ES2320350T3 - Procedimientos para detectar patogenos bacterianos. - Google Patents
Procedimientos para detectar patogenos bacterianos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2320350T3 ES2320350T3 ES04817984T ES04817984T ES2320350T3 ES 2320350 T3 ES2320350 T3 ES 2320350T3 ES 04817984 T ES04817984 T ES 04817984T ES 04817984 T ES04817984 T ES 04817984T ES 2320350 T3 ES2320350 T3 ES 2320350T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- solution
- sample
- microorganisms
- procedure
- container
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 80
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 50
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 170
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 44
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 28
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 27
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 22
- 239000012503 blood component Substances 0.000 claims description 21
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 16
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 16
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 12
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 80
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 53
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 29
- -1 tissue Substances 0.000 description 19
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 16
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 16
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 13
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 229960002798 cetrimide Drugs 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108010065152 Coagulase Proteins 0.000 description 7
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 6
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 6
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 6
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 6
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 6
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 6
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 6
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940053200 antiepileptics fatty acid derivative Drugs 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 4
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229910003481 amorphous carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIALAIQRYISUEV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]e Polymers CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO OIALAIQRYISUEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol monoethoxylate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCO)C=C1 JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 206010060968 Arthritis infective Diseases 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 206010007882 Cellulitis Diseases 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 206010012455 Dermatitis exfoliative Diseases 0.000 description 1
- 206010015988 Eyelid infection Diseases 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010035713 Glycodeoxycholic Acid Proteins 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N Glycodeoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710179002 Hemolytic toxin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920002701 Polyoxyl 40 Stearate Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 208000031650 Surgical Wound Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000004526 exfoliative dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N glycodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012092 latex agglutination test Methods 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000015688 methicillin-resistant staphylococcus aureus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000025 natural resin Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229950004053 octoxinol Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 206010030861 ophthalmia neonatorum Diseases 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099429 polyoxyl 40 stearate Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56938—Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un procedimiento para detectar Staphylococcus aureus en una muestra, caracterizado porque comprende: (a) mezclar una muestra que comprende un medio y microorganismos con una primera disolución que comprende un reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante en un recipiente, dichos microorganismos sospechosos de comprender Staphylococcus aureus; (b) separar dichos microorganismos de dicho medio y un volumen de dicha primera disolución y retirar dicho medio y el volumen de dicha primera disolución de dicho recipiente; (c) añadir una segunda disolución que comprende una disolución ácida y/o un tampón, un detergente y una sal a dicho recipiente para volver a suspender dichos microorganismos; y (d) detectar Staphylococcus aureus en la suspensión resultante de (c) usando un test de aglutinación.
Description
Procedimientos para detectar patógenos
bacterianos.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La presente invención se refiere a
procedimientos para la identificación de patógenos bacterianos
incluyendo Staphylococcus. Más concretamente, la presente
invención se refiere a la identificación de Staphylococcus
aureus en muestras.
El género Staphylococcus incluye al menos
20 especies diferentes. (Para una revision, véase Novick, R.P., The
Staphylococcus as a Molecular Genetic System, Capítulo 1, págs.
1-37 en MOLECULAR BIOLOGY OF THE STAPHYLOCOCCI, R.
Novick, Ed., VCH Publishers, Nueva York (1990)). Las especies se
diferencian entre sí en un 80% o más, por cinética de hibridación,
mientras que las cepas dentro de las especies son idénticas en al
menos un 90% por la misma técnica.
La especie Staphylococcus aureus es un
coco gram positivo, aerobio facultativo formador de agregados
considerado entre las especies más virulentas del género.
Staphylococcus aureus es un patógeno
ubicuo. (Véase, por ejemplo, Mims y col., MEDICAL MICROBIOLOGY,
Mosby-Year Book Europe Limited, Londres, Reino
Unido (1993)). Es un agente etiológico de una variedad de dolencias,
de gravedad variable entre leve y fatal. Unas pocas de entre las
dolencias más comunes causadas por infecciones de S. aureus
son quemaduras, celulitis, infecciones del párpado, envenenamiento
de alimentos, infecciones en las articulaciones, conjuntivitis
neonatal, osteomielitis, infecciones de la piel, infecciones de
heridas quirúrgicas, dermatitis exfoliativa, y síndrome de shock
tóxico. Staphylococcus aureus también produce enfermedades
más graves como neumonía, meningitis y bacteremia.
Cuando se introduce en un alimento,
Staphylococcus aureus puede producir una o más enterotoxinas
estafilocócicas. Si se ingieren, las enterotoxinas estafilocócicas
termoestables pueden producir síntomas de envenenamiento por
alimentos y una gama de otras enfermedades.
Staphylococcus aureus posee una pared
celular protectora que comprende una capa de peptidoglicano
reticulado. La pared celular es resistente a la fagocitosis, lo que
se cree es debido, en parte, a la producción de Proteína A sobre la
superficie celular. Staphylococcus aureus también produce
toxina hemolítica, que puede dañar los glóbulos rojos y las células
inmunes.
De acuerdo con lo mencionado, es claramente
evidente que es importante que los patógenos bacterianos como
Staphylococcus aureus se puedan identificar en muestras, y
que estos patógenos sean identificados tan rápidamente como sea
posible, de forma que los pacientes puedan ser tratados con rapidez.
A dicho fin, se han desvelado diferentes procedimientos para
detectar Staphylococcus aureus. Por ejemplo, la Patente de
los Estados Unidos 5.496.706 desvela un procedimiento para detectar
Staphylococcus aureus en una muestra. El procedimiento usa
anticuerpos anti-MRSA-230 para
detectar Staphylococcus aureus por medios de aglutinación
visible. Este procedimiento, sin embargo, es bastante caro.
Muchos laboratorios realizan un test de la
coagulasa en porta como procedimiento rápido y barato para la
presunta identificación de S. aureus. Este test se basa en
la observación de la aglutinación de una suspensión densa de
células de S. aureus en presencia de una gota de plasma sobre
un porta. La aglutinación va mediada por el enlace del fibrinógeno
con un receptor específico en la superficie de la bacteria,
denominado factor de aglutinación. Sin embargo, el test de la
coagulasa en porta tiene numerosos inconvenientes. Por ejemplo, de
10 a 15% de aislados de S. aureus producen resultados
negativos falsos, obligando a la confirmación de todos los
negativos en un test de la coagulasa en tubo. Un test de la
coagulasa en tubo es otro procedimiento de uso habitual para
identificar S. aureus. Este procedimiento, sin embargo,
requiere un periodo de incubación de 4 a 24 horas.
Además, los procedimientos de la PCR de ciclo
rápido en tiempo real pueden proporcionar resultados en treinta
(30) minutos y los procedimientos de hibridación in situ con
sonda como FISH pueden proporcionar resultados en noventa (90)
minutos. Sin embargo, estos procedimientos son caros, y/o requieren
mucho trabajo.
Además, el ensayo directo de botellas de cultivo
celular positivo usando tests en látex no se ha recomendado debido
a la escasa sensibilidad y especificidad del ensayo. Véase Spears,
D.J. y col., J. Clin. Microbiol. 36:1032-1034
(1998) y Slidex Staph Plus, 09760 C-GB, bioMerieux,
Inc. (2000). Así, hay una necesidad en la técnica de un medio
rápido, preciso y barato para detectar e identificar
Staphylococcus aureus.
También se puede hacer referencia a lo
siguiente: documento US-B-6.340.571,
que se refiere a anticuerpos específicos para Staphylococcus
aureus y uso de los mismos; documento
EP-A-0 323 331, que se refiere a un
reactivo para la detección de Staphylococcus aureus por
aglutinación; y van Griethuysen, A., y col., Journal of Clinical
Microbiology, 39, 2001, 86-89, que se titula
"International multicenter evaluation of latex agglutination tests
for identification of Staphylococcus aureus".
