del DNA. Dicho de otro modo, el DNA diana localizado entre las regiones de homología se reemplazará en lugar del DNA extraño de interés.

Para el propósito de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos afines, expresada como porcentaje, hace referencia al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x 100) dividido por el número de posiciones comparadas. Una laguna, es decir una posición en una alineación en la cual está presente un residuo en una secuencia pero no en la otra, se considerará como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza por el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970). La alineación de secuencias asistida por ordenador puede realizarse convenientemente utilizando programas de software estándar tales como GAP, que forma parte del paquete Wisconsin, versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.) utilizando la matriz de registro por defecto con una penalidad por creación de laguna de 50 y una penalidad por extensión de laguna de 3.

Uno de los fragmentos de DNA modificados que codifican I-SceI, que pueden utilizarse para introducir eficientemente un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal, tiene una secuencia de nucleótidos que se ha diseñado para cumplir los criterios siguientes:

a): la secuencia de nucleótidos codifica una endonucleasa I-SceI funcional, tal como una endonucleasa I-SceI que tiene la secuencia de aminoácidos que se proporciona en SEQ ID No. 1;

b): la secuencia de nucleótidos tiene un contenido de GC de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%;

c): la secuencia de nucleótidos no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAA TA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA;

d): el nucleótido no comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por CCAAT, ATTGG, GCAAT y ATTGC;

e): la secuencia de nucleótidos no comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA o GCAGG;

f): la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de GC constituido por 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C;

g): la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo de GC constituido por 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de A o T; y

h): la secuencia de nucleótidos no comprende codones que codifiquen Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala que comprenden dobletes TA o GC en posiciones 2 y 3 (es decir la secuencia de nucleótidos no comprende los codones TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG).

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I-SceI es una endonucleasa específica de sitio, responsable de la movilidad de los intrones en las mitocondrias en Saccharomyces cerevisiae. La enzima es codificada por el intrón opcional Sc LSU.1 del gen de rRNA 21S e inicia una rotura del DNA bicatenario en el sitio de inserción del intrón que genera un corte escalonado de 4 pb con salientes 3'OH. El sitio de reconocimiento de la endonucleasa I-SceI se extiende a lo largo de una secuencia no simétrica de 18 pares de bases (Colleaux et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6022-6026). La secuencia de aminoácidos para I-SceI y un equivalente de código universal del gen mitocondrial de I-SceI han sido proporcionados por, v.g., el documento WO 96/14408.

WO 96/14408 describe que las variantes siguientes de la proteína I-SceI son todavía funcionales:

\bullet: \vtcortauna las posiciones 1 a 10 pueden delecionarse

\bullet: \vtcortauna posición 36: se tolera Gly(G)

?: posición 40: se toleran Met (M) o Val (V)

\bullet: \vtcortauna posición 41: se toleran Ser (S) o Asn (N)

?: posición 43: se tolera Ala (A)

?: posición 46: se toleran Val (V) o N (Asn)

?: posición 91: se tolera Ala (A)

?: posiciones 123 y 156: se tolera Leu (L)

\bullet: \vtcortauna posición 223 : se toleran Ala (A) y Ser (S)

y secuencias sintéticas de nucleótidos que codifican tales enzimas variantes de I-SceI pueden diseñarse también y utilizarse de acuerdo con la presente invención.

Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de I-SceI, en la cual los cuatro aminoácidos localizados en posición aminoterminal se han reemplazado por una señal de localización nuclear (SEQ ID No. 1) consiste por tanto en 244 trinucleótidos que pueden representarse con R1 a R244. Para cada una de estas posiciones son posibles entre las 1 y 6 posibles opciones de trinucleótidos que codifican el mismo aminoácido. La Tabla 1 presenta las opciones posibles para los trinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 1 y proporciona los requisitos estructurales (sean condicionales o absolutos) que permiten evitar la inclusión en la secuencia de DNA sintética de las "secuencias de nucleótidos prohibidas" arriba mencionadas. Se proporciona también la secuencia de nucleótidos de los trinucleótidos contiguos en el código UIPAC.

Como se utilizan en esta memoria, los símbolos del código UIPAC tienen su significado usual, es decir: N= A o C o G o T; R= A o G; Y= C o T; B= C o G o T (no A); V= A o C o G (no T); D= A o G o T (no C); H=A o C o T (no G); K= G o T; M= A o C; S= G o C; W=A o T.

