ES2320669T3 - Genes, que contienen una secuencia de adn, que codifica una hidroxinitrilo liasa, proteinas recombinantes con actividad de hidroxinitrilo liasa y su utilizacion. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado, que tiene la secuencia de nucleótidos, que se reproduce en la Figura 8, desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2.083 ininterrumpidamente, o que abarca esta secuencia con resta de las regiones de intrones de los nucleótidos 104 hasta 249, 907 hasta 1.047 y 1.889 hasta 1.993.

Description

Genes, que contienen una secuencia de ADN, que codifica una hidroxinitrilo liasa, proteínas recombinantes con actividad de hidroxinitrilo liasa y su utilización.

Los procedimientos biocatalíticos han adquirido una gran importancia para la industria química. La realización de reacciones químicas mediando toma de ayuda de catalizadores biológicos es interesante en este caso sobre todo en los sectores de utilización, en los que se puede aprovechar la propiedad, que está frecuentemente presente, de ciertas enzimas de convertir químicamente o formar de manera preferente uno de los dos enantiómeros, en el caso de las reacciones químicas con componentes quirales o proquirales.

Unas premisas esenciales para el aprovechamiento de estas favorables propiedades de las enzimas son su disponibilidad en unas cantidades requeridas técnicamente y una reactividad lo suficientemente alta, así como una estabilidad en las condiciones reales de un procedimiento técnico.

Una clase particularmente interesante de compuestos químicos quirales la constituyen las cianhidrinas. Las cianhidrinas son importantes, por ejemplo, en el caso de la síntesis de \alpha-hidroxiácidos, \alpha-hidroxicetonas y \beta-aminoalcoholes, que encuentran utilización para la obtención de sustancias biológicamente activas, p.ej. sustancias activas farmacéuticas, vitaminas o compuestos piretroides.

La preparación de estas cianhidrinas se efectúa mediante reacción por adición de ácido cianhídrico con grupo carbonilo de una cetona o un aldehído.

La preparación a escala técnica de compuestos quirales, tales como, por ejemplo, (S)-cianhidrinas, se pudo realizar mediante el descubrimiento de la enzima (S)-hidroxinitrilo liasa procedente de Hevea brasiliensis, y se describe, por ejemplo, en el documento de solicitud de patente internacional WO 97/03204, y en los documentos de patentes europeas EP 0.951.561 y EP 0.927.766.

Sin embargo, existe una gran cantidad de compuestos químicos interesantes, en los que los enantiómeros R son importantes para ciertas aplicaciones técnicas. Hasta ahora sólo se describieron unos procedimientos para la producción de una serie de productos, que sólo se pueden emplear a la escala del laboratorio (véanse p.ej.: los documentos EP 0.276.375, EP 0.326.063 y EP 0.547.655). En este caso, se emplearon predominantemente unas preparaciones enzimáticas, que se habían obtenido a partir de plantas de la familia de las Rosaceae, por ejemplo, a partir de los corazones de almendras (Prunus amygdalus).

En los últimos tiempos, las Prunus spezies han adquirido una importancia cada vez mayor, de tal manera que se intentó investigar a éstas más detalladamente.

A partir de la bibliografía especializada, por ejemplo de Plant Physiology, abril de 1999, tomo 119, páginas 1.535-1.546, se sabe que en Prunus spezies se pueden presentar varias isoenzimas R-HNL. Estas isoenzimas son expresadas en diversos tejidos de la planta de una manera diferentemente intensa. En el caso de la planta Prunus serotina, que es estrechamente afín con Prunus amygdalus, se pudieron identificar hasta ahora 5 diferentes isoenzimas y se pudieron secuenciar sus genes. De Prunus amygdalus se ha descrito hasta ahora, en Planta (1998) 206: 388-393, solamente una isoenzima, a saber una que es expresada de la manera más intensa en el capullo de una flor. Un gen para esta isoenzima R-HNL ya se aisló, y se secuenció el ADNc (ADN cromosomal).

No obstante, ni en la bibliografía especializada ni en la bibliografía de patentes se ha descrito todavía ningún informe acerca de una expresión heteróloga (funcional) satisfactoria de un gen de este tipo.

Tampoco se han realizado hasta ahora aplicaciones técnicas a una escala más grande. La causa esencial de ello consiste en que no estaban a disposición hasta ahora preparaciones enzimáticas procedentes de corazones de almendras con una actividad de hidroxinitrilo liasa en unas cantidades suficientes y con unos costes soportables.

Un objetivo de este invento fue, por lo tanto, proporcionar una base que pueda poner a disposición una R-hidroxinitrilo liasa en las cantidades que son necesarias para las aplicaciones técnicas.

Con el fin de alcanzar este objetivo, se buscó una vía para producir una enzima correspondiente a la preparación de R-HNL de Prunus amygdalus mediante estrategias de tecnología genética, con ayuda de una correspondiente cepa de microorganismos recombinantes. Una enzima recombinante de este tipo, con actividad de R-HNL, se debería poner a disposición técnicamente de esta manera en una cantidad suficiente.

A partir de las secuencias de ADN descritas en la bibliografía antes citada, se puede deducir, que en el caso de los genes de las diferentes isoenzimas están altamente conservadas unas determinadas regiones. Este hecho se aprovecha conforme al invento como base para generar unos cebadores para la amplificación mediante una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de genes R-HNL de P. amygdalus. Con ayuda de tales cebadores se pueden amplificar entonces, con un ADN aislado a partir de, por ejemplo, corazones de almendras (P. amygdalus), como molde (en inglés "template") mediante una PCR, unos fragmentos de ADN, los cuales, en el caso de un análisis mediante una electroforesis en gel de agarosa, muestran unas bandas específicas concretas. Conforme al invento se podían encontrar en este caso unas bandas que correspondían al tamaño de genes mdl (Planta (1998) 206: 388-393). A continuación, se generan unos cebadores correspondientes para todas las isoenzimas conocidas en el caso de Prunus serotina y se obtienen unos correspondientes productos de PCR. Un ADN procedente de esta región se aísla a partir de unos correspondientes geles preparativos de agarosa y se introduce por clonación en vectores normales clásicos para la clonación de fragmentos generados mediante una PCR en Escherichia coli.

El análisis de las secuencias de una serie de clones escogidos, puso de manifiesto que están presentes unos clones que tienen homologías con respecto a los respectivos genes de R-HNL, ya conocidos, de especies de Prunus, a pesar de que las secuencias de los clones o respectivamente genes, que se han obtenido de esta manera, se diferencian en varias posiciones de las secuencias con respecto de las secuencias ya conocidas o respectivamente publicadas, con lo que se establecen unas importantes diferencias funcionales.