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un
procedimiento para detectar Staphylococcus aureus en una
muestra que es rápido, preciso y menos caro que los procedimientos
de la técnica anterior. El procedimiento comprende las etapas
de:
(a) mezclar una muestra que comprende un medio y
microorganismos con una primera solución en un recipiente, de los
microorganismos sospechosos de comprender Staphylococcus
aureus;
(b) separar los microorganismos del medio y del
volumen de la primera solución y eliminar el medio y el volumen de
la primera disolución del recipiente;
(c) añadir una segunda solución al recipiente
para volver a suspender los microorganismos; y
(d) detectar la presencia de Staphylococcus
aureus en la suspensión resultante de la etapa (c) usando un
test de aglutinación.
La presente invención también proporciona otro
procedimiento para detectar Staphylococcus aureus en una
muestra. Este procedimiento comprende las etapas de:
(a) preparar una muestra que comprende un medio,
microorganismos y plasma, suero, sangre o un componente de la
sangre, de los microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) mezclar la muestra con una primera
disolución en un recipiente;
(c) separar los microorganismos del medio, el
volumen de la primera disolución y el volumen de plasma, suero,
sangre o componente de la sangre y eliminar el medio, el volumen de
la primera disolución y el volumen de plasma, suero, sangre o
componente de la sangre del recipiente;
(d) añadir una segunda disolución al recipiente
para volver a suspender los microorganismos; y
(e) detectar la presencia de Staphylococcus
aureus en la disolución resultante de la etapa (d) usando un
test de aglutinación.
Los procedimientos anteriormente descritos
proporcionan un resultado definitivo en quince (15) minutos,
permitiendo que se pueda notificar al médico a cargo del paciente
la identificación de este importante patógeno.
Además, se pueden usar modificaciones de estos
procedimientos para evaluar la presencia de otras bacterias
patógenas que pueden expresar factores de virulencia idéntica o
similar a los de S. aureus.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado anteriormente, la presente
invención proporciona un procedimiento para detectar
Staphylococcus aureus en una muestra caracterizado porque
comprende:
(a) mezclar una muestra que comprende un medio y
microorganismos con una primera disolución que comprende un
reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante en un
recipiente, de los microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) separar los microorganismos del medio y del
volumen de la primera disolución y eliminar el medio y el volumen
de la primera disolución del recipiente;
(c) añadir una segunda disolución que comprende
una disolución ácida y/o un tampón, un detergente y una sal al
recipiente para volver a suspender los microorganismos; y
(d) detectar la presencia de Staphylococcus
aureus en la suspensión resultante de la etapa (c) usando un
test de aglutinación.
Las muestras que se pueden usar en este
procedimiento de la presente invención se pueden obtener de
cualquier fuente, incluyendo, pero sin limitación a, sangre,
productos sanguíneos, tejidos, ascites, medios de cultivo, fluidos
corporales, piel, pus, especímenes uro-genitales,
heces, alimentos, bebidas, productos cosméticos, productos
farmacéuticos, productos para el cuidado de la salud, superficies
como suelos y mesas, y partículas aéreas como polen y polvo. La
muestra será una muestra que sea sospechosa de tener
microorganismos, en particular, Staphylococcus aureus. La
muestra puede haber sido ya ensayada para la presencia de
microorganismos y haber dado un ensayo positivo para los
microorganismos. La muestra puede requerir la adición de un medio
antes de la etapa (a). La cantidad de medio a añadir, si se
necesita, sería dependiente del número estimado de microorganismos
en la muestra y puede ser establecida fácilmente por una persona
experta en la técnica.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El plasma, suero, sangre o componente de la
sangre se mezcla preferiblemente con la muestra y la primera
disolución en la etapa (a). Si el plasma, suero, sangre o
componente de la sangre se mezcla con la muestra y la primera
disolución, el volumen de plasma, suero, sangre o componente de la
sangre se separa junto con el medio y el volumen de la primera
disolución de los microorganismos y se eliminan del recipiente
durante la etapa (b). La muestra, por tanto, se puede obtener de
una fuente tal como sangre, productos sanguíneos, tejido, fluidos
corporales, piel, pus, etc., y por tanto ya incluye plasma, suero,
sangre o un componente de la sangre. En estos casos, el volumen de
plasma, suero, sangre o componente de la sangre se separa junto con
el medio y el volumen de la primera disolución de los
microorganismos y se elimina del recipiente durante la etapa
(b).
La etapa (a) proporciona que la muestra y la
primera disolución se mezclen en un recipiente y esto puede llevarse
acabo con una vortización breve del recipiente. Preferiblemente, el
recipiente es un tubo cónico.
La cantidad de muestra que se puede mezclar con
la primera disolución en la etapa (a) está comprendida entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml, preferiblemente, la
cantidad de muestra mezclada con la primera disolución en la etapa
(a) es aproximadamente de 5,0 ml.
La cantidad de la primera disolución que se
puede mezclar con la muestra en la etapa (a) está comprendida entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml. La primera disolución
preferiblemente comprende un reactivo alcalino. Los reactivos
alcalinos que se pueden usar con la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, etanolamina, fosfato trisódico, hidróxido
sódico e hidróxido potásico. La primera disolución puede comprender
también un detergente. Lo más preferible, la primera disolución
comprende un reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante.
Los detergentes que se pueden usar con la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, ácido cólico, Triton
X-100, ácido deoxicólico, cetrimida,
N-dodecilsulfobetaína, digitonina,
n-dodecil-\beta-D-maltósido,
ácido glicodeoxicólico, n-lauroilsarcosina, sulfato
de laurilo, saponina, monooletado de sorbitán polioxietilenado,
polietilenglicol
P-1,1,3,3-tetrametilbutilfenil éter,
y derivados polioxietilenados de ácidos grasos. Los agentes
quelantes que se pueden usar con la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, EGTA y EDTA.
En una forma de realización preferida, la
primera disolución comprende hidróxido sódico, Triton
X-100 y EDTA. Más concretamente, la primera
disolución comprende hidróxido sódico 0,2 N, Triton
X-100 al 1,0% y EDTA 1mM. La cantidad de esta
primera disolución que se puede mezclar con la muestra en la etapa
(a) está comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10
ml. Preferiblemente, la cantidad de esta primera disolución
mezclada con la muestra en la etapa (a) es aproximadamente de 5,0
ml.
En otra forma de realización preferida, la
primera disolución comprende una disolución ácida con un pH en el
intervalo entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 5,5.
Preferiblemente, la disolución ácida comprende acetato o citrato.
Además, la disolución ácida preferiblemente comprende uno o más de
los siguientes: un detergente, una sal, un agente quelante y un
alcohol. Se puede usar cualquiera de los detergentes y agentes
quelantes anteriormente mencionados aunque se prefiere que la
disolución ácida incluya uno de los detergentes cetrimida o
N-dodecilsulfobetaína.
El procedimiento anteriormente mencionado
proporciona la separación de los microorganismos del medio y del
volumen de la primera disolución y elimina el medio y el volumen de
la primera disolución del recipiente. Preferiblemente, los
microorganismos se pueden separar del medio y del volumen de la
primera disolución por centrifugación o filtración. Lo más
preferible, los microorganismos se separan del medio y del volumen
de la primera disolución centrifugando durante diez (10) minutos a
\geq 1,000 G para peletizar los microorganismos. Preferiblemente,
el medio es un medio de cultivo.
La etapa (c) del procedimiento anterior
proporciona la adición de una segunda disolución al recipiente para
volver a suspender los microorganismos. Una vez la segunda
disolución se ha añadido al recipiente, el recipiente debe
someterse a vortización.
