ES2320660T3 - Procedimientos para sintetizar peptidos limitados en la conformacion, peptidomimeticos y su utilizacion a modo de vacunas sinteticas. - Google Patents
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Abstract
Péptido que comprende una o más unidades de fórmula (II): ** ver fórmula** en la que Apro es (2S,4S)-4-aminoprolina.
Description
Procedimientos para sintetizar péptidos
limitados en la conformación, peptidomiméticos y su utilización a
modo de vacunas sintéticas.
La presente invención se refiere a
peptidomiméticos que están conformacionalmente restringidos debido a
una reticulación interna. Dicha reticulación se forma entre la
cadena lateral de un residuo o aminoácido o análogo y un residuo de
prolina (2S,4S)-4-funcionalizado. La
invención se refiere asimismo a la utilización de residuos de
prolina (2S,4S)-4-funcionalizados
como unidades constructivas en la síntesis de dichos
peptidomiméticos y a la utilización de los mismos como antígenos,
individualmente o en combinación con sistemas de administración
inmunopotenciadores adecuados, por ejemplo, virosomas de la gripe
reconstituidos inmunopotenciadores, a efectos de desencadenar una
respuesta inmune en un mamífero. Asimismo, la presente invención
también se refiere a composiciones que contienen dichos
peptidomiméticos. Por último, la presente invención se refiere a
procedimientos para preparar un anticuerpo utilizando los
peptidomiméticos anteriores, así como a un anticuerpo que se puede
obtener mediante dichos procedimientos.
Los nuevos conocimientos científicos y
tecnologías permiten identificar y localizar epítopes neutralizantes
esenciales de los microorganismos que causan infecciones y otras
enfermedades. A menudo, estas estructuras antigénicas se pueden
imitar utilizando pequeños péptidos o polipéptidos lineales, que
generalmente se designan peptidomiméticos. Dichos miméticos parecen
candidatos prometedores de cara a las estrategias de vacunación y
en el diseño de nuevas vacunas sintéticas.
Sin embargo, la conformación tiene un papel
clave en la capacidad de los péptidos para desencadenar respuestas
de anticuerpos contra las proteínas plegadas. A menudo, los péptidos
lineales desencadenan anticuerpos que se enlazan bien a proteínas
desnaturalizadas, pero reconocen menos frecuentemente los epítopes
conformacionales en las estructuras proteínicas nativas. En
general, estos péptidos son conformacionalmente más móviles, y en
consecuencia es improbable que adopten una estructura secundaria
estable en solución acuosa que corresponda al epítope
tridimensional sobre la superficie de una proteína.
A efectos de superar estas limitaciones, se
pueden incorporar restricciones conformacionales a la cadena
peptídica primaria, lo que reduciría el grado de flexibilidad
estructural. Si la conformación "congelada" de un péptido de
este tipo imita la estructura secundaria correspondiente del epítope
diana, el antígeno peptídico se puede utilizar para obtener
anticuerpos que potencialmente reaccionarán con estructuras
proteínicas que presenten dichos epítopes.
En la técnica anterior, se conocen diversos
enfoques para introducir restricciones conformacionales en una
cadena peptídica o polipeptídica lineal. Por ejemplo, la formación
de un puente entre dos aminoácidos adyacentes en un péptido provoca
una modificación conformacional local, limitándose su flexibilidad
en comparación con la de los péptidos habituales. Algunas
posibilidades para formar dichos puentes incluyen la incorporación
de lactamas y piperazinonas (para un estudio, véase Giannis y
Kolter, Angew. Chem. Int. Ed., 1993, 32: 1244).
Es posible establecer restricciones globales en
la conformación de un péptido limitando la flexibilidad de la hebra
del mismo mediante ciclización (Hruby et al, Biochem. J.,
268:249, 1990). Los métodos comunes de ciclización son los mismos
que se encuentran en los péptidos cíclicos de procedencia natural.
Dichos métodos incluyen la ciclización de cadena lateral a cadena
lateral o la ciclización de cadena lateral a grupo terminal. Otra
ciclización común es la ciclización terminal a terminal.
Otro enfoque conceptual a la restricción
conformacional de los péptidos fue el introducido por Gilon et
al, (Biopolymers, 31:745, 1991), que propusieron una ciclización
esqueleto a esqueleto de los péptidos. Las ventajas teóricas de
esta estrategia incluyen la capacidad de llevar a cabo la
ciclización a través de los carbonos o nitrógeno del esqueleto
peptídico sin interferir con las cadenas laterales, que pueden ser
cruciales para la interacción con el anticuerpo.
Otro enfoque en el diseño de peptidomiméticos
conformacionalmente restringidos, que se describe en la patente US
2004/0176283, consiste en enlazar una secuencia de aminoácidos corta
de interés a una "plantilla", a efectos de generar un
peptidomimético cíclico restringido. Dichos peptidomiméticos
cíclicos no sólo están estructuralmente estabilizados mediante sus
plantillas, ofreciendo de este modo conformaciones tridimensionales
que pueden limitar los epítopes conformacionales de virus y
parásitos, sino que además son más resistentes que los péptidos
lineales a la degradación proteolítica en suero.
La patente US 2004/0176283 da a conocer además
la síntesis de peptidomiméticos reticulados conformacionalmente
restringidos mediante la preparación de aminoácidos sintéticos para
el acoplamiento de esqueleto a aminoácidos colocados apropiadamente
a efectos de estabilizar la estructura supersecundaria de los
miméticos. La reticulación se puede alcanzar mediante acoplamiento
amídico del grupo amino primario de un residuo de
(2S,3R)-3-aminoprolina
ortogonalmente protegido a un grupo carboxilo de cadena lateral
apropiadamente colocado de glutamato. Se ha seguido este enfoque en
la preparación de repeticiones tetrapeptídicas conformacionalmente
restringidas de la proteína CS, en la que, como mínimo, una prolina
ha sido sustituida por
(2S,3R)-3-aminoprolina y, a efectos
de introducir un grupo carboxilo de cadena lateral, se ha
incorporado glutamato como sustitución para la alanina.
