ES2249760T3

ES2249760T3 - Composiciones y procedimientos de administracion de materias geneticas.

Info

Publication number: ES2249760T3
Application number: ES94909492T
Authority: ES
Inventors: Davi B. Weiner; William V. Williams; Bin Wang; Leslie R. Coney; Michael J. Merva; Vincent R. Zurawski Jr.
Original assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania; The Wistar Institute
Current assignee: Wyeth LLC; University of Pennsylvania; The Wistar Institute
Priority date: 1993-01-26
Filing date: 1994-01-26
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2014-01-26
Also published as: AU675702B2; CA2153593C; IL108449A0; IL108449A; DE69434469D1; JP3701966B2; EP0681483A4; US20060222629A1; CA2153593A1; NZ262582A; PT681483E; DE69434469T2; ATE302854T1; EP0681483A1; WO1994016737A1; HU219767B; EP0681483B1; HUT73099A; AU6232094A; US8304234B2

Abstract

SE PRESENTAN UNOS METODOS PARA INTRODUCIR MATERIAL GENETICO EN LAS CELULAS DE UN INDIVIDUO Y COMPUESTOS Y EQUIPAMIENTO PARA LLEVAR A CABO EL CITADO PROCESO. LOS METODOS COMPRENDEN LOS PASOS DE PONER EN CONTACTO CON LAS CELULAS DE UN INDIVIDUO, UN POTENCIADOR DE LA FUNCION POLINUCLEOTIDA Y ADMINISTRAR A LAS CELULAS UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE ESTE LIBRE DE PARTICULAS RETROVIRALES. LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDA QUE CODIFICA UNA PROTEINA QUE COMPRENDE COMO MINIMO UN ANTIGENICO DETERMINANTE DE ESTRUCTURA CONOCIDA, QUE ES IDENTICO O SUSTANCIALMENTE SIMILAR A UN ANTIGENICO DETERMINANTE DE ESTRUCTURA CONOCIDA DE UN ANTIGENO PATOGENO O UN ANTIGENO ASOCIADO CON UNA ENFERMEDAD HIPERPROLIFERATIVA O AUTOINMUNE, PROTEINA QUE DE OTRO MODO NO ESTARIA PRESENTE EN EL INDIVIDUO, DEBIDO A LA FALTA DE UN GEN DEL INDIVIDUO O A QUE ESTE GEN FUNCIONE PARCIALMENTE O NO FUNCIONE, O UNA PROTEINA QUE PRODUZCA EFECTO TERAPEUTICO EN EL INDIVIDUO. SE PRESENTAN METODOS PARA INMUNIZAR CONTRA EL VIH A UN INDIVIDUO, DE FORMA PROFILACTICA O TERAPEUTICA. SE PRESENTAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y EQUIPAMIENTO PARA PONER EN PRACTICA LOS METODOS DE ESTE INVENTO.

Description

Composiciones y procedimientos de administración de materias genéticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y su uso en la introducción de material genético en las células de un individuo. Las composiciones de la invención pueden ser utilizadas para distribuir agentes protectores y/o terapéuticos que incluyen el material genético que codifica dianas de proteína para proteínas de inmunización y terapéuticas.

Antecedentes de la invención

La introducción directa de un gen funcional, normal en un animal vivo ha sido estudiada como medio para remplazar información genética defectuosa. En algunos estudios, se introduce ADN directamente en las células de un animal vivo sin utilizar una partícula viral u otro vector infeccioso. Nabel, E.G., y col., (1990) Science 249:1285-1288, describen la expresión génica de sitio específico in vivo de un gen de la beta-galactosidasa que era transferido directamente a la pared arterial en ratones. Wolfe, J.A. y col., (1990) Science 247:1465-1468, describen la expresión de diversos genes informadores que eran transferidos directamente a músculo de ratón in vivo. Acsadi G. Y col., (1991) Nature 352:815-818, describen la expresión del gen de la distrofina humana en ratones tras la inyección intramuscular de constructos de ADN. Wolfe, J.A., y col., 1991 BioTechniques 11(4):474-485, que se incorpora aquí como referencia, se refiere a condiciones que afectan a la transferencia génica directa a músculo de roedor in vivo. Felgner, P.L. y G. Rhodes, (1991) Nature 349:315-352, describen la distribución directa de genes purificados in vivo como fármacos sin el uso de retrovirus.

Se ha sugerido el uso de la transferencia génica directa como método de vacunación anti-patógenos alternativo. Se sugiere el uso de la transferencia génica directa mediante una simple inyección como posible estrategia de vacunación frente al HIV. Se ha informado de que se ha observado una respuesta inmune celular a gp120 de HIV resultante de la introducción del ADN plasmídico que codifica la misma en células. En PCT International Application Number PCT/US90/01515 publicada el 4 de Octubre de 1990 se describen métodos de inmunización de un individuo frente a la infección por patógenos inyectando directamente polinucleótidos desnudos en las células individuales en un procedimiento de una sola etapa. El uso de agentes transfectantes distintos de las lipofectinas es excluido específicamente de los métodos descritos. La estimulación de células inoculadas no se describe ni se sugiere. Se describe una vacuna para el HIV que consiste en la introducción de polinucleótidos que codifican la proteína gp120 viral. La operabilidad de esta vacuna no se ha puesto en evidencia.

Thomason, D.B. y col., (1990) Cell Physiol. 27:C578-581 y la Solicitud de Patente PCT Núm. de Serie WO 91/12329 describen la administración de bupivacaína en células musculares con el fin de inducir la proliferación de células satélite como parte de un protocolo de distribución génica mediada por retrovirales.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a las composiciones para su uso en métodos de introducción de material genético en las células de un individuo. Los métodos comprenden las etapas de poner en contacto las células de dicho individuo con un agente intensificador de la función de los polinucleótidos, que es preferiblemente un agente que facilita la absorción del ADN por las células o intensifica una respuesta inflamatoria, y administrar a las células, una molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos que o bien codifique un péptido o una proteína deseados, o bien sirva como molde para moléculas de ácido nucleico funcionales. La molécula de ácido nucleico es administrada libre de partículas retrovirales. La proteína deseada puede ser una proteína que funciona en el individuo o sirve como diana para una respuesta inmune.

La presente invención hace referencia a composiciones para su uso en un método de inmunización de un individuo frente a un patógeno. El método comprende las etapas de poner en contacto las células de dicho individuo con un agente intensificador de la función de los polinucleótidos, que es preferiblemente un agente que facilita la absorción de ADN por las células o intensifica la respuesta inmune, y administrar a las células, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado en un antígeno del patógeno y está conectado operablemente a secuencias reguladoras. La molécula de ácido nucleico es susceptible de ser expresada en las células del indivi-
duo.

La presente invención se refiere a una composición para su uso en un método de inmunización de un ser humano frente al HIV. El método comprende las etapas de administrar a un humano una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado en una proteína del HIV conectado operablemente a secuencias reguladoras.

La presente invención se refiere a una composición para su uso en un método de inmunización de un ser humano contra el HIV. El método comprende las etapas de administrar dos moléculas de ácido nucleico diferentes a diferentes células del humano. Cada molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado en una proteína del HIV conectado operablemente a secuencias reguladoras. Las diferentes moléculas de ácido nucleico comprenden cada una secuencias nucleotídicas diferentes que codifican al menos un péptido diferente del otro y son susceptibles de ser expresadas en células humanas.

La presente invención se refiere a composiciones para su uso en los métodos de inmunización de un individuo frente a una enfermedad hiperproliferativa o una enfermedad autoinmune. Los métodos comprenden las etapas de administrar a las células de un individuo, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado en una proteína asociada con una enfermedad hiperproliferativa o una proteína asociada con una enfermedad autoinmune, respectivamente, y está conectado operativamente a secuencias reguladoras; siendo susceptible la molécula de ácido nucleico de ser expresada en las células.

La presente invención hace referencia a composiciones para su uso en el método de tratamiento de un individuo que padece una enfermedad que comprende las etapas de poner en contacto células de dicho individuo con un agente intensificador de la función del polinucleótido, que es preferiblemente un agente que facilita la absorción del ADN por las células o intensifica una respuesta inflamatoria, y administrar a las células de un individuo, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que funciona en lugar de un gen defectuoso o que codifica una molécula que produce un efecto terapéutico en el individuo y está conectado operativamente a las secuencias reguladoras; siendo susceptible la molécula de ácido nucleico de ser expresada en las células.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico y un intensificador de la función del polinucleótido.

La presente invención se refiere a vacunas contra el HIV profilácticas y terapéuticas que comprenden un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más péptidos que comprenden cada uno al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado sobre al menos una proteína del HIV conectada operativamente a secuencias reguladoras; siendo susceptible la molécula de ácido nucleico de ser expresada en células humanas.

La presente invención se refiere a vacunas contra el HIV profilácticas y terapéuticas que comprenden dos inoculantes. El primer inoculante comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y una primera molécula de ácido nucleico. La primera molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más péptidos que comprenden cada uno al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado sobre al menos una proteína del HIV conectada operativamente a secuencias reguladoras; siendo susceptible la molécula de ácido nucleico de ser expresada en células humanas. El segundo inoculante comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y una segunda molécula de ácido nucleico. La segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica uno o más péptidos que comprenden cada uno al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado sobre al menos una proteína del HIV conectada operativamente a secuencias reguladoras; siendo susceptible la molécula de ácido nucleico de ser expresada en células humanas. La primera y segunda moléculas de ácido nucleico son diferentes y codifican péptidos diferentes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un diagrama que representa la construcción de un plásmido pM160 que se producía insertando un fragmento generado mediante PCR que codifica la glicoproteína gp160 de HIV-HXB2 en el plásmido pMAMneoBlue (Clonetech).

La Figura 1B es una fotografía de un autorradiograma de una transferencia Western de productos lisados de células completas de células transfectadas con el plásmido pM160 (células 3G7) versus células transfectadas sólo con el vector (células TE671) que muestra la producción de gp120 y gp41 en células 3G7 y no en células TE671.

La Figura 2 es una fotografía de un autorradiograma que muestra las inmunoprecipitaciones de la unión de anticuerpos del suero a gp160-I^{125}.

Las Figuras 3A-3E son gráficos que muestran los resultados de ELISA de unión de diferentes sueros a diversas proteínas inmovilizadas sobre placas de microtitulación.

Las Figuras 4A y 4B son fotografías de células MT-2 infectadas con virus libre de células TCID_{50}HIV-1/III_{B} que se había incubado previamente con diluciones seriadas de antisueros.

La Figura 4C es un gráfico que ilustra los valores de neutralización (V_{n}/V_{O}) versus los factores de dilución de los resultados utilizando suero de control (X = ratones inmunizados con el vector pMAMneoBlue) y un suero de ensayo (O = ratones inmunizados con pM160).

Las Figuras 4D-4G son fotografías de células H9/III_{B} utilizadas en experimentos para examinar la inhibición sincitial utilizando sueros de animales inmunizados y de control.

La Figura 5 es un diagrama que representa la supervivencia de ratones inmunizados y no inmunizados sensibilizados con células tumorales marcadas y no marcadas con gp160 de HIV. Los ratones fueron inmunizados con la glicoproteína gp160 recombinante, ADN vector solo o vector recombinante que comprende ADN que codifica gp160. Se introdujeron en ratones células tumorales SP2/0 o células tumorales SP2/0-gp160 (células SP2/0 transfectadas con ADN que codifica gp160 y expresa gp160).

La Figura 6 es un mapa plasmídico de pGAGPOL.rev.

La Figura 7 es un mapa plasmídico de pENV.

La Figura 8 muestra cuatro esqueletos, A, B, C y D, utilizados para preparar un constructo genético.

La Figura 9 muestra cuatro insertos, 1, 2, 3 y 4 que son insertados en esqueletos para producir constructos genéticos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención hace referencia a composiciones para su uso en un método de introducción de moléculas de ácido nucleico en las células de un animal que proporciona el elevado nivel de absorción y función de las moléculas de ácido nucleico. El método comprende las etapas de administrar moléculas de ácido nucleico que están libres de partículas virales, concretamente partículas retrovirales, a la célula de un individuo junto con la administración de un co-agente que intensifica la respuesta inflamatoria y/o intensifica la expresión de la molécula de ácido nucleico en el tejido y/o facilita la absorción de la molécula de ácido nucleico por la célula. Las realizaciones preferidas de la presente invención proporcionan métodos de distribución de moléculas de ácido nucleico en células de un individuo sin el uso de agentes infecciosos.

Las moléculas de ácido nucleico que son distribuidas a las células según la invención pueden servir como: 1) moldes genéticos para proteínas que funcionan como agentes inmunizadores profilácticos y/o terapéuticos; 2) copias de reposición de genes defectuosos, perdidos o no funcionales; 3) moldes genéticos para proteinas terapéuticas; 4) moldes genéticos para moléculas antisentido; o 5) moldes genéticos para ribozimas. En el caso de moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas, las moléculas de ácido nucleico preferiblemente comprenden las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción en células del animal. En el caso de las moléculas de ácido nucleico que sirven como moldes para moléculas antisentido y de ribozimas, tales moléculas de ácido nucleico están conectadas preferiblemente a elementos reguladores necesarios para la producción de copias suficientes de las moléculas antisentido y de ribozima codificadas de ese modo respectivamente. Las moléculas de ácido nucleico están libres de partículas retrovirales y se proporcionan preferiblemente como ADN en forma de plásmidos.

El co-agente también es referido aquí como "intensificador de la función del polinucleótido" o "PFE". Un PFE es un compuesto o composición que intensifica la respuesta inflamatoria y/o intensifica la expresión de la molécula de ácido nucleico en el tejido y/o facilita la absorción de la molécula de ácido nucleico por la célula y preferiblemente tiene más de una de estas propiedades. Los intesificadores de la función del polinucleótido que facilitan la absorción de ADN y ARN por las células y estimulan la división celular y la replicación también son referidos como agentes estimuladores de la célula. Los co-agentes preferidos según la presente invención se seleccionan del grupo formado por ésteres de ácido benzoico y anilidas. En las realizaciones preferidas, el PFE es la bupivacaína.

Según algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos que inmunizan profilácticamente y/o terapéuticamente a un individuo contra una célula relacionada con una enfermedad patógena o anómala. El material genético codifica un péptido o proteína que comparte al menos un epítopo con una proteína inmunogénica encontrada en el patógeno o las células a las que va a ser dirigido. El material genético es expresado por las células del individuo y sirve como diana inmunogénica contra la cual se logra la respuesta inmune. La respuesta inmune resultante tiene una base amplia: además de una respuesta inmune humoral, se obtienen ambos brazos de la respuesta inmune celular. Los métodos son útiles para conferir inmunidad profiláctica y terapéutica. Así, en un método de inmunización se incluyen ambos métodos de protección de un individuo frente a una sensibilización con un patógeno, o la aparición de la proliferación de células específicas así como los métodos de tratamiento de un individuo que padece una infección por patógenos, una enfermedad hiperproliferativa o una enfermedad autoinmune.

La presente invención es útil para lograr respuestas inmunes amplias frente a una proteína diana, es decir proteínas específicamente asociadas con patógenos o las propias células "anómalas" del individuo. La presente invención es útil para inmunizar individuos frente a agentes y organismos patógenos de manera que la respuesta inmune contra una proteína patógena proporcione inmunidad protectora contra el patógeno. La presente invención es útil para combatir enfermedades hiperproliferativas y trastornos tales como el cáncer logrando una respuesta inmune contra una proteína diana que esté específicamente asociada con las células hiperproliferativas. La presente invención es útil para combatir enfermedades y trastornos autoinmunes logrando una respuesta inmune contra una proteína diana que esté específicamente asociada con células implicadas en la afección autoinmune.

Algunos aspectos de la presente invención hacen referencia a la terapia génica; esto es, a composiciones para su uso en métodos de introducción de moléculas de ácido nucleico en las células de un individuo, copias exógenas de genes que corresponden a genes defectuosos, perdidos, no funcionales o parcialmente funcionales del individuo o que codifican proteínas terapéuticas, es decir, proteínas cuya presencia en el individuo eliminará una deficiencia en el individuo y/o cuya presencia proporcionará un efecto terapéutico en el individuo proporcionando de ese modo un medio de distribución de la proteína mediante un medio alternativo a partir de la administración de proteína.

Según se utiliza aquí se pretende que el término "proteína deseada" haga referencia a péptidos y proteínas codificados por constructos génicos de la presente invención que o bien actúan como proteínas diana para una respuesta inmune o bien como proteína terapéutica o compensatoria en regímenes de terapia génica.

Según la presente invención, el ADN o el ARN que codifica una proteína deseada es introducido en las células de un individuo en el que es expresado, produciendo de ese modo la proteína deseada. El ADN o ARN que codifica la proteína deseada es conectado a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo. Entre los elementos reguladores para la expresión del ADN se incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Además, también se pueden incluir otros elementos, tales como la región Kozak, en el constructo genético.

Según se utiliza aquí, el término "constructo genético" hace referencia a la molécula de ADN o ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada y que incluye las señales de iniciación y terminación conectadas operablemente a elementos reguladores incluyendo un promotor y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo vacunado.

Según se utiliza aquí, el término "forma expresable" hace referencia a constructos génicos que contienen los elementos reguladores necesarios conectados operablemente a una secuencia codificadora que codifica una proteína diana, de manera que cuando estén presentes en la célula del individuo, se exprese la secuencia codificadora.

Según se utiliza aquí, el término "vacuna genética" hace referencia a una preparación farmacéutica que comprende un constructo genético que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana incluyendo preparaciones farmacéuticas útiles para invocar una respuesta inmune terapéutica.

Según se utiliza aquí, el término "terapéutico genético" hace referencia a una preparación farmacéutica que comprende un constructo genético que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína terapéutica o compensatoria.

Según se utiliza aquí, el término "proteína diana" hace referencia a una proteína contra la cual se puede lograr una respuesta inmune. La proteína diana es una proteína inmunogénica que comparte al menos un epítopo con una proteína del patógeno o del tipo de célula no deseable tal como una célula cancerosa o una célula implicada en una enfermedad autoinmune contra la cual se requiere inmunización. La respuesta inmune dirigida contra la proteína diana protegerá al individuo y tratará al individuo de una infección o enfermedad específica con la cual está asociada la proteína diana.

Según se utiliza aquí, el término "compartir un epítopo" hace referencia a proteínas que comprenden al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de otra proteína.

Según se utiliza aquí, se pretende que el término "epítopo sustancialmente similar" haga referencia a un epítopo que tiene una estructura que no es idéntica a un epítopo de una proteína pero sin embargo evoca una respuesta inmune celular o humoral que presenta reacción cruzada con esa proteína.

Según se utiliza aquí, se pretende que el término "proteína terapéutica" haga referencia a proteínas cuya presencia confiere un beneficio terapéutico al individuo.

Según se utiliza aquí, se pretende que el término "proteína compensatoria" haga referencia a proteínas cuya presencia compensa la ausencia de una proteína producida endógenamente totalmente funcional debida a un gen endógeno ausente, defectuoso, que no funciona o que funciona parcialmente.

Los constructos genéticos comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína deseada conectada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión génica. Por consiguiente, la incorporación de la molécula de ADN o ARN a una célula viva da como resultado la expresión del ADN o ARN que codifica la proteína deseada y por tanto, la producción de la proteína deseada.

Cuando es absorbido por una célula, el constructo genético que incluye la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada conectada operablemente a los elementos reguladores puede seguir presente en la célula en forma de una molécula extracromosómica funcional o se puede integrar en el ADN cromosómico de la célula. El ADN puede ser introducido en células en las que permanece como material genético separado en forma de plásmido. Alternativamente, el ADN lineal que puede ser integrado en un cromosoma puede ser introducido en la célula. Cuando se introduce ADN en la célula, se pueden añadir los reactivos que promueven la integración del ADN en los cromosomas. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración también pueden ser incluidos en la molécula de ADN. Alternativamente, se puede administrar ARN a la célula. Asimismo se contempla proporcionar el constructo genético en forma de minicromosomas lineales que incluyen un centrómero, telómeros y un origen de replicación.

La molécula que codifica una proteína deseada puede ser ADN o ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Estas moléculas pueden ser ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido de los mismos o una molécula de ARN tal como ARNm. Por consiguiente, según se utiliza aquí, se pretende que los términos "constructo de ADN", "constructo genético" y "secuencia de nucleótidos" hagan referencia tanto a moléculas de ADN como de ARN.

Entre los elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ADN se incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, y una señal de poliadenilación. Además, a menudo se requieren intensificadores para la expresión génica. Es necesario que esos elementos estén conectados operablemente a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores sean operables en el individuo al cual son administrados.

Generalmente se considera que los codones de iniciación y el codón de parada son parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. No obstante, es necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo al cual se administra el constructo génico. Los codones de iniciación y terminación deben estar en marco con la secuencia codificadora.

Los promotores y las señales de poliadenilación utilizados deben ser funcionales en las células del individuo.

Entre los ejemplos de los promotores útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, se incluyen, pero no están limitados a los promotores del Virus de Simios 40 (SV40), el promotor del Virus del Tumor Mamario de Ratón (MMTV), el promotor del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) tal como el de las Largas Repeticiones Terminales (LTR), el del Virus de Moloney, ALV, de Citomegalovirus (CMV) tal como el promotor temprano inmediato de CMV, el del Virus Epstein Barr (EBV), el del Virus del Sarcoma de Rous (RSV) así como los promotores de genes humanos tales como el de la Actina Humana, la Miosina Humana, la Hemoglobina Humana, la creatina del músculo humano y la metalotioneína humana.

Entre los ejemplos de las señales de poliadenilación útiles para poner en práctica la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, se incluyen pero no están limitados a las señales de poliadenilación de SV40 y las señales de poliadenilación de LTR. En particular, se utiliza la señal de poliadenilación de SV40 que está en el plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA), referida como señal de poliadenilación de SV40.

Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión del ADN, también se pueden incluir otros elementos en la molécula de ADN. Entre tales elementos adicionales se incluyen los intensificadores. El intensificador puede ser seleccionado del grupo que incluye pero no limitado a: Actina humana, Miosina humana, Hemoglobina humana, creatina de músculo humano e intensificadores virales tales como los de CMV, RSV y EBV.

Los constructos genéticos pueden ser proporcionados con el origen de replicación de mamífero con el fin de mantener el constructo extracromosómicamente y producir múltiples copias del constructo en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificadora EBNA-1 del antígeno nuclear que produce la replicación episómica de elevado número de copias sin integración.

En algunas realizaciones preferidas, el vector utilizado se selecciona entre los descritos en el Ejemplo 46. En los aspectos de la invención referentes a la terapia génica, se prefieren los constructos con orígenes de replicación que incluyen el antígeno necesario para la activación.

En algunas realizaciones preferidas relacionadas con las aplicaciones de la inmunización, el constructo genético contiene secuencias de nucleótidos que codifican una proteína diana y adicionalmente incluyen genes para proteínas que intensifican la respuesta inmune frente a tales proteínas diana. Los ejemplos de tales genes son aquellos que codifican citoquinas y linfoquinas tales como el interferón á, el interferón gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL1-, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. En algunas realizaciones, se prefiere que el gen para GM-CSF esté incluido en constructos genéticos utilizados para las composiciones inmunizadoras.

Se puede añadir un elemento adicional que sirva como diana para la destrucción celular si fuera deseable eliminar las células que reciben el constructo genético por cualquier razón. Se puede incluir en el constructo genético un gen de la timidina quinasa (tk) de herpes en una forma expresable. Se puede administrar el fármaco ganciclovir al individuo y ese fármaco ocasionará la eliminación selectiva de cualquier célula productora de tk, proporcionando, de ese modo, el medio para la destrucción selectiva de las células con el constructo genético.

Con el fin de maximizar la producción de proteína, se pueden seleccionar secuencias reguladoras que estén bien adaptadas para la expresión génica en las células a las que se ha administrado el constructo. Por otra parte, se pueden seleccionar codones que se transcriban muy eficazmente en la célula. Aquel que posea el conocimiento práctico de la técnica puede producir constructos de ADN que sean funcionales en las células.

Con el fin de someter a ensayo la expresión, los constructos genéticos pueden ser sometidos a ensayo en cuanto a los niveles de expresión in vitro utilizando el cultivo de tejidos de células del mismo tipo que las que se van a administrar. Por ejemplo, si la vacuna genética se va a administrar a las células de músculo humano, se pueden utilizar células de músculo desarrolladas en cultivo tales como células de tumores musculares sólidos de rabdomiosarcoma como modelo in vitro para medir el nivel de expresión.

Los constructos genéticos utilizados en la presente invención no son incorporados dentro de partículas retrovirales. Los constructos genéticos son absorbidos por la célula sin inserción mediada por partículas retrovirales tal como la que ocurre cuando partículas retrovirales con ARN retroviral que está incorporado a las partículas retrovirales infectan una célula. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "libre de partículas retrovirales" haga referencia a constructos genéticos que no estén incorporados a partículas retrovirales. Según se utiliza aquí, se pretende que "disociado de un agente infeccioso" haga referencia a material genético que no es parte de un vector viral, bacteriano o eucariótico, ya sea activo, inactivado, vivo o muerto, que sea susceptible de infectar una célula.

En algunas realizaciones, los constructos genéticos constituyen menos de un genoma viral replicable, completo de manera que tras la introducción en la célula, el constructo genético posee información genética insuficiente para dirigir la producción de partículas virales infecciosas. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "genoma viral incompleto" haga referencia a un constructo genético que contiene menos de un genoma completo de tal manera que la incorporación de semejante constructo genético a la célula no constituya la introducción de suficiente información genética para la producción de virus infecciosos.

En algunas realizaciones, se puede distribuir una vacuna viral atenuada como constructo genético que contiene suficiente material genético para permitir la producción de partículas virales. La distribución de la vacuna atenuada como constructo genético permite un modo más fácil de producir grandes cantidades de producto de inmunización activo puro, seguro.