La cantidad de la segunda disolución que se
puede añadir al recipiente en la etapa (c) está comprendida entre
aproximadamente 0,05 ml y aproximadamente 5 ml. Preferiblemente, la
segunda disolución comprende una disolución ácida y/o un tampón
como Tris, HEPES, MOPS y fosfato. Los tampones que se pueden usar
con la presente invención tienen un pKa en el intervalo entre
aproximadamente 5,0 y aproximadamente 9,0. Más preferiblemente, los
tampones que se pueden usar con la presente invención tienen un pKa
en el intervalo entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0.
Preferiblemente, la segunda disolución comprende
un detergente y/o una sal. Los detergentes que se pueden usar con
la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ácido cólico,
deoxiácido cólico, cetrimida,
N-docecilsulfobetaína, digitonina,
n-docecil-\beta-D-maltósido,
glicodeoxiácido cólico, n-lauroilsarcosina, sulfato
de laurilo, saponina, monooleato de sorbitán polioxietilenado,
polietilenglicol
P-1,1,3,3-tetrametilbutilfenil
éter, derivados polioxietilenados de ácidos grasos y Triton
X-100. Las sales que se pueden usar con la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, cloruro potásico, cloruro
sódico, cloruro magnésico, sulfato magnésico and coluro cálcico.
En una forma de realización preferida, la
segunda disolución comprende Tris, cloruro sódico y Tween 80. Más
concretamente, la segunda disolución comprende Tris 0,1 M (pH 7,2),
cloruro sódico 0,15 M y Tween 80 al 0,5%. La cantidad de esta
segunda disolución que se puede añadir al recipiente en la etapa (c)
está comprendida entre aproximadamente 0,05 ml y aproximadamente 5
ml. Preferiblemente, la cantidad de esta segunda disolución añadida
al recipiente en la etapa (c) está comprendida entre aproximadamente
0,5 y aproximadamente 1,0 ml.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La etapa (d) del procedimiento anterior
proporciona detectar la presencia de Staphylococcus aureus en
la suspensión resultante de la etapa (c). Esto se consigue
preferiblemente usando un test de aglutinación como el test Slidex
Staph Plus. Preferiblemente, de 20 a 40 \mul de la suspensión
resultante de la etapa (c) se añade a una gota del control y a
continuación se ensaya usando un test Slidex Staph Plus.
Alternativamente, se puede usar un test Staphytect Plus de
Oxoid.
La presente invención también proporciona otro
procedimiento para detectar Staphylococcus aureus en una
muestra. Este procedimiento comprende las etapas de:
(a) preparar una muestra que comprende un medio,
microorganismos y plasma, suero, sangre o un componente de la
sangre, de los microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) mezclar la muestra con una primera
disolución que comprende un reactivo alcalino, un detergente y un
agente quelante en un recipiente;
(c) separar los microorganismos del medio, el
volumen de la primera disolución y el volumen de la plasma, suero,
sangre o componente de la sangre y eliminar el medio, el volumen de
la primera disolución y el volumen de plasma, suero, sangre o
componente de la sangre del recipiente;
(d) añadir una segunda disolución que comprende
una disolución ácida y/o un tampón, un detergente y una sal al
recipiente para volver a suspender los microorganismos; y
(e) detectar la presencia de Staphylococcus
aureus en la suspensión resultante de la etapa (d) usando un
test de aglutinación.
La etapa (a) proporciona la preparación de una
muestra que comprende un medio, microorganismos y plasma, suero,
sangre o un componente de la sangre. El tipo de muestra a ensayar
determinará cómo debe prepararse la muestra. Las muestras que se
pueden usar en los procedimientos de la presente invención se pueden
obtener de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitación a,
sangre, productos sanguíneos, tejido, ascites, medios de cultivo,
fluidos corporales, piel, pus, especímenes
uro-genitales, heces, alimentos, bebidas, productos
cosméticos, productos farmacéuticos, productos para el cuidado de
la salud, superficies como suelos y mesas, y partículas aéreas como
polen y polvo. La muestra será una muestra que sea sospechosa de
tener microorganismos, en concreto, Staphylococcus aureus.
La muestra puede haber sido ya ensayada para la presencia de
microorganismos y haber dado positivo para los microorganismos. La
muestra puede requerir la adición de un medio y/o la muestra puede
requerir la adición de plasma, suero, sangre o un componente de la
sangre. La cantidad de medio y/o plasma, suero, sangre o componente
de la sangre a añadir, si es necesario, será dependiente del número
estimado de microorganismos en la muestra y puede ser establecida
fácilmente por una persona experta en la técnica.
La etapa (b) proporciona que la muestra y la
primera disolución se mezclen en un recipiente y esto se puede
llevar a cabo sometiendo brevemente el recipiente a vortización. El
recipiente es preferiblemente un tubo cónico.
La cantidad de muestra que se puede mezclar con
la primera disolución en la etapa (b) está comprendida entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml. Preferiblemente, la
cantidad de muestra mezclada con la primera disolución en la etapa
(b) es aproximadamente de 5,0 ml.
La cantidad de la primera disolución que se
puede mezclar con la muestra en la etapa (b) está comprendida entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml. La primera disolución
preferiblemente comprende un reactivo alcalino. Los reactivos
alcalinos que se pueden usar con la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, etanolamina, fosfato trisódico, hidróxido
sódico e hidróxido potásico. La primera disolución puede también
comprender un detergente. Lo más preferible, la primera disolución
comprende un reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante.
Los detergentes que se pueden usar con la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, ácido cólico, Triton
X-100, deoxiácido cólico, cetrimida,
N-docecilsulfobetaína, digitonina,
n-docecil-\beta-D-maltósido,
glicodeoxiácido cólico, n-lauroilsarcosina, sulfato
de laurilo, saponina, monooleato de sorbitán polioxietilenado,
polietilenglicol
P-1,1,3,3-tetrametilbutilfenil éter
y derivados polioxietilenados de ácidos grasos. Los agentes
quelantes que se pueden usar con la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, EGTA y EDTA.
En una forma de realización preferida, la
primera disolución comprende hidróxido sódico, Triton
X-100 y EDTA. Más concretamente, la primera
disolución comprende hidróxido sódico 0,2 N Triton
X-100 al 1,0% y EDTA 1mM. La cantidad de esta
primera disolución que se puede mezclar con la muestra en la etapa
(b) está comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10
ml. preferiblemente, la cantidad de esta primera disolución
mezclada con la muestra en la etapa (b) es aproximadamente de 5,0
ml.
En otra forma de realización preferida, la
primera disolución comprende una disolución ácida con un pH en el
intervalo entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 5,5.
Preferiblemente, la disolución ácida comprende acetato o citrato.
Además, la disolución ácida preferiblemente comprende uno o más de
lo siguiente: un detergente, una sal, un agente quelante y un
alcohol. Se puede usar cualquiera de los detergentes y agentes
quelantes anteriormente mencionados aunque se prefiere que la
disolución ácida incluya uno de los detergentes cetrimida o
N-docecilsulfobetaína.
El procedimiento anterior proporciona separar
los microorganismos del medio, el volumen de la primera disolución
y el volumen de plasma, suero, sangre o componente de la sangre y
eliminar el medio, el volumen de la primera disolución y el volumen
de la plasma, suero, sangre o componente de la sangre del
recipiente. Preferiblemente, los microorganismos se pueden separar
del medio, el volumen de la primera disolución y el volumen de la
plasma, suero, sangre o componente de la sangre por centrifugación
o filtración. Lo más preferible, los microorganismos se separan del
medio, el volumen de la primera disolución y el volumen de la
plasma, suero, sangre o componente de la sangre centrifugando
durante diez (10) minutos a \geq 1.000 G para peletizar los
microorganismos. Preferiblemente, el medio es un medio de
cultivo.
La etapa (d) del procedimiento anterior
proporciona la adición de una segunda disolución al recipiente para
volver a suspender los microorganismos. Una vez que se ha añadido al
recipiente la segunda disolución, el recipiente debe someterse a
vortización.