\newpage
En la técnica anterior, existen diversos
enfoques para utilizar análogos de prolina modificados para
incorporar restricciones conformacionales en los péptidos. Por
ejemplo, Zhang et al, J. Med Chem., 1996, 39:
2738-2744, describen la síntesis y el ensayo
biológico de diversos análogos cíclicos de la angiotensina II,
ciclizada entre las posiciones 5 y 7, a efectos de estudiar las
características conformacionales del reconocimiento molecular de la
angiotensina II. La ciclización se ha alcanzado formando enlaces
amina entre la
4-amino-trans-prolina
y los grupos carboxilo de cadena lateral de aspartato y glutamato,
por un lado, y mediante puentes disulfuro entre los residuos de
homocisteína y las
4-mercapto-trans/cis-prolinas.
Además, la
(2S,3R,4R)-diaminoprolina, como dicetopiperazina, se
ha incorporado a un mimético de bucle proteínico mediante síntesis
peptídica en fase sólida. Se puso de manifiesto mediante análisis
RMN que el mismo adoptaba una conformación estable de horquilla
beta en DMSO (Pfeifer y Robinson, Chem. Comm., 1998,
1977-1978).
Se podría afirmar que la vacunación es la
invención médica más exitosa, y que los programas de vacunación
global han dado resultados extraordinarios. Sin embargo, la
aparición de nuevas enfermedades infecciosas como amenaza global,
tal como el SIDA, y el retorno de enfermedades infecciosas que
parecían dominadas por la quimioterapia, tal como la tuberculosis y
la malaria, han dado lugar a una gran necesidad de desarrollo de
nuevas y sofisticadas vacunas.
En particular, la malaria constituye un
creciente problema sanitario en todo el tercer mundo. Varios cientos
de millones de personas sufren la enfermedad y su forma más aguda,
provocada por el parásito protozoario Plasmodium falciparum,
causa la muerte de más de un millón de niños al año sólo en
África.
Actualmente, no existe ninguna vacuna eficaz
contra el parásito, y los antiguos fármacos establecidos, tal como
la cloroquina, están perdiendo rápidamente su eficacia por culpa del
desarrollo de resistencia a los mismos. Por otro lado, la
investigación continua ha proporcionado muchos nuevos antígenos como
candidatos potenciales para el desarrollo de una vacuna contra la
malaria.
Se han identificado diversas dianas para
anticuerpos en el parásito de la malaria, siendo uno de los cuales
la proteína circumsporozoita (CS) presente sobre la superficie de
los esporozoitos tempranos (Potocnjak et al, J. Exp. Med.,
1980, 151: 1504-1513). La parte central de la
proteína CS (M_{r} = 44 kDa) contiene 41 repeticiones tándem de
un tetrapéptido, 37 de las cuales son
Asn-Ala-Asn-Pro y
cuatro de las cuales son
Asn-Val-Asp-Pro
(Godson et al, Nature, 1983, 305: 29-33; Dame
et al, Science, 1984, 225: 593-599).
Se puso de manifiesto que los péptidos NANP
repetidos en tándem lineales pueden provocar anticuerpos en ratones
y conejos que reconocen la proteína CS nativa y bloquean la invasión
por esporozoitos de los hepatocitos (Dame et al, Science,
1984, 225: 593-599; Ballou et al, Science,
1985, 228: 996-999; Young et al, Science,
1985, 228: 958-962; y Zavala et al, Science,
1985, 228: 1436-1440). Estos resultados eran una
exclusión a los estudios de vacunación en humanos con péptidos
(Asn-Ala-Asn-PrO)_{3}
sintéticos conjugados con la toxina del tétanos. Sin embargo, la
respuesta inmune no fue suficientemente intensa para que dichos
conjugados resultaran útiles como vacuna contra la malaria
(Herrington et al, Nature, 1987, 328: 257). A continuación,
se iniciaron una serie de estudios con el objetivo de optimizar la
respuesta inmune a los péptidos
(Asn-Ala-Asn-Pro)_{n}
(Etlinger et al, Eur. J. Immunol., 1991, 21:
1505-1511; Tam et al, J. Exp. Med., 1990,
171: 299-306; Pessi et al, Eur. J. Immunol.,
1991, 21: 2273-2276; y de Oliviera et al,
Vaccine, 1994, 12: 1012-1017).
Todos estos esfuerzos se deben considerar
teniendo en cuenta el hecho de que las conformaciones de las
repeticiones
(Asn-Ala-Asn-Pro) en
la proteína CS no se conocían y, por lo tanto, no se podían tener en
cuenta en el procedimiento de diseño. Parecía mucho más probable
que los péptidos cortos y lineales
(Asn-Ala-Asn-Pro)_{3}
estuvieran mayormente desestructurados en solución acuosa y fueran
susceptibles de sufrir una rápida degradación proteolítica en
suero. Un estudio posterior también sugirió que una parte
significativa de la respuesta inmune contra un péptido lineal
(Asn-Ala-Asn-Pro)_{3}
se dirige contra los extremos terminales de la cadena, que
evidentemente no están presentes en la proteína CS nativa (Etlinger
y Trzecjak, Phil. Trans. Roy. Soc. Lond. B, 1993, 340:
69-72). Aunque la estructura de la región de
repetición
(Asn-Ala-Asn-Pro) de
la proteína CS sigue sin conocerse, los estudios de modelos
sugieren que el motivo
(Asn-Pro-Asn-Ala-Asn)
puede adoptar un giro beta helicoidal, que se repite en tándem en
la proteína CS a efectos de generar una nueva estructura
supersecundaria. Los peptidomiméticos cíclicos de este motivo
(Asn-Pro-Asn-Ala-Asn)
se sintetizaron y se puso de manifiesto mediante RMN que adoptaban
giros helicoidales en solución acuosa (Pfeifer et al, Chimia,
2001, 55(4): 334-339).
Aplicando el enfoque de incorporar restricciones
conformacionales mediante reticulación interna, la patente USA
2004/0176283 describe la preparación de un peptidomimético
conformacionalmente restringido que corresponde a la región
repetitiva de tetrapéptido anteriormente mencionada de la proteína
CS. En una repetición quíntuple, un residuo de prolina ha sido
sustituido por
(2S,3R)-3-aminoprolina y, además, un
residuo de alanina ha sido sustituido por glutamato. A
continuación, la reticulación interna se ha alcanzado mediante
acoplamiento amídico entre el grupo amino primario de la unidad de
prolina modificada y el grupo carboxilo de cadena lateral del
glutamato.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
miméticos peptídicos y proteínicos presentan potencialmente un gran
valor en el diseño de vacunas sintéticas. Dichos miméticos deben
funcionar estimulando el sistema inmune a efectos de producir
anticuerpos que reconozcan el parásito intacto. Sin embargo, la
dificultad de presentar en un mimético los epítopes
conformacionales existentes en el antígeno nativo y que resultan
necesarios para dar respuestas protectoras de anticuerpos no se ha
superado completamente.