Por lo tanto, de una manera inesperada, se encontró una nueva variante de los genes de HNL, a pesar de que se utilizaron unas combinaciones de cebadores, en cuyos casos se aprovechó la secuencia ya conocida de un ADNc obtenido a partir de un material de flores de Prunus amygdalus.

Los nuevos genes se secuenciaron y se determinó la secuencia de ADN genómico.

Así, por ejemplo, se pueden producir unos cebadores para PCR, específicos para ciertos genes, que se basan en la homología entre secuencias del gen MDL1 de Prunus amygdalus y del gen mdl5 de Prunus serotina, con lo cual, tras una amplificación y clonación, se obtiene el gen HNL5.

Por ejemplo, el gen HNL5 procedente de Prunus amygdalus, obtenido por medio de una amplificación por PCR, tiene la secuencia de nucleótidos que se reproduce en la Figura 1.

Además, se pueden producir, por ejemplo, unos cebadores de PCR que son específicos para ciertos genes, que se basan en la homología entre secuencias del gen mdl1 de Prunus serotina, con lo cual, tras una amplificación y una clonación, se obtiene un nuevo gen, el gen HNL1.

Por ejemplo, el gen HNL1, obtenido por una amplificación mediante PCR, tiene la secuencia de nucleótidos que se reproduce en la Figura 8, la cual es objeto del invento.

Es objeto del invento un ácido nucleico aislado, que comprende la secuencia de nucleótidos, que se reproduce en la Figura 8, desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2.083 de una manera ininterrumpida, o que comprende esta secuencia de la que se han restado las regiones de intrones de los nucleótidos 104 hasta 249, 907 hasta 1.047 y 1.889 hasta 1.993.

Los clones genómicos o respectivamente sus ADN's genómicos constituyen la base para la obtención de preparaciones enzimáticas en diferentes células anfitrionas mediante una expresión heteróloga, por ejemplo, por medio de una expresión inducible o constitutiva.

Además, a partir del análisis de las secuencias de los ADN genómicos de los nuevos genes conformes al invento, se puede observar que, en el caso de las proteínas codificadas por los nuevos genes, se trata de unas proteínas que disponen de una secuencia de señal o respectivamente de un péptido de señal vegetal, con lo que se hace posible una expresión secretoria de proteínas heterólogas en células anfitrionas adecuadas.

En este caso, se utilizan unos vectores de expresión especiales, con los que la proteína, codificada por uno de los nuevos genes que se han introducido por clonación, es expresada como una proteína de fusión con un péptido de
señal.

El presente invento se refiere, por consiguiente, además, a unas proteínas recombinantes, que se pueden preparar mediante una expresión heteróloga de la secuencia de ADN de los genes HNL1 procedentes de Prunus amygdalus en unas células anfitrionas adecuadas, las cuales proteínas tienen las secuencias de aminoácidos reproducidas en la Fig. 9.

Células anfitrionas adecuadas son en este caso, por ejemplo, ciertos microorganismos. Se prefieren microorganismos eucarióticos, y se prefieren especialmente hongos. Ejemplos de ellos son Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris.

Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la hidroxinitrilo liasa HNL1 procedente de Prunus amygdalus, que se deriva de la secuencia de nucleótidos del gen HNL1, se reproduce en la Figura 9.

Unas células anfitrionas adecuadas son en este caso de nuevo, por ejemplo, ciertos microorganismos. Se prefieren ciertas bacterias o ciertos microorganismos eucarióticos, se prefieren especialmente ciertos hongos, tales como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris.

Por ejemplo, en la Figura 4 se reproduce la secuencia ácido nucleico del fragmento de ADN, que codifica una proteína híbrida secretoria (PamHNL5xGOX)con una actividad de HNL, el cual se compone de secuencias del gen HNL5 de P. amygdalus y del gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger. La secuencia de aminoácidos, que se deriva de la secuencia de nucleótidos (véase la Figura 4) de la proteína híbrida PamHNL5xGOX, se reproduce en la Figura 5.

La Figura 6 muestra la comparación entre las secuencias de aminoácidos de la proteína HNL5 procedente de Prunus amygdalus y de la proteína híbrida PamHNL5xGOX.

A fin de acceder a las proteínas recombinantes conformes al invento, se elaboran ulteriormente, por ejemplo, los clones, que muestran homologías con respecto a los conocidos genes de MDL1 procedentes de P. amygdalus y/o para mdl1 de P. serotina.

A fin de obtener unas proteínas recombinantes con una actividad de hidroxinitrilo liasa se introducen los correspondientes genes HNL1 p.ej. en un vector de expresión para Pichia pastoris o para Saccharomyces cerevisiae.

Previamente, el ADN genómico se puede empalmar mediante una PCR. De manera preferida, se produce un fragmento de base para la construcción de plásmidos de expresión destinados a la expresión heteróloga del correspondiente gen en bacterias y organismos eucarióticos. Para ello, se construye un plásmido, a partir del cual se puede obtener un fragmento de ADN que codifica un gen conforme al invento, para su incorporación en diferentes vectores de expresión mediante recorte con endonucleasas de restricción.

Con los genes conformes al invento se puede producir, por consiguiente, en un anfitrión heterólogo, una HNL funcional mediante expresión, por ejemplo, con un sistema promotor inducible o con un sistema que expresa de una manera constitutiva.

A partir de un gran número de transformantes se pueden encontrar, por consiguiente, unas cepas recombinantes de, por ejemplo, Pichia pastoris, que sobreexpresan una proteína recombinante con actividad de R-HNL. La proteína con actividad de R-NHL se puede encontrar en estas cepas, después de una inducción de la expresión, en la parte predominante en el material sobrenadante de cultivo.

Por consiguiente, por primera vez se pudo producir una proteína recombinante en unas cantidades aprovechables para aplicaciones técnicas, que tiene una actividad de R-HNL, que es comparable con la que se puede encontrar en corazones de almendras (corazones de Prunus amygdalus).

De manera inesperada, se pudo comprobar que las proteínas recombinantes con actividad de R-HNL, que se derivan, por ejemplo, de los genes HNL1 conformes al invento, y que son designadas como Pam-HNL1, tienen, en comparación con la preparación enzimática aislada a partir de corazones de almendras, unas propiedades esencialmente mejores como biocatalizadores en tandas de reacción destinadas a la preparación de cianhidrinas, y, por consiguiente, se pueden utilizar de una manera especialmente ventajosa para la síntesis biocatalítica de cianhidri-
nas.

Las secuencias de las proteínas recombinantes conformes al invento se pueden acortar adicionalmente también además en el extremo terminal de C, o respectivamente, las secuencias en las regiones de los terminales de N y C se pueden intercambiar por las de una proteína afín, que tiene otra función distinta. Las proteínas modificadas de esta manera son, por consiguiente, también un objeto del invento.

