ES2320883T3

ES2320883T3 - Composiciones y metodos para la administracion de material genetico.

Info

Publication number: ES2320883T3
Application number: ES04075092T
Authority: ES
Inventors: David B. Weiner; William V. Williams; Bin Wang; Leslie R. Coney; Vincent R. Zurawski Jr.
Original assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania; The Wistar Institute
Current assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania; The Wistar Institute
Priority date: 1993-01-26
Filing date: 1994-01-26
Publication date: 2009-05-29
Anticipated expiration: 2014-01-26
Also published as: EP1770168A2; ATE420193T1; EP1473369B1; EP1473369A3; DK1473369T3; DE69435182D1; EP1770168A3; PT1473369E; EP1473369A2

Abstract

El uso de un potenciador de la función de los polinucleótidos en la elaboración de un medicamento para introducir material genético en las células de un individuo, en el que el medicamento se administra simultáneamente a las células del individuo junto con una molécula de ácido nucleico que está libre de partículas retrovirales, en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y las sales clorhídricas de los mismos.

Description

Composiciones y métodos para la administración de material genético.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a composiciones y métodos para introducir material genético en las células de un individuo. Las composiciones y métodos de la invención se pueden utilizar para administrar agentes protectores y/o terapéuticos que incluyen material genético que codifica las proteínas objetivo para proteínas terapéuticas y de inmunización.

Antecedentes de la invención

Se ha estudiado la introducción directa de un gen funcional normal en un animal vivo como un medio de sustituir la información genética defectuosa. En algunos estudios, el ADN se introduce directamente en las células de un animal vivo sin usar una partícula viral u otro vector infeccioso. Nabel, E.G., et al., (1990) Science 249:1285-1288, revela una expresión génica sitio-específica in vivo de un gen de la beta-galactosidasa que se transfirió directamente a la pared arterial de los ratones. Wolfe, J.A. et al., (1990) Science 247:1465-1468, revela la expresión de diversos genes informadores que se transfirieron directamente al músculo del ratón in vivo. Acsadi G., et al., (1991) Nature 352:815-818, revela la expresión de un gen de la distrofina humana en ratones tras una inyección intramuscular de construcciones de ADN. Wolfe, J.A., et al., 1991 BioTechniques 11(4):474-485, que se incluye en el presente documento como referencia, hace referencia a las condiciones que afectan a la transferencia directa de genes en el músculo de los roedores in vivo. Feigner, P.L. y G. Rhodes, (1991) Nature 349:351-352, revela la administración directa de genes purificados in vivo como fármacos sin la utilización de los retrovirus.

Se ha sugerido el uso de la transferencia directa de genes como un método alternativo de vacunación anti-patógena. Se sugiere el uso de la transferencia directa de genes mediante una única inyección como una posible estrategia de vacunación contra el VIH. Se informa que se ha observado una respuesta inmunitaria celular al pg 120 del VIH que resulta de la introducción de ADN plasmídico que lo codifica en células. La Solicitud Internacional PCT (Tratado de Cooperación en Materia de Patentes) Número PCT/US90/01515 publicada el 4 de octubre de 1990 revela métodos para inmunizar a un individuo contra una infección patógena inyectándole directamente polinucleótidos desnudos en las células del individuo en un procedimiento de un único paso. El uso de agentes de transfección que no sean las lipofectinas está expresamente excluido de los métodos revelados. Ni se revela ni se sugiere la estimulación de las células inoculadas. Se revela una vacuna contra el VIH que consiste en la introducción de polinucleótidos que codifican la proteína viral pg120. La factibilidad de esta vacuna no está demostrada.

Thomason, D.B. et al., (1990) Cell Physiol. 27:C578-581 y la Solicitud de Patente PCT con Nº de serie WO 91/12329 revelan la administración de bupivacaína a células musculares para inducir la proliferación de células satélite como parte de un protocolo de administración de genes con mediación retroviral.

Frankel, et al, WO 91/09958, describe una técnica sencilla para administrar moléculas directamente al núcleo de una célula, in vitro o in vivo, mediante el uso de la proteína Tat del VIH conjugada con la molécula de interés. Los iones metálicos que se unen a la proteína Tat pueden incrementar la estabilidad del complejo proteína-conjugado.

George, et al, WO 92/20316, describe un complejo molecular soluble para dirigir un gen que codifica una proteína inmunogénica deseada a una célula específica in vivo. George describe en especial la construcción de conjugados de ADN de la asioloorosomucoide-polilisina, que se inyectaron y dirigieron al hígado de ratones.

Jenkins, et al., AIDS Research and Human Retroviruses, 1991, Vol. 7, p. 991-998, describe la administración del ácido nucleico del virus de inmunodeficiencia de los simios (VIS) en células in vitro mediante el uso de un virus recombinante de la viruela aviar. Los autores fueron capaces de caracterizar la expresión de las proteínas del VIS en las células infectadas así como de visualizar partículas del VIS. Jenkins describe el uso concreto del sistema recombinante de la viruela aviar para servir como una herramienta inmunológica para el análisis de la respuesta inmunitaria provocada a través de la administración de las vacunas contra el VIH.

Haffar, et al, WO 91/07425, describe las partículas retrovirales recombinantes que se pueden utilizar como herramientas inmunogénicas para los protocolos de vacunación. Haffar describe específicamente el uso de sus vectores recombinantes del VIH para la administración de ADN que codifique una parte enormemente inmunogénica del virus del VIH. Haffar demuestra la utilidad potencial de los vectores virales no replicativos para dirigir la transferencia de ADN a las células susceptibles normalmente a la infección con el VIH.

Sodroski, et al, EP 0 386 882 Al, describe la construcción y el uso de líneas de células y vectores de envoltorio defectuoso del VIH. Mientras que Sodroski demuestra la utilidad de generar dichas líneas de células para el VIH para la producción de anticuerpos, los autores también ilustran un método básico de transfección de las células utilizando construcciones del VIH de replicación defectuosa.

Resumen de la invención

La presente invención hace referencia a métodos para introducir material genético en las células de un individuo. Los métodos comprenden los pasos de poner en contacto células de dicho individuo con un agente potenciador de la función de los polinucleótidos, que es preferentemente un agente que facilita la captación de ADN por parte de las células o que aumenta una respuesta inflamatoria, y el de administrar a las células una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que o bien codifica una proteína o péptido deseados o sirve como modelo para las moléculas funcionales de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico se administra libre de partículas retrovirales. La proteína deseada puede ser o bien una proteína que funcione dentro del individuo o que sirva como un objetivo para una respuesta inmunitaria.

La presente invención hace referencia a un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno. El método comprende los pasos de poner en contacto células de dicho individuo con un agente potenciador de la función de los polinucleótidos, que es preferentemente un agente que facilita la captación de ADN por parte de las células o que aumenta la respuesta inmunitaria, y el de administrar a las células una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en un antígeno patógeno y que está unida de forma operativa a secuencias reguladoras. La molécula de ácido nucleico es capaz de expresarse en las células del individuo.

La presente invención hace referencia a un método para inmunizar a un ser humano contra el VIH. El método comprende los pasos de administrar a un ser humano una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido que consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras.

La presente invención hace referencia a un método para inmunizar a un ser humano contra el VIH. El método comprende los pasos de administrar dos moléculas de ácido nucleico diferentes a diferentes células del ser humano. Cada molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido que consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras. Cada una de las diferentes moléculas de ácido nucleico consta de diferentes secuencias de nucleótidos que codifican al menos un péptido diferente del de la otra y cada una es capaz de expresarse en células humanas.

La presente invención hace referencia a métodos para inmunizar a un individuo contra una enfermedad hiperproliferativa o una enfermedad autoinmune. Los métodos comprenden los pasos de administrar a las células de un individuo, una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en una proteína asociada con una enfermedad hiperproliferativa o una proteína asociada con una enfermedad autoinmune, respectivamente, y que está unida de forma operativa a secuencias reguladoras; siendo capaz la molécula de ácido nucleico de expresarse en las células.

La presente invención hace referencia a métodos para tratar a un individuo que sufre de una enfermedad que comprende los pasos de poner en contacto células de dicho individuo con un agente potenciador de la función de los polinucleótidos, que es preferentemente un agente que facilita la captación de ADN por parte de las células o aumenta una respuesta inflamatoria, y de administrar a las células de un individuo una molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótidos que funciona en lugar de un gen defectuoso o que codifica una molécula que produce un efecto terapéutico en el individuo y está unida de forma operativa a secuencias reguladoras; siendo capaz la molécula de ácido nucleico de expresarse en las células.

La presente invención hace referencia a composiciones farmacéuticas que constan de una molécula de ácido nucleico y un potenciador de la función de los polinucleótidos. La presente invención hace referencia a kits farmacéuticos que están compuestos de un contenedor que consta de una molécula de ácido nucleico y un contenedor que consta de un potenciador de la función de los polinucleótidos.

La presente invención hace referencia a vacunas profilácticas y terapéuticas contra el VIH que están compuestas de un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más péptidos cada uno de los cuales consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en al menos una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras; siendo capaz la molécula de ácido nucleico de expresarse en células humanas.

La presente invención hace referencia a vacunas profilácticas y terapéuticas contra el VIH que están compuestas de dos inoculantes. El primer inoculante consta de un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una primera molécula de ácido nucleico. La primera molécula de ácido nucleico consta de una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más péptidos cada uno de los cuales consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en al menos una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras; siendo capaz la molécula de ácido nucleico de expresarse en células humanas. El segundo inoculante está compuesto de un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una segunda molécula de ácido nucleico. La segunda molécula de ácido nucleico consta de una secuencia de nucleótidos que codifica uno ó más péptidos cada uno de los cuales consta de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en al menos una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras; siendo capaz la molécula de ácido nucleico de expresarse en células humanas. La primera y segunda molécula de ácido nucleico son diferentes y codifican péptidos diferentes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un diagrama que representa la construcción del plásmido pM160 que se ha producido insertando un fragmento generado por RCP que codifica la glicoproteína pg160 de HXB2 del VIH en el plásmido pMAMneoBlue (Clonetech).

La Figura 1B es una fotografía de un autoradiograma de una inmunoelectrotransferencia de tipo Western (Western blotting) de lisatos de célula completa de células transfectadas con el plásmido pM160 (células 3G7) frente a células transfectadas únicamente con vectores (células TE671) que muestran la producción de pg120 y pg41 en células 3G7 y no en células TE671.

La Figura 2 es una fotografía de un autoradiograma que muestra inmunoprecipitaciones de anticuerpos en suero uniéndose a ^{125}I-pg160.

Las Figuras 3A - 3E son gráficos que muestran resultados ELISA uniendo diferentes sueros a diversas proteínas inmovilizadas en placas de microtítulo.

Las Figuras 4A y 4B son fotografías de células MT-2 infectadas con el virus libre de células DICT_{50}VIH-1/III_{8} que había sido incubado previamente con diluciones consecutivas de antisueros.

La Figura 4C es un gráfico que ilustra los valores de neutralización (V_{n}/V_{o}) frente a los factores de dilución de los resultados obtenidos utilizando el suero de control (x = ratones inmunizados con el vector pMAMneoBlue) y los sueros de prueba (O = ratones inmunizados con pM160).

Las Figuras 4D - 4G son fotografías de células H9/III_{B} utilizadas en experimentos para examinar la inhibición sincitial utilizando sueros procedentes de animales inmunizados y animales de control.

La Figura 5 es un gráfico que representa la supervivencia de ratones inmunizados y ratones no inmunizados a los que se ha desafiado con células tumorales marcadas con pg160 y no marcadas del VIH. Los ratones fueron inmunizados con proteína pg160 recombinante, solamente con ADN de vector o con vector recombinante que estaba compuesto de ADN que codifica pg160. Las células tumorales SP2/0 ó SP2/0-pg160 (células SP2/0 transfectadas con ADN que codifica pg160 y que expresa pg160) se introdujeron en los ratones.

La Figura 6 es un mapa del plásmido pGAGPOL.rev.

La Figura 7 es un mapa del plásmido pENV.

La Figura 8 muestra cuatro esqueletos, A, B, C y D, utilizados para preparar construcciones genéticas.

La Figura 9 muestra cuatro inserciones, 1, 2, 3 y 4 que se insertan en los esqueletos para producir construcciones genéticas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención hace referencia a un método para introducir moléculas de ácido nucleico en las células de un animal lo que hace posible el elevado nivel de captación y función de las moléculas de ácido nucleico. El método de la presente invención comprende los pasos de administrar moléculas de ácido nucleico que están libres de partículas virales, especialmente partículas retrovirales, a la célula de un individuo en conjunción con la administración de un coagente que aumente la respuesta inflamatoria y/o aumente la expresión de la molécula de ácido nucleico en el tejido y/o facilite la captación de la molécula de ácido nucleico por parte de la célula. Las realizaciones preferentes de la presente invención proporcionan métodos para administrar moléculas de ácido nucleico a las células de un individuo sin el uso de agentes infecciosos.

Las moléculas de ácido nucleico que se administran a las células de conformidad con la invención pueden servir como: 1) modelos genéticos para proteínas que funcionan como agentes inmunizadores profilácticos y/o terapéuticos; 2) copias de sustitución de genes que son defectuosos, que faltan o no funcionan; 3) modelos genéticos para proteínas terapéuticas; 4) modelos genéticos para moléculas antisentido; o 5) modelos genéticos para ribozimas. En el caso de las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, las moléculas de ácido nucleico están compuestas preferentemente de las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción en las células del animal. En el caso de las moléculas de ácido nucleico que sirven como modelos para moléculas antisentido y ribozimas, dichas moléculas de ácido nucleico están preferentemente unidas a elementos reguladores necesarios para la producción de suficientes copias de las moléculas de ribozimas y antisentido codificadas de ese modo respectivamente. Las moléculas de ácido nucleico están libres de partículas retrovirales y se proporcionan preferentemente como ADN en la forma de plásmidos.

También se denomina al coagente en el presente documento "potenciador de la función de los polinucleótidos" o "PFP". Un PFP es un compuesto o composición que aumenta la respuesta inflamatoria y/o aumenta la expresión de la molécula de ácido nucleico en el tejido y/o facilita la captación de la molécula de ácido nucleico por parte de la célula y tiene preferentemente más de una de estas propiedades. Los potenciadores de la función de los polinucleótidos que facilitan la captación de ADN o ARN por parte de las células y estimulan la replicación y división de las células también se denominan agentes estimulantes de las células. Los coagentes preferentes de conformidad con la presente invención se seleccionan de entre el grupo que consta de anilidas y ésteres de ácido benzoico. En realizaciones preferentes, el PFP es la bupivacaína.

De conformidad con algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan las composiciones y métodos que profiláctica y/o terapéuticamente inmunizan a un individuo contra un patógeno o una célula anómala relacionada con una enfermedad. El material genético codifica un péptido o una proteína que comparte al menos un epítopo con una proteína inmunogénica que se encuentra en el patógeno o en las células que se van a marcar como objetivo. El material genético se expresa por parte de las células del individuo y sirve como un objetivo inmunogénico contra el que se provoca una respuesta inmunitaria. La respuesta inmunitaria resultante tiene una base amplia: además de una respuesta inmunitaria humoral, se provocan ambos brazos de la respuesta inmunitaria celular. Los métodos de la presente invención son útiles para conferir inmunidad profiláctica y terapéutica. Por lo tanto, un método de inmunización incluye ambos métodos para proteger a un individuo del desafío patógeno, o la incidencia o proliferación de células específicas así como métodos de tratar a un individuo que sufra de una infección patógena, una enfermedad hiperproliferativa o una enfermedad autoinmune.

La presente invención es útil para provocar amplias respuestas inmunitarias contra una proteína objetivo, esto es, proteínas asociadas específicamente a patógenos o las células "anómalas" propias del individuo. La presente invención es útil para inmunizar a individuos contra organismos y agentes patogénicos de tal manera que una respuesta inmunitaria contra la proteína de un patógeno proporcione inmunidad protectora contra el patógeno. La presente invención es útil para combatir afecciones y enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer provocando una respuesta inmunitaria contra una proteína objetivo que está asociada específicamente a las células hiperproliferativas. La presente invención es útil para combatir afecciones y enfermedades autoinmunes provocando una respuesta inmunitaria contra una proteína objetivo que está asociada específicamente a células implicadas en la condición autoinmune.

Algunos aspectos de la presente invención hacen referencia a la terapia génica; esto es, a composiciones para y métodos de introducir moléculas de ácido nucleico en las células de las copias exógenas de genes de un individuo que corresponden a genes que son defectuosos, faltan, no funcionan o funcionan parcialmente en el individuo o que codifican proteínas terapéuticas, esto es, proteínas cuya presencia en el individuo eliminará una deficiencia en el individuo y/o cuya presencia proporcionará un efecto terapéutico en el individuo proporcionando de ese modo un medio de administrar la proteína a través de un medio alternativo a la administración proteica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína deseada" pretende hacer referencia a péptidos y proteínas codificados por construcciones génicas de la presente invención que o bien actúan como proteínas objetivo para una respuesta inmunitaria o como una proteína compensadora o terapéutica en los regímenes de terapia génica.

De conformidad con la presente invención, se introduce el ADN o ARN que codifica una proteína deseada en las células de un individuo donde se expresa, produciendo así la proteína deseada. El ADN o ARN que codifica la proteína deseada está unido a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Entre los elementos reguladores para la expresión del ADN se incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Además, también pueden estar incluidos en la construcción genética otros elementos, tales como por ejemplo una región Kozak.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "construcción genética" hace referencia a la molécula de ADN o ARN que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada y que incluye señales de iniciación y terminación unidas de forma operativa a elementos reguladores incluyendo un promotor y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo vacunado.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "forma expresable" hace referencia a las construcciones génicas que contienen los elementos reguladores necesarios unidos de forma operativa a una secuencia de codificación que codifica una proteína objetivo, de tal manera que cuando están presentes en la célula del individuo, se expresará la secuencia de codificación.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "vacuna genética" hace referencia a un preparado farmacéutico que está compuesto de una construcción genética que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína objetivo incluyendo preparados farmacéuticos útiles para invocar una respuesta inmunitaria terapéutica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "terapéutico genético" hace referencia a un preparado farmacéutico que está compuesto de una construcción genética que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína compensadora o terapéutica.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína objetivo" hace referencia a una proteína contra la que se puede provocar una respuesta inmunitaria. La proteína objetivo es una proteína inmunogénica que comparte al menos un epítopo con una proteína del patógeno o tipo de célula no deseable tal como por ejemplo una célula cancerosa o una célula implicada en una enfermedad autoinmune contra la que se necesita inmunización. La respuesta inmunitaria dirigida contra la proteína objetivo protegerá al individuo contra y tratará al individuo con respecto a la enfermedad o infección específica con la que está asociada la proteína objetivo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "que comparte un epítopo" hace referencia a proteínas que están compuestas de al menos un epítopo que es idéntico a o básicamente similar a un epítopo de otra proteína.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "epítopo básicamente similar" pretende hacer referencia a un epítopo que tiene una estructura que no es idéntica a un epítopo de una proteína pero que sin embargo invoca una respuesta inmunitaria celular o humoral que reacciona de forma cruzada con esa proteína.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína terapéutica" pretende hacer referencia a proteínas cuya presencia confiere un beneficio terapéutico al individuo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína compensadora" pretende hacer referencia a proteínas cuya presencia compensa por la ausencia de una proteína producida de forma endógena que funciona por completo debido a un gen endógeno ausente, defectuoso, que no funciona o que funciona parcialmente.

Las construcciones genéticas están compuestas de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada unida de forma operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión génica. Por lo tanto, la incorporación de la molécula de ADN o ARN a una célula viva da por resultado la expresión del ADN o ARN que codifica la proteína deseada y por consiguiente, la producción de la proteína deseada.

Cuando es captada por una célula, la construcción genética que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada unida de forma operativa a los elementos reguladores puede seguir presente en la célula como una molécula extracromosómica que funciona o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. Se puede introducir el ADN en las células, donde permanece como un material genético separado en la forma de un plásmido. De manera alternativa, el ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma se puede introducir en la célula. Cuando se introduce ADN en la célula, se pueden añadir reactivos que promueven la integración de ADN en los cromosomas. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración también pueden incluirse en la molécula de ADN. De manera alternativa, se puede administrar ARN a la célula. También se considera el proporcionar la construcción genética como un minicromosoma lineal incluyendo un centrómero, telómeros y un origen de replica-
ción.

La molécula que codifica una proteína deseada puede ser ADN o ARN que esté compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Estas moléculas pueden ser ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido de los mismos o una molécula de ARN tal como por ejemplo ARNm. Por consiguiente, tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "construcción de ADN", "construcción genética" y "secuencia de nucleótidos" se pretende que hagan referencia tanto a moléculas de ADN como a moléculas de ARN.

Entre los elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ADN se incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, y una señal de poliadenilación. Además, a menudo se necesitan potenciadores para la expresión génica. Es necesario que estos elementos estén unidos de forma operativa a la secuencia que codifica las proteínás deseadas y que los elementos reguladores sean funcionales en el individuo al que se administren.

Los codones de iniciación y el codón de parada se consideran generalmente que forman parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al que se administre la construcción génica. Los codones de iniciación y terminación deben estar encuadrados con la secuencia de codificación.

Los promotores y las señales de poliadenilación utilizados deben ser funcionales dentro de las células del individuo.

Entre los ejemplos de promotores útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para los seres humanos, se incluyen pero sin limitarse a los promotores del Virus del Simio 40 (SV40), el promotor del Virus del Tumor Mamario Murino (rDTfV), el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) tal como por ejemplo el promotor de Repetición Terminal Larga (RTL) del VIH, el virus de Moloney, el VLA, el Citomegalovirus (CMV) tal como por ejemplo el promotor temprano inmediato del CMV, el Virus de Epstein Barr (VEB), el Virus del Sarcoma de Rous (VSR) así como los promotores de los genes humanos tales como por ejemplo la Actina humana, la Miosina humana, la Hemoglobina humana, la creatina muscular humana y la metalotioneína humana.

Entre los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para los seres humanos, se incluyen pero sin limitarse a las señales de poliadenilación del SV40 y las señales de poliadenilación de RTL. En particular, se utiliza la señal de poliadenilación del SV40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, California), denominada la señal de poliadenilación del SV40.

Además de los elementos reguladores necesarios para la expresión de ADN, también pueden incluirse otros elementos en la molécula de ADN. Entre dichos elementos adicionales se incluyen los potenciadores. El potenciador se puede seleccionar de entre el grupo que incluye pero no se limita a: la Actina humana, la Miosina humana, la Hemoglobina humana, la creatina muscular humana y los potenciadores virales tales como por ejemplo los procedentes del CMV, el VSR y el VEB.

Se pueden proporcionar las construcciones genéticas con origen de replicación de mamífero para mantener la construcción extracromosómicamente y producir múltiples copias de la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, California) contienen el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región de codificación del antígeno nuclear EBNA-1 que produce replicación episomal de alto número de copia sin integración.

En algunas realizaciones preferentes, el vector utilizado se selecciona de entre los descritos en el Ejemplo 46. En aspectos de la invención referentes a la terapia génica, se prefieren las construcciones con orígenes de replicación que incluyen el antígeno necesario para su activación.

En algunas realizaciones preferentes relativas a aplicaciones de inmunización, la construcción genética contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína objetivo e incluyen de forma adicional genes para proteínas que aumentan la respuesta inmunitaria contra dichas proteínas objetivo. Ejemplos de tales genes son aquellos que codifican citoquinas y linfoquinas tales como por ejemplo el interferón alfa, el interferón gamma, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el GC-SF, el GM-CSF, el TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. En algunas realizaciones, se prefiere que el gen para GM-CSF se incluya en las construcciones genéticas utilizadas en las composiciones inmunizadoras.

Se puede añadir un elemento adicional que sirva como un objetivo para la destrucción celular si se desea para eliminar las células que reciben la construcción genética por la razón que fuere. Se puede incluir un gen de la timidina quinasa (tk) del herpes de una forma expresable en la construcción genética. Se puede administrar el fármaco ganciclovir al individuo y ese fármaco causará la eliminación selectiva de cualquier célula que produzca tk, proporcionando de este modo el medio para la destrucción selectiva de células con la construcción genética.

Para maximizar la producción de proteínas, se pueden seleccionar secuencias reguladoras que sean las adecuadas para la expresión génica en las células en las que se administre la construcción. Además, se pueden seleccionar los codones que se transcriban más eficazmente en la célula. Una persona que posea unos conocimientos ordinarios de la técnica puede producir construcciones de ADN que sean funcionales en las células.

