ES2245487T3 - Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas. - Google Patents

Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas.

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Abstract

Un método para dirigir la inserción de una secuencia nucleotídica de interés a un sitio cromosómico específico dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende: (a) introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende la secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.

Description

Composiciones y métodos para la modificación genética de plantas.
Campo de la invención
La invención se refiere a la modificación genética de plantas. Particularmente, se proporciona el control de la integración y la expresión génica en plantas.
Antecedentes de la invención
Las técnicas de modificación genéticas permiten insertar secuencias nucleotídicas exógenas en el genoma de un organismo. Se ha descrito un número de métodos para la modificación genética de plantas. Todos estos métodos se basan en introducir un DNA extraño en la célula de planta, el aislamiento de aquellas células que contienen el DNA extraño integrado en el genoma, seguido por la regeneración subsiguiente de una planta entera. Desgraciadamente, tales métodos producen células transformadas que contienen el DNA extraño introducido insertado aleatoriamente en todo el genoma y a menudo en múltiples copias.
La inserción aleatoria de DNA introducido en el genoma de células huésped puede ser letal si acaso el DNA extraño se inserta en, y así muta, un gen natural críticamente importante. Además, aun cuando un caso de inserción aleatoria no deteriore el funcionamiento de un gen de la célula huésped, la expresión de un gen extraño insertado puede estar influenciada por "efectos de posición" provocados por el DNA genómico circundante. En algunos casos, el gen se inserta en sitios en los que los efectos de posición son suficientemente fuertes para evitar la síntesis de una cantidad eficaz de producto a partir del gen introducido. En otros casos, la sobreproducción del producto génico tiene efectos perjudiciales sobre la célula.
La expresión transgénica está típicamente gobernada por las secuencias, incluyendo promotores y potenciadores, que está físicamente conectadas al transgén. Actualmente, no es posible modificar precisamente la estructura de los transgenes una vez que han sido introducidos en células de planta. En muchas aplicaciones de tecnología transgénica, sería deseable introducir el transgén en una forma y a continuación poder modificar el transgén de una manera definida. Por estos medios, los transgenes podrían activarse o inactivarse cuando las secuencias que controlan la expresión transgénica pudieran alterarse retirando secuencias presentes en el transgén original o insertando secuencias adicionales en el transgén.
Para eucariotas superiores, la recombinación homóloga es un caso esencial que participa en procesos como la reparación de DNA y el intercambio de cromátidas durante la mitosis y la meiosis. La recombinación depende de dos secuencias extendidas altamente homólogas y varias proteínas auxiliares. La separación de hebras puede producirse en cualquier punto entre las regiones de homología, aunque las secuencias particulares pueden influir en la eficacia. Estos procesos pueden explotarse para una integración orientada de transgenes en el genoma de ciertos tipos de células.
Incluso con los avances en la modificación genética de plantas superiores, los principales problemas asociados con las técnicas de transformación génica convencionales han permanecido esencialmente sin resolver en cuanto a los problemas analizados previamente relativos a niveles de expresión variables debidos a efectos de posición cromosómicos y variación del número de copias de genes transferidos. Por estas razones, se necesitan métodos eficaces para la orientación y el control de la inserción de secuencias nucleotídicas que han de integrarse en un genoma de planta.
Sumario de la invención
Se proporcionan composiciones y métodos para la integración orientada de secuencias nucleotídicas en una planta transformada. Los métodos emplean casetes de transferencia que están flanqueados por sitios de recombinación no idénticos.
Los métodos encuentran uso para orientar la integración de secuencias nucleotídicas de interés en un sitio cromosómico específico, encontrar sitios de integración óptimos en un genoma de planta, comparar la actividad promotora en plantas transformadas, manejar transposiciones cromosómicas y otra manipulación genética de plantas.
También se proporcionan plantas trasnsgénicas y células de planta que contienen sitios de recombinación no idénticos correspondientes.
De acuerdo con esto, la invención proporciona un método para orientar la inserción de una secuencia nucleotídica de interés en un sitio cromosómico específico dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende (a) introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende la secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación de los sitios de recombinación no idénticos.
La invención también proporciona un método para situar sitios de integración preferidos dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende introducir en dicha célula de planta un sitio diana que comprende una secuencia nucleotídica flanqueada por sitios de recombinación no idénticos; (a) determinar el nivel de expresión de dicha secuencia nucleotídica; y (b) seleccionar una célula de planta que expresa dicha secuencia nucleotídica.
La invención también proporciona un método para determinar la actividad promotora en una célula de planta, que comprende (a) introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica un gen marcador; estando flanqueado dicho casete de transferencia por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y establece la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
La invención también proporciona un método para minimizar o eliminar la expresión resultante de la integración aleatoria de secuencias de DNA en el genoma de una célula de planta, que comprende (a) introducir en el genoma de la célula de planta una secuencia nucleotídica que comprende un sitio diana que comprende dos sitios de recombinación no idénticos, en donde sitio diana está situado aguas abajo de un promotor fusionado a una secuencia de iniciación traduccional ATG; (b) introducir un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes, en donde la secuencia de iniciación traduccional ATG de dicha secuencia nucleotídica de interés está reemplazado por uno de los sitios de recombinación no idénticos correspondientes del sitio diana, y de una manera tal que después de la orientación satisfactoria la secuencia nucleotídica de interés se sitúa en el marco de lectura correcto para formar una fusión traduccional entre la secuencia de iniciación traduccional ATG y la secuencia nucleotídica de interés; y (c) proporcionar una recombinasa que reconoce y establece la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
La invención también proporciona un método para seleccionar directamente células de planta transformadas, que comprende (a) introducir en los genomas de células de planta un casete de transferencia, comprendiendo dichos genomas de células de planta un sitio diana que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que comprende un primer sitio de recombinación no idéntico, una secuencia nucleotídica de interés y un segundo sitio de recombinación no idéntico, y comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica que codifica un gen marcador seleccionable no conectado operablemente a un promotor, en donde dicho casete de transferencia está flanqueado por dichos sitios de recombinación no idénticos primero y segundo; y (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos, y hacer crecer dichas células de planta sobre un agente selectivo apropiado para recuperar células que expresan el marcador seleccionable.
La invención también proporciona un método para reducir la complejidad de la integración de transgenes en un genoma de célula de planta, que comprende (a) introducir en la célula de planta un casete de transferencia flanqueado por sitios de recombinación no idénticos, comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica de interés, comprendiendo dicho genoma de células de planta un sitio diana que comprende sitios de recombinación no idénticos correspondientes; (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos; y (c) seleccionar células de planta con patrones de integración simples en su genoma.
La invención también proporciona un método para combinar múltiples casetes de transferencia en una localización en un genoma de una planta, que comprende (a) introducir en el genoma de la célula de planta un primer casete de transferencia que comprende al menos tres sitios de recombinación no idénticos, en donde al menos dos de dichos sitios de recombinación no idénticos, que se denominan aquí los sitios de reorientación primero y segundo, están en estrecha proximidad entre sí; (b) introducir en el genoma de la célula de planta un segundo casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los primeros sitios de reorientación de dicho primer casete de transferencia; y (c) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en el primer sitio de reorientación.
La invención también proporciona un método para combinar múltiples casetes de transferencia en una posición en un genoma de una célula de planta, comprendiendo dicho método (a) introducir en la célula de planta un sitio diana que comprende al menos un primer y un segundo sitio de recombinación no idéntico; (b) introducir en la célula de planta un primer casete de transferencia que comprende en el siguiente orden al menos el primero, un tercero y el segundo sitio de recombinación no idéntico, en donde los sitios de recombinación no idénticos primero y tercero del primer casete de transferencia flanquean una primera secuencia nucleotídica de interés; (c) proporcionar una primera recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos primero y segundo; (d) introducir en la célula de planta un segundo casete de transferencia que comprende al menos los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero, en donde los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero del segundo casete de transferencia flanquean una segunda secuencia nucleotídica de interés; y (e) proporcionar una segunda recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero.
La invención también proporciona un método para retirar una secuencia nucleotídica de interés introducida en el genoma de una célula de planta, que comprende (a) proporcionar dicha célula de planta, en la que dicha secuencia nucleotídica de interés está flanqueada por sitios de recombinación no idénticos; (b) introducir en la célula de planta una molécula oligonucleotídica de RNA-DNA quimérica capaz de reconocer y establecer una conversión de nucleótidos en uno de los sitios de recombinación no idénticos del casete de transferencia a fin de crear dos sitios de recombinación idénticos; y (c) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la escisión de las secuencias entre los dos sitios de recombinación idénticos.
La invención también proporciona una célula de planta dicotiledónea o monocotiledónea que tiene establemente incorporados en su genoma: (a) un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por o que comprende al menos dos sitios de recombinación FRT no idénticos; o (b) al menos un primer y un segundo casete de transferencia, en donde: (i) dicho primer casete de transferencia comprende una primera secuencia nucleotídica de interés flanqueada por un primer y un segundo sitio de recombinación, en donde dichos sitios de recombinación primero y segundo no son idénticos; (ii) dicho segundo casete de transferencia comprende una segunda secuencia nucleotídica de interés flanqueada por el segundo sitio de recombinación y un tercer sitio de recombinación, en donde dicho tercer sitio de recombinación no es idéntico a dicho sitio de recombinación primero y segundo; y (iii) dicho segundo sitio de recombinación está compartido entre el primer y el segundo casete de transferencia, de modo que el genoma de la célula de planta comprende en el siguiente orden el primer sitio de recombinación, la primera secuencia nucleotídica de interés, el segundo sitio de recombinación, la segunda secuencia nucleotídica de interés y el tercer sitio de recombinación.
La invención también proporciona una célula de planta monocotiledónea que tiene establemente incorporado en su genoma un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por o que comprende al menos dos sitios de recombinación FRT no idénticos o dos sitios de recombinación LOX no idénticos, en donde dicha célula de planta es de una monocotiledónea.
La invención también proporciona una planta transformada que comprende una célula de planta de la invención.
La invención también proporciona una semilla transformada de tal planta.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona un esquema para el apilamiento génico a través de la integración específica para el sitio usando el sistema de FLP.
La Figura 2 proporciona un constructo del plásmido representativo PHP10616.
Descripción detallada de la invención
Se proporcionan composiciones y métodos para la integración orientada direccional de nucleótidos exógenos en una planta transformada. Los métodos usan nuevos sitios de recombinación en un sistema de orientación génica que facilita la orientación direccional de genes y secuencias nucleotídicas deseados en sitios de recombinación correspondientes previamente introducidos en el genoma de la planta diana.
En los métodos de la invención, una secuencia nucleotídica flanqueada por dos sitios de recombinación no idénticos se introduce en el genoma del organismo diana estableciendo un sitio diana para la inserción de secuencias nucleotídicas de interés. Una vez que se establece una planta estable o un tejido cultivado, un segundo constructo, o secuencia nucleotídica de interés, flanqueado por sitios de recombinación correspondientes a los que flanquean el sitio diana, se introduce en la planta o los tejidos transformados establemente en presencia de una proteína recombinante. Este procedimiento da como resultado el intercambio de las secuencias nucleotídicas entre los sitios de recombinación no idénticos del sitio diana y el casete de transferencia.
Se sabe que la planta transformada puede comprender múltiples sitios diana; es decir, grupos de sitios de recombinación no idénticos. De esta manera, están disponibles múltiples manipulaciones del sitio diana en la planta transformada. Por sitio diana en la planta transformada se entiende una secuencia de DNA que se ha insertado en el genoma de la planta transformada y comprende sitios de recombinación no idénticos.