El constructo genético puede ser administrado con o sin el uso de microproyectiles. Se prefiere que los constructos genéticos de la presente invención puedan ser transmitidos a las células de un individuo libres de partículas sólidas. Según se utiliza aquí, se pretende que la frase "libre de partículas sólidas" haga referencia a un líquido que no contenga ningún microproyectil sólido utilizado como medio de perforar, punzar o atravesar de otro modo la membrana celular de una célula con el fin de crear un puerto para la entrada del material genético en la célula.

La presente invención puede ser utilizada para inmunizar a un individuo frente a todos los patógenos tales como virus, procariotas y organismos eucarióticos patógenos tales como organismos unicelulares patógenos y parásitos multicelulares. La presente invención es particularmente útil para inmunizar a un individuo contra aquellos patógenos que infectan las células y que no están encapsulados tales como virus, y procariotas tales como gonorrea, listeria y shigella. Además, la presente invención también es útil para inmunizar a un individuo contra protozoos patógenos que incluyen una fase en el ciclo vital en la que son patógenos intracelulares. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "patógeno intracelular" haga referencia a un virus u organismo patógeno que, al menos parte de su ciclo reproductivo o celular, existe dentro de una célula huésped y produce allí o hace que se produzcan, proteínas patógenas. En la Tabla 1 se proporciona una lista de algunas de las familias y géneros virales para los cuales se pueden elaborar vacunas según la presente invención. Los constructos de ADN que comprenden secuencias de ADN que codifican los péptidos que comprenden al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo presentado en el antígeno del patógeno tal como los antígenos enumerados en las tablas son útiles en las vacunas. Por otra parte, la presente invención también es útil para inmunizar a un individuo contra otros patógenos incluyendo protozoos patógenos procarióticos y eucarióticos así como parásitos multicelulares tales como los enumerados en la Tabla 2.

Con el fin de producir una vacuna genética para proteger de la infección por patógenos, el material genético que codifica las proteínas inmunogénicas contra las cuales se puede organizar una respuesta inmune protectora debe estar incluido en el constructo genético. Bien infecte el patógeno intracelularmente, para lo que la presente invención es particularmente útil, bien extracelularmente, es poco probable que todos los antígenos del patógeno logren una respuesta protectora. Debido a que el ADN y el ARN son ambos relativamente pequeños y pueden ser producidos relativamente fácilmente, la presente invención proporciona la ventaja adicional de permitir la vacunación con múltiples antígenos patógenos. El constructo genético utilizado en la vacuna genética puede incluir material genético que codifique muchos antígenos patógenos. Por ejemplo, se pueden incluir diversos genes virales en un único constructo proporcionando de ese modo dianas múltiples. Además, muchos inoculantes que se puede distribuir a diferentes células de un individuo pueden ser preparados para que incluyan colectivamente, en algunos casos, un grupo completo o, más preferiblemente, incompleto tal como un grupo casi completo de genes en la vacuna. Por ejemplo, se puede administrar un grupo completo de genes virales utilizando dos constructos que contengan cada uno una mitad diferente del genoma que se administran en diferentes sitios. Así, se puede invocar una respuesta inmune contra cada antígeno sin el riesgo de que un virus infeccioso sea ensamblado. Esto permite la introducción de más de una única diana antigénica y puede eliminar el requerimiento de que los antígenos protectores sean identificados.

La facilidad de manipulación y la naturaleza poco costosa del ADN y el ARN permiten adicionalmente medios más eficaces de rastreo de antígenos protectores. Los genes pueden ser clasificados y sometidos a ensayo sistemáticamente mucho más fácilmente que las proteínas. Se seleccionan los agentes y organismos patógenos para los cuales se está produciendo la vacuna contra los que proteger y se identifica una proteína inmunogénica. En las Tabla 1 y 2 se incluyen listas de algunos de los agentes patógenos y organismos para los cuales se pueden preparar vacunas genéticas para proteger a un individuo de la infección por los mismos. En algunas realizaciones preferidas, los métodos de inmunización de un individuo contra un patógeno están dirigidos contra el HIV, el HTLV o el HBV.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para conferir una respuesta inmune protectora de amplia base frente a células hiperproliferativas que son características en enfermedades hiperproliferativas y a un método de tratamiento de individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "enfermedades hiperproliferativas" haga referencia a aquellas enfermedades y trastornos caracterizados por la hiperproliferación de las células. Entre los ejemplos de las enfermedades hiperproliferativas se incluyen todas las formas de cáncer y psoriasis.

Se ha descubierto que la introducción de un constructo genético que incluya una secuencia de nucleótidos que codifique una proteína asociada a una "célula hiperproliferativa" inmunogénica en las células de un individuo da como resultado la producción de aquellas proteínas en las células vacunadas de un individuo. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "proteína asociada hiperproliferativa" haga referencia a proteínas que están asociadas con una enfermedad hiperproliferativa. Para inmunizar frente a enfermedades hiperproliferativas, se administra un constructo genético que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que está asociada con una enfermedad hiperproliferativa a un individuo.

Con el fin de que la proteína asociada hiperproliferativa sea una diana inmunogénica eficaz, debe ser una proteína que sea producida exclusivamente o a niveles superiores en las células hiperproliferativas en comparación con las células normales. Entre los antígenos diana se incluyen tales proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos que comprenden al menos un epítopo encontrado en tales proteínas. En algunos casos una proteína asociada hiperproliferativa es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a la proteína normal excepto que ésta tiene una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente que da como resultado un epítopo diferente no encontrado en la proteína normal. Entre semejantes proteínas diana se incluyen aquellas que son proteínas codificadas por oncogenes tales como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Además de los productos oncogénicos como antígenos diana, entre las proteínas diana para los tratamientos anti-cáncer y los regímenes protectores se incluyen las regiones variables de los anticuerpos elaborados por los linfomas de las células B y las regiones variables de los receptores de las células T de los linfomas de las células T, que, en algunas realizaciones, también son utilizadas como antígenos diana para las enfermedades autoinmunes. Se pueden utilizar otras proteínas asociadas a tumores como proteínas diana tales como las proteínas que se encuentran a niveles superiores en las células tumorales incluyendo la proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 17-1A y las proteínas de unión a folato.

Si bien la presente invención puede ser utilizada para inmunizar a un individuo contra una o más de la diversas formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para inmunizar profilácticamente a un individuo que está predispuesto a desarrollar un cáncer concreto o que ha tenido un cáncer y por lo tanto es susceptible de recaída. Los avances en genética y tecnología así como en epidemiología permiten la determinación de la probabilidad y la evaluación del riesgo de que un individuo desarrolle un cáncer. Utilizando el rastreo genético y/o las historias sanitarias familiares, es posible predecir la probabilidad que un individuo concreto tiene para desarrollar cualquiera de los diversos tipos de cáncer.

De un modo similar, aquellos individuos que ya han desarrollado un cáncer y que han sido tratados para eliminar el cáncer o están de otro modo en remisión son particularmente susceptibles de recaída o reaparición. Como parte de un régimen de tratamiento, tales individuos pueden ser inmunizados contra el cáncer con que han sido diagnosticados con el fin de combatir la recurrencia. Así, una vez que se sabe que un individuo ha tenido un tipo de cáncer y está en riesgo de recaída, puede ser inmunizado con el fin de preparar su sistema inmune para combatir cualquier futura aparición de cáncer.

La presente invención proporciona composiciones para el tratamiento de individuos que padecen enfermedades hiperproliferativas. La introducción de constructos genéticos sirve como agente inmunoterapéutico, dirigiendo y promoviendo el sistema inmune del individuo a combatir las células hiperproliferativas que producen la proteína diana.

La presente invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de individuos que padecen enfermedades y trastornos autoinmunes confiriendo una respuesta inmune protectora de amplia base contra dianas que están asociadas con la autoinmunidad incluyendo receptores celulares y células que producen anticuerpos dirigidos "contra sí mismas".

Entre las enfermedades autoinmunes mediadas por las células T se incluyen la artritis reumatoide (AR), la esclerosis múltiple (EM), el síndrome de Sjogren, la sarcoidosis, la diabetes melitus dependiente de insulina (DMDI), la tiroiditis autoinmune, la artritis reactiva, la espondilitis anquilosante, la escleroderma, la polimiositis, la dermatomiositis, la psoriasis, la vasculitis, la granulomatosis de Wegener, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por receptores de las células T que se unen a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de las células T lograría una respuesta inmune que incluyera CTL para eliminar esas células T.

En la AR, diversas regiones variables específicas de los receptores de las células T (TCR) que están implicadas en la enfermedad han sido caracterizadas. Entre estas TCR se incluyen V\beta-3, V\beta-14, V\beta-17 y V\alpha-17. Así, la vacunación con un constructo de ADN que codifique al menos una de estas proteínas logrará una respuesta inmune que se dirigirá a las células T implicadas en la AR. Ver: Howell, M.D., y col., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10921-10925; Paliard, X., y col., 1991 Science 253:325-329; Williams, W.V., y col., 1992 J. Clin. Invest. 90:326-333; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.

En la EM, han sido caracterizadas las diversas regiones variables específicas de los TCR que están implicadas en la enfermedad. Entre estos TCR se incluyen V\beta-7 y V\alpha-10. Así, la vacunación con un constructo de ADN que codifica al menos una de estas proteínas logrará una respuesta inmune que se dirigirá a las células T implicadas en la EM. Ver: Wuchepfenning, K.W., y col., 1990 Science 248:1016-1019; Oksenberg, J.R., y col., 1990 Nature 345:344-346; cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.

En la escleroderma, han sido caracterizadas las diversas regiones variables específicas de los TCR que están implicadas en la enfermedad. Entre estos TCR se incluyen V\beta-6, V\beta-8, V\beta-14 y V\alpha-16, V\alpha-3C, V\alpha-7, V\alpha-14, V\alpha-15, V\alpha-16, V\alpha-28 y V\alpha-12. Así, la vacunación con un constructo de ADN que codifica al menos una de estas proteínas logrará una respuesta inmune que se dirigirá a las células T implicadas en la escleroderma.

Con el fin de tratar a los pacientes que padecen una enfermedad autoinmune mediada por las células T, concretamente aquellas para las cuales tiene que ser caracterizada todavía la región variable del TCR, se puede realizar una biopsia sinovial. Se pueden tomar muestras de las células T presentes e identificar la región variable de esos TCR utilizando mecanismos normalizados. Se pueden preparar vacunas genéticas utilizando esta información.

Entre las enfermedades autoinmunes mediadas por las células B se incluyen el Lupus (LES), la enfermedad de Graves, la miastenia grave, la anemia hemolítica autoinmune, la trombocitopenia autoinmune, el asma, la crioglobulinemia, la esclerosis biliar primaria y la anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por los anticuerpos que se unen a los antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con las enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de los anticuerpos podría lograr una respuesta inmune incluyendo los CTL para eliminar aquellas células B que producen el anticuerpo.

Con el fin de tratar a pacientes que padecen una enfermedad autoinmune mediada por las células B, se debe identificar la región variable de los anticuerpos implicados en la actividad autoinmune. Se puede realizar una biopsia y se pueden tomar muestras de los anticuerpos presentes en el sitio de la inflamación. Se puede identificar la región variable de esos anticuerpos utilizando mecanismos normalizados. Se pueden preparar vacunas genéticas utilizando esta información.

En el caso del LES, se cree que un antígeno es el ADN. Así, en pacientes que van a ser inmunizados contra el LES, sus sueros pueden ser rastreados en cuanto a los anticuerpos anti-ADN y se puede preparar una vacuna que incluya constructos de ADN que codifiquen la región variable de semejantes anticuerpos anti-ADN encontrados en los sueros.

Los rasgos estructurales comunes entre las regiones variables de ambos TCR y anticuerpos son bien conocidos. La secuencia de ADN que codifica un TCR concreto o anticuerpo puede ser encontrada generalmente siguiendo métodos bien conocidos tales como los descritos en Kabat, y col., 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest U.S. Deparment of Health and Human Services, Bethesda MD, que se incorpora aquí como referencia. Además, se puede encontrar un método general para clonar regiones variables funcionales a partir de anticuerpos en Chaudhary, V.K., y col., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066, que se incorpora aquí como referencia.

En algunas de las realizaciones de la invención que se refieren a la terapia génica, los constructos génicos contienen o bien genes compensatorios o bien genes que codifican proteínas terapéuticas. Entre los ejemplos de los genes compensatorios se incluye un gen que codifica la distrofina o un fragmento funcional, un gen que compensa el gen defectuoso en pacientes que padecen fibrosis quística, una insulina, un gen que compensa el gen defectuoso en pacientes que padecen ADA, y un gen que codifica el Factor VIII. Entre los ejemplos de los genes que codifican proteínas terapéuticas se incluyen genes que codifican eritropoyetina, interferón, receptor de LDL, GM-CSF, IL-2, IL-4 y TNF. Adicionalmente, se pueden administrar constructos genéticos que codifican componentes de anticuerpos de cadena sencilla que se unen específicamente a sustancias tóxicas.

En algunas realizaciones preferidas, se proporciona el gen de la distrofina como parte de un mini-gen y se utiliza para tratar a individuos que padecen distrofia muscular. En algunas realizaciones preferidas, se proporciona un mini-gen que contiene la secuencia codificadora de una proteína distrofina parcial. Las anomalías de la distrofina son responsables de la Distrofia Muscular de Becker (DMB) más suave y de la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) grave. En la DMB, se elabora distrofina, pero es anómala en tamaño y/o cantidad. El paciente está de leve a moderadamente débil. En la DMD no se elabora proteína y el paciente está unido a una silla a la edad de 13 años y normalmente muere a una edad de 20 años. En algunos pacientes, concretamente aquellos que padecen DMB, la proteína distrofina parcial producida por la expresión de un mini-gen transmitido según la presente invención puede proporcionar una función muscular mejorada.

En algunas realizaciones preferidas, los genes que codifican la IL-2, la IL-4, el interferón o el TNF son transmitidos a células tumorales que o bien están presentes o bien son eliminadas y después reintroducidas en un individuo. En algunas realizaciones, se administra un gen que codifica el interferón gamma a un individuo que padece esclerosis múltiple.

También se pueden distribuir moléculas antisentido y ribozimas a las células de un individuo introduciendo material genético que actúa como molde para copias de semejantes agentes activos. Estos agentes inactivan o interfieren de otro modo en la expresión de los genes que codifican las proteínas cuya presencia no es deseable. Los constructos que contienen secuencias que codifican moléculas antisentido pueden ser utilizados para inhibir o prevenir la producción de proteínas dentro de las células. Así, se puede eliminar o reducir la producción de proteínas tales como los productos de los oncogenes. De un modo similar, las ribozimas pueden desorganizar la expresión génica destruyendo selectivamente el ARN mensajero antes de que sea traducido a proteína. En algunas realizaciones, se tratan células según la invención utilizando constructos que codifican moléculas antisentido o ribozimas como parte de un régimen terapéutico que implica la administración de otros agentes terapéuticos y procedimientos. Los constructos génicos que codifican moléculas antisentido y ribozimas utilizan vectores similares a los utilizados cuando se desea la producción de proteína excepto que la secuencia codificadora no contiene un codón de iniciación para iniciar la traducción del ARN a proteína. En algunas realizaciones, se prefieren los vectores descritos en el Ejemplo 46, particularmente aquellos que contienen un origen de replicación y una forma expresable del antígeno nuclear apropiado.

Las ribozimas son ARN catalíticos que son capaces de autoescindirse o de escindir otra molécula de ARN. Diversos tipos diferentes de ribozimas, tales como cabeza de martillo (hammerhead), horquilla (hairpin), el intrón del grupo I de Tetrahimena, "axhead", y la ARNasa P son conocidos en la técnica. (S. Edington, Biotechnology 1992 10, 256-262). Las ribozimas cabeza de martillo tienen un sitio catalítico que ha sido cartografiado hasta un núcleo de menos de 40 nucleótidos. Diversas enzimas de viroides vegetales y ARN satélites comparten una estructura secundara común y ciertos nucleótidos conservados. Aunque estas ribozimas sirven naturalmente como su propio sustrato, el dominio de la enzima puede ser dirigido a otro ARN sustrato por medio del emparejamiento de bases con secuencias que flanquean el sitio de escisión conservado. Esta capacidad para adaptar el diseño de las ribozimas ha permitido que sean utilizadas para la escisión de ARN específica de la secuencia (G. Paolella y col., EMBO 1992, 1913-1919). Por lo tanto estarán dentro del alcance de un experto en la técnica la utilización de diferentes secuencias catalíticas de diversos tipos de ribozimas, tales como la secuencia catalítica cabeza de martillo y el diseño de las mismas de la manera descrita aquí. Las ribozimas pueden ser diseñadas contra una variedad de dianas incluyendo secuencias de nucleótidos patógenas y secuencias oncogénicas. Entre algunas de las realizaciones preferidas de la invención se incluyen una complementariedad suficiente para redireccionar específicamente el transcrito de fusión abl-bcr a la vez que se mantiene la eficacia de la reacción de escisión.

Según la presente invención, las células se tratan con compuestos que facilitan la absorción de constructos genéticos por las células. Según algunas realizaciones de la presente invención, se tratan células con compuestos que estimulan la división celular y facilitan la absorción de los constructos genéticos. La administración de compuestos que facilitan la absorción de constructos genéticos por las células incluyendo compuestos estimuladores celulares produce una respuesta inmune más eficaz contra la proteína diana codificada por el constructo genético.

Según algunas realizaciones de la presente invención, se administra el constructo genético a un individuo utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. Según algunas realizaciones de la presente invención, el constructo genético es administrado simultáneamente a un individuo intradérmicamente, subcutáneamente e intramuscularmente utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son bien conocidos y ampliamente asequibles. Un experto normal en la técnica puede, siguiendo las presentes enseñanzas, utilizar dispositivos de inyección sin aguja para distribuir material genético a las células de un individuo. Los dispositivos de inyección sin aguja están bien adaptados para la distribución de material genético a todos los tejidos. Son particularmente útiles para distribuir material genético a las células de la piel y el músculo. En algunas realizaciones, se puede utilizar un dispositivo de inyección sin aguja para propulsar un líquido que contenga moléculas de ADN hacia la superficie de la piel de un individuo. El líquido es propulsado a una velocidad suficiente de manera que tras el impacto con la piel el líquido atraviese la superficie de la piel, penetre la piel y el tejido muscular bajo la misma. Así, el material genético es administrado simultáneamente de manera intradérmica, subcutánea e intramuscular. En algunas realizaciones, se puede utilizar un dispositivo de inyección sin aguja para distribuir material genético al tejido de otros órganos con el fin de introducir una molécula de ácido nucleico en las células de ese órgano.

Según la invención, la vacuna genética puede ser administrada directamente al individuo que va a ser inmunizado o ex vivo en células separadas del individuo que son reimplantadas tras la administración. Por cualquier ruta, el material genético es introducido en las células que están presentes en el organismo del individuo. Entre las rutas de administración se incluyen, pero no están limitadas a, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral así como transdérmica o mediante inhalación o supositorio. Entre las rutas de administración preferidas se incluyen la inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. La distribución de constructos génicos que codifican proteínas diana puede conferir inmunidad de la mucosa en individuos inmunizados mediante un modo de administración en el cual el material se presenta en tejidos asociados con la inmunidad mucosal. Así, en algunos ejemplos, el constructo génico es transmitido mediante la administración en la cavidad bucal en la boca de un individuo.

Los constructos genéticos pueden ser administrados por medios que incluyen, pero no están limitados a, jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin aguja, o "pistolas génicas de bombardeo con microproyectiles". Alternativamente, la vacuna genética puede ser introducida mediante diversos métodos en células que se separan del individuo. Entre tales métodos se incluyen, por ejemplo, la transfección ex vivo, la electroporación, la microinyección y el bombardeo con microproyectiles. Una vez que el constructo genético es absorbido por las células, éstas son reimplantadas en el individuo. Se contempla que se puedan implantar de otra manera células no inmunogénicas que tengan constructos genéticos incorporados a ellas en el individuo incluso si las células vacunadas fueran tomadas originalmente de otro individuo.

Las vacunas genéticas según la presente invención comprenden de aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las vacunas contienen de aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las vacunas contienen de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las vacunas contienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las vacunas contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las vacunas contienen aproximadamente 100 microgramos de ADN.

Las vacunas genéticas según la presente invención se formulan según el modo de administración que se vaya a utilizar. Un experto normal en la técnica puede formular fácilmente una vacuna genética que comprenda un constructo genético. En los casos en los que la inyección intramuscular sea el modo de administración elegido, se utiliza preferiblemente una formulación isotónica. Generalmente, entre los aditivos para la isotonicidad se pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Entre los estabilizadores se incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación. Las preparaciones farmacéuticas según la presente invención se proporcionan estériles y libres de pirógeno.

Los constructos genéticos de la invención se formulan o se administran junto con un intensificador de la función del polinucleótido. Los co-agentes preferidos según la presente invención se seleccionan del grupo formado por ésteres de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y sales hidrocloruro de los mismos tales como la familia de anestésicos locales.

El PFE puede ser un compuesto que tenga una de las siguientes fórmulas:

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, m-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, donde el grupo amino de los compuestos de aminobenceno puede ser amino, alquil(C_{1}-C_{5})amino, dialquil(C_{1}-C_{5})(C_{1}-C_{5})amino y las sustituciones de los compuestos sustituidos son halógeno, alquilo C_{1}-C_{5} y alcoxi C_{1}-C_{5};

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{3} es hidrógeno, amina, alquil(C_{1}-C_{5})amina, dialquil-(C_{1}-C_{5})(C_{1}-C_{5})amina;

R^{2} + R^{3} pueden formar un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo sustituido en N con alquilo C_{1}-C_{10};

R^{4} es Ar, R^{2} o alcoxi C_{1}-C_{5}, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido con alcoxi C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo sustituido en N con alquilo C_{1}-C_{10};

R^{5} es C=NH;

R^{6} es Ar, R^{2} o alcoxi C_{1}-C_{5}, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido con alcoxi C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo sustituido en N con alquilo C_{1}-C_{10}; y

R^{7} es Ar, R^{2} o alcoxi C_{1}-C_{5}, un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido con alcoxi C_{1}-C_{10} incluyendo un heterociclo sustituido en N con alquilo C_{1}-C_{10}.

Entre los ejemplos de los ésteres se incluyen: ésteres de ácido benzoico tales como piperocaína, meprilcaína e isobucaína; ésteres de ácido para-aminobenzoico tales como procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína y cloroprocaína; ésteres de ácido meta-aminobenzoico incluyendo metabutamina y primacaína; y ésteres de ácido para-etoxibenzoico tales como paretoxicaína. Entre los ejemplos de las anilidas se incluyen lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína y prilocaína. Entre otros ejemplos de tales compuestos se incluyen dibucaína, benzocaína, diclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, metil-bupivacaína, butasin-picrato, fenacaína, diota, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina, y los bicíclicos derivados botánicamente tales como cocaína, cinamoilcocaína, truxilina y cocaetileno y todos esos compuestos formando complejos con hidrocloruro.

En las realizaciones preferidas, el PFE es la bupivacaína. La diferencia entre la bupivacaína y la mepivacaína es que la bupivacaína tiene un grupo N-butilo en lugar del grupo N-metilo de la mepivacaína. Los compuestos pueden tener en ese N, C_{1}-C_{10}. Los compuestos pueden estar sustituidos con halógeno como la procaína y la cloroprocaína. Se prefieren las anilidas.

La bupivacaína es administrada simultáneamente con el constructo genético. La bupivacaína y el constructo genético pueden ser formulados en la misma composición. La bupivacaína es particularmente útil como agentes estimulador celular en vista de sus muchas propiedades y actividades cuando se administra a un tejido. La bupivacaína promueve y facilita la absorción de material genético por la célula. Como tal, es un agente transfectante. La administración de constructos genéticos junto con bupivacaína facilita la entrada de los constructos genéticos en las células. Se cree que la bupivacaína desorganiza la membrana celular o la hace de otro modo más permeable. La división y la replicación celular son estimuladas por la bupivacaína. Por consiguiente, la bupivacaína actúa como agente replicante. La administración de bupivacaína también irrita y lesiona el tejido. Como tal, actúa como agente inflamatorio que logra la migración y la quimiotaxis de las células inmunes hacia el sitio de la administración. Además de las células normalmente presentes en el sitio de la administración, las células del sistema inmune que migran al sitio en respuesta al agente inflamatorio pueden ponerse en contacto con el material genético administrado y la bupivacaína. La bupivacaína, que actúa como agente de transfección, es asequible para promover también la absorción de material genético por tales células del sistema inmune.

La bupivacaína está relacionada químicamente y farmacológicamente con los anestésicos locales aminoacílicos. Es un homólogo de la mepivacaína y está relacionada con la lidocaína. La bupivacaína vuelve el tejido muscular sensible al voltaje en la prueba con sodio y lleva a cabo la concentración de iones sodio dentro de las células. Se puede encontrar una descripción completa de las actividades farmacológicas de la bupivacaína en Ritchie, J.M. y N.M. Greene, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds.: Gilman, A.G. y col., 8ª Edición, Capítulo 15:3111, que se incorpora aquí como referencia. La bupivacaína y los compuestos que presentan una similitud funcional con la bupivacaína son preferidos en el método de la presente invención.

La bupivacaína-HCl es denominada químicamente 2-piperidinocarboxamida, 1-butil-N-(2,6-dimetilfenil)-monohidrocloruro, monohidrato y es ampliamente asequible comercialmente para usos farmacéuticos de muchas fuentes incluyendo de Astra Pharmaceutical Products Inc. (Westboro, MA) y Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (Nueva York, NY), Eastman Kodak (Rochester, NY). La bupivacaína es formulada comercialmente con o sin metilparabeno y con o sin epinefrina. Se puede utilizar cualquiera de tales formulaciones. Es asequible comercialmente para uso farmacéutico a concentraciones del 0,25%, 0,5% y 0,75% que pueden ser utilizadas en la invención. Si se desea se pueden preparar concentraciones alternativas, concretamente aquellas entre el 0,05% y el 1,0% que logran efectos deseables. Según la presente invención, se administran de aproximadamente 250 \mug a aproximadamente 10 mg de bupivacaína. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 250 \mug a aproximadamente 7,5 mg. En algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 5,0 mg. En algunas realizaciones se administran de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 3,0 mg. En algunas realizaciones se administran de aproximadamente 5 a 50 \mug. Por ejemplo, en algunas realizaciones se administran de aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 2 ml, preferiblemente de aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 1500 \mul y más preferiblemente aproximadamente 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en un portador farmacéutico isotónico en el mismo sitio de la vacuna antes, simultáneamente o después de administrar la vacuna. De un modo similar, en algunas realizaciones, se administran de aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 2 ml, preferiblemente de 50 \mul a aproximadamente 1.500 \mul y más preferiblemente aproximadamente 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% en un portador farmacéutico isotónico en el mismo sitio que la vacuna antes, simultáneamente o después de administrar la vacuna. La bupivacaína y cualquier otro compuesto que actúe similarmente, concretamente aquellos de la familia afín de anestésicos locales pueden ser administrados a concentraciones que proporcionan la facilitación deseada de la absorción de los constructos genéticos por las células.