Para probar la expresión, las construcciones genéticas se pueden someter a prueba para ver los niveles de expresión in vitro utilizando cultivo de tejido de las células del mismo tipo que las que se van a administrar. Por ejemplo, si la vacuna genética se va a administrar a células musculares humanas, las células musculares maduradas en un cultivo tales como por ejemplo las células de tumores musculares sólidos de rabdomiosarcoma se pueden utilizar como un modelo in vitro para medir el nivel de expresión.

Las construcciones genéticas utilizadas en la presente invención no están incluidas dentro de las partículas retrovirales. Las construcciones genéticas son captadas por la célula sin inserción mediada por la partícula retroviral tal como la que se produce cuando las partículas de los retrovirus con ARN retroviral que se incluye en las partículas retrovirales infecta a una célula. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "libre de partículas retrovirales" pretende hacer referencia a construcciones genéticas que no están incluidas dentro de las partículas retrovirales. Tal y como se utiliza en el presente documento, "disociado de un agente infeccioso" pretende hacer referencia a material genético que no forma parte de un vector viral, bacteriano o eucariótico, tanto si está activo, inactivo, vivo o muerto, que es capaz de infectar una célula.

En algunas realizaciones, las construcciones genéticas constituyen menos que un genoma viral replicable completo de tal manera que tras la introducción en la célula, la construcción genética posee información genética insuficiente como para dirigir la producción de partículas virales infecciosas. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "genoma viral incompleto" pretende hacer referencia a una construcción genética que contiene menos que un genoma completo de manera que la incorporación de tal construcción genética en una célula no constituye la introducción de información genética suficiente para la producción del virus infeccioso.

En algunas realizaciones, se puede administrar una vacuna viral atenuada como una construcción genética que contenga material genético suficiente como para permitir la producción de partículas virales. La administración de la vacuna atenuada como una construcción genética hace posible una manera más sencilla de producir grandes cantidades de producto inmunizador seguro, puro y activo.

La construcción genética se puede administrar cono sin el uso de microproyectiles. Se prefiere que las construcciones genéticas de la presente invención se puedan administrar a las células de un individuo libres de partículas sólidas. Tal y como se utiliza en el presente documento, la frase "libre de partículas sólidas" pretende hacer referencia a un líquido que no contiene ningún microproyectil sólido utilizado como un medio para perforar, pinchar o atravesar de otra manera la membrana celular de una célula para crear un puerto de entrada para el material genético en la
célula.

La presente invención se puede utilizar para inmunizar a un individuo contra todos los patógenos tales como por ejemplo los virus, procariotas y organismos eucarióticos patogénicos tales como por ejemplo organismos patogénicos unicelulares y parásitos multicelulares. La presente invención es especialmente útil para inmunizar a un individuo contra aquellos patógenos que infectan a las células y que no están encapsulados tales como por ejemplo los virus, y las procariotas como la gonorrea, listeria y shigella. Además, la presente invención es también útil para inmunizar a un individuo contra los patógenos protozoarios que incluyen una fase en el ciclo de vida en la que son patógenos intracelulares. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "patógeno intracelular" pretende hacer referencia a un virus u organismo patogénico que, al menos en parte de su ciclo de vida o ciclo reproductivo, existe dentro de una célula huésped y allí produce o hace que se produzcan proteínas patógenas. La Tabla 1 proporciona un listado de algunos de los géneros y familias virales para las que se puede hacer vacunas de conformidad con la presente invención. Las construcciones de ADN que están compuestas de secuencias de ADN que codifican los péptidos que constan de al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo expresado en un antígeno patógeno tal como por ejemplo aquellos antígenos enumerados en las tablas son útiles en las vacunas. Además, la presente invención es también útil para inmunizar a un individuo contra otros patógenos incluyendo los patógenos protozoarios eucarióticos y procarióticos así como los parásitos multicelulares tales como por ejemplo los enumerados en la
Tabla 2.

Para producir una vacuna genética para proteger contra la infección patógena, se debe incluir en la construcción genética el material genético que codifica las proteínas inmunogénicas contra las que se puede desarrollar una respuesta inmunitaria protectora. Tanto si el patógeno infecta de forma intracelular, para lo que la presente invención es especialmente útil, como si lo hace de forma extracelular, es poco probable que todos los antígenos patógenos provoquen una respuesta protectora. Dado que el ADN y el ARN son ambos relativamente pequeños y se pueden producir de manera relativamente sencilla, la presente invención proporciona la ventaja adicional de hacer posible la vacunación con múltiples antígenos patógenos. La construcción genética utilizada en la vacuna genética puede incluir material genético que codifique muchos antígenos patógenos. Por ejemplo, se pueden incluir diversos genes virales en una única construcción proporcionando de ese modo múltiples objetivos. Además, se pueden preparar múltiples inoculantes que se pueden administrar a diferentes células en un individuo para que incluyan conjuntamente, en algunos casos, un conjunto de genes completo o, más preferentemente, un conjunto de genes incompleto tal como por ejemplo un conjunto de genes casi completo en la vacuna. Por ejemplo, se puede administrar un conjunto completo de genes virales utilizando dos construcciones en las que cada una contenga una mitad diferente del genoma que se administran en diferentes sitios. Por lo tanto, se puede invocar una respuesta inmunitaria contra cada antígeno sin el riesgo de ensamblar un virus infeccioso. Esto hace posible la introducción de más de un único antígeno objetivo y puede eliminar el requisito de tener que identificar a los antígenos protectores.

La facilidad de manipulación y la naturaleza económica del ADN y el ARN hacen posible además medios más eficientes de cribado en busca de antígenos protectores. Los genes se pueden clasificar y someter a prueba sistemáticamente mucho más fácilmente que las proteínas. Se seleccionan los organismos y agentes patogénicos para los que se está produciendo la vacuna para protegerse contra ellos y se identifica una proteína inmunogénica. Las Tablas 1 y 2 incluyen listados de algunos de los organismos y agentes patogénicos para los que se pueden preparar vacunas genéticas para proteger a un individuo de la infección por parte de ellos. En algunas realizaciones preferentes, los métodos para inmunizar a un individuo contra un patógeno se dirigen contra el VIH, el VLHT o el
VHB.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método de conferir una respuesta inmunitaria protectora de base amplia contra las células hiperproliferantes que son características de las enfermedades hiperproliferativas y un método de tratar a individuos que sufren de enfermedades hiperproliferativas. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "enfermedades hiperproliferativas" pretende hacer referencia a aquellas enfermedades y afecciones caracterizadas por la hiperproliferación de células. Entre los ejemplos de enfermedades hiperproliferativas se incluyen todas las formas de cáncer y psoriasis.

Se ha descubierto que la introducción de una construcción genética que incluya una secuencia de nucléótidos que codifique una proteína asociada a una "célula hiperproliferante" inmunogénica en las células de un individuo da por resultado la producción de aquellas proteínas en las células vacunadas de un individuo. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína asociada hiperproliferativa" pretende hacer referencia a las proteínas que están asociadas a una enfermedad hiperproliferativa. Para inmunizar contra las enfermedades hiperproliferativas, se administra a un individuo una construcción genética que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que está asociada a una enfermedad hiperproliferativa.

Para que la proteína asociada hiperproliferativa sea un objetivo inmunogénico efectivo, debe ser una proteína que se produzca exclusivamente o en mayores niveles en células hiperproliferativas en comparación con células normales. Entre los antígenos objetivo se incluyen dichas proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos que están compuestos de al menos un epítopo que se encuentra en dichas proteínas. En algunos casos, una proteína asociada hiperproliferativa es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a la proteína normal salvo que posee una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente que da por resultado un epítopo diferente que no se encuentra en la proteína normal. Tales proteínas objetivo incluyen aquellas que son proteínas codificadas por oncogenes tales como por ejemplo myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además de los productos de los oncogenes como antígenos objetivo, entre las proteínas objetivo para los tratamientos contra el cáncer y los regímenes protectores se incluyen regiones variables de anticuerpos hechos por linfomas de células B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas realizaciones, también se utilizan como antígenos objetivo para las enfermedades autoinmunes. Se pueden utilizar otras proteínas asociadas a tumores como proteínas objetivo tales como por ejemplo las proteínas que se encuentran en mayores niveles en las células tumoralés incluyendo la proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 17-1A y las proteínas de unión a folatos.

Aunque la presente invención se puede utilizar para inmunizar a un individuo contra una o más de las diversas formas de cáncer, la presente invención es especialmente útil para inmunizar profilácticamente a un individuo que tiene predisposición a desarrollar un cáncer concreto o que ha tenido cáncer y es por lo tanto susceptible de una recaída. La evolución en la genética y la tecnología así como la epidemiología hacen posible la determinación de la probabilidad y la evaluación del riesgo de desarrollo del cáncer en un individuo. Utilizando el cribado genético y/o los antecedentes familiares de salud, es posible predecir la probabilidad que un individuo en concreto tiene para desarrollar cualquiera de los varios tipos de cáncer.

De forma similar, aquellos individuos que ya han desarrollado cáncer y a los que se ha tratado para eliminar el cáncer o en los que el cáncer está remitiendo son especialmente susceptibles de una recaída y de volver a sufrirlo. Como parte de un régimen de tratamiento, a tales individuos se les puede inmunizar contra el cáncer que se les ha diagnosticado que han tenido para combatir su reaparición. De este modo, una vez que se conoce que un individuo ha sufrido un tipo de cáncer y tiene el riesgo de una recaída, se le puede inmunizar para preparar su sistema inmunitario para que combata cualquier futura aparición del cáncer.

La presente invención proporciona un método para tratar a individuos que sufren de enfermedades hiperproliferativas. En dichos métodos, la introducción de construcciones genéticas sirve como una inmunoterapia, dirigiendo y estimulando el sistema inmunitario del individuo para combatir las células hiperproliferativas que producen la proteína objetivo.

La presente invención proporciona un método para tratar a individuos que sufren de afecciones y enfermedades autoinmunes confiriendo una respuesta inmunitaria protectora de base amplia contra objetivos que están asociados a la autoinmunidad incluyendo receptores celulares y células que producen anticuerpos "autodirigidos".

Entre las enfermedades autoinmunes mediadas por células T se incluyen la artritis reumatoide (AR), la esclerosis múltiple (EM), el síndrome de Sjogren, la sarcoidosis, la diabetes mellitus insulino dependiente (DMID), la tiroiditis autoinmune, la artritis reactiva, la espondilitis anquilosante, la escleroderma, la polimiositis, la dermatomiositis, la psoriasis, la vasculitis, la granulomatosis de Wegener, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por receptores de células T que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de las células T provocaría una respuesta inmunitaria incluyendo que los LTC eliminen esas células T.

En la AR, se han caracterizado varias regiones variables específicas de receptores de células T (RCT) que están implicados en la enfermedad. Estos RCT incluyen V\beta-3, V\beta-14, VS-17 y V\alpha-17. Por lo tanto, la vacunación con una construcción de ADN que codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que marcará como objetivo las células T implicadas en la AR. Véase: Howell, M.D., et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253:325-329; Williams, W. V., et al., 1992 J. Clin. Invest. 90:326-333; cada uno de los cuales se incluye en el presente documento por referencia.

En la EM, se han caracterizado varias regiones variables específicas de los RCT que están implicados en la enfermedad. Estos RCT incluyen V\beta-7 y V\alpha-10. Por lo tanto, la vacunación con una construcción de ADN que codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que marcará como objetivo las células T implicadas en la EM. Véase: Wucherpfennig, K.W., et al., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et al., 1990 Nature 345:344-346; cada uno de los cuales se incluye en el presente documento por referencia.

En la escleroderma, se han caracterizado varias regiones variables específicas de los RCT que están implicados en la enfermedad. Estos RCT incluyen V\beta-6, V\beta-8, V\beta-14 y V\alpha-16, V\alpha-3C, V\alpha-7, V\alpha-14, V\alpha-15, V\alpha-16, V\alpha-28 y V\alphaa-12. Por lo tanto, la vacunación con una construcción de ADN que codifica al menos una de estas proteínas provocará una respuesta inmunitaria que marcará como objetivo las células T implicadas en la escleroderma.

Para tratar a pacientes que sufren de una enfermedad autoinmune mediada por células T, especialmente aquellas para las que aún se tiene que caracterizar la región variable de los RCT, se puede llevar a cabo una biopsia sinovial. Se pueden tomar muestras de las células T presentes y la región variable de aquellos RCT identificados utilizando técnicas estándar. Se pueden preparar vacunas genéticas utilizando esta información.

Entre las enfermedades autoinmunes mediadas por células B se incluyen el Lupus (LES), la enfermedad de Grave, la miastenia gravis, la anemia hemolítica autoinmune, la trombocitopenia autoinmune, el asma, la crioglobulinemia, la esclerosis biliar primaria y la anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por anticuerpos que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de los anticuerpos provocaría una respuesta inmunitaria incluyendo que los LTC eliminen aquellas células B que producen los anticuerpos.

Para tratar a pacientes que sufren de una enfermedad autoinmune mediada por células B, se debe identificar la región variable de los anticuerpos implicados en la actividad autoinmune. Se puede llevar a cabo una biopsia y se pueden tomar muestras de los anticuerpos presentes en un sitio de inflamación. Se puede identificar la región variable de esos anticuerpos utilizando técnicas estándar. Se pueden preparar vacunas genéticas utilizando esta información.

En el caso del LES, se cree que un antígeno es el ADN. Por lo tanto, en pacientes que van a ser inmunizados contra el LES, se pueden cribar sus sueros en busca de anticuerpos anti-ADN y se puede preparar una vacuna que incluya construcciones de ADN que codifiquen la región variable de dichos anticuerpos anti-ADN encontrados en los sueros.

Las características estructurales comunes entre las regiones variables tanto de los RCT como de los anticuerpos son bien conocidas. La secuencia de ADN que codifica un RCT o anticuerpo en particular se puede encontrar generalmente siguiendo métodos bien conocidos tales como por ejemplo aquellos descritos en Kabat, et al. 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Bethesda MD, que se incluye en el presente documento por referencia. Además, se puede encontrar un método general para clonar las regiones variables funcionales de anticuerpos en Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:1066, que se incluye en el presente documento por referencia.

En algunas de las realizaciones de la invención que hace referencia a la terapia génica, las construcciones génicas contienen o bien genes compensadores o genes que codifican proteínas terapéuticas. Entre los ejemplos de genes compensadores se incluyen un gen que codifica distrofina o un fragmento funcional, un gen para compensar por el gen defectuoso en pacientes que sufren de fibrosis quística, una insulina, un gen para compensar por el gen defectuoso en pacientes que sufren de ADA, y un gen que codifica el Factor VIII. Entre los ejemplos de genes que codifican las proteínas terapéuticas se incluyen genes que codifican eritropoietina, interferón, receptor de LBD, GM-CSF, IL-2, IL-4 y TNF. De forma adicional, se pueden administrar construcciones genéticas que codifican componentes de anticuerpos de una cadena que se unen específicamente a sustancias tóxicas.

En algunas realizaciones preferentes, el gen de la distrofina se proporciona como parte de un mini-gen y se utiliza para tratar a individuos que sufren de distrofia muscular. En algunas realizaciones preferentes, se proporciona un mini-gen que contiene secuencia de codificación para una proteína de la distrofina parcial. Las anomalías de la distrofina son responsables tanto de la Distrofia Muscular de Becker (DMB) más leve como de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) más grave. En la DMB se produce distrofina, pero es anómala en tamaño y/o cantidad. El paciente se encuentra de no muy fuerte a moderadamente débil. En la DMD no se produce ninguna proteína y el paciente se ve confinado a una silla de ruedas para la edad de 13 años y normalmente muere para la edad de 20 años. En algunos pacientes, especialmente aquellos que sufren de DMB, la proteína de la distrofina parcial producida por la expresión de un mini-gen administrado de conformidad con la presente invención puede proporcionar una función muscular
mejorada.

En algunas realizaciones preferentes, los genes que codifican IL-2, IL-4, interferón o TNF se administran a las células tumorales que están o bien presentes o que se han extraído y después se reintroducen en un individuo. En algunas realizaciones, se administra un gen que codifica el interferón gamma a un individuo que sufre de esclerosis múltiple.

También se pueden administrar moléculas antisentido y ribozimas a las células de un individuo introduciendo material genético que actúa como un modelo para las copias de tales agentes activos. Estos agentes inactivan u obstaculizan de otra manera la expresión de genes que codifican proteínas cuya presencia no es deseable. Las construcciones que contienen secuencias que codifican moléculas antisentido se pueden utilizar para inhibir o impedir la producción de proteínas dentro de las células. Por consiguiente, las proteínas de producción tales como por ejemplo los productos de los oncogenes se pueden eliminar o reducir. De modo similar, las ribozimas pueden perturbar la expresión génica destruyendo de forma selectiva el ARN mensajero antes de que sea traducido en proteína. En algunas realizaciones, las células se tratan de conformidad con la invención utilizando construcciones que codifican antisentido o ribozimas como parte de un régimen terapéutico que implica la administración de otros procedimientos y terapias. Las construcciones génicas que codifican moléculas antisentido y ribozimas utilizan vectores similares a aquellos que se utilizan cuando la producción de proteínas se desea salvo que la secuencia de codificación no contiene un codón de comienzo para iniciar la traducción del ARN en proteína. En algunas realizaciones, se prefiere que los vectores descritos en el Ejemplo 46, especialmente aquellos que contienen un origen de replicación y una forma expresable del antígeno nuclear apropiado.

Las ribozimas son ARN catalíticos que son capaces de la auto-división o la división de otras moléculas de ARN. Varios tipos diferentes de ribozimas, tales como por ejemplo las de cabeza de martillo, de horquilla, de intrón del grupo I de Tetrahymena, de cabeza de hacha, y de ARNasa P, son conocidos en la técnica. (S. Edgington, Biotechnology 1992 10, 256:262). Las ribozimas de cabeza de martillo tienen un sitio catalítico que se ha encuadrado hasta un núcleo de menos de 40 nucleótidos. Diversas ribozimas en viroides de plantas y los ARN satélite comparten una estructura secundaria común y ciertos nucleótidos conservados. Aunque estas ribozimas por naturaleza sirven como su propio sustrato, el campo enzimático se puede dirigir a otro sustrato de ARN a través del emparejado básico con secuencias que flanquean el sitio de división conservado. Esta capacidad de diseñar de forma personalizada las ribozimas les ha permitido que se utilicen para la división de ARN específico de las secuencias (G. Paolella et al., EMBO 1992, 1913-1919). Por lo tanto estará dentro del alcance de una persona experta en la técnica el poder utilizar diferentes secuencias catalíticas de varios tipos de ribozimas, tales como por ejemplo la secuencia catalítica de cabeza de martillo y diseñarlas de la manera revelada en el presente documento. Las ribozimas se pueden diseñar contra una variedad de objetivos incluyendo las secuencias de nucleótidos patógenas y las secuencias oncogénicas. Ciertas realizaciones preferentes de la invención incluyen la complementariedad suficiente como para dirigir de forma específica la transcripción de fusión abl-bcr a la vez que se mantiene la eficiencia de la reacción de división.

De conformidad con algunas realizaciones de la presente invención, las células se tratan con compuestos que facilitan la captación de construcciones genéticas por parte de las células. De conformidad con algunas realizaciones de la presente invención, las células se tratan con compuestos que estimulan la división celular y facilitan la captación de las construcciones genéticas. La administración de compuestos que facilitan la captación de las construcciones genéticas por parte de las células incluyendo compuestos estimulantes de células da por resultado una respuesta inmunitaria más eficiente contra la proteína objetivo codificada por la construcción genética.

De conformidad con algunas realizaciones de la presente invención, la construcción genética se administra a un individuo utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. De conformidad con algunas realizaciones de la presente invención, la construcción genética se administra simultáneamente a un individuo de forma intradérmica, subcutánea e intramuscular utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son bien conocidos y están ampliamente disponibles. Una persona que posea unos conocimientos ordinarios de la técnica puede utilizar, siguiendo las enseñanzas del presente documento, dispositivos de inyección sin aguja para administrar el material genético a las células de un individuo. Los dispositivos de inyección sin aguja son muy apropiados para administrar material genético a todos los tejidos. Son especialmente útiles para administrar material genético a células musculares y cutáneas. En algunas realizaciones, se puede utilizar un dispositivo de inyección sin aguja para propulsar un líquido que contiene moléculas de ADN hacia la superficie de la piel del individuo. El líquido es propulsado a una velocidad suficiente como para que cuando impacte con la piel el líquido penetre la superficie de la piel, penetre a través de la piel y el tejido muscular bajo ella. Por lo tanto, el material genético se administra simultáneamente de forma intradérmica, subcutánea e intramuscular. En algunas realizaciones, se puede utilizar un dispositivo de inyección sin aguja para administrar material genético al tejido de otros órganos para introducir una molécula de ácido nucleico a las células de ese órgano.

De conformidad con la invención, la vacuna genética se puede administrar directamente al individuo a ser inmunizado o ex vivo a células que se hayan extraído del individuo que serán reimplantadas después de la administración. Por cualquiera de las vías, se introduce el material genético en las células que están presentes en el cuerpo del individuo. Entre las vías de administración se incluyen, pero no se limitan a, la vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral así como de forma transdérmica o por inhalación o supositorio. Entre las vías de administración preferentes se incluyen la inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal e intradérmica. La administración de construcciones génicas que codifican proteínas objetivo puede conferir inmunidad mucosa en individuos inmunizados a través de un modo de administración en el que el material se presente en tejidos asociados a la inmunidad mucosa. Por lo tanto, en algunos ejemplos, la construcción genética se administra en la cavidad bucal dentro de la boca de un individuo.

Las construcciones genéticas se pueden administrar utilizando medios entre los que se incluyen, pero no se limitan a, jeringuillas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, o "pistolas genéticas de bombardeo con microproyectiles". De manera alternativa, la vacuna genética se puede introducir a través de diversos medios en las células que se han extraído del individuo. Entre tales medios se incluyen, por ejemplo, la transfección ex vivo, la electroporación, la microinyección y el bombardeo con microproyectiles. Después de que la construcción genética haya sido captada por las células, éstas son reimplantadas en el individuo. Se prevé que aparte de eso las células no inmunogénicas que tengan construcciones genéticas incluidas allí se pueden implantar en el individuo incluso si las células vacunadas se hubieron tomado originalmente de otro individuo.

Las vacunas genéticas de conformidad con la presente invención están compuestas de alrededor de 1 nanogramo a alrededor de 1000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las vacunas contienen alrededor de 10 nanogramos a alrededor de 800 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las vacunas contienen alrededor de 0,1 a alrededor de 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las vacunas contienen alrededor de 1 a alrededor de 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las vacunas contienen alrededor de 25 a alrededor de 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferentes, las vacunas contienen alrededor de 100 microgramos de ADN.

Las vacunas genéticas de conformidad con la presente invención se formulan de conformidad con el modo de administración a ser utilizado. Una persona que posea conocimientos ordinarios de la técnica puede formular fácilmente una vacuna genética que está compuesta de una construcción genética. En los casos en que la inyección intramuscular sea el modo de administración elegido, se utiliza preferentemente una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir el cloruro sódico, la dextrosa, el manitol, el sorbitol y la lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas como por ejemplo la solución salina tamponada con fosfato. Entre los estabilizadores se incluyen la gelatina y la albúmina. En algunas realizaciones, se añade a la formulación un agente vasoconstrictor. Los preparados farmacéuticos de conformidad con la presente invención se proporcionan estériles y libres de pirogenes.

Las construcciones genéticas de la invención se formulan con o se administran en conjunción con un potenciador de la función de los polinucleótidos. Los co-agentes preferentes de conformidad con la presente invención se seleccionan de entre el grupo que consta de ésteres de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y las sales clorhídricas de los mismos tales como por ejemplo aquellas de la familia de los anestésicos locales.