Ejemplos de sitios de recombinación para usar en la invención se conocen en la técnica e incluyen sitios FRT (Véanse, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang y otros (1991) Nucleic Acids Research 19:443-448; Paul D. Sadowski (1995) en Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology vol. 51, pp. 53-91; Michael M. Cox (1989) en Mobile DNA, Berg y Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D. C., pp.116-670; Dixon y otros (1995) 18:449-458; Umlauf y Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1845-1852; Buchholz y otros (1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119; Kilby y otros (1993) Trends Genet. 9:413-421: Rossant y Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594; Albert y otros (1995) The Plant J. 7:649-659; Bayley y otros (1992) Plant Mol. Biol. 18:353-361; Odell y otros (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369-378 y Dale y Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10558-105620; todas las cuales se incorporan aquí mediante referencia); Lox (Albert y otros (1995) Plant J. 7:649-659; Qui y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1706-1710; Stuurman y otros (1996) Plant Mol. Biol. 32:901-913; Odell y otros (1990) Mol. Gen. Gevet. 223: 369-378; Dale y otros (1990) Gene 91: 79-85 y Bayley y otros (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361.).
El plásmido de dos micras encontrado en la mayoría de las cepas presentes en la naturaleza de Saccharomyces cerevisiae codifica una recombinasa específica para el sitio que promueve una inversión del DNA entre dos repeticiones invertidas. Esta inversión representa un papel principal en la amplificación del número de copias del plásmido. La proteína, denominada proteína FLP, cataliza sucesos de recombinación específicos para el sitio. El sitio de recombinación mínimo (FRT, ID SEC Nº 1) se ha definido y contiene dos repeticiones de 13 pares de bases (pb) invertidas que rodean un espaciador asimétrico de 8 pb. La proteína FLP segmenta el sitio en las uniones de las repeticiones y el espaciador y está conectada covalentemente al DNA a través de un fosfato 3'.
Recombinasas específicas para el sitio como FLP segmentan y religan DNA en secuencias diana específicas, dando como resultado una recombinación definida precisamente entre dos sitios idénticos. Para funcionar, el sistema necesita los sitios de recombinación y la recombinasa. No se necesitan factores auxiliares. Así, todo el sistema puede insertarse en y funcionar en células de planta.
Se ha observado que el sistema de recombinación específico para el sitio FLP/FRT de levadura funciona en plantas. Hasta la fecha, el sistema ha sido utilizado para la escisión de DNA no deseado. Véanse Lyznik y otros (1993) Nucleic Acid Res. 21:969-975. En contraste, la presente invención utiliza FRTs no idénticos para el intercambio, la orientación, la disposición, la inserción y el control de la expresión de secuencias nucleotídicas en el genoma de planta.
Para poner en práctica los métodos de la invención, se necesita una planta transformada que contiene un sitio diana integrado en su genoma. El sitio diana se caracteriza por estar flanqueado por sitios de recombinación no idénticos. Se requiere adicionalmente un casete de orientación que contiene una secuencia nucleotídica flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes a los sitios contenidos en el sitio diana del organismo transformado. Se requiere una recombinasa que reconoce los sitios de recombinación no idénticos que cataliza la recombinación específica para el sitio.
Se sabe que la recombinasa puede ser proporcionada por cualquier medio conocido en la técnica. Esto es, puede proporcionarse en el organismo o la célula de planta transformando el organismo con un casete de expresión capaz de expresar la recombinasa en el organismo, mediante expresión transitoria; o proporcionando RNA mensajero (mRNA) para la recombinasa o la proteína de recombinasa.
Por "sitios de recombinación no idénticos" se entiende que los sitios de recombinación de flanqueo no son idénticos en secuencia y no se recombinarán o la recombinación entre los sitios será mínima. Esto es, un sitio de recombinación de flanqueo puede ser un sitio FRT en el que el segundo sitio de recombinación puede ser un sitio FRT mutado. Los sitios de recombinación no idénticos usados en los métodos de la invención impiden o suprimen mucho la recombinación entre los dos sitios de recombinación de flanqueo y la escisión de la secuencia nucleotídica contenida en los mismos. De acuerdo con esto, se sabe que cualesquiera sitios de recombinación no idénticos adecuados pueden utilizarse en la invención, incluyendo sitios FRT y FRT mutantes, sitios FRT y lox, sitios lox y lox mutantes, así como otros sitios de recombinación conocidos en la técnica.
Sitio de recombinación no idéntico adecuado implica que, en presencia de recombinasa activa, se produce la escisión de secuencias entre dos sitios de recombinación no idénticos, si se produce, con una eficacia considerablemente inferior que la disposición de orientación del intercambio mediada recombinantemente de secuencias nucleotídicas en el genoma de planta. Así, sitios no idénticos adecuados para usar en la invención incluyen los sitios donde la eficacia de recombinación entre los sitios es baja; por ejemplo, donde la eficacia es menor que aproximadamente 30 a aproximadamente 50%, preferiblemente menor que aproximadamente 10 a aproximadamente 30%, más preferiblemente menor que aproximadamente 5 a aproximadamente 10%.
Según se apunta anteriormente, los sitios de recombinación en el casete de orientación corresponden a los del sitio diana de la planta transformada. Esto es, si el sitio diana de la planta transformada contiene sitios de recombinación no idénticos de flanqueo de FRT y un FRT mutante, el casete de orientación contendrá los mismos sitios de recombinación no idénticos de FRT y FRT mutante.
Se sabe además que la recombinasa, que se usa en la invención, dependerá de los sitios de recombinación en el sitio diana de la planta transformada y el casete de orientación. Esto es, si se utilizan sitios FRT, la recombinasa FLP será necesaria. De la misma manera, cuando se utilizan sitios lox, se requiere la recombinasa Cre. Si los sitios de recombinación no idénticos comprenden un sitio tanto FRT como lox, se requerirá la recombinasa tanto FLP como Cre en la célula de planta.
La recombinasa FLP es una proteína que cataliza una reacción específica para el sitio que está implicada en amplificar el número de copias del plásmido de dos micras de S. cerevisiae durante la replicación del DNA. La proteína FLP se ha clonado y expresado. Véase, por ejemplo, Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80:4223-4227. La recombinasa FLP para usar en la invención puede ser la derivada del género Saccharomyces. Puede ser preferible sintetizar la recombinasa usando codones preferidos de planta para la expresión óptima en una planta de interés. Véase, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. Nº de Serie 08/972.258, presentada el 18 de Noviembre de 1997, titulada "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase".
La recombinasa Cre de bacteriófago cataliza la recombinación específica para el sitio entre dos sitios lox. La recombinasa Cre es conocida en la técnica. Véanse, por ejemplo, Guo y otros (1997) Nature 389:40-46; Abremski y otros (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514; Chen y otros (1996) Somat. Cell Mol. Genet. 22:477-488 y Shaikh y otros (1977) J. Biol. Chem. 272: 5695-5702. Tal secuencia Cre también puede sintetizarse usando codones preferidos de plantas.
Cuando es apropiado, las secuencias nucleotídicas que han de insertarse en el genoma de planta pueden optimizarse para la expresión incrementada en la planta transformada. Cuando se usan genes de mamífero, levadura o bacterianos en la invención, pueden sintetizarse usando codones preferidos de planta para una expresión mejorada. Se sabe que para la expresión en monocotiledóneas, también pueden sintetizarse genes de dicotiledóneas usando codones preferidos de monocotiledóneas. Están disponibles en la técnica métodos para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.380.831, 5.436.391 y Murray y otros (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498.
Los codones preferidos de planta pueden determinarse a partir de los codones utilizados más frecuentemente en las proteínas expresadas en la planta de interés. Se sabe que pueden construirse secuencias preferidas de monocotiledóneas o dicotiledóneas así como secuencias preferidas de plantas para especies de plantas particulares. Véanse, por ejemplo, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328 y Murray y otros (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498. Patente de EE.UU. Nº 5.380.831; Patente de EE.UU. Nº 5.436.391, y similares. Se sabe además que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica puede optimizarse o sintetizarse. Esto es, también pueden usarse secuencias totalmente optimizadas o parcialmente optimizadas.
Se sabe que las modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresión génica en un huésped celular y pueden usarse en la invención. Estas incluyen eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espúreas, señales de sitios de corte y empalme exón-intrón, repeticiones similares a transposones y otras de tales secuencias bien caracterizadas, que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse hasta niveles medios para un huésped celular dado, según se calcula mediante referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar estructuras de mRNA secundarias de tipo horquilla predichas.
La presente invención también abarca nuevos sitios diana de recombinación de FLP (FRT). El FRT (ID SEC Nº 1) se ha identificado como una secuencia mínima que comprende dos repeticiones de 13 pares de bases, separadas por un espaciador de 8 bases, como sigue:
5'GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'
en donde los nucleótidos entre corchetes indican la región espaciadora. Los nucleótidos de la región espaciadora pueden reemplazarse por una combinación de nucleótidos, con tal de que las dos repeticiones de 13 bases estén separadas por 8 nucleótidos. Parece que la secuencia nucleotídica real del espaciador no es crítica. Sin embargo, para la práctica de la invención, algunas substituciones de nucleótidos en la región espaciadora pueden funcionar mejor que otras.
El espaciador de 8 pares de bases está implicado en el apareamiento de DNA-DNA durante el intercambio de hebras. La asimetría de la región determina la dirección de alineamiento de sitios en el suceso de recombinación, lo que subsiguientemente conducirá a inversión o escisión. Como se indica previamente, la mayoría del espaciador puede mutarse sin una pérdida de función. Véase, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751.
Se proporcionan nuevos sitios mutantes FRT para usar en la práctica de los métodos de la presente invención. Tales sitios mutantes pueden construirse mediante mutagénesis basada en PCR. Aunque se proporcionan aquí sitios FRT mutantes (ID SEC Nº 2, 3, 4 y 5), se sabe que pueden usarse otros sitios FRT mutantes en la práctica de la invención. La presente invención no es el uso de un sitio FRT o recombinación particular, sino que en cambio sitios de recombinación no idénticos o sitios FRT pueden utilizarse para la inserción y la expresión orientada de secuencias nucleotídicas en un genoma de planta. Así, otros sitios FRT mutantes pueden construirse y utilizarse basándose en la presente descripción.
Según se analiza previamente, poner DNA genómico que contiene un sitio diana con sitios de recombinación no idénticos junto con un vector que contiene un casete de transferencia con sitios de recombinación no idénticos correspondientes, en presencia de la recombinasa, da como resultado la recombinación. La secuencia nucleotídica del casete de transferencia situado entre los sitios de recombinación de flanqueo se intercambia con la secuencia nucleotídica del sitio diana situado entre los sitios de recombinación de flanqueo. De esta manera, secuencias nucleotídicas de interés pueden incorporarse precisamente en el genoma del huésped.
Se sabe que pueden ponerse en práctica muchas variaciones de la invención. Por ejemplo, pueden construirse sitios diana que tienen múltiples sitios de recombinación no idénticos. Así, múltiples genes o secuencias nucleotídicas pueden apilarse u ordenarse en posiciones precisas en el genoma de planta. Asimismo, una vez que se ha establecido un sitio diana dentro del genoma, pueden introducirse sitios de recombinación adicionales mediante la incorporación de tales sitios dentro de la secuencia nucleotídica del casete de transferencia y la transferencia de los sitios a la secuencia diana. Así, una vez que se ha establecido un sitio diana, es posible añadir subsiguientemente sitios o alterar los sitios a través de recombinación.
