ES2256149T3 - Genes, que contienen una secuencia de dna que codifica hidroxinitritilasa, proteinas recombinantes con actividad hidroxinitrilasa y su empleo. - Google Patents
Genes, que contienen una secuencia de dna que codifica hidroxinitritilasa, proteinas recombinantes con actividad hidroxinitrilasa y su empleo.Info
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Abstract
Ácido nucleico aislado, que comprende un ácido nucleico con la secuencia continua SEQ ID NO: 19 desde el nucleótido 13 hasta el nucleótido 2151 o que comprende ésta secuencia menos las zonas de intrón desde los nucleótidos 116 hasta 257, desde 918 hasta 1120 y desde 1962 hasta 2077.
Description
Genes, que contienen una secuencia de DNA que
codifica hidroxinitritilasa, proteínas recombinantes con actividad
hidroxinitrilasa y su empleo.
Los procedimientos biocatalíticos han adquirido
un gran significado para la industria química. La realización de
reacciones químicas con ayuda de catalizadores biológicos es
interesante ante todo en aquellos campos de aplicación, en los
cuales pueda aprovecharse la propiedad de los enzimas,
frecuentemente presente, para favorecer o para formar
preferentemente, en el caso de reacciones químicas con componentes
quirales o proquirales, uno de los dos enantiómeros.
Las condiciones previas esenciales para el
aprovechamiento de éstas propiedades favorables de los enzimas son
su disponibilidad en cantidad industrialmente necesaria y una
reactividad suficientemente elevada, así como estabilidad bajo las
condiciones reales de un procedimiento industrial.
Una clase especialmente interesante de compuestos
químicos quirales está constituida por las cianhidrinas. Las
cianhidrinas tienen importancia, por ejemplo, en la síntesis de
\alpha-hidroxiácidos, de
\alpha-hidroxicetonas, de
\beta-aminoalcoholes, que encuentran aplicación
para la obtención de productos biológicamente activos, por ejemplo
productos farmacéuticamente activos, vitaminas o compuestos
piretroides.
La obtención de éstas cianhidrinas se lleva a
cabo mediante la adición de ácidos cianhídrico sobre el grupo
carbonilo de una cetona o aldehído.
La obtención industrial de compuestos quirales,
tales como por ejemplo las (S)-cianhidrinas, pudo
llevarse a cabo mediante el desarrollo del enzima
(S)-hidroxinitril liasa a partir de Hevea
brasiliensis y se ha descrito, por ejemplo, en las publicaciones
WO 97/03204, EP 0 951561 y EP 0 927 766.
Sin embargo existe un gran número de compuestos
químicos, interesantes, en los que son significativos para la
aplicación industrial los enantiómeros R. Hasta ahora se han
descrito únicamente procedimientos para la obtención de una serie de
productos, que únicamente podían ser empleados a escala de
laboratorio (por ejemplo las publicaciones: EP 0 276 375, EP 0 326
063, EP 0 547 655). En éste caso se emplearon preponderantemente
preparaciones enzimáticas, que se habían obtenido a partir de
plantas de la familia Rosaceae, por ejemplo a partir de las
pepitas de almendra (Prunus amygdalus).
En los últimos tiempos ha adquirido cada vez
mayor significado la Prunus spezies, de manera que se ha
intentado su investigación más exacta.
Se sabe por la literatura especializada, por
ejemplo por Plant Physiology, Abril 1999, Vol 119, páginas
1535-1546, que pueden presentarse en la Prunus
spezies varios isoenzimas R-HNL. Éstos
isoenzimas son expresados con intensidad variable en los diversos
tejidos de las plantas. En el caso de la planta Prunus
amygdalus que está próximamente emparentada con Prunus
serotina, han podido identificarse hasta ahora 5 isoenzimas
diferentes y se han secuenciado sus genes. Hasta el presente se ha
descrito de Prunus amygdalus únicamente un isoenzima en la
publicación Planta (1998) 206: 388-393,
concretamente uno que es expresado con intensidad máxima en los
capullos de las flores. Se ha aislado ya un gen para éste isoenzima
R-NHL y se ha secuenciado el cDNA.
Sin embargo, no se ha descrito todavía ningún
informe sobre una expresión heteróloga con éxito (funcional) de un
gen de éste tipo en la literatura especializada o en la literatura
de patentes.
Tampoco se han realizado, hasta ahora,
aplicaciones industriales a gran escala. El motivo fundamental se
debe a que las preparaciones enzimáticas constituidas por pepitas de
almendras con actividad de hidroxinitrilasa no estaban disponibles
hasta ahora en cantidades suficientes y a precios aceptables.
El objetivo de ésta invención es, por lo tanto,
conseguir una base que pueda poner a disposición una
R-hidroxinitrilasa en cantidades necesarias para
aplicaciones industriales.
Para conseguir éste objetivo se buscó una vía
para producir un enzima, correspondiente a la preparación de
R-HNL de Prunus amygdalus mediante
estrategias de ingeniería genética con ayuda de una cepa de
microorganismos recombinante, correspondiente. Un enzima
recombinante de éste tipo con actividad R-HNL
debería poderse poner a disposición de éste modo industrialmente en
cantidades suficientes.
A partir de las secuencias de DNA descritas en la
literatura anteriormente citada, puede derivarse que en los genes de
los diversos isoenzimas se conservan determinadas zonas en gran
medida. Esto se toma como base, según la invención, para generar
iniciadores para la amplificación PCR de genes P. amygdalus
R-HNL. Con ayuda de tales iniciadores pueden
amplificarse a continuación trozos de DNA con DNA aislado a partir,
por ejemplo, de pepitas de almendra (P. amygdalus) como
matrices (muestras) por medio de PCR, que muestran bandas
específicas concretas en el caso del análisis mediante
electrofóresis de gel-agarosa. Según la invención
tenían que encontrarse en éste caso bandas que correspondiesen al
tamaño de los genes mdl (Planta (1998) 206:
388-393). A continuación se generan iniciadores
correspondientes para todos los isoenzimas conocidos en el caso de
Prunus serotina y se obtienen productos correspondientes PCR.
Se aísla el DNA de ésta zona a partir del geles de agarosa
preparativos correspondientes y se incorporan por clonación en
Escherichia coli en vectores normalizados para la clonación
de fragmentos generados por PCR.