El PFP puede ser un compuesto que tenga una de las fórmulas siguientes:

Ar-R^{1}-O-R^{2}-R^{3}

o

Ar-N-R^{1}-R^{2}-R^{3}

o

R^{4}-N-R^{5}-R^{6}

o

R^{4}-O-R^{1}-N-R^{7}

en las que:

\quad: Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, m-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, en los que el grupo amino en los compuestos de aminobenceno pueden ser amino, alquilamina C_{1}-C_{5}, dialquilamina C_{1}-C_{5}, C_{1}-C_{5} y sustituciones en compuestos sustituidos son el halógeno, el alquilo C_{1}-C_{5} y el alcóxido C_{1}-C_{5};

\quad: R^{1} es C=O;

\quad: R^{2} es el aquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

\quad: R^{3} es el hidrógeno, la amina, la alquilamina C_{1}-C_{5}, la dialquilamina C_{1}-C_{5}, C_{1}-C_{5};

\quad: R^{2} + R^{3} pueden formar un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido del alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida del alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido del alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo N-sustituido del alquilo C_{1}-C_{10};

\quad: R^{4} es Ar, R^{2} ó el alcóxido C_{1}-C_{5}, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido del alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida del alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido del alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido del alcóxido C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo N-sustituido del alquilo C_{1}-C_{10};

\quad: R^{5} es C=NH;

\quad: R^{6} es Ar, R^{2} ó el alcóxido C_{1}-C_{5}, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido del alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida del alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido del alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido del alcóxido C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo N-sustituido del alquilo C_{1}-C_{10}; y

\quad: R^{7} es Ar, R^{2} ó un alcóxido C_{1}-C_{5}, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido del alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida del alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido del alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido del alcóxido C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo N-sustituido del alquilo C_{1}-C_{10}.

Entre los ejemplos de ésteres se incluyen: ésteres de ácido benzoico tales como por ejemplo la piperocaína, la meprilcaína y la isobucaína; ésteres de ácido para-aminobenzoico tales como por ejemplo la procaína, la tetracaína, la butetamina, la propoxicaína y la cloroprocaína; ésteres de ácido meta-aminobenzoico incluyendo la metabutamina y la primacaína; y ésteres de ácido para-etoxibenzoico tales como por ejemplo la paretoxicaína. Entre los ejemplos de anilidas se incluyen la lidocaína, la etidocaína, la mepivacaína, la bupivacaína, la pirrocaína y la prilocaína. Entre otros ejemplos de tales compuestos se incluyen la dibucaína, la benzocaína, la diclonina, la pramoxina, la proparacaína, la butacaína, el benoxinato, la carbocaína, la bupivacaína de metilo, el picrato de butesina, la fenacaína, el diotano, la lucaína, la intracaína, la nupercaína, la metabutoxicaína, la piridocaína, la biofenamina y los bicíclicos derivados botánicamente tales como por ejemplo la cocaína, la cinamilcocaína, la truxilina y el etileno de cocaína y todos los compuestos que se asocian con el ácido clorhídrico.

En realizaciones preferentes, el PFP es la bupivacaína. La diferencia entre la bupivacaína y la mepivacaína es que la bupivacaína tiene un grupo N-butilo en lugar de un grupo N-metilo de la mepivacaína. Los compuestos pueden tener en esa N, C_{1}-C_{10}. Los compuestos pueden ser sustituidos por un halógeno como por ejemplo la procaína y la cloroprocaína. Se prefieren las anilidas.

La bupivacaína se administra antes de, de forma simultánea a o posteriormente a la construcción genética. La bupivacaína y la construcción genética se pueden formular en la misma composición. La bupivacaína es especialmente útil como un agente estimulante celular en vista de sus muchas propiedades y actividades cuando se administra en los tejidos. La bupivacaína promueve y facilita la captación de material genético por parte de la célula. Como tal, es un agente de transfección. La administración de construcciones genéticas en conjunción con la bupivacaína facilita la entrada de las construcciones genéticas en las células. La bupivacaína se cree que deteriora o hace que la membrana celular sea más permeable de otra manera. La replicación y la división celular se ven estimuladas por la bupivacaína. En consecuencia, la bupivacaína actúa como un agente de replicación. La administración de bupivacaína también irrita y daña el tejido. Como tal, actúa como un agente inflamatorio que provoca la migración y quimiotaxis de las células inmunitarias al sitio de administración. Además de las células que normalmente están presentes en el sitio de administración, las células del sistema inmunitario que migran al sitio en respuesta al agente inflamatorio, pueden entrar en contacto con el material genético administrado y la bupivacaína. La bupivacaína, actuando como un agente de transfección, está disponible para promover la captación de material genético también por parte de tales células del sistema inmunitario.

La bupivacaína está relacionada química y farmacológicamente con los anestésicos locales aminoacilos. Es un homólogo de la mepivacaína y está relacionada con la lidocaína. La bupivacaína hace que el voltaje del tejido muscular sea sensible al desafío de sodio y lleva a cabo la concentración fónica dentro de las células. Se puede encontrar una descripción completa de las actividades farmacológicas de la bupivacaína en Ritchie, J.M. y N.M. Greene, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Editores: Gilman, A.G. et al, 8ª Edición, Capítulo 15:3111, que se incluye en el presente documento por referencia. La bupivacaína y los compuestos que muestran una similitud funcional con la bupivacaína se prefieren en el método de la presente invención.

La bupivacaína-HCl se designa químicamente como 2-piperidinecarboxamida, 1-butilo-N-(2,6-dimetilfenilo)-mono-hidrocloruro, monohidrato y está ampliamente disponible de forma comercial para usos farmacéuticos procedente de muchas fuentes incluyendo de Astra Pharmaceutical Products Inc. (Wetsboro, Massachusetts) y Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (Nueva York, NY), Eastman Kodak (Rochester, NY). La bupivacaína se formula comercialmente con y sin metilparabeno y con o sin epinefrina. Se puede utilizar cualquiera de tales formulaciones. Está disponible de forma comercial para uso farmacéutico en concentraciones de 0,25%, 0,5% y 0,75% que se pueden utilizar en la invención. Se pueden preparar si así se desea concentraciones alternativas, especialmente aquellas entre 0,05% y 1,0% que provocan efectos deseables. De conformidad con la presente invención, se administra alrededor de 250 \mug a alrededor de 10 mg de bupivacaína. En algunas realizaciones, se administra alrededor de 250 \mug a alrededor de 7,5 mg. En algunas realizaciones, se administra alrededor de 0,05 mg a alrededor de 5,0 mg. En algunas realizaciones, se administra alrededor de 0,5 mg a alrededor de 3,0 mg. En algunas realizaciones se administra alrededor de 5 a 50 \mug. Por ejemplo, en algunas realizaciones se administra alrededor de 50 \mul a alrededor de 2 ml, preferentemente de 50 \mul a alrededor de 1500 \mul y más preferentemente alrededor de 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en un portador farmacéutico isotónico en el mismo sitio que la vacuna antes de, de forma simultánea a o después de que se administre la vacuna. De manera similar, en algunas realizaciones, se administra alrededor de 50 \mul a alrededor de 2 ml, preferentemente de 50 \mul a alrededor de 1500 \mul y más preferentemente alrededor de 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% en un portador farmacéutico isotónico en el mismo sitio que la vacuna antes de, de forma simultánea a o después de que se administre la vacuna. La bupivacaína y cualesquiera otros compuestos que actúen de forma similar, especialmente aquellos de la familia afín de los anestésicos locales, se pueden administrar en concentraciones que proporcionen la facilitación deseada de la captación de construcciones genéticas por parte de las células.

En algunas realizaciones de la invención, el individuo se somete primero a una inyección de bupivacaína antes de la vacunación genética mediante inyección intramuscular. Esto es, hasta por ejemplo aproximadamente de una semana a diez días antes de la vacunación, al individuo se le inyecta primero bupivacaína. En algunas realizaciones, antes de la vacunación, al individuo se le inyecta bupivacaína aproximadamente de 1 a 5 días antes de la administración de la construcción genética. En algunas realizaciones, antes de la vacunación, al individuo se le inyecta bupivacaína aproximadamente 24 horas antes de la administración de la construcción genética. De manera alternativa, la bupivacaína se puede inyectar de forma simultánea, minutos antes o después de la vacunación. Por lo tanto, la bupivacaína y la construcción genética pueden combinarse e inyectarse de forma simultánea como una mezcla. En algunas realizaciones, la bupivacaína se administra tras la administración de la construcción genética. Por ejemplo, hasta aproximadamente de una semana a diez días después de la administración de la construcción genética, al individuo se le inyecta bupivacaína. En algunas realizaciones, al individuo se le inyecta bupivacaína aproximadamente 24 horas después de la vacunación. En algunas realizaciones, al individuo se le inyecta bupivacaína aproximadamente de 1 a 5 días después de la vacunación. En algunas realizaciones, al individuo se le administra bupivacaína hasta aproximadamente una semana a diez días después de la vacunación.

Entre otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios y que se pueden administrar conjuntamente con la bupivacaína y compuestos que actúan de forma similar se incluyen las lectinas, los factores de crecimiento, las citoquinas y las linfoquinas tales como por ejemplo el interferón alfa, el interferón gamma, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el GC-SF, el GM-CSF, el TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12 así como la colagenasa, el factor de crecimiento de fibroblasto, el estrógeno, la dexametasona, las saponinas, los agentes activos superficiales como por ejemplo los complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), el adyuvante incompleto de Freund, un análogo de LPS incluyendo el Lípido A de monofosforilo (MPL), los péptidos de muramilo, los análogos de quinona y las vesículas tales como por ejemplo el escualeno, el ácido hialurónico y la hialuronidasa también pueden utilizarse administrándose en conjunción con la construcción genética. En algunas realizaciones, las combinaciones de estos agentes se administran en conjunción con la bupivacaína y la construcción genética. Por ejemplo, la bupivacaína y o bien el ácido hialurónico o la hialuronidasa se administran conjuntamente con una construcción genética.

La construcción genética se puede combinar con colágeno como una emulsión y administrar de forma parenteral. La emulsión de colágeno proporciona un medio para la liberación sostenida de ADN. Se utilizan de 50 \mul a 2 ml de colágeno. Se combinan aproximadamente 100 \mug de ADN con 1 ml de colágeno en una realización preferente utilizando esta formulación. Otras formulaciones de liberación sostenida como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo, que se incluye en el presente documento por referencia. Dichas formulaciones incluyen las suspensiones acuosas, las suspensiones y soluciones oleosas, las emulsiones e implantes así como los depósitos y dispositivos transdérmicos. En algunas realizaciones, se prefieren las formulaciones de liberación gradual para las construcciones genéticas. En algunas realizaciones, se prefiere que la construcción genética sea liberada gradualmente entre 6-144 horas, preferentemente 12-96 horas, más preferentemente 18-72 horas.

En algunas realizaciones de la invención, la construcción genética se inyecta con un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son especialmente útiles para la administración simultánea del material de forma intramuscular, intradérmica y subcutánea.

En algunas realizaciones de la invención, la construcción genética se administra con un PFP mediante un procedimiento de bombardeo con partículas de microproyectiles tal y como enseña Sanford et al. en la Patente estadounidense 4.945.050 editada el 31 de julio de 1990, y que se incluye en el presente documento por referencia.

En algunas realizaciones de la invención, la construcción genética se administra como parte de un complejo de liposomas con un agente potenciador de la función de los polinucleótidos.

En algunas realizaciones de la invención, se somete al individuo a una única vacunación para producir una respuesta inmunitaria completa y amplia. En algunas realizaciones de la invención, se somete al individuo a una serie de vacunaciones para producir una respuesta inmunitaria completa y amplia. De conformidad con algunas realizaciones de la invención, se ponen al menos dos y preferentemente de cuatro a cinco inyecciones a lo largo de un periodo de tiempo. El periodo de tiempo entre las inyecciones puede incluir desde 24 horas de separación a dos semanas o más entre las inyecciones, preferentemente una semana de separación entre ellas. De manera alternativa, se ponen al menos dos y hasta cuatro inyecciones diferentes de forma simultánea en distintos sitios.

En algunas realizaciones de la invención, una vacunación completa incluye la inyección de un único inoculante que contiene una construcción genética incluyendo secuencias que codifican uno o más epítopos objetivo.

En algunas realizaciones de la invención, una vacunación completa incluye la inyección de dos o más inoculantes diferentes en distintos sitios. Por ejemplo, en una vacuna contra el VIH de conformidad con la invención, la vacuna está compuesta por dos inoculantes en la que cada uno consta de material genético que codifica diferentes proteínas virales. Este método de vacunación permite la introducción de tanto como un conjunto completo de genes virales en el individuo sin el riesgo de ensamblar una partícula viral infecciosa. Por lo tanto, se puede invocar una respuesta inmunitaria contra la mayoría de o todos los virus en el individuo vacunado. La inyección de cada inoculante se lleva a cabo en diferentes sitios, preferentemente a una distancia como para garantizar que ninguna célula reciba ambas construcciones genéticas. Como una precaución de seguridad adicional, algunos genes se pueden suprimir o alterar para impedir de forma adicional la capacidad de ensamblaje viral infeccioso. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "kit farmacéutico" pretende hacer referencia de forma colectiva a múltiples inoculantes utilizados en la presente invención. Dichos kits incluyen contenedores separados que contienen diferentes inoculantes y/o agentes estimulantes celulares. Se pretende que estos kits se proporcionen para incluir un conjunto de inoculantes utilizados en un método inmunizador.

Los métodos de la presente invención son útiles en los campos de la medicina tanto humana como veterinaria. Por consiguiente, la presente invención hace referencia a la inmunización genética de mamíferos, aves y peces. Los métodos de la presente invención pueden ser especialmente útiles para las especies de mamíferos incluyendo las especies humana, bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina:

Los Ejemplos que se exponen a continuación incluyen ejemplos representativos de aspectos de la presente invención. No se pretende que los Ejemplos limiten el alcance de la invención sino más bien que sirvan a efectos de ilustración.

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Ejemplos

Ejemplo 1

La presente invención proporciona una vacuna contra el VIH que utiliza la inmunización genética directa. Se proporcionan las construcciones genéticas que, cuando se administran a las células de un individuo, se expresan para producir proteínas del VIH. De conformidad con algunas realizaciones, la producción de todas las proteínas estructurales virales en las células del individuo provoca una respuesta inmunitaria protectora que protege contra la infección con el VIH. La vacuna contra el VIH de la presente invención se puede utilizar para inmunizar a individuos no infectados de la infección con el VIH o servir como una inmunoterapia para aquellos individuos que ya están infectados. La vacuna contra el VIH de la presente invención invoca una respuesta inmunitaria incluyendo LTCs que reconocen y atacan las células infectadas con el VIH y reconocen el contingente más amplio de la proteína del VIH. Por lo tanto, se protege a los individuos no infectados de la infección con el VIH.

En algunas realizaciones, la presente invención hace referencia a un método para inmunizar a un individuo contra el VIH administrando dos inoculantes. Estos dos inoculantes están compuestos de al menos dos y preferentemente más de dos, una pluralidad o todos los genes del virus del VIH. Sin embargo, los inoculantes no se administran juntos. Por consiguiente, a una célula inoculada no se le administrará un complemento completo de genes. El individuo vacunado recibirá al menos dos genes virales diferentes y preferentemente más de dos, más preferentemente una pluralidad de o todos los genes virales. Las respuestas inmunitarias se pueden dirigir entonces al complemento total de la proteína objetivo del VIH.

Esta estrategia incrementa la probabilidad de que el material genético que codifica la proteína objetivo más efectiva se incluya en la vacuna y reduce la probabilidad de que una partícula viral escape a la detección por parte de la respuesta inmunitaria a pesar de los cambios estructurales en una o más proteínas virales que se producen cuando el virus sufre una mutación. Por lo tanto, es aconsejable vacunar a un individuo con múltiples y preferentemente con un complemento completo o casi completo de genes que codifican proteínas virales.

Si se provee a una única célula con un complemento completo de genes virales, es posible que un virus infeccioso completo se pueda ensamblar dentro de la célula. Por consiguiente, una construcción genética de conformidad con la presente invención no se provee con dicho complemento completo de genes. Además, dos o más inoculantes, teniendo cada uno de ellos un conjunto incompleto de genes y combinados teniendo hasta un complemento completo de genes virales, se administran a diferentes células, preferentemente en un sitio distante uno del otro para garantizar que ninguna célula vacunada sea expuesta sin querer a un conjunto completo de genes. Por ejemplo, se puede insertar una parte del genoma del VIH en una primera construcción y se inserta la parte restante del genoma del VIH en una segunda construcción. La primera construcción se administra a un individuo como una vacuna genética en el tejido muscular de un brazo mientras que la segunda construcción se administra a un individuo como una vacuna genética en el tejido muscular del otro brazo del individuo. Se puede exponer al individuo a un conjunto completo de genes virales; vacunando de este modo en lo esencial contra todo el virus pero sin riesgo alguno de que se ensamble una partícula viral infecciosa.

Como una precaución de seguridad adicional, incluso cuando se administre material genético por parte de dos o más inoculantes en partes distantes del cuerpo del individuo, uno o más genes esenciales se pueden suprimir o alterar de forma intencionada para garantizar adicionalmente que no se pueda formar una partícula viral infecciosa. En dichas realizaciones, al individuo no se le administra un conjunto funcional completo de los genes virales.

Una precaución de seguridad adicional proporciona partes no superpuestas del genoma viral en las construcciones genéticas separadas que componen los inoculantes separados respectivamente. Por lo tanto, se impide la recombinación entre las dos construcciones genéticas.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un complemento completo de genes estructurales. Los genes estructurales del VIH constan de gag, pol y env. Estos tres genes se proporcionan en dos construcciones de ADN o ARN diferentes. Por lo tanto, en una realización preferente, gag y pol están en una construcción de ADN o ARN y env está en otra. En otra realización preferente, gag está en una construcción de ADN o ARN y pol y env están en la otra. En otra realización preferente, gag y env están en una construcción de ADN o ARN y pol está en la otra. En algunas realizaciones preferentes, las construcciones que contienen revtienen un aceptor de empalme en la parte superior del codón de comienzo para rev. En algunas realizaciones preferentes, las construcciones que contienen gag tienen un donante de empalme en la parte superior del codón de comienzo de la traducción de gag. Opcionalmente, en cualquiera de estas combinaciones, los genes reguladores del VIH también pueden estar presentes. Los genes reguladores del VIH son: vpr, vif, vpu, nef, tat y rev.

La construcción de ADN en una realización preferente está compuesta de un promotor, un potenciador y una señal de poliadenilación. El promotor se puede seleccionar de entre el grupo que consta de: RTL del VIH, Actina humana, Miosina humana, CMV, VSR, Moloney, VTMM, Hemoglobina humana, creatina muscular humana y VEB. El potenciador se puede seleccionar de entre el grupo que consta de: Actina humana, Miosina humana, CMV, VSR, Hemoglobina humana, creatina muscular humana y VEB. La señal de poliadenilación se puede seleccionar de entre el grupo que consta de: señal de poliadenilación de RTL y señal de poliadenilación de SV40, especialmente la señal de poliadenilación menor de SV40 entre otras.

En algunas realizaciones, la vacuna de dos inoculantes se administra de forma intramuscular en tejidos espacialmente apartados del individuo, preferentemente en diferentes extremidades, como por ejemplo en el brazo derecho y el izquierdo. Cada inoculante de la presente invención puede contener desde aproximadamente 1 a alrededor de 1000 microgramos de ADN. Preferentemente, cada inoculante contiene alrededor de 1 a alrededor de 500 microgramos de ADN. Más preferentemente, cada inoculante contiene alrededor de 25 a alrededor de 250 microgramos de ADN. Más preferentemente, cada inoculante contiene alrededor de 100 microgramos de ADN.

El inoculante en algunas realizaciones está en un portador isotónico estéril, preferentemente una solución salina o solución salina tamponada con fosfato.

En algunas realizaciones, antes de la administración de la vacuna, al tejido a ser vacunado se le inyecta un agente de proliferación celular, preferentemente la bupivacaína. Las inyecciones de bupivacaína se pueden poner hasta alrededor de 24 horas antes de la vacunación. Se prevé que la inyección de bupivacaína se produzca inmediatamente antes de la vacunación. Se administra alrededor de 50 \mul a alrededor de 2 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en NaCl isotónico en el sitio donde se va a administrar la vacuna, preferentemente, de 50 \mul a alrededor de 1500 \mul, más preferentemente alrededor de 1 ml.

En otras realizaciones, un agente de proliferación celular, preferentemente la bupivacaína, se incluye en la formulación junto con la construcción genética. Se administra alrededor de 50 \mul a alrededor de 2 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en NaCl isotónico en el sitio donde se va a administrar la vacuna, preferentemente, de 50 \mul a alrededor de 1500 \mul, más preferentemente alrededor de 1 ml.

En consecuencia, algunas realizaciones están compuestas de una vacuna de dos inoculantes: un inoculante constando de una construcción de ADN o ARN que tiene dos genes estructurales del VIH, el otro inoculante constando de una construcción de ADN o ARN que tiene el tercer gen estructural restante del VIH de manera que los inoculantes combinados contengan un complemento completo de genes estructurales del VIH. Los genes estructurales en cada construcción de ADN están unidos de forma operativa a un promotor, un potenciador y una señal de poliadenilación. Los mismos o diferentes elementos reguladores pueden controlar la expresión de los genes virales. Cuando se vacuna a un individuo, los dos inoculantes se administran de forma intramuscular en diferentes sitios, preferentemente en diferentes brazos. En algunas realizaciones de la invención, se administra primero la bupivacaína en el sitio donde se va a administrar el inoculante. En algunas realizaciones de la invención, se incluye la bupivacaína en las formulaciones junto con las construcciones genéticas.

En algunas realizaciones, el procedimiento de vacunación se repite al menos una vez y preferentemente dos o tres veces. Cada procedimiento de vacunación se lleva a cabo con una separación de desde 24 horas a dos meses.

En algunas realizaciones, la vacuna se administra utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. En algunas realizaciones, la vacuna se administra de forma hipodérmica utilizando un dispositivo de inyección sin aguja proporcionando de ese modo una administración intramuscular, intradérmica, subcutánea de forma simultánea a la vez que también se administra el material de forma intersticial.

Entre las construcciones genéticas preferentes se incluyen las siguientes. Plásmidos y Estrategias de Clonación:

Se construyeron dos plásmidos: uno que contiene el gag/pol del VIH y el otro que contiene el env del VIH.

El clon genómico del VIH-1 pNL43 se obtuvo a través del Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del SIDA (AIDS Research and Reference Reagent Program) (ARRRP) del NIH (Institutos nacionales de la salud), División del SIDA, NIAID (Instituto nacional de alergias y enfermedades infecciosas), NIH, del Dr. Malcolm Martin, y se puede utilizar como el material de comienzo para los genes virales del VIH-1 para las construcciones genéticas. De manera alternativa, cualquier clon molecular del VIH de la célula infectada puede ser modificado suficientemente, a través del uso de la tecnología de cadena de polimerasa, para la construcción incluyendo el clon HXB2, el clon MN así como el clon SF ó BAL-1. El clon pNL43 es una construcción que consta de un ADN proviral del VIH-1 más 3 kb de la secuencia huésped del sitio de integración clonado en pUC18.

Construcción del plásmido pNL-puro-env:

Este plásmido fue construido para la expresión de gag pol. El sitio StuI dentro del ADN humano que lo flanquea de 5' que no es del VIH de pNL43 fue destruido mediante la digestión parcial con StuI seguida de una digestión de los extremos libres con polimerasa 1 E. coli. El plásmido lineal se rellenó y después se auto-ligó, dejando un único sitio StuI dentro del genoma del VIH. Este plásmido, pNLDstu, fue después digerido con las enzimas de desgaste StuI y BsaBI que eliminaron una sección grande de la secuencia de codificación para pg120. El promotor de SV40 y la región de codificación de resistencia a la puromicina (puromicina acetil transferasa (PAC)) fueron aislados de pBABE-puro (Morgenstern y Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18(12):3587-3596, que se incluye en el presente documento por referencia, proporcionado amablemente por el Dr. Hartmut Land de la Fundación Imperial para la Investigación del Cáncer) utilizando EcoRI y ClaI. Este fragmento fue desgastado, después clonado en el pNLDstu digerido en StuI/BsaBI. Se seleccionó un clon con el fragmento de SV40-puro en la orientación correcta de manera que la RTL de 3' del VIH pudiera proporcionar funciones poli A para el mensaje de PAC. Este plásmido fue denominado pNLpuro.

