ES2321048T3 - Celulas hospedadoras que expresan eritropoyetina humana recombinante. - Google Patents
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Abstract
Una célula hospedadora que comprende un primer vector y un segundo vector, en la que dicho primer vector comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de eritropoyetina que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos no incluye regiones no codificadoras 5'' y 3'' del gen de EPO; (ii) un promotor vírico; y (iii) un terminador vírico; y en la que dicho segundo vector comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dihidrofolato-reductasa (DHFR).
Description
Células hospedadoras que expresan eritropoyetina
humana recombinante.
La presente invención se refiere, en general, a
una célula hospedadora según se define en las reivindicaciones, que
comprende un primer vector que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una eritropoyetina (EPO) humana
recombinante. En particular, el vector de expresión comprende sólo
un promotor que regula la expresión de EPO. La presente invención
también se refiere a un método para producir EPO, según se define
en las
reivindicaciones.
reivindicaciones.
EPO es una glucoproteína que estimula la
diferenciación de los eritoblastos en la médula ósea, incrementando
así el recuento de eritrocitos en sangre circulante. La vida media
de los eritrocitos en seres humanos es de 120 días y, por lo tanto,
un ser humano pierde 1/120 eritrocitos cada día. Esta pérdida debe
ser restituida continuamente para mantener un nivel adecuado de
glóbulos rojos.
La existencia de EPO se postuló por primera vez
a finales de siglo y fue definitivamente demostrada por Reissman y
Erslev al principio de la década de los años 50. Véanse Carnot y
col., C.R. Acad. Sci. (Francia) 143:
384-386 (1906); Carnot y col., C.R. Acad.
Sci. (Francia), 143: 432-435 (1906);
Carnot y col., C.R. Soc. Biol., 111:
344-346 (1906); Carnot, C.R. Soc. Biol.,
111: 463-465 (1906); Reissman, Blood,
5: 372-380 (1950) y Erslev, Blood,
8: 349-357 (1953). Los experimentos de
Reissman y Erslev fueron pronto confirmados por otros
investigadores. Véanse, Hodgson y col., Blood, 9:
299-309 (1954); Gordon y col., Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., 86: 255-258 (1954) y Borsook
y col., Blood, 9: 734-742 (1954).
La identificación del sitio de producción de EPO
en el organismo fue un tema de debate. Experimentos sucesivos
condujeron a la identificación del riñón como el principal órgano y
de las células intersticiales peritubulares como el sitio de la
síntesis. Véanse, Jacobson y col., Nature, 179:
633-634 (1957); Kuratowska y col., Blood,
18: 527-534 (1961); Fisher, Acta
Hematol., 26: 224-32 (1961); Fisher y
col., Nature, 205: 611-612 (1965);
Frenkel y col., Ann. N. Y Acad. Sci., 149:
292-293 (1968); Busuttil y col., Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., 137: 327-330 (1971);
Busuttil, Acta Haematol., (Suiza), 47:
238-242 (1972); Erslev, Blood, 44:
77-85 (1974); Kazal, Ann. Clin. Lab. Sci.,
5: 98-109 (1975); Sherwood y col.,
Endocrinology, 99: 504-510 (1976);
Fisher, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 28:
101-122 (1988); Jelkmann y col., Exp.
Hematol., 11: 581-588 (1983); Kurtz y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80:
4008-4011 (1983); Caro y col., J. Lab. Clin.
Med., 103: 922-931 (1984); Caro, y col.,
Exp. Hematol., 12: 357 (1984); Schuster y col.,
Blood, 70: 316-318 (1986); Bondurant y
col., Mol. Cell. Biol., 6: 2731-2733
(1986); Schuster y col., Blood, 71:
524-527 (1988); Koury y col., Blood,
71: 524-527 (1988); Lacombe y col., J.
Clin. Invest., 81: 620-623 (1988); Koury
y col., Blood, 74: 645-651 (1989).
Una proporción más pequeña, que varía del 10% al
15% de la EPO total, es producida por el hígado en adultos. Véanse,
Naughton y col., J. Surg. Oncol., 12:
227-242 (1979); Liu y col., J. Surg. Oncol.,
15: 121-132 (1980); Dornfest y col.,
Ann. Clin. Lab. Sci., 11: 37-46
(1981); Dinkelaar y col., Exp. Hematol., 9:
796-803 (1981); Caro y col., Am. J. Physiol.,
244: 5 (1983); Dornfest y col., J. Lab. Clin. Med.,
102: 274-285 (1983); Naughton y col., Ann.
Clin. Lab. Sci., 13: 432-438 (1983);
Jacobs y col., Nature,: 806-810 (1985);
Erslev y col., Med. Oncol. Tumor. Pharmacother., 3:
159-164 (1986). La EPO producida es directamente
proporcional al grado de hipoxia tisular y su expresión aumenta al
incrementar el número de células productoras de EPO.