Las proteínas recombinantes se distinguen en particular también por el hecho de que tienen una glicosilación específica para ciertos anfitriones, con lo que las proteínas recombinantes son esencialmente más estables que las proteínas naturales.

Una ventaja especial de las proteínas recombinantes conformes al invento resulta de la estabilidad esencialmente más alta, por medio de la cual se necesita una cantidad de enzimas esencialmente más pequeña, en comparación con la enzima natural, para conseguir una alta pureza en cuanto a enantiómeros. Así, unos ensayos de comparación mostraron que en el caso de una utilización de las proteínas recombinantes conformes al invento, sólo se necesita una décima parte de la cantidad requerida de la proteína natural, a fin de conseguir unas comparables purezas en cuanto a enantiómeros (= valores de ee [exceso enantiomérico]).

Un objeto adicional del invento es, por consiguiente, la utilización de las proteínas recombinantes (HNL's) conformes al invento para la preparación de (S)- o (R)-cianhidrinas.

Como materiales de partida para la preparación de (S)- o (R)-cianhidrinas se emplean un aldehído o una cetona como substrato, un compuesto donante de grupos cianuro y una proteína recombinante conforme al invento.

Por aldehídos se han de entender, en este caso, aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos. Por aldehídos alifáticos se han de entender, en este caso, aldehídos saturados o insaturados, alifáticos, lineales, ramificados o cíclicos. Unos aldehídos alifáticos preferidos son aldehídos lineales que tienen en particular de 2 a 30 átomos de C, de manera preferida de 2 a 18 átomos de C, que están saturados o insaturados una vez o múltiples veces. El aldehído puede tener en este caso tanto enlaces C-C dobles como también enlaces C-C triples. Los aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos pueden además estar sin sustituir o sustituidos con unos grupos, que son inertes en las condiciones de reacción, por ejemplo con grupos arilo o heteroarilo que están eventualmente sustituidos, tales como grupos fenilo, fenoxi o indolilo, o con grupos de halógeno, hidroxi, hidroxi-alquilo de C_{1}-C_{5}, alcoxi de C_{1}-C_{5}, (alquil de C_{1}-C_{5})-tio, de éteres, de alcoholes, de ésteres de ácidos carboxílicos, nitro o azido.

Ejemplos de aldehídos aromáticos o heteroaromáticos son benzaldehído o respectivamente benzaldehídos diversamente sustituidos tales como por ejemplo 3,4-difluoro-benzaldehído, 3-fenoxi-benzaldehído, 4-fluoro-3-fenoxi-benzaldehído, hidroxi-benzaldehído, metoxi-benzaldehído, además furfural, metil-furfural, antraceno-9-carbaldehído, furano-3-carbaldehído, indol-3-carbaldehído, naftaleno-1-carbaldehído, ftalodialdehído, pirazol-3-carbaldehído, pirrol-2-carbaldehído, tiofeno-2-carbaldehído, isoftaloaldehído o piridina-aldehído, tienil-aldehído, etc.

Las cetonas son cetonas alifáticas, aromáticas o heteroaromáticas, en las que el átomo de carbono del carbonilo está sustituido de manera desigual. Por cetonas alifáticas se han de entender cetonas saturadas o insaturadas, lineales, ramificadas o cíclicas. Las cetonas pueden estar saturadas o insaturadas una vez o múltiples veces. Ellas pueden estar sin sustituir, o pueden estar sustituidas con unos grupos que son inertes en las condiciones de reacción, por ejemplo con grupos arilo o heteroarilo eventualmente sustituidos, tales como grupos fenilo o indolilo, con grupos de halógenos, de éteres, de alcoholes, de ésteres de ácidos carboxílicos, nitro o azido.

Ejemplos de cetonas aromáticas o heteroaromáticas son acetofenona, indolil-acetona, etc

Los aldehídos y las cetonas, que se adecuan conforme al invento, se conocen o se pueden preparar de una manera usual.

Los substratos se hacen reaccionar en presencia de las HNL's conformes al invento con un compuesto donante de grupos cianuro.

Como compuesto donante de grupos cianuro entran en consideración ácido cianhídrico, cianuros de metales alcalinos o una cianhidrina de la fórmula general I

R_{1}R_{2}C(OH)(CN).

En la fórmula I R_{1} y R_{2} significan, independientemente uno de otro, hidrógeno o un grupo hidrocarbilo sin sustituir, o R_{1} y R_{2} significan en común un grupo alquileno con 4 ó 5 átomos de C, no significando R_{1} y R_{2} al mismo tiempo hidrógeno. Los grupos hidrocarbilo son grupos alifáticos o aromáticos, de manera preferida son grupos alifáticos. De manera preferida, R_{1} y R_{2} significan grupos alquilo con 1 - 6 átomos de C, se prefiere muy especialmente el compuesto donante de grupos cianuro, cianhidrina de acetona.

La preparación del compuesto donante de grupos cianuro se puede efectuar según procedimientos conocidos. Las cianhidrinas, en particular la cianhidrina de acetona, se pueden adquirir también comercialmente.

De manera preferida, como compuesto donante de grupos cianuro, se emplean ácido cianhídrico (HCN), KCN, NaCN, o la cianhidrina de acetona, de manera especialmente preferida se emplea el ácido cianhídrico.

El ácido cianhídrico puede ser liberado en este caso también poco antes de la reacción a partir de una de sus sales tales como, por ejemplo, NaCN o KCN, y se puede añadir en sustancia o en una forma disuelta a la mezcla de
reacción.

La reacción se puede llevar a cabo en un sistema orgánico, acuoso o de 2 fases, o en una emulsión.

Como sistema acuoso se utiliza una solución acuosa o una solución tamponadora, que contiene la HNL conforme al invento. Ejemplos de ésta son un tampón de citrato de Na, un tampón de fosfato, etc.

Como agente diluyente orgánico se pueden utilizar hidrocarburos alifáticos o aromáticos, no miscibles o escasamente miscibles con agua, que eventualmente están halogenados, alcoholes, éteres o ésteres, o mezclas de éstos. De manera preferida se emplean metil-terc.-butil-éter (MTBE), diisopropil-éter, dibutil-éter y acetato de etilo, o sus mezclas.

Las HNL's conformes al invento se pueden presentar en este caso o bien como tales, o inmovilizadas en el agente diluyente orgánico, pero la reacción se puede efectuar, no obstante, también en un sistema de dos fases o en una emulsión con una HNL no inmovilizada.