En algunas realizaciones de la invención, el individuo es sometido primero a inyección de bupivacaína antes de la vacunación genética mediante inyección intramuscular. Esto es, hasta, por ejemplo, aproximadamente una semana a diez días antes de la vacunación, el individuo es inyectado primero con bupivacaína. En algunas realizaciones, antes de la vacunación, el individuo es inyectado con bupivacaína aproximadamente 1 a 5 días antes de la administración del constructo genético. En algunas realizaciones, antes de la vacunación, el individuo es inyectado con bupivacaína aproximadamente 24 horas antes de la administración del constructo genético. Alternativamente, la bupivacaína puede ser inyectada simultáneamente, minutos antes o después de la vacunación. Por consiguiente, la bupivacaína y el constructo genético pueden ser combinados e inyectados simultáneamente en forma de mezcla. En algunas realizaciones, la bupivacaína es administrada tras la administración del constructo genético. Por ejemplo, hasta aproximadamente una semana a diez días después de la administración del constructo genético, el individuo es inyectado con bupivacaína. En algunas realizaciones, el individuo es inyectado con bupivacaína aproximadamente 24 horas después de la vacunación. En algunas realizaciones, el individuo es inyectado con bupivacaína aproximadamente 1 a 5 días después de la vacunación. En algunas realizaciones, se administra la bupivacaína al individuo hasta aproximadamente una semana a diez días después de la vacunación.

Entre otros agentes que pueden funcionar como agentes transfectantes y/o agentes replicantes y/o agentes inflamatorios y que pueden ser administrados simultáneamente con la bupivacaína y compuestos de acción similar se incluyen lectinas, factores de crecimiento, citoquinas y linfoquinas tales como el interferón \alpha, el interferón gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12 así como también se pueden administrar junto con el constructo genético colagenasa, factor de crecimiento de fibroblastos, estrógeno, dexametasona, saponinas, agentes tensioactivos tales como los complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), coadyuvante incompleto de Freund, análogos de LPS incluyendo monofosforil Lípido A (MPL), muramil-péptidos, análogos de quinona y vesículas tales como el escualeno y el escualeno, el ácido hialurónico y la hialuronidasa. En algunas realizaciones, se administran junto con la bupivacaína y el constructo genético combinaciones de estos agentes. Por ejemplo, la bupivacaína y el ácido hialurónico o la hialuronidasa se administran simultáneamente con un constructo genético.

El constructo genético puede ser combinado con colágeno en forma de emulsión y transmitido parenteralmente. La emulsión de colágeno proporciona un método para la liberación sostenida del ADN. Se utilizan de 50 \mul a 2 ml de colágeo. Se combinan aproximadamente 100 \mug de ADN con 1 ml de colágeno en una realización preferida utilizando esta formulación. Otras formulaciones de liberación sostenida tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia modelo en este campo, que se incorpora aquí como referencia. Entre tales formulaciones se incluyen suspensiones acuosas, soluciones y suspensiones oleosas, emulsiones e implantes así como reservorios y dispositivos transdérmicos. En algunas realizaciones, se prefieren formulaciones de liberación con el tiempo para los constructos genéticos. En algunas realizaciones, se prefiere que el constructo genético se libere con el tiempo entre 6 y 144 horas, preferiblemente 12-96 horas, más preferiblemente 18-72 horas.

En algunas realizaciones de la invención, el constructo genético es inyectado con un dispositivo de inyección sin aguja. Los dispositivos de inyección sin aguja son particularmente útiles para la administración simultánea del material intramuscularmente, intradérmicamente y subcutáneamente.

En algunas realizaciones de la invención, el constructo genético es administrado con un PFE por medio un procedimiento de bombardeo con microproyectiles como ilustran Sanford y col. en la Patente de los Estados Unidos 4.945.050 expedida el 31 de Julio de 1990, que se incorpora aquí como referencia.

En algunas realizaciones de la invención, el constructo genético es administrado como parte de un complejo liposómico con un agente intensificador de la función del polinucleótido.

En algunas realizaciones de la invención, el individuo está sujeto a una única vacunación para producir una respuesta inmune amplia, completa. En algunas realizaciones de la invención, el individuo está sujeto a una serie de vacunaciones para producir una respuesta inmune amplia, completa. Según algunas realizaciones de la invención, se administran al menos dos y preferiblemente cuatro a cinco inyecciones a lo largo de un período de tiempo. El período de tiempo entre inyecciones puede incluir de 24 horas a dos semanas o más entre inyecciones, preferiblemente una semana. Alternativamente, al menos dos y hasta cuatro inyecciones separadas se administran simultáneamente en diferentes sitios.

En algunas realizaciones de la invención, una vacunación completa incluye la inyección de un único inoculante que contiene un constructo genético incluyendo secuencias que codifican uno o más epítopos redireccionados.

En algunas realizaciones de la invención, se incluye una vacunación completa de dos o más inoculantes diferentes en sitios diferentes. Por ejemplo, en una vacuna de HIV según la invención, la vacuna comprende dos inoculantes en los que cada uno comprende material genético que codifica diferentes proteínas virales. Este método de vacunación permite la introducción de un grupo completo de genes virales en el individuo sin el riesgo de ensamblaje de una partícula viral infecciosa. Así, se puede invocar una respuesta inmune contra la mayor parte o todo el virus en el individuo vacunado. La inyección de cada inoculante se realiza en diferentes sitios, preferiblemente a una distancia que asegure que no hay células que reciban ambos constructos genéticos. Como una precaución de seguridad adicional, algunos genes pueden ser suprimidos o alterados para evitar adicionalmente la capacidad de ensamblaje de viriones infecciosos.

Las composiciones y usos de la presente invención son útiles en los campos de la medicina tanto humana como veterinaria. Por consiguiente, la presente invención hace referencia a mamíferos, pájaros y peces. Los métodos de la presente invención pueden ser particularmente útiles para especies de mamíferos incluyendo las especies humana, bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina.

Entre los Ejemplos expuestos más abajo se incluyen ejemplos representativos de aspectos de la presente invención. No se pretende que los ejemplos limiten el alcance de la invención sino que tengan fines ejemplares. Además, se pueden resumir diversos aspectos de la invención por medio de la siguiente descripción. Sin embargo, no se pretende que esta descripción limite el alcance de la invención sino que más bien subraye los diversos aspectos de la invención. Un experto normal en la técnica puede apreciar fácilmente los aspectos adicionales y las realizaciones de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1

La presente invención proporciona una vacuna contra el HIV en la que se utiliza la inmunización genética directa. Se proporcionan constructos genéticos que, cuando son transmitidos a las células de un individuo, son expresados para producir proteínas del HIV. Según algunas realizaciones, la producción de todas las proteínas estructurales virales en las células de un individuo logran una respuesta inmune protectora que protege frente a la infección por HIV. La vacuna contra el HIV de la presente invención puede ser utilizada para inmunizar individuos no infectados frente a la infección por HIV o servir como agente inmunoterapéutico para aquellos individuos ya infectados. La vacuna contra el HIV de la presente invención invoca una respuesta inmune que incluye CTL que reconocen y atacan las células infectadas por el HIV y reconocen el contingente más amplio de proteínas de HIV. Así, los individuos no infectados son protegidos de la infección por el HIV.

En algunas realizaciones, la presente invención hace referencia a la inmunización de un individuo frente al HIV administrando dos inoculantes. Estos dos inoculantes comprenden al menos dos y preferiblemente más de dos, una pluralidad o todos los genes del virus HIV. No obstante, los inoculantes no son transmitidos juntos. Por consiguiente, a la célula inoculada no se le administrará un complemento completo de genes. El individuo vacunado recibirá al menos dos diferentes y preferiblemente más de dos, más preferiblemente una pluralidad o todos los genes virales. Las respuestas inmunes pueden ser dirigidas después al complemento total de las proteínas diana del HIV.

Esta estrategia aumenta la probabilidad de que el material genético que codifica la proteína diana más eficaz sea incluido en la vacuna y reduce la probabilidad de que una partícula viral escape a la detección por la respuesta inmune a pesar de los cambios estructurales en una o más proteínas virales que se producen cuando el virus experimenta una mutación. Por consiguiente, es deseable vacunar a un individuo con múltiples y preferiblemente un complemento casi completo o completo de genes que codifican las proteínas virales.

Si se proporciona a una única célula un complemento completo de genes virales, es posible que se pueda ensamblar un virus infeccioso completo dentro de la célula. Por consiguiente, no se proporciona un constructo genético según la presente invención con semejante complemento de genes. Además, dos o más inoculantes cada uno con un grupo incompleto de genes y combinados hasta tener un complemento completo de genes virales, son administrados a diferentes células, preferiblemente en sitios distantes entre sí para asegurarse de que las células no vacunadas serán expuestas por descuido a un grupo completo de genes. Por ejemplo, se puede insertar una porción del genoma de HIV en un primer constructo e insertar la porción restante del genoma del HIV en un segundo constructo. El primer constructo es administrado a un individuo en forma de vacuna genética en el tejido muscular de un brazo mientras el segundo constructo es administrado al individuo en forma de una vacuna genética en el tejido muscular del otro brazo del individuo. El individuo puede ser expuesto a un grupo completo de genes virales; vacunando de ese modo esencialmente contra el virus completo pero sin riesgo de que se ensamble una partícula viral infecciosa.

Como medida de seguridad adicional, incluso cuando el material genético es transmitido por medio de dos o más inoculantes en partes distantes del organismo del individuo, se pueden suprimir o alterar intencionadamente uno o más genes esenciales para asegurarse adicionalmente de que no se puede formar una partícula viral infecciosa. En tales realizaciones, no se administra al individuo un grupo de genes virales funcional completo.

Una medida de seguridad adicional proporciona porciones no solapantes del genoma viral en constructos genéticos separados que componen los inoculantes separados respectivamente. Por consiguiente, se evita la recombinación entre dos constructos genéticos.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un complemento completo de genes estructurales. Los genes estructurales del HIV constan de gag, pol y env. Estos tres genes son proporcionados en dos constructos de ADN o ARN diferentes. Por consiguiente, en una realización preferida, gag y pol están en un constructo de ADN o ARN y env está en otro. En otra realización preferida, gag está en un constructo de ADN o ARN y pol y env están en el otro. En otra realización preferida, gag y env están en un constructo de ADN o ARN y pol está en el otro. En algunas realizaciones preferidas, los constructos que contienen rev tienen un aceptor de empalme aguas arriba del codón de inicio para rev. En algunas realizaciones preferidas, los constructos que contienen gag tienen un donador de empalme aguas arriba del codón de inicio de la traducción gag. Opcionalmente, en cualquiera de estas combinaciones, también pueden estar presentes los genes reguladores de HIV. Los genes reguladores del HIV son: vpr, vif, vpu, nef, tat y
rev.

En una realización preferida el constructo de ADN consta de un promotor, un intensificador y una señal de poliadenilación. El promotor puede ser seleccionado del grupo formado por: LTR de HIV, Actina humana, Miosina humana, CMV, RSV, Moloney, MMTV, Hemoglobina humana, creatina muscular humana y EBV. El intensificador puede ser seleccionado del grupo formado por: Actina humana, Miosina humana, CMV, RSV, Hemoglobina humana, creatina muscular humana y EBV. La señal de poliadenilación puede ser seleccionada del grupo formado por: la señal de poliadenilación de LTR y la señal de poliadenilación de SV40, concretamente la señal de poliadenilación menor de SV40 entre otras.

En algunas realizaciones, la vacuna de dos inoculantes es administrada intramuscularmente en tejidos espacialmente segregados del individuo, preferiblemente en diferentes apéndices, tal como por ejemplo en los brazos derecho e izquierdo. Cada inoculante de la presente invención puede contener de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1.000 microgramos de ADN. Preferiblemente, cada inoculante contiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. Más preferiblemente, cada inoculante contiene de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. Muy preferiblemente, cada inoculante contiene aproximadamente 100 microgramos de ADN.

En algunas realizaciones el inoculante es un portador isotónico estéril, preferiblemente solución salina tamponada con fosfato o solución salina.

Un agente de proliferación celular, preferiblemente bupivacaína se incluye en la formulación junto con el constructo genético. De aproximadamente 50 \mul a aproximadamente 2 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y de metilparabeno en NaCl isotónico al 0,1% se administran en el sitio en el que se va a administrar la vacuna, preferiblemente, de 50 \mul a aproximadamente 1.500 \mul, más preferiblemente aproximadamente 1 ml.

Por consiguiente, algunas realizaciones comprenden una vacuna de dos inoculantes: un inoculante comprende un constructo de ADN o ARN que tiene dos genes estructurales de HIV, el otro inoculante comprende un constructo de ADN o ARN que tiene el tercer gen estructural del HIV restante de manera que los inoculantes combinados contienen un complemento completo de los genes estructurales del HIV. Los genes estructurales de cada constructo de ADN están conectados operablemente a un promotor, un intensificador y una señal de poliadenilación. Los mismos o diferentes elementos reguladores pueden controlar la expresión de los genes virales. Cuando se vacuna a un individuo, se administran los dos inoculantes intramuscularmente en diferentes sitios, preferiblemente en diferentes brazos. En algunas realizaciones de la invención, se incluye bupivacaína en las formulaciones junto con los constructos genéticos.

En algunas realizaciones, el procedimiento de vacunación se repite al menos una vez y preferiblemente dos o tres veces. Cada procedimiento de vacunación se realiza con una separación de 24 horas a 2 meses.

En algunas realizaciones, la vacuna se administra utilizando un dispositivo de inyección sin aguja. En algunas realizaciones, la vacuna se administra hipodérmicamente utilizando un dispositivo de inyección sin aguja proporcionando de ese modo una administración intramuscular, intradérmica, subcutánea simultáneamente a la vez que también se administra el material intersticialmente.

Entre los constructos genéticos preferidos se incluyen los siguientes.

Plásmidos y Estrategias de Clonación

Se construyeron dos plásmidos: uno que contiene gag/pol de HIV y el otro que contiene env de HIV.

Se obtuvo el clon genómico de HIV-1 pNL43 a través del NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (ARRRP), Division of AIDS, NIAID, NIH, del Dr. Malcolm Martin, y se puede utilizar como material de partida para los genes virales de HIV-1 para los constructos genéticos. Alternativamente, se puede modificar cualquier clon molecular de HIV de células infectadas, por medio del uso de la tecnología de la cadena de polimerasa, suficientemente para la construcción incluyendo el clon HXB2, el clon MN así como el clon SF o BAL-1. El clon pNL43 es un constructo que consta de ADN proviral de HIV-1 más 3 kb de la secuencia del huésped desde el sitio de integración clonado en pUC18.

Construcción del plásmido pNL-puro-env^{-}

Este plásmido fue construido para la expresión de gag pol. El sitio StuI del ADN humano que flanquea la región 5' que no es de HIV fue destruido mediante digestión parcial con StuI seguido de la digestión de los tres extremos libres con polimerasa 1 de E. coli. El plásmido lineal fue rellenado y después autoligado, dejando un único sitio StuI en el genoma de HIV. Este plásmido, pNLDstu, fue digerido después con las enzimas para formar extremos romos StuI y BsaBI que eliminaban una gran sección de la secuencia codificadora de gp120. El promotor SV40 y la región codificadora de la resistencia a puromicina (puromicin acetil transferasa (PAC)) fueron aislados de pBABE-puro (Morgenstern y Land, 1990 Nucl. Acids. Res. 18(12):3587-3596, que se incorpora aquí como referencia, amablemente proporcionado por el Dr. Hartmunt Land of the Imperial Cancer Research Fund) utilizando EcoRI y ClaI. Los extremos de este fragmento se volvieron romos, después se clonó en pNLDstu digerido con StuI/BsaBI. Se seleccionó un clon con el fragmento puro de SV40 en la orientación correcta de manera que la LTR 3' de HIV pudiera proporcionar funciones poli A al mensaje de la PAC. Este plásmido fue denominado pNLpuro.

Estrategia de clonación para la deleción del gen regulador vpr del vector gag pol de HIV

Una región desde inmediatamente aguas arriba del sitio PflMI único hasta inmediatamente después del codón de terminación vif fue amplificada por medio de PCR utilizando cebadores que se introducían un cambio de aminoácidos no conservativo (glu \rightarrow val) en el aminoácido 22 de vpr, un codón de parada en el marco de lectura de vpr inmediatamente después del aminoácido 22, y un sitio EcoRI inmediatamente después del nuevo codón de parada. Este fragmento de PCR fue sustituido por el fragmento PflMI-EcoRI de pNLpuro o pNL43. Esta sustitución producía la deleción de 122 nucleótidos del marco de lectura abierto de vpr, eliminando así la posibilidad de reversión que supone una estrategia de mutación puntual. Los plásmidos resultantes, pNLpuro\Deltavpr, codifican los primeros 21 aminoácidos naturales de vpr más una valina más todos los demás genes de HIV-1 restantes y las uniones de empalme en su forma nativa. Semejante estrategia de deleción también sería aplicable a nef, vif, y vpu y permite la expresión del gen estructural pero protege de la generación de un virus recombinante vivo.

Construcción de plásmidos para la expresión de la envuelta

El segmento de ADN que codifica el gen de la envuelta de HIV-1 HXB2 fue clonado mediante la técnica de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el ADN clonado en lambda obtenido del AIDS Research and Reference Reagent Program. Las secuencias de los cebadores 5' y 3' son 5'-AGGCGTCTCGAGA
CAGAGGAGAGCAAGAAATG-3' (SEC ID NUM: 1) con la incorporación del sitio XhoI y 5'-TTTCCCTCTAGA
TAAGCCATCCAATCACAC-3' (SEC ID NUM: 2) con la incorporación del sitio XbaI, respectivamente, que abarca la región codificadora de gp160, tat y rev. La amplificación específica del gen fue realizada utilizando la ADN polimerasa de Taq según las instrucciones del fabricante (Perkin-Elmer Cetus Corp.). Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa fueron tratados con 0,5 \mug/ml de proteinasa K a 37ºC durante 30 minutos seguido de una extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. El ADN recuperado fue digerido después con XhoI y XbaI durante dos horas a 37ºC y sometido a electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de la PCR XhoI-XbaI aislado y purificado fue clonado en el plásmido Bluescript (Stratagene Inc., La Jolla, CA) y después subclonado en el vector de expresión eucariótico pMAMneoBlue (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). El constructo resultante fue denominado pM160 (Figura 1A). El ADN plasmídico fue purificado mediante centrifugación con gradiente de CsCl. El constructo de ADN pM160 codifica la glicoproteína unida a membrana gp160 de HIV-1/HXB2 (Fisher, A.G., y col., (1985) Nature 316:262-265) bajo el control del elemento intensificador RSV con LTR de MMTV como promotor.

Construcción del plásmido de expresión de la envuelta alternativo denominado plásmido env-rev de HIV-1

La reacción que codifica los dos exones de rev y los marcos de lectura abiertos de vpu y de la envuelta de HIV-1 HXB2 fue amplificada mediante PCR y clonada en el vector de expresión pcNDA/neo (Invitrogen). Este plásmido dirige la producción de la envuelta a través del promotor de CMV.

Producción y Purificación

El plásmido en E. coli (DH5 alfa) se hace crecer como sigue: Se raya una placa de agar LB más ampicilina con el cultivo del plásmido deseado a partir de la solución de partida congelada. La placa se incuba durante la noche (14-15 horas) a 37ºC. Se toma una única colonia de la placa y se inocula en 15 ml de medio LB con una preparación de peptona y 50 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo se desarrolla a 37ºC mientras se sacude (aprox. 175 rpm) durante 8-10 horas. Las lecturas de la DO_{600} deben ser de al menos 1,0. Se inocula 1 litro de medio LB con peptona y 50 \mug/ml de ampicilina con una D.O del cultivo de 1. Estos dos cultivos de 1-2 litros se desarrollan durante la noche a 37ºC mientras se sacuden (175 rpm).

Los plásmidos desarrollados en E. coli (cepa DH5 alfa) son cosechados y purificados mediante los siguientes métodos. Los procedimientos generales para la lisis de las células y la purificación del plásmido se pueden encontrar en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª Edición, J. Sambrook, E.F. Fritsch, y Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989. Las células se concentran y se lavan con tampón glucosa-tris-EDTA pH 8,0. Las células concentradas son sometidas a lisis mediante tratamiento con lisozima y tratadas brevemente con KOH 0,2 N, el pH es ajustado después a 5,5 con tampón acetato de potasio/ácido acético. El material insoluble es separado por centrifugación. Al sobrenadante se añade 2-propanol para precipitar el plásmido. El plásmido es redisuelto en tampón tris-EDTA y adicionalmente purificado mediante extracción con fenol/cloroformo y una precipitación adicional con 2-propanol.

La endotoxina puede ser separada opcionalmente mediante una variedad de métodos incluyendo los siguientes: adsorción específica mediante materiales inmunizados tales como polimixina (Tani y col., Biomater, Artif. Cells Immobilization Biotechnol. 20(2-4):457-62 (1992); Issekutz, J. Immunol. Methods 61(3):275-81 (1983)); anticuerpos monoclonales anti-endotoxinas, tales como 8A1 y HA-1A® (Centocor, Malvern, PA; Bogard y col. J. Immunol. 150(10):4438-4449 (1993); Rietschel y col., Infect. Immunity página 3863 (1993)); filtros profundos cargados positivamente (Hou y col., J. Parenter. Sci. Technol. 44(4):204-9 (Julio-Agosto 1990)); poli(gamma-metil-L-glutamato), Hyrayama y col., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 40(8):2106-9 (1992)); histidina (Matsumae y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 12(2):129-40 (1990)); columnas y membranas de interacción hidrófoba (Aida y col., J. Immunol Methods 132(2):191-5 (1990); Umeda y col., Biometer. Artif Cells Artif Organs 18(4):491-7 (1990); Hou y col., Biochem. Biophys. Acta 1073(1):149-54 (1991); Sawada y col., J. Hyg. (Londres) 97(1):103-14 (1986)); resinas hidrófobas específicas útiles para separar endotoxinas incluyendo resinas de poliestireno/divinilbenceno o divinilbenceno hidrófobas tales como Brownlee Polypore Resin (Applied Biosystems, Palo Alto, CA); XUS 40323.00 (Dow Chemical, Midland, MI); HP20, CHP20P (Mitsubishi Kasei, U.S.); Hamilton PRP-1, PRP-infinity (Hamilton, Reno, NV); Jordi Reversed-Phase DVB, Jordi Gel DVB, Plymer Labs PLgel® (Alltech, Deerfield, IL); Vydac PLx® (Separations Group, Hesperia, CA); entre otros materiales y métodos para eliminar endotoxinas se incluyen Detoxi-Gel® Endotoxin Removing Gel (Pierce Chemical, Rockford, IL); Application Note 206, (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ). Ver también generalmente, Sharma, Biotech. App. Biochem. 8:5-22 (1986). Los anticuerpos monoclonales anti-endotoxinas se unen a los dominios conservados de la endotoxina, preferiblemente anticuerpos para el lípido A, la porción más conservada estructuralmente de la molécula de endotoxina. Entre tales anticuerpos monoclonales anti-lípido A se incluyen el anticuerpo monoclonal IgG murino de elevada afinidad 8A1 y el anticuerpo monoclonal IgM(k) anti-lípido A humano HA-1A®. El HA-1A® derivaba de una vacuna de E. coli J5 humana B. HA-1A®. Se ha informado que el HA-1A® presenta una amplia reactividad cruzada con una variedad de endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos).

Ejemplo 2

En experimentos diseñados para comparar la respuesta inmunogénica lograda mediante vacunación genética y vacunación con proteína, se diseñaron modelos animales utilizando células tumorales que expresaban específicamente una proteína diana foránea. Se han desarrollado tres modelos de ratón inmunocompetente que expresan antígenos foráneos. Se utilizan tres líneas de células tumorales clónicas que derivan de la cepa de ratón Balb/c. Las líneas celulares son: 1) una línea de células linfoides que no produce metástasis significativamente en otros tejidos pero forma grandes tumores palpables que parecen destruir al animal en un período de 8-12 semanas; 2) una línea celular de melanoma murino con cierta capacidad para producir metástasis, en su mayor parte en el pulmón, y que, tras la inoculación con 1 millón de células, da como resultado el desarrollo en ratones de grandes tumores palpables que de un modo similar destruirán al animal en 10-12 semanas; y 3) una línea celular de adenocarcinoma de pulmón murino que produce metástasis en múltiples tejidos y destruye al animal en 12 semanas o más. Se han seleccionado subclones que pueden presentar antígenos foráneos en una forma no reconocida. Cuando los tumores transfectados se implantan en una cepa de ratón parental, a diferencia de la mayoría de las líneas tumorales murinas similares, los animales no elaboran una respuesta inmune protectora a los antígenos foráneos presentados y los tumores son aceptados. Estos tumores destruirán después al animal con el mismo fenotipo en el mismo marco temporal que el tumor no transfectado original. Utilizando estos modelos, se puede medir la respuesta inmune lograda mediante la vacunación genética contra un antígeno.