Otra variación incluye proporcionar una región promotora o de iniciación de la transcripción conectada operablemente con el sitio diana en un organismo. Preferiblemente, el promotor estará 5' con respecto al primer sitio de recombinación. Transformando el organismo con un casete de transferencia que comprende una región de codificación, la expresión de la región de codificación se producirá durante la integración del casete de transferencia en el sitio diana. Esta modalidad proporciona un método para seleccionar células transformadas, particularmente células de planta, proporcionando una secuencia marcadora seleccionable como la secuencia de codificación.
Otras ventajas del presente sistema incluyen la posibilidad de reducir la complejidad de la integración de transgenes o DNA transferido en un organismo utilizando casetes de transferencia como los analizados anteriormente y seleccionando organismos con patrones de integración simples. De la misma manera, pueden identificarse sitios preferidos dentro del genoma comparando varios sucesos de transformación. Un sitio preferido dentro del genoma incluye uno que no rompe la expresión de secuencias esenciales y proporciona la expresión adecuada de la secuencia transgénica.
Los métodos de la invención también proporcionan medios para combinar múltiples casetes en una posición dentro del genoma. Véase, por ejemplo, la Figura 1. Pueden añadirse o suprimirse sitios de recombinación en sitios diana dentro del genoma.
Cualquier medio conocido en la técnica para poner en contacto los tres componentes del sistema puede usarse en la invención. Por ejemplo, una planta puede transformarse establemente para alojar el sitio diana en su genoma. La recombinasa puede expresarse o proporcionarse transitoriamente. Alternativamente, una secuencia nucleotídica capaz de expresar la recombinasa puede integrarse establemente en el genoma de la planta. En presencia del sitio diana correspondiente y la recombinasa, el casete de transferencia, flanqueado por sitios de recombinación no idénticos correspondientes, se inserta en el genoma de la planta transformada.
Alternativamente, los componentes del sistema pueden ponerse en contacto cruzando sexualmente plantas transformadas. En esta modalidad, una planta transformada, progenitor uno, que contiene un sitio diana integrado en su genoma puede cruzarse sexualmente con una segunda planta, progenitor dos, que se ha transformado genéticamente con un casete de transferencia que contiene sitios de recombinación no idénticos de flanqueo, que corresponden a los de la planta uno. La planta uno o la planta dos contiene dentro de su genoma una secuencia nucleotídica que expresa recombinasa. La recombinasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o inducible.
Promotores inducibles incluyen promotores inducibles térmicamente, promotores sensibles a estradiol, promotores inducibles químicamente y similares. Promotores inducibles por patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), que son inducidas después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Véanse, por ejemplo, Redolfi y otros (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes y otros (1992) The Plant Cell 4:645-656 y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. De esta manera, pueden controlarse la expresión de recombinasa y la actividad subsiguiente en los sitios de recombinación.
Promotores constitutivos para usar en la expresión de genes en plantas son conocidos en la técnica. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Depicker y otros (1982) Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Odell y otros (1985) Nature 313:810-812), promotor de ubitiquina (Christensen y otros (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689), promotores procedentes de genes tales como ribulosa bisfosfato carboxilasa (De Almeida y otros (1989) Mol. Gen. Genet. 218:78-98), actina (McElroy y otros (1990) Plant J. 2:163-171), histona, DnaJ (Baszczynski y otros (1997) Maydica 42:189-201) y similares.
Las composiciones y los métodos de la invención encuentran uso en la orientación de la integración de secuencias nucleotídicas transferidas a un sitio cromosómico específico. La secuencia nucleotídica puede codificar cualquier secuencia nucleotídica de interés. Genes particulares de interés incluyen los que proporcionan un rasgo funcional fácilmente analizable a la célula y/o el organismo huésped, tales como genes marcadores, así como otros genes que alteran el fenotipo de las células receptoras, y similares. Así, pueden utilizarse en la invención genes que afectan al crecimiento de las plantas, la altura, la susceptibilidad a una enfermedad, los insectos, el valor nutricional y similares. La secuencia nucleotídica también puede codificar una secuencia "antisentido" para interrumpir o modificar la expresión génica.
Se sabe que las secuencias nucleotídicas se utilizarán en una unidad o casete de expresión funcional. Por unidad o casete de expresión funcional se entiende la secuencia nucleotídica de interés con un promotor funcional y en la mayoría de los casos una región de terminación. Existen diversos modos de alcanzar la unidad de expresión funcional dentro de la práctica de la invención. En una modalidad de la invención, el ácido nucleico de interés se transfiere o inserta en el genoma como una unidad de expresión funcional. Alternativamente, la secuencia nucleotídica puede insertarse en un sitio dentro del genoma que está 3' con respecto a una región promotora. En este último caso, la inserción de la región de codificación 3' con respecto a la región promotora es tal que se alcanza una unidad de expresión funcional durante la integración. Por comodidad, para la expresión en plantas, el ácido nucleico que codifica sitios diana y los casetes de transferencia, incluyendo las secuencias nucleotídicas de interés, puede estar contenido dentro de casetes de expresión. El casete de expresión comprenderá una región de iniciación transcripcional, o promotor, conectada operablemente al ácido nucleico que codifica el péptido de interés. Tal casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para la inserción del gen o los genes de interés para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.
La región de iniciación transcripcional, el promotor, puede ser natural u homóloga o extraña o heteróloga para el huésped, o podría ser la secuencia natural o una secuencia sintética. Por extraña se entiende que la región de iniciación transcripcional no se encuentra en el huésped silvestre en el que se introduce la región de iniciación transcripcional. Puede usarse un promotor natural o heterólogo con respecto a la secuencia de codificación de interés.
El casete transcripcional incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción una región de iniciación transcripcional y traduccional, una secuencia de DNA de interés y una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. La región de terminación puede ser natural con la región de iniciación transcripcional, puede ser natural con la secuencia de DNA de interés o puede derivarse de otra fuente. Regiones de terminación convenientes están disponibles del gen inhibidor de proteinasa de patata (PinII) o del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véanse, además, Guerineau y otros (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y otros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y otros (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe y otros (1990) Gene 91:151-158; Ballas y otros 1989) Nucleic Acids Res.17:7891-7903; Joshi y otros (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5' en el constructo del casete de expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para potenciar la traducción. Los líderes de traducción se conocen en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región de no codificación 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R. y Moss, B. (1989) PNAS USA, 86:6126-6130); líderes de potivirus, por ejemplo, líder de TEV (virus del grabado del tabaco) (Allison y otros (1986)); líder de MDMV (virus del mosaico del enanismo del maíz); Virology,154:9-20) y proteína de unión de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G. y P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90-94; líder no traducido del mRNA de proteína de envuelta del virus del mosaico de la alfalfa (RNA de AMV 4) (Jobling, S. A. y Gehrke, L., (1987) Nature, 325:622-625; líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), (Gallie y otros (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256, Gallie y otros (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257-3273 y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, S.A. y otros (1991) Virology, 81:382-385). Véase, además, Della-Cioppa y otros (1987) Plant Physiology, 84:965-968. También pueden utilizarse otros métodos conocidos para potenciar la traducción, por ejemplo, intrones y similares.
Los casetes de expresión pueden contener uno o más de un gen o secuencia de ácido nucleico que ha de transferirse y expresarse en la planta transformada. Así, cada secuencia de ácido nucleico estará conectada operablemente a secuencias reguladoras 5' y 3'. Alternativamente, pueden proporcionarse múltiples casetes de expresión.
Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados.
Véanse, generalmente, G.T. Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech., 3:506-511; Christopherson y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6314-6318; Yao y otros (1992) Cell, 71:63-72; W.S. Reznikoff (1992) Mol. Microbiol, 6:2419-2422; Barkley y otros (1980) The Operon, pp. 177-220; Hu y otros (1987) Cell, 48:555-566; Brown y otros (1987) Cell, 49:603-612; Figge y otros (1988) Cell, 52:713-722; Deuschle y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 86:5400-5404; Fuerst y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2549-2553; Deuschle y otros (1990) Science, 248:480-483; M. Gossen (1993) PhD Thesis, University of Heidelberg; Reines y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1917-1921; Labow y otros (1990) Mol. Cell Bio., 10:3343-3356; Zambretti y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3952-3956; Baim y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5072-5076; Wyborski y otros (1991) Nuc. Acids Res., 19:4647-4653; A. Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. and Struc. Biol., 10:143-162; Degenkolb y otros (1991) Antimicrob. Agents Chemother., 35:1591-1595; Kleinschnidt y otros (1988) Biochemistry, 27:1094-1104; Gatz y otros (1992) Plant J., 2:397-404; A.L. Bonin (1993) PhD Thesis, University of Heidelberg; Gossen y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Oliva y otros (1992) Antimicrob. Agents Chemother., 36:913-919; Hlavka y otros (1985) Handbook of Exp. Pharmacology, 78; Gill y otros (1988) Nature 334:721-724.
Los métodos de la invención también pueden utilizarse para encontrar sitios de integración óptimos dentro de un genoma de planta. De esta manera, una planta se transforma con un casete de expresión que comprende un gen marcador seleccionable. El casete de expresión es un sitio diana ya que el gen marcador está flanqueado por sitios de recombinación no idénticos. Un protoplasto, tejidos o plantas enteras transformados pueden probarse para determinar los niveles de actividad del gen insertado. Por comparación de actividades celulares del gen en diferentes sitios de inserción, pueden encontrarse sitios de integración preferidos en los que el gen se expresa a niveles altos o aceptables. Estas plantas pueden utilizarse a continuación con técnicas de reorientación subsiguientes para reemplazar el gen marcador por otros genes o secuencias nucleotídicas de interés. De la misma manera, múltiples genes pueden insertarse en el sitio óptimo para la expresión. Véase, por ejemplo, la Figura 2, que indica un esquema para el apilamiento génico que utiliza integración específica para el sitio que usa el sistema FRT/FLP.
Está disponible una variedad de manipulaciones genéticas usando las composiciones de la presente invención, incluyendo, por ejemplo, comparar la actividad promotora en una planta transformada. Antes de la presente invención, la actividad promotora no podía determinarse y compararse precisamente debido a que los genes quiméricos estaban insertados en diferentes posiciones dentro del genoma de planta. Tales posiciones cromosómicas afectaban a la actividad. Utilizando los métodos de la presente invención, es posible una comparación directa de la actividad promotora en un contexto cromosómico definido. Así, usando los métodos puede alcanzarse una actividad potenciada de genes seleccionando sitios cromosómicos óptimos así como promotores óptimos para la expresión en la célula de planta.
La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitada a, maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, especies de Brassica rapa), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea battus), guacamote (Manihot esculenta), café (especies de Cofea), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), cítricos (especies de Citrus), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (especies de Musa), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendras (Prunus amygdalus), remolachas azucareras (Beta vulgaris), avenas, cebada, hortalizas, plantas ornamenteales y coníferas.
Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías de Lima (Phaseolus limensis), guisantes (especies de Lathyrus) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón (C. melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (especies de Rhododendron), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (especies de Rosa), tulipanes (especies de Tulipa), narcisos (especies de Narcissus), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo. Coníferas que pueden emplearse para poner en práctica la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino de incienso (Pinus taeda), pino elliotii (Pinus elliotii), pino ponderoso (Pinus ponderosa), pino contorcido (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata); pino de Oregón (Pseudotsuga menziesii); tsuga del Pacífico (Tsuga canadensis); picea de Sitka (Picea glauca); secuoya roja (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto común (Abies amabilis) y balsamina (Abies balsamea) y cedros tales como tuya gigante (Thuja plicata) y ciprés de Nootka (Chamaecyparis nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, canola, soja, algodón, cacahuete, sorgo, trigo, tabaco, etc.), más preferiblemente plantas de maíz y soja, aún más preferiblemente plantas de maíz. Se sabe que los métodos de la invención pueden aplicarse en cualquier sistema de planta. Métodos para la transformación de plantas son conocidos en la técnica. De esta manera, pueden obtenerse plantas, células de planta, tejido de planta, semillas y similares genéticamente modificados. Los procedimientos de transformación pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, elegida como diana para la transformación. Métodos adecuados para transformar células de planta incluyen microinyección (Crossway y otros (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y otros (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee y otros (1988) Biotechnology, 6:915-921), transferencia génica directa (Paszkowski y otros (1984) EMBO J., 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sanford y otros, Patente de EE.UU. 4.945.050; WO91/10725 y McCabe y otros (1988) Biotechnology, 6:923-926). Véanse, además, Weissinger y otros (1988) Annual Rev. Genet., 22:421-477; Sanford y otros (1987) Partculate Science and Technology, 5:27-37 (cebolla); Christou y otros (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe y otros (1988) Bio/Technology, 6:923-926 (soja); Datta y otros (1990) Biotechnology, 8:736-740 (arroz); Klein y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309 (maíz); Klein y otros (1988) Biotechnology, 6:559-563 (maíz); WO91/10725 (maíz); Klein y otros (1988) Plant Physiol., 91:440-444 (maíz); Fromm y otros (1990) Biotechnology, 8:833-839 y Gordon-Kamm y otros (1990) Plant Cell, 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (Londres), 311:763-764; Bytebier y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5345-5349(Liliaceae); De Wet y otros (1985) En The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G. P. Chapman y otros, pp. 197-209. Longman, NY (polen); Kaeppler y otros (1990) Plant Cell Reports, 9:415-418 y Kaeppler y otros (1992) Theor. Appl. Genet., 84:560-566 (transformación mediada por cristalitos filamentarios) D'Halluin y otros (1992) Plant Cell, 4:1495-1505 (electroporación); Li y otros (1993) Plant Cell Reports, 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany, 75:407-413 (arroz) y Osjoda y otros (1996) Nature Biotechnology, 14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens).
Las células que se han transformado pueden hacerse crecer como plantas de acuerdo con sistemas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick y otros (1986) Plant Cell Reports, 5:81-84. Estas plantas regeneradas pueden polinizarse a continuación con la misma cepa transformada o cepas diferentes, y el híbrido resultante tener la característica fenotípica deseada identificada. Pueden hacerse crecer dos o más generaciones para asegurar que la característica fenotípica de interés se mantenga y se herede establemente y a continuación las semillas se recojen para asegurar que se haya alcanzado el fenotipo u otra propiedad deseada.
Se sabe que puede utilizarse cualquier medio de transformación para la presente invención. Sin embargo, para insertar el sitio diana dentro de la planta transformada, puede preferirse la transformación mediada por Agrobacterium. La transformación mediada por Agrobacterium tiende generalmente a insertar un número de copias inferior de DNA transferido que el bombardeo con partículas u otros medios de transformación.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Parte experimental
La presente invención general proporciona un procedimiento para usar sitios FRT existentes y nuevos en un nuevo sistema de orientación génica que facilita la reorientación direccional de genes deseados en sitios FRT previamente introducidos en el genoma del organismo diana. Los nuevos sitios FRT difieren de sitios FRT descritos previamente en la secuencia de las regiones espaciadoras de 8 pb de los sitios FRT. Publicaciones previas también han mostrado que en presencia de proteína FLP, la recombinación de secuencias entre dos sitios FRT se produce eficazmente solo con dos sitios FRT idénticos. Véase, por ejemplo, Umlauf y Cox (1988) Embo J. 7:1845- 1852; Schlake y Bode (1994) Biochem. 33:12746-12751. Para usar la invención, una secuencia génica o de DNA se flanquea por dos sitios FRT no idénticos y se introduce en un genoma de un organismo diana. El gen encerrado puede ser un marcador seleccionable, permitiendo de ese modo la selección para secuencias introducidas satisfactoriamente. La caracterización molecular confirma la integración de secuencias deseadas incluyendo sitios FRT completos. Se listan posteriormente ejemplos genéticos de construcciones de vectores útiles para poner en práctica la invención:
A.
\underline{FRTa}-P1-G1-T1-\underline{FRTb}
B.
\underline{FRTa}-P1-G1-T1-\underline{FRTa}
C.
\underline{FRTb}-P1-G1-T1-\underline{FRTb}
D.
P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTb}
E.
P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTa}
F.
P1-\underline{FRTb}-G1-T1-\underline{FRTb}
G.
P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
H.
P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-P2-G2-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
I.
P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-\underline{FRTa}::G2(noATG)-T2-\underline{FRTb}
J.
P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-\underline{FRTa}::G2(noATG)-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
K.
P1-\underline{FRTa}-G1-T1-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
L.
P1-\underline{FRTa}-G1-T1-P2-G2-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
M.
P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTa}-G2-T2-\underline{FRTb}
N.
P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTa}-G2-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
Pueden construirse variaciones de los mismos con otros promotores, genes, terminadores o sitios FRT.
FRTa y FRTb son dos ejemplos de sitios FRT no idénticos. P1, P2 y P3 son diferentes promotores, G1, G2 y G3 son diferentes genes, T1, T2 y T3 son diferentes terminadores. ATG es el inicio del codón de traducción para el gen subsiguiente. La denominación noATG indica que el gen particular carece del codón de iniciación de la traducción ATG. El símbolo :: implica una fusión entre elementos adyacentes, y cuando se usa entre ATG, FRT y un gen implica que las secuencias se reúnen para generar una fusión traducciinal en el marco que da como resultado un producto génico apropiadamente expresado y funcional.
A a F son configuraciones preferidas para probar nuevos sitios FRT con respecto a la capacidad para recombinar secuencias entre ellos; siendo la situación deseada que cuando se usan dos del mismo sitio, la recombinación es eficaz y que cuando se usan dos sitios diferentes, no tiene lugar recombinación entre ellos en presencia de proteína FLP. G a J son configuraciones preferidas para el uso general al desarrollar líneas para la reorientación. Se entiende que cualquier número de genes u otras combinaciones de secuencias pueden ensamblarse para usar como parte de esta invención. K a N son posibles configuraciones que también podrían usarse.
Una vez que se establece una planta o tejido cultivado estable con uno de los constructos anteriores, un segundo constructo flanqueado por los mismos sitios FRT que flanquean las secuencias del primer constructo anterior se introduce en los tejidos establemente transformados junto con la expresión de proteína FLP. Los nuevos constructos pueden ser, pero no se limitan a, los siguientes:
O.
\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-\underline{FRTb}
P.
\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
Q.
\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTb}
R.
\underline{FRTa}-G1-T1-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
La proteína FLP puede suministrarse a) cotransformando con un plásmido que porta un gen que codifica FLP; b) cointroduciendo mRNA o proteína de FLP directamente; c) usando una línea para la transformación inicial que expresa FLP constitutivamente o después de la inducción; o d) haciendo crecer las plantas que soportan los vectores elegidos como diana iniciales, cruzando con plantas que expresan proteína FLP activa y seleccionando casos en la progenie.
Como un ejemplo de trabajo, la secuencia O anterior se introduce en una línea que contiene una copia de la secuencia G integrada establemente en el genoma, en presencia de proteína FLP funcional. Tiene lugar recombinación entre sitios FRT idénticos de modo que la secuencia entre los sitios FRT en O reemplaza a la secuencia entre los sitios FRT correspondientes de la secuencia G, dando de ese modo una nueva secuencia reintegrada orientada direccionalmente. El nuevo gen en O se elimina ahora del promotor P1 en G. El propósito de diseñar algunos de los constructos sin un codón de iniciación ATG en el gen es tal que si se produce la integración aleatoria, existe una probabilidad extremadamente baja de expresión del gen introducido, ya que para que esto ocurra el fragmento necesitaría integrarse tras una región promotora endógena en el marco de lectura correcto. Esto se produciría de forma extremadamente rara y los datos hasta la fecha no han dado ejemplos de este suceso usando una secuencia tal como O donde el gen contenido es el gen GUS fácilmente evaluable. Un requisito para cada gen que ha de construirse de este modo (es decir, sin ATG en el gen pero con el ATG aguas arriba del sitio FRT) es la demostración de que el gen puede tolerar una fusión de la secuencia FRT entre el codón ATG y el segundo codón de la proteína. Hasta la fecha, esto ha funcionado para un gran número pero no todos los genes. En los últimos casos podría usarse la otra forma del constructo que retiene el ATG (por ejemplo Q.). Se espera que todas las secuencias listadas anteriormente funcionen en este esquema, algunas con frecuencias o eficacias diferentes que otras.
Un problema al que se dirige esta estrategia es las limitaciones con los sistemas de transformación actuales, particularmente en plantas, donde el aporte de DNA a células o núcleos y la integración subsiguiente en el genoma se producen más o menos aleatoriamente e impredeciblemente. Esto es particularmente cierto con métodos de bombardeo de partículas; se han elaborado argumentos de que los métodos basados en Agrobacterium tienden a aportar secuencias flanqueadas en el límite por T-DNA a regiones más activamente transcritas del genoma, pero aparte de eso el procedimiento todavía es en gran parte aleatorio. Por lo tanto, para el desarrollo de productos comerciales, necesitan generarse grandes números (estimaciones de >200) de casos para identificar un caso: a) que se exprese en el nivel deseado; b) en el que el producto sea funcional y eficaz; c) que tenga una complejidad de integración simple para facilitar la recuperación; d) que no contenga secuencias extrañas que planteen posibles problemas reguladores; e) que se mantenga establemente la expresión a lo largo de generaciones; f) lo más importante, que no tenga un impacto negativo sobre las características de comportamiento agrónomo cuando se pasa a través de un programa de reproducción que implica la introgresión del rasgo en diferentes fondos genéticos. La utilización de recursos es muy grande y así los esquemas que pueden producir notablemente la demanda de recursos serían muy beneficiosos para la producción de números mayores de productos finales deseados.
Ejemplo 1 Creación de nuevos sitios FRT no idénticos
Se construyeron fragmentos de DNA que contenían nuevas secuencias FRT sintetizando, reasociando y ligando oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para amplificación por PCR (Mullis y Faloona, 1987) de un producto de DNA que contiene la nueva secuencia FRT cerca del extremo 5' del producto de PCR. El producto de FRT recientemente construido incluye sitios de restricción de flanqueo útiles para clonar en unidades de expresión de plantas. En general, el extremo 5' está flanqueado por un sitio NheI y un sitio NcoI terminal. El sitio NcoI incluye las bases ATG, que se usan ventajosamente en constructos vectoriales recientemente desarrollados como las secuencia de reconocimiento para iniciar un marco de lectura abierto. En constructos basados en la secuencia denominados noATG/FRT, el sitio NheI se usa para clonar eliminando de ese modo el ATG aguas arriba en el procedimiento. En el extremo 3' de la secuencia FRT, se incluye un sitio de restricción que permite la identificación única de las secuencias espaciadoras individuales. Como ejemplos específicos, el sitio FRT silvestre (denominado FRT1 aquí) se clona con un sitio BglII de flanqueo, el sito FRT5 (espaciador TTCAAAAG) tiene un sitio ScaI, el sitio FRT6 (espaciador TTCAAAAA) tiene un sitio AatII y el sitio FRT7 (espaciador TTCAATAA) tiene un sitio SpeI. El sitio de restricción de flanqueo más externo es un sitio XhoI y se usa para clonar un gen de interés en el marco de lectura abierto.