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Ejemplo 1

Aislamiento de un ADN genómico a partir de corazones de almendra (corazones de Prunus amygdalus)

Corazones de almendra secados (Farmgold, número de carga L4532, cosecha de 1999) se picaron finamente con un cuchillo y se congelaron con nitrógeno líquido en una cubeta de trituración, y se trituraron bajo nitrógeno líquido con una mano de almirez para dar un polvo fino. 0,1 gramos del polvo congelado de corazones de almendra se mezclaron directamente con un tampón de ruptura (en inglés "Breaking Buffer")(NaAc 100 mM; EDTA 50 mM; NaCl 500 mM, ajustado a un pH de 5,5; SDS al 1,4% y 20 \mug/ml de ARNasa A), calentado a una temperatura de 65ºC. Después de una incubación durante 15 minutos mediando sacudimiento constante, los residuos de células insolubles se separaron mediante centrifugación (durante 10 min., a 7.000 g) y el material sobrenadante se mezcló con un volumen igual de acetato de amonio 10 M, y a continuación se incubó durante 10 min sobre hielo. Después de una centrifugación durante 15 minutos a 10.000 g, se extrajo el material sobrenadante 2 x (2 veces) con una mezcla de fenol y cloroformo (1/1, fenol equilibrado con Tris 50 mM, de pH 8,0). Después de una extracción adicional con un volumen doble de una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico (24/1), el ADN se precipitó desde el material sobrenadante con un volumen igual de isopropanol, se separó por centrifugación, el sedimento de ADN se lavó con etanol al 70% y se secó al aire. El ADN se disolvió entonces durante 20 min a 68ºC en 200 \mul de agua y se purificó mediante una precipitación con etanol (Ausubel y colaboradores, 1999). Después de la centrifugación, el sedimento de ADN se secó al aire y se disolvió en 50 \mul de agua.

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Ejemplo 2

Amplificación y clonación de un segmento de ADN genómico de almendra (Prunus amygdalus)DNS que tiene una homología con conocidos genes mdl de Rosaceae

Puesto que se sabía que en Prunus spezies pueden aparecer varias isoenzimas de hidroxinitrilo liasas con una alta homología de las secuencias entre ellas (Hu y Poulton 1999), se produjeron cebadores para PCR que eran específicos para ciertos genes, basados en la homología de secuencias del gen mdl5 de Prunus serotina y del gen MDL1 de Prunus amygdalus (Suelves y colaboradores, 1998):

Cebador 1:

5'- CGGAATTCACAATATGGAGAAATCAACAATGTCAG-3'

Cebador 2:

5'- CGGAATTCTTCACATGGACTCTTGAATATTATG-3'

La amplificación se efectuó en una tanda de 50 \mul de volumen con 1,2 U de la polimerasa de ADN Taq "Hotstar" (de Qiagen, Hilden, Alemania), con 50 ng de un ADN genómico de almendra como "molde", en cada caso con 200 ng de los cebadores 1 y 2, con 5 \mul de una mezcla de dNTPs (nucleótidos trifosfatos)(en cada caso 2 mM), todos ellos en 1 x tampón para PCR correspondientemente al manual del estuche Hotstar (en inglés "Hotstar Kit") (de Qiagen, Hilden, Alemania), comenzando con una etapa de desnaturalización durante 15 minutos a 95ºC, seguida por 30 ciclos (1 min a 95ºC, 30 s a 64ºC, 1 min a 72ºC) para la amplificación, y por una incubación final durante 5 min a 72ºC para la producción de productos completos.

Mediante esta PCR se obtuvo un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 2,16 kb [kilobases] (comprobado por un análisis mediante electroforesis en gel de agarosa). Este producto de la PCR se purificó mediante el "Qiaquick Kit" [estuche Qiaquick] (de Qiagen, Hilden, Alemania) correspondientemente al manual adjunto y mediando utilización del estuche "Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" [secuenciación con ciclo de terminador desoxi y colorante] (de Applied Biosystems Inc., Forster City, CA, EE.UU.) se secuenció según la estrategia de la migración de cebadores (en inglés "primer walking"), partiendo de los dos cebadores empleados para la PCR. La secuencia de ADN obtenida del fragmento de PCR, que tiene un longitud total de 2.162 pares de bases, se reproduce en la
Figura 1.

Aproximadamente 0,5 \mug del producto de PCR purificado se cortaron con la endonucleasa de restricción EcoRI y se introdujeron por clonación en el vector plasmídico pBSSK(-) (de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, EE.UU) a través del sitio de corte con EcoRI. El inserto de una molécula recombinante resultante (el correspondiente plásmido se designó como pBSPamHNL5g) se secuenció según el método descrito más arriba, y la secuencia del fragmento clonado era idéntica en un 100% a la secuencia del producto de la PCR que se había obtenido con los dos cebadores (1 y 2), que se ha descrito más arriba.

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Ejemplo 3

Análisis de la secuencia del fragmento de ADN genómico de Prunus amygdalus obtenido por una amplificación mediante PCR con los cebadores 1 y 2

En la región del segmento de ADN, amplificado mediante una PCR y secuenciado, se encontró un marco de lectura abierto, que está interrumpido por 3 intrones. Estos tres intrones se identificaron con ayuda de la secuencia de consenso de intrones "GT.....AG". El marco de lectura comienza con un codón ATG en la posición +13 y termina con un codón de parada en la posición +2.151.

Para la región codificadora se unieron juntos los fragmentos de las posiciones 13 hasta 115 (exón I), de las posiciones 258 hasta 917 (exón II), de las posiciones 1.121 hasta 1.961 (exón III) y de las posiciones 2.078 hasta 2.150 (exón IV). La secuencia de ADN reunida codifica una proteína con 559 aminoácidos y con un peso molecular calculado de 61 kDa o respectivamente 57,9 kDa para una forma procesada en el terminal de N. Las masas de los péptidos se calcularon con ayuda del paquete de programas GCG (del Genetics Computer Group, Wisconsin, EE.UU.). Para esta proteína se estableció la denominación PamHNL5.