Se observó que los ratones vacunados con una vacuna genética que comprendía un constructo genético que daba como resultado la producción de la proteína diana por las células del ratón lograban una respuesta inmune que incluía un fuerte efecto citotóxico que eliminaba completamente los tumores que presentaban la proteína diana pero sin efecto sobre los tumores que no lo hacían. En los ratones inoculados con la propia proteína diana, la respuesta inmune lograda de ese modo era mucho menos efectiva. Se reducía el tamaño de los tumores, pero debido a una ausencia de respuesta citotóxica, éstos no eran eliminados. Como controles, se utilizaron tumores no transfectados en experimentos que comparaban la respuesta inmune de animales vacunados con la vacuna genética, con la vacuna de subunidades y animales no vacunados. Estos experimentos demuestran claramente que la vacuna genética producía una respuesta inmune más eficaz, más amplia que era susceptible, en virtud de los CTL, de eliminar completamente los tumores. En contraste, la inmunización utilizando proteína diana intacta producía una respuesta inmune menos eficaz, más limitada.

Ejemplo 3

En otra realización de la invención, se ha diseñado una vacuna genética contra el HIV. La proteína viral gp160, que es transformada en gp120 y gp 41, es la proteína diana contra la cual se produce una vacuna genética. La vacuna genética contiene un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica gp160 conectada operablemente a secuencias reguladoras. Cuando se administra a un individuo, el constructo de ADN de la vacuna genética es incorporado a las células del individuo y la gp160 es producida. La respuesta inmune que se logra por medio de la proteína es de base amplia e incluye la respuesta inmune humoral y ambos brazos de la celular. La respuesta biológica amplia proporciona una protección superior a la lograda cuando se administra la propia proteína.

Se inyectó intramuscularmente a los ratones pM160, descrito en el Ejemplo 1, y con posterioridad se analizó en cuanto a las respuestas inmunes anti-HIV. Los antisueros de los animales inmunizados de esta manera producen respuestas inmunes anti glicoproteína de la envuelta de HIV como se mide mediante un análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) y análisis de inmunoprecipitación. Los antisueros neutralizan la infección por HIV-1 e inhiben la formación de sincitios inducida por HIV-1.

La neutralización observada y la actividad anti-sincitial pueden ser resultado de la reactividad de los anticuerpos logrados con las regiones funcionalmente importantes de la proteína de la envuelta del HIV-1, tal como el bucle V3 de gp120, el sitio de unión de CD4 y la región "inmunodominante" N-terminal de gp41, entre otras.

En el procedimiento de inmunización genética descrito aquí, se inyectaron 100 \mul de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilarabeno al 0,1% en solución salina isotónica en los músculos cuadriceps de ratones BALB/c utilizando una aguja de calibre 27 para estimular la regeneración de las células musculares y facilitar la absorción del constructo genético. Veinticuatro horas más tarde, se inyectaron en los mismos sitios de la inyección 100 \mug de pM160 o 100 \mug de pMAMneoBlue como plásmido de control (Fig. 1A). Los ratones fueron reforzados inyectando la misma cantidad de constructo de ADN tres veces a intervalos de dos semanas de la misma manera pero sin pretratamiento con bupivacaína-HCl.

Para la inmunización frente a gp160 recombinante, se inmunizaron inicialmente ratones BALB/C con 1 \mug de gp160 recombinante glicosilada (HIV-1/III_{B}) (MicroGeneSys Inc). En coadyuvante completo de Freund seguido de tres refuerzos de 1 \mug de gp160 cada uno en coadyuvante incompleto de Freund a intervalos de dos semanas. Se determinó la producción de anticuerpo contra gp160 de HIV-1 sometiendo a ensayo el suero de ratón en cuanto a su capacidad para inmunoprecipitar la gp160. La inmunoprecipitación se realizó utilizando 1 x 10^{6} cpm de rgp160 marcada con I^{125}, sueros de ratón y cuentas de proteína G-agarosa (GIBCO, Inc.) como han descrito previamente Osther, K., y col., (1991) Hybridoma 10:673-683, que se incorpora aquí como referencia. Las precipitaciones específicas fueron analizadas mediante SDS-PAGE al 10%. La calle 1 es 1 \mul de suero de ratón pre-inmune que se hace reaccionar con gp160-I^{125}. La calle 2 es 1 \mul de suero de ratón inmunizado del ratón inmunizado con pM160. La calle 3 es 1 \mul de dilución 1:100 de anticuerpo anti-gp120 monoclonal ID6 (Ugen, K.E., y col., (1992) Generation of Monoclonal Antibodies Against the Amino Region of gp120 Which Elicits Antibody Dependent Cellular Cytotoxiciy, Cold Spring Harbor Laboratory) como control positivo. La flecha indica la glicoproteína de la envuelta gp160-I^{125} inmunoprecipitada específicamente.

La gp160 marcada con I^{125} fue inmunoprecipitada específicamente con antisueros derivados de animales inmunizados con pM160 (Fig. 2, calle 2) así como el control positivo anticuerpo monoclonal anti-gp120, ID6 (Fig. 2, calle 3). En contraste, los sueros preinmunes (Fig. 2, calle 1) sólo mostraban una actividad mínima en el mismo análisis.

Ocho de los diez ratones inmunizados con el constructo pM160 eran positivos en cuanto a la reactividad contra gp160 como se determinaba mediante ELISA y las respuestas inmunes del animal con el título anti-gp160 más elevado fueron analizadas con detalle. Cuatro ratones inmunizados con el vector de control mostraban todos una reactividad negativa similar para gp160 en el ELISA y uno de estos sueros fue utilizado como control para experimentos posteriores.

Se ha demostrado que los anticuerpos neutralizadores de HIV son dirigidos específicamente a diversos epítopos en gp120 y gp41, que incluyen el bucle V3 de gp120 (Goudsmit, J. y col., (1988) AIDS 2:157-164; y Putney, S.D., y col., (1989) Development of an HIV Subunit Vaccine, Montreal), el sitio de unión a CD4 próximo al extremo carboxi de gp120 (Lasky, L.A., y col., (1987) Cell 50:975-985) así como el bucle inmunodominante de gp41 inmediatamente aguas abajo de la región de fusión N-terminal (Schrier, R.D., y col., (1988) J. Virol. 62:2531-2536).

Para determinar si los anticuerpos anti-gp160 logrados en estos ratones son reactivos con estas importantes regiones de las glicoproteínas de la envuelta, los péptidos para el bucle BRU/V3, los péptidos para el bucle MN/V3, los péptidos para el extremo N de HXB2/gp41 o los péptidos para el sitio de unión a HXB2/CD4 fueron absorbidos en placas de microtitulación y las reactividades específicas de los antisueros de los ratones fueron determinadas mediante análisis ELISA. Las placas de microtitulación fueron recubiertas con 1 \mug/ml de gp160 o 10 \mug/ml de cada péptido en tampón bicarbonato 0,1 M (pH 9,5) durante la noche a 4ºC, bloqueadas con seralbúmina bovina en PBS al 2%, y se hicieron reaccionar con IgG anti-ratón de cabra conjugada con HRPO (Fisher) durante una hora a 37ºC y se envolvieron con sustrato TMB (Sigma) durante 10-30 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad. Los resultados son referidos en la Figura 3. Los antisueros fueron los siguientes: (-+-) es suero preinmune, (-X-) es el suero inmunizado con el vector pMAMneoBlue, (-O-) es el suero inmunizado con pM160, (-\Delta-) es el de los ratones inmunizados con la glicoproteína rgp160. La Figura 3A muestra los resultados utilizando una placa recubierta con proteína rgp160. La Figura 3B muestra los resultados utilizando una placa recubierta con los péptidos del bucle BRU/V3 (CNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGK (SEC ID NUM: 11)). La Figura 3C muestra los resultados utilizando una placa recubierta con péptidos del bucle MN/V (YNKRKRIHIQRGPGRAFYTTKNIIC (SEC ID NUM: 12)) con la secuencia QR de HIV-1/III_{B} en negrita. La Figura 3D muestra los resultados utilizando una placa recubierta con péptidos del sitio de unión HXB2/CD4 (CRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGIRC (SEC ID NUM: 13)). La Figura 3E muestra los resultados utilizando una placa recubierta con péptidos de la región inmunodominante BRU/gp41 (RILAVERYIKDQQLLGIWGCSGKLIC (SEC ID NUM: 14)).

La Figura 3 demuestra que el antisuero ratón inmunizado con el constructo pM160 tiene una reactividad significativamente más elevada con los péptidos del bucle BRU y MN/V3, el péptido del sitio de unión a CD4 y el péptido gp41 inmunodominante que con el suero inmunizado con la proteína gp160 recombinante (gp160). El antisuero del ratón inmunizado con rgp160 tenía un título mucho mayor contra la rgp160 que el antisuero inmunizado con pM160, pero una actividad inferior contra los tres epítopos de neutralización específica de la gp160 sometida a ensayo.

Para determinar si los antisueros generados mediante la inmunización con el ADN poseían actividad antiviral, se examinó la capacidad de los antisueros para neutralizar la infección por HIV-1. Se incubó virus HIV-1/III_{B} libre de células a una TCID_{50} de 100 con diluciones seriadas de los antisueros antes de ser utilizado para infectar células diana MT-2 (Montefiori, D.C., (1998), J. Clin. Microbio. 26:231-235).

Se preincubaron virus HIV-1/III_{B} libres de células a una TCID_{50} de 100 con diluciones seriadas de los antisueros durante una hora a 37ºC. Tras la incubación el virus pretratado fue cultivado en placa después sobre 4 x 10^{4} de la línea celular diana, MT-2 durante una hora a 37ºC, tras la infección las células MT-2 fueron lavadas tres veces y después incubadas a 37ºC con CO_{2} al 5%. Se evaluó la fusión tres días más tarde cuantitativamente mediante recuento visual del número de sincitios por pocillo en experimentos por triplicado bajo un microscopio de contraste de fases.

Se informa sobre los resultados en la Figura 4. La Figura 4A muestra los resultados utilizando sueros de ratón inmunizado con el vector en comparación con la Figura 4B que muestra los resultados utilizando sueros inmunizados con pM160. Los valores de neutralización (V_{n}/V_{o}) versus los factores de dilución (Nara, P., (1989) Techniques In HIV Research eds. Aldovini, A. & Walkter, B.D., 77-86 M Stockton Press) se ilustran en la Figura 4C. El suero de control (-X) era el de los ratones inmunizados con el vector pMAMneoBlue. Los sueros de ensayo (O) eran los de los de ratones inmunizados con pM160.

La inhibición de sincitios se realizó como describen Osther, K., y col., (1991) Hybridoma 10:673-683. La línea celular H9/III_{B} fue preincubada con diluciones seriadas (1:100, 1:200, y 1:400) de los antisueros elaborados en placas de 96 pocillos en un volumen total de 50 \mul durante 30 minutos a 37ºC con CO_{2} al 5%. La fusión fue evaluada tres días más tarde cuantitativamente mediante recuento visual del número de sincitios por pocillo bajo un microscopio de contraste de fases. La Figura 4D son las células diana cultivadas simultáneamente con la línea celular HIV-1/III_{B} tratada con suero preinmune. La Figura 4E es igual que la Figura 4D pero tratada con suero inmunizado con el control con vector. La Figura 4F es igual que la Figura 4D pero tratada con suero inmunizado con rgp160. La Figura 4G es igual que la Figura 4D pero tratada con suero inmunizado con pM160. Las Figuras 4D a 4G muestran que la inhibición de sincitios era evidente a una dilución 1:200 en estos análisis. Las células MT-2 fueron infectadas con HIV-1/III_{B} libre de células que había sido preincubado con antisuero inmunizado con el vector que formaba rápidamente sincitios (Figura 4A). En comparación, la preincubación con suero de ratón inmunizado con pM160 evitaba la formación de sincitios (Figura 4B). Las cinéticas de neutralización fueron determinadas mediante V_{n}/V_{o} versus las diluciones seriadas de antisueros (Nara, P., (1989) Techniques In HIV Research, eds. Aldovini, A. & Walker, B.D., 77-86, M. Stockton Press) (Figura 4C). El suero del ratón inmunizado con pM160 tenía actividad neutralizadora biológicamente activa a diluciones de hasta 1:320 mientras los antisueros de control no tenían una actividad
similar.

Para determinar si el antisuero del ratón inmunizado con pM160 podía inhibir la propagación del virus mediada por la envuelta a través de la fusión célula a célula directa, se realizaron análisis de inhibición de sincitios. El antisuero del ratón inmunizado con pM160 inhibe la formación de sincitios inducida por el HIV-1 a diluciones 1:200 (Fig. 4G). En contraste, los sueros preinmunes (Fig. 4D), los antisueros de los ratones inmunizados con rgp160 (Fig. 4F) y los antisueros de los animales inmunizados con el vector de control (Fig. 4E) fracasaban al inhibir la formación de sincitios a las mismas diluciones.

Las observaciones de los análisis de neutralización (Figuras 4A-C) y de inhibición de los sincitios (Figuras D-G) de estos sueros se corresponden con las reactividades de ELISA observadas (Fig. 3). El antisuero del ratón inmunizado con pM160 que mostraba un elevado nivel de unión a los epítopos neutralizadores demostraba del mismo modo actividades anti-virales de elevado nivel; por el contrario, los sueros con poca unión a estos epítopos incluyendo el antisuero del ratón inmunizado con rgp160 tienen una escasa actividad anti-viral.

Para someter a ensayo si los antisueros de los ratones inmunizados con pM160 pueden inhibir la unión de gp120 a las células T que portan CD4, se empleó un análisis de inhibición directa controlado mediante fluorocitometría (Chen, Y.H., y col., (1992) AIDS 6:533-539. Se observó que el suero del ratón inmunizado con el constructo pM160 era capaz de bloquear la unión de gp120 a las células T que portan CD4: una dilución 1:15 de suero inmune inhibía la unión FITC-gp120 a células CD4^{+}SupT1 en un 22% \pm 2% en experimentos por duplicado como se evaluaba mediante citometría de flujo. Esto indica que esta región para la entrada del HIV en las células diana también puede ser inhibida funcionalmente por medio de este antisuero. Estos datos son coherentes con la reactividad observada en el ELISA del antisuero hacia los péptidos del sitio de unión a CD4 (Fig. 3c).

Los estudios de isotipaje de la inmunoglobulina fueron realizados utilizando un estuche de isotipaje de anticuerpos monoclonales murinos comercial (Sigma). De los anticuerpos específicos anti-gp160 logrados mediante la inmunización con pM160, el 19% son IgG1, el 51% son IgG2, el 16% son IgG3, el 10% son IgM y el 5% son IgA. La predominancia de isotipos IgG indica que ha tenido lugar una respuesta inmune secundaria, y adicionalmente sugiere que se pueden lograr células T coadyuvantes mediante inmunización genética.

Se recubrieron placas de microtitulación con ADN de pM160 y pMAMneoBlue y se determinó la unión específica mediante ELISA utilizando todos los animales inmunizados con los sueros. No se observó una unión significativa al ADN plasmídico. Así, utilizando material genético para la inoculación en el tejido muscular parece poco probable producir una respuesta anti-ADN plasmídico.

La introducción de un constructo de ADN en músculo de ratón mediante inyección sin aguja puede ocasionar resultados incoherentes, ya que esta técnica no proporciona un medio para controlar la absorción de ADN por las células musculares. Se comparó la inyección de constructo de ADN solo (n\approx4) con animales pretratados conbupivacaína. Las respuestas inmunes observadas en los dos grupos eran diferentes, con un 25% y un 75% de animales que respondían en los análisis ELISA, respectivamente. Se puede lograr un incremento de la eficacia mediante el uso de un sistema de distribución de ADN directo tal como el bombardeo con partículas (Klein, T.M., y col., (1992) Bio/technology 10:286-291.

La evidencia de neutralización, la inhibición de sincitios, la inhibición de la unión CD4-gp120, y la unión específica a diversas regiones importantes de la gp160 demuestran que la introducción de un constructo de ADN que codifica la proteína unida a la membrana gp160 de HIV directamente en células musculares de animales vivos puede lograr respuestas humorales específicas, y generar anticuerpos anti-virales biológicamente relevantes.

Para someter a ensayo si la vacuna es capaz de lograr una respuesta inmune protectora, se utilizó el modelo animal descrito antes. Se transfectaron células tumorales con ADN que codificaba p160, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pm160. Los controles incluían animales no vacunados, animales vacunados con ADN vector solo y animales a los que se había administrado la proteína gp160.

Los resultados demuestran que la respuesta inmune de los ratones vacunados genéticamente era suficiente para eliminar completamente los tumores transfectados a la vez que no tenía efecto sobre los tumores no traducidos. La vacunación con la proteína gp160 conducía a una cierta reducción del tamaño del tumor en los tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tenía efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraban una mortalidad similar tanto para los tumores transfectados como los no transfectados.

Ejemplo 4

La siguiente es una lista de constructos que pueden ser utilizados en los métodos de la presente invención. El vector pBabe.puro, que se utiliza como material de partida para producir muchos de los constructos enumerados más abajo, fue construido originalmente y referido por Morgenstern, J.P. y H. Land, 1990 Nucl. Acids Res. 18(12):3587-3596, que se incorpora aquí como referencia. El plásmido pBabe.puro es particularmente útil para la expresión de genes exógenos en células de mamífero. Las secuencias de ADN que van a ser expresadas son insertadas en los sitios de clonación bajo el control del promotor de la larga repetición terminal (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo MuLv). El plásmido contiene el marcador seleccionable para la resistencia a la puromicina.

Ejemplo 5

El plásmido pBa.V\alpha3 es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento genómico EcoRI de 2,7 kb que codifica la región Va3 del receptor de las células T conteniendo los segmentos L, V y J clonados en el sitio EcoRI de pBabe.puro. La proteína diana derivada del receptor de las células T es útil en la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades autoinmunes mediadas por las células T y el linfoma de las células T clonotípico y la leucemia.

Ejemplo 6

El plásmido pBa.gagpol-vpr es un plásmido de 9,88 kb que contiene los genes gag/pol y vif de HIV/MN clonado en pBabe.puro. El gen vpr está suprimido. El plásmido que contiene estos genes virales del HIV, que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra el HIV y el SIDA. La secuencia de ADN del HIV está publicada por Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 7

El plásmido pM160 es un plásmido de 11,0 kb que contiene el fragmento de la PCR de 2,3 kb que codifica la proteína de la envuelta de HIV-I/3B y los genes rev/tat clonados en pMAMneoBlue. La región nef está suprimida. El plásmido que contiene estos genes virales del HIV, que codifican las proteínas diana del HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por el HIV y el SIDA. La secuencia de ADN de HIV-1/3B está publicada por Fisher, A., 1995 Nature 316:262, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: K03455, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 8

El plásmido pBa.VL es un plásmido de 5,4 kb que contiene el fragmento de la pCR que codifica la región VL de un anticuerpo anti-ADN clonado en pBabe.puro en los sitios XbaI y EcoRI. La proteína diana derivada del anticuerpo es un ejemplo de una proteína diana útil en la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades autoinmunes mediadas por las células B y el linfoma de las células B clonotípico y la leucemia. Se puede encontrar un método general para la clonación de regiones variables funcionales a partir de anticuerpos en Chaudhary, V.K., y col., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 9

El plásmido pOspA.B es un plásmido de 6,84 kb que contiene las regiones codificadoras que codifican los antígenos OspA y OspB de Borrelia burgdorferi, la espiroqueta responsable de la enfermedad de Lyme clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y SalI. Los cebadores de la PCR utilizados para generar loS fragmentos OspA y OspB son 5'-GAAG
GATCCATGAAAAAATATTTATTGGG-3' (SEC ID NUM: 3) y 5'-ACTGTCGACTTATTTTAAAGCGTTTTT
AAG-3' (SEC ID NUM: 4). Ver: Williams, W.V., y col. 1992 DNA and Cell. Biol. 12(3):207, que se incorpora aquí como referencia. El plásmido que contiene estos genes patógenos, que codifican proteínas diana, es útil en la inmunización contra la enfermedad de Lyme.

Ejemplo 10

El plásmido pBa.Rb-G es un plásmido de 7,10 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la proteína G de la rabia clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene este gen patógeno, que codifica la proteína G de la rabia, es útil en la inmunización contra la rabia. La secuencia de ADN se describe en Genbank Núm.: M32751, que se incorpora aquí como referencia. Ver también: Anilionis, A., y col., 1981 Nature 294:275, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 11

El plásmido pBa.HPV-L1 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la proteína de la cápsida L1 del papilomavirus humano (HPV) incluyendo las cepas de HPV 16, 18, 31 y 33 clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido es útil en la inmunización contra la infección por HPV y la terapia causada por el cáncer. La secuencia de ADN es descrita en Genbank Núm.: M15781, que se incorpora aquí como referencia. Ver también: Howley, P., 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R.M. y col. Capítulo 58:1625; y Shah, K. y P. Howley, 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R.M. y col. Capítulo 59; ambas incorporadas aquí como referencia.

Ejemplo 12

El plásmido pBa.HPV-L2 es un plásmido de 6,80 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la proteína de la cápsida L2 del papilomavirus humano (HPV) incluyendo las cepas de HPV 16, 18, 31 y 33 clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido es útil en la inmunización contra la infección por HPV y la terapia causada por el cáncer. La secuencia de ADN es descrita en Genbank Núm.: M15781, que se incorpora aquí como referencia. Ver también: Howley, P., 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R.M. y col. Capítulo 58:1625; y Shah, K. y P. Howley, 1990 Fields Virology, Volumen 2, Eds.: Channock, R.M. y col. Capítulo 59; ambas incorporadas aquí como referencia.

Ejemplo 13

El plásmido pBa.MNp7 es un plásmido de 5,24 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la región codificadora de P7 incluyendo la secuencia gag (proteína del núcleo) de HIV MN clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV, que codifica las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por HIV y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human. Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 14

El plásmido pGA733-2 es un plásmido de 6,3 kb que contiene el antígeno de superficie del tumor GA733-2 clonado de la línea celular de carcinoma colorrectal SW948 en el vector pCDMB (Seed, B. Y A. Aruffo, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365, que se incorpora aquí como referencia) en el sitio BstXI. La proteína diana asociada al tumor es un ejemplo de proteína diana útil en la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer. El antígeno GA733-2 es un antígeno diana útil contra el cáncer de colon. El antígeno es referido por Szala, S. Y col., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3542-3546, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 15

El plásmido pT4-pMV7 es un plásmido de 11,15 kb que contiene el ADNc que codifica el receptor CD4 humano clonado en el vector pMV7 en el sitio EcoRI. La proteína diana CD4 es útil en la inmunización y el tratamiento contra el linfoma de las células T. El plásmido pT4-pMV7 es asequible de AIDS Repository, Catálogo Núm. 158.

Ejemplo 16

El plásmido pDJGA733 es un plásmido de 5,1 kb que contiene el antígeno de superficie del tumor GA733-2 clonado en el vector pBabe.puro en el sitio BamHI. La proteína diana asociada al tumor es un ejemplo de proteína diana útil en la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer. El antígeno GA733-2 es un antígeno diana útil contra el cáncer de colon.

Ejemplo 17

El plásmido pBa.RAS es un plásmido de 6,8 kb que contiene la región codificadora de ras que fue subclonado primero a partir de pZIPneoRAS y clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. La proteína diana ras es un ejemplo de una molécula de señalización citoplásmica. El método de clonación de ras es referido por Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4:1577, que se incorpora aquí como referencia. Los plásmidos que codifican ras son útiles para la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer; en particular, el cáncer relacionado con ras tal como el cáncer de vejiga, músculo, pulmón, cerebro y hueso.

Ejemplo 18

El plásmido pBa.MNp55 es un plásmido de 6,38 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la región codificadora p55 incluyendo la secuencia precursora gag de HIV MN (proteína núcleo) clonado en pBabe.puro en el sitio BamHI. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV, que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por HIV y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 19

El plásmido pBa.MNp24 es un plásmido de 5,78 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR del molde pMN-SF1 que codifica la región codificadora p24 incluyendo la región codificadora de gag de HIV MN clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV, que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por HIV y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 20

El plásmido pBa.MNp17 es un plásmido de 5,5 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR que codifica la región codificadora p17 incluyendo la secuencia gag de HIV MN (proteína núcleo) clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV, que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por HIV y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 21

El plásmido pBa.SIVenv es un plásmido de 7,8 kb que contiene un fragmento generado por PCR de 2,71 amplificado a partir de un constructo que contiene SIV 239 en pBR322 clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. Los cebadores utilizados son 5'-GCCAGTTTTGGATCCTTAAAAAAGGCTTGG-3' (SEC ID NUM: 5) y 5'-TTGTGAGGGACAGAATTCCAATCAGGG-3' (SE ID NUM: 6). El plásmido es asequible de AIDS Research and Reference Reagent Program; Catálogo Núm. 210.

Ejemplo 22

El plásmido pcTSP/ATK.env es un plásmido de 8,92 kb que contiene un fragmento generado por PCR que codifica la región codificadora de la envuelta de HTLV completa a partir de productos aislados de HTLV-1/TSP y /ATK subclonados en el vector pcDNA1/neo. Los cebadores utilizados son 5'-CAGTGATATCCCGGGAGACTCCTC-3' (SEC ID NUM: 7) y 5'-GAATAGAAGAACTCCTCTAGAATTC-3' (SE ID NUM: 8). El plásmido pcTSP/ATK.env es referido en 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3599, que se incorpora aquí como referencia. La proteína diana env de HTLV es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por HTLV y el linfoma de las células T.

Ejemplo 23

El plásmido pBa.MNgp160 es un plásmido de 7,9 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR de 2,8 kb amplificado a partir de un constructo que contiene MNenv en pSP72 y clonado en pBabe.puro en los sitios BamHI y EcoRI. Los cebadores utilizados son 5'-GCCTTAGGCGGATCCTATGGCAGGAAG-3' (SEC ID NUM: 9) y 5'-TAAGATGGGTGGCCATGGTGAATT-3' (SEC ID NUM: 10). Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV, que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento de la infección por HIV y el SIDA.