Estrategia de clonación para la supresión del gen regulador vpr del vector de gag pol del VIH:

Se amplificó una región de justo la parte superior del único sitio Pf1MI hasta justo después del codón de terminación vif a través de la RCP utilizando cebos que introdujeron un cambio de aminoácidos no conservador (glu\rightarrowval) en el aminoácido 22 de vpr, un codón de parada en el marco de lectura de vpr inmediatamente después del aminoácido 22, y un sitio de EcoRI siguiendo de forma inmediata al nuevo codón de parada. Este fragmento de RCP sustituyó al fragmento de Pf1MI-EcoRI de pNLpuro ó pNL43. Esta sustitución dio por resultado la supresión de 122 nucleótidos del marco de lectura abierto de vpr, eliminando así la posibilidad de reversión que conlleva la estrategia de mutación de punto. Los plásmidos resultantes, pNLpuro\Deltavpr, codifican los primeros 21 aminoácidos naturales de vpr más una valina más todos los demás genes del VIH-1 restantes y las uniones de empalme en su forma nativa. Dicha estrategia de supresión también sería aplicable a nef, vif, y vpu y harían posible la expresión génica estructural pero protegerían de la generación de un virus recombinante vivo. La construcción plasmídica para la expresión envolvente:

El segmento de ADN que codifica el gen envolvente HXB2 del VIH-1 se clonó mediante la técnica de amplificación por reacción en cadena de polimerasa (RCP) utilizando el ADN clonado lambda obtenido del Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del SIDA. Las secuencias de los cebos de 3' y 5' son 5'-AGGCGTCTC
GAGACAGAGGAGAGCAAGAAATG-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 1) con la incorporación del sitio de XhoI y 5'-TTTCCCTCTAGATAAGCCATCCAATCACAC-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 2) con la incorporación del sitio de XbaI, respectivamente, que engloban la región de codificación de rev, tat y pg160. Se llevó a cabo una amplificación específica de los genes utilizando polimerasa del ADN Taq de conformidad con las instrucciones del fabricante (Perkin-Elmer Cetus Corp.). Los productos de la reacción de RCP se trataron con 0,5 \mug/ml de proteinasa K a 37ºC durante treinta minutos seguido de una extracción de fenol/cloroformo y una precipitación de etanol. El ADN recuperado se digirió entonces con XhoI y XbaI durante dos horas a 37ºC y fue sometido a electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de RCP de XhoI-XbaI aislado y purificado fue clonado en plásmido Bluescript (Strategene Inc., La Jolla, California) y después subclonado en el vector de expresión eucariótico pMAMneoBlue (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California). La construcción resultante fue designada como pM160 (Figura 1A). El ADN plasmídico fue purificado con ultracentrifugación gradual de CsCl. La construcción de ADN pM160 codifica la glicoproteína unida a la membrana de pg160 del HXB2/VIH-1 (Fisher, A.G., et al., (1985) Nature 316:262-265) bajo el control de un elemento potenciador del VSR con RTL del VTMM como un promotor.

Una construcción plasmídica de expresión envolvente alternativa llamada plásmido env-rev del VIH-1:

La región que codifica los dos exones de rev y el vpu y que envuelve los marcos de lectura abiertos del HXB2 del VIH-1 fue amplificada a través de RCP y clonada en el vector de expresión pCNDA/neo (Invitrogen). Este plásmido conduce la producción envolvente a través del promotor de CMV.

Producción y purificación:

El plásmido en E. coli (DH5 alfa) se madura de la manera que sigue: Una placa de agar de ampicilina positiva LB se ve surcada del cultivo plasmídico deseado procedente de las existencias congeladas. La placa se incuba durante la noche (14-15 horas) a 37ºC. Se toma una única colonia de la placa y se inocula en 15 ml de medio LB con un preparado de peptona y 50 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se madura a 37ºC mientras se agita (ca. 175 rpm) durante 8-10 horas. Las lecturas de OD_{600} deberían ser de al menos 1,0. 1 litro de medio LB con peptona y 50 \mug/ml de ampicilina se inoculan con 1,0 OD de cultivo. Estos cultivos de 1-2 litros se maduran durante la noche a 37ºC mientras se agitan (175 rpm).

El plásmido madurado en E. coli (cepa DH5 alfa) se recoge y purifica mediante los siguientes métodos. Se pueden encontrar procedimientos generales para la Tisis de células y la purificación del plásmido en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Edición, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. Las células se concentran y lavan con tampón de pH 8,0 de glucosa-tris-AEDT. Se efectúa el proceso de tisis de las células concentradas mediante tratamiento con lisozimas y se tratan brevemente con 0,2 N de KOH, el pH se ajusta después a 5,5 con tampón de ácido acético/acetato de potasio. El material insoluble se extrae mediante centrifugación. Se añade al sobrenadante 2-propanol para precipitar el plásmido. El plásmido se redisuelve en un tampón de tris-AEDT y se purifica adicionalmente mediante extracción de fenol/cloroformo y una precipitación adicional con 2-propa-
nol.

La endotoxina se puede extraer de forma opcional mediante una variedad de métodos incluyendo los siguientes: adsorción específica por materiales inmovilizados tales como por ejemplo la polimixina (Tani et al., Biomater. Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 20(2-4) : 457-62 (1992); Issekutz, J. Immunol. Methods 61(3) : 275-81 (1983)); anticuerpos monoclonales de anti-endotoxina, tales como por ejemplo 8A1 y HA-1A^{TM} (Centocor, Malvern, PA; Bogard et al. J. Immunol. 150(10):4438-4449 (1993); Rietschel et al., Infect. Immunity página 3863 (1993)); filtros de profundidad cargados positivamente (Hou et al., J. Parenter. Sci. Technol. 44(4) : 204-9 (julio-agosto de 1990)); poli(gamma-metil L-glutamato), Hirayama et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokio) 40(8):2106-9 (1992)); histidina (Matsumae et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 12(2):129-40 (1990)); membranas y columnas de interacción hidrofóbica (Aida et al., J. Immunol. Methods 132 (2) : 191-5 (1990); Umeda et al., Biomater. Artif. Cells Artif. Organs 18(4):491-7 (1990); Hou et al., Biochem. Biophys. Acta 1073(1):149-54 (1991); Sawada et al., J. Hyg. (Londres) 97(1):103-14 (1986)); resinas hidrofóbicas específicas útiles para extraer la endotoxina incluyendo las resinas de divinilbenceno o poliestireno/divinilbenceno hidrofóbicas tales como por ejemplo la resina poliporo Brownlee (Applied Biosystems, Palo Alto, California); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, Miami); HP20, CHP20P (Mitsubishi Kasei, EE.UU.); PRP-infinito, PRP-1 de Hamilton (Hamilton, Reno, Nevada); DVB de fase invertida de Jordi, DVB de gel de Jordi, PLgeI^{TM} de Polymer Labs (Alltech, Deerfield, Illinois); PLX^{TM} de Vydac (Separations Group, Hesperia, California); entre otros materiales y métodos para extraer la endotoxina se incluyen el gel de extracción de la endotoxina Detoxi-GeI^{TM} (Pierce Chemical, Rockford, Illinois); Nota de solicitud 206, (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, Nueva Jersey). Véase también en general, Sharma, Biotech. App. Biochem. 8:5-22 (1986). Los anticuerpos monoclonales de anti-endotoxina preferentes se unen a los campos conservados de endotoxina, preferentemente anticuerpos contra el lípido A, la parte más conservada estructuralmente de la molécula de la endotoxina. Tales anticuerpos monoclonales anti-lípido A incluyen el anticuerpo monoclonal IgG murino de gran afinidad 8A1 y el anticuerpo monoclonal IgM(k) A anti-lípido humano HA-1A^{TM}. El HA-1A^{TM} se derivó de una vacuna J5 de E. coli B humana. HA-1A^{TM}. Se ha informado de que el HA-1A^{TM} es enormemente reactivo de forma cruzada con una variedad de endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos).

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Ejemplo 2

En experimentos diseñados para comparar la respuesta inmunogénica provocada por la vacunación genética y la vacunación proteínica, se diseñaron modelos animales utilizando células tumorales que expresan específicamente una proteína objetivo extraña. Se han desarrollado tres modelos de ratón inmunes competentes que expresan antígenos extraños. Se utilizan tres líneas celulares tumorales clonales que provienen de la cepa del ratón Balb/c. Las líneas celulares son: 1) una línea celular linfoide que no produce metástasis de forma significativa en otros tejidos pero que forma grandes tumores palpables que aparecen para matar al animal en el plazo de un periodo de 8-12 semanas; 2) una línea celular de melanoma murino con algo de capacidad para producir metástasis, principalmente en el pulmón, y que después de la inoculación con 1 millón de células, da por resultado el desarrollo en los ratones de grandes tumores palpables que matan de modo similar al animal en el plazo de 10-12 semanas; y 3) una línea celular de adenocarcinoma de pulmón murino que produce metástasis en múltiples tejidos y mata al animal en el plazo de 12 o más semanas. Se han seleccionado subclones que pueden mostrar antígenos extraños en una forma no identificada. Cuando se implantan los tumores transfectados en una cepa precursora de ratón, a diferencia de la mayoría de las líneas de tumores murinos similares, los animales no realizan una respuesta inmunitaria protectora ante los antígenos extraños mostrados y los tumores se aceptan. Estos tumores entonces matan al animal con el mismo fenotipo en el mismo lapso de tiempo que el tumor no transfectado original. Utilizando estos modelos, se puede medir la respuesta inmunitaria provocada por la vacunación genética contra un antígeno.

Se observó que los ratones vacunados con una vacuna genética que estaba compuesta por una construcción genética que daba por resultado la producción de la proteína objetivo por parte de las células del ratón provocaban una respuesta inmunitaria incluyendo un citotóxico fuerte que eliminaba por completo los tumores que mostraban la proteína objetivo pero sin efecto alguno sobre los tumores que no la mostraban. En los ratones inoculados con la propia proteína objetivo, la respuesta inmunitaria provocada de ese modo era mucho menos efectiva. Los tumores se redujeron en tamaño pero, debido a la ausencia de una respuesta citotóxica, no fueron eliminados. Como controles, los tumores no transfectados se utilizaron en experimentos que comparaban la respuesta inmunitaria de los animales vacunados con la vacuna genética, la vacuna subunidad y los animales no vacunados. Estos experimentos demuestran claramente que la vacuna genética produjo una respuesta inmunitaria más amplia y más efectiva que fue capaz, en virtud de los LTC, de eliminar por completo los tumores. Por contraste, la inmunización utilizando proteína objetivo intacta produjo una respuesta inmunitaria menos efectiva y más limitada.

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Ejemplo 3

En otra realización de la invención, se ha diseñado una vacuna genética contra el VIH. La proteína viral pg160, que se transforma en pg120 y pg 41, es la proteína objetivo contra la que se produce una vacuna genética. La vacuna genética contiene una construcción de ADN que está compuesta de una secuencia de ADN que codifica elementos reguladores unidos de forma operativa de pg160. Cuando se administra a un individuo, la construcción de ADN de la vacuna genética se incorpora a las células del individuo y se produce pg160. La respuesta inmunitaria que se provoca por parte de la proteína tiene una base amplia e incluye la respuesta inmunitaria celular humoral y ambos brazos de ella. La amplia respuesta biológica proporciona una protección superior a la que se consigue cuando se administra la proteína misma.

Se inyectó a los ratones de forma intramuscular con pM160, descrito en el Ejemplo 1, y posteriormente se analizaron en busca de respuestas inmunitarias anti-VIH. Los antisueros de los animales inmunizados de esta manera producen respuestas inmunitarias de glicoproteína envolvente anti-VIH tal y como lo ha medido el ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) y los ensayos de inmunoprecipitación. Los antisueros neutralizan la infección con el VIH-1 e inhiben la formación de sincitio inducida por el VIH-1.

La actividad anti-sincitial y de neutralización observadas pueden ser el resultado de la reactividad de los anticuerpos provocados contra regiones funcionalmente importantes de la proteína envolvente del VIH-1, tales como por ejemplo el bucle V3 de pg120, el sitio de unión CD4 y la región "inmunodominante" N-terminal de pg 41, entre otras.

En el procedimiento de inmunización genética descrito en el presente documento, se inyectó en los músculos de los cuádriceps de los ratones BALB/c 100 \mul de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en NaCl isotópico utilizando una aguja de calibre 27 para estimular la regeneración celular del músculo y facilitar la captación de la construcción genética. Veinticuatro horas más tarde, se inyectaron entonces los mismo sitios de la inyección con o bien 100 \mug de pM160 o con 100 \mug de pMAMneoBlue como un plásmido de control (Figura I A). Se dieron dosis de refuerzo a los ratones inyectándoles la misma cantidad de construcción de ADN tres veces en intervalos de dos semanas de la misma manera pero sin un pre-tratamiento con bupivacaína-HCl.

Para la inmunización de pg160 recombinante, se inmunizó inicialmente a los ratones BALB/C con 1 \mug de pg160 recombinante glicosilado (VIH-I/III_{B}) (MicroGeneSys Inc.) en adyuvante completo de Freund seguido por tres dosis de refuerzo de 1 \mug de pg160 cada una en adyuvante incompleto de Freund en intervalos de dos semanas. La producción de anticuerpos contra el pg160 del VIH-1 se determinó sometiendo a ensayo los sueros del ratón para ver su capacidad para inmunoprecipitar pg160. La inmunoprecipitación se llevó a cabo utilizando 1 x 10^{6} cpm de rpg160 marcado ^{125}I, sueros de ratón y perlas de agarosa de proteína-G (GIBCO, Inc.) tal y como lo ha descrito anteriormente Osther, K., et al., (1991) Hybridoma 10:673-683, que se incluye en el presente documento por referencia. Las precipitaciones específicas se analizaron mediante SDS-PAGE al 10%. El carril 1 es 1 \mul de suero de ratón preinmune que ha reaccionado con el ^{125}I-pg160. El carril 2 es 1 \mul de suero de ratón inmunizado de lo ratones inmunizados con pM160. El carril 3 es 1 \mul de una dilución 1:100 de anticuerpo anti-pg120 monoclonal ID6 (Ugen, K.E., et al., (1992) Generation of Monoclonal Antibodies Against the Amino Region of gp120 Which Elicits Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity, Laboratorio de Cold Spring Harbor) como un control positivo. La flecha indica la glicoproteína envolvente de ^{125}I-pg160 inmunoprecipitada de forma específica.

El pg160 marcado ^{125}I se inmunoprecipitó de forma específica con antisueros procedentes de los animales inmunizados con pM160 (Figura 2, carril 2) así como el anticuerpo monoclonal anti-pg120 de control positivo, ID6 (Figura 2, carril 3). Por contraste, los sueros preinmunes (Figura 2, carril 1) únicamente mostraron una mínima actividad en el mismo ensayo.

Ocho de los diez ratones inmunizados con la construcción pM160 dieron positivo para la reactividad contra pg160 tal y como fue determinado por ELISA y se analizaron en detalle las respuestas inmunitarias del animal con el título anti-pg160 más elevado. Cuatro ratones inmunizados con el vector de control mostraron una reactividad negativa similar ante el pg160 en ELISA y uno de estos sueros se usó como el control para experimentos posteriores.

Se ha mostrado que los anticuerpos neutralizadores del VIH están dirigidos específicamente a diversos epítopos en pg120 y pg41, que incluyen el bucle V3 en pg120 (Goudsmit, J. et al., (1988) AIDS 2:157-164; y Putney, S.D., et al., (1989) Development Of An HIV Subunit Vaccine, Montreal), el sitio de unión CD4 cerca del extremo carboxilo de pg120 (Lasky, L.A., et al., (1987) Cell 50:975-985) así como el bucle inmunodominante de pg41 justo en la parte inferior de la región de fusión N-terminal (Schrier, R.D., et al., (1988) J. Virol. 62:2531-2536).

Para determinar si los anticuerpos anti-pg160 provocados en estos ratones son reactivos ante estas importantes regiones de las glicoproteínas envolventes, los péptidos para el bucle BRUN3, los péptidos para el bucle MN/V3, los péptidos para el extremo HXB2/pg41 N-terminal o los péptidos para el sitio de unión HXB2/CD4 fueron absorbidos a placas de microtítulo y se determinaron reactividades específicas de los antisueros de ratón en ensayos ELISA. Un \mug/ml de pg160 ó 10 \mug/ml de cada péptido se resvistieron de placas de microtítulo en 0,1M de tampón de bicarbonato (pH 9,5) durante la noche a 4ºC, bloquearon con 2% de albúmina de suero bovino en SSTF, y reaccionaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con HRPO (Fisher) durante una hora a 37ºC y se desarrollaron con substrato de TMB (Sigma) durante 10-30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se informa de los resultados en la Figura 3. Los antisueros fueron como sigue: (-+-) es sueros preinmunes, (-x-) es los sueros inmunizados con el vector pMAMneoBlue, (-O-) es los sueros inmunizados con pM160, (-\Delta-) es de ratones inmunizados con la proteína rpg160. La Figura 3A muestra los resultados utilizando una placa revestida con proteína rpg160. La Figura 3B muestra los resultados utilizando una placa revestida con péptidos de bucle BRUN3 (CNTRKRIRIQRGP
GRAFVTIGK (ID DE SECUENCIA Nº: 11)). La Figura 3C muestra los resultados utilizando una placa revestida con péptidos de bucle MNN (YNKRKRIHIQRGPGRAFYTTKNIIC (ID DE SECUENCIA Nº: 12)) con la secuencia QR del VIH-1/III_{B} en negrita. La Figura 3D muestra los resultados utilizando una placa revestida con péptidos del sitio de unión HXB2/CD4 (CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGIRC (ID DE SECUENCIA Nº: 13)). La Figura 3E muestra los resultados utilizando una placa revestida con péptidos de la región inmunodominante BRU/pg41 (RILAVERYIKDQQLLGIWGCSGKLIC (ID DE SECUENCIA Nº:14)).

La Figura 3 muestra que el antisuero del ratón inmunizado con la construcción pM160 tiene una reactividad significativamente más elevada ante los péptidos de bucle MNN3 y BRU, el péptido del sitio de unión CD4 y el péptido pg41 inmunodominante que el suero inmunizado (rpg160) de la proteína pg160 recombinante. El antisuero del ratón inmunizado con rpg160 tenía un título mucho más elevado contra el rpg160 que el antisuero inmunizado con pM160, pero una actividad menor contra los tres epítopos de neutralización específicos de pg160 sometidos a ensayo.

Para determinar si los antisueros generados mediante la inmunización de ADN poseían actividad antiviral, se examinó la capacidad de los antisueros para neutralizar la infección con el VIH-1. Se incubó el virus del VIH-1/III_{B} libre de células a 100 DICT_{50} con diluciones en serie de los antisueros antes de utilizarlo para infectar las células objetivo MT-2 (Montefiori, D.C., (1988) J. Clin. Microbio. 26:231-235).

El virus libre de células del VIH-1/III_{8} de cien DICT_{50} fue preincubado con diluciones en serie de antisueros durante una hora a 37ºC. Siguiendo la incubación se puso al virus pretratado en placas en la línea de células objetivo 4x10^{4}, MT-2 durante una hora a 37ºC, tras la infección las células MT-2 se lavaron tres veces y después se incubaron a 37ºC al 5% de CO_{2}. Se evaluó la fusión tres días más tarde de forma cuantitativa contando visualmente el número de sincitios por pocillo en experimentos hechos por triplicado bajo un microscopio de contraste de fase.

Se informa de los resultados en la Figura 4. La Figura 4A muestra los resultados utilizando sueros de ratón inmunizado con vector en comparación con la Figura 4B que muestra los resultado utilizando sueros inmunizados con pM160. Los valores de neutralización (V_{n}/V_{o}) frente a los factores de dilución (Nara, P., (1989) Techniques In HIV Research, editores Aldovini, A. y Walkter, B.D., 77-86 M Stockton Press) se ilustran en la Figura 4C. El suero de control (-x) era de los ratones inmunizados con vector pMAMneoBlue. Los sueros de ensayo (O) eran de ratones inmunizados con pM160.

Se llevó a cabo la inhibición sincitial tal y como lo describe Osther, K., et al., (1991) Hybridoma 10:673-683. Se preincubó la línea celular H9/III_{B} con diluciones en serie (1:100, 1:200, y 1:400) de antisueros y se realizó en placas de 96 pocillos en un volumen total de 50 \mul durante treinta minutos a 37ºC al 5% de CO_{2}. Se evaluó la fusión tres días después de forma cuantitativa contando visualmente el número de sincitios por pocillo bajo un microscopio de construcción de fase. La Figura 4D es las células objetivo cultivadas conjuntamente con la línea celular del VIH-1/III_{B} tratada con suero preinmune. La Figura 4E es la misma que la Figura 4D pero tratada con el suero inmunizado de control de vector. La Figura 4F es la misma que la Figura 4D pero tratada con suero inmunizado con rpg160. La Figura 4G es la misma que la Figura 4D pero tratada con suero inmunizado con pM160. Las Figuras 4D ala 4G muestran que la inhibición de sincitios era evidente en una dilución de 1:200 en estos ensayos. Se infectaron las células MT-2 con VIH-1/III_{B} libre de células que había sido preincubado con sincitios formados fácilmente de antisuero inmunizado con vector (Figura 4A). En comparación con ello, la preincubación con suero de ratón inmunizado con pM160 impidió la formación sincitial (Figura 4B). La cinética de neutralización se determinó mediante V_{n}/V_{o} frente a diluciones en serie de antisueros (Nara, P., (1989) Techniques In HIV Research, editores Aldovini, A. y Walker, B.D., 77-86, M Stockton Press) (Figura 4C). El suero procedente del ratón inmunizado con pM160 tenía una actividad neutralizadora activa biológicamente en diluciones de hasta 1:320 mientras que los antisueros de control no mostraban una actividad similar.

Para determinar si el antisuero procedente del ratón inmunizado con pM160 podría inhibir la propagación del virus mediado envolvente a través de la fusión directa de célula a célula, se llevaron a cabo ensayos de inhibición sincitial. El antisuero del ratón inmunizado con pM160 inhibe la formación sincitial inducida por el VIH-1 en diluciones de 1:200 (Figura 4G). Por contraste, los sueros preinmunes (Figura 4D), los antisueros de los ratones inmunizados con rpg160 (Figura 4F) y los antisueros de los animales inmunizados con vector de control (Figura 4E) no pudieron inhibir la formación sincitial en las mismas diluciones.

Las observaciones de los ensayos de neutralización (Figuras 4A-C) y de inhibición sincitial (Figuras D-G) de estos sueros guarda correlación con las reactividades de ELISA observadas (Figura 3). El antisuero del ratón inmunizado con pM160 que mostró un elevado nivel de unión a epítopos neutralizadores asimismo demostró un elevado nivel de actividades antivirales; a la inversa, los sueros con poca unión a estos epítopos incluyendo el antisuero de los ratones inmunizados con rpg160 tienen poca actividad antiviral.

Para probar si los antisueros de ratones inmunizados con pM160 pueden inhibir la unión de pg120 a las células-T que lleven CD4, se empleó un ensayo de inhibición directa controlado mediante flurocitometría (Chen, Y.H., et al., (1992) AIDS 6:533-539). Se observó que el suero del ratón inmunizado con la construcción pM160 era capaz de bloquear la unión de pg120 a las células-T que llevan CD4: una dilución de 1:15 de suero inmunitario inhibió que FITC-pg120 se uniera a células CD4*SupT1 en un 22% \pm 2% de los experimentos hechos por duplicado tal y como fue evaluado mediante citometría de flujo. Esto indica que esta región de entrada del VIH en las células objetivo también se puede inhibir de forma funcional mediante este antisuero. Estos datos concuerdan con la reactividad de ELISA observada en el antisuero ante los péptidos del sitio de unión CD4 (Figura 3C).

Se llevaron a cabo estudios de isotipificación de inmunoglobulina utilizando un kit de isotipificación de anticuerpos monoclonales murinos comercial (Sigma). De los anticuerpos específicos anti-pg160 provocados por la inmunización con pM160, el 19% son IgG1, el 51% son IgG2, el 16% son IgG3, el 10% son IgM y el 5% son IgA. El predominio de isotipos IgG indica que se ha producido una respuesta inmunitaria secundaria, y sugiere además que se pueden provocar células-T ayudantes mediante la inmunización genética.

Los ADN de pM160 y pMAMneoBlue se revistieron en placas de microtítulo y se determinó una unión específica mediante ELISA utilizando sueros de todos los animales inmunizados. No se observó ninguna unión significativa al ADN plasmídico. Por lo tanto, el utilizar material genético para la inoculación en el tejido muscular parece improbable que produzca una respuesta de ADN anti-plasmídica.

La introducción de ADN de la construcción en el músculo del ratón mediante una inyección con aguja puede causar resultados contradictorios, ya que esta técnica no proporciona un medio para controlar la captación de ADN por parte de las células musculares. Se comparó la inyección de ADN de la construcción solamente (n\approx4) con animales pretratados con bupivacaína (n\approx4). Las respuestas inmunitarias observadas en los dos grupos fueron diferentes, con un 25% y un 75% de los animales reaccionando en los ensayos de ELISA respectivamente. Se puede conseguir una eficiencia mayor utilizando un sistema de administración directa de ADN tal como por ejemplo el bombardeo con partículas (Klein, T.M. et al., (1992) Bio/technology 10:286-291).