El análisis de las secuencias de una serie de
clones seleccionados indicó que estaban presentes clones con
homologías con respecto a los correspondientes genes, ya conocidos
R-HNL de tipos de Prunus, aún cuando las
secuencias de los clones, obtenidos de éste modo o bien de los genes
se diferenciaban en varias posiciones de las secuencias de las
secuencias ya conocidas o bien publicadas, con lo cual se
determinaron diferencias funcionales importantes.
Así pues se encontró, inesperadamente, una nueva
variante de los genes HNL, aún cuando se utilizaron combinaciones de
iniciadores, en los cuales se habían utilizado las secuencias, ya
conocidas, de un cDNA obtenido a partir del material de las flores
de Prunus amygdalus.
El nuevo gen se secuenció y se determinó la
secuencia de DNA genómica.
El objeto de la presente invención es, por lo
tanto, un nuevo gen, que abarca la secuencia de nucleótidos SEQ ID
NO: 19 continua desde el nucleótido 13 hasta el nucleótido 2151 o
que abarca ésta secuencia menos las zonas del intrón desde los
nucleótidos 116 hasta 257, desde 918 hasta 1120 y desde 1962 hasta
2077.
De éste modo pueden prepararse iniciadores
específicos PCR basados en la homología de la secuencia del gen MDL1
de Prunus amygdalus y del gen mdl5 de Prunus serotina,
después de lo cual se obtiene el nuevo gen, el gen HNL5, tras
amplificación y clonación.
De manera ejemplificativa el gen HNL5,
obtenido mediante amplificación PCR, procedente de Prunus
amygdalus, la secuencia de nucleótidos representada en la figura
1 (SEQ ID NO: 19).
El nuevo gen HNL5 se diferencia de la
secuencia publicada del gen MDL1 de Prunus amygdalus en 7
pares de bases.
Los clones genómicos o bien sus DNA genómicos
representan la base para la obtención de preparaciones enzimáticas
mediante expresión heteróloga, por ejemplo mediante expresión
inducible o constituyente, en diversas células huésped.
Además puede verse por el análisis secuencial del
DNA genómico del nuevo gen, según la invención, que la proteína
codificada por el nuevo gen está constituida por una proteína que
dispone de una secuencia de señal o bien de un péptido de señal
vegetal, con lo cual es posible también una expresión de secreción
de proteínas heterólogas en células huésped adecuadas.
En éste caso se utilizaron vectores especiales de
expresión, con los cuales se expresa como proteína de fusión con un
péptido de señal la proteína codificada por uno de los nuevos genes
incorporados por clonación.
La presente invención se refiere, por lo tanto,
además, a proteínas recombinantes, que pueden ser preparadas
mediante expresión heteróloga de la secuencia de DNA del gen
HNL5 de Prunus amygdalus en células huésped
adecuadas.
Las células huésped, adecuadas en éste caso, son,
por ejemplo, microorganismos. Son preferentes microorganismos
eucarióticos, siendo especialmente preferentes los hongos. Ejemplos
a éste respecto son Saccharomyces cerevisiae o Pichia
pastoris.
La secuencia de aminoácidos derivada de la
secuencia de nucleótidos del gen HNL5 de la hidroxinitrilasa
HNL5 de Prunus amygdalus ha sido representada en la figura 3
(SEQ ID NO: 20).
Para obtener proteínas recombinantes con
actividad hidroxinitrilasa se incorpora el gen correspondiente
HNL5, por ejemplo en un vector de expresión para Pichia
pastoris o para Saccharomyces cerevisiae.
Como paso previo puede engarzarse el DNA genómico
por medio de PCR. Preferentemente se preparará un fragmento básico
para la construcción de los plásmidos de expresión para la expresión
heteróloga del gen correspondiente en bacterias y en eucariotas.
Para ello se construye un plásmido, a partir del cual puede
obtenerse un fragmento de DNA que codifique el gen según la
invención para la incorporación en diversos vectores de expresión
mediante el corte con endonucleasas de restricción.
Así pues, con los genes según la invención puede
producirse mediante expresión, por ejemplo con un sistema promotor
inducible o con un sistema promotor de expresión constructivo, en un
huésped heterólogo un HNL funcional. Así pues, a partir de un gran
número de transformados pudieron encontrarse cepas recombinantes de,
por ejemplo, Pichia pastoris, que sobreexpresaron proteína
recombinante con actividad R-HNL. La proteína con
actividad R-HNL puede encontrarse en éstas cepas
tras inducción de la expresión, en su parte preponderante en el
sobrenadante del cultivo.
Así pues, pudo prepararse por primera vez una
proteína recombinante en cantidades empleables para aplicaciones
industriales, que presenta una actividad R-HNL
comparable a la que puede encontrarse en las pepitas de almendra
(pepitas de Prunus amygdalus).
Inesperadamente pudo observarse, que la proteína
recombinante con actividad R-HNL, que se deriva del
gen HNL5, según la invención, y que se denomina como
Pam-HNL5, presenta propiedades sensiblemente
mejores, en comparación con el preparado enzimático aislado a partir
de pepitas de almendra, a modo de biocatalizador en cargas de
reacción para la obtención de cianhidrinas y, por lo tanto, que
puede emplearse de forma especialmente ventajosa para la síntesis
biocatalítica de cianhidrinas.
La secuencia de la proteína recombinante según la
invención puede acortarse además en los extremos
C-terminales, o bien puede intercambiarse la
secuencia en la zona N- y C-terminal por las de la
glucosaoxidasa de Aspergillus niger.
La proteína recombinante se caracteriza,
especialmente, también porque presenta una glicosilación específica
del huésped, con lo cual la proteína recombinante es sensiblemente
más estable que la proteína nativa.
Una ventaja especial de la proteína recombinante
según la invención se desprende de la estabilidad esencialmente
mayor con lo que se requiere una cantidad enzimática esencialmente
menor en comparación con el enzima nativo para conseguir una elevada
pureza de los enantiómeros. De éste modo, ensayos comparativos
muestran que, cuando se utiliza la proteína recombinante según la
invención se requiere únicamente un décimo de la cantidad necesaria
de proteína nativa para conseguir una pureza comparable de los
enantiómeros (valores ee).