Las estructuras y las secuencias de los sitios FRT que se indican y/o se usan en el presente ejemplo de la invención se representan posteriormente con posiciones de sitios de restricción, repeticiones y regiones espaciadoras indicadas.
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Ejemplo 2 Creación de vectores de transformación de plantas que contienen nuevos sitios FRT no idénticos
Basándose en el diseño de sitios FRT que se describe anteriormente, se usaron procedimientos de PCR o mutagénesis estándar para crear un sitio XhoI que se solapa en el inicio de una secuencia génica que ha de usarse para clonación aguas arriba del sitio FRT, convirtiendo de ese modo el codón de iniciación ATG en GTG. La ligación de un FRT a la secuencia génica mutada en XhoI crea un nuevo marco de lectura abierto que se inicia 5' con respecto al FRT. Una segunda secuencia FRT puede clonarse aguas abajo del terminador usando una variedad de métodos incluyendo PCR o ligación. La unidad FRT/gen/terminador/FRT puede usarse a continuación para elaborar constructos de diana o substrato.
Las dianas se crean insertando un promotor en el sitio NcoI aguas arriba del primer FRT. Esto mantiene un marco de lectura abierto completo de la fusión FRT/gen. Estos constructos diana son para usar en experimentos de transformación para crear "líneas diana" deseables. Se construyen vectores substrato clonando con el sitio NheI para truncar el codón de iniciación de la unidad FRT/gen, eliminando de ese modo el marco de lectura abierto apropiado. Estos vectores substrato se usan en experimentos diseñados para reorientar un nuevo gen flanqueado por sitios FRT en los sitios FRT correspondientes introducidos previamente en las líneas diana. En cualquier caso, para crear múltiples casetes génicos, unidades de promotor/gen/terminador adicionales se insertan entre el terminador y el segundo FRT en cualesquiera moléculas diana o substrato.
Ejemplo 3 Demostración de la funcionalidad de nuevos sitios FRT y el requerimiento de dos sitios idénticos para la recombinación eficaz de secuencias de DNA situadas entre dos sitios FRT
Plásmidos que contenían dos secuencias FRT idénticas o dos diferentes se ensayaron con respecto a la eficacia de recombinación de secuencias entre los sitios FRT mediante transformación en 294-FLP, una versión de la cepa MM294 de E. coli con FLP recombinasa integrada en el locus lacZ (Buchholz y otros, 1996). Las cepas se hicieron crecer durante la noche a 37ºC con agitación, permitiendo la expresión constitutiva de FLP recombinasa en los cultivos. El DNA plasmídico se aisló usando procedimientos estándar y se digirió con enzimas de restricción que crean nuevos fragmentos de restricción después de la recombinación mediada por FLP. La extensión de la recombinación entre los sitios FRT se estimó examinando patrones de formación de bandas sobre un gel de agarosa. La Tabla 1 resume datos del análisis del gel.
TABLA 1
Combinación de Sitios Diana Extensión de la Recombinación
FRT1 y FRT1 Completa
FRT5 y FRT5 Extensiva, pero parcialmente incompleta
FRT6 y FRT6 Completa
FRT7 y FRT7 Completa
FRT1 y FRT5 Sin recombinación
FRT1 y FRT6 Sin recombinación
FRT1 y FRT7 Sin recombinación
FRT5 y FRT6 Sin recombinación
FRT5 y FRT7 Sin recombinación
FRT6 y FRT7 Cantidad muy pequeña de recombinación
Los resultados de estos estudios indican que la escisión de secuencias entre sitios FRT idénticos se produce con alta eficacia en general (FT5, ID SEC Nº 3, parece ser menos eficaz globalmente que los sitios FRT1, ID SEC Nº 2, o la nueva FRT6, ID SEC Nº 4, y FRT7, ID SEC Nº 5). De forma igual de importante, la recombinación con dos sitios FRT diferentes estaba ausente, o al menos era indetectable bajo las condiciones de este ensayo para todas las combinaciones menos FRT6, ID SEC Nº 4, y FRT7, ID SEC Nº 5, donde se apreciaba un pequeño grado de recombinación. Estos datos proporcionaban un fuerte apoyo para la utilidad potencial de sitios FRT no idénticos al desarrollar un sistema de integración génica direccional. Un punto a resaltar es que debido a que la recombinación de secuencias entre dos sitios FRT idénticos puede producirse con diferentes eficacias dependiendo del sitio FRT específico usado (por ejemplo, FRT5, ID SEC Nº 3, en el presente experimento), el diseño de constructos para la integración orientada direccional puede requerir la selección juiciosa de pares de sitios FRT para optimizar con respecto a la eficacia de recombinación deseada o para evitar cualquier recombinación no deseada.
Ejemplo 4 Introducción de secuencias de DNA que incluyen nuevos sitios FRT no idénticos en células de plantas, generación y recuperación de casos transgénicos estables ("líneas diana"), conservación de "líneas diana" y regeneración de plantas
Se produjo un número de casos transgénicos estables que portaban sitios diana FRT. Estas líneas diana se generaron introduciendo uno de una serie de constructos incluyendo, por ejemplo, PHP9643, PHP10616, PHP11407, PHP11410, PHP11457, PHP11599, PHP11893 o PHP14220 (Véase la Tabla 2) en células de maíz, mediante bombardeo de partículas, según se describe en Register y otros (1994) Plant Mol. Biol. 25:951-961 o a través de cocultivo con Agrobacterium según se describe por Heath y otros (1997) Mol. Plant-Microbe Interact. 10:22-227; Hiei y otros (1994) Plant J. 6:271-282 e Ishida y otros (1996) Nat. Biotech. 14:745-750 y en la Solicitud Provisional Nº de Serie 60/045.121 para "Agrobacterium Mediated Sorghum Transformation", presentada el 30 de Abril de 1997. Todos los vectores se construyeron usando técnicas de biología molecular estándar como las descritas, por ejemplo, en Sambrook y otros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.). La Tabla 2 posterior describe los componentes dentro de cada uno de los vectores usados para crear un grupo de líneas diana. La estrategia de ensamblaje era como sigue. La primera unidad de expresión en cada caso contiene el fragmento PstI de 2,0 kb del promotor de ubiquitina de maíz Ubi-1 (Christensen y otros (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689). Aguas abajo del promotor de ubiquitina, secuencias FRT variables se insertaron usando NcoI u otros sitios que retenían el codón de iniciación ATG. PHP10616 tiene la secuencia de codificación mo-PAT (Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº de Serie 60/035.560 para "Methods for Improving Transformation Efficiency", presentada el 14 de Enero de 1997) fusionada en el marco en el sitio XhoI que flanquea FRT1 (véase anteriormente, ID SEC Nº 2). PHP11407 y PHP11893 tienen GFPm-C3 (PCT/US97/07688, presentada el 1 de Mayo de 1997 a partir de la Solicitud Provisional 0/016.345, presentada el 1 de Mayo de 1996) que contiene el segundo intrón de ST-LS1 de patata (Vancanneyt y otros (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245-250) fusionado en el marco en el sitio XhoI de FRT1 y FRT6, respectivamente. El terminador del inhibidor de proteinasa de patata II (PinII) (bases 2 a 310 de An y otros (1989) Plant Cell 1:115-122) se ligó aguas abajo de las secuencias de codificación. PHP10616 tiene una secuencia FRT5 (ID SEC Nº 3) clonada aguas abajo del terminador de PinII.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Las segundas unidades de expresión tienen el promotor de ubiquitina de maíz o alternativamente las versiones potenciadas o estándar del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor. El promotor 35S estándar incluye las bases -421 a +2 (de Gardner y otros (1981) Nucl. Acids Res. 9:2871-2888), y la versión potenciada tiene una duplicación de bases -421 a -90 aguas arriba de este promotor 35S estándar. El líder del virus del mosaico del tabaco de 79 pb O' (Gallie y otros (1987) Nucl. Acids Res. 15:3257-3273) se inserta aguas abajo del promotor 35S seguido por el primer intrón del gen de alcohol deshidrogenasa de maíz ADH1-S (Dennis y otros (1984) Nucl. Acids Res. 12:3983-3990). Las secuencias de codificación en estas segundas unidades de expresión incluyen los genes mo-PAT, bar (Thompson y otros (1987) EMBO J. 6:2519-2523) o HM1 (Johal y Briggs, Science 258:985-987) seguidos por el terminador de PinII o el terminador 35S (nucleótidos 7487-7639 en Gardner y otros (1981) Nucl. Acids Res. 9:2871-2888). Los sitios FRT variables se ligan aguas abajo de los terminadores según se muestra en la tabla. Una tercera unidad de expresión está presente en PHP9643 y tiene una fusión FRT1/GFPm clonada usando el sitio NheI de flanqueo de FRT1 (ID SEC Nº 2) para retirar el codón de iniciación ATG de GFPm, haciéndolo de ese modo no funcional en el constructo existente, pero donde la escisión correcta de las secuencias entre los sitios FRT1 (ID SEC Nº 2) puede poner la GFPm en el marco con el promotor de ubiquitina y ATG de la primera unidad de expresión, haciéndola de ese modo funcional. Aguas abajo de GFPm está el terminador de PinII seguido por una secuencia FRT5 (ID SEC Nº 3).
PHP9643 se clonó en una cadena principal plasmídica derivada de pUC. Todos los otros vectores se clonaron en un plásmido de tipo pSB11 (Véanse, por ejemplo, EPA0672753A1, EPA0604662A1, EPA0687730A1 y la Patente de EE.UU. Nº 5.591.616) con las unidades de expresión contenidas entre las secuencias límite de TDNA. Todos se orientan con la unidad de expresión uno adyacente al límite derecho. Los plásmidos basados en pSB11 se integraron en el plásmido superbinario pSB1 (Véanse, por ejemplo, EPA0672752A1, EPA0604662A1, EPA0687730A1 y la Patente de EE.UU. Nº 5.591.616) mediante recombinación homóloga entre los dos plásmidos. La cepa HB101 de E. coli que contiene los derivados de pSB11 se cruzó con la cepa de Agrobacterium LBA4404 que aloja pSB1 para crear los plásmidos cointegrados PHP10616, PHP11407, PHP11410, PHP11457, PHP11599, PHP11893 y PHP14220 en Agrobacterium (mediante el método de Ditta y otros (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351). Los cointegrados se verificaron mediante la resistencia de Agrobacterium a la espectinomicina y digestiones de restricción con SalI.
La Tabla 2 también incluye un ejemplo de un vector para crear una línea diana donde los sitios FRT se insertan en el intrón de ubiquitina de maíz (última entrada) como una localización alternativa para la colocación de FRT u otros sitios diana.
Después de la selección de casos establemente transformados, muestras de estas líneas diana se criopreservaron como un suministro para experimentos futuros usando el sistema descrito por Peterson (véase la solicitud 08/859.313). Para varios pero no todos los casos, se hizo crecer otra muestra de callo procedente de varios de los casos transgénicos estables, se transfirió a medio de regeneración para inducir la formación de plántulas y las plantas se recuperaron subsiguientemente y se hicieron crecer hasta la madurez (Register y otros (1994) Plant. Mol. Biol. 25:951-961).