La secuencia proteínica deducida para el marco abierto (sin intrones) se muestra en la Figura 3. Se pudieron comprobar unas homologías pronunciadas con hidroxinitrilo liasas conocidas de Rosaceae (programa "Blast", paquete GCG, versión 10.1, del Genetics Computer Group, Wisconsin, EE.UU), existiendo las homologías más altas con las secuencias publicadas de la Mdl1 procedente de Prunus amygdalus (identidad de 99 por ciento, Suelves y colaboradores, 1998) y de la Mdl5 procedente de Prunus serotina (identidad de 94 por ciento, Hu y Poulton, 1999). Con ayuda de esta homología se identificó también una secuencia de señal disociable con una disociación entre S27 y L28. Un sitio de disociación de este tipo se pudo detectar, en los casos de las dos isoenzimas Mdl1 y Mdl4 de Prunus serotina, mediante una secuenciación de los terminales de N de las proteínas naturales purificadas procedentes de un material vegetal (Zihua Hu y Jonathan E. Poulton, Plant Physiology, 119, 1.535-1.546, 1999). Las secuencias de diferentes isoenzimas HNL, que están presentes en Rosacea species, sólo se conocen de Prunus serotina. A causa de las homologías más altas con la secuencia de la Mdl5 procedente de Prunus serotina, el nuevo gen HNL procedente de Prunus amygdalus se designó como HNL5. La búsqueda de motivos de secuencias en el banco de datos de motivos de secuencias PROSITE (paquete GCG, versión 10.1, del Genetics Computer Group, Wisconsin, EE.UU) dio por resultado la presencia de 13 sitios potenciales de glicosilación en N (dibujados en la Figura
3).

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Ejemplo 4

Obtención de un gen HNL5 de Prunus amygdalus exento de intrones, por un empalme mediante una PCR. Por medio de una estrategia especial de PCR, mediando utilización de cebadores que se solapan, se unieron las regiones codificadoras unas con otras mediante 4 reacciones consecutivas de PCR (correspondientemente a la Figura 2)

En la primera ronda de PCR (PCR1-1 y PCR1-2) se amplificaron los exones II y III con los pares de cebadores PamHNL5b/PamHNL5c (PCR1-1) o respectivamente PamHNL5d/PamHNL5e (PCR1-2). Las tandas de PCR de 50 \mul de volumen en 1 x tampón para PCR (de Qiagen) contenían: en cada caso 100 pmol de los correspondientes cebadores, 2,5 U de la polimerasa de ADN Taq "Hotstar" (de Qiagen), 5 \mul de una mezcla de dNTPs (en cada caso 2 mM), 10 ng del plásmido pBSPamHNL5g como molde. Se hizo desarrollar el siguiente programa: 15 min a 95ºC, 30 ciclos con 1 min a 95ºC, 30 s a 68ºC, 1 min a 72ºC y para finalizar con 5 min a 72ºC para la producción de productos completos). Los productos procedentes de la PCR1-1 y de la PCR1-2, después de una separación por electroforesis en un gel de agarosa, se eluyeron desde el gel mediante el estuche QiaexII.

Mediante una amplificación de aproximadamente 50 ng del producto procedente de la PCR1-1 en cada caso con 100 pmol de los cebadores PamHNL5a2 y PamHNL5c se efectuó en la segunda ronda de PCR (PCR2) una prolongación de este primer producto de PCR. Se hizo desarrollar el siguiente programa: 15 min a 95ºC, 30 ciclos con 1 min a 95ºC, 30 s a 68ºC, 1 min a 72ºC y para finalizar con 5 min a 72ºC para la producción de productos completos). Las demás condiciones fueron las mismas que en el caso de la PCR1. Este producto de PCR, después de una separación por electroforesis, se purificó asimismo a través de un gel de agarosa y se eluyó.

Mediante una PCR exenta de cebadores, en la tercera ronda de PCR (PCR3) se unieron unos con otros los productos procedentes de la PCR1-2 y de la PCR2 con ayuda de los extremos que se solapan (5 ciclos con 1 min a 94ºC, 30 s a 68ºC y 1,5 min a 72ºC, en cada caso aproximadamente 100 ng de los dos productos procedentes de la PCR1-1 y de la PCR2 en tandas de 50 \mul en 1 x tampón para PCR (de Qiagen), 5 \mul de la mezcla de dNTPs (en cada caso 2 mM) y 2,5 U de la polimerasa de ADN Taq "Hotstar" (de Qiagen).

La complementación hasta la longitud total del gen codificador HNL5 de Prunus amygdalus y para la amplificación del producto total se efectuó en una cuarta ronda de PCR (PCR4) en cada caso con 100 pmol de los cebadores PamHNL5a1 y PamHNL5f. Éstos se añadieron directamente a la mezcla de reacción de la PCR3. Se hizo desarrollar el siguiente programa: 20 ciclos con 1 min a 95ºC, 30 s a 63ºC, 1,5 min a 72ºC y para finalizar con 5 min a 72ºC). Las demás condiciones fueron las mismas que en el caso de la PCR1.

El producto obtenido en la última ronda de PCR se separó a través de un gel preparativo de agarosa y el ADN con un tamaño de 1,6 - 1,8 kb se eluyó desde el gel mediante el estuche "QuiaexIl" (de Qiagen), y se introdujo por clonación en el plásmido pBSSK(-) a través del sitio de corte con EcoRI. Se escogió un clon con un modelo de restricción correcto y se secuenció.

La secuencia en la región codificadora era idéntica en un 100% a la de los exones de la secuencia de ADN genómico. Este clon se designó como pBSPamHNL5orf.

Cebadores de oligonucleótidos

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Ejemplo 5

Producción de un fragmento de base para la construcción de plásmidos de expresión destinados a una expresión heteróloga del gen HNL5 de Prunus amygdalus en bacterias y organismos eucariotas

El objetivo de este experimento era la construcción de un plásmido, a partir del cual se pueda obtener un fragmento de ADN, que codifique el HNL5 de Prunus amygdalus, para su introducción en diferentes vectores de expresión mediante recorte con endonucleasas de restricción. En este caso, por una amplificación mediante PCR, a través de unos correspondientes cebadores, se añadieron unas secuencias adecuadas junto a los extremos del gen HNL5 de Prunus amygdalus, que está contenido en el pBSPamHNL5orf.

Con los cebadores PCRHNL5-a y PCRHNL5-e se amplificó el inserto del plásmido pBSPamHNL5orf mediante una PCR (10 ng del ADN del plásmido pBSPamHNL5orf como molde, 400 ng del cebador PCRHNL5-a, 200 ng del cebador PCRHNL5-e). La reacción de PCR se efectuó en tandas de 50 \mul de volumen en 1 x tampón para PCR (de Qiagen), que contiene 5 \mul de la mezcla de dNTPs (en cada caso 2 mM) y 1,2 U de la polimerasa de ADN Taq "Hotstar" (de Qiagen). Se hizo desarrollar el siguiente programa: 15 min a 95ºC, 30 ciclos con 1 min a 95ºC, 30 s a 68ºC, 1,5 min a 72ºC y para finalizar con 5 min a 72ºC para la producción de unos productos comple-
tos.

El fragmento de ADN obtenido, después de haber cortado con la endonucleasa de restricción EcoRI, se introdujo por clonación en el vector pBSSK(-) (de Stratagene, EE.UU) y se verificó mediante secuenciación. El plásmido resultante se designó como pBSPamHNL5ex.