La evidencia de la neutralización, la inhibición sincitial, la inhibición de la unión CD4-pg120, y la unión específica con diversas regiones importantes en el pg160 demuestran que la introducción de una construcción de ADN que codifica la glicoproteína unida con la membrana de pg160 del VIH directamente en las células musculares de animales vivos puede provocar respuestas humorales específicas, y generar anticuerpos antivirales relevantes biológicamente.

Para probar si la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmunitaria protectora, se utilizó el modelo de animal descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codificaba p160, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluyeron líneas tumorales no transfectadas.

Se vacunó a los animales inmunizados genéticamente con plásmido pm160. Los controles incluyeron animales no vacunados, animales vacunados únicamente con ADN de vector y animales a los que se había administrado la proteína pg160.

Los resultados demuestran que la respuesta inmunitaria de los ratones vacunados genéticamente era suficiente como para eliminar por completo los tumores transfectados a la vez que no tenían efecto alguno sobre los tumores no traducidos. La vacunación con la proteína pg160 llevó a cierta reducción del tamaño del tumor en los tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tuvo ningún efecto en la mortalidad. Los animales no vacunados mostraron una mortalidad similar tanto para los tumores transfectados como para los no transfecta-
dos.

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Ejemplo 4

Lo siguiente es un listado de construcciones que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. El vector pBabe.puro, que se utiliza como un material de inicio para producir muchas de las construcciones que se enumeran a continuación, fue construido originalmente por y se informó de ello por parte de Morgenstern, J.P. y H. Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18(12) : 3587-3596. El plásmido pBabe.puro es especialmente útil para la expresión de genes exógenos en células de mamíferos. Las secuencias de ADN que se van a expresar se insertan en sitios de clonación bajo el control del promotor de repetición terminal larga (RTL) del virus de la leucemia murina de Moloney (VLMu Mo). El plásmido contiene el marcador seleccionable para la resistencia a la puromicina.

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Ejemplo 5

El plásmido pBa.V\alpha3 es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento genómico EcoRI de 2,7 kb que codifica la región Va3 del receptor de células T que contiene los segmentos L, V y J clonados en el sitio EcoRI de pBabe.puro. La proteína objetivo derivada del receptor de células T es útil en la inmunización contra y el tratamiento de las enfermedades autoinmunes mediadas por células T y la leucemia y el linfoma de células T clonotípicos.

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Ejemplo 6

El plásmido pBa.gagpol-vpr es un plásmido de 9,88 kb que contiene los genes gag/pol y vif del VIH/MN clonados en pBabe.puro. Se suprime el gen vpr. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. La secuencia de ADN del VIH se ha publicado en Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549.

Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: M17449.

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Ejemplo 7

El plásmido pM160 es un plásmido de 11,0 kb que contiene el fragmento de RCP de 2,3 kb que codifica la proteína envolvente del VIH-I/3B y los genes rev/tat clonados en pMAMneoBlue. Se suprime la región nef. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. La secuencia de ADN del VIH-1/3B se ha publicado en Fisher, A., 1985 Nature 316:262. Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: K03455.

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Ejemplo 8

El plásmido pBa.VL es un plásmido de 5,4 kb que contiene el fragmento de RCP que codifica la región VL de un anticuerpo anti-ADN clonado en pBabe.puro en los sitios XbaI y EcoRI. La proteína objetivo derivada de anticuerpos es un ejemplo de una proteína objetivo útil en la inmunización contra y el tratamiento de enfermedades autoinmunes mediadas por células B y la leucemia y el linfoma de células B clonotípicos. Un método general para clonar regiones variables funcionales de anticuerpos se puede encontrar en Chaudhary, V.K., et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:1066.

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Ejemplo 9

El plásmido pOspA.B es un plásmido de 6,84 kb que contiene las regiones de codificación que codifican los antígenos OspA y OspB del Borrelia burgdorferi, la espiroqueta responsable de la enfermedad de Lyme clonada en pBabe.puro en los sitios BamHI y SalI. Los cebos de RCP utilizados para generar los fragmentos OspA y OspB son 5'-GAAGGATCCATGAAAAAATATTTATT-GGG-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 3) y 5'-ACTGTCGACTTATTT
TAAAGCGTTTTTAAG-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 4). Véase: Williams, W.V., et al. 1992 DNA and Cell. Biol.
11(3) : 207, que se incluye en el presente documento por referencia. El plásmido que contiene estos genes patógenos, que codifican proteínas objetivo, es útil en la inmunización contra la enfermedad de Lyme.

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Ejemplo 10

El plásmido pBa.Rb-G es un plásmido de 7,10 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la proteína G de la rabia clonada en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene este gen patógeno, que codifica la proteína G de la rabia, es útil en la inmunización contra la Rabia. La secuencia de ADN se revela en Genebank nº: M32751.

Véase también: Anilionis, A., et al., 1981 Nature 294:275.

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Ejemplo 11

El plásmido pBa.HPV-L1 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la proteína capsídica LI del virus del papiloma humano (VPH) incluyendo las cepas 16, 18, 31 y 33 del VPH clonadas en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido es útil en la inmunización contra la infección con el VPH y el cáncer causado de ese modo. La secuencia de ADN se revela en Genebank nº: M15781. Véase también: Howley, P., 1990 Fields Virology, Volumen 2, Editores: Channock, R.M. et al. Capítulo 58:1625; y Shah, K. y P. Howley, 1990 Fields Virology, Volumen 2, Editores: Channock, R.M. et al. Capítulo 59;

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Ejemplo 12

El plásmido pBa.HPV-L2 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la proteína capsídica L2 del virus del papiloma humano (VPH) incluyendo las cepas 16, 18, 31 y 33 del VPH clonadas en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido es útil en la inmunización contra la infección con el VPH y el cáncer causado de ese modo. La secuencia de ADN se revela en Genebank nº: M15781. Véase también: Howley, P., 1990 Fields Virology, Volumen 2, Editores: Channock, R.M. et al. Capítulo 58:1625; y Shah, K. y P. Howley, 1990 Fields Virology, Volumen 2, Editores: Channock, R.M. et al. Capítulo 59;

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Ejemplo 13

El plásmido pBa.MNp7 es un plásmido de 5,24 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la región de codificación p7 incluyendo la secuencia (proteína nuclear) de gag de MN del VIH clonada en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549. Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: M17449.

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Ejemplo 14

El plásmido pGA733-2 es un plásmido de 6,3 kb que contiene el antígeno superficial tumoral GA733-2 clonado de la línea celular del carcinoma colorectal SW948 en el vector pCDM8 (Seed, B. y A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:3365) en el sitio BstXl. La proteína objetivo asociada al tumor es un ejemplo de una proteína objetivo útil en la inmunización contra y el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como por ejemplo el cáncer. El antígeno GA733-2 es un antígeno objetivo útil contra el cáncer de colon. Se informa acerca del antígeno GA733 en Szala, S. et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:3542-3546.

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Ejemplo 15

El plásmido pT4-pMV7 es un plásmido de 11,15 kb que contiene ADNc que codifica el receptor de CD4 humano clonado en el vector pMV7 en el sitio EcoRI. La proteína objetivo CD4 es útil en la inmunización contra y el tratamiento del linfoma de células T. El plásmido pT4-pMV7 está disponible en el Depósito del SIDA, Catálogo nº 158.

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Ejemplo 16

El plásmido pDJGA733 es un plásmido de 5,1 kb que contiene el antígeno superficial tumoral GA733 clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. La proteína objetivo asociada con el tumor es un ejemplo de una proteína objetivo útil en la inmunización contra y el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como por ejemplo el cáncer. El antígeno GA733 es un antígeno objetivo útil contra el cáncer de colon.

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Ejemplo 17

El plásmido pBa.RAS es un plásmido de 6,8 kb que contiene la región de codificación de ras que fue subclonada primero de pZIP-neoRAS y clonada en pBabe.puro en el sitio BamHI. La proteína objetivo de ras es un ejemplo de una molécula de señalización citoplásmica. Se informa del método de clonación de ras en Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4:1577, que se incluye en el presente documento por referencia. Los plásmidos de codificación de ras son útiles para la inmunización contra y el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como por ejemplo el cáncer; en particular, el cáncer relacionado con el ras, por ejemplo el cáncer de vejiga, de músculos, de pulmón, de cerebro y de huesos.

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Ejemplo 18

El plásmido pBa.MNp55 es un plásmido de 6,38 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la región de codificación p55 incluyendo la secuencia (proteína nuclear) precursora de gag de MN del VIH clonada en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549.

Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: M17449.

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Ejemplo 19

El plásmido pBa.MNp24 es un plásmido de 5,78 kb que contiene un fragmento generado por RCP del modelo pMN-SF1 que codifica la región de codificación p24 incluyendo toda la región de codificación de gag de MN del VIH clonada en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549.

Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: M17449.

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Ejemplo 20

El plásmido pBa.MNp17 es un plásmido de 5,5 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la región de codificación p17 incluyendo la secuencia (proteína nuclear) de gag de MN del VIH clonada en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549. Se puede acceder ala secuencia a través de Genbank nº: M17449.

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Ejemplo 21

El plásmido pBa.SlVenv es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento generado por RCP de 2,71 amplificado a partir de una construcción que contiene VIS 239 en pBR322 clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. Los cebos utilizados son 5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 5) y 5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 6). El plásmido está disponible del Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del SIDA; Catálogo nº 210.

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Ejemplo 22

El plásmido pcTSP/ATK.env es un plásmido de 8,92 kb que contiene un fragmento generado por RCP que codifica la región de codificación envolvente del VLHT al completo de los aislados VLHT-1/TSP y /ATK subclonados en el vector pcDNA1/neo. Los cebos utilizados son 5'-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 7) y 5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3'(ID DE SECUENCIA Nº: 8). Se informa del plásmido pcTSP/ATK.env en 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:3599. La proteína objetivo env del VLHT es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VLHT y el linfoma de células T.

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Ejemplo 23

El plásmido pBa.MNgp160 es un plásmido de 7,9 kb que contiene un fragmento generado por RCP de 2,8 kb amplificado a partir de una construcción que contiene MMenv en pSP72 y clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. Los cebos utilizados son 5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 9) y 5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3' (ID DE SECUENCIA Nº: 10). Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549.

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Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: M17449. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA.

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Ejemplo 24

El plásmido pC.MNp55 es un plásmido de 11,8 kb que contiene un fragmento generado por RCP de 1,4 kb amplificado a partir de la región de gag, del aislado de MN y clonado en el vector pCEP4. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH, que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549. Se puede acceder a la secuencia a través de Genbank nº: M17449.

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Ejemplo 25

El plásmido pC.Neu es un plásmido de 14,2 kb que contiene un fragmento de ADN de 3,8 kb que contiene la región de codificación oncogénica neu humana que se eliminó de la construcción RTL-2/erbB-2 y subclonó en el vector pCEP4. Se informa del plásmido pC.Neu en DiFiore 1987 Science 237:178. La proteína objetivo oncogénica neu es un ejemplo de un receptor de factor de crecimiento útil como una proteína objetivo para la inmunización contra y el tratamiento de las enfermedades hiperproliferativas tales como por ejemplo el cáncer, en particular, el cáncer de colon, de pecho, de pulmón y de cerebro.

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Ejemplo 26

El plásmido pC.RAS es un plásmido de 11,7 kb que contiene un fragmento de ADN de 1,4 kb que contiene la región de codificación oncogénica de ras que fue subclonada primero de pZIPneoRAS y subclonada en pCEP4 en el sitio BamHI. Se informa del plásmido pC.RAS en Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4:1577. La proteína objetivo de ras es un ejemplo de una molécula de señalización citoplásmica. El plásmido de codificación de ras es útil para la inmunización contra y el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como por ejemplo el cáncer; en particular, el cáncer relacionado con ras como por ejemplo el cáncer de vejiga, de músculos, de pulmón, de cerebro y de huesos.

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Ejemplo 27

El plásmido pNLpuro es un plásmido de 15 kb que contiene una inserción de SV40-puro y gag/pol del VIH. El plásmido que contiene estos genes virales del VIH que codifican proteínas objetivo del VIH, es útil en la inmunización contra y el tratamiento de la infección con el VIH y el SIDA.

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Ejemplo 28

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra el CD4 humano en los ratones. Estos experimentos fueron diseñados para probar la capacidad de una vacuna para proteger contra un antígeno del linfoma T. En el linfoma de células T, el CD4 es un antígeno específico tumoral. Por consiguiente, este modelo demuestra la capacidad de la vacuna genética para proteger contra el linfoma T. Además, estos experimentos probaron la efectividad contra un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina de las moléculas. El CD4 se conserva enormemente entre las especies murina y humana.

El modelo animal utilizado ha sido descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica CD4, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas. Aunque los animales eran inmunocompetentes, no se dirigió una respuesta inmunitaria contra los tumores marcados CD4 implantados en los animales no vacunados.

Se vacunó a los animales inmunizados genéticamente con plásmido pT4-pMV7, descrito en el Ejemplo 15. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína de CD4.

En el procedimiento de inmunización genética descrito en el presente documento, se inyectó a los músculos del cuádriceps de los ratones BALB/c con 100 \mul de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en NaCl isotónico utilizando una aguja de calibre 27 para estimular la regeneración celular muscular para facilitar la captación de la construcción genética. Veinticuatro horas más tarde, se inyectó entonces los mismos sitios de inyección con o bien 100 \mug de pT4-pMV7 o con 100 \mug de pMV7 como un plásmido de control. A los ratones se les dieron dosis de refuerzo inyectando la misma cantidad de construcción de ADN tres veces en intervalos de dos semanas de la misma manera pero sin pretratamiento con bupivacaína-HCl.

Los animales recibieron 1.000.000 de células tumorales marcadas CD4. En animales no vacunados, se formaron grandes tumores y se produjo la muerte tras aproximadamente 7-10 semanas. Los animales vacunados no desarrollaron tumores mortales similares.

Los resultados demuestran que la respuesta inmunitaria de los ratones vacunados genéticamente fue suficiente como para eliminar por completo los tumores transfectados y a la vez no tener ningún efecto en los tumores no transfectados. La vacunación con proteína CD4 llevó a cierta reducción en el tamaño de los tumores en los tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tuvo ningún efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraron una mortalidad similar tanto para tumores transfectados como para tumores no transfectados.

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Ejemplo 29

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra el GA733 humano en los ratones. Estos experimentos se diseñaron para probar la capacidad de una vacuna para proteger contra el cáncer asociado al GA733 tal como por ejemplo el cáncer de colon. El modelo animal utilizado se ha descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica GA733, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con plásmido pGA733-2, descrito en el Ejemplo 14, siguiendo el método descrito anteriormente. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína GA733.

Los resultados demuestran que la respuesta inmunitaria de los ratones vacunados genéticamente fue suficiente como para eliminar por completo los tumores transfectados a la vez que no tuvieron ningún efecto sobre los tumores no traducidos. La vacunación con proteína GA733 llevó a cierta reducción en el tamaño de los tumores en tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tuvo ningún efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraron una mortalidad similar tanto para tumores transfectados como para tumores no transfectados.

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Ejemplo 30

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra el p185neu humano en los ratones. Estos experimentos se diseñaron para probar la capacidad de una vacuna para proteger contra el cáncer asociado al p185neu tal como por ejemplo el cáncer de pecho, de pulmón y el de cerebro. El modelo animal utilizado se ha descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica neu, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfecta-
das.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con plásmido pRTL-2/erbB-2, un plásmido de 14,3 kb que contiene la región de codificación oncogénica de neu humana clonada en el vector RTL-2 en el sitio XhoI siguiendo el método descrito anteriormente. El 5'RTL y 3'RTL son de RTL del VLMu-Moloney. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína p185neu.

Los resultados demuestran que la respuesta inmunitaria de los ratones vacunados genéticamente fue suficiente como para eliminar por completo los tumores transfectados a la vez que no tuvieron ningún efecto sobre los tumores no traducidos. La vacunación con proteína p185 llevó a cierta reducción en el tamaño de los tumores en tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tuvo ningún efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraron una mortalidad similar tanto para tumores transfectados como para tumores no transfectados.

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Ejemplo 31

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra el Ras humano en los ratones. Estos experimentos se diseñaron para probar la capacidad de una vacuna para proteger contra el cáncer asociado al Ras tal como por ejemplo el cáncer de vejiga, de músculos, de pulmón, de cerebro y de huesos. El modelo animal utilizado se ha descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica Ras, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con plásmido pBa.RAS, descrito en el Ejemplo 17, siguiendo el método de vacunación descrito anteriormente. La proteína objetivo de ras es un ejemplo de una molécula de señalización citoplásmica. Se informa del método de clonación de ras en Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4:1577. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína Ras.

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Ejemplo 32

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra el antígeno de la proteína G de la rabia humana en los ratones. El modelo animal utilizado se ha descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica la proteína G de la rabia, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con plásmido pBa.Rb-G que se describe en el Ejemplo 10, siguiendo el método de vacunación descrito anteriormente. La proteína objetivo G de la rabia es un ejemplo de un antígeno patógeno. La secuencia de ADN se revela en Genebank nº: M32751. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína G.

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Ejemplo 33

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra el antígeno de la enfermedad de Lyme en los ratones. El modelo animal utilizado se ha descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica OspA y OspB, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con plásmido pOspA.B que se describe en el Ejemplo 9. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se habían administrado las proteínas OspA y OspB.

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Ejemplo 34

Se diseñó una construcción de ADN para probar la efectividad de una vacuna genética contra una región variable del receptor de células T humanas en los ratones. Estos experimentos se diseñaron para probar la capacidad de una vacuna para proteger contra un cáncer asociado a lá proteína derivada del receptor de células T tal como por ejemplo el linfoma de células T y las enfermedades autoinmunes mediadas por células T. El modelo animal utilizado se ha descrito anteriormente. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codifica Ras, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con plásmido pBa.Va3 que se describe en el Ejemplo 5 siguiendo el método de vacunación descrito anteriormente.

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Ejemplo 35

Se puede utilizar el plásmido pM160 como un material de comienzo para varios plásmidos útiles para expresar uno o más genes de la parteenv del VIH. La construcción de pM160 se ha descrito anteriormente. El plásmido engloba la región de codificación de rev, tat y pg160. Falta el gen nef.

El promotor que controla la expresión génica de pg160/rev/tat es RTL del VTMM. El promotor se puede suprimir y sustituir por un promotor de Actina, un promotor de miosina, un promotor de RTL del VIH y un promotor del CMV.

El gen que confiere la resistencia a la ampicilina se puede suprimir o inactivar de otra manera. El gen que confiere la resistencia a la neomicina se puede poner bajo el control de un promotor bacteriano.

El potenciador del virus del sarcoma de Rous se puede suprimir del plásmido. El potenciador del VSR se puede sustituir por el potenciador muscular de creatina.

Los genes pg160/rev/tat se superponen y comparten las mismas secuencias de nucleótidos en diferentes marcos de lectura. El gen rev se puede suprimir cambiando su codón de iniciación por un codón diferente. De forma similar, el gen tat se puede eliminar con los mismos medios. En cada plásmido salvo en aquellos que utilizan el promotor de RTL del VIH para controlar pg160/rev/tat, se pueden eliminar o bien rev, tat, o tanto rev como tat. En los plásmidos que utilizan el promotor de RTL del VIH, tat debe estar presente.

La siguiente Tabla enumera los plásmidos modificados por pM160. Cada plásmido tiene un gen de ampicilina inactivado. Cada uno ha suprimido el potenciador del VSR. Algunos no tienen ningún potenciador (no); algunos tienen un potenciador muscular de creatina (PMC). Algunos tienen el gen rev del VIH (sí) mientras que se ha suprimido en otros (no). Algunos tienen el gen tat del VIH (sí) mientras que se ha suprimido en otros (no).

1

Las construcciones RA-29 a la RA-56 son idénticas a la RA-1 a la RA-32 respectivamente salvo que en cada caso el promotor que controla el gen de neomicina es un promotor bacteriano.

Ejemplo 36

El plásmido pNLpuro se puede utilizar como un material de comienzo para producir varios plásmidos diferentes que expresan los genes gag/pol del VIH. Tal y como se ha escrito anteriormente, pNLpuro se construyó para la expresión de gag/pol. El plásmido pNLpuro\Deltavpr, que se ha descrito anteriormente, fue diseñado para suprimir el gen regulador vpr del vector de gag pol del VIH para eliminar una proteína reguladora necesaria del conjunto de genes a ser introducidos mediante la vacunación. Además de vpr, aquellas personas con conocimientos ordinarios de la técnica pueden hacer otros cambios en el plásmido pNL43puro utilizando técnicas de biología molecular estándares y material de comienzo que está ampliamente disponible.

Las secuencias humanas de flanqueo 5' y 3' de las secuencias del VIH se pueden extraer a través de diversos métodos. Por ejemplo, utilizando RCP, las secuencias solamente de VIH, de SV40-puro, y de pUC18 se pueden amplificar y reconstruir.

La región de psi del VIH, que es importante en el envoltorio del virus, se puede suprimir de los plásmidos con base de pNL43puro. Para suprimir la región de psi, se corta el plásmido pNLpuro con SacI y SpeI. Esta digestión elimina la región de psi así como el 5'RTL que está en la parte superior y la parte de la región de gag/pol que está en la parte inferior de psi. Para reintroducir las secuencias que no son psi suprimidas, se lleva a cabo la amplificación por RCP para regenerar esas secuencias. Se diseñan cebos que regeneran las partes de la secuencia 5' y 3' del VIH para psi sin regenerar psi. Los cebos reforman el sitio SacI en la parte del plásmido 5' del 5' RTL. Los cebos se dirigen a la parte inferior desde un sitio en la parte superior del sitio SacI a un sitio justo 3' del extremo 5' de la región de psi, generando un sitio AatI en el extremo 3'. Los cebos que comienzan justo a 5' de la región de psi también generan un sitio AatI y, comenzando a 3' del sitio SpeI, regeneran ese sitio. Los fragmentos generados por RCP se digieren con SacI, Aatl y SpeI y se enlazan junto con el fragmento pNLpuro-psi digerido con SacI/SpeI. El promotor 5' RTL del VIH se puede suprimir y sustituir por el promotor del virus de Moloney, RTL del VTMM, el promotor de Actina, el promotor de miosina y el promotor del CMV.

El sitio de poliadenilación 3' RTL del VIH se puede suprimir y sustituir por el sitio de poliadenilación de SV40.

El gen que confiere la resistencia a la ampicilina se puede suprimir o inactivar de otra manera.

Lo que sigue a continuación es un listado de construcciones con base de pNLpuro en las que se suprimen las regiones de psi y vpr del VIH y se suprimen las regiones de flanqueo humanas 5' y 3' de las secuencias del VIH.

2

Las construcciones LA-17 a la LA-32 son idénticas a LA-1 a la LA-16 respectivamente salvo que en cada caso permanece al menos una de las secuencias de flanqueo humanas.

Ejemplo 37

En otra construcción para expresar el gen env, esa región del VIH puede introducirse en el plásmido pCEP4 disponible comercialmente (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es especialmente útil dado que contiene el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región de codificación del antígeno nuclear EBNA-1 que produce replicación episomal de alto número de copia sin integración. El pCEP4 también contiene el marcador de higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región de codificación de env del VIH se coloca bajo el control regulador del promotor del CMV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región de codificación de env del VIH se obtuvo como un fragmento de RCP de 2,3 kb del VIH/3B, secuencia de Genebank K03455. El plásmido resultante con base de pCEP4, pRA-100, se mantiene extracromosómicamente y produce la proteína de pg160.

Ejemplo 38

En otra construcción para expresar el gen env, esa región del VIH puede introducirse en el plásmido pREP4 disponible comercialmente (Invitrogen). El plásmido pREP4 es especialmente útil dado que contiene el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región de codificación del antígeno nuclear EBNA-1 que produce replicación episomal de alto número de copia sin integración. El pREP4 también contiene el marcador de higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región de codificación de env del VIH se coloca bajo el control regulador del promotor del VSR y el sitio de poliadenilación de SV40. La región de codificación de env del VIH se obtuvo como un fragmento de RCP de 2,3 kb del VIH/3B, secuencia de Genebank K03455. El plásmido resultante con base de pCEP4, pRA-101, se mantiene extracromosómicamente y produce la proteína de pg160.