El documento EP 341603 da a conocer, entre
otros, compuestos circulares conformacionalmente restringidos que
comprenden una 4-tiometil-prolina
enlazada covalentemente a través de un enlace disulfuro a una
cisterna, a efectos de formar un enlace interno entre las cadenas
laterales de dichos aminoácidos.
Tanto Pfeiffer et al (2003), Angew. Chem.
Int. Ed. 42, 2368-2371, como Moreno et al
(2001), Chembiochem: A Europ. J. Chem. Biol. 2,
838-843, dan a conocer peptidomiméticos que
comprenden, entre otros,
(2S,3R)-3-aminoprolina.
Persiste la necesidad de encontrar nuevas rutas
para incorporar restricciones conformacionales a una cadena de
péptido lineal a efectos de congelar una conformación específica.
Dado que resulta imposible predecir con exactitud la conformación
final del péptido resultante, generalmente se requiere crear todo un
conjunto de péptidos restringidos con la misma secuencia primaria,
analizándose a continuación su capacidad de imitar un epítope de la
proteína antigénica. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un análisis
de este tipo analizando en los péptidos restringidos individuales
su reactividad frente a anticuerpos conocidos de dicha proteína
antigénica. En consecuencia, es necesario tener una variedad de
modos distintos para incorporar una restricción conformacional a un
péptido precursor disponible.
Sorprendentemente, se ha descubierto que los
péptidos conformacionalmente restringidos que se ciclizan a través
de un residuo de prolina sustituido con 4-amino, que
presentan una estereoquímica específica, da lugar a una estructura
tridimensional distinta y única para un péptido determinado. La
restricción conformacional se alcanza mediante una reticulación
interna entre un residuo de prolina modificado que presenta un grupo
funcional amino en la posición 4 y un grupo funcional de cadena
lateral espacialmente adyacente de un segundo residuo. El residuo
de prolina modificado con amino se caracteriza por una
estereoquímica (2S,4S).
Los peptidomiméticos cíclicos ciclizados
mediante residuos
(2S,4S)-4-aminoprolina proporcionan
una nueva clase de péptidos conformacionalmente restringidos que
parecen ser más estables en solución acuosa y, en consecuencia,
tienen una menor tendencia a la degradación en suero, por ejemplo
cuando se administran en forma de vacuna.
Las síntesis de peptidomiméticos que contienen
un residuo o residuos de
(2S,4S)-4-aminoprolina son mucho más
fácilmente accesibles que, por ejemplo, sus correspondientes
sustituidos en la posición 3, debido a una ruta sintética más corta
que comprende menos etapas individuales. Además, los materiales de
partida para sintetizar la unidad de
(2S,4S)-4-aminoprolina están
disponibles en grandes cantidades, ya que son sustancias estándar
que se pueden adquirir directamente a través de diversos
suministradores, por ejemplo, a través de Neosystem, 7 Rue de
Boulogne, 67100 Estrasburgo, Francia.
La incorporación de residuo de
(2S,4S)-4-aminoprolina en lugar, por
ejemplo, de una unidad de prolina sustituida en la posición 3, da
lugar a un péptido conformacionalmente restringido que presenta una
estructura peptídica tridimensional sustancialmente modificada.
Resulta sorprendente que este pequeño cambio en la estructura
química tenga un impacto tan grande en la conformación y en la
inmunogenicidad del péptido resultante del péptido.
Los aminoácidos y los residuos aminoácidos
descritos en la presente memoria se pueden designar de acuerdo con
el código de una o tres letras aceptado y referenciado en la
bibliografía bien conocida por los expertos en la materia, tal como
Stryer, Biochemistry, 4ª ed., Freeman and Co., Nueva York, 1995 y
Creighton, Proteins, 2ª ed., Freeman and Co., Nueva York, 1993.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
términos "péptido" y "polipéptido" se utilizan como
sinónimos y en su sentido más amplio, que se refiere a un compuesto
de dos o más residuos aminoácidos, o análogos de aminoácidos. Los
residuos aminoácidos pueden estar enlazados mediante enlaces
peptídicos, o alternativamente mediante otros enlaces, por ejemplo
éster, éter, etc. Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "aminoácido" o "residuo aminoácido" se refiere a
aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo las
formas enantioméricas D o L, y a análogos de aminoácidos.
El término "epítope" o "epítope de célula
B", tal como se utiliza en la presente memoria, designa el
componente estructural de una molécula que es responsable de las
interacciones específicas con las correspondientes moléculas de
anticuerpos (inmunoglobulina) desencadenadas por el mismo antígeno o
un antígeno relacionado. Más generalmente, el término se refiere a
un péptido que presenta las mismas propiedades inmunorreactivas, o
unas propiedades similares, tales como una afinidad específica de
enlazamiento de anticuerpos, que la proteína o péptido antigénicos
utilizados para generar el anticuerpo. Un epítope que se forma
mediante una secuencia peptídica específica se refiere generalmente
a cualquier péptido que reaccione con anticuerpos contra la
secuencia específica.
El término "antígeno", tal como se utiliza
en la presente memoria, se refiere a una molécula que se utiliza
para inducir la producción de anticuerpos. Alternativamente, el
término se utiliza para designar una molécula que reacciona con un
anticuerpo específico.
El término "inmunogen", tal como se utiliza
en la presente memoria, describe una entidad que induce la
producción de anticuerpos en un animal huésped. En algunos casos,
el antígeno y el inmunogen son una misma entidad, mientras que en
otros, las dos entidades son diferentes.
\newpage
El término "inmunopotenciador" se utiliza
en la presente memoria para referirse a un efecto favorecedor de
las funciones inmunes que puede tener lugar mediante la estimulación
de células efectoras inmunes y puede conducir a una mayor
resistencia a agentes infecciosos o parásitos.
El término "sintético", tal como se utiliza
en la presente memoria, se refiere a péptidos producidos mediante
un método químico tal como se ha descrito anteriormente, por
ejemplo.
El término "peptidomimético" se utiliza en
la presente memoria para designar un péptido o análogo de péptido
que imita biológicamente los determinantes activos en parásitos,
virus u otras biomoléculas.