Así pues, un fragmento de DNA sintético aislado adecuado es uno que comprende una secuencia de nucleótidos como la representada en SEQ ID No. 2, en donde los codones se seleccionan entre las opciones proporcionadas de tal manera que se obtenga una secuencia de nucleótidos con un contenido global de GC de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, con preferencia aproximadamente 54% a 55%, con la condición de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 28 a la posición 30 no es AAG; si la secuencia de nucleótidos en la posición 34 a la 36 es AAT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 39 no es ATT o ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 34 a la posición 36 es AAC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 39 no es ATT simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 40 a la posición 42 sea AAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 34 a la posición 36 es AAC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 39 no es ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 39 es ATT o ATA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 40 a la 42 no es AAA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 49 a la posición 51 no es CAA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 52 a la posición 54 no es GTA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 58 a la posición 63 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 67 a la posición 69 es CCC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 70 a la posición 72 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 76 a la posición 78 es AAA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 79 a la posición 81 no es TTG simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 82 a la 84 sea CTN; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 79 a la posición 81 es TTA o CTA, entonces a secuencia de nucleótidos desde la posición 82 a la posición 84 no es TTA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 88 a la posición 90 no es GAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 91 a la posición 93 es TAT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 94 a la posición 96 no es AA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 97 a la posición 99 es TCC o TCG o AGC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 100 a la 102 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 103 a 105 sea TTR; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 100 a la 102 es CAA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 103 a la 105 no es TTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 109 a la posición 111 es GAA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 112 a la 114 no es TTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 115 a 117 es AAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 118 a la posición 120 no es ATT o ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 121 a 123 es GAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 124 a la posición 126; (sic) la secuencia de nucleótidos desde la posición 133 a 135 no es GCA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 139 a la posición 141 no es ATT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 142 a la posición 144 es GGA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 145 a la posición 147 no es TTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 145 a la posición 147 es TTA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 148 a la posición 150 no es ATA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 151 a 153 sea TTR; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 145 a la posición 147 es CTA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 148 a la posición 150 no es ATA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 151 a 153 sea TTR; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 148 a la posición 150 es ATA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 151 a la posición 153 no es CTA o TTG; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 160 a la posición 162 es GCA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 163 a la posición 165 no es TAC; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 163 a la posición 165 es TAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 166 a la posición 168 no es ATA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 169 a la posición 171 sea AGR; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 172 a la posición 177 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende GCAGG; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 178 a la posición 186 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende AGGTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 193 a la posición 195 es TAT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 196 a la posición 198 no es TGC; la secuencia de nucleótidos desde la posición 202 a la posición 204 no es CAA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 217 a la posición 219 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 220 a la posición 222 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 223 a la posición 225 no es GCA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 223 a la posición 225 es GCA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 226 a la posición 228 no es TAC; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 253 a la posición 255 es GAC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 256 a la posición 258 no es CAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 279 es CAT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 280 a la posición 282 no es AAA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 298 a la posición 303 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 304 a la posición 306 es GGC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 307 a la posición 309 no es AAT; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 307 a la posición 312 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 334 a la posición 342 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 340 a la posición 342 es AAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 343 a 345 no es CAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 346 a la posición 348 es CAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 349 a la posición 351 no es GCA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 349 a la posición 357 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 355 a la posición 357 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 358 a la posición 360 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 361 a 363 no es TTG; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 364 a la posición 366 es GCC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 367 a la posición 369 no es AAT; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 367 a la posición 378 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 382 a la posición 384 es AAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 385 a la posición 387 no es AAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 385 a la posición 387 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 400 a 402 es CCC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 403 a 405 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 403 a 405 es AAT, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 406 a 408 no es AAT; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 406 a la posición 411 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 421 a la posición 426 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 430 a la posición 432 no es CCA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 436 a la posición 438 es TCA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 439 a la posición 441 no es TTG; la secuencia de nucleótidos desde la posición 445 a la posición 447 no es TAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 481 a 483 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 484 a la posición 486 es AAA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 487 a la posición 489 no es AAT simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 490 a la posición 492 sea AGY; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 490 a la posición 492 es TCA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 493 a la posición 495 no es ACC simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 496 a 498 sea AAY; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 493 a la posición 495 es ACC, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 496 a 498 no es AAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 496 a la posición 498 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 499 a la posición 501 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 502 a la posición 504 no es TCA o AGC; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 508 a posición 510 es GTA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 511 a 513 no es TTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 514 a la posición 516 es AAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 no es ACA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 es ACC o ACG, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a la posición 525 sea TCN; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a la posición 531 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 544 a la posición 546 es GAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 547 a la posición 549 no es TAT, simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 550 a la posición 552 sea TTR; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 547 a la posición 552se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 559 a la posición 561 es GGA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 562 a la posición 564 no es TTG simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 565 a 567 sea CGN; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 565 a la posición 567 es CGC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 568 a la posición 570 no es AAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 568 a la posición 570 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 574 a la posición 576 es TTC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 577 a la posición 579 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 580 a la posición 582 sea TTR; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 577 a la posición 579 es CAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 580 a la posición 582 no es TTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 583 a la posición 585 es AAT la secuencia de nucleótidos desde la posición 586 a 588 no es TGC; la secuencia de nucleótidos desde la posición 595 a la posición 597 no es AAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 598 a la posición 600 es ATT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 601 a la posición 603 no es AAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 598 a la posición 600 no es ATA; la secuencia de nucleótidos desde la posición 601 a la posición 603 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 604 a la posición 606 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 607 a la posición 609 no es AAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 607 a la posición 609 no es AAT; la secuencia de nucleótidos desde la posición 613 a la posición 615 no es CCA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 613 a la posición 615 es CCG, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 616 a la posición 618 no es ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 616 al nucleótido de la posición 618 es ATA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 619 a 621 no es ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 619 a la posición 621 es ATA, entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 622 a la posición 624 no es TAC; la secuencia de nucleótidos desde la posición 619 a la posición 621 no es ATT; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 640 a la posición 645 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 643 a la posición 645 es TTA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 646 a la posición 648 no es ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 643 a la posición 645 es CTA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 646 a la posición 648 no es ATA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 655 a la posición 660 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 658 a 660 es TTA o CTA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 no es ATT o ATC; la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 no es ATA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 es ATT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 670 a la posición 675 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende ATTTA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 691 a la posición 693 es TAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 694 a la posición 696 no es AAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 694 a la posición 696 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 697 a la posición 699 no es TTG; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 700 a la posición 702 es CCC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 703 a la posición 705 no es AAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 703 a la posición 705 es AAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 706 a la posición 708 no es ACA o ACT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 706 a la posición 708 es ACA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 709 a 711 no es ATA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 712 a la posición 714 sea AGY; la secuencia de nucleótidos no comprende los codones TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG; dicha secuencia de nucleótidos no comprende un tramo GC constituido por 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C; y la secuencia de nucleótidos no comprende un tramo AT constituido por 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo
de A o T.

Un grupo preferido de secuencias de oligonucleótidos sintéticas se presenta en la Tabla 2 y corresponde a un fragmento de DNA sintético aislado proporcionado que comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en SEQ ID No 3, en donde los codones se seleccionan entre las opciones proporcionadas de tal manera que se obtenga una secuencia de nucleótidos con un contenido global de GC de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%, con preferencia aproximadamente 54%-55%, con la condición de que si la secuencia de nucleótidos desde la posición 121 a la posición 123 es GAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 124 a 126 no es CAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 253 a la posición 255 es GAC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 256 a 258 no es CAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 279 es CAT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 280 a 282 no es AAA; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 340 a la posición 342 es AAG entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 343 a la posición 345 no es CAT; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 490 a la posición 492 es TCA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 493 a la posición 495 no es ACC; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 499 a la posición 501 es AAA entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 502 a 504 no es TCA o AGC; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 517 a la posición 519 es ACC entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente al hecho de que la secuencia de nucleótidos desde la posición 523 a 525 sea TCN; si la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 663 es ATT entonces la secuencia de nucleótidos desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 7 a la posición 15 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 61 a la posición 69 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 130 a la posición 138 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 268 a la posición 279 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 322 a la posición 333 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 460 a la posición 468 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 13 a la posición 27 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 37 a la posición 48 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 184 a la posición 192 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 214 a la posición 219 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 277 a la posición 285 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 388 a la posición 396 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 466 a la posición 474 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 484 a la posición 489 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 571 a la posición 576 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 598 a la posición 603 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 604 a la posición 609 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 613 a la posición 621 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 646 a la posición 651 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 661 a la posición 666 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y los codones de la secuencia de nucleótidos desde la posición 706 a la posición 714 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia de nucleótidos resultante no comprende un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo
de A o T.

La secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 es un ejemplo de una secuencia de nucleótidos sintética de este tipo que codifica una endonucleasa I-SceI que no contiene ya ninguna de las secuencias de nucleótidos o codones a evitar. Sin embargo, estará claro que una persona experta en la técnica puede obtener fácilmente una secuencia similar codificante de I-SceI por reemplazamiento de uno o más (entre 2 y 20) de los nucleótidos a seleccionar en lugar de cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID 3 (con exclusión de cualquiera de las combinaciones prohibidas descritas en el párrafo anterior) y utilizar la misma para obtener un efecto
similar.

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Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un fragmento de DNA aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa I-SceI en la cual dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 o cualquier secuencia de nucleótidos obtenida reemplazando 1 a 20 nucleótidos de SEQ ID No 4 en sustitución de cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3, de tal manera que el contenido de GC de dicha secuencia de nucleótidos es aproximadamente 50 a aproximadamente 60%, con la condición de que

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Para la expresión en células de plantas, los fragmentos de DNA sintéticos que codifican I-SceI pueden enlazarse operativamente a un promotor expresable en plantas a fin de obtener un gen quimérico expresable en plantas.

Una persona experta en la técnica reconocerá inmediatamente que para este aspecto de la invención, no se requiere que el DNA de reparación y/o el DNA que codifica la endonucleasa DSBI se introduzcan en la célula de la planta por métodos de transferencia directa de DNA, sino que el DNA puede introducirse también en las células de las plantas por métodos de transformación mediada por Agrobacterium como están disponibles en la técnica.

En otro aspecto, un método de acuerdo con la invención para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal que comprende los pasos de

(a): inducir una rotura de las dos cadenas en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula;

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal;

se caracteriza adicionalmente porque antes del paso (a), las células de la planta se incuban en un compuesto vegetal fenólico.

"Compuestos fenólicos de origen vegetal" o "fenólicos de origen vegetal" adecuados para la invención son aquellas moléculas fenólicas sustituidas que son capaces de inducir una respuesta quimiotáctica positiva, particularmente aquéllas que son capaces de inducir expresión incrementada de genes virales en un plásmido Ti que contiene Agrobacterium sp., particularmente un plásmido Ti que contiene Agrobacterium tumefaciens. Métodos para medir la respuesta quimiotáctica a compuestos fenólicos de origen vegetal han sido descritos por Ashby et al., (1988 J. Bacteriol. 170:4181-4187) y métodos para medir la inducción de la expresión de genes virales son también muy conocidos (Stachel et al., 1985 Nature 318:624-629; Bolton et al., 1986 Science 232:983-985). Compuestos fenólicos de origen vegetal preferidos son los encontrados en exudados de lesiones de células vegetales. Uno de los compuestos fenólicos de origen vegetal mejor conocidos es la acetosiringona, que está presente en cierto número de células lesionadas e intactas de diversas plantas, si bien en diferentes concentraciones. No obstante, la acetosiringona (3,5-dimetoxi-4-hidroxiacetofenona) no es el único compuesto fenólico de origen vegetal que puede inducir la expresión de genes virales. Otros ejemplos son \alpha-hidroxi-acetosiringona, ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico), ácido siríngico (ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico), ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico), catecol (1,2-dihidroxibenceno), ácido p-hidroxibenzoico (ácido 4-hidroxibenzoico), ácido \beta-resorcílico (ácido 2,4-dihidroxibenzoico), ácido protocatéquico (ácido 3,4-dihidroxibenzoico), ácido pirogálico (ácido 2,3,4-trihidroxibenzoico), ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico) y vanillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído). Como se utilizan en esta memoria, se hace referencia a las moléculas mencionadas como compuestos fenólicos de origen vegetal. Los compuestos fenólicos de origen vegetal pueden añadirse al medio de cultivo de las plantas sea aisladamente o en combinación con otros compuestos fenólicos de origen vegetal. Aunque no se pretende limitar la invención a un modo de acción particular, se cree que el efecto estimulante aparente de estos compuestos fenólicos de origen vegetal sobre la división celular (y por tanto también sobre la replicación del genoma) pueden mejorar la inserción direccionada del DNA extraño.

Las células vegetales se incuban preferiblemente en el compuesto fenólico de origen vegetal durante aproximadamente una semana, aunque se espera que la incubación durante aproximadamente uno o dos días en o sobre un compuesto fenólico de origen vegetal será suficiente. Las células vegetales deberían incubarse durante un tiempo suficiente para estimular la división celular. De acuerdo con Guivarc'h et al., (1993), Protoplasma 174:10-18) dicho efecto puede obtenerse ya por incubación de las células vegetales durante un tiempo tan reducido como 10 minutos.

Los métodos mejorados arriba mencionados para inserción de DNA direccionada basada en la recombinación homóloga pueden aplicarse también para mejorar la calidad de las células de plantas transgénicas y plantas obtenidas por métodos directos de transferencia de DNA, particularmente por bombardeo con microproyectiles. Es bien conocido en la técnica que la introducción de DNA por bombardeo con microproyectiles conduce frecuentemente a patrones de integración complejos del DNA introducido (integración de copias múltiples del DNA extraño de interés, sea completa o parcial, regeneración de estructuras repetidas). Sin embargo, algunos genotipos o variedades de plantas pueden ser más aptos para transformación utilizando bombardeo con microproyectiles que para transformación utilizando v.g. Agrobacterium tumefaciens. Por consiguiente, sería ventajoso que la calidad de las células vegetales o plantas transgénicas obtenidas por bombardeo con microproyectiles pudieran mejorarse, es decir que pudiera influirse en el patrón de integración del DNA extraño para hacerlo más simple.

El descubrimiento arriba mencionado de que la introducción de DNA extraño por bombardeo con microproyectiles en presencia de una rotura inducida del DNA bicatenario en el genoma celular, con lo cual el DNA extraño tiene homología para las secuencias que flanquean la rotura del DNA bicatenario conduce frecuentemente (aproximadamente 50% de los sucesos obtenidos) a patrones de integración simples (inserción de una sola copia de una manera predecible y ausencia de inserción de fragmentos adicionales del DNA extraño) proporciona la base para un método de simplificación de la complejidad de inserción del DNA extraño en el genoma nuclear de las células vegetales.

Un método posible de producción de una planta transgénica por bombardeo con microproyectiles comprende los pasos de

(a): inducir una rotura de DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, de acuerdo con los métodos descritos en otro lugar de este documento o disponibles en la técnica; y

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal por bombardeo con microproyectiles en donde dicho DNA extraño de interés está flanqueado por dos regiones de DNA que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado en el genoma de la planta.

Una porción significativa de la población de plantas transgénicas así obtenida tendrá un patrón de integración simple del DNA extraño en el genoma de las células de la planta, más particularmente una porción significativa de las plantas transgénicas tendrán solamente una inserción de una copia del DNA extraño, comprendida exactamente entre las dos regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado en el genoma de la planta. Esta porción es mayor que la población de plantas transgénicas con patrones de integración simples, cuando las plantas se obtienen por bombardeo simple con microproyectiles sin inducir una rotura del DNA bicatenario, y sin proporcionar al DNA extraño homología con las regiones genómicas que flanquean el sitio preseleccionado.