Ejemplo 24

El plásmido pC.MNp55 es un plásmido de 11,8 kb que contiene un fragmento generado mediante PCR de 1,4 kb amplificado a partir de la región gag del producto aislado de MN y clonado en el vector pCEP4. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV, que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento de la infección por HIV y el SIDA. Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549, que se incorpora aquí como referencia. La secuencia es accesible de Genbank Núm.: M17449, que se incorpora aquí como referencia.

Ejemplo 25

El plásmido pC.Neu es un plásmido de 14,2 kb que contiene un fragmento de 3,8 kb que contiene la región codificadora del oncogen neu humano que fue cortado del constructo LTR/erB-2 y subclonado en el vector pCEP4. El plásmido pC.Neu es referido por DiFiore 1987 Science 237:178, que se incorpora aquí como referencia. La proteína diana del oncogen neu es un ejemplo de un receptor del factor de crecimiento útil como proteína diana para la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer; en particular, cáncer de colon, mama, pulmón y cerebro.

Ejemplo 26

El plásmido pC.RAS es un plásmido de 11,7 kb que contiene un fragmento de ADN de 1,4 kb que contiene la región codificadora del oncogen ras que fue subclonado primero a partir de pZIPneoRAS y subclonada en pCEP4 en el sitio BamHI. El plásmido pC.RAS es referido por Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4:1577, que se incorpora aquí como referencia. La proteína diana ras es un ejemplo de una molécula de señalización citoplásmica. El plásmido que codifica ras es útil para la inmunización y el tratamiento contra las enfermedades hiperproliferativas tales como el cáncer; en particular, los cánceres relacionados con ras tales como vejiga, músculo, pulmón, cerebro y
hueso.

Ejemplo 27

El plásmido pNLpuro es un plásmido de 15 kb que contiene gag/pol de HIV y la inserción de SV40-puro. El plásmido que contiene estos genes virales de HIV que codifican las proteínas diana de HIV, es útil en la inmunización y el tratamiento contra la infección por HIV y el SIDA.

Ejemplo 28

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra CD4 humano en ratones. Estos experimentos fueron diseñados para someter a ensayo la capacidad de una vacuna para proteger contra un antígeno de linfoma T. En el linfoma de las células T, CD4 es un antígeno específico tumoral. Por consiguiente, este modelo demuestra la capacidad de la vacuna genética para proteger contra el linfoma T. Adicionalmente, estos experimentos sometían a ensayo la eficacia contra un miembro de la superfamilia de moléculas de las inmunoglobulinas. CD4 está muy conservado entre las especies humana y murina.

El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codificaba CD4, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas. Aunque los animales eran inmunocompetentes, la respuesta inmune no se dirigía contra los tumores marcados con CD4, implantados en los animales no vacunados.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pT4-pMV7, descrito en el Ejemplo 15. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína CD4.

En el procedimiento de inmunización genética descrito aquí, se inyectaron 100 \mul de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en NaCl isotónico en los cuadriceps de ratones BALB/c utilizando una aguja del calibre 27 para estimular la regeneración de las células del músculo para facilitar la absorción del constructo genético. Veinticuatro horas más tarde, se inyectaron o bien 100 \mug de pT4-pMV7 o bien 100 \mug de pMV7 como plásmido de control en los mismos sitios de las inyecciones. Los ratones fueron reforzados mediante inyección de la misma cantidad de constructo de ADN tres veces a intervalos de dos semanas de la misma manera pero sin pretratamiento con bupivacaína.

Los animales recibían 1.000.000 de células tumorales marcadas con CD4. En los animales no vacunados, se formaban grandes tumores y se producía la muerte después de aproximadamente 7-10 semanas. Los animales vacunados no desarrollaban tumores mortales similares.

Los resultados demuestran que la respuesta inmune de los ratones vacunados genéticamente era suficiente para eliminar completamente los tumores transfectados si bien no tenía efecto sobre los tumores no transfectados. La vacunación con la proteína CD4 conducía a una cierta reducción del tamaño del tumor en los tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tenía efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraban una mortalidad similar tanto para los tumores transfectados como no transfectados.

Ejemplo 29

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra GA733 humano en ratones. Estos experimentos fueron diseñados para someter a ensayo la capacidad de una vacuna para proteger contra el cáncer asociado a GA733 tal como el cáncer de colon. El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codificaba GA733, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pGA733-2, descrito en el Ejemplo 14, siguiendo el método descrito antes. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína GA733.

Los resultados demuestran que la respuesta inmune de los ratones vacunados genéticamente era suficiente para eliminar completamente los tumores transfectados si bien no tenía efecto sobre los tumores no traducidos. La vacunación con la proteína GA733 conducía a una cierta reducción del tamaño del tumor en los tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tenía efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraban una mortalidad similar tanto para los tumores transfectados como no transfectados.

Ejemplo 30

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra p185neu humano en ratones. Estos experimentos fueron diseñados para someter a ensayo la capacidad de una vacuna para proteger contra el cáncer asociado a p185neu tal como el cáncer de mama, pulmón y cerebro. El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales se transfectaron con ADN que codificaba neu, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pLTR-2/erbB-2, un plásmido de 14,3 kb que contiene la región codificadora del oncogén neu humano clonado en el vector LTR-2 en el sitio XhoI siguiendo el método descrito antes. Las 5'LTR y 3'LTR son de las LTR de MuLV de Moloney. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína p185neu.

Los resultados demuestran que la respuesta inmune de los ratones vacunados genéticamente era suficiente para eliminar completamente los tumores transfectados si bien no tenía efecto sobre los tumores no traducidos. La vacunación con la proteína p185 conducía a una cierta reducción del tamaño del tumor en los tumores transfectados en comparación con los tumores no transfectados pero no tenía efecto sobre la mortalidad. Los animales no vacunados mostraban una mortalidad similar tanto para los tumores transfectados como no transfectados.

Ejemplo 31

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra Ras humano en ratones. Estos experimentos fueron diseñados para someter a ensayo la capacidad de una vacuna para proteger contra el cáncer asociado a Ras tal como el cáncer de vejiga, músculo, pulmón, cerebro y hueso. El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codificaba Ras, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pBa.RAS descrito en el Ejemplo 17 siguiendo el método descrito antes. La proteína diana ras es un ejemplo de molécula de señalización citoplásmica. El método de clonación de ras es referido en Weinberg 1984 Mol. Cell. Biol. 4:1577, que se incorpora aquí como referencia. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína Ras.

Ejemplo 32

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra el antígeno de la proteína G de la rabia humano en ratones. El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales se transfectaron con ADN que codificaba la proteína G de la rabia, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pBa.Rb-G que se describe en el Ejemplo 10, siguiendo el método de vacunación descrito antes. La proteína diana G de la rabia es un ejemplo de un antígeno patógeno. La secuencia de ADN se describe en Genbank Núm.: M32751. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se había administrado la proteína G.

Ejemplo 33

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra el antígeno de la enfermedad de Lyme en ratones. El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codificaba OspA y OspB, se confirmó que expresaban las proteínas y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pOspA.B que se describe en el Ejemplo 9. Los controles incluían animales no vacunados y animales a los que se habían administrado las proteínas OspA y OspB.

Ejemplo 34

Se diseñó un constructo de ADN para someter a ensayo la eficacia de una vacuna genética contra la región variable del receptor de las células T humano en ratones. Estos experimentos fueron diseñados para someter a ensayo la capacidad de una vacuna para proteger contra un cáncer asociado con la proteína derivada del receptor de las células T tal como el linfoma de las células T y las enfermedades autoinmunes mediadas por las células T. El modelo animal utilizado ha sido descrito más arriba. Las células tumorales fueron transfectadas con ADN que codificaba Ras, se confirmó que expresaban la proteína y se implantaron en el animal. Los controles incluían líneas tumorales no transfectadas.

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Los animales inmunizados genéticamente fueron vacunados con el plásmido pBa-Vá3 que se describe en el Ejemplo 5 siguiendo el método de vacunación descrito antes.

Ejemplo 35

Se puede utilizar el plásmido pM160 como sustancia de partida para diversos plásmidos útiles para expresar uno o más genes de la porción env de HIV. La construcción de pM160 se ha descrito antes. El plásmido abarca la región codificadora de gp160, tat y rev. El gen nef está ausente.

El promotor que controla la expresión del gen gp160/rev/tat es la LTR de MMTV. El promotor puede ser suprimido y remplazado por el promotor de la Actina, el promotor de la miosina, el promotor LTR de HIV y el promotor de CMV.

El gen que confiere resistencia a la ampicilina puede ser suprimido o inactivado de otro modo. El gen que confiere resistencia a la neomicina puede ser situado bajo el control de un promotor bacteriano.

Se puede suprimir el virus del sarcoma de Rous del plásmido. Se puede remplazar el intensificador de RSV por el intensificador de la creatina del músculo.

Los genes gp160/rev/tat se solapan y comparten las mismas secuencia de nucleótidos en diferentes marcos de lectura. El gen rev puede ser suprimido cambiando su codón de iniciación por un codón diferente. De un modo similar, el gen tat puede ser eliminado mediante los mismos métodos. En cada plásmido excepto en aquellos que utilizan el promotor LTR de HIV para controlar gp160/rev/tat, cualquiera de rev, tat o ambos rev y tat pueden ser eliminados. En los plásmidos que utilizan el promotor LTR de HIV, debe estar presente tat.

La siguiente Tabla enumera plásmidos modificados con pM160. Cada plásmido tiene un gen de la ampicilina inactivado. Cada uno tiene el intensificador de RSV suprimido. Algunos no tienen intensificador (no); algunos tienen el intensificador muscular creatina (CME). Algunos tienen el gen rev de HIV (si) mientras se suprime en otros (no). Algunos tienen el gen tat de HIV (si) mientras se suprime en otros (no).

Constructo	Promotor	Intensificador	rev	tat
RA-1	Actina	no	si	si
RA-2	Actina	no	si	no
RA-3	Actina	no	no	si
RA-4	Actina	CME	si	si
RA-5	Actina	CME	si	no
RA-6	Actina	CME	no	si
RA-7	CMV	no	si	si
RA-8	CMV	no	si	no
RA-9	CMV	no	no	si
RA-10	CMV	CME	si	si
RA-11	CMV	CME	si	no
RA-12	CMV	CME	no	si
RA-13	MMTV	no	si	si
RA-14	MMTV	no	si	no
RA-15	MMTV	no	no	si
RA-16	MMTV	CME	si	si
RA-17	MMTV	CME	si	no
RA-18	MMTV	CME	no	si
RA-19	Miosina	no	si	si
RA-20	Miosina	no	si	no
RA-21	Miosina	no	no	si
RA-22	Miosina	CME	si	si
RA-23	Miosina	CME	si	no
RA-24	Miosina	CME	no	si
RA-25	LTR HIV-1	no	si	si
RA-26	LTR HIV-1	no	no	si
RA-27	LTR HIV-1	CME	si	si
RA-28	LTR HIV-1	CME	no	si

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Las construcciones de RA-29 a RA-56 son idénticas a RA-1 a RA-32 respectivamente excepto que en cada caso el promotor que controla el gen de la neomicina es un promotor bacteriano.

Ejemplo 36

El plásmido pNL/puro puede ser utilizado como material de partida para producir diversos plásmidos diferentes que expresan los genes gag/pol de HIV. Como se ha descrito antes, se construyó pNLpuro para la expresión de gag pol. El plásmido pNLpuro\Deltavpr, que se ha descrito antes, fue diseñado para suprimir el gen regulador vpr del vector gag pol de HIV con el fin de eliminar una proteína reguladora necesaria del grupo de genes que se van a introducir mediante vacunación. Además de vpr, los expertos normales en la técnica pueden realizar otros cambios en el plásmido pNL43puro utilizando mecanismos de biología molecular normalizada y material de partida ampliamente asequible.

Las secuencias 5' y 3' limítrofes humanas de las secuencias de HIV pueden ser separadas mediante diversos métodos. Por ejemplo, utilizando la PCR, se pueden amplificar y reconstruir sólo las secuencias de HIV, SV40-puro, y pUC18.

La región psi de HIV, que es importante en el empaquetamiento del virus, puede ser suprimida de los plásmidos basados en pNL43puro. Con el fin de suprimir la región psi, se corta el plásmido pNLpuro con SacI y SpeI. Esta digestión elimina la región psi así como la LTR 5' que está aguas arriba y la porción de la región gag/pol que está aguas abajo de psi. Con el fin de reinsertar las secuencias diferentes de psi suprimidas, se realiza la amplificación mediante PCR para regenerar esas secuencias. Se diseñan cebadores que regeneran las porciones de la secuencia de HIV 5' y 3' con respecto a psi sin regenerar psi. Los cebadores vuelven a formar el sitio SacI en la porción del plásmido 5' de la LTR 5'. Los cebadores van aguas abajo desde el sitio aguas arriba del sitio SacI hacia el sitio inmediatamente 3' del extremo 5' de la región psi, generando un sitio AatI en el extremo 3'. Los cebadores que empiezan inmediatamente 5' de la región psi también generan un sitio AatI y, comenzando 3' del sitio SpeI, regeneran ese sitio. Los fragmentos generados mediante PCR son digeridos con SacI, AatI y SpeI y ligados entre sí con el fragmento pNLpuro-psi digerido con SacI/SpeI. El promotor LTR 5' de HIV puede ser suprimido y remplazado por el promotor del virus de Moloney, LTR de MMTV, el promotor de la Actina, el promotor de la miosina y el promotor de CMV.

El sitio de poliadenilación de LTR 3' de HIV puede ser suprimido y remplazado por el sitio de poliadenilación de SV40.

El gen que confiere resistencia a la ampicilina puede ser suprimido o inactivado de otro modo.

La siguiente es una lista de construcciones basadas en pNLpuro en las que han sido suprimidas las regiones psi y vpr de HIV y han sido suprimidas las regiones limítrofes humanas 5' y 3' de las secuencias de HIV.

Constructo	Promotor	poli(A)	Amp^{r}
LA-1	Moloney	LTR 3' HIV	si
LA-2	Moloney	SV40	si
LA-3	Moloney	LTR 3' HIV	no
LA-4	Moloney	SV40	no
LA-5	CMV	LTR 3' HIV	si
LA-6	CMV	SV40	si
LA-7	CMV	LTR 3' HIV	no
LA-8	CMV	SV40	no
LA-9	MMTV	LTR 3' HIV	si
LA-10	MMTV	SV40	si
LA-11	MMTV	LTR 3' HIV	no
LA-12	MMTV	SV40	no
LA-13	LTR 5' HIV	LTR 3' HIV	si
LA-14	LTR 5' HIV	SV40	si
LA-15	LTR 5' HIV	LTR 3' HIV	no
LA-16	LTR 5' HIV	SV40	no

Las construcciones LA-17 a LA-32 son idénticas a LA-1 a LA-16 respectivamente excepto que en cada caso al menos una de las secuencias limítrofes humana permanece.

Ejemplo 37

En otra construcción para expresar el gen env, esa región de HIV puede ser insertada en el plásmido asequible comercialmente pCEP4 (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificadora del antígeno nuclear EBNA-1 que produce la replicación episómica con un elevado número de copias sin integración. PCEP4 también contiene el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región codificadora de env de HIV se coloca bajo el control regulador del promotor de CMV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región codificadora de env de HIV fue obtenida en forma de un fragmento de PCR de 2,3 kb de HIV/3B, secuencia de Genebank K03455. El plásmido basado en pCEP4 resultante, pRA-100, es mantenido extracromosómicamente y produce la proteína gp160.

Ejemplo 38

En otra construcción para expresar el gen env, esa región de HIV puede ser insertada en el plásmido asequible comercialmente pREP4 (Invitrogen). El plásmido pREP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificadora del antígeno nuclear EBNA-1 que produce la replicación episómica con un elevado número de copias sin integración. PREP4 también contiene el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región codificadora de env de HIV se coloca bajo el control regulador del promotor de RSV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región codificadora de env de HIV fue obtenida en forma de un fragmento de PCR de 2,3 kb de HIV/3B, secuencia de Genebank K03455. El plásmido basado en pREP4 resultante, pRA-101, es mantenido extracromosómicamente y produce la proteína gp160.

Ejemplo 39

En otra construcción para expresar los genes gag/pol esa región de HIV puede ser insertada en el plásmido asequible comercialmente pCEP4 (Invitrogen). El plásmido pCEP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificadora del antígeno nuclear EBNA-1 que produce la replicación episómica con un elevado número de copias sin integración. PCEP4 también contiene el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región codificadora de gag/pol de HIV se coloca bajo el control regulador del promotor de CMV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región codificadora de gag/pol de HIV fue obtenida a partir de HIV MN, secuencia de Genebank MI7449, e incluyen el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido basado en pCEP4 resultante, pLA-100, es mantenido extracromosómicamente y produce las proteínas GAG55, transcriptasa inversa, proteasa e integrasa.

Ejemplo 40

En otra construcción para expresar los genes gag/pol, esa región de HIV puede ser insertada en el plásmido asequible comercialmente pREP4 (Invitrogen). El plásmido pREP4 es particularmente útil ya que contiene el origen de replicación del virus Epstein Barr y la región codificadora del antígeno nuclear EBNA-1 que produce la replicación episómica con un elevado número de copias sin integración. PREP4 también contiene el marcador de la higromicina bajo el control regulador del promotor de la timidina quinasa y el sitio de poliadenilación. La región codificadora de gag/pol de HIV se coloca bajo el control regulador del promotor de CMV y el sitio de poliadenilación de SV40. La región codificadora de gag/pol de HIV fue obtenida a partir de HIV MN, secuencia de Genebank MI7449, e incluye el gen vif. El gen vpr no está incluido. El plásmido basado en pREP4 resultante, pLA-101, es mantenido extracromosómicamente y produce las proteínas GAG55, transcriptasa inversa, proteasa e integrasa.

Ejemplo 41

La siguiente construcción, referida aquí como pGAGPOL.rev, es útil para expresar los genes gag/pol de HIV.

El plásmido incluye el gen de resistencia a la kanamicina y el origen de replicación del ADN de pBR322. La secuencia proporcionada para la regulación de la transcripción incluye: un promotor de citomegalovirus; un intensificador del virus del Sarcoma de Rous; y una señal de poliadenilación de SV40. Entre las secuencias de HIV incluidas en pGAGPOL.rev se incluían una secuencia que codifica p17, p24 y p15 del marco de lectura abierto de gag; una secuencia que codifica la proteasa, una secuencia que codifica la transcriptasa inversa que contiene una pequeña deleción y una secuencia que codifica el extremo amino inactivo de la integrasa del marco de lectura abierto de pol; y una secuencia que codifica rev. Cada una de las secuencias de HIV está derivada de la cepa HXB2 de HIV-1.

En pGAGPOL.rev están incluidos numerosos rasgos de seguridad. Entre estos se incluye el uso del promotor de CMV y un sitio poli(A) no retroviral. Además, la deleción de la secuencia \psi limita la capacidad para empaquetar el ARN viral. Además, las múltiples mutaciones de la transcriptasa inversa rinden un producto enzimáticamente inactivo. Por otra parte, una gran deleción de la integrasa rinde un producto inactivo y se utiliza un marcador de resistencia a la kanamicina para estabilizar los transformantes bacterianos.

El plásmido pGAGPOL.rev se construye como sigue

Etapa 1. Se utiliza un subclon de parte del genoma de HIV-1 (HXB2) que es clonado en Bluescript (Stratagene). El subclon de HIV-1 contiene la LTR 5' completa y el resto del genoma de HIV-1 hasta el nucleótido 5795 (numeración de Genebank). Las secuencias de HIV-1 son obtenidas del plásmido HXB2D (AIDS Repository).

Etapa 2. Parte de la PCR de gag del plásmido HXB2D (AIDS Repository) de marco de lectura abierto. Cortar el fragmento de la PCR con NotI y SpeI y ligar con el subclon de HIV-1 descrito antes restringido con NotI y SpeI.

Etapa 3. Unión gag/pol de la PCR y parte de las secuencias codificadoras de pol del plásmido HXB2D (AIDS Repository) con los cebadores SEC UD NUM: 15 y SEC ID NUM: 16. Cortar el producto de la PCR con ClaI y ligar entre sí. Cortar los fragmentos ligados con BclI y SalI y ligar con el plásmido de la Etapa 2 digerido con BclI y
SalI.

Etapa 4. Cortar el plásmido de la Etapa 3 con BspMI y EcoRI y religar con adaptadores formados recociendo los conectores SEC ID NUM: 17 y SEC ID NUM: 18.

Etapa 5. Cortar el plásmido de la Etapa 4 con NotI y SalI y ligar con el plásmido de 4a o 4b en la descripción escrita para pENV (más abajo). Cortar también con NotI y SalI.

Etapa 6. Restringir el plásmido de la Etapa 5 con SalI y MluI y ligar con el producto de la PCR obtenido mediante PCR de rev con los cebadores SEC ID NUM: 19 y SEC ID NUM: 20.

Etapa 7. Cortar el plásmido de la Etapa 6 con NotI y ligar con el producto obtenido mediante PCR del elemento sensible a rev en el plásmido HXB2D (AIDS Repository) con los cebadores SEC ID NUM: 21 y SEC ID NUM:
22.

Las Etapas 6 y 7 son opcionales.

Ejemplo 42

La siguiente construcción, referida aquí como pENV, es útil para expresar los genes env de HIV.

El plásmido incluye el gen de resistencia a la kanamicina y el origen de replicación del ADN de pBR322. Las secuencias proporcionadas para la regulación de la transcripción incluyen: un promotor de citomegalovirus; un intensificador del virus del Sarcoma de Rous; y una señal de poliadenilación de SV40. Entre las secuencias de HIV incluidas en pENV se incluían una secuencia que codifica vpu; una secuencia que codifica rev; una secuencia que codifica gp160; una secuencia que codifica el 50% de nef; una secuencia que codifica vif; y una secuencia que codifica vpr con una deleción en el extremo carboxi de 13 aminoácidos. Las secuencias de vpu, rev, gp160 y nef derivan de la cepa MN de HIV-1. Las secuencias vif y vpr derivan de la cepa HXB2 de HIV-1.

En pGAGPOL.rev están incluidos numerosos rasgos de seguridad. Entre estos se incluye el uso del promotor de CMV y un sitio poli(A) no retroviral. Además, tat ha sido suprimida y la deleción del 50% de nef rinde un producto nef "inactivo". Además, vif y vpr se colocan fuera de la secuencia normal y la deleción parcial de vpr asegura adicionalmente un producto vpr inactivo.

El plásmido pENV se construye como sigue

Etapa 1. Partir de pUC18 digerido con HindIII y EcoRI. El fragmento resultante que contiene el origen de replicación de ColE1 y el gen laci deben ser ligados con el fragmento EcoRI/HindIII de pMAMneoBlue que contiene el intensificador del virus del sarcoma de Rous de los autores de la presente invención. El plásmido resultante o pMAMneo-Blue de Clontech (Palo Alto, CA) puede ser digerido después con HindIII y BglI. Utilizando mecanismos normalizados, ligar con el fragmento que contiene el gen kan mediante PCR del plásmido Geneblock (Pharmacia).

Etapa 2. Si se ha utilizado pMAMneo-Blue como plásmido de partida, digerir con MluI y EcoRI, rellenar los extremos con fragmento de Klenow de la polimerasa I y religar.

Etapa 3. Después, o bien con pMAMneo-Blue o bien con el plásmido derivado de pUC18U, digerir con HindIII y ligar con el sitio poliA de SV40 y la región de empalme temprana obtenida mediante PCR de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) con los cebadores SEC ID NUM: 23 y SEC ID NUM: 24.

Etapa 4a. Digerir con BamHI y ligar con el promotor de CMV obtenido mediante PCR de pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) con los cebadores SEC ID NUM: 25 y SEC ID NUM: 26.

Etapa 4b. Digerir con BamHI y ligar con la LTR de MoMLV obtenida mediante PCR con los cebadores SEC ID NUM: 27 y SEC ID NUM: 28.

Etapa 5. Digerir con NotI y MluI y ligar con la región codificadora de GP160 obtenida mediante PCR de pMM-ST1 con los cebadores SEC ID NUM: 29 y SEC ID NUM: 30.

Etapa 6. Digerir con MluI y ligar con las secuencias que codifican vif en su totalidad y vpr con una deleción en el extremo carboxi de 13aa mediante CPR del plásmido HXB2D (AIDS Repository) con los cebadores SEC ID NUM: 31 y SEC ID NUM: 32.

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Ejemplo 43

Se proporciona un sistema de inmunización que comprende:

una composición farmacéutica que comprende aproximadamente 100 \mug de pGAGPOL. rev en solución farmacéuticamente aceptable isotónica; y

una preparación farmacéutica que comprende 100 \mug de pENV en solución farmacéuticamente aceptable isotónica. Además, el sistema de inmunización comprende una composición farmacéutica que comprende aproximadamente 1 ml de bupivacaína-HCl al 0,5% y metilparabeno al 0,1% en un portador farmacéutico isotónico.

En semejante sistema de inmunización preferido, se realiza un primer grupo de administraciones en las cuales la bupivacaína y una de las dos composiciones farmacéuticas se administran intramuscularmente a un individuo, preferiblemente en un músculo del brazo o de la nalga. La bupivacaína y la otra composición farmacéutica se administran intramuscularmente al individuo en un sitio diferente, preferiblemente alejado del sitio de administración de la primera composición farmacéutica, preferiblemente en el músculo del otro brazo o en la otra nalga. Los siguientes grupos de administraciones se pueden realizar más tarde en el tiempo, preferiblemente de 48 horas a dos semanas o más más tarde.

El sistema de inmunización puede ser utilizado para vacunar a un individuo con el fin de proteger al individuo de la infección por HIV o para tratar a un individuo infectado por HIV con un agente inmunoterapéutico.