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Cebadores de oligonucleótidos

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Ejemplo 6

Construcción de secuencias artificiales de expresión para la expresión heteróloga del gen HNL5 en Pichia pastoris

El ADN del plásmido pBSPamHNL5ex se cortó con EcoRI y el fragmento de HNL se separó con respecto de la porción del vector mediante una electroforesis preparativa en gel. Después de una elución del fragmento de ADN de HNL por medio del estuche Qiaex II (de Qiagen), éste se introdujo por clonación a través de los sitios de corte con EcoRI en los plásmidos pHILD2 y pGAPZ (de Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). La orientación correcta de los insertos con respecto a los promotores se comprobó con ayuda de cortes de control. Se escogió en cada caso un clon con un inserto orientado correctamente y se conservó. Las transiciones correctas desde la porción del vector hasta el fragmento de HNL incorporado se verificaron mediante una secuenciación. Estos dos plásmidos de expresión resultantes para Pichia pastoris se designaron como pHILDPamHNL5a (para una expresión inducible) y pGAPPamHNL5a (para una expresión constitutiva).

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Ejemplo 7

Expresión inducible del gen HNL5 de Prunus amygdalus en Pichia pastoris

El ADN del plásmido pHILDPamHNL5a se cortó con la endonucleasa de restricción NotI y se transformó en el seno de Pichia pastoris GS115 (de Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). La transformación se efectuó según las prescripciones del estuche "Pichia Expression Kit" [Estuche de expresión en Pichia] (de Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.). 100 clones prototrofos para histidina se cultivaron según las prescripciones del estuche "Pichia Expression Kit" en un medio líquido (500 ml de cultivos de sacudimiento) y se indujeron durante 48 horas con metanol. Las células se separaron por centrifugación y se suspendieron con un tampón de disgregación (Tris-HCl 50 mM, de pH 7,6) hasta una densidad óptica (OD_{600}) de 50,0, y se disgregaron según el "método de la bola de vidrio" (Ausubel y colaboradores, Current Protocolls in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, Nueva York, 1999) en un homogeneizador "Merckenschlager" (de la entidad Braun, Melsungen, Alemania). Tanto los materiales sobrenadantes del cultivo como también los materiales lisados de las células fueron ensayados en cuanto a la actividad de una enzima HNL con un ensayo clásico de la actividad (análogamente al documento de patente internacional WO 97/03.204) mediando utilización de mandelonitrilo racémico como substrato. Se escogieron y conservaron dos clones, que mostraron las óptimas actividades en el material sobrenadante del cultivo en el caso de estos experimentos en un matraz de sacudimiento (Pichia pastoris PamHNL5-a37 y Pichia pastoris PamHNL5-a4). Un análisis del tipo de aprovechamiento de metanol dio como resultado el fenotipo Mut^{+} (un buen aprovechamiento del metanol) para Pichia pastoris PamHNL5-a37 y el fenotipo Mut^{S} (un lento aprovechamiento del metanol) para Pichia pastoris PamHNL5-a4.

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Ejemplo 8

Expresión constitutiva del gen HNL5 de Prunus amygdalus en el seno de Pichia pastoris

El plásmido pGAPPamHNL5a se transformó en el seno de P. pastoris GS115. La transformación se efectuó según las prescripciones del estuche de expresión en Pichia de la Invitrogen Corp, San Diego, CA, EE.UU.). La selección de los transformantes se efectuó sobre placas de medio completo YPD con 100 mg/l de zeocina. 100 clones resistentes a zeocina se cultivaron en cada caso en 500 ml del medio completo YPD y se sacudieron durante 96 horas a 30ºC. Las células se separaron por centrifugación y se determinó la actividad de HNL en el material sobrenadante del cultivo. Se conservó un clon que mostró la mejor actividad en el material sobrenadante del cultivo, y se designó como Pichia pastoris PamHNL5-a2.

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Ejemplo 9

Producción de HNL con una cepa de Pichia pastoris transformada con el gen HNL5 procedente de Prunus amygdalus (mediante un sistema de expresión indiciable? (inducible) con metanol) en un biorreactor de laboratorio

La cultivación de Pichia pastoris PamHNL5-a37 se efectuó en un biorreactor de laboratorio clásico (con un volumen total de 42 l) en un procedimiento en tres fases. Éste se componía de una primera fase de crecimiento exponencial y de una segunda fase de crecimiento lineal para la formación de una biomasa, y de una subsiguiente fase de expresión para la formación de la enzima recombinante HNL de Prunus amygdalus, procediéndose en principio según el método descrito para la preparación de HNL recombinante de Hevea brasiliensis (Hasslacher, M., Schall, M., Hayn, M., Bona, R., Rumbold, K., Lückl, J., Griengl, H., Kohlwein, S.D., Schwab, H.: High Level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts [Expresión intracelular de alto nivel de la hidroxinitrilo liasa procedente del árbol tropical de caucho Hevea brasiliensis en anfitriones microbianos]. Protein Expression and Purification [Expresión y purificación de proteínas] 11, 61-71,
1997).

En detalle, se respetaron las siguientes condiciones:

Los agentes químicos 1.-8., dimensionados para 20 litros, se dispusieron previamente en el biorreactor, disueltos en 15 litros de agua, y se esterilizaron en común con el reactor a 121ºC durante 1 hora. Después de un enfriamiento a 29ºC, se ajustó el valor del pH en el medio a un pH de 5,0 con amoniaco (agente químico 9, dispuesto previamente en una botella de afluencia estéril). Después de esto, aproximadamente 200 ml de una solución de elementos traza (agentes químicos 10-18, con unas cantidades correspondientes para 20 l) filtrada en condiciones estériles, se introdujeron en el biorreactor a través de una botella de afluencia.

El biorreactor preparado previamente de esta manera se inoculó con 2 litros de un cultivo preliminar, que se había cultivado en matraces de sacudimiento a 30ºC de acuerdo con las condiciones indicadas en el manual del estuche "Pichia Expression Kit" (de Invitrogen Corp., San Diego, CA, EE.UU.). La cultivación se llevó a cabo a una temperatura constante de 29ºC. Mediante regulación de la aireación (entre 15 y como máximo 40 litros de aire/min) y del número de revoluciones del agitador (entre 250 y 500 rpm), se mantuvo la presión parcial de O_{2} a un valor mayor que un 30% de la concentración de saturación. Después de 21 horas, la biomasa había crecido hasta un valor situado en la región de 22 g/l de peso en seco de las células (ZTG de ZellTrockenGewicht). A partir de este momento se añadió dosificadamente glicerol estéril en porciones pequeñas constantes, a intervalos de 15 min, añadiéndose 130 g de glicerol por hora. En esta segunda fase de crecimiento lineal, se pudo alcanzar una concentración de la biomasa en la región de 70 g/l de ZTG en un período de tiempo de 42 horas.