Otro objeto de la invención es, por lo tanto, el
empleo de la proteína recombinante según la invención (HNL) para la
obtención de (S)- o (R)-cianhidrinas.
Como materiales de partida para la obtención de
las (S)- o (R)-cianhidrinas se emplea un aldehído o
una cetona a modo de substrato, un donador de grupos cianuro y la
proteína recombinante según la invención.
Se entenderán por aldehídos, en éste caso, los
aldehídos alifáticos, aromáticos o heteroaromáticos. Se entenderán
por aldehídos alifáticos, en éste caso, aldehídos saturados o
insaturados, alifáticos, de cadena lineal, de cadena ramificada o
cíclicos. Los aldehídos alifáticos preferentes son aldehídos de
cadena lineal con, especialmente, 2 hasta 30 átomos de carbono,
preferentemente con 2 hasta 18 átomos de carbono, que sean saturados
o mono o poliinsaturados. El aldehído puede presentar en éste caso
tanto dobles enlaces C-C como también triples
enlaces C-C. Además los aldehídos alifáticos,
aromáticos o heteroaromáticos pueden estar insubstituidos o pueden
estar substituidos por grupos inertes bajo las condiciones de la
reacción, por ejemplo por grupos arilo o heteroarilo, en caso dado
substituidos, tales como grupos fenilo, fenoxi o indolilo, por
grupos halógeno, hidroxi, hidroxi-alquilo con 1 a 5
átomos de carbono, alcoxi con 1 a 5 átomos de carbono, alquiltio con
1 a 5 átomos de carbono, éter, alcohol, carboxilo, nitro o
azido.
azido.
Ejemplos de aldehídos aromáticos o
heteroaromáticos son benzaldehído o bien diversos benzaldehídos
substituidos tales como por ejemplo
3,4-diflúorbenzaldehído,
3-fenoxibenzaldehído,
4-flúor-3-fenoxibenzaldehído,
hidroxibenzaldehído, metoxibenzaldehído, además furfural,
metilfurfural,
antraceno-9-carbaldehído,
furano-3-carbaldehído,
indol-3-carbaldehído,
naftalin-1-carbaldehído,
ftaldialdehído,
pirazol-3-carbaldehído,
pirrol-2-carbaldehído,
tiofeno-2-carbaldehído,
isoftalaldehído o piridinaldehídos, tienilaldehídos, etc.
Las cetonas son cetonas alifáticas, aromáticas o
heteroaromáticas, en las cuales está substituido de manera no
idéntica el átomo de carbono del carbonilo. Se entenderán por
cetonas alifáticas las cetonas saturadas o insaturadas, de cadena
lineal, de cadena ramificada o cíclicas. Las cetonas pueden ser
saturadas o pueden estar mono o poliinsaturadas. Pueden estar
insubstituidas o pueden estar substituidas por grupos inertes bajo
las condiciones de la reacción, por ejemplo por grupos arilo o
heteroarilo substituidos en caso dado, tales como grupos fenilo o
indolilo, por grupos halógeno, éter, alcohol, éster de ácido
carboxílico, nitro o azido.
Ejemplos de cetonas aromáticas o heteroaromáticas
son acetofenona, indolilacetona, etc.
Los aldehídos y las cetonas, que son adecuadas
según la invención, son conocidas o pueden prepararse de manera
usual.
Los substratos se hacen reaccionar con un donador
de grupos cianuro en presencia de los HNL según la invención.
Como donador de grupos cianuro entran en
consideración ácido cianhídrico, cianuros alcalinos o una
cianhidrina de la fórmula general I
R_{1}R_{2}C(OH)(CN)
En la fórmula I, R_{1} y R_{2} significan,
independientemente entre sí, hidrógeno o un grupo hidrocarbonado
insubstituido, o R_{1} y R_{2} significan, conjuntamente, un
grupo alquileno con 4 a 5 átomos de carbono, donde R_{1} y R_{2}
no significan, simultáneamente, hidrógeno. Los grupos
hidrocarbonados son grupos alifáticos o aromáticos, preferentemente
alifáticos. De forma especialmente preferente, R_{1} y R_{2}
significan grupos alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, siendo muy
preferente el donador de grupos cianuro constituido por la
acetoncianhidrina.
La obtención del donador de grupos cianuro puede
llevarse a cabo según procedimientos conocidos. Las cianhidrinas,
especialmente la acetoncianhidrina, pueden adquirirse también el
comercio.
Preferentemente se empleará ácido cianhídrico
(HCN), KCN, NaCN, o acetoncianhidrina, de forma especialmente
preferente ácido cianhídrico como donador de grupos cianuro.
El ácido cianhídrico puede liberarse en éste caso
poco antes de la reacción a partir de una de sus sales tales como
por ejemplo NaCN o KCN y añadirse en substancia o en forma disuelta
a la mezcla de la reacción.
La reacción puede llevarse a cabo en el sistema
orgánico, acuoso o de dos fases o en emulsión.
Como sistema acuoso se empleará una solución
acuosa, que contenga el HNL según la invención o solución tampón.
Ejemplos a éste respecto son: el tampón de citrato de Na, el tampón
de fosfato, etc.
Como diluyentes orgánicos pueden emplearse
hidrocarburos alifáticos o aromáticos no miscibles con agua o solo
ligeramente miscibles con agua, que en caso dado estén halogenados,
alcoholes, éteres o ésteres o mezclas de los mismos. Preferentemente
se empleará metil-terc.-butiléter (MTBE),
diisopropiléter, dibutiléter y acetato de etilo sus mezclas.
El HNL según la invención puede presentarse en
éste caso bien como tal o inmovilizado en un diluyente orgánico,
pudiéndose llevar a cabo la reacción, sin embargo, también en un
sistema bifásico o en emulsión con HNL no inmovilizado.