En una realización conveniente de la invención, la célula de la planta diana comprende en su genoma un gen marcador, flanqueado por dos sitios de reconocimiento para una endonucleasa de escisión rara inductora de rotura del DNA bicatenario, una en cada sitio. Este DNA marcador puede introducirse en el genoma de la célula de la planta de interés utilizando cualquier método de transformación, o puede haber sido introducido en el genoma de una célula vegetal de otra línea o variedad de plantas (tal como una línea o variedad de una planta fácilmente susceptible de transformación) e introducirse en la célula de la planta de interés por técnicas clásicas de mejora genética. Preferiblemente, la población de plantas o células de plantas transgénicas que comprenden un gen marcador flanqueado por dos sitios de reconocimiento para una endonucleasa de escisión rara inductora de una rotura de las dos cadenas ha sido analizada respecto al patrón de expresión del gen marcador (tal como expresión alta, expresión regulada temporal o espacialmente) y las líneas de plantas con el patrón de expresión deseado han sido identificadas. La producción de una planta transgénica por bombardeo con microproyectiles que comprende los pasos de

(a): inducir una rotura del DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula de una planta, de acuerdo con los métodos descritos en otro lugar de este documento o disponibles en la técnica; y

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula de la planta por bombardeo con microproyectiles, en donde dicho DNA extraño de interés está flanqueado por dos regiones de DNA que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado en el genoma de la planta;

conducirá a células de plantas y plantas transgénicas en las cuales el gen marcador ha sido reemplazado por el DNA extraño de interés.

El gen marcador puede ser cualquier gen marcador seleccionable o un gen marcador expresable en plantas y susceptible de cribado, que es preferiblemente un gen marcador quimérico convencional. El gen marcador quimérico puede comprender un DNA marcador que se encuentra bajo el control de, y enlazado operativamente en su extremo 5' a un promotor, preferiblemente un promotor constitutivo expresable en plantas, tal como un promotor 35S de CaMV, o un promotor ligero inducible tal como el promotor del gen que codifica la subunidad pequeña de Rubisco; y enlazado operativamente en su extremo 3' a señales adecuadas de terminación de la transcripción y poliadenilación en plantas. El DNA marcador codifica preferiblemente un RNA, proteína o polipéptido que, cuando se expresa en las células de una planta, permite que tales células se separen fácilmente de aquellas células en las cuales no se expresa el DNA marcador. La elección del DNA marcador no es crítica, y puede seleccionarse cualquier DNA marcador adecuado de una manera bien conocida. Por ejemplo, un DNA marcador puede codificar una proteína que proporciona un color distinguible a la célula de la planta transformada, tal como el gen A1 (Meyer et al., (1987), Nature 330:677), puede codificar una proteína fluorescente [Chalfie et al., Science 263; 802-805 (1994); Crameri et al, Nature Biotechnology 14:315-319 (1996)], puede codificar una proteína que proporciona a la célula de la planta transformada resistencia a los herbicidas, tal como el gen bar, codificante de PAT, que proporciona resistencia a la fosfinotricina (EP 0242246), o puede codificar una proteína que proporciona a las células transformadas resistencia a los antibióticos, tal como el gen aac(6'), que codifica GAT que proporciona resistencia a la gentamicina (WO 94/01560). Un gen marcador seleccionable de este tipo codifica generalmente una proteína que confiere a la célula resistencia a un antibiótico u otro compuesto químico que es normalmente tóxico para las células. En las plantas, el gen marcador seleccionable puede codificar también por tanto una proteína que confiere resistencia a un herbicida, tal como un herbicida que comprende un inhibidor de la glutamina-sintetasa (v.g. fosfinotricina) como un ingrediente activo. Un ejemplo de tales genes son genes que codifican fosfinotricin-acetil-transferasa tales como los genes sfr o sfrv (EP 242236; EP 242246; De Block et al., 1987 EMBO J. 6:2513-2518).

El DNA de reparación introducido puede comprender adicionalmente un gen marcador que permite discriminar mejor entre la integración por recombinación homóloga en el sitio preseleccionado y la integración en cualquier otra parte del genoma. Genes marcadores de este tipo están disponibles en la técnica e incluyen genes marcadores con lo cual la ausencia del gen marcador puede seleccionarse positivamente en condiciones selectivas (v.g. codA, citosina-desaminasa de E. coli que confiere sensibilidad a 5-fluoro-citosina, Perera et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23, 793; Stougaard (1993) Plant J.: 755). El DNA de reparación tiene que comprender el gen marcador de una manera tal que la integración del DNA de reparación en el genoma nuclear de manera aleatoria da como resultado la presencia del gen marcador, mientras que la integración del DNA de reparación por recombinación homóloga da como resultado la ausencia del gen marcador.

Quedará inmediatamente claro que pueden obtenerse también los mismos resultados utilizando un solo sitio preseleccionado para inducir en el mismo la rotura de las dos cadenas, que está localizado en o cerca de un gen marcador. Las regiones de homología flanqueantes se seleccionan luego preferiblemente de tal manera que o bien desactivan el gen marcador, o delecionan el gen marcador y emplean en sustitución del mismo el DNA extraño a insertar.

Se apreciará que los medios y métodos de la invención son particularmente útiles para maíz, pero pueden ser utilizados también en otras plantas con efectos similares, particularmente en plantas de cereales que incluyen trigo, avena, cebada, centeno, arroz, césped de hipódromo, sorgo, mijo o caña de azúcar. Los métodos de la invención pueden aplicarse también a cualquier planta con inclusión, pero sin carácter limitante, de algodón, tabaco, canola, colza oleaginosa, soja, hortalizas, patatas, Lemna spp., Nicotiana spp ., Arabidopsis, alfalfa, cebada, habichuelas, maíz, algodón, lino, guisante, colza, arroz, centeno, cártamo, sorgo, soja, girasol, tabaco, trigo, espárragos, remolacha, brócoli, col, zanahoria, coliflor, apio, pepino, berenjena, lechuga, cebolla, colza oleaginosa, pimiento, patata, calabaza, rábano, espinaca, calabaza de cuello curvo, tomate, calabacín, almendra, manzana, albaricoque, plátano, mora, arándano común, cacao, cereza, coco, arándano agrio, dátil, uva, pomelo, guayaba, kiwi, limón, lima, mango, melón, nectarina, naranja, papaya, fruto de la pasión, melocotón, cacahuete, pera, piña, pistacho, ciruela, frambuesa, fresa, mandarina, nogal y sandía.