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Ejemplo 39

En otra construcción para expresar los genes gag/pol, esa región del VIH puede introducirse en el plásmido pCEP4 disponible comercialmente (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es especialmente útil dado que contiene el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región de codificación del antígeno nuclear EBNA-1 que produce replicación episomal de alto número de copia sin integración. El pCEP4 también contiene el marcador de higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región de codificación de gag/pol del VIH se coloca bajo el control regulador del promotor del CMV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región de codificación de gag/pol del VIH se obtuvo del MN del VIH, secuencia de Genebank M17449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido resultante con base de pCEP4, pLA-100, se mantiene extracromosómicamente y produce las proteínas de la integrasa, la proteasa, la transcriptasa inversa y GAG55.

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Ejemplo 40

En otra construcción para expresar los genes gag/pol, esa región del VIH puede introducirse en el plásmido pREP4 disponible comercialmente (Invitrogen). El plásmido pREP4 es especialmente útil dado que contiene el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región de codificación del antígeno nuclear EBNA-1 que produce replicación episomal de alto número de copia sin integración. El pREP4 también contiene el marcador de higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región de codificación de gag/pol del VIH se coloca bajo el control regulador del promotor del CMV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región de codificación de gag/pol del VIH se obtuvo del MN del VIH, secuencia de Genebank M17449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido resultante con base de pREP4, pLA-101, se mantiene extracromosómicamente y produce las proteínas de la integrasa, la proteasa, la transcriptasa inversa y GAG55.

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Ejemplo 41

La siguiente construcción, a la que se denomina en el presente documento pGAGPOL.rev, es útil para expresar los genes gag/pol del VIH.

El plásmido incluye un gen de resistencia a la Kanamicina y un origen de replicación del ADN de pBR322. Las secuencias proporcionadas para la regulación de la transcripción incluyen: un promotor del citomegalovirus; un potenciador del virus del sarcoma de Rous; y una señal de poliadenilación de SV40. Las secuencias del VIH-1 incluidas en pGAGPOL.rev incluyen una secuencia que codifica p17, p24 y p15 del marco de lectura abierto de gag; una secuencia que codifica proteasa, una secuencia que codifica transcriptasa inversa que contiene una pequeña supresión y una secuencia que codifica el extremo amino inactivo de la integrasa del marco de lectura abierto de poi; y una secuencia que codifica rev. Cada una de las secuencias del VIH procede de la cepa HXB2 del VIH-1.

Se incluyen diversas características de seguridad en pGAGPOL.rev. Entre éstas se incluyen el uso del promotor del CMV y un sitio poli(A) no retroviral. Además, la supresión de la secuencia y limita la capacidad de envolver el ARN viral. Además, múltiples mutaciones de la transcriptasa inversa producen un producto inactivo enzimáticamente. Es más, una gran supresión de integrasa produce un producto inactivo y se utiliza un marcador de resistencia a la Kanamicina para estabilizar transformantes bacterianos.

El plásmido pGAGPOL.rev se construye de la siguiente manera.

Paso 1.: Se utiliza un subclon de la parte del genoma del VIH-1 (HXB2) que se clona en Bluescript (Stratagene). El subclon del VIH-1 contiene el 5' RTL completo y el resto del genoma del VIH-1 del nucleótido 5795 (numeración de Genebank). Las secuencias del VIH-1 se obtienen del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA).

Paso 2.: RCP de parte de gag del plásmido de marco de lectura abierto HXB2D (Depósito del SIDA). Cortar el fragmento de RCP con NotI y SpeI y ligarlo con el subclon del VIH-1 descrito anteriormente restringido con NotI y SpeI.

Paso 3.: RCP de la unión gag/pol y parte de las secuencias de codificación de pol del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA) con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 15 e ID DE SECUENCIA Nº: 16. Cortar el producto de RCP con ClaI y ligarlos juntos. Cortar los fragmentos ligados con BclI y SalI y ligarlos con plásmido del Paso 2 digerido con BclI y SalI.

Paso 4.: Cortar el plásmido del Paso 3 con BspMI y EcoRI y religarlos con adaptadores formados mediante enlazadores de recocido ID DE SECUENCIA Nº: 17 e ID DE SECUENCIA Nº: 18.

Paso 5.: Cortar el plásmido del Paso 4 con NotI y SalI y ligarlos con el plásmido de o bien 4a ó 4b de la descripción escrita para pENV (a continuación). Cortar también con NotI y SalI.

Paso 6.: Restringir el plásmido del Paso 5 con SalI y MluI y ligarlos con producto de RCP obtenido mediante RCP de rev con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 19 e ID DE SECUENCIA Nº: 20.

Paso 7.: Cortar el plásmido del Paso 6 con NotI y ligarlos con producto obtenido mediante RCP del elemento de respuesta de rev en el plásmido HXB2D (Depósito del SIDA) con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 21 e ID DE SECUENCIA Nº: 22.

Los Pasos 6 y 7 son opcionales.

Ejemplo 42

La siguiente construcción, a la que se denomina en el presente documento pENV, es útil para expresar los genes env del VIH.

El plásmido incluye un gen de resistencia a la Kanamicina y un origen de replicación del ADN de pBR322. Las secuencias proporcionadas para la regulación de la transcripción incluyen: un promotor del citomegalovirus; un potenciador del virus del sarcoma de Rous; y una señal de poliadenilación de SV40. Las secuencias del VIH-1 incluidas en pENV incluyen una secuencia que codifica vpu; una secuencia que codifica rev; una secuencia que codifica pg 160; una secuencia que codifica el 50% de nef, una secuencia que codifica vif y, una secuencia que codifica vpr con una supresión de 13 aminoácidos de extremo carboxilo. Las secuencias de vpv, rev, pg160 y nef proceden de la cepa MN del VIH-1. Las secuencias de vif y vpr proceden de la cepa HXB2 del VIH-1.

Se incluyen diversas características de seguridad en pGAGPOL.rev. Entre éstas se incluyen el uso del promotor del CMV y un sitio poli(A) no retroviral. Además, se ha suprimido tat y una supresión al 50% de nef produce un producto nef "inactivo". Además, vif y vpr se colocan fuera de la secuencia normal y una supresión parcial de vpr garantiza además un producto vpr inactivo.

El plásmido pENV se construye de la siguiente manera.

Paso 1.: Comenzar con pUC18 digerido con HindIII y EcoRI. El fragmento resultante que contiene el origen de replicación de ColEl y el gen laci deberían ligarse con el fragmento EcoRI/HindIII de PMAMneoBlue que contiene el potenciador del virus del sarcoma de Rous. El plásmido resultante o pMAMneo-Blue de Clontech (Palo Alto, California) se puede digerir entonces con HindIII y BglI. Utilizando técnicas estándar, ligar con el fragmento que contiene el gen kan obtenido mediante RCP del plásmido de geneblock (Pharmacia).

Paso 2.: Si se ha utilizado pMAMneo-Blue como plásmido de comienzo, digerir con MluI y EcoRI, rellenar los extremos con fragmento Klenow de Polimerasa I y religar.

Paso 3.: Después, con o bien plásmido procedente de pUC18 o pMAMneo-Blue, digerir con HindIII y ligarlos con el sitio poliA de SV40 y la región de empalme temprano obtenida mediante RCP de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, California) con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 23 e ID DE SECUENCIA Nº: 24.

Paso 4a.: Digerir con BamHI y ligar con el promotor del CMV obtenido mediante RCP de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, California) con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 25 e ID DE SECUENCIA Nº: 26.

Paso 4b.: Digerir con BamHI y ligar con RTL del VLM Mo obtenido mediante RCP con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 27 e ID DE SECUENCIA Nº: 28.

Paso 5.: Digerir con NotI y MluI y ligar con la región de codificación de PG160 obtenida mediante RCP de pMN-ST1 con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 29 e ID DE SECUENCIA Nº: 30.

Paso 6.: Digerir con HluI y ligar con las secuencias que codifican vif en su totalidad y vpr con una supresión de 13aa de extremo carboxilo mediante RCP del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA) con los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 31 e ID DE SECUENCIA Nº: 32.

Ejemplo 43

Se proporciona un sistema de inmunización que está compuesto de:

\quad: una composición farmacéutica que está compuesta de alrededor de 100 \mug de pGAGPOL.rev en una solución isotónica aceptable farmacéuticamente; y,

\quad: un preparado farmacéutico que está compuesto de 100 \mug de pENV en una solución isotónica aceptable farmacéuticamente. Además, el sistema de inmunización consta preferentemente de una composición farmacéutica que consta de alrededor de 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en un portador farmacéutico isotónico.

En tal sistema de inmunización preferente, se lleva a cabo una primera serie de administraciones en las que la bupivacaína y una de las dos composiciones farmacéuticas se administran de forma intramuscular a un individuo, preferentemente en un músculo de un brazo o nalga. La bupivacaína y la otra de las dos composiciones farmacéuticas se administran de forma intramuscular al individuo en un sitio diferente, preferentemente alejado del sitio de la administración de la primera composición farmacéutica, preferentemente en un músculo del otro brazo o nalga. Se pueden llevar a cabo posteriores series de administraciones más adelante, preferentemente después de 48 horas a dos semanas ó más.

El sistema de inmunización se puede utilizar para vacunar a un individuo para proteger a ese individuo de la infección con el VIH o para tratar a un individuo infectado con el VIH con una inmunoterapia.

Ejemplo 44

En algunas realizaciones, la presente invención hace referencia a un método para inmunizar a un individuo contra el VIH administrando un único inoculante. Este inoculante incluye una construcción genética que está compuesta de al menos uno, preferentemente dos, más preferentemente más de dos o una pluralidad de los genes del virus del VIH o todos los genes estructurales. Sin embargo, el inoculante no contiene un complemento completo de todos los genes del VIH. Si se provee a una única célula con un complemento completo de genes virales, es posible que se pueda ensamblar un virus infeccioso completo dentro de la célula. En consecuencia, no se provee una construcción genética de conformidad con la presente invención con tal complemento completo de genes. Como una precaución de seguridad, se pueden suprimir o alterar de forma intencionada uno o más genes esenciales para garantizar adicionalmente que no se puede formar una partícula viral infecciosa.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proveen al menos partes de uno, dos o todos los genes estructurales del VIH. Los genes estructurales del VIH constan de gag, pol y env. Se proveen partes de al menos uno de estos tres genes en una construcción genética. En consecuencia, en algunas realizaciones, se provee al menos una parte de cada gag y pol en una construcción genética; en algunas realizaciones, se provee al menos una parte de env en una construcción genética; en algunas realizaciones, se provee al menos una parte de gag en una construcción genética; en algunas realizaciones se provee al menos una parte de cada pol y env en una construcción genética; en algunas realizaciones, se provee al menos una parte de cada gag y env en una construcción genética; en algunas realizaciones, se provee al menos una parte de pol en una construcción genética. Opcionalmente, se provee todo el gen. Opcionalmente, en cualquiera de estas construcciones, también pueden estar presentes los genes reguladores del VIH. Los genes reguladores del VIH son: vpr, vif, vpu, nef, tat y rev.

Ejemplo 45

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "unidad de expresión" pretende hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que está compuesta de un promotor unido de forma operativa a una secuencia de codificación unida de forma operativa a una señal de poliadenilación. La secuencia de codificación puede codificar una o más proteínas o fragmentos de las mismas. En realizaciones preferentes, una unidad de expresión se encuentra dentro de un plásmido.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "unidad de expresión del VIH" pretende hacer referencia a una secuencia de ácido nucleico que está compuesta de un promotor unido de forma operativa a una secuencia de codificación unida de forma operativa a una señal de poliadenilación en la que la secuencia de codificación codifica un péptido que consta de un epítopo que es idéntico o básicamente similar a un epítopo que se encuentra en una proteína del VIH. "Epítopo básicamente similar" pretende hacer referencia a un epítopo que posee una estructura que no es idéntica a un epítopo de una proteína del VIH pero que sin embargo invoca una respuesta inmunitaria celular o humoral que reacciona de forma cruzada ante una proteína del VIH. En realizaciones preferentes, la unidad de expresión del VIH consta de una secuencia de codificación que codifica una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. En realizaciones preferentes, una unidad de expresión del VIH se encuentra dentro de un plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una única construcción genética que posee una única unidad de expresión del VIH que contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "construcción de una única unidad de expresión del VIH" pretende hacer referencia a una única construcción genética que contiene una única unidad de expresión del VIH. En realizaciones preferentes, una construcción de una única unidad de expresión del VIH se encuentra en la forma de un plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se provee una única construcción genética que posee más de una unidad de expresión del VIH en las que cada una contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH" pretende hacer referencia a un único plásmido que contiene más de una unidad de expresión del VIH. En realizaciones preferentes, una construcción de múltiples unidades de expresión del VIH se encuentra en la forma de un plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se provee una única construcción genética que posee dos unidades de expresión del VIH en las que cada una contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas del VIH o fragmentos de las mismas. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "construcción genética de dos unidades de expresión del VIH" pretende hacer referencia a un único plásmido que contiene dos unidades de expresión del VIH, esto es, una construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene dos unidades de expresión del VIH. En una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH, se prefiere que una unidad de expresión del VIH opere en la dirección opuesta a la otra unidad de expresión del VIH. En realizaciones preferentes, una construcción de dos unidades de expresión del VIH se encuentra en la forma de un
plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se provee una vacuna genética del VIH que contiene una única construcción genética. La única construcción genética puede ser una construcción genética de una única unidad de expresión del VIH, una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH o una construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene más de dos unidades de expresión del VIH.

En algunas realizaciones de la presente invención, se provee una vacuna genética del VIH que contiene más de una construcción genética en un único inoculante.

En algunas realizaciones de la presente invención, se provee una vacuna genética del VIH que contiene más de una construcción genética en más de un inoculante. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "múltiples inoculantes" pretende hacer referencia a una vacuna genética que está compuesta de más de una construcción genética, cada una de las cuales se administra por separado. En algunas realizaciones de la presente invención, se provee una vacuna genética del VIH que contiene dos construcciones genéticas. Cada construcción genética puede ser, independientemente, una construcción genética de una única unidad de expresión del VIH, una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH o una construcción genética de múltiples unidades de expresión del VIH que contiene más de dos unidades de expresión del VIH. En algunas realizaciones, ambas construcciones genéticas son construcciones genéticas de una única unidad de expresión del VIH. En algunas realizaciones, ambas construcciones genéticas son construcciones genéticas de dos unidades de expresión del VIH. En algunas realizaciones, ambas construcciones genéticas son construcciones genéticas de múltiples unidades de expresión del VIH. En algunas realizaciones, una construcción genética es una construcción genética de una única unidad de expresión del VIH y la otra es una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH. Una persona que posea conocimientos ordinarios de la técnica puede reconocer y darse cuenta fácilmente de las muchas variaciones dependiendo del número de construcciones genéticas utilizadas en una vacuna genética y el número de unidades de expresión del VIH que pueden estar presentes en cada construcción genética.

Se prefiere que las construcciones genéticas de la presente invención no contengan ciertas secuencias del VIH, concretamente, aquellas que juegan un papel en el genoma del VIH que se integra en el material cromosómico de la célula en la que se introduce. Se prefiere que las construcciones genéticas de la presente invención no contengan RTLs del VIH. Del mismo modo, se prefiere que las construcciones genéticas de la presente invención no contengan un sitio psi del VIH. Además, se prefiere que se suprima el gen de la transcriptasa inversa y se suprima el gen de la integrasa. Las supresiones incluyen eliminar solamente algunos de los codones o sustituir algunos de los codones para eliminar en lo esencial el gen. Por ejemplo, el codón de iniciación se puede suprimir o cambiar o mover fuera del marco para dar como resultado una secuencia de nucleótidos que codifique uno incompleto y que no funcione.

También se prefiere que las construcciones genéticas de la presente invención no contengan un gen tat transcribible del VIH. El gen tat, que se superpone al gen rev se puede suprimir por completo sustituyendo los codones que codifican rev con otros codones que codifican el mismo aminoácido para rev pero que no codifican el aminoácido tat necesario en el marco de lectura en el que tat está codificado. De forma alternativa, solamente algunos de los codones se intercambian para o bien cambiar, esto es, suprimir en lo esencial, el codón de iniciación para tat y/o cambiar, esto es, suprimir en lo esencial, suficientes codones como para dar por resultado una secuencia de nucleótidos que codifique un tat incompleto y que no funcione.

Se prefiere que una construcción genética esté compuesta de secuencias de codificación que codifiquen péptidos que poseen al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo de las proteínas de gag, pol, env ó rev del VIH. Se prefiere más aún que una construcción genética esté compuesta de secuencias de codificación que codifiquen al menos una de las proteínas de gag, pol, env ó rev del VIH o fragmentos de las mismas. Se prefiere que una construcción genética esté compuesta de secuencias de codificación que codifiquen péptidos que tengan más de un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo de las proteínas de gag, pol, env ó rev del VIH. Se prefiere aún más que una construcción genética esté compuesta de secuencias de codificación que codifiquen más de una de las proteínas de gag, pol, env ó rev del VIH o fragmentos de las mismas.

En algunas realizaciones, una construcción genética está compuesta de secuencias de codificación que codifican péptidos que poseen al menos un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo de las proteínas de vif, vpr , vpu ó nef del VIH. En algunas realizaciones, una construcción genética está compuesta de secuencias de codificación que codifican al menos una de las proteínas de vif, vpr, vpu ó nef del VIH o fragmentos de las mismas.

Una construcción genética de una única unidad de expresión del VIH puede estar compuesta de regiones de codificación para uno o más péptidos que comparten al menos un epítopo con una proteína del VIH o un fragmento de la misma en una única unidad de expresión bajo el control regulador de un único promotor y señal de poliadenilación. Se prefiere que las construcciones genéticas codifiquen más de una proteína del VIH o un fragmento de la misma. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. Se prefiere que el promotor sea un promotor de SV40 o un promotor del CMV, preferentemente un promotor temprano inmediato del CMV. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal de poliadenilación funcional en una célula humana. Se prefiere que la señal de poliadenilación sea una señal de poliadenilación de SV40, preferentemente la señal de poliadenilación menor de SV40. Si se proporciona más de una región de codificación en una única unidad de expresión, pueden estar directamente adyacentes una de la otra o separadas por regiones que no son de codificación. Para que se pueda expresar de la forma adecuada, una región de codificación debe tener un codón de iniciación y un codón de terminación.

Una construcción genética de dos unidades de expresión del VIH puede estar compuesta de regiones de codificación para uno o más péptidos que comparten al menos un epítopo con una proteína del VIH o un fragmento de la misma en cada una de las dos unidades de expresión. Cada unidad de expresión está bajo el control regulador de un único promotor y señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, se prefiere que las construcciones genéticas codifiquen más de una proteína del VIH o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, se prefiere que las secuencias de nucleótidos que codifican gag y pol estén presentes en una unidad de expresión y las secuencias de nucleótidos que codifican env y rev estén presentes en la otra. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. Se prefiere que el promotor sea un promotor de SV40 o un promotor del CMV, preferentemente un promotor del CMV temprano inmediato. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal de poliadenilación funcional en una célula humana. Se prefiere que la señal de poliadenilación sea una señal de poliadenilación de SV40, preferentemente la señal de poliadenilación menor de SV40. Si se proporciona más de una región de codificación en una unidad de expresión, pueden estar directamente adyacentes una de la otra o separadas por regiones que no son de codificación. Para que se pueda expresar de la forma adecuada, una región de codificación debe tener un codón de iniciación y un codón de terminación.

De conformidad con algunas realizaciones de la presente invención, el epítopo reactivo de forma cruzada del CMH de Clase II en env se suprime y se sustituye por la región análoga del VIH II.

Cuando una construcción genética contiene gag y/o pol, es generalmente importante que rev esté también presente. Además de rev, se puede proporcionar un elemento de respuesta rev con gag y pol para una expresión incrementada de esos genes.

Cuando se producen construcciones genéticas que se prefiere que el gen env utilizado en el plásmido 1 proceda de aislados MM o similares a MN incluyendo aislados clínicos que se parezcan a MN, preferentemente aislados clínicos no sincitiales que sean inductores, preferentemente aquellos que son macrófago-trópicos procedentes de aislados clínicos de fase temprana.

Se pueden producir múltiples proteínas a partir de una única unidad de expresión mediante empalme alternativo. Se proporcionan señales de empalme para permitir el empalme alternativo que produce diferentes mensajes que codifican diferentes proteínas.

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Ejemplo 46

La Figura 8 muestra cuatro esqueletos, A, B, C y D. La Figura 9 muestra 4 inserciones, 1, 2, 3 y 4. La inserción 1 secunda la expresión de gag y pol; el elemento de respuesta de rev se clonó de una manera como para conservar el aceptor de empalme del VIH. La inserción 2 es similar a la inserción 1 dado que también secunda la expresión de gag y pol salvo que el elemento de respuesta de rev se clonó sin conservar el aceptor de empalme del VIH. La inserción 3 secunda la expresión de gag y pol, incluye una supresión del gen de la integrasa y no incluye la presencia del elemento de respuesta de rev que actúa en cis. La inserción 4 secunda la expresión de rev, vpu y env. El env puede tener el epítopo reactivo de forma cruzada del CMH de clase II alterado para eliminarla reactividad cruzada y el bucle V3 se puede alterar para eliminar la posibilidad de la formación sincitial.

En algunas realizaciones, el esqueleto A se utiliza con la inserción 1. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori+ es el esqueleto A con la inserción 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori- es el esqueleto A con la inserción 1 sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pA1ori+ como pA1ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pA1ori+int+ y pA1ori-int+. Los plásmidos pA1ori+, pA1ori-, pA1ori+int+ y pA1ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pA1ori+TI-, pA1ori-TI-, pA1ori+int+TI- y pA1ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto A se utiliza con la inserción 2. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori+ es el esqueleto A con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori- es el esqueleto A con la inserción 1 sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pA2ori+ como pA2ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pA2ori+int+ y pA2ori-int+. Los plásmidos pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+ y pA2ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pA2ori+TI-, pA2ori-TI-, pA2ori+int+TI- y pA2ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto B se utiliza con la inserción 1. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori+ es el esqueleto B con la inserción 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori- es el esqueleto B con la inserción 1 sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pB1ori+ como pB1ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pB1ori+int+ y pB1ori-int+. Los plásmidos pB1ori+, pB1ori-, pB1ori+int+ y pB1ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pB1ori+TI-, pB1ori-TI-, pB1ori+int+TI- y pB1ori- int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto B se utiliza con la inserción 2. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori+ es el esqueleto B con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori- es el esqueleto B con la inserción I sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pB2ori+ como pB2ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pB2ori+int+ y pB2ori-int+. Los plásmidos pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ y pB2ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pB2ori+TI-, pB2ori-TI-, pB2ori+int+TI- y pB2ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto A menos rev se utiliza con la inserción 3. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori+ es el esqueleto A con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori- es el esqueleto A menos rev con la inserción 3 sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pA/r-3ori+ como pA/r-3ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori-int+. Los plásmidos pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pA/r-3ori+TI-, pA/r-3ori-TI-, pA/r-3ori+int+TI- y pA/r-3ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto C se utiliza con la inserción 1. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori+ es el esqueleto C con la inserción 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori- es el esqueleto C con la inserción I sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pC1ori+ como pC1ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pC1ori+int+ y pC1ori-int+. Los plásmidos pC1ori+, pC1ori-, pC1ori+int+ y pC1ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pC1ori+TI-, pC1ori-TI-, pC1ori+int+TI- y pC1ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto C se utiliza con la inserción 2. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori+ es el esqueleto C con la inserción 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori- es el esqueleto C con la inserción 2 sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pC2ori+ como pC2ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pC2ori+int+ y pC2ori-int+. Los plásmidos pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ y pC2ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pC2ori+TI-, pC2ori-TI-, pC2ori+int+TI- y pC2ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto C se utiliza con la inserción 3. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori+ es el esqueleto C con la inserción 3 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori- es el esqueleto C con la inserción 3 sin el origen de replicación de SV40. De forma adicional, tanto pC3ori+ como pC3ori- pueden incluir integrasa produciendo respectivamente pC3ori+int+ y pC3ori-int+. Los plásmidos pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ y pC3ori-int+ pueden modificarse de forma adicional suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (TI) produciendo respectivamente pC3ori+TI-, pC3ori-TI-, pC3ori+int+TI- y pC3ori-int+TI-.

En algunas realizaciones, el esqueleto D se utiliza con la inserción 4. Tales construcciones contienen de manera opcional el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori+ es el esqueleto D con la inserción 4 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori- es el esqueleto D con la inserción 4 sin el origen de replicación de SV40.

Ejemplo 47

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de un único inoculante/una única unidad de expresión que está compuesta de una construcción genética que incluye una secuencia de codificación que codifica un péptido que posee al menos un epítopo que es idéntico a o básicamente similar a los epítopos de las proteínas del VIH. La secuencia de codificación está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40.