Se trocearon finamente pepitas de almendra secas
(Farmgold, número de la carga L4532, cosecha 1999) con un cuchillo
y se congelaron con nitrógeno líquido en una cápsula de raspado y se
rasparon para dar un polvo fino bajo nitrógeno líquido con un
pistilo. Se combinaron 0,1 gramos del polvo congelado de pepitas de
almendra directamente con "tampón de Breaking" (100 mmoles de
NaAc; 50 mmoles de EDTA; 500 mmoles de NaCl, ajustado a pH 5,5; 1,4%
de SDS y 20 \mug/ml de RNAsa A), calentado a 65ºC. Tras una
incubación de 15 minutos bajo agitación se separó el residuo celular
no disuelto por centrifugación (10 minutos a 7000 g) y el
sobrenadante se combinó con un volumen idéntico de acetato de amonio
10 M y a continuación se incubó durante 10 minutos sobre hielo. Al
cabo de 15 minutos de centrifugación a 10.000 g se extrajo el
sobrenadante 2 x con fenol/cloroformo (1/1, fenol equilibrado con 50
mmoles de tris, pH 8,0). Al cabo de otra extracción con un volumen
dos veces mayor de cloroformo/alcohol isoamílico (24/1) se precipitó
el DNA a partir del sobrenadante con un volumen idéntico de
isopropanol, se separó por centrifugación, el pellet de DNA se lavó
con etanol al 70% y se secó al aire. El DNA se disolvió a
continuación durante 20 minutos a 68ºC en 200 \mul de agua y se
purificó mediante una precipitación en etanol (Ausbel et al.,
1999). Tras la centrifugación se secó al aire el pellet de DNA y se
disolvió en 50 \mul de agua.
Puesto que se sabía que en Prunus spezies
pueden presentarse varios isoenzimas de hidroxinitrilasas con
elevada homología secuencial entre sí (Hu und Poulton, 1999), se
preparó el iniciador específico PCR basado en la homología
secuencial del gen mdl5 de Prunus serotina y del gen
MDL1 de Prunus amygdalus (Suelves et at.,
1998):
Iniciador 1:
5'-CGGAATTCACAATATGGAGAAATCAACAATGTCAG-3'
Iniciador 2:
5'-CGGAATTCTTCACATGGACTCTTGAATATTATG-3'
La amplificación se llevó a cabo en una carga de
50 \mul con 1,2 U "Hotstar" Taq DNA polimerasa
(Qiagen, Hilden, Alemania), con 50 ng de DNA genómico de almendras
como "matriz", respectivamente 200 ng de iniciador 1 y 2, 5
\mul de un dNTP (respectivamente 2 mmoles) de Mix, todo ello en 1
x tampón PCR de acuerdo con el manual del "estuche Hotstar"
(Qiagen, Hilden, Alemania), comenzándose con una etapa de
desnaturalización durante 15 minutos a 95ºC, seguida por 30 ciclos
(1 minuto 95ºC, 30 segundos 64ºC, 1 minuto 72ºC) para la
amplificación y por una incubación final durante 5 minutos a 72ºC
para la obtención de los productos completos.
Mediante ésta PCR se obtuvo un fragmento de DNA
con un tamaño de aproximadamente 2,16 kb (que puede determinarse
mediante análisis por medio de electrofóresis de
gel-agarosa). Éste producto PCR se purificó con
ayuda del "estuche Qiaquick" (Qiagen, Hilden, Alemania) de
acuerdo con el manual adjunto y se secuenció con empleo del estuche
"Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" (Applied Biosystems
Inc., Forster City, CA, USA) según la estrategia del "iniciador
desplazante" a partir de los dos iniciadores empleados para la
PCR. La secuencia de DNA obtenida del fragmento PCR con una longitud
total de 2162 pares de bases, se ha representado en la figura 1.
Se cortaron aproximadamente 0,5 \mug del
producto PCR purificado con la endonucleasa de restricción
EcoRI y se incorporó por clonación en el vector plásmido
pBSSK(-) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA) a través
del punto de corte de EcoRI. El inserto se una molécula recombinante
resultante (el plásmido correspondiente se designó como pBSPamHNL5g)
se secuenció según el método anteriormente descrito y la secuencia
del fragmento clonado era idéntica en un 100% con la secuencia del
producto PCR anteriormente descrito, obtenido con ambos
iniciadores
(1 y 2).
(1 y 2).
En la zona del segmento de DNA, amplificado y
secuenciado por medio de PCR, se encontró un marco de lectura
abierto, que está interrumpido por 3 intrones. Éstos tres intrones
se identificaron con ayuda de la secuencia de intron
consenso"GT.....AG". El marco de lectura comienza con un codón
ATG en la posición +13 y termina con un codón de detención en la
posición +2151.
Para la zona codificante se unieron los
fragmentos desde la posición 13 hasta 115 (Exon I), desde la
posición 258 hasta 917 (Exon II), desde 1121 hasta 1961 (Exon III) y
desde 2078 hasta 2150 (Exon IV). La secuencia de DNA combinada
codificó una proteína con 559 aminoácidos y con un peso molecular
calculado de 61 kDa, o bien de 57,9 kDa para una forma procesada
N-terminal. La masa peptídica se calculó con ayuda
del paquete de programas GCG (Genetics Computer Group, Wisconsin,
USA). Para ésta proteína se tomó la denominación PamHNL5.
La secuencia de proteínas derivada para el marco
de lectura abierto (sin intrón) se ha representado en la figura 3.
Pudo determinarse una marcada homología con respecto a las
hidroxinitrilasas conocidas de Rosaceae ("Blast"
Programm, GCG Paket, Versión 10.1, Genetics Computer Group,
Wisconsin, USA) consistiendo la máxima homología con las secuencias
publicadas de Mdl1 de Prunus amygdalus (99 por ciento de
identidad, Suelves et al., 1998) y de Mdl5 de Prunus serotina
(identidad del 94 por ciento, Hu und Poulton, 1999). Con ayuda de
ésta homología se identificó también una señal de frecuencia
cortable con corte entre S27 y L28. Un punto de corte de éste tipo
pudo detectarse en ambos isoenzimas Mdl1 y Mdl4 de Prunus
serotina por medio de una secuenciación
N-terminal de las proteínas nativas purificadas a
partir de material vegetal (Zihua Hu und Jonathan E. Poulton, Plant
Physiology, 119, 1535 - 1546, 1999). Las secuencias de los diversos
isoenzimas HNL existentes en Rosacea species con conocidas
únicamente por la Prunus serotina. Debido a la máxima
homología con la secuencia de Mdl5 de Prunus serotina se
determinó el nuevo gen HNL de Prunus amygdalus como
HNL5. La busca en el banco de datos de motivos secuenciales
en el motivo secuencial PROSITE (GCG Paket, Versión 10.1, Genetics
Computer Group, Wisconsin, USA) indicó la existencia de 13 puntos
potenciales de N-glicosilación (indicados en la
figura 3).