Ejemplo 44

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un método de inmunización de un individuo frente el HIV administrando un único inoculante. Este inoculante incluye un constructo genético que comprende al menos uno, preferiblemente dos, más preferiblemente más de dos o una pluralidad de los genes del virus HIV o todos los genes estructurales. Sin embargo, el inoculante no contiene un complemento completo de todos los genes de HIV. Si se proporciona a una única célula un complemento completo de genes virales, es posible que se ensamble un virus infeccioso completo dentro de la célula. Por consiguiente, no se proporciona un constructo genético según la presente invención con semejante complemento completo de genes. Como medida de precaución, se pueden suprimir uno o más genes esenciales o se pueden alterar intencionadamente para asegurar adicionalmente que no se pueda formar una partícula viral infecciosa.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporcionan al menos porciones de uno, dos o todos los genes estructurales de HIV. Los genes estructurales de HIV constan de gag, pol y env. Se proporcionan porciones de al menos uno de estos tres genes en un constructo genético. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se proporciona al menos una porción de cada uno de gag y pol en un constructo genético; en algunas realizaciones, se proporciona al menos una porción de env en un constructo genético; en algunas realizaciones, se proporciona al menos una porción de gag en un constructo genético; en algunas realizaciones se proporciona al menos una porción de cada uno de pol y env en un constructo genético; en algunas realizaciones, se proporciona al menos una porción de cada uno de gag y env en un constructo genético; en algunas realizaciones se proporciona al menos una porción de pol en un constructo genético. Opcionalmente, se proporciona el gen completo. Opcionalmente, en cualquiera de estos constructos, pueden estar presentes los genes reguladores de HIV. Los genes reguladores de HIV son: vpr, vif, vpu, nef, tat y rev.

Ejemplo 45

Según se utiliza aquí, se pretende que el término "unidad de expresión" haga referencia a una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia codificadora conectada operablemente a una señal de poliadenilación. La secuencia codificadora puede codificar una o más proteínas o fragmentos de las mismas. En las realizaciones preferidas, una unidad de expresión está dentro de un plásmido.

Según se utiliza aquí, se pretende que el término "unidad de expresión de HIV" haga referencia a una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia codificadora conectada operablemente a una señal de poliadenilación en la cual la secuencia codificadora codifica un péptido que comprende un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo encontrado en una proteína de HIV. Se pretende que "epítopo sustancialmente similar" haga referencia a un epítopo que tiene una estructura que no es idéntica a un epítopo de una proteína de HIV pero sin embargo evoca una respuesta inmune celular o humoral que presenta reacción cruzada con una proteína de HIV. En las realizaciones preferidas, la unidad de expresión de HIV comprende una secuencia codificadora que codifica una o más proteínas de HIV o fragmentos de las mismas. En las realizaciones preferidas, la unidad de expresión de HIV está en un plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un constructo genético individual que tiene una única unidad de expresión de HIV que contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas de HIV o fragmentos de las mismas. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "constructo de una única unidad de expresión de HIV" haga referencia a un único constructo genético que contiene una única unidad de expresión de HIV. En las realizaciones preferidas, el único constructo de la unidad de expresión de HIV está en forma de un plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un único constructo genético que tiene más de una unidad de expresión de HIV en las que cada una contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas de HIV o fragmentos de las mismas. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "constructo genético de múltiples unidades de expresión de HIV" haga referencia a un único plásmido que contiene más de una unidad de expresión de HIV. En las realizaciones preferidas, un constructo de múltiples unidades de expresión de HIV está en forma de plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un único constructo genético que tiene dos unidades de expresión de HIV en las que cada una contiene secuencias de ADN que codifican una o más proteínas de HIV o fragmentos de las mismas. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "constructo genético de dos unidades de expresión de HIV" haga referencia a un único plásmido que contiene dos unidades de expresión de HIV, es decir un constructo genético de múltiples unidades de expresión de HIV que contiene dos unidades de expresión genética unitarias de expresión de HIV. En un constructo genético de dos unidades de expresión de HIV, se prefiere que una unidad de expresión funcione en dirección opuesta a la otra unidad de expresión de HIV. En las realizaciones preferidas, el constructo de dos unidades de expresión de HIV está en forma de un plásmido.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una vacuna genética de HIV que contiene un único constructo genético. El constructo genético único puede ser un constructo genético de una única unidad de expresión de HIV, un constructo genético de dos unidades de expresión o un constructo genético de múltiples unidades de expresión de HIV que contiene más de dos unidades de expresión de HIV.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una vacuna genética de HIV que contiene más de un constructo genético en un único inoculante.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una vacuna genética de HIV que contiene más de un constructo genético en más de un inoculante. Según se utiliza aquí, se pretende que el término "inoculante múltiple" haga referencia a una vacuna genética que comprende más de un constructo genético, cada uno de los cuales es administrado por separado. En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una vacuna genética de HIV que contiene dos constructos genéticos. Cada constructo genético puede ser, independientemente, un constructo genético de una única unidad de expresión de HIV, un constructo genético de dos unidades de expresión de HIV o un constructo de expresión de múltiples unidades de expresión de HIV que contiene más de dos unidades de expresión de HIV. En algunas realizaciones, ambos constructos genéticos son constructos genéticos de una única unidad de expresión de HIV. En algunas realizaciones, ambos constructos genéticos son constructos genéticos de dos unidades de expresión de HIV. En algunas realizaciones, ambos constructos genéticos son constructos genéticos de múltiples unidades de expresión de HIV. En algunas realizaciones, un constructo genético es un constructo genético de una única unidad de expresión de HIV y el otro es un constructo genético de dos unidades de expresión de HIV. Un experto normal en la técnica puede reconocer fácilmente y apreciar las muchas variaciones que dependen del número de constructos genéticos utilizados en una vacuna genética y del número de unidades de expresión de HIV que pueden estar presentes en cada constructo genético.

Se prefiere que los constructos genéticos de la presente invención no contengan ciertas secuencias de HIV, concretamente, aquellas que juegan un papel en el genoma del HIV que se integra en el material cromosómico de la célula en la cual se introduce. Se prefiere que los constructos genéticos de la presente invención no contengan LTR de HIV. De un modo similar, se prefiere que los constructos genéticos de la presente invención no contengan un sitio psi de HIV. Adicionalmente, se prefiere que el gen de la transcriptasa inversa sea suprimido y el gen de la integrasa sea suprimido. Entre las deleciones se incluyen la deleción de sólo algunos de los codones o la reposición de algunos de los codones con el fin de suprimir esencialmente el gen. Por ejemplo, se puede suprimir el codón de iniciación o se puede cambiar o desplazar fuera del marco para dar como resultado una secuencia de nucleótidos que codifique un incompleto o no funcional.

Asimismo se prefiere que los constructos genéticos de la presente invención no contengan un gen tat transcribible de HIV. El gen tat, que se solapa con el gen rev puede ser completamente suprimido sustituyendo los codones que codifican rev por otros codones que codifican el mismo aminoácido para rev pero que no codifican el aminoácido tat requerido en el marco de lectura en el cual está codificado tat. Alternativamente, sólo algunos de los codones están sujetos a cualquier cambio, esto es, esencialmente suprimen, el codón de iniciación para tat y/o cambian, es decir, esencialmente suprimen codones suficientes para dar como resultado una secuencia de nucleótidos que codifique un tat incompleto y no funcional.

Se prefiere que el constructo genético comprenda secuencias codificadoras que codifiquen péptidos que tengan al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de las proteínas gag, pol, env o rev de HIV. Es más preferido que un constructo genético comprenda secuencias codificadoras que codifiquen al menos una de las proteínas gag, pol, env o rev de HIV o fragmentos de las mismas. Se prefiere que un constructo genético comprenda secuencias codificadoras que codifiquen péptidos que tengan más de un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de las proteínas gag, pol, env o rev de HIV. Es más preferido que un constructo genético comprenda secuencias codificadoras que codifiquen más de una de las proteínas gag, pol, env o rev de HIV o fragmentos de las mismas.

En algunas realizaciones, un constructo genético comprende secuencias codificadoras que codifican péptidos que tienen al menos un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de las proteínas vif, vpr, vpu o nef de HIV. En algunas realizaciones, un constructo genético comprende secuencias codificadoras que codifican al menos una de las proteínas vif, vpr, vpu o nef de HIV o fragmentos de las mismas.

Un constructo genético de una única unidad de expresión de HIV puede comprender regiones codificadoras para uno o más péptidos que comparten al menos un epítopo con una proteína de HIV o un fragmento de la misma en una única unidad de expresión bajo el control regulador de un único promotor y una señal de poliadenilación. Se prefiere que los constructos genéticos codifiquen más de una proteína de HIV o fragmentos de las mismas. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. Se prefiere que el promotor sea un promotor de SV40 o un promotor de CMV, preferiblemente un promotor temprano inmediato de CMV. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal de poliadenilación funcional en una célula humana. Se prefiere que la señal de poliadenilación sea una señal de poliadenilación de SV40, preferiblemente la señal de poliadenilación menor de SV40. Si se proporciona más de una región codificadora en una única unidad de expresión, estás pueden estar inmediatamente adyacentes entre sí o separadas mediante regiones no codificadoras. Con el fin de ser expresada apropiadamente, una región codificadora debe tener un codón de iniciación y un codón de terminación.

Un constructo genético de dos unidades de expresión de HIV puede comprender regiones codificadoras para uno o más péptidos que comparten al menos un epítopo con una proteína de HIV o fragmento de la misma en cada una de las dos unidades de expresión. Cada unidad de expresión está bajo el control regulador de un único promotor y una señal de poliadenilación. En algunas realizaciones, se prefiere que los constructos genéticos codifiquen más de una proteína de HIV o fragmento de la misma. En algunas realizaciones, se prefiere que las secuencias de nucleótidos que codifican gag y pol estén presentes en una unidad de expresión y las secuencias de nucleótidos que codifican env y rev estén presentes en la otra. El promotor puede ser cualquier promotor funcional en una célula humana. Se prefiere que el promotor sea un promotor de SV40 o un promotor de CMV, preferiblemente un promotor de CMV temprano inmediato. La señal de poliadenilación puede ser cualquier señal de poliadenilación funcional en una célula humana. Se prefiere que la señal de poliadenilación sea una señal de poliadenilación de SV40, preferiblemente la señal de poliadenilación menor de SV40. Si se proporciona más de una región codificadora en una unidad de expresión, estás pueden estar inmediatamente adyacentes entre sí o separadas mediante regiones no codificadoras. Con el fin de ser expresada apropiadamente, una región codificadora debe tener un codón de iniciación y un codón de terminación.

Según algunas realizaciones de la presente invención, el epítopo que presenta reacción cruzada con el MHC de Clase II en env es suprimido y remplazado por la región análoga de HIV II.

Cuando un constructo genético contiene gag y/o pol, es generalmente importante que también esté presente rev. Además de rev, se puede proporcionar un elemento de respuesta a rev con gag y pol para un incremento de la expresión de esos genes.

Cuando se producen constructos genéticos se prefiere que el gen env utilizado en el plásmido 1 derive de productos aislados de MN o similares a MN incluyendo productos aislados clínicos que se asemejen a MN, preferiblemente productos aislados clínicos que no induzcan sincitios, preferiblemente aquellos que manifiestan tropismo hacia los macrófagos de productos aislados clínicos de la fase temprana.

Se pueden producir proteínas múltiples a partir de una única unidad de expresión mediante empalme alternativo. Las señales de empalme son proporcionadas para permitir el empalme alternativo que produce diferentes mensajes que codifican diferentes proteínas.

Ejemplo 46

La Figura 8 muestra cuatro esqueletos, A, B, C y D. La Figura 9 muestra 4 insertos, 1, 2, 3 y 4. El inserto 1 soporta la expresión de gag y pol; el elemento de respuesta rev fue clonado de manera que conservara el aceptor de empalme de HIV. El inserto 2 es similar al inserto 1 ya que soporta la expresión de gag y pol excepto que el elemento de respuesta a rev fue clonado sin conservar el aceptor de empalme de HIV. El inserto 3 soporta la expresión de gag y pol, incluye una deleción del gen de la integrasa y no incluye la presencia del elemento de respuesta a rev que actúa en cis. El inserto 4 soporta la expresión de rev, vpu y env. Env puede tener el epítopo que presenta reactividad cruzada con MHC de clase II alterado para eliminar la reactividad cruzada y el bucle V3 puede ser alterado para eliminar la posibilidad de formación de sincitios.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto A con el inserto 1. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori+ es el esqueleto A con el inserto 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA1ori- es el esqueleto A con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pA1ori+ o pA1ori- puede incluir la integrasa rindiendo pA1ori+int+ o pA1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA1ori+, pA1ori-, pA1ori+int+ y pA1ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pA1ori+RT-, pA1ori-RT-, pA1ori+int+RT- y pA1ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto A con el inserto 2. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori+ es el esqueleto A con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA2ori- es el esqueleto A con el inserto 2 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pA2ori+ o pA2ori- puede incluir la integrasa rindiendo pA2ori+int+ o pA2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA2ori+, pA2ori-, pA2ori+int+ y pA2ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pA2ori+RT-, pA2ori-RT-, pA2ori+int+RT- y pA2ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto B con el inserto 1. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori+ es el esqueleto B con el inserto 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB1ori- es el esqueleto B con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pB1ori+ o pB1ori- puede incluir la integrasa rindiendo pB1ori+int+ o pB1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pB1ori+, pB1ori-, pB1ori+int+ y pB1ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pB1ori+RT-, pB1ori-RT-, pB1ori+int+RT- y pB1ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto B con el inserto 2. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori+ es el esqueleto B con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pB2ori- es el esqueleto B con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pB2ori+ o pB2ori- puede incluir la integrasa rindiendo pB2ori+int+ o pB2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pB2ori+, pB2ori-, pB2ori+int+ y pB2ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pB2ori+RT-, pB2ori-RT-, pB2ori+int+RT- y pB2ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto A menos rev con el inserto 3. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori+ es el esqueleto A con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pA/r-3ori- es el esqueleto A menos rev con el inserto 3 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pA/r-3ori+ o pA/r-3ori- puede incluir la integrasa rindiendo pA/r-3ori+int+ o pA/r-3ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pA/r-3ori+, pA/r-3ori-, pA/r-3ori+int+ y pA/r-3ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pA/r-3ori+RT-, pA/r-3ori-RT-, pA/r-3ori+int+RT- y pA/r-3ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto C con el inserto 1. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori+ es el esqueleto C con el inserto 1 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC1ori- es el esqueleto C con el inserto 1 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pC1ori+ o pC1ori- puede incluir la integrasa rindiendo pC1ori+int+ o pC1ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC1ori+, pC1ori-, pC1ori+int+ y pC1ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pC1ori+RT-, pC1ori-RT-, pC1ori+int+RT- y pC1ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto C con el inserto 2. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori+ es el esqueleto C con el inserto 2 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC2ori- es el esqueleto C con el inserto 2 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pC2ori+ o pC2ori- puede incluir la integrasa rindiendo pC2ori+int+ o pC2ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC2ori+, pC2ori-, pC2ori+int+ y pC2ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pC2ori+RT-, pC2ori-RT-, pC2ori+int+RT- y pC2ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto C con el inserto 3. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori+ es el esqueleto C con el inserto 3 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pC3ori- es el esqueleto C con el inserto 3 sin el origen de replicación de SV40. Adicionalmente, pC3ori+ o pC3ori- puede incluir la integrasa rindiendo pC3ori+int+ o pC3ori-int+, respectivamente. Los plásmidos pC3ori+, pC3ori-, pC3ori+int+ y pC3ori-int+ pueden ser modificados adicionalmente suprimiendo funcionalmente el gen de la transcriptasa inversa (RT) rindiendo pC3ori+RT-, pC3ori-RT-, pC3ori+int+RT- y pC3ori-int+RT-, respectivamente.

En algunas realizaciones, se utiliza el esqueleto D con el inserto 4. Tales constructos contienen opcionalmente el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori+ es el esqueleto D con el inserto 4 y el origen de replicación de SV40. El plásmido pD4ori- es el esqueleto D con el inserto 4 sin el origen de replicación de SV40.

Ejemplo 47

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de una única unidad de expresión/único inoculante que comprende un constructo genético que incluye una secuencia codificadora que codifica un péptido que tiene al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a los epítopos de las proteínas de HIV. La secuencia codificadora está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40.

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de una única unidad de expresión/único inoculante que comprende un constructo genético que incluye una secuencia codificadora que codifica al menos una proteína de HIV o un fragmento de la misma. La secuencia codificadora está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40. La proteína de HIV se selecciona del grupo formado por gag, pol, env y rev. En algunas realizaciones se prefiere que la vacuna genética proporcionada comprenda un constructo genético que incluya una secuencia codificadora que codifice al menos dos proteínas de HIV o fragmentos de las mismas seleccionadas del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, se prefiere que la vacuna genética proporcionada comprenda un constructo genético que incluya una secuencia codificadora que codifique al menos tres proteínas de HIV o fragmentos de las mismas seleccionadas del grupo formado por gag, pol, env y rev ofragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, se prefiere que la vacuna genética proporcionada comprenda un constructo genético que incluya una secuencia codificadora que codifique gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas.

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de una unidad de expresión dual/único inoculante que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión genética cada una de las cuales comprende una secuencia codificadora que codifica un péptido que tiene al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a epítopos de las proteínas de HIV. La secuencia codificadora está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40. Las dos unidades de expresión están codificadas en direcciones opuestas entre sí.

En algunas realizaciones, se proporciona una vacuna genética de una unidad de expresión dual/único inoculante que comprende un constructo genético que incluye dos unidades de expresión cada una de las cuales comprende una secuencia codificadora que codifica al menos una proteína de HIV o un fragmento de la misma. Cada unidad de expresión comprende una secuencia codificadora que está bajo el control regulador del promotor temprano inmediato de CMV y la señal de poliadenilación menor de SV40. La proteína de HIV se selecciona del grupo formado por gag, pol, env, y rev. En algunas realizaciones se prefiere que la vacuna genética proporcionada comprenda un constructo genético que incluya dos unidades de expresión, al menos una de las cuales comprende una secuencia codificadora que codifica al menos dos proteínas de HIV o fragmentos de las mismas seleccionadas del grupo formado por gag, pol, env, y rev o fragmentos de las mismas y el otro comprende al menos una proteína de HIV o fragmentos de la misma seleccionada del grupo formado por gag, pol, env, y rev o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, se prefiere que la vacuna genética proporcionada comprenda un constructo genético que incluya dos unidades de expresión, al menos una de las cuales comprende una secuencia codificadora que codifica al menos tres proteínas de HIV o fragmentos de las mismas seleccionadas del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas y el otro comprende al menos una proteína de HIV o fragmentos de la misma seleccionada del grupo formado por gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, se prefiere que la vacuna genética proporcionada comprenda un constructo genético que comprenda dos unidades de expresión e incluya una secuencia codificadora que codifique gag, pol, env y rev o fragmentos de las mismas.

Ejemplo 48

Se elaboró un constructo genético, el plásmido pCMN160\Delta16, para su uso en un estuche farmacéutico o en una composición farmacéutica anti-HIV. pCMN160\Delta16 fue construido como sigue:

Etapa 1: Se utilizaron los cebadores SEC ID NUM: 35 y SEC ID NUM: 34, un fragmento PCR del ADN genómico de HIV/MN.

Etapa 2: Se utilizaron los cebadores SEC ID NUM: 33 y SEC ID NUM: 36, un fragmento PCR del ADN genómico de HIV/MN.

Etapa 3: Se combinaron los cebadores SEC ID NUM: 35 y SEC ID NUM: 36 con 2 \mul de material de reacción de las Etapas 1 y 2.

Etapa 4: El producto de reacción de la Etapa 3 fue cortado con NotI y MluI e insertado en el Esqueleto A descrito en el Ejemplo 46 cortado con NotI y MluI.

De ese modo se forma el plásmido pCMN160\Delta16 que contiene como inserto en el Esqueleto A una región codificadora que codifica la proteína ENV de la cepa MN con la región rev y media nef teniendo la región HLA-DB cambios para HIV-2.

Ejemplo 49

Se elaboró el plásmido pGAGPOL.rev2 como sigue. Primero se elaboró el esqueleto. Después, se generó un inserto con gag y pol de HIV y se insertó en el esqueleto.

El esqueleto se preparó como sigue:

Etapa 1: Digerir pMAMneo (Clonetech) con BglI. Rellenar con el fragmento de Klenow de la Polimerasa I. Cortar con HindIII. Purificar en gel el fragmento de 1763 pb.

Etapa 2: Amplificar el gen Kan^{R} del plásmido pJ4\Omegakan^{+} (gen de resistencia a la kanamicina obtenido de Pharmacia Inc. Clonado en pJ4\Omega obtenido como una donación de la Imperial Cancer Research Fund UK; pJ4\Omega fue
construido originalmente y referido en Morgenstern, J.P. y H. Land, Nucl. Acids Res. 18(4):1068, que se incorpora aquí como referencia) con los oligos SEC ID NUM: 37 y SEC ID NUM: 38. Volver romos los extremos de PCR. Cortar con HindIII. Purificar en gel el fragmento de la PCR.

Etapa 3: Ligar el esqueleto del vector generado a partir de pMAMneo y descrito en la etapa #1 con el producto de la PCR que codifica el gen Kan^{R} y descrito en el etapa #2. Aislar el plásmido que contiene el gen Kan^{R} y el origen de replicación bacteriano.

Etapa 4: Digerir el plásmido resultante con MluI, rellenar con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. Ligar con el conector SacII (New England Biolabs).

Etapa 5. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 4 con AseI y SspI.

Etapa 6. Someter a PCR parte del gen Kan^{R} del plásmido descrito en la etapa 3 utilizando los cebadores SEC ID NUM: 38 y SEC ID NUM: 40. Cortar el producto de la PCR con SspI y AseI.

Etapa 7. Ligar el fragmento más grande obtenido en la etapa 5 con el producto de la PCR obtenido en la etapa 6.

Etapa 8. Cortar el producto de la ligadura/plásmido obtenido en la etapa 7 con HindIII. Volver romos los extremos con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I.

Etapa 9. Cortar pCEP4 (Invitrogen) con SalI para liberar el fragmento de ADN que contiene el promotor de CMV, el poliligador, y el sitio poliA de SV40. Purificar este fragmento y volver romos los extremos con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I.

Etapa 10. Ligar el plásmido obtenido en la etapa 8 y el fragmento obtenido en la etapa 9. Aislar el plásmido que contiene el origen de replicación bacteriano, el gen Kan^{R}, el intensificador de RSV, el promotor de CMV, el polilgador, y el sitio poliA de SV40.

Etapa 11. Cortar el plásmido obtenido en la etapa 10 con BamHI y NheI.

Etapa 12. Recocer los oligonucléotidos SEC ID NUM: 41 y SEC ID NUM: 42.

Etapa 13. Ligar el plásmido obtenido en la etapa 10 con los oligonucleótidos recocidos obtenidos en la etapa 12. Aislar el plásmido que contiene el adaptador contenido en la etapa 12.

Etapa 14. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 13 con SalI y MluI.

Etapa 15. Amplificar mediante PCR el marco de lectura abierto de rev utilizando BBG35 (RD Systems Inc. Minneapolis, MN; que contiene la región codificadora para rev de la cepa de HIV HX3B en pUC19) como molde y los cebadores SEC ID NUM: 43 y SEC ID NUM: 44. Digerir el producto de la PCR con SalI y MluI.

Etapa 16. Ligar el plásmido obtenido en la etapa 14 con el producto de la PCR producido en la etapa 15. Aislar el plásmido que contiene la región codificadora de rev.

Preparación del inserto gag/pol

Etapa 1. Se clonó un subclon de parte del genoma de HIV-1 (HXB2) en Bluescript (Stratagene). El subclon de HIV-1 contiene la LTR 5' completa y el resto del genoma de HIV-1 hasta el nucleótido 5795 (Numeración de Genbank) clonado en los sitios XbaI y SalI de Bluescript. Las secuencias de HIV-1 se obtienen del plásmido HXB2D (AIDS Repository).

Etapa 2. Someter a PCR parte de la región codificadora de gag del marco de lectura abierto del plásmido descrito en la etapa 1 (el subclon de parte del genoma de HIV-1 HXB2 que está subclonado en Bluescript) utilizando los cebadores SEC ID NUM: 45 y SEC ID NUM: 46.

Etapa 3. Digerir el plásmido descrito en la etapa 1 (el subclon de parte del genoma de HIV-1 HXB2 que está clonado en Bluescript) con EcoRI. Purificar el plásmido que contiene el esqueleto de pBluescript, la LTR de HIV-1 5', la región codificadora de gag y parte de la región codificadora de pol y religar.

Etapa 4. Cortar el plásmido obtenido en la etapa 3 con NotI y SpeI y ligar con el fragmento de la PCR descrito en la Etapa 2 una vez que este ha sido digerido con NotI y SpeI. Aislar el plásmido que contiene el fragmento de la PCR en lugar del fragmento NotI/SpeI original que contiene la LTR de HIV-1 5'.

Etapa 5. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 4 con EcoRI y SalI.

Etapa 6. Recocer los oligonucleótidos SEC ID NUM: 47 y SEC ID NUM: 48.

Etapa 7. Ligar el plásmido obtenido en la etapa 5 con el adaptador obtenido en la etapa 6. Aislar el plásmido que contiene el adaptador clonado en los sitios EcoRI/SalI.

Etapa 8. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 7 con NdeI y EcoRI.

Etapa 9. Amplificar mediante PCR el Elemento de Respuesta Rev (RRE) de un plásmido que contiene la secuencia RRE de la cepa HXB2 de HIV-1 utilizando los cebadores SEC ID NUM: 49 y SEC ID NUM: 50. Digerir el producto de la PCR con NdeI y EcoRI.

Etapa 10. Ligar el plásmido obtenido en la etapa 8 con el producto de la PCR obtenido en la etapa 9. Aislar el plásmido que contiene el inserto con la secuencia RRE.

Etapa 11. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 10 con NotI y SalI y aislar el fragmento que contiene la región codificadora de gag, la región codificadora de pol modificada, y la secuencia RRE.

Etapa 12. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 16 del protocolo para preparar el esqueleto que se ha descrito antes con NotI y SalI.

Etapa 13. Ligar el plásmido obtenido en la etapa 12 con el inserto obtenido en la etapa 11. Aislar los plásmidos que contienen el inserto que contiene la región codificadora de gag, la región codificadora de pol modificada, y la secuencia RRE.