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de un único inoculante/una única unidad de expresión que está compuesta de una construcción genética que incluye una secuencia de codificación que codifica al menos una proteína del VIH o un fragmento de la misma. La secuencia de codificación está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40. La proteína del VIH se selecciona de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev. En algunas realizaciones se prefiere que se proporcione la vacuna genética que esté compuesta de una construcción genética que incluya una secuencia de codificación que codifique al menos dos proteínas del VIH o fragmentos de las mismas seleccionadas de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, se prefiere que se proporcione la vacuna genética que esté compuesta de una construcción genética que incluya una secuencia de codificación que codifique al menos tres proteínas del VIH o fragmentos de las mismas seleccionadas de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, se prefiere que se proporcione la vacuna genética que esté compuesta de una construcción genética que incluya una secuencia de codificación que codifique gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos.

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de un único inoculante/doble unidad de expresión que está compuesta de una construcción genética que incluye dos unidades de expresión y cada una de las cuales consta de una secuencia de codificación que codifica un péptido que tiene al menos un epítopo que es idéntico a o básicamente similar a los epítopos de las proteínas del VIH. La secuencia de codificación está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40. Las dos unidades de expresión están codificadas en direcciones opuestas una de la otra.

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de un único inoculante/doble unidad de expresión que está compuesta de una construcción genética que incluye dos unidades de expresión y cada una de las cuales consta de una secuencia de codificación que codifica al menos una proteína del VIH o un fragmento de la misma. Cada unidad de expresión está compuesta de una secuencia de codificación que está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato del CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40. La proteína del VIH se selecciona de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev. En algunas realizaciones se prefiere que se proporcione la vacuna genética que esté compuesta de una construcción genética que incluya dos unidades de expresión y que al menos una de las cuales conste de una secuencia de codificación que codifique al menos dos proteínas del VIH o fragmentos de las mismas seleccionadas de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos y que la otra conste de al menos una proteína del VIH o fragmentos de la misma seleccionadas de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, se prefiere que se proporcione la vacuna genética que esté compuesta de una construcción genética que incluya dos unidades de expresión y que al menos una de las cuales conste de una secuencia de codificación que codifique al menos tres proteínas del VIH o fragmentos de las mismas seleccionadas de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos y que la otra conste de al menos una proteína del VIH o fragmentos de la misma seleccionadas de entre el grupo que consta de gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, se prefiere que se proporcione la vacuna genética que esté compuesta de una construcción genética que incluya dos unidades de expresión e incluya una secuencia de codificación que codifique gag, pol, env y rev o fragmentos de los mismos.

Ejemplo 48

Una construcción genética, el plásmido pCMN160\Delta16 se creó para su uso en una composición farmacéutica o kit farmacéutico anti-VIH. pCMN160\Delta16 se construyó de la manera que sigue a continuación:

Paso 1:: Se utilizaron los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 35 e ID DE SECUENCIA Nº: 34, un fragmento de RCP del ADN genómico de VIH/MN.

Paso 2:: Se utilizaron los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 33 e ID DE SECUENCIA Nº: 36, fragmento de RCP del ADN genómico de VIH/MN.

Paso 3:: Se combinaron los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 35 e ID DE SECUENCIA Nº: 36 con 2 \mul de material de reacción de los pasos 1 y 2.

Paso 4:: El producto de reacción del Paso 3 se cortó con NotI y HluI y se insertó en el Esqueleto A descrito en el Ejemplo 46 cortado con NotI y HluI.

El plásmido pCMN160\Delta16 se forma de ese modo que contiene como una inserción del Esqueleto A una región de codificación que codifica la Proteína ENV de la cepa MN con la región de rev y la mitad de nef teniendo cambios en la región HLA-DB ante el VIH-2.

Ejemplo 49

El plásmido pGAGPOL.rev2 se creó de la manera que sigue a continuación. Primero se creó el esqueleto. Después, se generó una inserción con gag y pol del VIH y se insertó en el esqueleto.

El esqueleto se preparó de la manera que sigue a continuación.

Paso 1.: Digerir pMAMneo (Clonetech) con BglI. Rellenar con fragmento Klenow de Polimerasa I. Cortar con HindIII. Purificar con gel un fragmento de 1763bp.

Paso 2.: Amplificar el gen Kan^{R} del plásmido pJ4\Omegakan+ (gen de resistencia a la Kanmicina obtenido de Pharmacia Inc., clonado en pJ4\Omega obtenido como un regalo de la Fundación Imperial para la Investigación del Cáncer del Reino Unido; pJ4\Omega la construyó originalmente e informó de ella Morgenstern, J.P. y H. Land, Nucl. Acids Res. 18(4):1068, que se incluye en el presente documento por referencia) con los oligos ID DE SECUENCIA Nº: 37 e ID DE SECUENCIA Nº: 38. Desgastar el producto de RCP. Cortar con HindIII. Purificar con gel el fragmento de RCP.

Paso 3:: Ligar el esqueleto del vector generado de pMAMneo y descrito en el paso nº 1 con el producto de RCP que codifica el gen Kan^{R} y descrito en el paso nº 2. Aislar el plásmido que contiene el gen Kan^{R} y el origen de replicación bacteriano.

Paso 4.: Digerir el plásmido resultante con Mlul, rellenar con fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN. Ligar con el enlazador SacII (New England Biolabs).

Paso 5.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 4 con AseI y SspI.

Paso 6.: RCP de parte del gen Kan^{R} del plásmido descrito en el paso 3 utilizando los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 39 e ID DE SECUENCIA Nº: 40. Cortar el producto de RCP con SspI y AseI.

Paso 7:: Ligar el mayor fragmento obtenido en el paso 5 con producto de RCP obtenido en el paso 6.

Paso 8.: Cortar el plásmido/producto de ligación obtenido en el paso 7 con HindIII. Desgastar con el fragmento Klenow de la polimerasa I de ADN.

Paso 9.: Cortar pCEP4 (Invitrogen) con SalI para liberar un fragmento de ADN que contiene el promotor del CMV, el polienlazador, y el sitio poli A de SV40. Purificar este fragmento y desgastar con el fragmento Klenow de la Polimerasa I de ADN.

Paso 10.: Ligar el plásmido obtenido en el paso 8 y el fragmento obtenido en el paso 9. Aislar el plásmido que contiene el origen de replicación bacteriano, el gen Kan^{R}, el potenciador del VSR, el promotor del CMV, el polienlazador, y el sitio poli A de SV40.

Paso 11.: Cortar el plásmido obtenido en el paso 10 con BamHI y NheI.

Paso 12.: Recocer los oligonucleótidos ID DE SECUENCIA Nº: 41 e ID DE SECUENCIA Nº: 42.

Paso 13.: Ligar el plásmido obtenido en el paso 10 con los oligonucleótidos recocidos obtenidos en el paso 12. Aislar el plásmido que contiene el adaptador contenido en el paso 12.

Paso 14.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 13 con SalI y MluI.

Paso 15.: Amplificar con RCP el marco de lectura abierto de rev utilizando BBG35 (RD Systems Inc. Mineápolis, MN; que contiene la región de codificación para rev de la cepa HX3B del VIH en pUC19) como modelo y los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 43 e ID DE SECUENCIA Nº: 44. Digerir el producto de RCP con SalI y MluI.

Paso 16.: Ligar el plásmido obtenido en el paso 14 con el producto de RCP producido en el paso 15. Aislar el plásmido que contiene la región de codificación de rev.

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Preparación de la inserción de gag/pol.

Paso 1.: Un subclon de parte del genoma (HXB2) del VIH-1 que fue clonado en Bluescript (Stratagene). El subclon del VIH-1 contiene el 5'RTL completo y el resto del genoma del VIH-1 del nucleótido 5795 (numeración de Genbank) clonado en los sitios de XbaI y SalI de Bluescript. Las secuencias del VIH-1 se obtienen del plásmido HXB2D (Depósito del SIDA).

Paso 2.: RCP de parte de la región de codificación de gag del marco de lectura abierto del plásmido descrito en el paso 1 (el subclon de parte del genoma HXB2 del VIH-1 que está clonado en Bluescript) utilizando los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 45 e ID DE SECUENCIA Nº: 46.

\newpage

Paso 3.: Digerir el plásmido descrito en el paso 1 (el subclon de parte del genoma HXB2 del VIH-1 que está clonado en Bluescript) con EcoRI. Purificar el plásmido que contiene el esqueleto pBluescript, el 5'RTL del VIH-1, la región de codificación de gag y parte de la región de codificación de pol y religar.

Paso 4.: Cortar el plásmido obtenido en el paso 3 con NotI y SpeI y ligar con el fragmento de RCP descrito en el Paso 2 después de que se digiera con NotI y SpeI. Aislar el plásmido que contiene el fragmento de RCP en vez del fragmento de NotI y SpeI original que contiene el 5' RTL del VIH-1.

Paso 5.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 4 con EcoRI y SalI.

Paso 6.: Recocer los oligonucleótidos ID DE SECUENCIA Nº: 47 e ID DE SECUENCIA Nº: 48.

Paso 7.: Ligar el plásmido obtenido en el paso 5 con el adaptador obtenido en el paso 6. Aislar el plásmido que contiene el adaptador clonado en los sitios de EcoRI/SalI.

Paso 8.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 7 con NdeI y EcoRI.

Paso 9.: Amplificar con RCP el Elemento de Respuesta a Rev (ERR) del plásmido que contiene la secuencia de ERR de la cepa HXB2 del VIH-1 utilizando los cebos ID DE SECUENCIA Nº: 49 e ID DE SECUENCIA Nº: 50. Digerir el producto de RCP con NdeI y EcoRI.

Paso 10.: Ligar el plásmido obtenido en el paso 8 con el producto de RCP obtenido en el paso 9. Aislar el plásmido que contiene la inserción con la secuencia de ERR.

Paso 11.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 10 con NotI y SalI y aislar el fragmento que contiene la región de codificación de gag, la región de codificación de pol modificada, y la secuencia de ERR.

Paso 12.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 16 del protocolo para preparar el esqueleto que se ha descrito anteriormente con NotI y SalI.

Paso 13.: Ligar el plásmido obtenido en el paso 12 con la inserción obtenida en el paso 11. Aislar los plásmidos que contienen la inserción que contiene la región de codificación de gag, la región de codificación de pol modificada, y la secuencia de ERR.

Paso 14.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 13 con XbaI y NheI. Desgastar los extremos y religar. Aislar el plásmido al que le falta el sitio XpnI que está presente entre los sitios XbaI y NheI en el plásmido obtenido en el paso 13.

Paso 15.: Digerir el plásmido obtenido en el paso 14 con KpnI y aislar el mayor fragmento.

Paso 16.: Recocer los oligonucleótidos ID DE SECUENCIA Nº: 51 e ID DE SECUENCIA Nº: 52.

Paso 17.: Ligar el fragmento plasmídico purificado obtenido en el paso 15 con el adaptador obtenido en el paso 16. Aislar el plásmido que contiene el adaptador insertado en el sitio KpnI del plásmido obtenido en el paso 15.

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Ejemplo 50

Inmunización genética con genes para proteínas reguladoras

Parte de la dificultad de combatir el VIH proviene de la extraordinaria variabilidad del virus y su capacidad para mutar rápidamente en nuevas formas. No solamente hay una considerable variación en la secuencia de las proteínas entre los aislados del VIH que se encuentran en la población humana en su totalidad, sino que el virus muta tan rápidamente que cada individuo infectado con el VIH en realidad alberga cierto número de microvariantes del VIH relacionadas. Dichos aislados del VIH presentan diferencias en la eficiencia de la replicación, el tropismo, la propensión a la neutralización, y la resistencia a los fármacos. A medida que aparecen los mutantes resistentes a los fármacos, se desvanecen los beneficios de la terapia con fármacos. Con AZT, la resistencia a los fármacos normalmente surge dentro del primer año de terapia. Esta constante generación de mutantes de escape puede jugar una parte en la capacidad del VIH
de vencer finalmente las defensas del huésped tras un largo periodo en el que el virus parece mantenerse bajo control.

Se ha informado de esta evolución mutacional en diversas regiones de la glicoproteína envolvente de pg120, incluyendo el principal campo neutralizador del bucle V3, y también en las proteínas nucleares del VIH. Las proteínas reguladoras del VIH se conservan mucho mejor que las proteínas estructurales y también presentan menos evoluciones mutacionales a lo largo del tiempo. Las proteínas reguladoras por lo tanto presentan objetivos atractivos para el ataque antiviral.

El VIH presenta una regulación temporal extraordinaria de la expresión de las proteínas reguladoras frente a las estructurales. En la fase temprana de la replicación viral, predominan los ARNm que codifican las proteínas reguladoras Tat, Rev y Nef, mientras que en la fase tardía, hay mayor expresión de los ARNm que codifican las proteínas estructurales, incluyendo los precursores de Gag, Pol, y Env, y muchas proteínas accesorias. Este cambio de la fase temprana a la tardía se desencadena cuando la proteína Rev alcanza un nivel concreto. El predominio de Tat, Rev y Nef pronto en el ciclo de replicación viral también hace que estas proteínas sean objetivos favorables para el ataque antiviral. Esto es especialmente cierto para tat y rev, que juegan papeles absolutamente esenciales en la regulación transcripcional y post-traducción de la expresión génica del VIH, y predominan pronto en el ciclo de replicación viral, antes de la transcripción de las proteínas estructurales virales y la producción de las partículas virales infecciosas.

En contraste con tat y rev, que juegan claramente papeles esenciales en la replicación del VIH, otras proteínas reguladoras tales como por ejemplo nef, vpr, vif, y vpu a veces se denominan proteínas "accesorias". Sus funciones se comprenden menos bien, y el grado en el que se atenúa la replicación viral mediante la pérdida de una función en concreto varía considerablemente y puede depender de que la célula huésped esté infectada. Sin embargo, la fuerte conservación de tales funciones entre aislados del VIH muy diversos, así como otros virus de la inmunodeficiencia de primates, sugiere la importancia de estas funciones "accesorias" en el proceso de infección natural. (Véase en general, Terwilliger, E.F., (1992) AIDS Research Reviews 2:3-27, W.C. Koff, F. Wong-Staal, y R.C. Kennedy, editores (Nueva York: Marcel Dekker, Inc.). De hecho, los virus recombinantes de primates suprimidos en o bien vpr, nef o vif no son patogénicos in vivo, demostrando adicionalmente la importancia de estos genes accesorios en el ciclo de vida del
virus.

Hay cierta evidencia de que se podrían conseguir unas respuestas inmunitarias más protectoras y de mayor nivel contra el VIH presentando unas pocas proteínas enzimáticas y/o reguladoras selectas, en vez del complemento completo de genes del VIH. Por lo tanto, una estrategia de inmunización centrada puede implicar de forma deseable la inmunización genética utilizando secuencias de codificación para una o más proteínas del VIH reguladoras y no estructurales, incluyendo tat, rev, vpr, nef, vpu o vif. Solamente se ha encontrado que vpr está asociada con la partícula viral, mientras que otras proteínas reguladoras, incluyendo tat, rev, net vif y vpu, no están asociadas al virión.

En algunas realizaciones de la inmunización genética contra el VIH utilizando genes reguladores, uno o más de los genes tat, rev, nef, vif y vpu se insertan en el esqueleto A que se describe en el Ejemplo 46. Se prefiere que se utilice tat y/o rev. En algunas realizaciones, tat o rev se insertan en el esqueleto A que se describe en el Ejemplo 46. En algunas realizaciones, los siguientes en orden descendente de conveniencia como objetivos son nef, vpr, vif, y vpu. Preferentemente, se empleará más de un gen regulador, incluyendo tat y rev; tat, rev, y nef; tat, rev, net y vpr; tat, rev, nef, vpr, y vif; tat, rev, nef, vpr, vif, y vpu; así como combinaciones de los mismos; y, opcionalmente, genes reguladores adicionales tales como por ejemplo tev.

La proteína Tat es un transactivador de expresión génica dirigida por RTL. Es absolutamente esencial para la replicación del VIH. Tat se produce pronto en el ciclo de replicación viral y el Tat funcional es necesario para la expresión de Gag, Pol, Env y Vpr. La forma predominante de Tat es una proteína de 86 aminoácidos derivada de los ARNm de dos exones. Los 58 aminoácidos aminoterminales son suficientes para la transactivación, aunque con actividad reducida. Tat actúa en una secuencia que actúa en cis llamada tar, para producir un incremento espectacular en la expresión génica impulsada por RTL. Tat puede actuar en parte a través de la síntesis incrementada de ARN y en parte incrementando la cantidad de proteína sintetizada por transcripción de ARN. Hasta hace poco, se creía que Tat actuaba solamente en la RTL del VIH-1. Sin embargo, también se ha informado de la expresión activada por Tat del promotor tardío del virus JC. Tat puede también estimular la proliferación celular como un factor exógeno, y puede jugar un papel que contribuye a estimular el crecimiento del Sarcoma de Kaposi en individuos infectados con el VIH. Debido a tales efectos potencialmente perjudiciales tanto en individuos infectados con el VIH como en individuos que no están infectados, las construcciones de tat preferidas empleadas para la inmunización genética se modifican para expresar solamente un Tat no funcional. Las mutaciones capaces de inactivar Tat o Rev pueden además actuar como mutaciones transdominantes, inactivando potencialmente de ese modo cualquier Tat funcional que se produzca en un individuo infectado con el VIH.

Rev es una segunda proteína reguladora del VIH que es esencial para la replicación viral. Es una proteína de 19 kD (116 aminoácidos) que se expresa a partir de dos exones de codificación que se encuentran en una variedad de ARNs acoplados de forma múltiple. Se han identificado dos campos bien diferenciados, una región básica implicada en la unión de ERR (elemento de respuesta a Rev) que contiene transcripciones y un campo de "activación" que induce exportaciones nucleares de dichas transcripciones como resultado de la unión. En el curso de la infección viral natural, Rev es necesario para la expresión de las proteínas estructurales del VIH Gag, Pol, y Env, así como Vpr.

Vpr es una proteína de 15 kD (96 aminoácidos) en la mayoría de las cepas del VIH-1, aunque el marco de lectura abierto de Vpr está muy truncado en muchas cepas virales con gran número de pases en un cultivo celular. El marco de lectura abierto de vpr está también presente en el VIH-2 y en la mayoría de los aislados del VIS. Vpr es la primera proteína reguladora retroviral que se ha encontrado que está asociada a las partículas virales del VIH. Su presencia en el virión del VIH sugiere que puede cumplir una función en algún momento temprano del ciclo de replicación viral. Vpr acelera la replicación del VIH, especialmente en la fase temprana de la infección. Vpr incrementa el nivel de expresión de los genes informadores unidos a la RTL del VIH multiplicándolo aproximadamente por tres. Además, Vpr y Tat parece que actúan sinergéticamente con respecto a los genes unidos por RTL. Puede aislarse Vpr del suero de individuos infectados con el VIH y parece que incrementa la capacidad del virus para infectar a nuevas células. También se ha descubierto que Vpr inhibe las proliferaciones celulares e induce la diferenciación celular (Levy, D.N. et al., Cell (1993) 72:1-20), un descubrimiento que puede ser significativo en vista de los informes de que los monocito/macrófagos primarios pueden infectarse in vitro solamente mientras están sufriendo la diferenciación (Schuitemaker, H. et al., (1992) J. Clin. Invest. 89:1154-1160). Incluso las células que no son capaces de secundar la replicación del VIH pueden hacerse irregulares por los efectos de Vpr. Por ejemplo, Vpr puede ser responsable del desgaste muscular que se observa con frecuencia en pacientes con SIDA. Debido a la actividad potencialmente perjudicial del Vpr, se debería llevar a cabo preferentemente una inmunización genética con una construcción de vpr modificada que expresará una proteína de Vpr no funcional.

Nef (también llamado 3' orf en material publicado más antiguo) es una proteína de 25-27 kD. Se ha sugerido que Nef puede estar implicado en la regulación a la baja de los linfocitos T CD4+. Además, Nef puede jugar un papel en la señalización celular. Nef parece ser importante para el establecimiento de la infección con el VIH in vivo. Los LTC específicos de Nef se cree que son importantes a la hora de controlar la infección con el VIH in vivo.

Vif es una proteína citoplásmica de 23 kD denominada "factor de infectividad viral". Aunque los virus mutantes con Vif defectuoso no se ven comprometidos con respecto a la transmisión de célula a célula, presentan una profunda disminución de la capacidad para infectar a muchas líneas celulares CD4+. Sin Vif, hay una gemación reducida del virus, y una infectividad reducida. En estudios con primates, los mutantes de supresión de Vif presentan una capacidad enormemente disminuida para establecer la infección in vivo. Estos estudios secundan un papel clínico para Vif en la replicación vírica en el huésped.

Vpu es una proteína de 15-20 kD (81 aminoácidos). Aunque los virus Vpu(+) y Vpu(-) producen la misma cantidad de proteína viral, el último presenta una acumulación intracelular incrementada de proteínas virales junto con virus extracelular disminuido. Esto sugiere que Vpu puede estar implicado en el ensamblaje y/o liberación de partículas virales.

A los retrovirus simples, tales como por ejemplo los virus aviares y murinos, les faltan las proteínas análogas a las proteínas reguladoras del VIH-1, VIH-2 y VIS. En tales animales, la infección retroviral tiende a ser autolimitante, con eliminación del virus y una patogenicidad disminuida. De forma similar, el VLHT-1, que incluye solamente Tax (que actúa muy parecido a Tat y también presenta una actividad semejante a vpr) y Rex (que actúa muy parecido a Rev) se elimina en muchos individuos. La inmunización genética con genes reguladores se considera relevante no solamente para el VIH, sino también para virus tales como por ejemplo el VHB (producto de gen X) y el VHC, y el VLHT-1 (Tax) y (Rex). En todos estos virus, se cree que los genes reguladores juegan un papel crítico en el ciclo de vida del virus y el establecimiento de la infección.

Ejemplo 51

Construcción del plásmido regulador de RIV-2, pREG

El plásmido pREG se construye en forma de pasos, y cada nivel intermedio se puede someter a prueba en busca de la expresión proteínica antes de que continúe la construcción. Se construye un vector de expresión que secunda la expresión de tat y rev a través de dos pasos. En primer lugar, se amplifica un producto de amplificación que contiene un sitio 5' NheI, el sitio donante de empalme mayor del VIH-1, la mayoría de la región de codificación de tat, la región que codifica la región aminoterminal de la proteína rev y un sitio de AvaII a partir de un modelo sintético. Este modelo sintético se genera utilizando las secuencias publicadas de la cepa HXB2 del VIH-1 obtenidas de la Base de datos de GenBank, y se altera para mutar los residuos de cisteína en las posiciones 22 y 30 de la proteína tat. Se ha mostrado que es-
tas mutaciones hacen que tat no sea funcional (Kuppuswamy, et al. (1989) Nucleic Acids Research 17(9):3551-3561).

El producto de RCP se liga en un vector que se digiere con NheI y AvaII y que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, la región de codificación de rev y una señal de poliadenilación de SV40. La secuencia de rev presente en el plásmido procede del clon proviral del VIH-1 III_{B}. Esto generará un vector de expre-
sión que contiene una región de codificación de tat completa pero mutada y una región de codificación de rev completa.

El paso posterior se lleva a cabo para generar un producto de RCP que contiene un sitio de AvaII en su extremo 5', una mutación en la posición 81 de los aminoácidos de rev, aproximadamente el 30% de la región de codificación de rev, aproximadamente el 30% de la región de codificación de nef, y un sitio de MluI en el extremo 3'. El cambio de aminoácido en la posición 81 se ha mostrado que elimina la función de rev, y por lo tanto, el plásmido resultante llevará ala producción de una proteína de rev no funcional (Bogard, H. y Greene, W.C. (1993) J. Virol. 67(5):2496-2502). Se asume que la mayor supresión de la región de codificación de nef dará por resultado la producción de una proteína de nef no funcional. El sitio 5' AvaII y la mutación en la posición 81 de los aminoácidos de la proteína de rev se introducen en el cebo de RCP de 5' que es complementario a la región de codificación de rev que contiene tanto el sitio de AvaII como el nucleótido que codifica el aminoácido 81. Se introducirá un codón de parada que cause la terminación de Nef en la posición 63 de los aminoácidos y el sitio 3' de clonación de codificación, MluI, mediante el cebo de RCP de 3'. El modelo de esta amplificación de RCP es un plásmido o modelo sintético que contiene las regiones de codificación de rev y nef de la cepa MN del VIH-1. El producto de RCP resultante se digerirá con AvaII y MluI, y se utilizará para sustituir el fragmento más pequeño de AvaII-MluI que resulta tras la digestión del plásmido tat-rev descrito en el párrafo anterior con AvaII y MluI.