Se unieron entre sí las zonas codificantes por
medio de 4 reacciones sucesivas PCR con ayuda de una estrategia PCR
especial con empleo de iniciadores solapados (de acuerdo con la
figura 2).
En el primer paso PCR (PCR1-1 y
PCR1-2) se amplificaron los exones II y III con el
par de iniciadores
PamHNL5b/PamHNL5c (PCR1-1) o bien PamHNL5d/PamHNL5e (PCR1-2). Las cargas de 50 \mul de PCR en tampón 1 x PCR (Qiagen) contenían: respectivamente 100 pmol del iniciador correspondiente, 2,5 U "Hotstar" Taq DNA polimerasa (Qiagen), 5 \mul de un dNTP (respectivamente 2 mmoles) Mix, 10 ng del plásmido pBSPamHNL5g a modo de matriz. Se procedió según el programa siguiente: 15 minutos a 95ºC, 30 ciclos 1 minuto a 95ºC, 30 segundos 68ºC, 1 minuto a 72ºC y, finalmente, 5 minutos a 72ºC para la obtención de los productos completos). Los productos procedentes de PCR1-1 y de PCR1-2 se eluyeron, tras separación mediante electrofóresis, en un gel de agarosa por medio del estuche Qiaexll, a partir del gel.
PamHNL5b/PamHNL5c (PCR1-1) o bien PamHNL5d/PamHNL5e (PCR1-2). Las cargas de 50 \mul de PCR en tampón 1 x PCR (Qiagen) contenían: respectivamente 100 pmol del iniciador correspondiente, 2,5 U "Hotstar" Taq DNA polimerasa (Qiagen), 5 \mul de un dNTP (respectivamente 2 mmoles) Mix, 10 ng del plásmido pBSPamHNL5g a modo de matriz. Se procedió según el programa siguiente: 15 minutos a 95ºC, 30 ciclos 1 minuto a 95ºC, 30 segundos 68ºC, 1 minuto a 72ºC y, finalmente, 5 minutos a 72ºC para la obtención de los productos completos). Los productos procedentes de PCR1-1 y de PCR1-2 se eluyeron, tras separación mediante electrofóresis, en un gel de agarosa por medio del estuche Qiaexll, a partir del gel.
Mediante amplificación de aproximadamente 50 ng
del producto procedente de PCR1-1 con
respectivamente 100 pmol de los iniciadores PamHNL5a2 y PamHNL5c se
verificó en el segundo paso PCR (PCR2) una prolongación de éste
primer producto PCR. Se procedió según el programa siguiente: 15
minutos a 95ºC, 30 ciclos 1 minuto a 90ºC, 30 segundos a 68ºC, 1
minuto a 72ºC y, finalmente, 5 minutos a 72ºC para la obtención de
los productos completos). Las demás condiciones eran idénticas a las
del PCR1. Éste producto PCR se purificó y se eluyó también a través
de un gel de agarosa, tras separación mediante electrofóresis.
En el tercer paso PCR (PCR3) se unieron entre sí
mediante PCR, en ausencia de iniciadores, los productos procedentes
de PCR1-2 y de PCR2 con ayuda de los extremos
solapantes (5 ciclos con 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 68ºC y 1,5
minutos a 72ºC, respectivamente 100 ng aproximadamente de ambos
productos procedentes de PCR1-1 y de PCR2 en cargas
de 50 \mul en 1 x tampón PCR (Qiagen), 5 \mul del dNTP
(respectivamente 2 mmoles) Mix y 2,5 U "Hotstar" Taq DNA
polimerasa (Qiagen).
El complemento para obtener la longitud completa
del gen HNL5 codificante de Prunus amygdalus y para la
amplificación del producto completo se llevó a cabo un cuarto paso
PCR (PCR4) con, respectivamente, 100 pmol de los iniciadores
PamHNL5a1 y PamHNL5f. Éstos se añadieron directamente a la mezcla de
la reacción de PCR3. Se aplicó el siguiente programa: 20 ciclos con
1 minuto a 95ºC, 30 segundos a 63ºC, 1,5 minutos a 72ºC y,
finalmente, 5 minutos a 72ºC. El resto de las condiciones fueron
iguales a las del PCR1.
El producto, obtenido en el último paso PCR se
separó por medio de un gel de agarosa preparativo y se eluyó el DNA
con un tamaño de 1,6 - 1,8 kb por medio del estuche "Quiaexll"
(Qiagen) a partir del gel y se incorporó por clonación en el
plásmido pBSSK(-) a través del punto de corte EcoRI. Se
eligió y se secuenció un clon con un patrón correcto de
restricción.
La secuencia en la zona codificante era idéntica
en un 100% con los exones de la secuencia genómica de DNA. Éste clon
se denominó como pBSPamHNL5orf.
\vskip1.000000\baselineskip
Iniciador oligonucleótido
El objetivo de éste experimento consistía en la
construcción de un plásmido a partir del cual pudiese obtenerse un
fragmento de DNA que codificase HNL5 de Prunus
amygdalus para la incorporación en diversos vectores de
expresión mediante corte con endonucleasas de restricción. En éste
caso se adicionaron secuencias adecuadas, mediante amplificación PCR
a través del iniciador correspondiente sobre el extremo del gen
HNL5 de Prunus amygdalus que contiene
pBSPamHNL5orf.
Con los iniciadores PCRHNL5-a y
PCRHNL5-e se amplificó el inserto del plásmido
pBSPamHNL5orf por medio de PCR (10 ng DNA del plásmido pBSPamHNL5orf
como matriz, 400 ng del iniciador PCRHNL5-a, 200 ng
del iniciador PCRHNL5-e). La reacción PCR se llevó a
cabo en cargas de 50 \mul en 1 x tampón PCR (Qiagen), que
contiene 5 \mul del dNTP (respectivamente 2 mmoles) Mix y 1,2 U
"Hotstar" Taq DNA polimerasa (Qiagen). Se aplicó el
programa siguiente: 15 minutos a 95ºC, 30 ciclos de 1 minuto a 95ºC,
30 segundos a 68ºC, 1,5 minutos a 72ºC y, finalmente, 5 minutos a
72ºC para la obtención de los productos completos.