La EPO ha demostrado tener una gran eficiencia
en el tratamiento de la anemia, especialmente de la anemia derivada
del fracaso renal. Véanse, Eschbach y col., N. England J. of
Med., 316: 73-78 (1987); Krane, Henry
Ford Hosp. Med. J., 31: 177-181 (1983).
Su utilidad terapéutica, sin embargo, ha sido limitada debido a la
no disponibilidad de un método de producción masiva. La cantidad y
cualidad de la EPO obtenida mediante los sistemas de extracción
conocidos fueron insuficientes. Recientemente, el uso de la
tecnología del DNA recombinante ha hecho posible obtener cantidades
grandes de proteínas. La aplicación de estas técnicas a células
eucariotas ha posibilitado una producción de EPO a gran escala.
Véanse las Patentes de EE. UU. 5.688.679 (concedida a Powell),
5.547.933 (concedida a Lin), 5.756.349 (concedida a Lin), 4.703.008
(concedida a Lin) y 4.677.195 (concedida a Hewick y col.).
En la actualidad, las técnicas del DNA
recombinante son muy conocidas y utilizadas. Estas técnicas implican
el uso de elementos genéticos tales como fragmentos de DNA y
enzimas para ensamblar y transferir construcciones genéticas para
la producción de proteínas recombinantes. Las técnicas de DNA
recombinante facilitan también el estudio de mecanismos biológicos.
Véanse, Frank-Kamenetskii, "Unraveling
DNA" [Samaia Glavnaia Molekula] (Addison Wesley
Longman Inc., Reading, Massachusetts, 1997); Brown, "Gene
Cloning" (Chapman y Hall, Londres, Inglaterra, 1995); Watson
y col.,"Recombinant DNA", 2ª Ed. (Scientific American
Books, Nueva York, Nueva York, 1992); Alberts y col.,
"Molecular Biology of the Cell" (Garland Publishing
Inc., Nueva York, Nueva York, 1990); Innis y col.,
compiladores,"PCR Protocols. A Guide to Methods and
Applications" (Academic Press Inc., San Diego,
California, 1990); Ehrlich, compilador, "PCR Technology.
Principles and Applications for DNA Amplification"
(Stockton Press, Nueva York, Nueva York, 1989); Sambrook y
col., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Bishop y col.,
"Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical
Approach" (IRL Press, 1987); Reznikoff, compilador,
"Maximizing Gene Expression" (Butterworths
Publishers, Stoneham, Massachusetts, 1987); Davis y col.,
"Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier
Science Publishing Co., Nueva York, Nueva York, 1986); Watson,
"The Double Helix" (Penguin Books USA Inc., Nueva
York, Nueva York, 1969).
El documento WO 86/03520 describe un método para
la producción de eritropoyetina.
Yanagi y col., J. Fermentation and
Bioingineering, Vol. 68, núm. 4 (1989), páginas
257-263, describen un elevado nivel de expresión
del cDNA de la eritropoyetina humana en células Namalwa
transfectadas de manera estable.
El documento US 5.618.698 describe la producción
de eritropoyetina.
La presente invención proporciona una célula
hospedadora que comprende un primer vector y un segundo vector, en
la que dicho primer vector comprende: (a) una secuencia de
nucleótidos que codifica el polipéptido de eritropoyetina que
consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, en la que
dicha secuencia de nucleótidos no incluye regiones no codificadoras
5' y 3' del gen de EPO; (b) un promotor vírico; y (c) un terminador
vírico, y en la que dicho segundo vector comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica dihidrofolato-reductasa
(DHFR).
La presente invención también proporciona una
célula hospedadora depositada como DSM ACC2397.
La presente invención proporciona por lo tanto
una línea de células eucariotas que produce EPO humana recombinante,
obtenida mediante medios de transfección con un vector de expresión
que comprende un gen que codifica EPO humana, según se define en
las reivindicaciones. El vector comprende además un promotor vírico
único y un terminador como elementos de control de la expresión. El
SEQ ID NO: 1 identifica la secuencia de aminoácidos codificada por
el gen usado.
La invención proporciona una célula hospedadora,
según se define en las reivindicaciones, que comprende un primer
vector y un segundo vector, en la que dicho primer vector comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la
eritropoyetina, que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 1, un promotor vírico y un terminador vírico.
La invención proporciona además un método según
se define en las reivindicaciones, para producir un polipéptido de
EPO, que comprende cultivar la célula hospedadora anteriormente
mencionada en unas condiciones tales que dicho polipéptido se
expresa y es recuperado.
Una de las ventajas de esta invención es que el
gen utilizado que codifica EPO no incluye fragmentos no
codificadores de las regiones 5' y 3'. Sin embargo, el sistema
reivindicado produce una cantidad inesperadamente alta de EPO.