El término "conformación", tal como se
utiliza en la presente memoria, designa las diversas disposiciones
tridimensionales no superponibles de los átomos que son
interconvertibles sin ninguna rotura de enlaces covalentes.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un péptido que comprende una o más unidades de fórmula
(II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Apro es
(2S,4S)-4-aminoprolina.
Los péptidos que comprenden una reticulación
interna entre una unidad de prolina
(2S,4S)-4-funcionalizada y un grupo
funcional de cadena lateral adecuado de un segundo residuo que imita
la estructura tridimensional, por ejemplo, de un epítope sobre la
superficie de una proteína antigénica, están conformacionalmente
restringidos.
Dichos péptidos, designados en lo sucesivo
peptidomiméticos, se caracterizan porque la reticulación interna
descrita anteriormente estabiliza una estructura supersecundaria
tridimensional del péptido.
Para formar dicha reticulación interna entre la
unidad de prolina modificada y la cadena lateral de otro residuo
aminoácido o análogo espacialmente adyacente, dicha cadena lateral
debe proporcionar un grupo funcional adecuado a efectos de permitir
la formación de un enlace químico estable entre ambos residuos. En
la fórmula (II), el residuo aminoácido es glutamato, y la
reticulación interna anteriormente mencionada se forma a través de
acoplamiento amídico con el residuo de
(2S,4S)-4-aminoprolina.
Los péptidos conformacionalmente restringidos
según la presente invención se parecen mucho a las conformaciones
tridimensionales que se encuentran en una proteína patógena intacta,
proporcionándose de este modo epítopes mejorados para la generación
de anticuerpos específicos de patógeno que reaccionan de forma
eficaz con dichos patógenos.
En otra forma de realización, el péptido según
la presente invención comprende una o más porciones de la proteína
circumsporozoita de la malaria (CS) de una especie de
Plasmodium, preferentemente Plasmodium falciparum.
La protección de los mamíferos, incluyendo el
hombre, frente a la infección por el agente etiológico de la
malaria, el Plasmodium, se puede alcanzar provocando una
respuesta inmune dirigida contra la proteína circumsporozoita (CS).
Se conocen cuatro especies de Plasmodium que infectan al
hombre. Se trata de las especies P. falciparum, P.
vivax, P. ovale y P. malariae. La proteína CS de
P. falciparum comprende aproximadamente 412 aminoácidos con
un peso molecular aproximado de 44.000. Comprende 41 repeticiones
en tándem de un tetrapéptido. Resultan preferentes los péptidos
sintéticos con una longitud de 5-20 residuos
derivados de la región repetitiva de la proteína CS del P.
falciparum.
Aunque la estructura tridimensional de la región
repetitiva de tetrapéptido en la proteína CS permanece desconocida,
estudios teóricos sugieren que es probable que la misma adopte una
conformación estable y repetitiva, posiblemente basada en giros
beta helicoidales, o estructuras similares. La presente invención da
a conocer péptidos para la imitación molecular de los epítopes
conformacionales de la proteína CS nativa de la malaria, que se
optimizan estructuralmente a efectos de producir anticuerpos
reactivos con una eficacia elevada.
En una forma de realización preferida de la
invención, el péptido comprende uno o más tetrapéptidos
seleccionados de entre el grupo constituido por
Asn-Pro-Asn-Ala,
Asn-Pro-Asn-Val,
Asp-Pro-Asn-Ala y
Asp-Pro-Asn-Val. Más
preferentemente, estos péptidos comprenden de 3 a 10, y de la forma
más preferida de 4 a 6, unidades tetrapeptídicas de este tipo.
La presente invención se refiere a
peptidomiméticos para la imitación molecular de los epítopes
conformacionales de la proteína CS de la especie Plasmodium,
preferentemente P. falciparum. Más preferentemente, el
péptido conformacionalmente restringido comprende
(Asn-Pro-Asn-Ala)_{n},
donde n es 2, 3, 4 ó 5.
Se puede analizar en modelos de estos
peptidomiméticos conformacionalmente restringidos la estabilidad y
la adopción de una estructura supersecundaria en simulaciones de
dinámica molecular (MD) en disolvente. La adopción de una
estructura supersecundaria por parte de estos peptidomiméticos
modelo puede evidenciar que sus estructuras son parecidas a la
conformación preferente de la región repetitiva de tetrapéptidos en
la proteína CS nativa. Además, se pueden examinar en los espectros
2D NOESY (espectroscopia de intensificación de efecto nuclear
Overhauser) de peptidomiméticos conformacionalmente restringidos las
conectividades entre los grupos NH peptídicos en los giros
helicoidales repetidos en tándem. Dichas conectividades ponen de
manifiesto la formación de giros helicoidales relativamente
estables en el contexto de una conformación de estructura
supersecundaria.
En una forma de realización más preferida, la
presente invención se refiere a péptidos en los que, como mínimo,
uno de dichos tetrapéptidos
Asn-Pro-Asn-Ala está
sustituido por
Asn-Pro-Asn-Glu, y
en los que el residuo glutamato de
Asn-Pro-Asn-Glu
forma una reticulación interna por acoplamiento amídico con
(2S,4S)-4-aminoprolina.
Resulta preferido que el péptido comprenda
esencialmente una repetición en tándem quíntuple de
(Asn-Pro-Asn-Ala)
de la proteína CS de P. falciparum, en la que la Pro de la
segunda repetición está sustituida por una unidad de
(2S,4S)-4-aminoprolina y la alanina
de la cuarta repetición está sustituida por glutamato (fórmula III,
designada en lo sucesivo UK39):
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Apro es
(2S,4S)-4-aminoprolina.
Mediante acoplamiento amídico, se forma una
reticulación interna que estabiliza una estructura que imita la
conformación nativa de epítopes de repetición en tándem de la
proteína CS.
Tal como se describe con mayor detalle en el
siguiente ejemplo, los estudios con modelos referidos al
peptidomimético UK39 (fórmula III) han puesto de manifiesto una
conformación única y distinta en comparación con el mimético
isomérico BP66, que difiere de UK39 únicamente en que la ciclización
se ha alcanzado a través de
(2S,3R)-3-aminoprolina. Debido a la
fácilmente accesible
(2S,4S)-4-aminoprolina, el UK39 (a
diferencia del BP66) se puede obtener mediante una ruta sintética
corta y estandarizada. Dado que el UK39 exige menos etapas de
síntesis individuales y los materiales de partida están catalogados
como sustancias estándar y, en consecuencia, están disponibles en
grandes cantidades, se pueden obtener fácilmente cantidades elevadas
de UK39 en comparación con la síntesis correspondiente del
BP66.