Después de esto, se inició la tercera fase con la inducción de la expresión mediante una adición dosificada de metanol. En este caso, el contenido de metanol en el caldo de cultivo se ajustó a un valor de 0,8-1% en peso. Al comienzo de la inducción y después de una inducción durante dos días, se añadió en cada caso una porción adicional de la solución estéril de elementos traza (agentes químicos 10-18, en unas cantidades correspondientes para 20 l, disueltas en aproximadamente 200 ml de agua). Después de una fase de inducción durante 110 horas, se pudo obtener una cantidad de enzimas de 110 U/ml del caldo de cultivo. Después de haber separado las células mediante, por ejemplo, una centrifugación, se puede obtener una preparación enzimática en bruto, que se puede emplear directamente para reacciones biocatalíticas.

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Se usaron los siguientes agentes químicos para la producción del medio de cultivo (cantidad por litro):

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Elementos traza y vitamina H (todos los agentes químicos en una calidad p.a.):

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Ejemplo 10

Construcción de un clon para la expresión del gen HNL5 de Prunus amygdalus como una proteína de fusión con porciones terminales de N y terminales de C de la glucosa oxidasa de Aspergillus niger

Esta construcción se concibió de tal manera que la proteína de fusión, que se había formado, se dirigió a la vía secretoria a través de la secuencia de señal heteróloga.

Mediante una PCR en una tanda de 50 \mul en 1 x tampón para PCR (de Qiagen) en cada caso con 100 pmol de los cebadores Glucox2 y Glucoxct, 10 ng del plásmido pPamHNL5orf como molde, 5 \mul de una mezcla de dNTPs (en cada caso 2 mM) y 1,2 U de la polimerasa de Taq "Hotstar" (de Qiagen) se sustituyeron en el extremo del terminal de C y el extremo del terminal de N del gen HNL5 por una secuencia derivada de la glucosa oxidasa, o respectivamente se acortaron (programa: 15 min a 95ºC, 30 x: 1 min a 95ºC, 1 min a 68ºC, 2 min a 72ºC, y para finalizar 10 min a 72ºC).

En una 2ª PCR, en una tanda de 50 \mul en 1 x tampón para PCR (de Qiagen) con 0,1 \mul del producto de la primera PCR como molde, en cada caso 100 pmol de los cebadores Glucox1 y Gucoxct, 2 \mul de una mezcla de dNTPs (en cada caso 2 mM), y 2,5 U de la polimerasa Pwo (de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), (programa: 5 min a 95ºC, 30 veces: 1 min a 95ºC, 0,5 min a 68ºC, 3 min a 72ºC y al final 3 min a 72ºC) se completó finalmente la región 5' del gen.

A través de los sitios de corte con EcoRI, que se introdujeron simultáneamente junto a los extremos del fragmento de ADN, se incorporó el producto de la PCR en el plásmido pHILD2 (de Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU.), después de haber cortado con EcoRI. Un clon con la orientación correcta del inserto con respecto al promotor de aox del plásmido pHilD2, se verificó mediante secuenciación de las regiones de transición desde el vector al inserto y se conservó. El plásmido construido de esta manera se designó como pHILDPamHNL5gox.

Un ADN linealizado con NotI del plásmido pHILDPamHNL5gox se transformó en el seno de la cepa de Pichia pastoris GS115 así como en la cepa deficiente en proteasas Pichia pastoris SMD1168. De cada tanda se cultivaron varios clones prototrofos para histidina en matraces de sacudimiento, y se determinó la actividad de HNL en el material sobrenadante del cultivo (ensayo patrón). Estos experimentos se llevaron a cabo análogamente a como se ha descrito en el Ejemplo 7. En el material sobrenadante del cultivo se pudo encontrar en algunos clones una actividad de HNL, con lo que se pudo comprobar que la secuencia de señal del gen gox de Aspergillus niger está capacitada para dirigir a la proteína HNL5 heteróloga a la vía secretoria en el caso de la expresión en el seno de Pichia pastoris.

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Cebadores de oligonucleótidos utilizados

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La secuencia de ácido nucleico del fragmento de ADN, que codifica una proteína híbrida secretoria (PamHNL5x
GOX) con actividad de HNL, se reproduce en la Figura 4, la secuencia de aminoácidos derivada de ésta se reproduce en la Figura 5. Una comparación de las secuencias de aminoácidos de la HNL5 procedente de Prunus amygdalus y de la proteína híbrida PamHNL5xGOX se puede tomar de la Figura 6.

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Ejemplo 11

Una proteína recombinante con actividad de HNL, que se había producido con la cepa recombinante de Pichia pastoris PamHNL5-a37 tal como se describe en el Ejemplo 9, se sometió a un análisis de la glicosilación mediante una digestión con endoglicosidasas. Para ello, 100 ml del material sobrenadante del cultivo se concentraron en 10 veces mediante una ultrafiltración (Biomax 30,000 NMWL, de Millipore, Bedford MA, EE.UU). Las muestras 1-2 se trataron con la N-glicosidasa F (estuche "N-Glykosidase F", de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).

En el caso de las muestras 4-5 se utilizó una preparación de HNL procedente de almendras de la entidad Roche, y en el caso de las muestras 6 y 7, el material sobrenadante aumentado de concentración del cultivo se trató con la endoglicosidasa H (de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Todas las tandas se llevaron a cabo en 10 \mul de volumen total.

Patrón:

Patrón de pesos moleculares del estuche "N-Glykosidase F" (5 \mul = 5 \mug)

Muestra 1:

2 U de PamHNL5 se trataron con 2,4 U de la enzima según la prescripción del estuche.

Muestra 2:

2 U de PamHNL5 se trataron con 2,4 U de la enzima según la prescripción del estuche, pero sin tampón de desnaturalización y sin desnaturalización por calor

Muestra 3:

2 PamHNL5 sin tratamiento

Muestra 4:

0,25 U de la preparación de R-HNL de grado III procedente de almendras de Roche (10,3 U/mg) se trataron con 2,4 U de N-glicosidasa F según la prescripción del estuche

Muestra 5:

0,25 U de la preparación de R-HNL de grado III de Roche (10,3 U/mg) no tratada

Muestra 6:

2,4 U de PamHNL5 se incubaron con 50 mU de la endoglicosidasa H en un tampón de fosfato 20 mM, sin desnaturalización durante 12 horas a 37ºC.