Ejemplo 5 Demostración de la funcionalidad de nuevos sitios FRT en plantas (A) Escisión de secuencias de DNA entre dos sitios FRT idénticos, pero no cuando están flanqueadas por dos secuencias FRT no idénticas
La extensión de la recombinación intraplasmídica se examinó en plantas usando los constructos de escisión de FRT descritos en la Tabla 3 posteriormente. Los vectores PHP10968, PHP10998, PHP10969, PHP11272, PHP11243, PHP11244, PHP12140, PHP12141, PHP12156 y PHP12157 se construyeron ligando el promotor de ubiquitina de maíz aguas arriba de secuencias FRT usando NcoI u otros sitios que mantenían el codón de iniciación ATG. La secuencia FRT se fusionó en el marco en el sitio XhoI de flanqueo a una secuencia GFPm que contenía una mutación de serina en treonina en el residuo de aminoácido 65 en la secuencia silvestre (nueva secuencia denominada GFPm-S65T). El terminador de pinII se clonó aguas abajo de GFPm. La segunda unidad de expresión consiste en una FRT sin promotor, clonada con el sitio NheI de flanqueo 5' para retirar el codón de iniciación ATG, fusionada en el marco con la secuencia de codificación de GUS (Jefferson y otros (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 8447-8451) y seguida por el terminador de pinII. La cadena principal vectorial es un plásmido derivado de pUC en todos los casos. Se efectuaron experimentos bombardeando los plásmidos indicados en células de maíz junto con el constructo pHP5096, que soporta un casete de expresión funcional para la proteína FLP. PHP5096, el vector de expresión de FLPm que se usó en experimentos con los vectores de escisión y de substrato, consiste en el promotor de ubiquitina de maíz clonado aguas arriba de la secuencia de codificación de FLPm (Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/972.258 para "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase") y el terminador de pinII en una cadena principal plasmídica derivada de pUC. En cada caso, la escisión satisfactoria retiraría secuencias intermedias entre los sitios FRT indicados poniendo de ese modo un gen uidA (GUS) inactivo en el marco con y en proximidad al promotor de ubiquitina dando como resultado actividad de GUS. Si no se produce la escisión, no se espera expresión de GUS. Los resultados para la expresión de GUS a partir de estos experimentos se indican en la Tabla 4 posteriormente. En estos estudios se producía escisión eficaz solo cuando los constructos contenían dos sitios FRT idénticos. En el caso de la combinación de FRT6 (ID SEC Nº 4) y FRT7 (ID SEC Nº 5), se observó una pequeña cantidad de recombinación, de nuevo enfatizando la necesidad de probar combinaciones de sitios diana y seleccionar juiciosamente combinaciones apropiadas para la aplicación.
2
TABLA 4
Plásmido Recombinación probada entre Expresión de GUS
PHP10968 FRT1 y FRT1 +++
PHP10998 FRT5 y FRT5 ++
PHP11272 FRT6 y FRT6 +++
PHP12157 FRT7 y FRT7 +++
PHP9643 FRT1 y FRT5 -
PHP11243 FRT1 y FRT6 -
PHP 12140 FRT 1 y FRT7 -
PHP11244 FRT5 y FRT6 -
PHP 12141 FRT5 y FRT7 -
PHP 12156 FRT6 y FRT7 + 
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B) Integración transitoria de una segunda secuencia de DNA flanqueada por dos sitios FRT no idénticos en células de planta
Se resumen en la Tabla 5 posteriormente datos de experimentos en los que líneas diana creadas usando los plásmidos descritos en la Tabla 2 se bombardeaban con un plásmido substrato que contenía un gen informador GUS flanqueado por los sitios FRT correspondientes usados en los constructos diana. Este experimento medía en la capacidad para detectar la expresión de GUS transitoria poco después de la introducción del plásmido substrato. Puesto que no hay promotor frente a la primera secuencia de codificación en los plásmidos substrato, la integración aleatoria, a no ser que se produjera en el marco detrás de una secuencia reguladora apropiada en cualquier parte del genoma, no daría como resultado la expresión de GUS. Este sistema de ensayo evalúa entonces la capacidad para orientar genes flanqueados por FRT a sitios FRT del genoma. En general, los vectores substrato de FRT (Tabla 6) se construyen como fusiones FRT/gen sin promotor clonadas usando el sitio NheI de flanqueo 5' del FRT para retirar el codón de iniciación ATG. Genes fusionados en el marco al FRT con el sitio XhoI de flanqueo incluyen uno de varios genes marcadores evaluables o seleccionables tales como aadA (Svab y otros (1990) Plant Mol. Biol. 14:197-205), uidA, GFPm, GFPm-C3/intrón o bar y están seguidos por un terminador de pinII. En algunos casos (PHP10259, PHP10603, PHP11561 y PHP11633), los plásmidos contienen una sola unidad de expresión y el segundo sitio FRT heterólogo está clonado aguas abajo del terminador de pinII. Los plásmidos substrato PHP10859, PHP10997, PHP11204, PHP11699 y PHP12190 tienen además de la primera unidad de expresión descrita anteriormente una segunda unidad que consiste en un promotor de ubiquitina de maíz, el promotor 35S potenciado o un promotor quimérico que consiste en la región potenciadora de 35S clonada aguas arriba de un promotor central sintético denominado Rsyn7 (Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/661.601, presentada el 11 de Junio de 1996) clonado aguas arriba de las secuencias de codificación de HM1, aadA, GUS o bar y el terminador de pinII. Un FRT heterólogo se inserta aguas abajo del segundo terminador. Finalmente, PHP11003 y PHP11809 contienen tres unidades de expresión. La primera unidad es una fusión noATG/FRT/gen sin promotor como la descrita anteriormente. La segunda unidad contiene el potenciador 35S/promotor Rsyn7 quimérico descrito anteriormente o el promotor ZmdJ1 (Baszczynski y otros (1997) Maydica 42:189-201) clonado aguas arriba de la secuencia de codificación de GUS y el terminador de pinII. La tercera unidad de expresión consiste en el promotor de ubiquitina de maíz clonado aguas arriba de la secuencia de codificación de HM1, el terminador pinII y una secuencia FRT heteróloga. Todos los vectores substrato de FRT se clonan en una cadena principal plasmídica derivada de pUC. Detalles de los componentes de estos vectores se describen en la Tabla 6. También se listan en la Tabla 6 dos vectores con situación alternativa de los sitios FRT en la UTR 5' o el intrón de ubiquitina.
TABLA 5
N° de manchas PHP9643 PHP1147 PHP11410 PHP11407 PHP11457
de GUS (n = 74) (n = 127) (n = 32) (n = 38) (n = 113)
sin manchas 17,57% 3,15% 6,25% 2,63% 7,96%
1-25 22,97% 48,03% 62,50% 10,53% 27,43%
26-100 31,08% 37,80% 18,75% 18,42% 32,74%
101-200 14,86% 8,66% 12,50% 57,89% 27,43%
demasiadas para 13,51% 2,36% 0,00% 10,53% 4,42%
contarlas 
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(Tabla pasa a página siguiente)
3
Los resultados de la Tabla 5 indican que la frecuencia y el nivel de la expresión de GUS varían entre diferentes casos, como podría predecirse para genes insertados en diferentes posiciones en el genoma. La predicción es que una vez que se identifica una línea de alta frecuencia y alta expresión, la expresión de los genes introducidos subsiguientemente en esos mismos sitios también será superior que en otros casos de expresión inferior.
C) Integración estable de una segunda secuencia de DNA flanqueada por dos secuencias FRT no idénticas en células de plantas
Un subgrupo de las "líneas diana" transgénicas estables descritas en el ejemplo 4 anteriormente se usó en experimentos destinados a reorientar establemente a estas líneas diana primarias un nuevo gen flanqueado por los mismos sitios FRT usados en las líneas diana y clonados en un segundo plásmido "substrato" de constructo. La Tabla 7 lista los constructos contenidos en las líneas diana primarias (de la Tabla 2), los sitios FRT contenidos en estas líneas y los plásmidos substrato (de la Tabla 6) que se reorientaban subsiguientemente a las líneas diana.
La Tabla 8 presenta datos de casos transgénicos estables que demuestran orientación satisfactoria y reproducible de secuencias introducidas hacia sitios diana genómicos previamente creados. Los datos mostrados son para 18 líneas diana independientes, cada una reorientada con un constructo de GUS sin promotor. Puesto que el gen bar se introducía simultáneamente en el mismo plásmido, la proporción de casos que expresan GUS de los casos totales recuperados con selección con bialofós proporciona una medida de la frecuencia de reorientación con relación a la integración aleatoria.
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TABLA 7
Constructo diana Sitios FRT Substratos que se evalúan
PHP9643 1/1/5 10603, 10259, 10859, 10997, 11003
PHP11147 1/5 10603, 10859, 11003
PHP11407 1/5 10603, 11204, 12190
PHP 11410 5/1 11633
PHP11457 6/1 11561, 11699, 11809
PHP11893 6/1 Experimentos en marcha 
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TABLA 8
Líneas Diana N° de Casos Aleatorios N° de Casos Orientados Frecuencia de Orientación (%)
A 13 1 7,1
B 14 1 6,7
C 108 14 11,5
D 18 1 5,3
E 14 2 12,5
F 9 1 10,0
G 65 1 1,5
H 63 9 12,5
I 71 6 7,8
J 15 1 6,3
TABLA 8 (continuación)
Líneas Diana N° de Casos Aleatorios N° de Casos Orientados Frecuencia de Orientación (%)
K 33 9 21,4
L 19 2 9,5
M 8 1 11,1
N 12 1 7,7
O 29 4 12,1
P 43 4 8,5
Q 16 3 15,8
R 4 1 20,0
S 12 1 7,7
T 10 1 9,1
U 1 2 66,7
Ejemplo 6 Evaluación del impacto de secuencias FRT introducidas sobre el desarrollo de plantas, la expresión génica y el comportamiento agrónomo
La evaluación inicial del impacto de las secuencias introducidas sobre el crecimiento de las plantas y la expresión génica se efectúa en el invernadero realizando observaciones regulares a través de la polinización y la formación de semillas. Las plantas tanto se autofecundan como se cruzan con otros genotipos para obtener semillas T1 para la evaluación subsiguiente en invernadero y campo. Para la evaluación de la expresión génica, se recogen y analizan datos tanto cualitativos como cuantitativos. Las semillas T1 procedentes de casos transgénicos que dan niveles aceptables o deseables de expresión que no muestran impacto negativo significativo en el desarrollo de las plantas (por ejemplo, tienen morfología de desarrollo normal, son andro- y geno-fértiles, etc.) se hacen crecer a continuación en parcelas de campo manipuladas junto con plantas de control no transgénicas, y los datos de comportamiento agrónomo estándar se recogen y se evalúan.
Ejemplo 7 Conversión de una secuencia FRT funcional introducida en una segunda secuencia FRT funcional no idéntica
El sistema adoptado aquí para desarrollar un método para convertir entre diferentes sitios FRT para usar en diversas aplicaciones se basa en la estrategia de "quimeraplastia" previamente descrita para realizar modificaciones nucleotídicas orientadas específicas en una secuencia diana estracromosómica o genómica especificada en células animales (Yoon y otros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:2071-2076; Cole-Strauss y otros (1996) Science 273:1386-1389). Esta capacidad en las plantas, según se demostró recientemente en estos laboratorios, es beneficiosa para extender el uso potencial de la presente invención para una aplicación más amplia. El uso propuesto de esta tecnología de "quimeraplastia" en la presente invención sería orientar y modificar nucleótidos en un sitio FRT de un par de sitios FRT no idénticos que flanquean una secuencia de DNA de interés en un modo que a continuación hace idénticos los dos sitos FRT. La expresión subsiguiente o simultánea de FLP recombinasa en células con estas modificaciones de sitios FRT conduciría a la escisión de las secuencias entre estos sitios FRT ahora idénticos, retirando de ese modo específicamente las secuencias de DNA no deseables del caso transgénico estable creado previamente que contiene esas secuencias. Una aplicación de ese sistema estaría, por ejemplo, en el caso de un marcador seleccionable que se requiere durante etapas iniciales de un programa de reproducción o retrocruzamiento para mantener y seleccionar plantas individuales preferidas, pero que no se desea en el producto final.