La cantidad de la segunda disolución que se
puede añadir al recipiente en la etapa (d) está comprendida entre
aproximadamente 0,05 ml y aproximadamente 5 ml. Preferiblemente, la
segunda disolución comprende una disolución ácida y/o un tampón
como Tris, HEPES, MOPS y fosfato. Los tampones que se pueden usar
con la presente invención tienen un pKa en el intervalo entre
aproximadamente 5,0 y aproximadamente 9,0. Más preferiblemente, los
tampones que se pueden usar con la presente invención tienen un pKa
en el intervalo entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0.
Preferiblemente, la segunda disolución comprende
un detergente y/o una sal. Los detergentes que se pueden usar con
la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ácido cólico,
deoxiácido cólico, cetrimida,
N-docecilsulfobetaína, digitonina,
n-docecil-\beta-D-maltósido,
glicodeoxiácido cólico, n-lauroilsarcosina, sulfato
de laurilo, saponina, monooleato de sorbitán polioxietilenado,
polietilenglicol
P-1,1,3,3-tetrametilbutilfenil
éter, derivados polioxietilenados de ácidos grasos and Triton
X-100. Las sales que se pueden usar con la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, cloruro potásico, cloruro
sódico, cloruro magnésico, sulfato magnésico and coluro cálcico.
En una forma de realización preferida, la
segunda disolución comprende Tris, cloruro sódico y Tween 80. Más
concretamente, la segunda disolución comprende Tris 0,1 M (pH 7.2),
cloruro sódico 0,15 M y Tween 80 0,5%. La cantidad de esta segunda
disolución que se puede añadir al recipiente en la etapa (d) está
comprendida entre aproximadamente 0,05 ml y aproximadamente 5 ml.
Preferiblemente, la cantidad de esta segunda disolución añadida al
recipiente en la etapa (d) está comprendida entre aproximadamente
0,5 y aproximadamente 1,0 ml.
La etapa (e) del procedimiento anterior
proporciona detectar la presencia de Staphylococcus aureus en
la suspensión resultante de la etapa (d). Esto se lleva a cabo
preferiblemente usando un test de aglutinación tal como el test
Slidex Staph Plus. Preferiblemente, de 20 a 40 \mul de la
suspensión resultante de la etapa (d) se añade a una gota del
control y a continuación se ensaya usando un test Slidex Staph Plus
test. Alternativamente se puede usar un test Staphytect Plus de
Oxoid.
La presente invención también proporciona otro
procedimiento para detectar Staphylococcus aureus en una
muestra. Este procedimiento comprende las etapas de:
(a) mezclar una muestra que comprende un medio,
un adsorbente y microorganismos con una primera disolución en un
recipiente, de los microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) separar adsorbente y microorganismos del
medio y el volumen de la primera disolución y eliminar el medio y
el volumen de la primera disolución del recipiente;
(c) añadir una segunda disolución al recipiente
para volver a suspender el adsorbente y los microorganismos; y
(d) detectar Staphylococcus aureus en la
suspensión resultante de la etapa (c) usando un test de
aglutinación.
Las muestras que se pueden usar en este
procedimiento de la presente invención se puede obtener de cualquier
fuente incluyendo, pero sin limitación a, sangre, productos
sanguíneos, tejido, ascites, medios de cultivo, fluidos corporales,
piel, pus, especímenes uro-genitales, heces,
alimentos, bebidas, productos cosméticos, productos farmacéuticos,
productos para el cuidado de la salud, superficies como suelos y
mesas, y partículas aéreas como polen y polvo. La muestra será una
muestra que sea sospechosa de tener microorganismos, en particular,
Staphylococcus aureus. La muestra puede haber sido ya
ensayada para la presencia de microorganismos y haber dado positivo
para los microorganismos. La muestra puede requerir la adición de un
medio antes de la etapa (a) y/o la muestra puede requerir la
adición de un adsorbente antes de la etapa (a). La cantidad de
medio y/o adsorbente a añadir, si fuera necesario, sería dependiente
del número estimado de microorganismos en la muestra y puede
determinarse fácilmente por una persona experta en la técnica.
El plasma, suero, sangre o componente de la
sangre se mezcla preferiblemente con la muestra y la primera
disolución en la etapa (a). Si el plasma, suero, sangre o
componente de la sangre se mezclan con la muestra y la primera
disolución, el volumen de plasma, suero, sangre o componente de la
sangre se separan junto con el medio y el volumen de la primera
disolución de los microorganismos y se eliminan del recipiente
durante la etapa (b). La muestra, sin embargo, puede obtenerse de
una fuente como sangre, productos sanguíneos, tejido, fluidos
corporales, piel, pus, etc., y por tanto ya incluye plasma, suero,
sangre o un componente de la sangre. En esos casos, el volumen de
plasma, suero, sangre o componente de la sangre se separa junto con
el medio y el volumen de la primera disolución de los
microorganismos y se eliminan del recipiente durante la etapa
(b).
La etapa (a) proporciona que la muestra y
primera disolución se mezclen en un recipiente y esto se puede
llevar a cabo sometiendo brevemente el recipiente a vortización. El
recipiente es preferiblemente un tubo cónico.
El adsorbente se selecciona entre el grupo
constituido por óxido de aluminio, silicatos de aluminio hidratado
nativo coloidal, silicatos de aluminio alcalinos cristalinos
hidratados, sílice, crústulas silíceas, fragmentos de varias
especies de diatomeas, carbón amorfo, resinas de intercambio iónico,
adsorbentes 'de resina polimérica y resina de poliestireno
reticulada con divinil benceno.
La cantidad de muestra que se puede mezclar con
la primera disolución en la etapa (a) es de aproximadamente 0,1 ml
a aproximadamente 10 ml. Preferiblemente, la cantidad de muestra
mezclada con la primera disolución en la etapa (a) es
aproximadamente de 5,0 ml.
La cantidad de la primera disolución que se
puede mezclar con la muestra en la etapa (a) está comprendida entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml. La primera disolución
preferiblemente comprende un reactivo alcalino. Los reactivos
alcalinos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a,
etanolamina, fosfato trisódico, hidróxido sódico e hidróxido
potásico. La primera disolución puede también comprender un
detergente. Lo más preferible, la primera disolución comprende un
reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante. Los
detergentes que se pueden usar con la presente invención incluyen,
pero no se limitan a, ácido cólico, deoxiácido cólico, cetrimida,
N-docecilsulfobetaína, digitonina,
n-docecil-\beta-D-maltósido,
glicodeoxiácido cólico, n-lauroilsarcosina, sulfato
de laurilo, saponina, monooleato de sorbitán polioxietilenado,
polietilenglicol
P-1,1,3,3-tetrametilbutilfenil éter,
Triton X-100 y derivados polioxietilenados de ácidos
grasos. Los agentes quelantes que se pueden usar con la presente
invención incluyen, pero no se limitan a, EGTA y EDTA.
En una forma de realización preferida, la
primera disolución comprende hidróxido sódico, Triton
X-100 y EDTA. Más concretamente, la primera
disolución comprende hidróxido sódico 0,2 N, Triton
X-100 al 1,0% y EDTA 1 mM. La cantidad de esta
primera disolución que se puede mezclar con la muestra en la etapa
(a) está comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10
ml. Preferiblemente, la cantidad de esta primera disolución
mezclada con la muestra en la etapa (a) es aproximadamente de 5,0
ml.
En otra forma de realización preferida, la
primera disolución comprende una disolución ácida con un pH en el
intervalo entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 5,5.
Preferiblemente, la disolución ácida comprende acetato o citrato.