Muestra 7:

2,4 U de PamHNL5 se incubaron con 5 mU de la endoglicosidasa H en un tampón de fosfato 20 mM, SDS al 0,2%, mercaptoetanol al 0,4% durante 12 horas a 37ºC.

Después de los tratamientos con las glicosidasas se separaron las muestras sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 12% y se tiñeron con Commassie Blue.

Estos resultados (véase la Figura 7) muestran que una gran parte de los oligosacáridos unidos a PamHNL5 puede ser eliminada por medio de la endoglicosidasa H también sin ninguna desnaturalización de la proteína PamHNL5.

Mediante la separación de los oligosacáridos, a partir de una mancha visible de proteínas con unos tamaños de 70 hasta más de 100 kDa, resulta una banda nítida a aproximadamente 60 kDa, lo que corresponde al peso molecular calculado de una proteína PamHNL5 no glicosilada.

Una banda de proteínas comparable no está presente en el preparado de Roche o sólo lo está en una medida grandemente secundaria. Además, no se puede observar ninguna diferencia significativa entre una preparación de proteínas no tratada y una preparación tratada con la endoglicosidasa F. A partir de este hallazgo, se puede comprobar inequívocamente que la enzima recombinante PamHNL5 se diferencia completamente del material enzimático obtenido a partir de corazones de almendras.

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Ejemplo 12

Clonación de un fragmento de ADN genómico con la región codificadora del gen HNL1 de Prunus amygdalus

Un fragmento de ADN genómico con la región codificadora del gen HNL1 de Prunus amygdalus se amplificó con los cebadores mandlp2f (5'-ACTACGAATTCGACCATGGAGAAATCAAC-3') y ecpamHNL1e (5'-CAGAATTC
GCCCTTGTGCATGCATCGATTAAAGAACCAAGGATGCTGCTGAC-3') procedentes de un ADN genómico de almendra (para la preparación, véase el Ejemplo 1) con ayuda de una PCR.

La amplificación se llevó a cabo en reacciones con unos volúmenes de 50 \mul con 1,2 unidades de la polimerasa de ADN "Hotstar" (de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), en cada caso 10 pmol de los dos cebadores, 2 \mul de una mezcla de dNTPs (en cada caso 5 mM) y 100 ng de ADN genómico de almendra en un tampón clásico para PCR (de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se utilizó el siguiente programa de PCR:

15 min a 95ºC, luego 10 ciclos con 1 min a 94ºC, 1 min a 45ºC y 1 min 20 s a 72ºC, seguidos por 30 ciclos con 1 min a 94ºC, 1 min a 64ºC y 1 min 20 s a 72ºC, así como una final etapa de "extensión o prolongación" durante 5 min a 72ºC.

Un análisis del ADN obtenido dio como resultado que mediante esta PCR se habían obtenido varios fragmentos de ADN con tamaños diferentes. El ADN amplificado se separó en un gel preparativo de agarosa. El ADN procedente de una banda que tiene el tamaño de aproximadamente 2,1 kb, que se ha de esperar para el gen HNL1, se aisló a partir de este gel de agarosa con el estuche de extracción en gel (Qiaquick Gel Extraction Kit, de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). El ADN obtenido, después de una digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI a través del sitio de corte con EcoRI, se introdujo por clonación en el vector de clonación pBSSK(-) (de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, EE.UU). Se aislaron 5 clones con los correspondientes insertos y se secuenciaron los insertos mediante la estrategia de "migración de cebador". Se escogió un clon, que correspondía a la secuencia de consenso así obtenida, y el plásmido contenido se designó como pSKpamHNL1_5_3.

Para la verificación y la determinación definitiva de la secuencia de ADN del gen HNL1 de Prunus amygdalus un fragmento adicional de ADN genómico se amplificó con los cebadores

mandlp3f (5'-ACTACGAATTCGACCATGGAGAAATCAACAATG-3') y pamHNL1end (5'-ATGCTGCTGACT
TGAGGGAATC-3').

La amplificación se llevó a cabo en reacciones con unos volúmenes de 50 \mul con 2,5 unidades de la polimerasa de ADN "Hotstar" (de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), en cada caso 10 pmol de los dos cebadores, 2 \mul de una mezcla de dNTPs (en cada caso 5 mM) y 50 ng de un ADN genómico de almendra en un tampón clásico para PCR (de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se utilizó el siguiente programa de PCR:

15 min a 95ºC, luego 5 ciclos con 1 min a 94ºC, 30 s a 55ºC y 2 min a 72ºC, luego 30 ciclos con 1 min a 94ºC, 30 s a 68ºC y 2 min a 72ºC, así como una final etapa de "extensión" durante 7 min a 72ºC.

Después de una separación del producto de PCR en un gel de agarosa, se detectó una banda individual de ADN. El producto de la PCR se purificó mediante el estuche Qiaquick Gel Extraction Kit (de Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y se secuenció mediante la estrategia de "migración de cebadores".

La secuencia de ADN se reproduce en la Figura 8. Los posibles intrones se identificaron a través de sus sitios generales de empalme en 5' y 3', así como su homología con el gen HNL1 de Prunus amygdalus. Los nucleótidos situados en las regiones de los tres intrones se muestran en letras minúsculas para el reconocimiento de las regiones de intrones. El inserto clonado en el plásmido pSKpamHNL1_5_3 tiene la misma secuencia.

La secuencia de proteínas de la proteína HNL1 de Prunus amygdalus se dedujo a partir de la región codificadora de la secuencia de ADN y se reproduce en la Figura 9.

Claims (9)

1. Ácido nucleico aislado, que tiene la secuencia de nucleótidos, que se reproduce en la Figura 8, desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2.083 ininterrumpidamente, o que abarca esta secuencia con resta de las regiones de intrones de los nucleótidos 104 hasta 249, 907 hasta 1.047 y 1.889 hasta 1.993.

2. Ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos que se reproduce en la Figura 8.

3. Proteínas recombinantes, que comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la Figura 9.

4. Proteínas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque tienen una glicosilación específica de un anfitrión.

5. Proteínas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque se preparan mediante expresión en un microorganismo eucariótico.

6. Proteínas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque se preparan mediante expresión en el seno de un hongo.

7. Proteínas recombinantes de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque la proteína tiene la secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

8. Utilización de proteínas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 - 7 para la preparación de (S)- o (R)-cianhidrinas.

9. Procedimiento para la preparación de (S)- o (R)-cianhidrinas, caracterizado porque se hacen reaccionar aldehídos y cetonas alifáticos(as), aromáticos(as) o heteroaromáticos(as), en presencia de un donante de grupos cianuro con proteínas de acuerdo con una de las reivindicaciones 3-7, en el seno de un sistema orgánico, acuoso o de 2 fases, o en una emulsión.