A) Diseño y construcción de vectores para probar la conversión de sitios FRT basada en quimeraplastia
Los vectores diana para evaluar esta estrategia de modificación de sitios FRT se muestran específicamente posteriormente, donde P1 y P2 representan dos promotores diferentes, G1 y G2 representan dos genes y T1 y T2 representan dos regiones terminadoras; estas regiones se muestran como cajas blancas. Diferentes sitios FRT se indican y se muestran como cajas oscuras. Una versión del constructo incorpora un tercer sitio FRT único aguas abajo del segundo gen y se usa para evaluar si la conversión orientada, en este caso, de FRT5 en FRT6 (ID SEC Nº 4), también da como resultado la conversión del sitio FRT1 (ID SEC Nº 2) aguas abajo en un sitio FRT6 (ID SEC Nº 4). En el primer caso, la dispersión del gen (G1) aguas abajo debe detectarse, mientras que si la conversión no es específica para FRT5 (ID SEC Nº 3) y el sitio FRT1 (ID SEC Nº 2) también se convierte, entonces ambas actividades génicas se perderán. Para los ejemplos específicos usados aquí, P1 es el promotor de ubiquitina de maíz, P2 es el promotor 35S de CaMV potenciado, G1 es el gen uidA (GUS), G2 es el gen bar y T1 y T2 son terminadores de pinII. Se entiende que basándose en las diversas descripciones de constructos vectoriales previas en esta solicitud, una variedad de diferentes promotores, genes, terminadores o secuencias de DNA o sitios FRT podría usarse para poner en práctica este método de componentes. Los casetes de DNA que se muestran posteriormente podrían ensamblarse en un plásmido basado en pUC para métodos de aporte de DNA directos (tales como bombardeo de partículas) o en un vector binario para la transformación basada en Agrobacterium según se describe previamente.
4
B) Diseño de moléculas oligonucleotídicas quiméricas para la conversión orientada basada en quimeraplastia de un sitio FRT
Se muestran posteriormente ejemplos específicos de moléculas quiméricas que se usarían para modificar un solo nucleótido a fin de convertir el sitio FRT5 (ID SEC Nº 3) en un sitio FRT6 (ID SEC Nº 4) en constructos como los descritos anteriormente. Se muestra tanto la secuencia lineal de estas moléculas quiméricas como la forma activa predicha de la molécula (basada en las publicaciones anteriores de Yoon y otros y Cole-Strauss y otros). Los residuos de DNA se representan en mayúsculas, los residuos de RNA en minúsculas y el sitio que ha de modificarse (una sola diferencia de nucleótidos entre FRT5, ID SEC Nº 3, y FRT6, ID SEC Nº 4) está subrayado y en negrita. Se representan posteriormente dos ejemplos de quimeras que difieren en el número de residuos aguas abajo del sitio FRT5 (ID SEC Nº 4) que podrían incluirse en el diseño de moléculas quiméricas y que determinarían así la especificidad para la secuencia diana.
1. Secuencia lineal oligonucleotídica quimérica (la secuencia incluye seis residuos específicos para la diana aguas abajo del sitio FRT que se modifica en el constructo diana y debe convertir solo este sitio FRT5, ID SEC Nº 3, específico en un sitio FRT6, ID SEC Nº 4)
101
Conformación oligonucleotídica activa
5
2. Secuencia lineal oligonucleotídica quimérica (la secuencia contiene residuos específicos solo para secuencias en el sitio FRT y así debe convertir cualquier sitio FRT5, ID SEC Nº 3, en una molécula diana en un sitio FRT6, ID SEC Nº 4)
102
Conformación oligonucleotídica activa
6
Construcciones vectoriales y moléculas oligonucleotídicas quiméricas como las descritas anteriormente se generaron y se usaron en los experimentos.
C) Demostración de la conversión de un sitio FRT en otro
Se generan líneas de maíz transgénico estables con los constructos que se describen anteriormente o con otros relacionados transformando en los constructos y seleccionando sobre bialofós según se describe anteriormente. Tejidos que han de usarse para el aporte de quimeras se transfieren sobre medio que no contiene bialofós y los oligonucleótidos quiméricos se aportan a células de estos casos estables mediante bombardeo de partículas, junto con el co-suministro de PHP5096 que soporta un casete de expresión de FLP recombinasa funcional. En experimentos de control, solo se aportan moléculas quiméricas o solo PHP5096. Después de un tiempo suficiente para que las células se recuperen sin selección con bialofós, muestras de los casos bombardeados se evalúan con respecto a la expresión de GUS. Para aquellos casos bombardeados que contienen el constructo con el sitio FRT1 (ID SEC Nº 2) aguas abajo que no muestra expresión de GUS, una muestra de células equivalente se cultiva en placa y se hace crecer sobre medio con o sin selección con bialofós para determinar la sensibilidad al producto químico. Si las moléculas quiméricas son específicas para modificar solo el sitio FRT5 (ID SEC Nº 3), entonces no deben observarse diferencias en el número y el crecimiento de células entre tratamientos con o sin selección. Por lo demás, deben apreciarse crecimiento y recuperación reducidos.
D) Verificación molecular de la conversión estable de sitios FRT
DNA de las muestras que exhiben expresión de GUS se aísla, se amplifica mediante PCR si es necesario y se somete a secuenciación mediante métodos estándar a través de la región correspondiente a la conversión nucleotídica predicha. Una extensión suficiente de DNA se somete a secuenciación para cubrir toda la región introducida originalmente de DNA a fin de confirmar la conversión correcta y específica. Usar métodos estándar para PCR, análisis Southern y/o secuenciación de muestras que expresan y no expresan GUS establece la presencia o ausencia de fragmentos de DNA específicos antes de y después del aporte de moléculas quiméricas y FLP recombinasa, y así substancia las observaciones visuales y químicas realizadas anteriormente.
E) Utilidad de la conversión de sitios FRT basada en quimeraplastia en una estrategia de apilamiento transgénico para plantas
Se describe en la Figura 1 una estrategia potencial para combinar o apilar múltiples transgenes deseados en una posición genómica usando el sistema basado en FRT no idénticos de la presente invención. Aunque el apilamiento de genes puede alcanzarse sin el uso del método de conversión de FRT orientado descrito en este ejemplo 7, este último método extiende las capacidades del sistema permitiendo la conversión in vivo de sitos FRT para crear nuevos sitios, en vez de reintroducir nuevos sitios FRT mediante transformación. En el diagrama de la Figura 1, un sitio FRT con un asterisco junto a él indica que inicialmente fue creado para ser no funcional con respecto a la recombinación entre él y el sitio FRT equivalente sin asterisco, pero que durante la conversión con el sistema basado en quimeraplastia descrito aquí se hace capaz de recombinación con su homólogo sin asterisco equivalente. En el ejemplo específico presentado en la figura, esto facilitaría, por ejemplo, la retirada de un marcador seleccionable para que ya nunca estuviera presente o para permitir reutilizar el marcador seleccionable en transformaciones futuras. Así, este método también proporciona un mecanismo para reciclar marcadores seleccionables, que solo es posible al usar el sistema de FRT de la presente invención.
Análisis
Hasta la fecha, en las plantas, la principal aplicación del sistema FLP/FRT ha sido para la escisión de DNA (Lyznik y otros (1993) Nucleic Acid Res. 21:969-975). Por ejemplo, un gen tal como un marcador seleccionable flanqueado por sitios FRT se introduce en primer lugar en células de planta mediante uno de varios sistemas de transformación y se recuperan casos o plantas transgénicos estables a través de la selección apropiada. A continuación, para eliminar el gen marcador seleccionable, la proteína FLP se expresa en las células transitoriamente introduciendo un plásmido que porta un casete de expresión de FLP, siguiendo establemente la integración de un casete de expresión de FLP introducido, o cruzando plantas que portan el gen marcador seleccionable flanqueado por FRT con plantas que portan secuencias para y que expresan proteína FLP activa (Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/972.258 para "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase").
Un problema principal asociado con el desarrollo del sistema FLP/FRT para integrar genes en animales o plantas proviene del hecho de que la reacción de recombinación catalizada por FLP recombinasa de levadura es un proceso reversible (Sadowski (1995) en Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 51:53-91). Por ejemplo, después de la introducción de una secuencia de DNA flanqueada por sitios FRT orientados de forma similar en células de planta en presencia de FLP recombinasa que se expresa activamente, la recombinación debe conducir a la inserción de las nuevas secuencias de DNA en el sitio FRT endógeno. Sin embargo, con la expresión continuada de enzima FLP, la reacción inversa conduciría a la reescisión de las secuencias introducidas debido a la recombinación entre los sitios FRT idénticos. Puesto que la reacción es reversible, la integración y la escisión pueden continuar repetidamente hacia el equilibrio. A medida que las células se dividen y la concentración de substrato de DNA por célula disminuye, la probabilidad de integración disminuye, de modo que, en general, con tal de que se exprese proteína FLP activa, la reacción se conducirá hacia el estado no integrado. Para favorecer la integración, debe establecerse una situación que evite la reescisión una vez que se produce la integración. Se ha sugerido un número de estrategias, incluyendo limitar la duración de la actividad de FLP recombinasa a través de la expresión inducible o introduciendo directamente proteína o RNA de FLP en las células Sadowski (1995) en Progress on Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 51:53-91), pero hasta la fecha no se ha establecido un sistema de integración no aleatorio para plantas.
La presente invención describe el desarrollo de un nuevo sistema de orientación génica útil para plantas que utiliza la FLP recombinasa de levadura o una FLP recombinasa modificada diseñada para funcionar más eficazmente en ciertas especies de planta y nuevos sitios FRT no idénticos que pueden usarse para la integración de DNA no reversible direccional. Adicionalmente, se describe aquí un nuevo uso de tecnologías auxiliares tales como "quimeraplastia" que permiten la modificación in vivo o in vitro de secuencias de DNA, tales como sitios FRT, para ampliar adicionalmente la utilidad del sistema. Los datos proporcionados demuestran la integración estable satisfactoria de secuencias de DNA entre dos sitios FRT no idénticos previamente introducidos, en maíz. Se muestra además que las secuencias de DNA entre los sitios FRT pueden reemplazarse subsiguientemente por una segunda secuencia de DNA flanqueada por los mismos sitios FRT que la primera. Juntos, estos resultados demuestran que es posible introducir y recuperar pares de sitios FRT no idénticos en ciertas posiciones genómicas, que pueden seleccionarse posiciones genómicas deseables o preferidas para expresar secuencias de DNA de interés y que estas posiciones seleccionadas pueden usarse para reorientar otras secuencias de DNA de interés. Aparte de los beneficios obvios de poder integrar genes en el genoma de plantas, la presente invención proporcionar medios para facilitar la introducción de nuevos genes o secuencias de DNA en posiciones genómicas que se ha determinado previamente que son particularmente beneficiosas para la integración génica desde la perspectiva de proporcionar niveles adecuados de expresión estable del gen o los genes introducidos y no exhibir impactos perjudiciales sobre las características agrónomas incluyendo el rendimiento. Además, la invención proporciona un sistema por el que la integración de dos o más genes puede dirigirse a la misma posición genómica, proporcionando un mecanismo para el "apilamiento génico". Estos genes apilados pueden mantenerse a continuación y manipularse como un par estrechamente conectado de rasgos en programas de reproducción. Así, esta invención también proporciona un método mejorado para introducir, mantener y reproducir múltiples rasgos genéticos de interés, incluyendo rasgos agrónomos, genes comercialmente importantes u otros productos génicos heterólogos.