Además, la disolución ácida preferiblemente comprende uno o más de
lo siguiente: un detergente, una sal, un agente quelante y un
alcohol. Se puede usar cualquiera de los detergentes y agentes
quelantes anteriormente mencionados aunque se prefiere que la
disolución ácida incluya uno de los detergentes cetrimida o
N-docecilsulfo-
betaína.
betaína.
El procedimiento anterior proporciona separar el
adsorbente y los microorganismos del medio y el volumen de la
primera disolución y eliminar el medio y el volumen de la primera
disolución del recipiente. Preferiblemente, el adsorbente y los
microorganismos se pueden separar del medio y el volumen de la
primera disolución por centrifugación o filtración. Lo más
preferible, el adsorbente y los microorganismos se separan del medio
y el volumen de la primera disolución por centrifugación durante
diez (10) minutos a \geq 1.000 G para romper el adsorbente y los
microorganismos. Preferiblemente, el medio es un medio de
cultivo.
La etapa (c) del procedimiento anterior
proporciona añadir una segunda disolución al recipiente para volver
a suspender el adsorbente y los microorganismos. Una vez la segunda
disolución se ha añadido al recipiente, el recipiente debe
someterse a vortización.
La cantidad de la segunda disolución que se
puede añadir al recipiente en la etapa (c) está comprendida entre
aproximadamente 0,05 ml y aproximadamente 5 ml. Preferiblemente, la
segunda disolución comprende una disolución ácida y/o un tampón
como Tris, HEPES, MOPS y fosfato. Los tampones que se pueden usar
con la presente invención tienen un pKa en el intervalo entre
aproximadamente 5,0 y aproximadamente 9,0. Más preferiblemente, los
tampones que se pueden usar con la presente invención tienen un pKa
en el intervalo entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0.
Preferiblemente, la segunda disolución comprende
un detergente y/o una sal. Los detergentes que se pueden usar con
la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ácido cólico,
deoxiácido cólico, cetrimida,
N-docecilsulfobetaína, digitonina,
n-docecil-\beta-D-maltósido,
glicodeoxiácido cólico, n-lauroilsarcosina, sulfato
de laurilo, Triton X-100, saponina, monooleato de
sorbitán polioxietilenado, polietilenglicol
P-1,1,3,3-tetrametilbutilfenil éter
y derivados polioxietilenados de ácidos grasos. Las sales que se
pueden usar con la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, cloruro potásico, cloruro sódico, cloruro magnésico, sulfato
magnésico y coluro cálcico.
En una forma de realización preferida, la
segunda disolución comprende Tris, cloruro sódico y Tween 80. Más
concretamente, la segunda disolución comprende 0,1 M Tris (pH 7.2),
cloruro sódico 0,15 M y Tween 80 L 0,5%. La cantidad de esta
segunda disolución que se puede añadir al recipiente en la etapa (c)
está comprendida entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 ml.
Preferiblemente, la cantidad de esta segunda disolución añadida al
recipiente en la etapa (c) está comprendida entre aproximadamente
0,5 y aproximadamente 1,0 ml.
La etapa (d) del procedimiento anterior
proporciona detectar la presencia de Staphylococcus aureus en
la suspensión resultante de la etapa (c). Esto se lleva a cabo
preferiblemente usando un test en látex como el test Slidex Staph
Plus. Preferiblemente, de 20 a 40 \mul de la suspensión resultante
de la etapa (c) se añaden a una gota del control y a continuación
se ensaya usando un test Slidex Staph Plus. Alternativamente, se
puede usar un test Staphytect Plus de Oxoid.
Otra forma de realización de la presente
invención proporciona detectar Staphylococcus aureus en una
muestra mediante:
(a) preparar una muestra que comprende un medio
y microorganismos, los microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) mezclar la muestra con una primera
disolución en un recipiente;
(c) separar los microorganismos del medio y un
volumen de la primera disolución y eliminar el medio y el volumen
de la primera disolución del recipiente;
(d) añadir una segunda disolución al recipiente
para volver a suspender los microorganismos; y
(e) detectar la presencia de Staphylococcus
aureus en la suspensión resultante de la etapa (d) usando un
test de aglutinación.
En esta forma de realización, el plasma, suero,
sangre o componente de la sangre se puede añadir a la muestra en la
etapa (a) y separar y eliminar del recipiente en la etapa (c) junto
con el medio y el volumen de la primera disolución.
La etapa (a) proporciona la preparación de una
muestra que comprende un medio y microorganismos. El tipo de
muestra a ensayar determinará cómo se preparará la muestra. Las
muestras usadas en este procedimiento y en cualquier procedimiento
para detectar S. aureus de acuerdo con la presente invención
se pueden obtener de cualquier fuente incluyendo, pero sin
limitación a, sangre, productos sanguíneos, tejido, ascites, medios
de cultivo, fluidos corporales, piel, pus, especímenes
uro-genitales y heces. Las muestras se pueden
obtener para detección de alimentos y bebidas; de productos
cosméticos, farmacéuticos, y para el cuidado de la salud; de
superficies como suelos, mesas y similares; y de partículas aéreas,
como polen y polvo. La muestra será una muestra que sea sospechosa
de tener microorganismos, en particular, Staphylococcus
aureus. La muestra puede haber sido ya ensayada para la
presencia de microorganismos y haber dado positivo para
microorganismos. La muestra a preparar durante la etapa (a) incluye
medio. Si la muestra no tiene medio ninguno, se necesitará añadir
medio a la muestra durante la etapa (a). La cantidad de medio a
añadir a la muestra durante la etapa (a), si fuera necesario,
dependerá del número estimado de microorganismos en la muestra y
esto será fácilmente determinable por una persona experta en la
técnica.
La etapa (b) de esta forma de realización
proporciona que la muestra y primera disolución se mezclen en un
recipiente y esto se puede llevar a cabo sometiendo brevemente el
recipiente a vortización. El recipiente es preferiblemente un tubo
cónico. La cantidad de muestra que se puede mezclar con la primera
disolución en la etapa (b) es de aproximadamente 0,1 ml a
aproximadamente 10 ml. Preferiblemente, la cantidad de muestra
mezclada con la primera disolución en la etapa (b) es
aproximadamente de 5,0 ml. La cantidad de la primera disolución que
se puede mezclar con la muestra en la etapa (b) está comprendida
entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml. La primera
disolución preferiblemente comprende un reactivo alcalino. Los
reactivos alcalinos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan
a, etanolamina, fosfato trisódico, hidróxido sódico e hidróxido
potásico. La primera disolución puede también comprender un
detergente. Lo más preferible, la primera disolución comprende un
reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante. Se puede usar
cualquiera de los detergentes y agentes quelantes anteriormente
mencionados.
Se prefiere en esta forma de realización que la
primera disolución comprenda hidróxido sódico, Triton
X-100 y EDTA. Más concretamente, la primera
disolución comprende hidróxido sódico 0,2 N, Triton
X-100 al 1,0% y EDTA 1 mM. La cantidad de esta
primera disolución que se puede mezclar con la muestra en la etapa
(b) está comprendida entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10
ml. Preferiblemente, la cantidad de esta primera disolución
mezclada con la muestra en la etapa (b) es aproximadamente de 5,0
ml.
Alternativamente, la primera disolución puede
comprender una disolución ácida con un pH en el intervalo entre
aproximadamente 2,5 y aproximadamente 5,5. Preferiblemente, la
disolución ácida comprende acetato o citrato. Además, la disolución
ácida preferiblemente comprende uno o más de lo siguiente: un
detergente, una sal, un agente quelante y un alcohol. Se puede usar
cualquiera de los detergentes y agentes quelantes anteriormente
mencionados aunque se prefiere que la disolución ácida incluya uno
de los detergentes cetrimida o
N-docecilsulfobetaína.