Etapa 14. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 13 con XbaI y NheI, volver romos los extremos y religar. Aislar el plásmido que carece del sitio KpnI que está presente entre los sitios XbaI y NheI en el plásmido obtenido en la etapa 13.

Etapa 15. Digerir el plásmido obtenido en la etapa 14 con KpnI y aislar el fragmento más grande.

Etapa 16. Recocer los oligonucleótidos SEC ID NUM: 51 y SEC ID NUM: 52.

Etapa 17. Ligar el fragmento plasmídico purificado obtenido en la etapa 15 con el adaptador obtenido en la etapa 16. Aislar el plásmido que contiene el adaptador insertado en el sitio KpnI del plásmido obtenido en la etapa 15.

Ejemplo 50 Inmunización Genética con Genes Para las Proteínas Reguladoras

Parte de la dificultad de combatir el HIV surge de la extraordinaria variabilidad del virus y de su capacidad para mutar rápidamente a nuevas formas. No sólo hay una sustancial variación en la secuencia de proteínas entre los productos aislados de HIV encontrados en la población humana en conjunto, sino que el virus muta tan rápidamente que cada individuo infectado con HIV alberga realmente numerosas microvariantes del HIV afines. Semejantes productos aislados de HIV manifiestan diferencias en la eficacia de replicación, el tropismo, la susceptibilidad de neutralización, y la resistencia a los fármacos. En cuanto aparecen mutantes resistentes a los fármacos, desaparecen los beneficios de la terapia con los fármacos. Con la AZT, la resistencia al fármaco surge típicamente en el primer año de terapia. Esta generación constante de mutantes de escape puede formar parte de la capacidad del HIV para finalmente vencer las defensas del huésped tras un largo período en el cual el virus parece haber sido contenido.

Se ha informado sobre esta tendencia mutacional en diversas regiones de la glicoproteína de la envuelta gp120, incluyendo el principal dominio neutralizador del bucle V3, y también en las proteínas núcleo del HIV. Las proteínas reguladoras del HIV están mucho más altamente conservadas que las proteínas estructurales y también manifiestan una tendencia mutacional menor a lo largo del tiempo. Por lo tanto las proteínas reguladoras presentan dianas atractivas para el ataque antiviral.

El HIV manifiesta una notable regulación temporal de la expresión de las proteínas reguladoras versus las estructurales. En la fase temprana de la replicación viral, predominan los ARNm que codifican las proteínas reguladoras Tat, Rev y Nef, mientras en la fase tardía, hay una mayor expresión de los ARNm que codifican las proteínas estructurales, incluyendo los precursores de Gag, Pol, y Env, y muchas proteínas accesorias. Esta tendencia de la fase temprana a la fase tardía es desencadenada cuando la proteína Rev alcanza un nivel concreto. La predominancia temprana de Tat, Rev y Nef en el ciclo de replicación viral también hace de estas proteínas dianas favorables para el ataque antiviral. Esto es especialmente cierto para tat y rev, que desempeñan papeles absolutamente esenciales en la regulación transcripcional y post-traduccional de la expresión génica de HIV, y predominan pronto en el ciclo de replicación viral, antes de la transcripción de las proteínas estructurales virales y la producción de partículas virales infecciosas.

En contraste con tat y rev, que desempeñan claramente papeles esenciales en la replicación de HIV, otras proteínas reguladoras tales como nef, vpr, vif, y vpu son referidas a veces como proteínas "accesorias". Sus funciones son menos conocidas, y el grado al cual es atenuada la replicación viral por la pérdida de una función concreta varía considerablemente y puede depender de la célula huésped que está siendo infectada. Sin embargo, la fuerte conservación de tales funciones entre los productos aislados ampliamente diversos, así como otros virus de inmunodeficiencia de primates, sugiere la importancia de estas funciones "accesorias" en el procedimiento de infección natural. (Ver en general, Terwilliger, E.F., (1992) AIDS Research Reviews 2:3-27, W.C. Koff, F. Wong-Staal, y R.C. Kennedy, eds. (New York: Marcel Dekker, Inc.). De hecho, los virus recombinantes de primates con vpr, nef, o vif no son patógenos in vivo, demostrando adicionalmente la importancia de estos genes accesorios en el ciclo vital del virus.

Existe una cierta evidencia de que se podían lograr respuestas inmunes más protectoras, de mayor nivel contra el HIV presentando una pocas proteínas reguladoras y/o enzimáticas selectas, en lugar del complemento completo de genes de HIV. Por consiguiente, una estrategia de inmunización enfocada puede implicar deseablemente la inmunización genética utilizando secuencias codificadoras para una o más proteínas de HIV no estructurales, reguladoras, incluyendo tat, rev, vpr, nef, vpu o vif. Se ha descubierto que sólo vpr está asociada con partículas virales, mientras las otras proteínas reguladoras, incluyendo tat, rev, nef, vif y vpu, no están asociadas con el virión.

En algunas realizaciones de la inmunización genética contra el HIV utilizando genes reguladores, uno o más de los genes de tat, rev, nef, vif y vpu son insertados en el esqueleto A que es descrito en el Ejemplo 46. Se prefiere utilizar tat y/o rev. En algunas realizaciones, se insertan tat o rev en el esqueleto A que se describe en el Ejemplo 46. En algunas realizaciones, en orden descendente de conveniencia como dianas están nef, vpr, vif, y vpu. Preferiblemente, se empleará más de un gen regulador, incluyendo tat y rev; tat, rev y nef; tat, rev, nef, y vpr; tat, rev, nef, vpr, y vif; tat, rev, nef, vpr, vif, y vpu; así como las combinaciones de los mismos; y, opcionalmente, genes reguladores adicionales tales como tev.

La proteína Tat es un transactivador de la expresión génica dirigida por la LTR. Es absolutamente esencial para la replicación de HIV. Tat es producida temprano en el ciclo de replicación viral y la Tat funcional es requerida para la expresión de Gag, Pol, Env y Vpr. La forma predominante de Tat es una proteína de 86 aminoácidos derivada de dos ARNm exónicos. Los 58 aminoácidos amino terminales son suficientes para la transactivación, aunque con una actividad reducida. Tat actúa sobre la secuencia que actúa en cis denominada tar, para producir un notable incremento en la expresión génica dirigida por LTR. Tat puede actuar en parte a través de la síntesis de ARN incrementada y en parte aumentando la cantidad de proteína sintetizada por el transcrito de ARN. Hasta hace poco, se pensaba que Tat actuaba sólo sobre la LTR de HIV-1. Sin embargo, también se ha informado sobre la expresión activada por Tat del promotor tardío del virus JC. Tat también puede estimular la proliferación celular como un factor exógeno, y puede jugar un papel contributivo al promover el crecimiento del sarcoma de Kaposi en individuos infectados por HIV. Debido a tales efectos potencialmente perjudiciales tanto en individuos infectados por HIV como no infectados, los constructos tat preferidos empleados para la inmunización genética son modificados para expresar sólo la Tat no funcional. Las mutaciones capaces de inactivar Tat o Rev pueden además actuar como mutaciones trans-dominantes, inactivando potencialmente de ese modo cualquier Tat funcional que esté siendo producida en un individuo infectado por HIV.

Rev es la segunda proteína reguladora de HIV que es esencial para la replicación viral. Es una proteína de 19 kD (116 aminoácidos) que es expresada a partir de dos exones codificadores encontrados en una variedad de ARNm múltiplemente ensamblados. Se han identificado dos dominios distintos, una región alcalina implicada en la unión a transcritos que contienen RRE (elemento de respuesta a Rev) y un dominio de "activación" que induce exportaciones nucleares de tales transcritos como resultado de la unión. En el transcurso de la infección viral natural, se requiere Rev para la expresión de las proteínas estructurales de HIV Gag, Pol, y Env, así como Vpr.

Vpr es una proteína de 15 kD (96 aminoácidos) en la mayoría de las cepas de HIV-1, aunque el marco de lectura abierto de Vpr está generalmente truncado en muchas cepas virales pasadas frecuentemente por cultivo celular. El marco de lectura abierto de vpr también está presente en HIV-2 y en la mayoría de los productos aislados de SIV. Vpr es la primera proteína reguladora retroviral que se ha encontrado que está asociada con las partículas virales de HIV. Su presencia en el virión de HIV sugiere que puede cumplir una función en algún momento temprano del ciclo de replicación viral. Vpr acelera la replicación del HIV, especialmente al principio de la infección. Vpr incrementa el nivel de expresión de los genes informadores conectados a la LTR de HIV aproximadamente tres veces. Por otra parte, Vpr y Tat parecen actuar sinérgicamente con respecto a los genes ligados a LTR. Vpr puede ser aislada del suero de individuos infectados por el HIV y parece incrementar la capacidad del virus para infectar nuevas células. También se ha encontrado que Vpr inhibe las proliferaciones celulares e induce la diferenciación celular (Levy, D.N. y col., Cell (1993) 72:1-20), un descubrimiento que puede ser significativo en vista de los informes de que los monocitos/macrófagos primarios son infectables in vitro sólo mientras se experimenta diferenciación (Schuitemaker, H. y col., (1992) J. Clin. Invest. 89:1154-1160. Incluso las células que son incapaces de soportar la replicación del HIV pueden ser desreguladas por los efectos de Vpr. Por ejemplo, Vpr puede ser responsable del desgaste muscular frecuentemente observado en los pacientes de SIDA. Debido a la actividad potencialmente perjudicial de Vpr, la inmunización genética se llevará a cabo preferiblemente con un constructo vpr modificado que expresará una proteína Vpr no funcional.

Nef (también denominada 3' orf en la literatura en el pasado) es una proteína 25-27 kD. Se ha sugerido que Nef puede estar implicada en la infrarregulación de los linfocitos T CD4+. Además, Nef puede jugar un papel en la señalización de la célula. Nef parece ser importante para el establecimiento de la infección por HIV in vivo. Se cree que los CTL específicos de Nef son importantes en el control de la infección por HIV in vivo.

Vif es una proteína citoplásmica de 23 kD denominada "factor de infectividad viral". Aunque los virus mutantes carentes de Vif no están comprometidos con respecto a la distribución célula a célula, muestran un profundo descenso en la capacidad para infectar muchas líneas celulares CD4+. Sin Vif, hay un descenso de virus en ciernes, y un descenso de la infectividad. En estudios con primates, los mutantes por deleción de Vif muestran una capacidad severamente disminuida para establecer la infección in vivo. Estos estudios apoyan el papel clínico de Vif en la replicación del virus en un huésped.

Vpu es una proteína de 15-20 kD (81 aminoácidos). Aunque los virus Vpu(+) y Vpu(-) producen la misma cantidad de proteína viral, los últimos muestran un aumento de la acumulación intracelular de proteínas virales junto con un descenso del virus extracelular. Esto sugiere que Vpu puede estar implicada en el ensamblaje y/o la liberación de las partículas virales.

Los retrovirus simples, tales como los virus murinos y aviares, carecen de proteínas análogas a las proteínas reguladoras de HIV-1, HIV-2 y SIV. En tales animales la infección retroviral tiende a ser autolimitante, con aclaramiento del virus y descenso de la patogenicidad. De un modo similar, HTLV-1, que incluye solo Tax (que actúa muy parecido a Tat y también manifiesta actividad de tipo vpr) y Rex (que actúa muy parecido a Rev) es aclarado de muchos individuos. La inmunización genética con genes reguladores es considerada relevante no sólo para el HIV, sino también para virus tales como HBV (producto génico X) y HCV, y HTLV-1 (Tax) y (Rex). En todos estos virus se cree que los genes reguladores juegan un papel crítico en el ciclo vital del virus y el establecimiento de la infección.

Ejemplo 51 Construcción del Plásmido Regulador de HIV-1, pREG

El plásmido pREG es construido por etapas, y cada intermedio puede ser sometido a ensayo en cuanto a la expresión de proteínas antes de continuar con la construcción. Se construye un vector de expresión que soporta la expresión de tat y rev por medio de dos etapas. Primero, se amplifica a partir de un molde sintético un producto de amplificación que contiene un sitio NheI 5', el sitio donador del empalme principal de HIV-1, la mayoría de la región codificadora de tat, la región codificadora de la región amino terminal de la proteína rev y un sitio AvaII. Este molde sintético es generado utilizando las secuencias publicadas de la cepa HXB2 de HIV-1 obtenida de GenBank Database, y es alterada para que mute los restos cisteínas de las posiciones 22 y 30 de la proteína tat. Estas mutaciones han demostrado que vuelven tat no funcional (Kuppuswamy, y col., (1989) Nucleic Acids Research 17(9): 3551-3561).

El producto de la PCR es ligado en un vector que es digerido con NheI y AvaII y que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del Sarcoma de Rous, la región codificadora de rev y una señal de poliadenilación de SV40. La secuencia de rev presente en el plásmido deriva del clon proviral de HIV-1 III_{B}. Este generará un vector de expresión de contiene una región codificadora de tat, completa pero mutada y una región codificadora de rev completa.

La etapa posterior se realiza para generar un producto de la PCR que contiene un sitio AvaII en su extremo 5', una mutación en la posición del aminoácido 81 de rev, aproximadamente el 30% de la región codificadora de ref, aproximadamente el 30% de la región codificadora de nef y un sitio MluI en el extremo 3'. Se ha demostrado que el cambio de aminoácido en la posición 81 elimina la función rev, y por lo tanto, el plásmido resultante conducirá a la producción de la proteína rev no funcional (Bogard, H. y Greene, W.C. (1993) J. Virol. 67(5):2496-2502). Se supone que la principal deleción de la región codificadora de nef dará como resultado la producción de una proteína nef no funcional. El sitio AvaII 5' y la mutación en la posición del aminoácido 81 de la proteína rev se introducen en el cebador de la PCR 5' que es complementario a la región codificadora de rev que contiene tanto el sitio AvaI como el aminoácido 81 que codifica el nucleótido. Un codón de parada que ocasiona la terminación de Nef en la posición del aminoácido 63 y el sitio de clonación codificador de 3', MluI, serán introducidos por el cebador de la PCR 3'. El molde para esta amplificación mediante PCR es un plásmido o molde sintético que contiene las regiones codificadoras de rev y nef de la cepa MN de HIV-1. El producto de la PCR resultante será digerido con AvaII y MluI, y utilizado para remplazar el fragmento AvaII-MluI más pequeño que resulta tras la digestión del plásmido tat-rev descrito en el párrafo anterior con AvaII y MluI.

Opcionalmente, vpr puede ser añadido a este plásmido en uno de los dos sitios. En un enfoque, vpr puede ser amplificado utilizando un cebador de PCR 5' que contiene el sitio MluI aguas arriba de las secuencias que abarcan el codón de iniciación de la traducción de vpr y un cebador de PCR 3' complementario al codón de parada de vpr y las secuencias que lo flanquean que también contienen un sitio de clonación MluI. Las secuencias aguas arriba del codón de iniciación contienen un aceptor de empalme. El producto de la PCR puede ser digerido con MluI e insertado en el plásmido tat rev nef descrito antes tras su digestión con MluI.

Alternativamente, la amplificación de vpr puede ser realizada de una manera análoga, sin embargo, los cebadores de la PCR contendrían sitios de restricción compatibles con la clonación en otro vector de manera que éste sea expresado bajo el control de un segundo promotor eucariótico. La casete derivada de este plásmido, que contiene el segundo promotor seguido de la región codificadora de vpr, seguida de una secuencia poliA, podría ser liberada mediante digestión con enzimas de restricción que flanquean la casete, pero no cortada con ella. El fragmento de ADN resultante sería clonado en un sitio único del plásmido tat, rev, vpr que cae fuera de la región necesaria para la expresión de tat rev vpr. De este modo, se forma un plásmido que tiene dos unidades de expresión.

Ejemplo 52 Construcción de Plásmidos de HCV y HTLV-1

Se puede utilizar un enfoque similar para generar un plásmido que expresa las proteínas codificadas por HTLV-1 o HCV que tienen las funciones enzimáticas requeridas para el ciclo vital del virus y/o para las proteínas reguladoras de estos virus. Para el HTLV-1, se genera un plásmido que codifica la proteína reguladora, TAX, utilizando el esqueleto plasmídico y una estrategia de clonación similar a las descritas antes. Entre tales genes de HCV que codifican las proteínas enzimáticas se incluyen la ARN polimerasa ARN dependiente, una proteína que tiene función de helicasa/proteasa. Las secuencias necesarias están publicadas y son asequibles por medio de GenBank. La organización viral de HTLV-1 y HCV se publican en Cann, A.J. y Chen. I.S.Y. Virology 2ª Edición, editado por B.N. Fiddr, Raven Press, Ltd., Nueva York, 1990 y Bradley, D.W. Transfusion Medicine Reviews, 1(2):93-102, 1992, respectivamente.

Ejemplo 53 Inmunización Genética con Genes Enzimáticos

La inmunización genética con genes que codifican proteínas con funciones enzimáticas, tales como el gen pol de HIV también puede ser una importante estrategia antiviral puesto que las enzimas tales como Pol son necesarias para la producción de virus vivo. Sin la polimerasa o cualquiera de sus funciones componentes, el HIV es no patógeno y no infeccioso. De un modo similar, los genes enzimáticos de otros virus, tales como la polimerasa de HBV, son dianas atractivas para la inmunización genética. Ver, v.g., Radziwill y col., Mutational Analysis of the Hepatitis B Virus P Gene Product: Domain Structure and RNase H Activity, J. Virol. 64 (2): 613-620 (1990).

Una razón del atractivo de las enzimas virales como diana inmunológica es la capacidad limitada de tales enzimas para mutar su secuencia de aminoácidos y todavía mantener sus funciones enzimáticas. Por ejemplo, con HIV-1, Pol manifiesta un número limitado de mutaciones de "escape" que están asociadas con la resistencia a análogos de nucleótidos tales como la AZT. Sin embargo, la inmensa mayoría de las dianas inmunológicas dentro de la proteína están preservadas incluso en los mutantes de escape a los fármacos.

Ejemplo 54 Construcción del Plásmido de la Polimerasa de HBV

Los experimentos referidos en la literatura indican que la expresión de la polimerasa de HBV ha sido lograda en células de cultivo de tejidos cuando los marcos de lectura abiertos tanto del núcleo como de la polimerasa están presentes en una molécula de ARNm. Asimismo se ha demostrado que en esta situación, la mutación de la ATG núcleo no influía en la expresión de la polimerasa.

El genoma de HBV es amplificado a partir de un plásmido que contiene un dímero cabeza-cola de la cepa ADW de HBV. Debido a que se desea la expresión de la polimerasa solamente, y no la del núcleo, el cebador de la PCR 5' es diseñado para mutar los codones de iniciación de la traducción del prenúcleo y el núcleo. Además, este cebador también introduce una secuencia DR1 mutante para eliminar la posibilidad de generación de un ARN genómico de replicación competente. Este producto de la PCR es colocado en un plásmido que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del Sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40. Los codones de iniciación de la traducción para el antígeno de superficie y el producto de la región codificadora de X son mutados para evitar la expresión de los productos del gen HBS y X.

Según otro enfoque para lograr la expresión de la polimerasa de HBV, se amplifica un producto de PCR que codifica la región codificadora de la polimerasa completa y se clona en un vector que contiene un gen de resistencia a la kanamicina y un origen de replicación de pBR322. Además, este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del Sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40. El cebador de la PCR 5' para esta amplificación contiene un sitio de clonación y abarca el codón de iniciación de la traducción del gen de la polimerasa. El producto de la PCR 3' contiene un sitio de restricción para clonar el inserto en el vector de expresión y asimismo es complementario al codón de parada tradicional del gen de la polimerasa de HBV y las secuencias que flanquean este codón de parada. Tras la ligadura de este producto de la PCR en un plásmido que contiene el gen de resistencia a la kanamicina, un origen de replicación de pBR322, un promotor de citomegalovirus, un intensificador del virus del sarcoma de Rous, y una señal de poliadenilación de SV40, los codones de inicio de la traducción para los genes del antígeno de superficie de la Hepatitis B y X se mutan para evitar la expresión de estos productos génicos. Se utiliza una estrategia alternativa similar a la descrita antes, sin embargo, el cebador de la PCR 3' en este caso incluye la señal poliA de HBV y secuencias que flanquean esta señal. Este cebador 3' se utiliza en el caso en el que esas secuencias que incluyen y/o rodean la señal poliA de HBV son importantes para la expresión. El análisis mutacional ha demostrado que la función del producto génico de la polimerasa de HBV puede ser eliminado mediante cambios concretos de nucleótidos (Radziwell, G. y col. (1990) J. Virol. 64:(2):613-620). Antes de utilizar un plásmido construido como se ha descrito antes, se puede mutar la polimerasa expresada mediante la introducción de una de estas mutaciones u otras que sean análogas.

Ejemplo 55

El factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) muestra efectos estimuladores sobre una variedad de linajes celulares incluyendo neutrófilos, monocitos/macrófagos y eosinófilos. Los efectos de GM-CSF hacen de él un modelo terapéutico atractivo. El GM-CSF ha sido aprobado por la FDA para su uso en el transplante de médula ósea autólogo y se han iniciado las pruebas clínicas para someter a ensayo la eficacia en el tratamiento de diversas neutropenias. En la actualidad, el GM-CSF es administrado como una proteína que normalmente requiere ser administrada en múltiples dosis. Las proteínas deben ser producidas y purificadas.

Un enfoque alternativo al uso de la proteína GM-CSF es la administración directa de un constructo génico que contiene un gen que codifica GM-CSF junto con la administración de bupivacaína. El constructo genético es construido mediante PCR de un gen de GM-CSF que incluye una secuencia señal. El constructo genético contiene preferiblemente un gen de resistencia a la kanamicina (gen de la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa), un origen de replicación bacteriano, secuencias que apoyan la expresión de la región codificadora de GM-CSF en las células en las que se introduce el plásmido como los vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 46. El plásmido contiene preferiblemente un origen de replicación de mamífero inducido por la replicación celular asociada con la administración de bupivacaína. Si se utiliza el origen de replicación de EBV, la secuencia que codifica el antígeno nuclear EBNA-1 también es incluido con las secuencias reguladoras apropiadas. Los cebadores para la amplificación mediante PCR del inserto contienen sitios para las enzimas de restricción para permitir la clonación en el vector de expresión y son complementarios a los extremos 5' y 3' de las secuencias codificadoras de GM-CSF. La reacción de PCR se realiza con un clon de ADNc como describen Lee y col. en Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:4360-4364.

Ejemplo 56

La leucemia mielógena crónica (CML) es un trastorno mieloproliferativo clónico de las células del tallo hematopoyético asociado con el cromosoma Philadelphia; una anomalía cromosómica resultante de la translocación entre los cromosomas 9 y 22. Los puntos de rotura del cromosoma 22 son agrupados en una región de 6 kb denominada región de agrupamiento de los puntos de rotura (BCR), mientras en el cromosoma 9, los puntos de rotura están dispersos por toda la región de 90 kb aguas arriba del exón 2 c-abl. Las diversas translocaciones 9:22 que resultan pueden ser subdivididas en dos tipos: translocaciones K28 y translocaciones L6. La transcripción por medio de la translocación bcr-abl da como resultado la generación de ARNm de fusión. Se ha demostrado que las secuencias antisentido dirigidas a la unión bcr-abl de los ARNm disminuye la capacidad de las células hematopoyéticas obtenidas de pacientes con CML para formar colonias.

Un constructo genético que codifica el antisentido es administrado junto con la bupivacaína a las células de un individuo que padece CML ex vivo. Las células tratadas son reintroducidas después en el individuo.

Ejemplo 57

Se construyen constructos génicos útiles en estuches y composiciones farmacéuticas para la vacunación y el tratamiento contra HBV con los vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 46. Los plásmidos contienen genes estructurales de HBV, concretamente genes que codifican el antígeno de superficie de HBV y/o el antígeno núcleo de HBV y/o antígeno prenúcleo de HBV.

Ejemplo 58

Se construyen constructos génicos útiles en estuches y composiciones farmacéuticas para la vacunación y el tratamiento contra HCV con los vectores descritos como esqueletos en el Ejemplo 46. Los plásmidos contienen genes estructurales de HCV, concretamente genes que codifican proteínas núcleo de HCV y/o la proteína de la envuelta de HCV.

Ejemplo 59

Se diseñó el constructo génico pREV que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica rev de HIV como única proteína diana. La secuencia codificadora de rev es clonada en el Esqueleto A descrito en el Ejemplo 46 a partir de BBG35 (RD Systems Inc. Minneapolis, MN) que contiene la región codificadora de rev de la cepa HXB3 de HIV en pUC19.

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TABLA 1

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Familia Picornavirus

Géneros:: Rhinovirus: (Medicina) responsable de \sim50% de los casos de resfriado común.

\quad: Etherovirus: (Medicina) incluye polivirus, coxsackievirus, echovirus, y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A.

\quad: Apthovirus: (Veterinaria) estos son los virus de las enfermedades de las patas y la boca.

: Antígenos diana: VP1, VP2, VP3, VP4, VPG

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Familia Calcivirus

Géneros:: Grupo de virus de Norwalk: (Medicina) estos virus son un importante agente causal de las gastroenteritis epidémicas.

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Familia Togavirus

Géneros:: Alfavirus: (Medicina y Veterinaria) entre los ejemplos se Incluyen los virus Senilis, el virus RossRiver y la encefalitis Equina Oriental y Occidental.

\quad: Reovirus: (Medicina) Virus de la Rubeola.

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Familia Flariviridae

\quad: Entre los ejemplos se incluyen: (Medicina) virus del dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis Japonesa, la encefalitis de St. Louis y la encefalitis proveniente de ácaros.

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\quad: Virus de la Hepatitis C: (Medicina) estos virus todavía no se sitúan en una familia pero se cree que son o bien togavirus o bien flavivirus. La mayor similitud es con la familia togavirus.