De acuerdo con los métodos de la invención pueden obtenerse células de plantas y plantas que comprenden moléculas de DNA extraño insertadas en sitios preseleccionados. También pueden obtenerse gametos, semillas, embriones, sean cigóticos o somáticos, progenie o híbridos de plantas que comprenden los sucesos de inserción de DNA direccionados, que se producen por métodos de mejora genética tradicionales.

Las plantas obtenidas por los métodos descritos en esta memoria pueden cruzarse adicionalmente por técnicas tradicionales de mejora genética con otras plantas para obtener plantas de progenie que comprenden los sucesos de inserción de DNA direccionados obtenidos de acuerdo con la presente invención.

Los ejemplos no limitantes siguientes describen el diseño de un gen quimérico modificado codificante de I-SceI, y el uso del mismo para insertar DNA extraño en un sitio preseleccionado del genoma de la planta.

A no ser que se indique otra cosa en los ejemplos, todas las técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiales y métodos estándar para trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Otras referencias para técnicas estándar de biología molecular incluyen Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (UK). Materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de polimerasa pueden encontrarse en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson et al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer Verlag, Alemania.

A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las secuencias siguientes:

SEQ ID No 1: secuencia de aminoácidos de una I-SceI quimérica que comprende una señal de localización nuclear enlazada a una proteína I-SceI que carece de los 4 aminoácidos amino-terminales.

SEQ ID No 2: secuencia de nucleótidos de la región codificante de I-SceI (código UIPAC).

SEQ ID No 3: secuencia de nucleótidos de la región codificante sintética de I-SceI (código UIPAC).

SEQ ID No 4: secuencia de nucleótidos de la región codificante sintética de I-SceI.

SEQ ID No 5: secuencia de nucleótidos del T-DNA de pTTAM78 (locus diana).

SEQ ID No 6: secuencia de nucleótidos del T-DNA de pTTA82 (DNA de reparación).

SEQ ID No 7: secuencia de nucleótidos de pCV78.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

Ejemplos Ejemplo 1 Diseño, síntesis y análisis de un gen quimérico expresable en plantas que codifica I-SceI

La región codificante de I-SceI en la cual se han reemplazado los 4 aminoácidos aminoterminales por una señal de localización nuclear se optimizó utilizando el proceso siguiente:

1.: Cambiar los codones al uso de codones más preferido para maíz sin alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína I-SceI, utilizando el equipo Synergy Geneoptimicer^{TM};

2.: Ajustar la secuencia para crear o eliminar sitios de restricción específicos para cambiar la región codificante sintética de I-SceI con el gen del código universal I-SceI;

3.: Eliminar todos los tramos GC más largos que 6 pb y los tramos AT más largos que 4 pb para evitar la formación de estructuras de RNA secundarias que pueden efectuar el corte y empalme de pre-mRNA;

4.: Evitar dobletes CG y TA en las posiciones de los codones 2 y 3;

5.: Evitar otros elementos reguladores tales como posibles señales prematuras de poliadenilación (GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATA TAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, sitios crípticos de corte y empalme de intrones (AAGGTAAGT y TGCAGG), pentámeros ATT TA y secuencias de recuadro CCAAT (CCAAT, ATTGG, CGAAT y ATTGC);

6.: Comprobar de nuevo si la región codificante adaptada cumple la totalidad de los criterios arriba mencionados.

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Un ejemplo posible de una secuencia de nucleótidos de este tipo se representa en SEQ ID No 4. Un fragmento sintético de DNA que tenía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 se sintetizó y se enlazó operativamente a un promotor CaMV35S y una señal de terminación y poliadenilación 3' de CaMV35S (produciendo el plásmido pCV78; SEQ ID No 7).

La región codificante sintética de I-SceI se clonó también en un vector de expresión bacteriano (como una proteína de fusión que permitía el enriquecimiento de proteína en cuentas de amilosa). Se comprobó la capacidad de la proteína I-SceI semi-purificada para escindir in vitro un plásmido que contuviera un sitio de reconocimiento por I-SceI.

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Ejemplo 2 Aislamiento de líneas de células de maíz que contienen un gen bar sin promotor precedido por un sitio I-SceI

Con objeto de desarrollar un ensayo para la recombinación mediada por homología inducida por la rotura de DNA bicatenario, se aislaron suspensiones de células de maíz que contenían un gen bar sin promotor precedido por un sitio de reconocimiento I-SceI integrado en el genoma nuclear en una sola copia. Después de la inducción de la rotura del DNA bicatenario por suministro de un gen quimérico expresable en plantas que codificaba la endonucleasa I-SceI, y suministro simultáneo de DNA de reparación que comprendía un promotor 35S de CaMV enlazado operativamente al extremo 5' del gen bar, puede insertarse el promotor 35S por inserción del DNA direccionada mediada por homología, dando como resultado un gen bar funcional que confiere resistencia a la fosfinotricina (PPT). El ensayo se representa esquemáticamente en la Figura 1.

Se construyó el locus diana enlazando operativamente por técnicas convencionales de clonación las regiones de DNA siguientes:

a): una señal de terminación y poliadenilación en el extremo 3' del gen de nopalina-sintetasa

b): una región de DNA codificante de bar sin promotor

c): una región de DNA que comprendía un sitio de reconocimiento de I-SceI

d): una señal de terminación y poliadenilación en el extremo 3' del gen 7 de A. tumefaciens (3'g7)

e): un gen de resistencia a la neomicina expresable en plantas que comprende un promotor de nopalina-sintetasa, un gen de neomicina-fosfotransferasa, y una señal 3' ocs.

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Esta región de DNA se insertó en un vector T-DNA entre los límites del T-DNA. El vector T-DNA se designó pTTAM78 (para la secuencia de nucleótidos del T-DNA véase SEQ ID No 5).

El vector T-DNA se utilizó directamente para transformar protoplastos de maíz de acuerdo con los métodos descritos en EP 0469273, utilizando una suspensión de células de maíz derivada de He89. El vector T-DNA se introdujo también en Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif(pEHA101) y la cepa de Agrobacterium resultante se utilizó para transformar una línea de células derivada de He89. Se identificaron varias líneas diana que contenían una sola copia del constructo del locus diana pTTAM78, tales como T24 (obtenido por transformación de protoplastos) y las líneas 14-1 y 1-20 (obtenidas por transformación mediada por Agrobacterium).

Se establecieron suspensiones de células a partir de estas líneas diana en un medio de suspensión de células N6M, y se cultivaron en presencia de luz en un aparato de sacudidas (120 rpm) a 25ºC. Las suspensiones se subcultivaron cada semana.