Este procedimiento proporciona separar los
microorganismos del medio y el volumen de la primera disolución y
eliminar el medio y el volumen de la primera disolución del
recipiente. Preferiblemente, los microorganismos se pueden separar
del medio y el volumen de la primera disolución por centrifugación o
filtración. Lo más preferible, los microorganismos se separan del
medio y el volumen de la primera disolución por centrifugación
durante diez (10) minutos a \geq 1.000 G para peletizar los
microorganismos.
La etapa (d) de este procedimiento proporciona
añadir una segunda disolución al recipiente para volver a suspender
los microorganismos. Una vez la segunda disolución se ha añadido al
recipiente, el recipiente debe someterse a vortización. La cantidad
de la segunda disolución que se puede añadir al recipiente en la
etapa (d) está comprendida entre aproximadamente 0,05 ml y
aproximadamente 5 ml. Preferiblemente, la segunda disolución
comprende una disolución ácida y/o un tampón como Tris, HEPES, MOPS
y fosfato. Los tampones que se pueden usar con la presente
invención tienen un pKa en el intervalo entre aproximadamente 5,0 y
aproximadamente 9,0. Más preferiblemente, los tampones que se
pueden usar con la presente invención tienen un pKa en el intervalo
entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0. Preferiblemente,
la segunda disolución comprende un detergente y/o una sal. Se puede
usar cualquiera de los detergentes y sales anteriormente
mencionados
Se prefiere que la segunda disolución comprenda
Tris, cloruro sódico y Tween 80. Más concretamente, la segunda
disolución comprende Tris 0,1 M (pH 7,2), cloruro sódico 0,15 M y
Tween 80 al 0,5%. La cantidad de esta segunda disolución que se
puede añadir al recipiente en la etapa (d) está comprendida entre
aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 ml. Preferiblemente, la
cantidad de esta segunda disolución añadida al recipiente en la
etapa (d) está comprendida entre aproximadamente 0,5 y
aproximadamente 1,0 ml.
La etapa (e) del procedimiento anterior
proporciona detectar la presencia de Staphylococcus aureus en
la suspensión resultante de la etapa (d). Esto se realiza
preferiblemente usando un test en látex tal como el test Slidex
Staph Plus. Preferiblemente, de 20 a 40 \mul de la suspensión
resultante de la etapa (d) se añaden a una gota del control y a
continuación se ensaya usando un test Slidex Staph Plus.
Alternativamente, se puede usar un test Staphytect Plus de
Oxoid.
El término "adsorbente" tal como se usa en
los procedimientos de la presente invención se selecciona
preferiblemente del grupo anteriormente proporcionado, sin embargo,
para los objetivos de esta solicitud, el término "adsorbente"
incluye todos los materiales adsorbentes que neutralizan, enlazan, e
inhiben sustancias antimicrobianas. Estos adsorbentes incluyen
resinas según se definen en la Patente de los Estados Unidos
4.632.902, y adsorbentes no resinosos.
El término "resina" tal como se usa en el
presente documento es un subtipo de adsorbentes, y además se define
para incluir resinas naturales y sintéticas, por ejemplo, ion
resinas de intercambio iónico, adsorbentes de resinas poliméricas
no funcionales y, en particular, resinas de poliestireno reticuladas
con divinilbenceno.
Los "adsorbentes no resinosos" tal como se
usa en el presente documento son otro subtipo de adsorbentes y se
definen como adsorbentes no resinosos y tamices moleculares
naturales y sintéticos que se pueden usar para clarificar,
desodorizar, decolorar y filtrar. Algunos de estos adsorbentes no
resinosos son los mismos que los usados en la producción de
antibióticos para retirar los antibióticos del medio de cultivo en
el que crecen las bacterias que producen los antibióticos.
Estos adsorbentes no resinosos incluyen varias
formas de 1) óxido de aluminio (alúmina), 2) silicatos de aluminio
hidratado nativo coloidal (arcillas), como bentonita, caolín, y
tierra de Fuller, 3) silicatos de aluminio alcalinos cristalinos
hidratados (zeolitas de sodio o calcio), 4) sílice (gel de sílice,
perlas de sílice) como Davisil, 5) frústulas silíceas y fragmentos
de varias especies de diatomeas (tierra de infusorios, tierra de
diatomeas) como Celite® (Manville Products Corporation, Denver,
Colo., EEUU) y 6) carbón amorfo (en particular, carbón activado)
como Carboraffin, Norit® (American Norit Company Inc., Jacksonville,
Fla., EEUU), Opocerbyl, y Ultracarbon. También se puede usar como
adsorbente el carbón activado natural, que se ha usado para evitar
los efectos letales de la oxidación en medio de transporte y medio
de crecimiento. Este medio se ha usado también para el transporte
de organismos peligrosos como Neisseria gonorrhoeae y para el
cultivo de especies de Legionella. Los adsorbentes no
resinosos no requieren pretratamiento con un tensioactivo con el fin
de activarlos. El tratamiento con tensioactivos puede incluso
disminuir las capacidades de adsorción de estos materiales.
Muchos de estos adsorbentes no resinosos
eliminan sustancias antimicrobianas en cultivo. Los adsorbentes no
resinosos preferidos son silicatos de aluminio hidratado nativo
coloidal (arcillas), y los grupos de materiales adsorbentes de los
carbonos amorfos (carbón activado) Los materiales adicionalmente
preferidos son la tierra de Fuller o el carbón activado usados en
solitario o en combinación.
Las muestras usadas en los procedimientos para
detectar S. aureus de acuerdo con la presente invención
contienen medios. Preferiblemente, el medio es medio de cultivo y el
medio de cultivo puede incluir medios generalistas como el caldo de
soja tríptico, caldo de infusión de cerebro-corazón,
caldo de Columbia, y caldo de Brucella.
En las disoluciones primera y segunda se pueden
incluir tensioactivos o potenciadores de la absorción adecuados,
tal como se ha descrito brevemente con anterioridad. Otros
tensioactivos o potenciadores de la absorción adecuados que se
pueden usar en las disoluciones primera y segunda incluyen, por
ejemplo, acido oleico, derivados polioxietilenados de ácidos
grasos, ésteres parciales de sorbitol anhidro, como por ejemplo,
Tween 20, polioxil 40 estearato, polioxietileno 50 estearato,
fusiatos, sales biliares, octoxinol y sus combinaciones. Los
tensioactivos adecuados incluyen tensioactivos no iónicos,
aniónicos y catiónicos.
La presente invención se detalla además en el
siguiente Ejemplo que se ofrece a efectos de ilustración y que no
se pretende que limite la invención en forma alguna. Se utilizan
técnicas convencionales bien conocidas en la técnica o bien
técnicas específicas que se detallan a continuación.
Se inocularon botellas de cultivo de plástico
BacT/ALERT SA (bioMerieux, Inc.) con 10 ml de sangre humana normal
y uno de treinta y tres (33) aislados estafilocócicos (17 S.
aureus, 16 adicionales que son aislados no de S.
aureus). Las cepas de ensayo se identificaron usando un
instrumento VITEK 2 (bioMerieux, Inc.) y un ensayo de coagulasa en
tubo. Las muestras de caldo de las botellas positivas se mezclaron
con un volumen igual de una primera disolución (Disolución A) y se
centrifugaron para peletizar los microorganismos. El pelet se
volvió a suspender en un pequeño volumen de una segunda disolución
(Disolución B) y se ensayó con los reactivos en látex Slidex Staph
Plus. Las muestras de caldo (10 y 100 \mul) se ensayaron también
usando el ensayo de coagulasa en tubo. Una descripción más
detallada del procedimiento es como sigue:
1. Añadir 5 ml de una muestra procedente de una
botella BacT/ALERT SA positiva a 5 ml de Disolución A en un tubo
cónico.
2. Mezclar el contenido del tubo y centrifugar
durante 10 min a \geq 1.000G para peletizar los
microorganismos.