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Familia Coronavirus: (Medicina y Veterinaria)

\quad: Virus de la bronquitis infecciosa (aves)

\quad: Virus gastroentérico transmisible porcino (cerdos)

\quad: Virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdo)

\quad: Virus de la Peritonitis infecciosa felina (gato)

\quad: Coronavirus entérico felino (gato)

\quad: Coronavirus canino (perro)

\quad: Los coronavirus respiratorios humanos causan \sim 40 casos de resfriado común humano. EJ. 224E, OC43 Nota - los coronavirus pueden causar hepatitis no A, B o C

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: Antígenos diana:

\quad: E1 - también denominado proteína matriz o M

\quad: E2 - también denominado proteína S o "espina"

\quad: E3 - también denominado proteína HE o hemaglutinin-esterasa (no presente en todos los coronavirus)

\quad: N - nucleocápsida

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Familia Rhabdovirus

Géneros:: Vesiliovirus

\quad: Lyssavirus: (medicina y veterinaria) Rabia

: Antígeno Diana: Proteína G

\quad: Proteína N

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Familia Filoviridae: (Medicina)

\quad: Virus de la fiebre hemorrágica tales como el virus de Marburg y Ebola

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Familia Paramyxovirus:

Géneros:: Paramyxovirus: (medicina y Veterinaria)

\quad: Virus de las parotiditis, Virus de la enfermedad de New Castle (importante patógeno en pollos)

\quad: Morbilivirus: (Medicina y Veterinaria)

\quad: Sarampión, el Moquillo canino

\quad: Pneuminvirus: (Medicina y Veterinaria)

\quad: Virus Respiratorio Sincitial

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Familia Orthomyxovirus (Medicina)

\quad: Virus Influenza

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Familia Bungavirus:

Géneros:: Bungavirus: (Medicina) Encefalitis de California, LA Crosse

\quad: Phlebovirus: (Medicina) Fiebre del Valle del Rift

\quad: Hantavirus: Puremala es un virus de la fiebre hemahagin

\quad: Nairvirus (Veterinaria) enfermedad del ganado de Nairobi

\quad: También muchos bungavirus no asignados

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Familia Arenavirus (Medicina)

\quad: LCM, virus de la fiebre de Lassa

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Famila Reovirus

Géneros:: Reovirus: un posible patógeno humano

\quad: Rotavirus: gastroenteritis aguda en niños

\quad: Orbivirus: (Medicina y Veterinaria)

\quad: Fiebre del Acaro de Colorado, Lebombo (humanos), encefalosis equina, lengua azul

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Familia Retrovirus

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: Sub-Familia:

\quad: Oncovirinal: (Veterinaria) (Medicina)

\quad: Virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII

\quad: Lentivirinal: (Medicina y Veterinaria)

\quad: HIV, virus de la inmunodeficiencia felina, infecciones equinas, virus de la anemia

\quad: Spumavirinal

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Familia Papovavirus

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: Sub-Familia:

\quad: Polyomavirus: (Medicina) Virus BKU y JCU

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: Sub-Familia:

\quad: Papillomavirus: (Medicina) muchos tipos virales asociados con cánceres o progresos malignos de papilomas.

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Adenovirus (Medicina)

\quad: EJ AD7, ARD., O.B. - causa enfermedad respiratoria - algunos adenovirus tales como 275 ocasiona enteritis

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Familia Parvovirus (Veterinaria)

\quad: Parvovirus felina: causa enteritis felina

\quad: Panleucopeniavirus felino

\quad: Parvovirus canino

\quad: Parvovirus porcino

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Familia Herpesvirus

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: Sub-Familia: Alfaherpesviridae

Géneros:: Simplexvirus (Medicina)

\quad: HSVI, HSVII

\quad: Varicelovirus: (Medicina - Veterinaria)

\quad: Pseudorrabia - varicela zoster

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: Sub-Familia: Betaherpesviridae

Géneros:: Citomegalovirus (Medicina)

\quad: HCMV

\quad: Muromegalovirus

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: Sub-Familia: Gammaherpesviridae

Géneros:: Linfocritovirus (Medicina)

\quad: EBV - (linfoma de Burkitt)

\quad: Rhadinovirus

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Familia Poxvirus

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: Sub-Familia: Cordopoxiviridae (Medicina - Veterinaria)

Géneros:: Variola (Viruela)

\quad: Vaccinia (Cowpox)

\quad: Parapoxivirus - Veterinaria

\quad: Auipoxvirus - Veterinaria

\quad: Capripoxvirus

\quad: Leporipoxvirus

\quad: Suipoxvirus

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: Sub-Familia: Entemopoxviridae

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Famila Hepadnavirus

\quad: Virus de la Hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

No Clasificado

\quad: Virus de la hepatitis delta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Patógenos bacterianos

: Entre los cocos gram-positivos patógenos se incluyen: los neumocócicos, estafilocócicos y estreptocócicos.

: Entre los cocos gram-negativos meningocócicos se incluyen: los meningocócicos y gonocócicos.

\vskip1.000000\baselineskip

: Entre los bacilos gram-negativos entéricos patógenos se incluyen: enterobacteriáceas; pseudomonas, acinetobacterias y eikennella; melioidosis; salmonella, shigellosis; haemophilus; chancroide; brucellosis; tularemia; yersinia (pasteurella); estreptobacillus moniliformis y espirillum; listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; difteria; cólera; anthrax; donovanosis (granuloma inguinal); y bartonellosis.

\vskip1.000000\baselineskip

: Entre las bacterias anaerobias patógenas se incluyen: tétanos; botulismo; otros clostridios; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Entre las enfermedades espiroquetales patógenas se incluyen: sífilis; tripanomatosis; frambesia, pinta y sífilis endémica; y leptospirosis.

: Entre otras infecciones causadas por patógenos bacterianos superiores y hongos patógenos se incluyen: actinomicosis, nocardiosis, criptococosis, balstomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis, mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis.

: Entre las infecciones por rickettsias se incluyen rickettsial y rickettsiosis.

\vskip1.000000\baselineskip

: Entre los ejemplos de infecciones por micoplasmas y clamidias se incluyen: micoplasma pneumoniae; linfogranuloma venéreo; psittacosis; e infecciones clamidiales perinatales.

\vskip1.000000\baselineskip

Eucariotas patógenos

: Entre los protozoos y helmintos patógenos y las infecciones por los mismos se incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocistis carinii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; infecciones por nematodos; trematodos o gusanos; y cestodos (tenia).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Weiner, David B.

\hskip3.9cm

Williams, William V.

\hskip3.9cm

Wang, Bin

\hskip3.9cm

Coney, Leslie R.

\hskip3.9cm

Merva, Michael J.

\hskip3.9cm

Zurawski, Vincent R., Jr.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Compositions and Methods for Delivery of Genetic Material

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 52

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIONES DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Woodcock Wasburn Kurtz

\hskip5.6cm

Mackiewicz & Norris

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: One Liberty Place 46th Floor

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Philadelphia

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Pennsylvania

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 19103

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE CON EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0,

\hskip6cm

Versión #1,25 mb-MD/JAF

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/125.012

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-SEP-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/124.962

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21-SEP-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/093.235

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-JUL-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/029.336

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-MAR-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/008.342

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-ENE-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: DeLuca, Mark

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 33.229

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: APOL-0013

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 215-568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 215-568-3429

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGCGTCTCG AGACAGAGGA GAGCAAGAAA TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCCCTCTA GATAAGCCAT CCAATCACAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGATCCA TGAAAAAATA TTTATTGGG

\hfill

29

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGTCGACT TATTTTAAAG CGTTTTTAAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGTTTTG GATCCTTAAA AAAGGCTTGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTGAGGGA CAGAATTCCA ATCAGGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTGATATC CCGGGAGACT CCTC

\hfill

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATAGAAGA ACTCCTCTAG AATTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTTAGGCG GATCCTATGG CAGGAAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGATGGGT GGCCATGGTG AATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly}

\sac{Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gln Arg Gly Pro Gly}

\sac{Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Arg Ile Lys Gln Phe Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly}

\sac{Lys Ala Met Thr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Ile Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Ile Lys Asp Gln Gln Leu}

\sac{Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTTAACT TTTGATCGAT CCATTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTTGTATC GATGATCTGA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAGTAGCA AAAGAAATAG TTAAG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCTTAAC TATTTCTTTT GCTAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTGTCGAC TGGTTTCAGC CTGCCATGGC AGGAAGAAGC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGACGCGTA TTCTTTAGCT CCTGACTCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGACGGTA GCGGCCGCAC AATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTAAAGCG GCCGCAATTG TT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 23:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTA GACATGATAA GATACATTG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCAGCTG GATCCCAGCT TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATTTCTGG GGATCCAAGC TAGT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATAGGATCC GCGCAATGAA AGACCCACC T

\hfill

31

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATGGATCC GCAATGAAAG ACCCCCGCTG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAAGCGGCC GCTCCTATGG CAGGAAGACG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTC TTATGCTTCT AGCCAGGCAC AATG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTT TATTACAGAA TGGAAAACAG ATGGCAGGTG

\hfill

40

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACGCGTT ATTGCAGAAT TCTTATTATG GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGCTTGGA GAGGATTATA GAAGTACTGC AAGAGCTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATCCTCTC CAAGCCTCAG CTACTGCTAT AGCTGTGGGC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAATAAAG CGGCCGCTCC TATGGCAGGA AGAGAAGCG

\hfill

39

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAATTAC GCGTCTTATG CTTCTAGCCA GGCACAATG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTG GGAATGCTCT GCCAGTGTTA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGCCGGA AGGGCACAAT AAAACTGTCT GCTTAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGATTCAG GTGAAAATAT TGTTGATGCG CTG

\hfill

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 111 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTCGACTG GTTTCAGCCT GCCATGGCAG GAAGAAGC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCACGACG CGTCTATTCT TTAGCTCCTG ACTCC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGCGGCCG CGTAAGTGGA GAGAGATGGT GCGAG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGTGGGGC TGTTGGCTCT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTTTTTG GGCATATGTA TGAGGGACAA TTGGAGAAGT G

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 70 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTATCTGG CATGGGTAC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 52:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGCCAGA TACTGGTAC

\hfill

29

Claims

1. El uso de un intensificador de la función de un polinucleótido y una molécula de ácido nucleico, donde dicha molécula de ácido nucleico está libre de partículas retrovirales es susceptible de ser expresada en las células de un individuo, en la fabricación de una composición para introducir material genético en las células de un individuo poniendo en contacto las células de dicho individuo con dicho intensificador de la función de un polinucleótido y administrar a las células de dicho individuo dicha molécula de ácido nucleico donde el intensificador de la función de un polinucleótido tiene una de las siguientes fórmulas:

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, m-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, donde el grupo amino de los compuestos aminobenceno puede ser amino, alquil(C_{1}-C_{5})amino, dialquil(C_{1}-C_{5})amino y las sustituciones de los compuestos sustituidos son halógeno, alquilo C_{1}-C_{5} y alcoxi C_{1}-C_{5};

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{3} es hidrógeno, amina, alquil(C_{1}-C_{5})amina, dialquil- (C_{1}-C_{5})(C_{1}-C_{5})amina;

R^{5} es C=NH;

2. El uso de un intensificador de la función de un polinucleótido y una molécula de ácido nucleico, donde dicha molécula de ácido nucleico está libre de partículas retrovirales y es susceptible de ser expresada en las células de un individuo, en la fabricación de una composición para inmunizar a un individuo contra un patógeno poniendo en contacto las células de dicho individuo con dicho intensificador de la función de un polinucleótido y administrar a las células de dicho individuo dicha molécula de ácido nucleico, donde en cualquier caso el intensificador de la función de un polinucleótido tiene una de las siguientes fórmulas:

\newpage

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, m-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, donde el grupo amino de los compuestos aminobenceno puede ser amino, alquil(C_{1}-C_{5})amino, dialquil(C_{1}-C_{5})(C_{1}-C_{5})amino y las sustituciones de los compuestos sustituidos son halógeno, alquilo C_{1}-C_{5} y alcoxi C_{1}-C_{5};

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{5} es C=NH;

3. El uso de un intensificador de la función de un polinucleótido y una molécula de ácido nucleico, donde dicha molécula de ácido nucleico está libre de partículas retrovirales y es susceptible de ser expresada en las células de un individuo, en la fabricación de una composición para introducir material genético en las células de un individuo poniendo en contacto las células de dicho individuo con dicho intensificador de la función de un polinucleótido y administrar a las células de dicho individuo dicha molécula de ácido nucleico, o en la fabricación de una composición para inmunizar a un individuo contra un patógeno poniendo en contacto las células de dicho individuo con dicho intensificador de la función de un polinucleótido y administrar a las células de dicho individuo dicha molécula de ácido nucleico, donde en cualquier caso el intensificador de la función de un polinucleótido es piperocaína, meprilcaína, isobucaína, procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína, cloroprocaína, metabutamina, primacaína, paretoxicaína, lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína, prilocaína, dibucaína, benzocaína, diclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, metil-bupivacaína, butasin-picrato, fenacaína, diotan, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina, cocaína, cinamoilcocaína, truxilina, o cocaetileno, donde los compuestos pueden adicionalmente formar complejos con hidrocloruro.

4. El uso de la reivindicación 1, 2 ó 3 donde dicho intensificador de la función de un polinucleótido es la bupivacáina.

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína y está conectada operablemente a secuencias reguladoras.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de un antígeno contra el cual se desea una respuesta inmune, dicha secuencia de nucleótidos está conectada operablemente a secuencias reguladoras.

7. El uso de la reivindicación 6, donde dicha proteína es un antígeno patógeno o un fragmento del mismo.

8. El uso de la reivindicación 7, donde dicho patógeno es un virus seleccionado del grupo formado por: el virus de la inmunodeficiencia humana HIV; el virus de la leucemia de las células T humanas, HTLV; el virus de la influenza; el virus de la hepatitis A, HAV; el virus de la hepatitis B, HBV; el virus de la hepatitis C, HCV; el virus del papiloma humano, HPV; el virus del Herpes simplex 1, HSV1; el virus del Herpes simplex 2, HSV2; el Citomegalovirus, CMV; el virus de Epstein-Barr, EBV; rhinovirus; y coronavirus.

9. El uso de la reivindicación 7, donde dicho patógeno es el HIV y dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HIV.

10. El uso de la reivindicación 7, donde dicho patógeno es el HIV y dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica más de una proteína estructural de HIV.

11. El uso de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, donde dicho patógeno es el HIV y dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica más de una proteína reguladora de HIV.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde al menos dos o más moléculas de ácido nucleico diferentes son administradas a diferentes células de un individuo, dichas moléculas de ácido nucleico diferentes comprenden cada una secuencias codificadoras que codifican uno o más antígenos patógenos del mismo patógeno.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde dicha molécula de ácido nucleico es administrada intramuscularmente.

15. El uso de la reivindicación 7, donde:

dicho individuo es un humano;

dicho patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana; y

dicha molécula de ácido nucleico es ADN y comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales de HIV gag y pol con una deleción de psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag con pol conectado operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

16. El uso de la reivindicación 15, donde dicha secuencia de ADN comprende adicionalmente un elemento de respuesta rev de HIV y una deleción de la integrasa de HIV.

17. El uso de la reivindicación 15 o la reivindicación 16, donde dicha secuencia de ADN comprende adicionalmente un aceptor de empalme de HIV.

18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde dicha molécula de ADN comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica rev de HIV conectado operablemente a un promotor de SV40 y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

19. El uso de la reivindicación 18, donde dichas secuencias de ADN que codifican rev codifican adicionalmente vpu de HIV y env de HIV.

20. El uso de la reivindicación 7, donde:

dicho individuo es un humano;

dicho patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana;

dicha molécula de ácido nucleico es ADN y comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas rev, vpu y env de HIV conectado operablemente al intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

\newpage

21. El uso de la reivindicación 7, donde:

dicho individuo es un humano;

dicho patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana;

se administran dos moléculas de ADN diferentes a diferentes células de un individuo; una de dichas moléculas de ácido nucleico es ADN y comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales de HIV gag ypol con una deleción en psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol conectada operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

la otra de dichas moléculas de ácido nucleico es ADN y comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas de HIV rev, vpu y env conectada operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

22. El uso de la reivindicación 6, donde

se administran dos moléculas de ácido nucleico diferentes a células de un individuo; comprendiendo cada una de dichas moléculas de ácido nucleico diferentes una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de al menos un antígeno de HIV conectado operablemente a secuencias reguladoras; siendo capaces dichas secuencias de ácido nucleico de ser expresadas en dichas células; las secuencias de nucleótidos de cada una de dichas diferentes moléculas de ácido nucleico codifican proteínas diferentes; dichas proteínas comprenden al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de al menos una de las proteínas de HIV codificadas por los genes de HIV seleccionados del grupo formado por gag, pol y env.

23. El uso de la reivindicación 6, donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana que comprende un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de una proteína asociada con las células que caracterizan una enfermedad conectada operablemente a secuencias reguladoras;

donde dicha molécula de ácido nucleico está libre de partículas retrovirales y es susceptible de ser expresada en dichas células.

24. El uso de la reivindicación 23, donde dicha enfermedad está caracterizada por células hiperproliferativas.

25. El uso de la reivindicación 23 o la reivindicación 24, donde dicha molécula de ácido nucleico se administra intramuscularmente.

26. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana seleccionada del grupo formado por: productos proteicos de los oncogenes myb, myc, fyn, ras, sarc, neu, y trk; productos proteicos del gen de translocación bcl/abl; P53; EGRF; regiones variables de anticuerpos elaborados por los linfomas de las células B; y regiones variables de los receptores de las células T de los linfomas de las células T.

27. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde dicha proteína se secciona del grupo formado por: regiones variables de anticuerpos implicados en enfermedades autoinmunes mediadas por las células B; y regiones variables de receptores de las células T implicados en enfermedades autoinmunes mediadas por las células T.

28. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 27, donde la composición comprende adicionalmente una molécula más de ácido nucleico que codifica una citoquina o una linfoquina.

29. El uso de la reivindicación 28, donde dicha molécula de ácido nucleico adicional codifica el interferón-\alpha, el interferón \gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 o IL-12.

30. El uso de la reivindicación 28, donde dicha molécula de ácido nucleico adicional codifica IL-12 o GM-CSF.

31. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada del grupo formado por: enzimas, proteínas estructurales, citoquinas, linfoquinas y factores de crecimiento.

32. El uso de la reivindicación 31, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el interferón-\alpha, el interferón \gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 o IL-12.

\newpage

33. El uso de la reivindicación 31, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IL-12 o GM-CSF.

34. Una composición farmacéutica que comprende

a) una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales de HIV gag y pol con una deleción de psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol conectada operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus, y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

b) un intensificador de la función del nucleótido que tiene una de las siguientes fórmulas:

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, m-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, donde el grupo amino de los compuestos aminobenceno puede ser amino, alquil(C_{1}-C_{5})amino, dialquil(C_{1}-C_{5}) amino y las sustituciones de los compuestos sustituidos son halógeno, alquilo C_{1}-C_{5} y alcoxi C_{1}-C_{5};

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{5} es C=NH;

35. Una composición farmacéutica que comprende:

a) una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas estructurales de HIV gag y pol con una deleción de psi, dicha secuencia de ADN que codifica gag y pol conectada operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

b) un intensificador de la función de un polinucleótido es piperocaína, meprilcaína, isobucaína, procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína, cloroprocaína, metabutamina, primacaína, paretoxicaína, lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína, prilocaína, dibucaína, benzocaína, diclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, metil-bupivacaína, butasin-picrato, fenacaína, diotan, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina, cocaína, cinamoilcocaína, truxilina, o cocaetileno, donde los compuestos pueden adicionalmente formar complejos con hidrocloruro.

36. La composición farmacéutica de la reivindicación 34 o 35, donde dicho intensificador de la función de un polinucleótido es la bupivacaína.

37. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, donde dicha secuencia de ADN comprende adicionalmente un elemento de respuesta a rev de HIV y una deleción de la integrasa de HIV.

38. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, donde dicha secuencia de ADN comprende adicionalmente un aceptor de empalme de HIV.

39. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, donde dicha molécula de ADN comprende adicionalmente una secuencia de ADN que codifica rev de HIV conectado operablemente a un promotor de SV40 y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40.

40. La composición farmacéutica de la reivindicación 39, donde dicha secuencia de ADN que codifica rev codifica adicionalmente vpu de HIV y env de HIV.

41. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 40 que comprende adicionalmente una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una citoquina o una linfoquina.

42. La composición farmacéutica de la reivindicación 41, donde dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el interferón-\alpha, el interferón-\gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 o IL-12.

43. La composición farmacéutica de la reivindicación 42, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IL-12 o GM- CSF.

44. Una composición farmacéutica que comprende

a) una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas de HIV rev, vpu, y env conectadas operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40: y

b) un intensificador de la función del polinucleótido que tiene una de las siguientes fórmulas:

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{5} es C=NH;

45. Una composición farmacéutica que comprende:

a) una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica las proteínas de HIV rev, vpu y env conectadas operablemente a un intensificador del virus del sarcoma de Rous, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus y una señal de poliadenilación menor de SV40 y opcionalmente un origen de replicación de SV40; y

46. La composición farmacéutica de la reivindicación 44 o 45, donde dicho intensificador de la función de un polinucleótido es la bupivacaína.

47. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 que comprende adicionalmente una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una citoquina o una linfoquina.

48. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, donde dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el interferón-\alpha, el interferón-\gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 o IL-12.

49. La composición farmacéutica según la reivindicación 47, donde dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IL-12 o GM-CSF.

50. El uso de un intensificador de la función del polinucleótido y una molécula de ácido nucleico, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína cuya presencia compensará la pérdida, no funcionamiento o funcionamiento parcial de una proteína o produce un efecto terapéutico sobre un individuo, dicha secuencia de nucleótidos conectada operablemente a secuencias reguladoras, donde dicha molécula de ácido nucleico está libre de partículas retrovirales y es susceptible de ser expresada en las células del individuo, en la fabricación de una composición para el tratamiento de una enfermedad (auto)inmune, donde dicho intensificador de la función del polinucleótido tiene una de las siguientes fórmulas:

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{5} es C=NH;

51. El uso de un intensificador de la función del polinucleótido y una molécula de ácido nucleico, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína cuya presencia compensará la pérdida, no funcionamiento, o funcionamiento parcial de una proteína o producirá un efecto terapéutico en un individuo, dicha secuencia de nucleótidos conectada operablemente a secuencias reguladoras, donde dicha molécula de ácido nucleico está libre de partículas retrovirales y es susceptible de ser expresada en las células del individuo, en la fabricación de una composición para el tratamiento de una enfermedad (auto)inmune, donde dicho intensificador de la función del polinucleótido es piperocaína, meprilcaína, isobucaína, procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína, cloroprocaína, metabutamina, primacaína, paretoxicaína, lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína, prilocaína, dibucaína, benzocaína, diclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, metil-bupivacaína, butasin-picrato, fenacaína, diotan, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina, cocaína, cinamoilcocaína, truxilina, o cocaetileno, donde los compuestos pueden adicionalmente formar complejos con hidrocloruro.

52. El uso de la reivindicación 50 ó 51, donde dicho intensificador de la función del polinucleótido es la bupivacaína.

53. El uso de la reivindicación 50 ó 51, donde dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

54. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 50 a 53, donde dicha molécula de ácido nucleico es administrada intramuscularmente.

55. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 50 a 54, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada del grupo formado por: enzimas, proteínas estructurales, citoquinas, linfoquinas y factores de crecimiento.

56. El uso de la reivindicación 55, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el interferón-\alpha, el interferón-\gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 o IL-12,

57. El uso de la reivindicación 55, donde dicha molécula de ácido nucleico comprende un nucleótido que codifica IL-12 o GM-CSF.

\newpage

58. Una composición farmacéutica que comprende:

i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada del grupo formado por: proteínas que comprenden al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de un antígeno patógeno; proteínas que comprenden un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de una proteína asociada a células hiperproliferativas; las proteínas que comprenden un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de una proteína asociada con las células que caracterizan una enfermedad autoinmune; proteínas cuya presencia compensará la pérdida, no funcionamiento o funcionamiento parcial de una proteína en un individuo; y proteínas que producen un efecto terapéutico en un individuo; y

ii) un intensificador de la función del polinucleótido;

donde dicha composición farmacéutica está libre de partículas retrovirales, y donde dicho intensificador de la función del polinucleótido tiene una de las siguientes fórmulas:

Ar - R^{1} - O - R^{2} - R^{3}

o

Ar - N - R^{1} - R^{2} - R^{3}

o

R^{4} - N - R^{5} - R^{6}

o

R^{4} - O - R^{1} - N - R^{7}

donde:

R^{1} es C=O;

R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10} incluyendo alquilos ramificados;

R^{5} es C=NH;

59. Una composición farmacéutica que comprende:

i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína seleccionada del grupo formado por: proteínas que comprenden al menos un epítopo que es idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de un antígeno patógeno; proteínas que comprenden un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de una proteína asociada a células hiperproliferativas; proteínas que comprenden un epítopo idéntico o sustancialmente similar a un epítopo de una proteína asociada con las células que caracterizan una enfermedad autoinmune; proteínas cuya presencia compensará la pérdida, no funcionamiento o funcionamiento parcial de una proteína en un individuo; y proteínas que producen un efecto terapéutico en un individuo; y

ii) un intensificador de la función del polinucleótido;

donde dicha composición farmacéutica está libre de partículas retrovirales, y donde dicho intensificador de la función del polinucleótido es piperocaína, meprilcaína, isobucaína, procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína, cloroprocaína, metabutamina, primacaína, paretoxicaína, lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína, prilocaína, dibucaína, benzocaína, diclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, metil-bupivacaína, butasin-picrato, fenacaína, diotan, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina, cocaína, cinamoilcocaína, truxilina, o cocaetileno, donde los compuestos pueden adicionalmente formar complejos con hidrocloruro.

60. La composición de la reivindicación 58 o 59, donde dicho intensificador de la función del polinucleótido es la bupivacaína.

61. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 58 a 60, que comprende adicionalmente una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una citoquina o una linfoquina.

62. La composición farmacéutica según la reivindicación 61, donde dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el interferón-\alpha, el interferón-\gamma, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 o IL-12.

63. La composición farmacéutica según la reivindicación 61, donde dicha segunda molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica IL-12 o GM-CSF.