Asimismo, el UK39 presenta una tendencia a
degradarse en solución acuosa menor que su análogo o isomérico
BP66. Aparentemente, este hecho es debido a una ganancia de
estabilidad de la conformación.
Asimismo, el UK39 muestra una excelente
antigenicidad y eliminación de parásitos in vivo. En
comparación con el BP66, es un mimético mejor. Con respecto a la
reactividad frente a anticuerpos dirigidos contra P.
falciparum, se enlazan más anticuerpos a UK39 que a BP66.
La conformación específica que subyace a las
características beneficiosas mencionadas anteriormente está
esencialmente determinada por la estereoquímica y la posición del
grupo funcional amino reticulante en el anillo de prolina
modificado.
El experto en la materia comprenderá que las
moléculas polipeptídicas antigénicas mencionadas anteriormente se
pueden administrar con uno o más adyuvantes a efectos de favorecer
la respuesta inmunológica. Por ejemplo, en función de la especie
huésped, los adyuvantes que se pueden utilizar incluyen, aunque sin
limitarse a los mismos: sales minerales o geles minerales tales
como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de
calcio; sustancias activas de superficie, tales como lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite,
hemocianinas de lapa californiana y dinitrofenol; moléculas
inmunoestimulantes, tales como citoquinas, saponinas, dipéptidos de
muramilo y derivados tripeptídicos, dinucleótidos CpG,
oligonucleótidos CpG, monofosforilo lípido A, y polifosfazenos;
adyuvantes particulados y microparticulados, tales como emulsiones,
liposomas, virosomas, cocleatos; o un complejo inmunoestimulante de
adyuvantes mucosales, adyuvante de Freund (completo e incompleto) y
adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum).
En otra forma de realización, los péptidos según
la presente invención están acoplados a un fosfolípido.
Preferentemente, el terminal N de estos péptidos se acopla a través
de un linker, preferentemente un linker de dicarboxilato, más
preferentemente un linker de succinato, a un derivado de ácido graso
de la fosfatidiletanolamina, preferentemente la
1-palmitoil-3-oleoil-fosfatidiletanolamina
(PE, fórmula IV). Preferentemente, dicho derivado de ácido graso es
un monoéster o diéster de glicerol con uno o dos ácidos grasos
C_{10} a C_{30} que pueden presentar uno o más enlaces dobles,
y pueden ser idénticos o diferentes. Fórmula (IV):
Los péptidos según la presente invención se
pueden utilizar en el diseño de vacunas sintéticas. Los
peptidomiméticos funcionan estimulando el sistema inmune a efectos
de producir anticuerpos que reconocen el parásito intacto.
Preferentemente, dichos miméticos se presentan al sistema inmune de
un modo que conduce a una producción más eficaz de anticuerpos. Por
ejemplo, los peptidomiméticos cíclicos se pueden presentar sobre
virosomas de la gripe reconstituidos inmunopotenciadores (IRIV) o
liposomas, una forma de administración de antígenos que ya se
aplica en el uso clínico en humanos.
La unión de un ancla de fosfolípido al terminal
N de los peptidomiméticos que funciona como antígeno permite
combinar el péptido con sistemas de administración
inmunopotenciadores. Según otro aspecto de la presente invención,
resultan preferentes péptidos que se combinan con un sistema de
administración inmunopotenciador. Los sistemas de administración
inmunopotenciadores preferentes se seleccionan de entre el grupo
constituido por liposomas, péptidos de múltiples antígenos y
virosomas reconstituidos inmunopotenciadores.
Por ejemplo, los virosomas de la gripe
reconstituidos inmunopotenciadores (IRIV), como agentes de
administración inmunopotenciadores compatibles con humanos, son
capaces de presentar los peptidomiméticos conformacionalmente
restringidos en múltiples copias al sistema inmune y, en
consecuencia, mejorar adicionalmente la generación de respuestas
eficaces de anticuerpos reactivos frente a patógenos. Los IRIV son
vesículas esféricas unilamelares preparadas a partir de una mezcla
de fosfolípidos y glicoproteínas de superficie del virus de la
gripe. La glicoproteína de membrana hemoglutinina del virus de la
gripe juega un papel esencial en la acción de los IRIV. Este
antígeno principal de la gripe es un componente inductor de fusión
que facilita el suministro de antígenos a las células
inmunocompetentes.
Además, los péptidos según la presente invención
(epítopes de células T) se pueden encapsular en virosomas a efectos
de protegerlos de la degradación enzimática por parte de los fluidos
corporales, y los mismos se presentarán al sistema inmune a través
de la ruta MHC de clase I.
Es particularmente preferido un péptido con
cinco repeticiones en tándem de
(Asn-Pro-Asn-Ala)
que se retícula íntegramente tal como se ha descrito anteriormente
y que además comprende un resto PE en su terminal N, que permite la
unión a un virosoma reconstituido inmunopotenciador de la gripe
(fórmula V).
Para los experimentos in vivo, los
péptidos según la presente invención se pueden combinar con
adyuvantes a efectos de mejorar la respuesta inmunológica. Por
ejemplo, en función de la especie huésped, los adyuvantes que se
pueden utilizar incluyen, aunque sin limitarse a los mismos: sales
minerales o geles minerales tales como hidróxido de aluminio,
fosfato de aluminio y fosfato de calcio; sustancias activas de
superficie, tales como lisolecitina, polioles plurónicos,
polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianinas de lapa
californiana y dinitrofenol; moléculas inmunoestimulantes, tales
como citoquinas, saponinas, dipéptidos de muramilo y derivados
tripeptídicos, dinucleótidos CpG, oligonucleótidos CpG,
monofosforilo lípido A, y polifosfazenos; adyuvantes particulados y
microparticulados, tales como emulsiones, liposomas, virosomas,
cocleatos; o un complejo inmunoestimulante de adyuvantes mucosales,
adyuvante de Freund (completo e incompleto) y adyuvantes humanos
potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum).
Sin embargo, se debe indicar que los adyuvantes fuertes, por
ejemplo los adyuvantes de Freund, pueden provocar graves efectos
secundarios no deseados, no aceptados por las autoridades
reguladoras para la aplicación en humanos.