La invención proporciona además usar la característica de no recombinación de sitios FRT no idénticos para permitir la creación de un grupo de líneas "parentales", que están inicialmente bien caracterizadas para todos los parámetros de expresión y comportamiento deseados descritos anteriormente. Estas líneas sirven a continuación como la base para la introducción de nuevos rasgos en los mismos sitios predefinidos del genoma donde se introdujeron los genes iniciales. Necesitan generarse muchos menos casos, ya que la integración se produciría preferentemente en sitios que se muestra que se expresan bien y tienen un impacto negativo mínimo sobre el comportamiento.
Aunque la invención precedente se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de comprensión, será obvio que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Baszczynski, Christopher
\hskip2,9cm Bowen, Benjamin A.
\hskip2,9cm Peterson, David J.
\hskip2,9cm Tagliani, Laura A.
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<120> Composición y Métodos para la Modificación Genética de Plantas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 035718-158667
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/065.627
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1997-11-18
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Saccharomyces cerevisiae 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (14)...(21) región espaciadora
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (39)...(46) región espaciadora
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para amplificaciones por
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\hskip-.1em\dddseqskip
PCR 
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccatggctag cgaagttcct attccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttca 
\hfill
60 
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\hskip-.1em\dddseqskip
gatctcgag 
\hfill
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 69
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<212> DNA
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para amplificaciones por
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PCR 
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<223> (39)...(46) región espaciadora
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<400> 3
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ccatggctag cgaagttcct attccgaagt ttctattctt caaaaggtat aggaacttca 
\hfill
60 
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtactcgag 
\hfill
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 72
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<212> DNA
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para amplificaciones por
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PCR 
\hfill
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<220>
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<223> (36)...(49) región espaciadora
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccatggctag cgaagttcct attccgaagt tcctattctt caaaaagtat aggaacttca 
\hfill
60 
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\hskip-.1em\dddseqskip
gacgtcctcg ag 
\hfill
72 
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<210> 5
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<211> 72
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<212> DNA
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Descripción del Organismo Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para amplificaciones por
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PCR 
\hfill
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<220>
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<223> (39)...(46) región espaciadora
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<400> 5
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ccatggctag cgaagttcct attccgaagt tcctattctt caataagtat aggaacttca 
\hfill
60 
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ctagttctcg ag 
\hfill
72 
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Claims (37)

1. Un método para dirigir la inserción de una secuencia nucleotídica de interés a un sitio cromosómico específico dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende:
(a)
introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende la secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y
(b)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
2. Un método para situar sitios de integración preferidos dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende:
(a)
introducir en dicha célula de planta un sitio diana que comprende una secuencia nucleotídica flanqueada por sitios de recombinación no idénticos;
(b)
determinar el nivel de expresión de dicha secuencia nucleotídica; y
(c)
seleccionar una célula de planta que expresa dicha secuencia nucleotídica.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además:
(d)
introducir en la célula de planta de la etapa (c) un casete de transferencia, comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y
(e)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
4. Un método para determinar la actividad promotora en una célula de planta, que comprende:
(a)
introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica un gen marcador, estando flanqueado dicho casete de transferencia por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y
(b)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, en el que dicho casete de transferencia comprende además un gen marcador seleccionable.
6. Un método para minimizar o eliminar la expresión resultante de la integración aleatoria de secuencias de DNA en el genoma de una célula de planta, que comprende:
(a)
introducir en el genoma de la célula de planta una secuencia nucleotídica que comprende un sitio diana que comprende dos sitios de recombinación no idénticos, en donde dicho sitio diana está situado aguas abajo de un promotor fusionado a una secuencia de iniciación de la traducción ATG;
(b)
introducir un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes, en donde la secuencia de iniciación de la traducción ATG de dicha secuencia nucleotídica de interés se ha reemplazado por uno de los sitios de recombinación no idénticos correspondientes del sitio diana, y de una manera tal que después de la orientación satisfactoria, la secuencia nucleotídica de interés se sitúa en el marco de lectura correcto para formar una fusión traduccional entre la secuencia de iniciación traduccional ATG y la secuencia nucleotídica de interés; y
(c)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
7. Un método para seleccionar directamente células de planta transformadas que comprende:
(a)
introducir en los genomas de célula de planta un casete de transferencia, comprendiendo dichos genomas de célula de planta un sitio diana que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que comprende un primer sitio de recombinación no idéntico, una secuencia nucleotídica de interés y un segundo sitio de recombinación no idéntico, y comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica que codifica un gen marcador seleccionable no conectado operablemente a un promotor, en donde dicho casete de transferencia está flanqueado por dichos sitios de recombinación no idénticos primero y segundo; y
(b)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos, y hacer crecer dichas células de planta sobre un agente selectivo apropiado para recuperar células que expresan el marcador seleccionable.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho casete de transferencia comprende al menos una región de codificación adicional conectada operablemente a un tercer promotor que conduce la expresión en dicha célula de planta.
9. Un método para reducir la complicidad de integración de transgenes en un genoma de célula de planta, que comprende:
(a)
introducir en la célula de planta un casete de transferencia flanqueado por sitios de recombinación no idénticos, comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica de interés, comprendiendo dicho genoma de célula de planta un sitio diana que comprende sitios de recombinación no idénticos correspondientes;
(b)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos; y
(c)
seleccionar células de planta con patrones de integración simples en su genoma.
10. Un método para combinar múltiples casetes de transferencia en una posición en un genoma y una célula de planta, que comprende:
(a)
introducir en el genoma de la célula de planta un primer casete de transferencia que comprende al menos tres sitios de recombinación no idénticos, en donde al menos dos de dichos sitios de recombinación no idénticos, denominados aquí los sitios de reorientación primero y segundo, están en estrecha proximidad entre sí;
(b)
introducir en el genoma de la célula de planta un segundo casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los primeros sitios de reorientación de dicho primer casete de transferencia; y
(c)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en el primer sitio de reorientación.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el segundo casete de transferencia comprende un cuarto sitio de recombinación no idéntico.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que el segundo casete de transferencia comprende un marcador seleccionable.
13. Un método para combinar múltiples casetes de transferencia en una posición en un genoma de una célula de planta, comprendiendo dicho método:
(a)
introducir en la célula de planta un sitio diana que comprende al menos un primer y un segundo sitio de recombinación no idéntico;
(b)
introducir en la célula de planta un primer casete de transferencia que comprende en el siguiente orden el primero, un tercero y el segundo sitio de recombinación no idéntico, en donde los sitios de recombinación no idénticos primero y tercero del primer casete de transferencia flanquean una primera secuencia nucleotídica de interés;
(c)
proporcionar una primera recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos primero y segundo;
(d)
introducir en la célula de planta un segundo casete de transferencia que comprende al menos los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero, en donde los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero del segundo casete de transferencia flanquean una segunda secuencia nucleotídica de interés; y
(e)
proporcionar una segunda recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero.
14. Un método para retirar una secuencia nucleotídica de interés introducida en el genoma de una célula de planta, que comprende:
(a)
proporcionar dicha célula de planta, en la que dicha secuencia nucleotídica de interés está flanqueada por sitios de recombinación no idénticos;
(b)
introducir en la célula de planta una molécula oligonucleotídica de RNA-DNA quimérica capaz de reconocer y realizar una conversión de nucleótidos en uno de los sitios de recombinación no idénticos del casete de transferencia a fin de crear dos sitios de recombinación idénticos; y
(c)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la escisión de las secuencias entre los dos sitios de recombinación idénticos.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de dichos sitios de recombinación no idénticos es un sitio FRT, FRT mutante, LOX o LOX mutante.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que al menos uno de los sitios es un sitio FRT o un sitio FRT mutante.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho sitio FRT mutante es FRT5 (ID SEC Nº 3), FRT 6 (ID SEC Nº 4) o FRT7 ((ID SEC Nº 5).
18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 14, en el que proporcionar la recombinasa comprende transformar genéticamente la planta con un casete de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que codifica la recombinasa.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 12, 14 ó 15, en el que la recombinasa comprende FLP o Cre.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que al menos dicha primera o dicha segunda recombinasa comprende FLP o Cre.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, en el que la recombinasa se ha sintetizado usando codones preferidos de maíz.
22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula de planta es de una monocotiledónea.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la monocotiledónea es maíz.
24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la célula de planta es de una dicotiledónea.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la dicotiledónea es canola, Brassica, soja, girasol o algodón.
26. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha célula de planta está contenida en una planta.
27. Una célula de planta dicotiledónea o monocotiledónea que tiene incorporado establemente en su genoma:
(a)
un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por o que comprende al menos dos sitios de recombinación FRT no idénticos; o
(b)
al menos un primer y un segundo casete de transferencia, en donde:
(i)
dicho primer casete de transferencia comprende una primera secuencia nucleotídica de interés flanqueada por un primer y un segundo sitio de recombinación, en donde dicho primer y dicho segundo sitios de recombinación son no idénticos;
(ii)
dicho segundo casete de transferencia comprende una segunda secuencia nucleotídica de interés flanqueada por el segundo sitio de recombinación y un tercer sitio de recombinación, en donde dicho tercer sitio de recombinación es no idéntico a dicho primer y dicho segundo sitio de recombinación; y
(iii)
dicho segundo sitio de recombinación está compartido entre el primer y el segundo casete de transferencia, de modo que el genoma de la célula de planta comprende en el siguiente orden el primer sitio de recombinación, la primera secuencia nucleotídica de interés, el segundo sitio de recombinación, la segunda secuencia nucleotídica de interés y el tercer sitio de recombinación;
o
una célula de planta monocotiledónea que tiene establemente incorporado en su genoma un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por o que comprende al menos dos sitios de recombinación FRT no idénticos o dos sitios de recombinación LOX no idénticos, en donde dicha célula de planta es de una monocotiledónea.
28. Una célula de planta dicotiledónea de acuerdo con la reivindicación 27, célula que es de una planta de canola, Brassica, soja, girasol o algodón.
29. Una célula de planta monocotiledónea de acuerdo con la reivindicación 27, célula que es de una planta de maíz.
30. Una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 27, que tiene establemente incorporado en su genoma al menos un primer y un segundo casete de transferencia según se define en la parte (b), en donde al menos uno de dichos sitios de recombinación no idénticos es un sitio FRT, un sitio FRT mutante, un sitio LOX o un sitio LOX mutante.
31. Una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 30, en la que al menos uno de dichos sitios FRT mutantes es FRT5 (ID SEC Nº 3), FRT 6 (ID SEC Nº 4) o FRT7 ((ID SEC Nº 5).
32. Una planta transformada que comprende una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31.
33. Una semilla transformada de la planta de acuerdo con la reivindicación 32.
34. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que comprende además hacer crecer la célula hasta una planta.
35. Un método de acuerdo con la reivindicación 34, que comprende además polinizar la planta con polen de una planta de la misma cepa o una cepa diferente e identificar plantas resultantes con la característica fenotípica deseada.
36. Un método de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35, que comprende hacer crecer dos o más generaciones de plantas.
37. Un método de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36, que comprende además recoger semillas de dichas plantas.
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