El fragmento de DNA, obtenido, se introdujo por
clonación, tras corte con la endonucleasa de restricción
EcoRI en el vector pBSSK(-) (Stratagene, USA) y se verificó
mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó
pBSPamHNL5ex.
\vskip1.000000\baselineskip
Iniciador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortó el DNA del plásmido pBSPamHNL5ex con
EcoRI y el fragmento de HNL se separó de la parte vectorial
por medio de una electrofóresis de gel preparativa. Tras elución del
fragmento de HNL del DNA por medio del estuche Qiaex II
(Qiagen) se incorporó éste por clonación en los plásmidos pHILD2 y
pGAPZ (Invitrogen, San Diego, CA, USA) a través de los puntos de
corte de EcoRI. Se comprobó la orientación correcta del
inserto, con respecto a los promotores, con ayuda de cortes de
control. Respectivamente se seleccionó y se conservó un clon con un
inserto correctamente orientado. Se comprobaron por secuenciación
las transiciones correctas, desde la parte vectorial hasta el
fragmento de HNL incorporado. Éstos dos plásmidos de expresión,
formados, para Pichia pastoris se denominaron como
pHILDPamHNL5a (para la expresión inducible) y como pGAPPamHNL5a
(para la expresión
constituyente).
constituyente).
Se cortó DNA del plásmido pHILDPamHNL5a con la
endonucleasa de restricción Notl y se transformó en Pichia
pastoris GS115 (Invitrogen, San Diego, CA, USA). La
transformación se llevó a cabo según la rutina del ``estuche
Pichia Expression (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Se
cultivaron 100 clones de prototropos de histidina según la rutina
del "estuche Pichia Expression" en medio líquido (500 ml
de cultivos bajo agitación) y se indujeron durante 48 horas con
metanol. Las células se separaron por centrifugación y se
suspendieron con tampón de fraccionamiento (50 mmoles de
tris-HCL, pH 7,6) hasta una densidad óptica
(OD_{600}) de 50,0 y se fraccionaron según el "método de la bola
de cristal" (Ausubel et al., Current Protocolls in
Molecular Biology, Green Publishing Associates and
Wiley-Interscience, New York, 1999) en un
homogeneizador "Merckenschlager" (firma Braun, Melsungen, RFA).
Se determinaron tanto los sobrenadantes de los cultivos como también
los lisados celulares en cuanto a la actividad enzimática HNL con un
patrón para la determinación de la actividad (análogo al de la
publicación WO 97/03204) con empleo de mandelonitrilo racémico como
substrato. Se seleccionaron y se conservaron dos clones, que
mostraron en éstos experimentos en matraz bajo agitación la mejor
actividad en el sobrenadante del cultivo (Pichia pastoris
PamHNL5-a37 y Pichia pastoris
PamHNL5-a4). Un análisis del tipo de aprovechamiento
del metanol proporcionó el fenotipo Mut^{+} (buen aprovechamiento
del metanol) para Pichia pastoris PamHNL5-a37
y el fenotipo Mut^{s} (aprovechamiento lento del metanol) para
Pichia pastoris PamHNL5-
a4.
a4.
Se transformó el plásmido pGAPPamHNL5a en P.
pastoris GS115. La transformación se llevó a cabo según la rutina
del estuche Pichia Expression de la firma Invitrogen Corp (San
Diego, CA, USA). La selección de los transformados se llevó a cabo
sobre placas de medio completo YPD con 100 mg/l de zeocina. Se
cultivaron 100 clones resistentes a la zeocina respectivamente en
500 ml de medio completo YPD y se sometieron a agitación durante 96
horas a 30ºC. Las células se separaron por centrifugación y se
determinó la actividad HNL en el sobrenadante del cultivo. Se
conservó un clon que mostró la mejor actividad en el sobrenadante
del cultivo y se denominó como Pichia pastoris
PamHNL5-a2.
El cultivo de Pichia pastoris
PamHNL5-a37 se llevó a cabo en un reactor
normalizado de laboratorio (volumen total 42 litros) en un
procedimiento con tres fases. Éste está constituido por una primera
fase de crecimiento exponencial y por una segunda fase de
crecimiento lineal para la formación de biomasa y por una fase
subsiguiente de expresión para la formación del enzima recombinante
Prunus amygdalus HNL, para lo cual se prosiguió, en
principio, según el método descrito para la producción de HNL
recombinante de Hevea brasiliensis (Hasslacher, M., Schall,
M., Hayn, M., Bona, R., Rumbold, K., Lückl, J., Griengl, H.,
Kohlwein, S.D., Schwab, H.: High level intracellular expression of
hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea
brasiliensis in microbial hosts. Protein Expression and Purification
11, 61-71, 1997).
En detalle se respetaron las condiciones
siguientes:
Se dispusieron en el bioreactor los productos
químicos 1.-8., dimensionados para 20 litros, disueltos en 15 litros
de agua y se esterilizaron, junto con el reactor, a 121ºC durante 1
hora. Tras refrigeración a 29ºC se ajustó el valor del pH en el
medio con amoníaco a pH 5,0 (producto químico 9, dispuesto en la
botella estéril de alimentación). A continuación se introdujeron en
el reactor aproximadamente 200 ml de una solución de elementos en
trazas, filtrada de manera estéril (productos químicos
10-18, en cantidades correspondientes para 20
litros) a través de una botella de alimentación.
El bioreactor preparado de éste modo se inoculó
con 2 litros de cultivo previo que se habían cultivado en matraces
bajo agitación a 30ºC según las condiciones indicadas en el manual
del "estuche Pichia Expression" (Invitrogen Corp., San Diego,
CA, USA). El cultivo se llevó a cabo a una temperatura constante de
29ºC. Mediante regulación de la aireación (entre 15 y 40 litros como
máximo de aire/minuto) y el número de revoluciones del agitador
(entre 250 y 500 revoluciones por minuto) se mantuvo la presión
parcial de O_{2} a un valor mayor que el 30% de la concentración
de saturación. Al cabo de 21 horas había crecido la biomasa hasta un
valor en el intervalo de 22 g/l de peso seco celular (ZTG). A partir
de éste instante se dosificó glicerina estéril a intervalos de 15
minutos, en porciones pequeñas constantes, añadiéndose 130 g de
glicerina por hora. En ésta segunda fase de crecimiento lineal pudo
alcanzarse una concentración de la biomasa en el intervalo de 70 g/l
de ZTG en un período de tiempo de 42
horas.
horas.