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Ejemplo 3 Inserción direccionada basada en homología

El DNA de reparación pTTA82 es un vector T-DNA que contiene entre los límites del T-DNA las regiones de DNA siguientes enlazadas operativamente:

a): una región de DNA que codifica solamente la parte aminoterminal del gen bar

b): una región de DNA que comprende un sitio de reconocimiento parcial por I-SceI (13 nucleótidos localizados en el extremo 5' del sitio de reconocimiento)

c): una región promotora 35S de CAMV

d): una región de DNA que comprende un sitio de reconocimiento parcial por I-SceI (9 nucleótidos localizados en el extremo 3' del sitio de reconocimiento)

e): una señal de terminación y poliadenilación en el extremo 3' del gen 7 de A. tumefaciens (3'g7)

f): un gen quimérico de resistencia a la neomicina expresable en plantas

g): un gen que codifica una endonucleasa deficiente en I-SceI, bajo control de un promotor 35S de CAMV

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La secuencia de nucleótidos del T-DNA pTTA82 se representa en SEQ ID No 6.

Este DNA de reparación se suministró juntamente con pCV78 (véase el Ejemplo 1) por bombardeo con partículas en células derivadas de suspensión que se extendieron en placas sobre papel de filtro como una capa delgada. El papel de filtro se extendió sobre sustrato Mahq1 VII.

El DNA se bombardeó en las células utilizando un dispositivo PDS-1000/He Biolistics. La preparación de los microvehículos y el recubrimiento del DNA sobre los microvehículos se realizaron esencialmente como ha sido descrito por Sanford et al. 1992. Los parámetros de bombardeo de partículas eran: distancia a la diana 9 cm; presión de bombardeo de 1350 psi (94,8 kg/cm^{2}), distancia de laguna de ¼'' (6,35 mm) y distancia de vuelo del macrovehículo de 11 cm. Inmediatamente después del bombardeo, el tejido se transfirió al sustrato no selectivo Mhi1VII. Como control para el suministro satisfactorio del DNA por bombardeo con partículas, las tres líneas diana se bombardearon también con microvehículos recubiertos con DNA plasmídico que comprendía un gen bar quimérico bajo el control de un promotor CaMV35S (pRVA52).

Cuatro días después del bombardeo, se transfirieron los filtros a un sustrato Mh1 VII complementado con 25 mg/l de PPT o sobre sustrato Ahx1.5VIIino1000 complementado con 50 mg/l de PPT.

Catorce días después, se transfirieron los filtros sobre medio Mh1 VII nuevo con 10 mg/l de PPT para las líneas diana T24 y 14-1, y sustrato Mh1 VII con 25 mg/l de PPT para la línea diana 1-20.

Dos semanas después, se registraron los sucesos potenciales de inserción direccionada basándose en su resistencia a PPT. Estos sucesos resistentes a PPT eran también positivos en el test Liberty Link de Hojas/Semillas de Maíz (Strategic Diagnostics Inc.).

\newpage

Número de callos resistentes a PPT 38 días después del bombardeo:

17

Los sucesos resistentes a PPT se subcultivaron ulteriormente en sustrato Mh1 VII que contenía 10 mg/l de PTT y se utilizó material de callo para el análisis molecular. Se analizaron 20 candidatos independientes TSI por análisis Southern utilizando el promotor 35S y la señal de terminación y poliadenilación en el extremo 3' del gen de nopalina-sintasa como sonda. Basándose en el tamaño del fragmento esperado, todos los sucesos parecían ser sucesos de inserción de secuencia direccionada perfectos. Además, el análisis ulterior de aproximadamente la mitad de los sucesos de inserción de secuencia direccionados no mostraba integración adicional no direccionada del DNA de reparación o el DNA codificante de I-SceI.

El análisis de las secuencias de DNA amplificadas de ocho de los sucesos de inserción direccionados demostró que estos sucesos eran de hecho sucesos TSI perfectos basados en recombinación homóloga.

Basándose en estos datos, la relación de inserción de DNA basada en recombinación homóloga frente a la recombinación "normal" ilegítima varía desde aproximadamente 30% para 1-20 a aproximadamente 17% para 14-1 y hasta aproximadamente 1% para 24.

Cuando se utilizan vectores similares a los descritos en Puchta et al. 1996 (supra) suministrados por electroporación a protoplastos de tabaco en presencia de roturas de DNA bicatenario inducidas por I-SceI, la relación de inserción de DNA basada en recombinación homóloga frente a inserción normal era aproximadamente 15%. Sin embargo, solamente uno de 33 sucesos caracterizados era un suceso de inserción de secuencia direccionado mediado por homología, con lo cual la recombinación homóloga era perfecta a ambos lados de la rotura bicatenaria.

Utilizando los vectores del Ejemplo 2, pero con un "constructo del código universal I-SceI" que comprendía una señal de localización nuclear, la relación de inserción de DNA basada en HR frente a inserción normal variaba entre 0,032% y 16% para líneas diana diferentes, utilizando tanto electroporación como suministro de DNA mediado por Agrobacterium. La frecuencia relativa de sucesos de inserción direccionada perfectos difería entre las diferentes líneas diana, y variaba desde 8 a 70% para el suministro del DNA mediado por electroporación y entre 73 y 90% para suministro de DNA mediado por Agrobacterium.

Ejemplo 4 La pre-incubación con acetosiringona mejora la frecuencia de recuperación de los sucesos de inserción direccionados

Una semana antes del bombardeo que se describe en el Ejemplo 3, se diluyeron suspensiones de células en medio N6M o en medio LSIDhy1.5 complementado con acetosiringona 200 mM. En caso contrario se utilizó el método que se describe en el Ejemplo 3. Como puede verse por los resultados resumidos en la tabla siguiente, la preincubación de las células a transformar con acetosiringona tenía efecto beneficioso sobre la recuperación de sucesos de inserción resistentes a PPT direccionados.

18

Ejemplo 5 Inserción de la secuencia direccionada mediada por DSB en maíz por suministro del DNA de reparación mediado por Agrobacterium

Para realizar la inserción de secuencias direccionadas mediada por DSB en el maíz, en las cuales el DNA de reparación es suministrado por transformación mediada por Agrobacterium, se construyeron vectores T-DNA similares a pTTA82 (véase Ejemplo 3), en los cuales el gen defectuoso I-SceI se reemplazó por el gen sintético codificante de I-SceI del Ejemplo 1. El vector T-DNA contenía adicionalmente una copia de Agrobacterium tumefaciens virG y virC (pTCV83) o virG, virC y virB (pTCV87) fuera de los límites del T-DNA. Estos vectores T-DNA se insertaron en LBA4404, que contenía el plásmido Ti adyuvante pAL4404, produciendo las cepas de Agrobacterium A4995 y A4996, respectivamente.