El peptidomimético reticulado se puede preparar
por métodos sintéticos en fase sólida bien conocidos en la técnica.
El péptido lineal se puede ensamblar utilizando la química de los
Fmoc. La disociación de la resina y la eliminación de los grupos
protectores de cadena lateral se puede llevar a cabo en una etapa, y
el acoplamiento del esqueleto clave del residuo de prolina
modificado y el glutamato se puede alcanzar por ciclización en DMF
con un reactivo de acoplamiento, tal como HATU.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a la utilización de los péptidos según la presente invención
para la preparación de una vacuna para el tratamiento de la
malaria. Los peptidomiméticos conformacionalmente restringidos que
comprenden una o más unidades de fórmula (II), en las que Apro es
(28,48)-4-aminoprolina, se pueden
utilizar para imitar la estructura de superficie de la proteína CS
y, de este modo, desencadenar una respuesta inmune humoral. Los
anticuerpos dirigidos contra un mimético de este tipo son capaces de
reaccionar con la proteína CS nativa en los esporozoitos de P.
falciparum. En consecuencia, los peptidomiméticos según la
presente invención se pueden utilizar ampliamente en el diseño de
vacunas sintéticas combinadas definidas molecularmente, incluyendo
las dirigidas contra múltiples antígenos y etapas de desarrollo de
P. falciparum, y contra otros agentes infecciosos.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para preparar anticuerpos en un huésped contra
especies de Plasmodium, preferentemente contra Plasmodium
falciparum, que comprende la etapa de administrar un péptido
tal como los descritos anteriormente a dicho huésped.
Habiendo descrito en términos generales la
presente invención, la misma se puede comprender con mayor detalle
haciendo referencia al siguiente ejemplo en conexión con las figuras
1-2 adjuntas.
La figura 1 ilustra esquemáticamente la ruta
sintética que conduce al peptidomimético conformacionalmente
restringido
Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-(Apro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Glu)_{ciclo}-Asn-Pro-Asn-Ala
unido a un resto PE.
La figura 2 muestra el grado de purificación del
peptidomimético según la invención de fórmula (III) en un
cromatograma HPLC. Tras completarse la síntesis, el disolvente se
eliminó y el residuo resultante se purificó utilizando una columna
de HPLC de fase inversa C4 (Vydac 214 TP 1010, 25 cm x 10 mm)
utilizando un gradiente que empieza con etanol en agua al 50% y
llegar hasta etanol al 100% (+0,1% TFA) durante 15 minutos. El UK39
aparece como un pico ancho aproximadamente a 90% etanol. m/z 1427
(M+2H)^{2+}.
La figura 3 muestra una comparación de
estructuras RMN promedio en solución acuosa del péptido según la
técnica anterior BP66 y el péptido UK39 según la presente
invención. El BP66 sólo difiere del UK39 en el hecho de que la
unidad de prolina modificada
(2S,4S)-4-aminoprolina ha sido
sustituida por el isómero
(2S,3R)-3-aminoprolina. Debido al
cambio de posición de la reticulación, desde la posición 3 a la
posición 4, la conformación de toda la parte macrocíclica del
péptido se ha modificado. La figura muestra estructuras RMN promedio
deducidas en agua por RMN y anillado simulado (SA). La figura se
preparó utilizando MOLMOL (Konradi R. et al, J. Mol. Graph.
1996, 14, 51-55).
Se debe comprender que el ejemplo siguiente se
indica únicamente a título ilustrativo y no se debe considerar
limitador de la presente invención en ningún sentido a la forma de
realización específica descrita en el mismo.
A menos que se especifique lo contrario, se
utilizan los procedimientos químicos generales y de síntesis
peptídica, tales como los descritos en Voet, Biochemistry, Wiley,
1990; Stryer; Peptide Chemistry. A Practical Textbook, 2ª ed.,
Miklos Bodanszky, Springer-Verlag, Berlín, 1993;
Principles of 15 Peptide Synthesis, 2ª ed., Miklos Bodanszky,
Springer-Verlag, Berlín, 1993; Chemical Approaches
to the Synthesis of Peptides and Proteins, P.
Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, CRC Press,
Boca Raton, 1997; Bioorganic Chemistry: Peptides and Proteins, S.
M. Hecht, ed., Oxford Press, Oxford, 1998.
A continuación se muestra la síntesis del
peptidomimético conformacionalmente restringido
Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-(Apro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Glu)_{ciclo}-Asn-Pro-Asn-Ala
unido a un resto PE. La síntesis del precursor de péptido lineal se
llevó a cabo en una resina Rink Amide MBHA (0,73 mM/g)
(Novabiochem) en un sintetizador de péptidos ABI433A de Applied
Biosystems. El péptido se sintetizó en una escala de 0,25 mmol
utilizando 4 eq. de cada aminoácido protegido con el grupo Fmoc,
cada uno de ellos activado con HBTU/HOBt (4 eq.). Los aminoácidos
utilizados fueron:
Fmoc-Asn(Mtt)-OH,
Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH y
Fmoc-(4S,2S)-4-aminoprolina(Boc)-OH.
La disociación del péptido lineal de la resina
se llevó a cabo utilizando TFA que contenía 2,5% de TIS y 2,5% de
agua durante 3 h a temperatura ambiente. Tras la eliminación de la
mayor parte del TFA en vacío, el péptido se precipitó utilizando
diisopropiléter, se lavó con iPr_{2}O, y se secó en vacío durante
1 h. El producto se puede analizar mediante HPLC de fase inversa en
una columna C18 y utilizando un gradiente de MeCN/H_{2}O (+0,1%
de TFA; 5->95%, MeCN; t_{R} = 10 min). m/z: 2294
(M+H)^{+}.
Para la ciclización, el anterior péptido lineal
en crudo se agitó durante una noche a temperatura ambiente junto
con 4 eq. de HATU, 4 eq. de HOAt en DMF y 1% v/v de DIEA (2 mg/ml de
péptido). Se eliminó el disolvente y el péptido se disolvió en 20%
piperidina/DMF, y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente a
efectos de eliminar el grupo Fmoc. El disolvente se evaporó y el
péptido se precipitó utilizando diisopropiléter, y se secó en
vacío. El producto se puede analizar mediante HPLC de fase inversa
en una columna C18 y utilizando un gradiente de MeCN/H_{2}O
(+0,1% TFA; 5->95% MeCN; t_{R} = 11 min). m/z: 2276
(M+H)^{+}.