A continuación se inició la tercera fase con la
inducción de la expresión mediante dosificación de metanol. En éste
caso se estableció el contenido en metanol en el caldo de cultivo a
un valor de 0,8-1% en peso. Al inicio de la
inducción y al cabo de dos días de inducción se añadió,
respectivamente, otra porción de solución estéril de elementos en
trazas (productos químicos 10-18, en cantidades
correspondientes a 20 litros, disueltos en 200 ml aproximadamente de
agua). Al cabo de 110 horas de fase de inducción pudo obtenerse una
cantidad enzimática de 110 U/ml de caldo de cultivo. Tras separación
de las células por ejemplo por centrifugación, pudo obtenerse una
preparación enzimática en bruto que puede emplearse directamente
para las conversiones biocatalíticas.
Se utilizaron los productos químicos siguientes
para la obtención del medio de cultivo (cantidades por litro):
| 1. | ácido ortofosfórico al 85% | 21 ml |
| 2. | CaSO_{4} | 0,9 g |
| 3. | K_{2}SO_{4} | 14,3 g |
| 4. | MgSO_{4}.7H_{2}O | 12,2 g |
| 5. | KHO | 3,3 g |
| (productos químicos 1 hasta 5 en calidad para análisis) | ||
| 6. | glicerina, calidad industrial | 50 ml |
| 7. | agua desionizada, cavidad doméstica, conductibilidad | 5,5-9,1 \muS/cm |
| 8. | agente antiespumante Acepol 83E al 10% | 1 ml |
| (Carl Becker Chemie GmbH, Hamburg, Alemania) | ||
| 9. | amoníaco al 25%, calidad industrial | |
| Elementos en trazas y vitamina H (todos los productos | ||
| químicos en calidad para análisis). | ||
| 10. | Biotina | 0,8 mg |
| 11. | CuSO_{4}.5H_{2}O. | 24,0 mg |
| 12. | Kl | 0,32 mg |
| 13. | MnSO_{4}.H_{2}O. | 12,0 mg |
| 14. | Na_{2}MoO_{4}.2 H_{2}O | 0,2 mg |
| 15. | H_{3}BO_{3} | 0,08 mg |
| 16. | CoCl_{2} | 2,0 mg |
| 17. | ZnSO_{4}.7H_{2}O | 80 mg |
| 18. | Fe(II)SO_{4}.7H_{2}O | 260 mg |
Proteína recombinante con actividad HNL, que se
produjo con la cepa recombinante Pichia pastoris
PamHNL5-a37 como se ha descrito en el ejemplo 9, se
sometió a un análisis de la glicosilación mediante digestión con
endoglicosidasas. Para ello se concentraron 10 veces 100 ml del
sobrenadante del cultivo mediante ultrafiltración (Biomax 30,000
NMWL, Millipore, Bedford, MA, USA). Se trataron las muestras
1-2 con N-glicosidasa F (estuche
N-glicosidasa F, Roche Diagnostics, Mannheim,
D).
En el caso de las muestras 4-5 se
empleó una preparación HNL de almendras de la firma Roche y en el
caso de las muestras 6 y 7 se trató el sobrenadante del cultivo
concentrado con endoglicosidasa H (Roche Diagnostics, Mannheim, D).
Todas las cargas se llevaron a cabo en volúmenes totales de 10
\mul.
- Std.
- Patrón del peso molecular del estuche N-glicosidasa F (5 \mul =5 \mug).
- Muestra 1:
- 2 U de PamHNL5 tratada con 2,4 U de enzima según la rutina del estuche.
- Muestra 2:
- 2 U de PamHNL5 tratada con 2,4 U de enzima según la rutina del estuche pero sin tampón desnaturalizante y sin desnaturalización por calor.
- Muestra 3:
- 2 U de PamHNL5 sin tratamiento.
- Muestra 4:
- 0,25 U de la preparación Roche R-HNL de grado III de almendras (10,3 U/mg) tratada con 2,4 U de N-glicosidasa F según la rutina del estuche.
- Muestra 5:
- 0,25 U de la preparación Roche grado III (10,3 U/mg) sin tratamiento.
- Muestra 6:
- se incubaron 2,4 U de PamHNL5 con 50 mU de endoglicosidasa H en 20 mmoles de tampón fosfato, sin desnaturalización, durante 12 horas a 37ºC.
- Muestra 7:
- se incubaron 2,4 U de PamHNL5 con 50 mU de endoglicosidasa H en 20 mmoles de tampón de fosfato, 0,2% de SDS, 0,4% mercaptoetanol, durante 12 horas a 37ºC.
Después del tratamiento con las glicosidasas se
separaron las muestras sobre un gel al 12% de
SDS-poliacrilamida y se colorearon con Commassie
Blue.
Éstos resultados (véase la figura 4) muestran que
una gran parte de los oligosacáridos, enlazados sobre PamHNL5 pueden
ser retirados por medio de endoglicosidasa H incluso sin
desnaturalización de la proteína PamHNL5.
Mediante la disociación de los oligosacáridos se
genera una banda nítida a aproximadamente 60 kDa a partir de un
quimérico de proteína visible a tamaños de 70 hasta más de 100 kDa,
que corresponde al peso molecular calculado de una proteína no
glicosilada PamHNL5.
En el preparado Roche no está presente una banda
proteica comparable o únicamente lo está en una proporción
fuertemente subordinada. Además no puede verse una diferencia
significativa entre una preparación de proteína no tratada y una
preparación tratada con endoglicosidasa F. A partir de ésta
comprobación puede determinarse inequívocamente que el enzima
recombinante PamHNL5 se diferencia completamente del material
enzimático obtenido a partir de pepitas de almendra.