Cultivos en suspensión de las líneas de células diana del Ejemplo 2, así como otras líneas de células diana obtenidas de manera similar a la descrita en el Ejemplo 2, se cultivaron conjuntamente con las cepas de Agrobacterium, y se extendieron después de ello en varias placas. El número de extensiones en placa se determinó por la densidad de la suspensión de células. Como control para la eficiencia de transformación, se cultivaron conjuntamente las suspensiones de células en un experimento paralelo con una cepa de Agrobacterium LBA4404 que contenía el plásmido Ti adyuvante pAL4404 y un vector T-DNA con un gen quimérico de resistencia a la fosfinotricina (gen bar) bajo control de un vector 35S de CaMV. El vector T-DNA contenía adicionalmente una copia de los genes de Agrobacterium tumefaciens virG, virC y virD, fuera del límite de T-DNA. Los resultados de cuatro experimentos independientes diferentes se resumen en las tablas siguientes:

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Experimento I con Agrobacterium

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19

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Experimento II con Agrobacterium

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20

Experimento III con Agrobacterium

21

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Experimento IV con Agrobacterium

22

Por consiguiente, está claro que, si bien el suministro de DNA de reparación mediado por Agrobacterium es claramente factible, la frecuencia de sucesos de Inserción de Secuencia Direccionada (TSI) es inferior en comparación con el suministro de DNA de reparación mediado por bombardeo con partículas. Los análisis Southern realizados sobre 23 sucesos TSI supuestos demostraron que 20 sucesos TSI son perfectos, basándose en el tamaño del fragmento. Sin embargo, en contraste con sucesos obtenidos por bombardeo con microproyectiles de acuerdo con el Ejemplo 3, únicamente 6 sucesos de 20 no contenían inserciones adicionales del DNA de reparación, 9 sucesos contenían 1 a 3 inserciones adicionales del DNA de reparación, y 5 sucesos contenían muchas inserciones adicionales del DNA de reparación.

El suministro mediado por bombardeo con partículas de DNA de reparación da también como resultado una mejor calidad de los sucesos TSI mediados por DSB comparado con el suministro del DNA de reparación por Agrobacterium. Esto está en contraste con el suministro mediado por bombardeo con partículas de "DNA transformante normal" que se caracteriza por la menor calidad de los transformantes (patrón de integración complejo) en comparación con la transformación mediada por Agrobacterium.

Esto indica que la calidad de los transformantes obtenidos por bombardeo con partículas u otros métodos de suministro directo de DNA puede mejorarse por inserción de secuencias mediada por DSB. Este resultado se confirma también por el experimento siguiente: después de la inserción de secuencia direccionada de un promotor 35S mediada por DSB, en ausencia de secuencias flanqueantes con homología para el locus diana en el DNA de reparación, se observó que después del suministro de DNA de reparación mediado por electroporación, solamente una minoría de los sucesos TSI contenían inserciones adicionales no direccionadas de promotor 35S (2 sucesos TSI de un total de 16 sucesos TSI analizados muestran una o más inserciones adicionales aleatorias del promotor 35S). En contraste, la inserción aleatoria del promotor 35S era considerablemente mayor en los sucesos TSI obtenidos por suministro mediado del promotor 35S por Agrobacterium (17 de 22 sucesos TSI analizados mostraban una o más inserciones adicionales aleatorias del promotor 35S).

Ejemplo 6 Composición de los medios

Mahq1VII: Medio N6 (Chu et al. 1975) complementado con 100 mg/l de hidrolizado de caseína, L-prolina 6 mM, 0,5 g/l de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), manitol 0,2 M, sorbitol 0,2 M, 2% de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D), ajustado a pH 5,8, solidificado con 2,5 g/l de Gelrite®.

Mhi1VII: Medio N6 (Chu et al. 1975) complementado con 0,5 g/l de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), manitol 0,2 M, 2% de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D), ajustado a pH 5,8 y solidificado con 2,5 g/l de Gelrite®.

Mh1VII: Igual que el sustrato Mhi1VII pero sin manitol 0,2 M.

Ahx1.5VIIino1000: Sales MS, complementadas con 1000 mg/l de mio-inositol, 0,1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 0,5 g/l de MES, 30 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 1,5 mg/l de 2,4-D, ajustado a pH 5,8 y solidificado con 2,5 g/l de Gelrite®.

LSIDhy1.5: Sales MS complementadas con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/l de mio-inositol, L-prolina 6 mM, 0,5 g/l de MES, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 1,5 mg/l de 2,4-D, ajustado a pH 5,2.

N6M: Macro-elementos: 2830 mg/l de KNO_{3}; 433 mg/L (NH_{4})_{2}SO_{4}; 166 mg/l CaCl_{2}.2H_{2}O; 250 mg/l
MgSO_{4}.7H_{2}O; 400 mg/l KH_{2}PO_{4}; 37,3 mg/l Na_{2}EDTA; 27,3 mg/l FeSO_{4}.7H_{2}O, micro-elementos MS, 500 mg/l de Bactotriptona, 0,5 g/l de MES, 1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 0,05 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 2 mg/l de glicina, 100 mg/l de mio-inositol, 3% de sacarosa, 0,5 mg/l de 2,4-D, ajustado a pH 5,8.

<110> Bayer BioScience N.V.

\hskip1cm D'Halluin, Kathleen

\hskip1cm Vanderstraeten, Chantal

\hskip1cm Ruiter, Rene

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Inserción direccionada mejorada en plantas

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> BCS 03-2007 WO1

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 03078700.6

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-11-18

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 7

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 244

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<212> PRT

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<213> Saccharomyces cerevisiae

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<400> 1

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23

24

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<210> 2

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<211> 732

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintética de DNA codificante de I-SceI (código UIPAC)

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<220>

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<221> característica diversa

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<222> (6)..(6)

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<223> N=A,G,C o T

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<220>

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<221> variación

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<222> (25)..(27)

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<223> AGR

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<220>

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<221> variación

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<222> (61)..(63)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (73)..(75)

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<223> AGY

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<220>

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<221> variación

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<222> (79)..(81)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (82)..(84)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (97)..(99)

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<223> AGY

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<220>

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<221> variación

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<222> (103)..(105)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (112)..(114)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (145)..(147)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (151)..(153)

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<223> TTR

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<220>

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<221> variación

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<222> (169)..(171)

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<223> AGR

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<220>

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<221> variación

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<222> (172)..(174)

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<223> AGY

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

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<222> (175)..(177)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGR

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<220>

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<221> variación

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<222> (244)..(246)

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<223> TTR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> variación

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<222> (247)..(249)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> variación