El producto anterior (40 mg) en DMF (5 ml), cada
uno con 4 eq. de HATU/HOAt, se trató con una solución de
PE-CO-(CH_{2})_{2}-COOH
(PE-succinato; 4 eq.) en DCM (5 ml) junto con 1% de
DIEA, y se agitó durante una noche a temperatura ambiente. El
disolvente se eliminó y el residuo resultante se purificó utilizando
una columna de HPLC de fase inversa C4 (Vydac 214 TP1010, 25 cm x
10 mm) utilizando un gradiente que empieza con etanol en agua al
50% hasta etanol al 100% (+0,1% TFA) durante 15 minutos. UK39
aparece como un pico ancho aproximadamente a 90% de etanol. m/z
1427 (M+2H)^{2+} (véase a continuación).
A continuación se pone de manifiesto la
reactividad del UK39 y de la forma isomérica BP66 frente a
anticuerpos dirigidos contra la proteína CS de P.
falciparum. El BP66 sólo difiere del UK39 en el hecho de que la
unidad de prolina modificada
(2S,4S)-4-aminoprolina (fórmula III)
de UK39 ha sido sustituida por el isómero
(2S,3R)-3-aminoprolina.
La tabla 1 muestra que se enlazan un mayor
número de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína CS
al UK39 que al BP66. De este modo, el peptidomimético UK39 que
comprende (2S,4S)-4-aminoprolina
proporciona una imitación mejorada de la región de repetición en
tándem de la proteína CS.
Las ventajas en reactividad inmunológica
proceden de la utilización de
(2S,4S)-4-aminoprolina en lugar de
la anterior (2S,3R)-3-aminoprolina.
Así pues, la mejora procede de hecho de desplazar la posición de
reticulación desde la posición 3 a la posición 4 del anillo de
prolina. La respuesta inmunológica generada por el nuevo mimético
es más intensa y diferente. Esta diferencia se observa en el hecho
de que un anticuerpo monoclonal se puede aislar a partir de la
inmunización con el mimético que contiene
(2S,4S)-4-aminoprolina, que se
enlaza al parásito pero no se enlaza al mimético que contiene
3-aminoprolina. Este hecho indica que la nueva
molécula imita partes de la proteína de superficie del parásito que
no están representadas en absoluto en el mimético anterior que
contiene (2S,3R)-3-aminoprolina (el
anticuerpo se enlaza al parásito y al mimético con
(2S,4S)-4-aminoprolina, pero no al
mimético con
(2S,3R)-3-aminoprolina). Esto se
puede racionalizar fácilmente, ya que modificando la posición de la
reticulación desde la posición 3 a la posición 4, los inventores han
modificado inevitablemente la conformación (forma) de la parte
macrocíclica de la molécula. La misma es una parte crucial para el
reconocimiento por parte de los anticuerpos. Los estudios con
modelos moleculares con ambos miméticos refuerza la noción de que
la modificación de la posición de la reticulación modifica también
la conformación del esqueleto. La modificación de la conformación
puede ser pequeña, pero incluso pequeños cambios en la conformación
pueden conducir a cambios en la manera en que el mimético es
reconocido por parte de los anticuerpos, y en consecuencia puede
modificar la capacidad de la molécula para imitar epítopes de la
superficie del parásito (tabla 1).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Para determinar qué conformación adoptará el
antígeno peptídico restringido en solución acuosa, se puede estudiar
el peptidomimético mediante métodos de RMN y MD en solución acuosa,
análogamente a estudios previos (Bisang, C. et al, J. Am.
Chem. Soc. 1998, 120, 7439-7449). Las estructuras
promedio en solución para los peptidomiméticos conformacionalmente
restringidos se calculan utilizando restricciones de distancia
derivadas de los efectos NOE por anillado dinámico simulado (SA) y
simulaciones de dinámica molecular (MD), utilizando métodos
descritos anteriormente (Bisang, C. et al, J. Am. Chem. Soc.
1998, 120, 7439-7449).
Los estudios de modelación referentes a UK39 y
BP66 muestran que la ciclización a través del residuo de
(2S,4S)-4-aminoprolina estabiliza
la conformación del UK39. Además, la modelación revela que el BP66
adopta una estructura diferente que el UK39. En consecuencia, se
puede concluir que el cambio de la ciclización desde la posición 3 a
la 4 junto con la estereoquímica específica del grupo amino
primario en el residuo de prolina modificado crea una nueva
conformación en los motivos NPNA.
Para la preparación de
PE-mimético-IRIV, una solución de 4
mg de hemaglutinina gripe A/Singapur se centrifuga durante 30 min a
100.000 g y el comprimido se disuelve en 1,33 ml de PBS que contiene
100 mM de OEG (PBS-OEG). 32 mg de fosfatidilcolina
(Lipoid, Ludwigshafen, Alemania), 6 mg de fosfatidiletanolamina y
los miméticos PE se disuelven en un volumen total de 2,66 ml de
PBS-OEG. Los fosfolípidos y la solución de
hemaglutinina se mezclan y se someten a sonicación durante 1 min. A
continuación, esta solución se centrifuga durante 1 hora a 100.000
g y el sobrenadante se filtra con esterilización (0,22 \mum). A
continuación, se forman virosomas por eliminación de detergente
utilizando BioRad SM BioBeads (BioRad, Glattbrugg, Suiza).
Las respuestas de los anticuerpos desencadenadas
por los IRIV cargados con el peptidomimético conformacionalmente
restringido UK39 se estudian en ratones BALB/c. La preinmunización
se alcanza con la vacuna de la gripe Inflexal Berna TM
(Berna-Products, Berna, Suiza). La inmunización se
alcanza con diversas dosis de
IRIV-peptidomimético.
Los ratones BALB/c se preinmunizan
intramuscularmente mediante vacuna del virus de la gripe entera
comercial (0,1 ml; Inflexal Berna, Berna Products, Berna, Suiza) en
el día 21. Empezando por el día 0, reciben en intervalos de tres
semanas tres dosis de peptidomimético UK39 conformacionalmente
restringido enlazado a IRIV por vía intramuscular en dosis de 50
\mug de mimético. Se extrae sangre dos semanas después de la
tercera inmunización y se analiza por ELISA e IFA.