Se disolvieron 0,5 g de (3,9 mmoles) de octanal
en 6 ml de terc.-butilmetiléter y se combinaron con 7,5 ml de
solución enzimática acuosa con R-HNL recombinante
del ejemplo 9 (pH 3,8). Tras adición de 0,33 ml (8,4 mmoles) de
ácido cianhídrico se agitó vivamente para la formación de una
emulsión en el agitador magnético a temperatura ambiente y la
reacción se siguió mediante GC en una columna de ciclodextrina. Al
cabo de 3 horas de tiempo de reacción se formó cianhidrina con un
81,1% ee y con una conversión del 48%.
Se diluyeron 80 ml (34 unidades/mmol de aldehído)
de una solución acuosa enzimática con R-HNL
recombinante (34 unidades/mmol de aldehído) con 10 ml de tampón 200
mM de fosfato de potasio/citrato de sodio pH 3,8 y se añadieron a
una solución, refrigerada previamente a 10ºC, formada por 42,2 g
(300 mmoles) de 2-clorobenzaldehído y 42 ml de
terc.-butilmetiléter. A continuación se dosificaron a la mezcla de
la reacción, bajo agitación con 950 revoluciones por minuto, 19,6 ml
(501 mmoles) de ácido cianhídrico en el transcurso de 40 minutos. El
desarrollo de la reacción se siguió, tras desactivación de la
cianhidrina con cloruro de acetilo, por medio de GC en una columna
de ciclodextrina.
| Horas | % conversión | % ee |
| 3,5 | 71,5 | 90,6 |
| 22 | 99,7 | 90 |
Ejemplo
comparativo
Se diluyeron 0,25 hasta 1 ml de solución de
R-oxinitrilasa (E.C.4.1.2.10; 2187 unidades/ml) con
tampón de citrato/fosfato 50 mM (pH 4,0), hasta 4 ml y se ajustó el
valor del pH de la solución enzimática en caso dado con algunas
gotas de disolución de ácido cítrico a pH 4,0. A ésta solución se
añadieron una solución de 3 ml de terc.-butilmetiléter y 0,8 g (5,69
mmoles) de 2-clorbenzaldehído y a continuación se
añadieron 445 \mul (11,38 mmoles) de ácido cianhídrico. La mezcla
de la reacción se agitó por medio de agitador magnético a
temperatura ambiente con 900 revoluciones por minuto.
La conversión y la pureza enantiómera de la
(R)-cianhidrina formada se analiza por medio de
GC.
Para ello se centrifugó una muestra de la
solución de la reacción y se diluyeron 50 \mul de la fase orgánica
con diclorometano. Tras una desactivación con cloruro de acetilo se
analizó mediante cromatografía gaseosa en una columna de
ciclodextrina.
| Tiempo | 0,25 ml de solución | 0,5 ml de solución | 1,0 ml de solución enzimática | |||
| (h) | enzimática corresponden a | enzimática corresponden a | corresponde a 384 | |||
| 96 unidades/mmol de | 192 unidades/mmol de | unidades/mmol de aldehido | ||||
| aldehído | aldehído | |||||
| % conversión | % ee | % conversión | % ee | % conversión | % ee | |
| 1,5 | 79,1 | 77,5 | 97,6 | 81,6 | 98,7 | 89,4 |
| 3 | 98 | 77,4 | 100 | 81,5 | 100 | 89,1 |
El ensayo comparativo mostró que, cuando se
utilizó la proteína recombinante según la invención análoga a la del
ejemplo 11, únicamente se requirió al décima parte de la cantidad
necesaria de proteína nativa, para alcanzar purezas comparables de
los enantiómeros (valor ee).
<110> DMS Fine Chemicals Austria NFG GmbH
& Co KG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos genes, que contienen una
secuencia de DNA que codifica hidroxinitrilasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> O.Z. 1212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver.2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggattcac aatatggaga aatcaacaat gtcag
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggaattctt cacatggact cttgaatatt atg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagatctga attccatgga gaaatcaaca atgtcagtta tactatttgt gttgcatctt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttg
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgtattgg aagagaagag gatcttctct act
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcctcttc tcttccaata catcaaattt gtcagctatt ggagtcatat atacgg
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaattcgcc ctttcgcatg ctcacatgga ctcttgaaca ttatgaatag cctc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcgcat gcggccgctc actgcattga cctttcttgc aggatttgaa g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactacgaatt cgaccatgga gaaatcaac
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaattcgc ccttgtgcat gcatcgatta aagaaccaag gatgctgctg ac
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactacgaatt cgaccatgga gaaatcaaca atg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: iniciador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgctgctga cttgagggaa tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus amygdalus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus amygdalus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: PamHNL5xGOX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 534
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
sintética: PamHNL5xGOX
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2087
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus amygdalus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 563
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus amygdalus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
Claims (8)
1. Ácido nucleico aislado, que comprende un ácido
nucleico con la secuencia continua SEQ ID NO: 19 desde el nucleótido
13 hasta el nucleótido 2151 o que comprende ésta secuencia menos las
zonas de intrón desde los nucleótidos 116 hasta 257, desde 918
hasta 1120 y desde 1962 hasta 2077.
2. Proteína recombinante, que puede ser preparada
mediante expresión heteróloga de la secuencia de DNA según la
reivindicación 1 en células huésped adecuadas.
3. Proteína recombinante según la reivindicación
2, caracterizada porque presenta una glicosilación
específica del huésped.
4. Proteína recombinante según la reivindicación
2, caracterizada porque se prepara mediante expresión en un
microorganismo eucariótico.
5. Proteína recombinante según la reivindicación
2, caracterizada porque se prepara mediante expresión en un
hongo.
6. Proteína recombinante según la reivindicación
2, caracterizada porque la proteína presenta la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO: 20 derivada de la secuencia de nucleótidos
del gen según la reivindicación 1.
7. Empleo de proteínas según una de las
reivindicaciones 2 a 6 para la fabricación de (S)- o de
(R)-cianhidrinas.
8. Procedimiento para la fabricación de (S)- o de
(R)-cianhidrinas, caracterizado porque se
hacen reaccionar aldehídos y cetonas alifáticos, aromáticos o
heteroaromáticos en presencia de un donador de grupos cianuro, con
proteínas según una de las reivindicaciones 2 a 7 en sistema
orgánico, acuoso o de 2 fases o en emulsión.
Applications Claiming Priority (4)
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