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<222> (265)..(267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (268)..(270)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (289)..(291)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (301)..(303)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

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<222> (310)..(312)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (361)..(363)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (370)..(372)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (409)..(411)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (424)..(426)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (436)..(438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (439)..(441)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (490)..(492)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (502)..(504)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (511)..(513)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (523)..(525)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (550)..(552)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (562)..(564)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (565)..(567)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (580)..(582)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (631)..(633)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (637)..(639)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (643)..(645)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (658)..(660)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (673)..(675)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (697)..(699)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (712)..(714)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (715)..(717)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGY

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (727)..(729)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> TTR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (54)..(54)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (63)..(63)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (66)..(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (69)..(69)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (75)..(75)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (81)..(81)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)..(84)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (99)..(99)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (105)..(105)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (114)..(114)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (135)..(135)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (138)..(138)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (144)..(144)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (147)..(147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (153)..(153)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (156)..(156)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (162)..(162)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (171)..(171)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (174)..(174)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (177)..(177)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (186)..(186)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (192)..(192)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (225)..(225)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (240)..(240)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (246)..(246)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (249)..(249)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (264)..(264)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (267)..(267)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (270)..(270)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (273)..(273)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (276)..(276)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (291)..(291)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (294)..(294)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (303)..(303)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (306)..(306)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (312)..(312)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (315)..(315)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (321)..(321)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (327)..(327)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (330)..(330)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (336)..(336)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (351)..(351)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (363)..(363)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (366)..(366)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (372)..(372)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (381)..(381)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (396)..(396)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (402)..(402)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (411)..(411)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (414)..(414)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (426)..(426)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (429)..(429)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (432)..(432)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (438)..(438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (441)..(441)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (444)..(444)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (465)..(465)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (468)..(468)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (492)..(492)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (495)..(495)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (504)..(504)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (510)..(510)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (513)..(513)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (519)..(519)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (525)..(525)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (531)..(531)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (543)..(543)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (552)..(552)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (552)..(552)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (555)..(555)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (561)..(561)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (564)..(564)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (567)..(567)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (582)..(582)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (594)..(594)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (615)..(615)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (633)..(633)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (639)..(639)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (645)..(645)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (660)..(660)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (669)..(669)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (675)..(675)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (681)..(681)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (699)..(699)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (702)..(702)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (708)..(708)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (714)..(714)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (717)..(717)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (723)..(723)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (729)..(729)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N = A, G, C o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 732

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia sintética preferida de DNA codificante de I-SceI (código UIPAC)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (73)..(75)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (97)..(99)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (169)..(171)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (172)..(174)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (175)..(177)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (268)..(270)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (289)..(291)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (436)..(438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (490)..(492)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (502)..(504)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (523)..(525)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (565)..(567)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (631)..(633)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (637)..(639)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (712)..(714)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (715)..(717)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> AGC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 732

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-DNA de pTTAM78 (locus diana)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del borde derecho del T-DNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(72)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (73)..(333)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' nos (complemento)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (334)..(351)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (352)..(903)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia bar (complemento)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (904)..(928)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (929)..(946)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sitio de reconocimiento de I-SceI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (947)..(967)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (968)..(1171)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3'g7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1172)..(1290)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1291)..(1577)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen promotor de nopalina-sintetasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1578)..(1590)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1591)..(2394)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nptII

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2395)..(2567)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' neo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2568)..(3183)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' ocs

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3184)..(3234)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3235)..(3262)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del borde izquierdo del T-DNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> T-DNA de pTTA82 (DNA de reparación)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del borde derecho del T-DNA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)..(62)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (63)..(578)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> bar 3' delecionado (complemento)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (579)..(603)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (604)..(616)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio I-SceI parcial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (617)..(1429)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P35S3 (complemento)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1430)..(1438)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio I-SceI parcial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1460)..(1663)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gen 3' 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1664)..(1782)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1783)..(2069)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> promotor del gen de nopalina-sintetasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2070)..(2082)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2083)..(2886)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> nptII

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2887)..(3059)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' neo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3060)..(3675)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' ocs

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3676)..(3731)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3732)..(4246)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P35S2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4247)..(4289)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ats1BL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4290)..(4322)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NLS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4323)..(5023)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-SceI defectuosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5024)..(5260)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' 35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5261)..(5317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de polienlazador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5318)..(5345)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del borde izquierdo del T-DNA

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4066

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pCV78

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (234)..(763)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> promotor P35S2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (764)..(805)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ats1b'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (808)..(839)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Señal de localización nuclear

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (840)..(1541)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> I-SceI sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1544)..(1792)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 3' 35S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3006)..(3886)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Resistencia a ampicilina (complemento)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

Claims

1. Un fragmento de DNA aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una endonucleasa I-SceI en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 4 o cualquier secuencia de nucleótidos obtenida por reemplazamiento de 1 a 20 nucleótidos de SEQ ID No. 4 por cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 3, de tal manera que el contenido de GC de dicha secuencia de nucleótidos es aproximadamente 50 a aproximadamente 60%, con la condición
de que

\newpage

2. Una secuencia de DNA aislada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 únicamente en una posición.

3. Una secuencia de DNA aislada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 únicamente en 10 posiciones.

4. Una secuencia de DNA aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4.

5. Un gen quimérico que comprende el fragmento de DNA aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 enlazado operativamente a un promotor expresable en plantas.

6. Uso de un gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 5 para insertar un DNA extraño en un sitio de reconocimiento de I-SceI en el genoma de una planta.

7. Un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal que comprende los pasos de

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal;

\quad: caracterizado porque la rotura del DNA bicatenario es introducida por una endonucleasa I-SceI codificada por un fragmento de DNA aislado de acuerdo con la reivindicación 1.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4.

9. El método de la reivindicación 7, en donde la secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 únicamente en una posición.

10. El método de la reivindicación 7, en donde la secuencia de nucleótidos difiere de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 únicamente en 10 posiciones.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicha endonucleasa I-SceI comprende una señal de localización nuclear.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el DNA extraño de interés se introduce en dicha célula vegetal por transferencia directa de DNA.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde dicha transferencia directa de DNA se realiza por bombardeo de microproyectiles recubiertos con el DNA extraño de interés.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en donde dicho DNA extraño de interés está flanqueado por una región de DNA que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una región de DNA que flanquea el sitio preseleccionado.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la célula vegetal es una célula de maíz.

16. El método de la reivindicación 15, en donde la célula de maíz está contenida en una suspensión de células.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual dicha célula vegetal se incuba en un compuesto fenólico de origen vegetal antes del paso (a).

18. El método de la reivindicación 17, en donde dicho compuesto fenólico de origen vegetal es acetosiringona.