Se recubren placas de microtitulación de ELISA
(Immunolon 413, Dynatech, Embrach, Suiza) a 4ºC durante una noche
con 50 ml de una solución de 5 mg/ml de constructos peptidomiméticos
en PBS, a pH 7,2. A continuación, los pocillos se bloquean con
leche en polvo al 5% en PBS durante 1 h a 37ºC, seguido de tres
lavados con PBS que contiene 0,05% de Tween-20. A
continuación, las placas se incuban con diluciones en serie de
factor dos de suero de ratón o sobrenadantes de células de
hibridoma en PBS que contiene 0,05% de Tween-20 y
0,5% de leche en polvo durante 2 h a 37ºC. Tras el lavado, las
placas se incubaron con anticuerpos de cabra anti IgG de ratón
(específicos de cadena g) conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma,
St. Louis, MO) durante 1 h a 37ºC, y a continuación se lavaron. Se
añadió substrato de fosfatasa (1 mg/ml de
p-nitrofenil fosfato, Sigma) en amortiguador (0,14%
Na_{2}CO_{3}, 0,3% NaHCO_{3}, 0,02% MgCl_{2}, pH 9,6) y se
incubó a temperatura ambiente. La densidad óptica (OD) del producto
de reacción se registra tras el tiempo apropiado a 405 nm
utilizando un lector de microplaca (Titertek Multiscan MCC/340,
Labsystems, Finlandia). Se registran curvas de titulación y se
analizan utilizando el software GENESIS LITE 2,16 (Life Sciences
Ltd., Basingstoke, Reino Unido). Los valores de dosis efectiva 20%
(ED20%) se calculan para cada curva y los correspondientes títulos
se fijan como títulos de punto final.
Se llevan a cabo ensayos de inmunofluorescencia
a efectos de analizar la reactividad de los anticuerpos obtenidos.
Se incuban esporozoitos de glándula salivar de P. falciparum
no fijados secados en aire (cepa NF54) fijados a placas de vidrio
de microscopio en una cámara húmeda durante 20 min a 37ºC con suero
diluido en PBS. A continuación, las placas de vidrio se lavan cinco
veces con PBS que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino
(PBS-BSA) y se secan. Se añaden anticuerpos de cabra
anti IgG de ratón marcados con FITC (específicos de Fab) (Sigma),
óptimamente diluidos en PBS que contiene 0,1 g/l de Evans43lue
(Merck, Alemania). Tras la incubación durante 20 min a 37ºC, las
placas de vidrio se lavan de nuevo cinco veces con
PBS-BSA, se secan, se fijan con glicerol y se
cubren con un cubreobjetos. Se utiliza un microscopio Leitz Dialux
20 que utiliza lentes 12,5/18 y un objetivo 40x/1,30 de
fluorescencia de aceite 160/0,17 a efectos de detectar la tinción
por fluorescencia a las longitudes de onda de 495 nm de excitación
y 525 nm de emisión.
<110> Pevion Biotech Ltd.
\hskip1cmUniversity zürich
\hskip1cmSwiss Tropical Institute
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para sintetizar
péptidos limitados en la conformación, peptidométicos y su
utilización a modo de vacunas sintéticas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P200925
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 03012520.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-06-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de repetición de tipo
tándem de la parte central de la proteína-cs
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Secuencia de repetición de tipo
tándem de la parte central de la proteína-cs
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 12
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<212> PRT
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<223> Secuencia de repetición de tipo
tándem de la parte central de la proteína-cs
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<400> 3
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<223> Secuencia de repetición de tipo
tándem de la parte central de la proteína-cs
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<400> 4
\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Parte de la proteína (CS) de
circumsporoizoto de malaria de una especia de Plasmodio
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<400> 5
\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Parte de la proteína (CS) de
circumsporoizoto de malaria de una especia de Plasmodio
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Parte de la proteína (CS) de
circumsporoizoto de malaria de una especia de Plasmodio
\newpage
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<400> 7
\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Parte de la proteína (CS) de
circumsporoizoto de malaria de una especia de Plasmodio
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína modificada
de una secuencia de repetición de tándem de la parte central de la
proteína-cs
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
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<210> 10
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> peptidomimético limitado en la
conformación
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc__feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6).._(6)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acoplamiento de la amida de (2s,
4s)-4-aminoprolina en pos. 6 con
residuo de glutamato en pos. 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
Claims (15)
1. Péptido que comprende una o más unidades de
fórmula (II):
en la que Apro es
(2S,4S)-4-aminoprolina.
2. Péptido según la reivindicación 1, que
presenta la fórmula (III):
3. Péptido según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho péptido está acoplado a un fosfolípido.
4. Péptido según la reivindicación 3, en el que
el terminal N de dicho péptido está acoplado a través de un linker
a un derivado de ácido graso de la fosfatidiletanolamina.
5. Péptido según la reivindicación 4, en el que
dicho linker es un linker de dicarboxilato.
6. Péptido según la reivindicación 5, en el que
dicho linker de dicarboxilato es un linker de succinato.
7. Péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que la fosfatidiletanolamina es
1-palmitoil-3-oleoil-fosfatidiletanolamina
(PE).
8. Péptido según la reivindicación 7, en el que
el péptido internamente reticulado de fórmula (III), que comprende
un resto PE en el terminal N, está enlazado a un virosoma de gripe
reconstituido inmunopotenciador.
9. Composición que comprende uno o más péptidos
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Composición según la reivindicación 9, que
comprende asimismo uno o más adyuvantes farmacéuticamente
aceptables.
11. Composición según la reivindicación 9 ó 10,
en la que dichos uno o más péptidos se combinan con un sistema de
administración inmunopotenciador, que se selecciona de entre el
grupo constituido por liposomas, péptidos de múltiples antígenos y
virosomas reconstituidos inmunopotenciadores.
12. Procedimiento para preparar un anticuerpo en
un huésped no humano contra una especie de Plasmodium, que
comprende la etapa de administrar un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 a dicho huésped no humano.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que dicha especie de Plasmodium es Plasmodium
falciparum.
14. Anticuerpo que se puede obtener mediante el
procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho
anticuerpo se enlaza a un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, pero no se enlaza a una variante de fórmula
II ó III en la que Apro es
(2S,3R)-3-aminoprolina.
15. Utilización del péptido según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de una vacuna para
tratar la malaria.
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