3. Eliminar todo el sobrenadante.
4. Volver a suspender completamente el pelet en
0,5-1,0 ml de Disolución B sometiendo el tubo a
vortización.
5. Añadir 20-40 \mul de la
suspensión bacteriana resultante a 1 gota del control y ensayo
usando los reactivos en látex Slidex Staph Plus (u otro kit
comercialmente disponible, por ejemplo, Staphytect Plus de
Oxoid).
6. Leer la reacción en el látex de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
La disolución A incluía NaOH 0,2N, Triton
X-100 al 1,0% y EDTA 1mM, y la Disolución B incluía
Tris 0,1M pH 7,2, NaCl 0,15M y Tween 80 al 0,5%. Otros compuestos
fuertemente básicos como etanolamina, hidróxido potásico y fosfato
trisódico se pueden sustituir por hidróxido sódico.
Los resultados de este experimento se muestran a
continuación en la Tabla 1. En particular, la Tabla 1 muestra los
resultados del ensayo directo de cultivos positivos de sangre SA con
el ensayo Slidex Staph Plus Latex. Las reacciones en látex se
clasificaron con una reactividad de 1+ a 4+ según se describe en las
instrucciones del fabricante.
Se prepararon también suspensiones a partir de
unas pocas cepas de of S. aureus y S. epidermidis
usando un procedimiento de centrifugación en dos etapas y un
procedimiento de centrifugación en cuatro etapas. Para el primer
procedimiento, se centrifugaron aproximadamente 7 ml de caldo, a
continuación se eliminó la parte superior, se añadió solución
salina y el caldo se centrifugó de nuevo y se volvió a suspender en
un pequeño volumen de solución salina. El Segundo procedimiento
implica preparar el pelet con solución salina seguido por dos
lavados con agua destilada, volviendo a suspender el pelet final en
solución salina. Los pelet del caldo de cada procedimiento de
centrifugación se ensayaron con los reactivos en látex Slidex Staph
Plus. La Tabla 2 muestra los resultados de una comparación directa
del procedimiento novedoso de la presente invención con los
procedimientos de centrifugación en 2 etapas y en 4 etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Como es evidente de las Tablas 1 y 2, las
reacciones positivas de S. aureus en látex fueron visibles
para todas las suspensiones de S. aureus preparadas usando
las soluciones descritas, pero no todas las cepas de S.
aureus ensayadas fueron no reactivas dando como resultado un
100% de sensibilidad y especificidad. Los resultados en látex
estuvieron disponibles en aproximadamente 15 minutos. Las
suspensiones de S. aureus preparadas usando el procedimiento
tradicional de centrifugación diferencial fueron negativas. Los
resultados en látex estuvieron completamente de acuerdo con los
resultados de coagulasa en tubo y VITEK 2.
El procedimiento descrito y usado en este
experimento proporciona un procedimiento rápido y barato para el
procesado de botellas de cultivo de sangre convencionales BacT/ALERT
con soluciones, mejorando espectacularmente la sensibilidad de un
test en látex rápido para S. aureus. El procedimiento
descrito permite confirmar S. aureus a los 15 minutos de
obtener el resultado de la cepa gran de una botella de cultivo de
sangre BacT/ALERT positiva y proporciona dirección para un ensayo
de susceptibilidad y en consecuencia ayudar a la recuperación del
paciente.
Claims (18)
1. Un procedimiento para detectar
Staphylococcus aureus en una muestra, caracterizado
porque comprende:
(a) mezclar una muestra que comprende un medio y
microorganismos con una primera disolución que comprende un
reactivo alcalino, un detergente y un agente quelante en un
recipiente, dichos microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) separar dichos microorganismos de dicho
medio y un volumen de dicha primera disolución y retirar dicho
medio y el volumen de dicha primera disolución de dicho
recipiente;
(c) añadir una segunda disolución que comprende
una disolución ácida y/o un tampón, un detergente y una sal a dicho
recipiente para volver a suspender dichos microorganismos; y
(d) detectar Staphylococcus aureus en la
suspensión resultante de (c) usando un test de aglutinación.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que de 0,1 a 10 ml de la dicha muestra se
mezclan con la dicha primera disolución en (a).
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que de 0,1 a 10 ml de la dicha primera
disolución se mezclan con la dicha muestra en (a).
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la dicha primera disolución comprende
hidróxido sódico, Triton X-100 y EDTA.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 en el que de 0,1 a 10 ml de la dicha primera
disolución se mezclan con la dicha muestra en (a).
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la dicha segunda disolución comprende
Tris, cloruro sódico y Tween 80.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6 en el que de 0,5 a 5 ml de la dicha segunda
disolución se añaden a dicho recipiente en (c).
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que plasma, suero, sangre o un componente de
la sangre se mezclan con la dicha muestra y la dicha primera
disolución en (a).
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el dicho test de aglutinación es un test
Slidex Staph Plus.
10. Un procedimiento para detectar
Staphylococcus aureus en una muestra caracterizado
porque comprende:
(a) preparar una muestra que comprende un medio,
microorganismos y plasma, suero, sangre o un componente de la
sangre, dichos microorganismos sospechosos de comprender
Staphylococcus aureus;
(b) mezclar la dicha muestra con una primera
disolución que comprende un reactivo alcalino, un detergente y un
agente quelante en un recipiente;
(c) separar dichos microorganismos de dicho
medio, un volumen de dicha primera disolución y un volumen de dicho
plasma, suero, sangre o componente de la sangre y retirar dicho
medio, el volumen de dicha primera disolución y el volumen de dicho
plasma, suero, sangre o componente de la sangre de dicho
recipiente;
(d) añadir una segunda disolución que comprende
una disolución ácida y/o un tampón, un detergente y una sal a dicho
recipiente para volver a suspender dichos microorganismos; y
(e) detectar la presencia de Staphylococcus
aureus en la suspensión resultante de (d) usando un test de
aglutinación.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que de 0,1 a 10 ml de la dicha muestra se
mezclan con la dicha primera disolución en (b).
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que de 0,1 a 10 ml de la dicha primera
disolución se mezclan con la dicha muestra en (b).
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que la dicha primera disolución comprende
hidróxido sódico, Triton X-100 y EDTA.
\newpage
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13 en el que de 0,1 a 10 ml de la dicha primera
disolución se mezclan con la dicha muestra en (b).
15. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que la dicha segunda disolución comprende
Tris, cloruro sódico y Tween 80.
16. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15 en el que de 0,05 a 5 ml de la dicha segunda
disolución se añaden a dicho recipiente en (d).
17. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que de 0,05 a 5 ml de la dicha segunda
disolución se añaden a dicho recipiente en (d).
18. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que el dicho test de aglutinación es un test
Slidex Staph Plus.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52792503P | 2003-12-09 | 2003-12-09 | |
| US527925P | 2003-12-09 | ||
| US57299704P | 2004-05-20 | 2004-05-20 | |
| US572997P | 2004-05-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2320350T3 true ES2320350T3 (es) | 2009-05-21 |
Family
ID=34704254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04817984T Expired - Lifetime ES2320350T3 (es) | 2003-12-09 | 2004-12-07 | Procedimientos para detectar patogenos bacterianos. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7387883B2 (es) |
| EP (1) | EP1695086B1 (es) |
| AT (1) | ATE423320T1 (es) |
| DE (1) | DE602004019564D1 (es) |
| ES (1) | ES2320350T3 (es) |
| WO (1) | WO2005059165A2 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8268579B2 (en) | 2008-01-24 | 2012-09-18 | Pilots Point Llc | Method and medium for detecting the presence or absence of pathogenic staphylococci in a first generation test sample |
| US8846336B2 (en) | 2009-06-27 | 2014-09-30 | Pilots Point Llc | Test mixtures for detecting the presence or absence of target microbes |
| WO2010151764A1 (en) * | 2009-06-27 | 2010-12-29 | Pilots Point Llc | Method and reagents for detecting the presence or absence of staphylococcus aureus in a test sample |
| EP2333105A1 (en) | 2009-12-08 | 2011-06-15 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Selective lysis of cells |
| US8524468B2 (en) * | 2009-12-22 | 2013-09-03 | Pilots Point Llc | Method for detecting the presence or absence of methicillin resistant staphylococcus aureus (MRSA) in a test sample |
| US20110275114A1 (en) * | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Edberg Stephen C | Method and medium for detecting the presence or absence of methicillin resistant staphylococcus aureus (mrsa) in a test sample |
| KR102535489B1 (ko) | 2014-06-13 | 2023-05-22 | 큐-리네아 에이비 | 미생물 검출 방법 및 특성 규명 방법 |
| GB201507026D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Linea Ab Q | Medical sample transportation container |
| GB2554767A (en) | 2016-04-21 | 2018-04-11 | Q Linea Ab | Detecting and characterising a microorganism |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4164449A (en) * | 1977-11-03 | 1979-08-14 | J. K. And Susie L. Wadley Research Institute And Blood Bank | Surface separation technique for the detection of microbial pathogens |
| AU543007B2 (en) * | 1980-04-15 | 1985-03-28 | Technicon Instruments Corportion | Agglutination immunoassay |
| US4632902A (en) * | 1981-08-20 | 1986-12-30 | Becton, Dickinson And Company | Method for detecting biological activity in a body fluid |
| US4617264A (en) * | 1983-11-04 | 1986-10-14 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Pretreatment method and composition |
| US4665024A (en) * | 1984-10-01 | 1987-05-12 | Becton, Dickinson And Company | Fluorescent gram stain |
| FR2625321B1 (fr) * | 1987-12-24 | 1992-10-02 | Pasteur Institut | Reactif pour le diagnostic de staphylococcus aureus par agglutination |
| US6277570B1 (en) * | 1993-04-13 | 2001-08-21 | Naxcor | Nucleic acid sequence detection employing probes comprising non-nucleosidic coumarin derivatives as polynucleotide-crosslinking agents |
| US5496706A (en) * | 1993-12-17 | 1996-03-05 | Helsinki University Licensing, Ltd. | Methods and materials for the detection of Staphylococcus aureus |
| ES2323161T3 (es) * | 1994-06-24 | 2009-07-08 | Innogenetics N.V. | Deteccion, identificacion y diferenciacion simultaneas de especies de mycobacterium utilizando un ensayo de hibridacion. |
| US20020055101A1 (en) | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US5708160A (en) * | 1995-04-26 | 1998-01-13 | The National Research Council | HSP-60 genomic locus and primers for species identification |
| US6936259B2 (en) * | 1995-06-08 | 2005-08-30 | University Of Saskatchewan | CAMP factor of Streptococcus uberis |
| US6737248B2 (en) | 1996-01-05 | 2004-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences |
| JP3957338B2 (ja) * | 1996-02-23 | 2007-08-15 | 株式会社カイノス | 診断薬 |
| FR2746398B1 (fr) * | 1996-03-21 | 1998-04-30 | Bio Merieux | Anticorps specifique de staphylococcus aureaus, et utilisations |
| US6022682A (en) * | 1996-08-14 | 2000-02-08 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Article and method for detection of enterotoxigenic staphylococci |
| US5837482A (en) | 1997-01-23 | 1998-11-17 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Culture medium and methods for detecting staphylococci |
| JPH10339731A (ja) * | 1997-06-06 | 1998-12-22 | Mitsubishi Chem Corp | 腸管出血性大腸菌感染の検出方法 |
| US20020086289A1 (en) | 1999-06-15 | 2002-07-04 | Don Straus | Genomic profiling: a rapid method for testing a complex biological sample for the presence of many types of organisms |
| US6372895B1 (en) | 2000-07-07 | 2002-04-16 | 3M Innovative Properties Company | Fluorogenic compounds |
| ES2281520T3 (es) | 2001-03-15 | 2007-10-01 | Jacques Schrenzel | Deteccion de staphylococcus aureus resistente a meticilina (sarm). |
| FR2822847B1 (fr) | 2001-03-30 | 2003-05-09 | Bio Merieux | Milieux de detection specifique de staphylococcus aureus et procede d'identification et/ou de denombrement utilisant de tels milieux |
-
2004
- 2004-12-07 WO PCT/US2004/040944 patent/WO2005059165A2/en not_active Ceased
- 2004-12-07 DE DE602004019564T patent/DE602004019564D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-12-07 ES ES04817984T patent/ES2320350T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-12-07 EP EP04817984A patent/EP1695086B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-12-07 US US11/005,668 patent/US7387883B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-12-07 AT AT04817984T patent/ATE423320T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7387883B2 (en) | 2008-06-17 |
| EP1695086A2 (en) | 2006-08-30 |
| EP1695086B1 (en) | 2009-02-18 |
| ATE423320T1 (de) | 2009-03-15 |
| DE602004019564D1 (de) | 2009-04-02 |
| WO2005059165A3 (en) | 2005-09-29 |
| WO2005059165A2 (en) | 2005-06-30 |
| US20050124026A1 (en) | 2005-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7429464B2 (en) | Methods for detecting bacterial pathogens | |
| Tung et al. | A bone sialoprotein-binding protein from Staphylococcus aureus: a member of the staphylococcal Sdr family | |
| ES2256028T3 (es) | Deteccion e identificacion de cepas bacterianas. | |
| JP5684569B2 (ja) | 微生物濃縮プロセス | |
| US20110183398A1 (en) | Microorganism-capturing compositions and methods | |
| ES2320350T3 (es) | Procedimientos para detectar patogenos bacterianos. | |
| KR102136694B1 (ko) | 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법 | |
| WO2002015964A1 (fr) | Materiau adsorbant une toxine bacterienne, procede d'elimination de la toxine par adsorption, et dispositif d'adsorption forme par remplissage du materiau adsorbant | |
| RU2470307C1 (ru) | Способ определения наличия протективного антигена сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией | |
| Kazuyama et al. | A novel method for isolation of Chlamydia pneumoniae by treatment with trypsin or EDTA | |
| US7425411B2 (en) | Method for recovering microorganisms from a sample | |
| ES2274388T3 (es) | Procedimiento para la preparacion de muestras de ensayo. | |
| RU2387715C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЕ ДНК, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ Р6, Р7, Р8, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ В ОТНОШЕНИИ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE И СЕЛЕКТИВНО-СВЯЗЫВАЮЩИХ IgA | |
| CN114994314A (zh) | 一种分离肺炎克雷伯氏菌的纳米磁珠基质试剂盒与应用 | |
| MEYER et al. | Surface properties of Staphylococcus saprophyticus: hydrophobicity, haemagglutination and Staphylococcus saprophyticus surface‐associated protein (Ssp) represent distinct entities | |
| CN107312714A (zh) | 用于中和培养基中的抗生素的方法 | |
| JP2006042743A (ja) | 細菌の回収方法 | |
| CN1742096A (zh) | 一种制备用于快速检测伤寒的凝集试剂的方法 | |
| US20160010144A1 (en) | Method for specifically isolating nucleic acids | |
| RU2244932C2 (ru) | Способ получения видоспецифического антигена chlamydia trachomatis для иммуноферментного анализа | |
| TW202444882A (zh) | 磁珠式核酸萃取系統 | |
| JP2023538876A (ja) | 生体物質中の感染性化合物を分離および／または検出および／または生体外で定量する方法 | |
| RU2614960C1 (ru) | Способ получения бифункционального аффинного сорбента для хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих | |
| RU2486524C1 (ru) | Способ определения летального фактора сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией | |
| Dunin-Wąsowicz et al. | Lyme neuroborreliosis (LNB)–clinical and diagnostic difficulties |