De forma opcional, se puede añadir vpr a este plásmido en uno de los dos sitios. En un enfoque, vpr se puede amplificar utilizando un cebo de RCP de 5' que contenga un sitio MluI en la parte superior de las secuencias que abarquen el codón de comienzo de la traducción de vpr y el cebo de RCP de 3' complementario al codón de parada de vpr y las secuencias que lo flanquean que también contienen un sitio de clonación de MluI. Las secuencias en la parte superior del codón de comienzo contienen un aceptor de empalme. El producto de RCP se puede digerir con MluI e insertar en el plásmido tat rev nef descrito anteriormente tras su digestión con MluI.

De forma alternativa, la amplificación de vpr se puede llevar a cabo de una manera análoga, sin embargo, los cebos de RCP contendrían sitios de restricción compatibles con la clonación en otro vector de modo que se exprese bajo el control de un segundo promotor eucariótico. El cassette procedente de este plásmido, que contiene el segundo promotor seguido de la región de codificación de vpr, seguido de la secuencia poli A, se podría liberar mediante la digestión con enzimas de restricción que flanqueen el cassette, pero que no se cortan dentro de él. El fragmento de ADN resultante sería clonado en un sitio único del plásmido de tat, rev, vpr que se sale fuera de la región necesaria para la expresión de tat rev vpr. De esta manera, se forma un plásmido que tiene dos unidades de expresión.

Ejemplo 52

Construcción de los plásmidos de VLHT-1 y Rev

Se puede utilizar un enfoque similar para generar un plásmido que exprese proteínas codificadas de VLHT-1 o VHC que tengan funciones enzimáticas necesarias para el ciclo de vida viral y/o para las proteínas reguladoras de estos virus. Para el VLHT-1, se genera un plásmido que codifica la proteína reguladora, TAX, utilizando el esqueleto plasmídico y una estrategia de clonación similar a aquellas descritas anteriormente. Tales genes de VHC que codifican proteínas enzimáticas incluyen la ARN-polimerasa dependiente de ARN, una proteína que tiene una función de helicasa/proteasa. Las secuencias necesarias están publicadas y disponibles a través de GenBank. La organización viral de VLHT-1 y VHC está publicada en Cann, A.J. y Chen, I.S.Y. virology, 2ª Edición, editado por B.N. Fiddr, Raven Press, Ltd., Nueva York, 1990 y Bradley, D.W. Transfusion Medicine Reviews, 1(2):93-102, 1992, respectivamente.

Ejemplo 53

Inmunización genética con genes enzimáticos

La inmunización genética con genes que codifican proteínas con funciones enzimáticas, tales como por ejemplo el gen pol del VIH también pueden ser una estrategia antiviral importante dado que las enzimas como Pol son necesarias para la producción de virus vivo. Sin polimerasa o cualquiera de sus funciones componentes, el VIH no es patogénico ni infeccioso. De forma similar, los genes enzimáticos de otros virus, tales como por ejemplo la polimerasa del VHB, son objetivos atractivos para la inmunización genética. Véase, por ejemplo, Radziwill et al., Mutational Analysis of the Hepatitis B Virus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity, J. Virol. 64(2):613-620 (1990).

Una razón del atractivo de las enzimas virales como un objetivo inmunológico es la limitada capacidad de tales enzimas para mutar su secuencia de aminoácidos y conservar aún sus funciones enzimáticas. Por ejemplo, con el VIH-1, Pol presenta un número limitado de mutaciones de "escape" que están asociadas a la resistencia a los análogos de los nucleótidos tales como AZT. Sin embargo, la gran mayoría de los objetivos inmunológicos dentro de la proteína se conservan incluso en los mutantes de escape de los fármacos.

Ejemplo 54

Construcción del plásmido de polimerasa del VHB

Los experimentos de los que informa el material publicado indican que se ha conseguido la expresión de polimerasa del VHB en células de cultivo de tejidos cuando los marcos de lectura abierto tanto de polimerasa como nucleares están presentes en una molécula de ARNm. También se ha demostrado que en esta situación, la mutación del ATG nuclear no influyó en la expresión de polimerasa.

El genoma del VHB se amplifica a partir de un plásmido que contiene un dímero de cabeza a cola de la cepa ADW del VHB. Debido a que se desea la expresión de la polimerasa solamente, y no del núcleo, el cebo de RCP de 5' se diseña para mutar los codones de iniciación de traducción nucleares y prenucleares. Además, este cebo también introduce una secuencia DR1 mutante para eliminar la posibilidad de la generación de un ARN genómico del VHB competente en la replicación. Este producto de RCP se coloca en un plásmido que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40. Los codones de iniciación de traducción para el antígeno superficial y el producto de la región de codificación de X se mutan para impedir la expresión de los productos de gen X y HBS.

De conformidad con otro enfoque para conseguir la expresión de la polimerasa del VHB, se amplifica un producto de RCP que codifica la región de codificación de polimerasa completa y se clona en un vector que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40. El cebo de RCP de 5' para esta amplificación contiene un sitio de clonación y abarca el codón de iniciación de la traducción del gen de polimerasa. El producto de RCP de 3' contiene un sitio de restricción para la clonación de la inserción en el vector de expresión y también es complementario al codón de parada tradicional del gen de polimerasa del VHB y las secuencias que flanquean este codón de parada. Tras ligar este producto de RCP en un plásmido que contiene el gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación de pBR322, un promotor del citomegalovirus, un potenciador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40, los codones de iniciación de traducción para el antígeno superficial de la Hepatitis B y los genes X se mutan para impedir la expresión de estos productos de gen. Se utiliza una estrategia alternativa similar a la descrita anteriormente, sin embargo, el cebo de RCP de 3' en este caso incluye la señal de VHBpoliA y las secuencias que flanquean esta señal. Este cebo de 3' se utiliza en el caso de que las secuencias que incluyen y/o rodean la señal de poliA del VHB sean importantes para la expresión. Un análisis mutacional ha demostrado que la función del producto de gen de polimerasa del VHB se puede eliminar mediante cambios concretos de los nucleótidos (Radziwell, G. et al. (1990) J. Virol. 64(2):613-620). Antes de utilizar un plásmido construido tal y como se ha descrito anteriormente, se puede mutar la polimerasa expresada mediante la introducción de una de estas mutaciones o de otras que sean análogas.

Ejemplo 55

El factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) presenta efectos estimulantes sobre una variedad de alineamientos celulares incluyendo neutrófilos, monocito/macrófagos y eosinófilos. Los efectos del GM-CSF lo hacen un modelo terapéutico atractivo. El GM-CSF ha sido homologado por la FDA para su uso en el transplante autólogo de médula ósea y se han iniciado ensayos clínicos para probar la eficacia en el tratamiento de diversas neutropenias. Actualmente, el GM-CSF se administra como una proteína que normalmente necesita ser administrada en múltiples dosis. Las proteínas se deben producir y purificar.

Un enfoque alternativo del uso de la proteína de GM-CSF es la administración directa de una construcción génica que contiene un gen que codifica GM-CSF en conjunción con la administración de bupivacaína. La construcción genética se construye mediante RCP de un gen de GM-CSF que incluye la secuencia de señalización. La construcción genética contiene preferentemente un gen de resistencia a la kanamicina (gen de aminoglicosido 3'-fosfotransferasa), un origen de replicación bacteriano, secuencias que secundan la expresión de la región de codificación de GM-CSF en las células en las que se introduce el plásmido tales como por ejemplo los vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 46. El plásmido contiene preferentemente un origen de replicación de mamífero inducido mediante la replicación celular asociada con la administración de bupivacaína. Si se utiliza el origen de replicación del VEB, la secuencia que codifica el antígeno nuclear EBNA-1 también se incluye con las secuencias reguladoras adecuadas. Los cebos para la amplificación de RCP de la inserción contienen sitios de enzima de restricción para permitir la clonación en el vector de expresión y son complementarios a los extremos de 5' y 3' de las secuencias de codificación de GM-CSF. La reacción de RCP se lleva a cabo con el clon de ADNc tal y como se describe en Lee et al. Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 82:4360-4364.

Ejemplo 56

La leucemia mieloide crónica (LMC) es una enfermedad mieloproliferativa clonal de las células madre hematopoyéticas asociadas con el cromosoma Filadelfia; una anomalía cromosómica resultado de la translocación entre los cromosomas 9 y 22. Los puntos de rotura en el cromosoma 22 se agrupan en una región de 6 kb denominada la región del grupo de puntos de rotura (BCR), mientras que en el cromosoma 9, los puntos de rotura están esparcidos a lo largo de una región de 90 kb en la parte superior del exón 2 de c-abl. Las diversas translocaciones 9:22 que resultan se pueden subdividir en dos tipos: translocaciones K28 y translocaciones L6. La transcripción a través de la translocación de bcr-abl resulta en la generación de los ARNm de fusión. Se ha demostrado que el antisentido dirigido como objetivo a la unión de bcr-abl de los ARNm disminuye la capacidad de las células hematopoyéticas obtenidas de pacientes de LMC para formar colonias.

Se administra una construcción genética que codifica el antisentido junto con la bupivacaína a las células de un individuo que sufre de LMC ex vivo. Las células tratadas se reintroducen después en el individuo.

Ejemplo 57

Las construcciones génicas útiles en las composiciones y kits farmacéuticos para la vacunación contra y el tratamiento para el VHB se construyen con los vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 46. Los plásmidos contienen genes estructurales del VHB, especialmente genes que codifican el antígeno superficial del VHB y/o el antígeno nuclear del VHB y/o el antígeno prenuclear del VHB.

Ejemplo 58

Las construcciones génicas útiles en las composiciones y kits farmacéuticos para la vacunación contra y el tratamiento para el VHC se construyen con los vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 46. Los plásmidos contienen genes estructurales del VHC, especialmente genes que codifican la proteína nuclear del VHC y/o la proteína envolvente del VHC.

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Ejemplo 59

La construcción génica pREV se diseñó que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el rev del VIH como la única proteína objetivo. La secuencia de codificación de rev se clona en el Esqueleto A descrito en el Ejemplo 46 a partir de BBG35 (RD Sytems Inc. Mineápolis, MN) que contiene la región de codificación de rev de la cepa HX3B del VIH en pUC19.

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TABLA 1

3

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TABLA 1 (continuación)

4

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TABLA 1 (continuación)

5

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TABLA 1 (continuación)

6

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TABLA 2

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: Patógenos bacterianos

: Entre los cocos gram-positivos patogénicos se incluyen: pneumococo; estafilococo; y estreptococo.

: Entre los cocos gram-negativos patogénicos se incluyen: meningococo; y gonococo.

: Entre los bacilos gram-positivos entéricos patogénicos se incluyen: enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria y eikenella; melioidosis; salmonella; shigellosis; hemophilus; chancroide; brucellosis; tularemia; yersinia (pasteurella); estreptobacillus moniliformis y espirilum; listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathiae: difteria; cólera; ántrax; donovanosis (granuloma inguinal); y bartonellosis.

: Entre las bacterias anaeróbicas patogénicas se incluyen: tétano; botulismo; otros clostridia; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Entre las enfermedades espiroquetales patogénicas se incluyen: sífilis; treponematosis: frambesia, pinta y sífilis endémica; y leptospirosis.

: Entre otras infecciones causadas por bacterias patógenas superiores y hongos patogénicos se incluyen: actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergillosis, y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petriellidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis.

: Entre las infecciones rickettsiales se incluyen la rickettsia y la rickettsiosis.

: Patógenos bacterianos

: Entre los ejemplos de infecciones por clamidia y micoplasma se incluyen: neumonía por micoplasma; linfogranuloma venéreo; psitacosis; e infecciones por clamidia perinatal.

: Eucariotas patogénicas

: Entre los helmintos y protozoos patogénicos y las infecciones producidas de ese modo se incluyen: las infecciones por amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocystis carinii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos ó gusanos planos; y el cestodo (tenia).

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Weiner, David B.

\hskip3.9cm

Williams, William V.

\hskip3.9cm

Wang, Bin

\hskip3.9cm

Coney, Leslie R.

\hskip3.9cm

Merva, Michael J.

\hskip3.9cm

Zurawski, Vincent R., Jr.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones y métodos para la administración de material genético

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 52

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewicz y Norris

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(B): CALLE: One Liberty Place, Piso 46

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(C): CIUDAD: Filadelfia

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(D): ESTADO: Pensilvania

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(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 19103

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con IBM PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Versión 1.25 mb-MD/JAF

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/125.012

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-SEPTIEMBRE-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/124.962

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-SEPTIEMBRE-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/093.235

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JULIO-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/029.336

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-MARZO-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/008.342

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-ENERO-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: DeLuca, Mark

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.229

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DEL EXPEDIENTE/DE REFERENCIA: APOL-0013

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 215-568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 215-568-3429

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCGTCTCG AGACAGAGGA GAGCAAGAAA TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCCCTCTA GATAAGCCAT CCAATCACAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGATCCA TGAAAAAATA TTTATTGGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGTCGACT TATTTTAAAC CGTTTTTAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGTTTTG GATCCTTAAA AAAGGCTTGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTGAGGGA CAGAATTCCA ATCAGGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGATATC CCGGGAGACT CCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATAGAAGA ACTCCTCTAG AATTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTTAGGCG GATCCTATGG CAGGAAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGATGGGT GGCCATGGTG AATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 11:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº 12

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 13:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 14:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTTAACT TTTGATCGAT CCATTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTGTATC GATGATCTGAC

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGTAGCA AAAGAAATAG TTAAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCTTAAC TATTTCTTTT GCTAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ARN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SÉCUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTGTCGAC TGGTTTCAGC CTGCCATGGC AGGAAGAAGC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGACGCGTA TTCTTTAGCT CCTGACTCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGACGGTA GCGGCCGCAC AATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTAAGCG GCCGCAATTG TT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 23:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTA GACATGATAA GATACATTG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCAGCTG GATCCCAGCT TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTTCTGG GGATCCAAGC TAGT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATAGGATCC GCGCAATGAA AGACCCCACC T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATGGATCC GCAATGAAAG ACCCCCGCTG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAAGCGGCC GCTCCTATGG CAGGAAGACG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTC TTATGCTTCT AGCCAGGCAC AATG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTT TATTACAGAA TGGAAAACAG ATGGCAGGTG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTT ATTGCAGAAT TCTTATTATG GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCTTGGA GAGGATTATA GAAGTACTGC AAGAGCTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATCCTCTC CAAGCCTCAG CTACTGCTAT AGCTGTGGC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAATAAAG CGGCCGCTCC TATGGCAGGA AGAGAAGCG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAATTAC GCGTCTTATG CTTCTAGCCA GGCACAATG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTG GGAATGCTCT GCCAGTGTTA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGCCGGA AGGGCACAAT AAAACTGTCT GCTTAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG CTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 40:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 41:

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 42:

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTCGACTG GTTTCAGCCT GCCATGGCAG GAAGAAGC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCACGACG CGTCTATTCT TTAGCTCCTG ACTCC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGCGGCCG CGTAAGTGGA GAGAGATGGT GCGAG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGTGGGGC TGTTGGCTCT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 47:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 48:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAA TTGGAGAAGT G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 50:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTATCTGG CATGGGTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID DE SECUENCIA Nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SECUENCIA Nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGCCAGA TACTGGTAC

\hfill

29

Claims

1. El uso de un potenciador de la función de los polinucleótidos en la elaboración de un medicamento para introducir material genético en las células de un individuo, en el que el medicamento se administra simultáneamente a las células del individuo junto con una molécula de ácido nucleico que está libre de partículas retrovirales, en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y las sales clorhídricas de los mismos.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es una bupivacaína.

3. El uso de la reivindicación 1 en el que dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína y está unida de forma operativa a secuencias reguladoras.

4. El uso de la reivindicación 1 en el que dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que consta de al menos un epítopo que es idéntico o básicamente similar a un epítopo de un antígeno contra el que se desea una respuesta inmunitaria, dicha secuencia de nucleótidos está unida de forma operativa a secuencias reguladoras.

5. El uso de un potenciador de la función de los polinucleótidos en la elaboración de un medicamento para inmunizar a un individuo contra un patógeno, en el que el medicamento se administra simultáneamente a las células del individuo junto con una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que consta de al menos un epítopo que es idéntico o básicamente similar a un epítopo de un antígeno patógeno, estando dicha secuencia de nucleótidos unida de forma operativa a secuencias reguladoras, libre de partículas retrovirales y siendo capaz de expresarse en dichas células, en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales clorhídricas.

6. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína.

7. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

8. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicha proteína es un antígeno patógeno o un fragmento del mismo.

9. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicha molécula de ácido nucleico se administra de forma intramuscular.

10. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicho patógeno es un virus seleccionado de entre el grupo que consta de: el virus de la inmunodeficiencia humana, VIH; el virus de la leucemia humana de células T, VLHT; el virus de la gripe; el virus de la hepatitis A, VHA; el virus de la hepatitis B, VHB; el virus de la hepatitis C, VHC; el virus del papiloma humano, VPH; el virus del herpes simple 1, VHS1; el virus del herpes simple 2, VHS2; el citomegalovirus, CMV; el virus de Epstein-Barr, VEB; el rinovirus; y, el coronavirus.

11. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicho patógeno es el VIH y dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína del VIH.

12. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicho patógeno es el VIH y dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica más de una proteína estructural del VIH.

13. El uso de la Reivindicación 5 en el que dicho patógeno es el VIH y dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica más de una proteína reguladora del VIH.

14. El uso de la Reivindicación 5 en el que al menos dos o más moléculas diferentes de ácido nucleico se administran a diferentes células de un individuo; cada una de dichas diferentes moléculas de ácido nucleico está compuesta de secuencias de nucleótidos que codifican uno o más antígenos patógenos del mismo patógeno.

15. El uso de la Reivindicación 5 en el que:

: dicho individuo es un ser humano;

: dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína;

: dicho patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana;

: dicha molécula de ácido nucleico es el ADN y está compuesta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales del VIH gag y pol con una supresión del psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

16. El uso de la Reivindicación 15 en el que dicha secuencia de ADN está compuesta además de un elemento de respuesta a rev del VIH y una supresión de la integrasa del VIH.

17. El uso de la Reivindicación 16 en el que dicha secuencia de ADN está compuesta además de un aceptor de empalme del VIH.

18. El uso de la Reivindicación 15 en el que dicha molécula de ADN está compuesta además de una secuencia de ADN que codifica el rev del VIH unida de forma operativa a un promotor de SV40 y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

19. El uso de la Reivindicación 18 en el que dicha secuencia de ADN que codifica rev adicionalmente codifica vpu del VIH yenv del VIH.

20. El uso de la Reivindicación 18 en el que dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol está compuesta además de un elemento de respuesta a rev del VIH y una supresión de la integrasa del VIH.

21. El uso de la Reivindicación 20 en el que dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol además está compuesta de un aceptor de empalme del VIH.

22. El uso de la Reivindicación 5 en el que:

: dicho individuo es un ser humano;

: dicho patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana;

: dicha molécula de ácido nucleico es el ADN y está compuesta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas del VIH rev, vpu y env unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

23. El uso de la Reivindicación 5 en el que:

: dicho individuo es un ser humano;

: dicho patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana; se administran dos moléculas de ADN diferentes a diferentes células de un individuo;

: una de dichas moléculas de ácido nucleico es el ADN y está compuesta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales del VIH gag y pol con una supresión del psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

: la otra de dichas moléculas de ácido nucleico es el ADN y está compuesta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas del VIH rev, vpu y env unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

24. El uso de un potenciador de la función de los polinucleótidos en la elaboración de un medicamento para inmunizar a un individuo contra una enfermedad, en el que el medicamento se administra simultáneamente a las células del individuo junto con una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína objetivo que consta de un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo de una proteína asociada con las células que caracterizan a dicha enfermedad unida de forma operativa a secuencias reguladoras, estando dicha secuencia de nucleótidos libre de partículas retrovirales y siendo capaz de expresarse en dichas células, en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales clorhídricas.

25. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína.

26. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicha enfermedad está caracterizada por células hiperproliferativas.

27. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicha enfermedad es una enfermedad autoinmune.

28. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

29. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicha molécula de ácido nucleico se administra de forma intramuscular.

30. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína objetivo seleccionada de entre el grupo que consta de: productos proteínicos de los oncogenes myb, myc, fyn, ras, sarc, neu y trk, los productos proteínicos del gen de translocación bcl/abl; P53; EGRF; regiones variables de anticuerpos creados por linfomas de células B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T.

31. El uso de la Reivindicación 24 en el que dicha proteína se selecciona de entre el grupo que consta de: regiones variables de anticuerpos implicados en la enfermedad autoinmune mediada por células B; y regiones variables de receptores de células T implicadas en la enfermedad autoinmune mediada por células T.

32. Un kit de inmunización farmacéutico que está compuesto de:

a): un primer inoculante que consta de:

i): un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente; y,

ii): una primera molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras; en la que dicha secuencia de nucleótidos es capaz de expresarse en células humanas;

b): un segundo inoculante que consta de:

i): un diluyente o portador aceptable farmacéuticamente; y,

ii): una segunda molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una proteína del VIH unida de forma operativa a secuencias reguladoras; en la que dicha secuencia de nucleótidos es capaz de expresarse en células humanas;

c): un tercer inoculante que está compuesto de bupivacaína. en el que dicha primera molécula de ácido nucleico no es idéntica a dicha segunda molécula de ácido nucleico.

33. Una composición farmacéutica que está compuesta de:

a): una molécula de ADN que consta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas del VIH rev, vpu y env unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

b): un potenciador de la función de los polinucleótidos; en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales clorhídricas de los mismos.

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 33 en la que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína.

35. Un kit de inmunización farmacéutico que está compuesto de:

a): un primer inoculante que consta de:

i): una primera composición farmacéutica que está compuesta de una molécula de ADN que consta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales del VIH gag y pol con una supresión del psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

ii): un potenciador de la función de los polinucleótidos; y

b): un segundo inoculante que está compuesto de:

i): una segunda composición farmacéutica que está compuesta de una molécula de ADN que consta de una secuencia de ADN que codifica las proteínas del VIH rev,vpu y env unida de forma operativa a un potenciador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato del citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

ii): un potenciador de la función de los polinucleótidos; en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales clorhídricas de los mismos.

36. El kit de inmunización farmacéutico de la reivindicación 35 en el que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína.

37. El uso de un potenciador de la función de los polinucleótidos en la elaboración de un medicamento para tratar a un individuo que se sospecha que sufre de una enfermedad, en el que el medicamento se administra simultáneamente a las células del individuo junto con una molécula de ácido nucleico que está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína cuya presencia compensará por una proteína que falta, que no es funcional o que funciona parcialmente o producirá un efecto terapéutico en el individuo, estando dicha secuencia de nucleótidos unida de forma operativa a secuencias reguladoras, libre de partículas retrovirales y siendo capaz de expresarse en dichas células, en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que está compuesto de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales clorhídricas.

38. El uso de la reivindicación 37 en el que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína.

39. El uso de la Reivindicación 37 en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

40. El uso de la Reivindicación 37 en el que dicha molécula de ácido nucleico se administra de forma intramuscular.

41. El uso de la Reivindicación 37 en el que dicha molécula de ácido nucleico está compuesta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada de entre el grupo que consta de: enzimas, proteínas estructurales, citoquinas, linfoquinas y factores de crecimiento.

42. Un kit farmacéutico que está compuesto de:

i): un contenedor que está compuesto de una molécula de ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada de entre el grupo que consta de: proteínas que están compuestas de al menos un epítopo que es idéntico o básicamente similar a un epítopo de un antígeno patógeno; proteínas que constan de un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo de una proteína asociada a células hiperproliferativas; proteínas que constan de un epítopo idéntico o básicamente similar a un epítopo de una proteína asociada a células que caracterizan una enfermedad autoinmune; proteínas cuya presencia compensará por una proteína que falta, no es funcional o que funciona parcialmente en un individuo; y proteínas que producen un efecto terapéutico en un individuo; y

ii): un contenedor que está compuesto de un potenciador de la función de los polinucleótidos; en el que el potenciador de la función de los polinucleótidos se selecciona de entre el grupo que consta de un éster de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales clorhídricas de los mismos; en el que dicho kit farmacéutico está libre de partículas retrovirales.

43. El kit farmacéutico de la reivindicación 42 en el que dicho potenciador de la función de los polinucleótidos es la bupivacaína.