Una ventaja adicional de esta invención es el
uso de vectores de expresión que comprenden solamente un promotor,
según se define en las reivindicaciones, que exhibe una elevada
productividad de EPO. Utilizando el método reivindicado, es posible
obtener más de 50 mg de EPO por litro de cultivo celular, por día,
es decir, más de cinco veces el nivel de producción de EPO
reivindicado por el mejor de los métodos hasta ahora descritos que
utilizan un único promotor.
La combinación del gen que codifica EPO,
reivindicado en esta invención, y un simple promotor, mostró,
sorprendentemente, funcionar eficientemente, dando como resultado
una célula estable productora de EPO. Las células transfectadas
produjeron una cantidad de EPO comparable a, o incluso más alta que
las cantidades descritas usando construcciones genéticas en teoría
más adecuadas, aunque más complejas y difíciles de manipular.
Una ventaja adicional de la invención
reivindicada es la cotransfección con dos vectores que confieren
diferente resistencia, simplificando y facilitando de este modo la
selección, la amplificación genética y el mantenimiento de las
células cotransfectadas productoras de EPO.
Otros objetivos y ventajas de la presente
invención se harán manifiestos a partir de la descripción que viene
a continuación.
La Figura 1 ilustra un análisis en gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) de una muestra de EPO
obtenida siguiendo el método descrito después de su purificación.
En las pistas 1, 4 y 7, se cargaron marcadores de peso molecular.
En las pistas 2, 3, 5 y 6, se procesaron diferentes cantidades de
EPO pura obtenida conforme al procedimiento reivindicado. La pureza
del producto obtenido y el peso molecular aparente que excede los 30
kDa es coincidente con el que se ha descrito para la EPO urinaria
humana, según pudo observarse claramente.
La Figura 2 ilustra un análisis de transferencia
Western de una muestra de EPO obtenida conforme al método descrito.
Se determina la identidad de la EPO producida, ya que es reconocida
por un anticuerpo monoclonal dirigido contra EPO humana. En las
pistas 1 y 2 se cargaron un estándar de EPO humana y marcadores de
peso molecular respectivamente. Las muestras de EPO obtenidas según
el método reivindicado se cargaron en las pistas de
3 a 5.
3 a 5.
La Figura 3 muestra un análisis de
SDS-PAGE de una muestra de EPO pura de una muestra
de EPO obtenida conforme al método descrito, y tratada además con
glucanasas. Los marcadores de peso molecular se cargaron en las
pistas 1, 4 y 8. Las pistas 2 y 7 corresponden a EPO no tratada. En
la pista 3, se cargó EPO tratada con O-glucanasa;
se verificó la presencia de un sitio de
O-glucosilación. En la pista 5, se cargó EPO
parcialmente digerida con N-glucanasa. Se puede
verificar la presencia de moléculas 3 N-glucosiladas
con pesos moleculares como los esperados para EPO. La pista 6 se
cargó con EPO digerida con N-glucanasa y se obtuvo
el peso molecular esperado para la proteína completamente
desglucosilada.
La Figura 4 ilustra un estudio de puntos
isoeléctricos en muestras de EPO pura producidas conforme al método
descrito. Las muestras de EPO se procesaron en las pistas 2, 3 y 4,
y los marcadores de punto isoeléctrico se procesaron en las pistas
1 y 5. Se verificó la presencia de isoformas que correspondían a
EPO, que mostraron un intervalo de puntos isoeléctricos de 3,0 a
4,5.
La base biológica de la tecnología del DNA
recombinante se podría resumir de la siguiente manera.
El DNA (ácido desoxirribonucleico) es el
material genético de todas las células vivas y de algunos virus.
Cadenas poliméricas de cuatro nucleótidos diferentes forman el DNA,
siendo cada uno de ellos una purina o una pirimidina unida a una
desoxirribosa. El resto azucarado está a su vez unido a un grupo
fosfato. Estos cuatro nucleótidos son: adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T).
Las cadenas de DNA se forman por medio de
uniones fosfotriéster entre los nucleótidos, en las que el fosfato
situado en la posición 5' de la desoxirribosa de uno de los
nucleótidos está unido a la posición 3' de la desoxirribosa del
nucleótido anterior. La síntesis in vivo tiene lugar de 5' a
3', que es la dirección convencional adoptada para describir las
secuencias de DNA.
El DNA funcional se presenta en forma de una
doble hélice de bases complementarias, en la que las cadenas se
mantienen juntas por medio de enlaces de hidrógeno formados entre
las A y las C de una de las cadenas y las T y las G de la cadena
complementaria, respectivamente. Esta es la razón por la que se hace
referencia a ellas como "pares de bases".
Las cadenas también son antiparalelas, es decir,
el extremo 5' de cada una de las hélices está emparejado con el
extremo 3' de la otra hélice, como se representa a continuación:
5'-TACGTAC-3'
3'-ATGCATC-5'
\vskip1.000000\baselineskip
Para que la síntesis de proteínas tenga lugar,
determinadas regiones codificadoras del DNA se transcriben primero
en RNA mensajero (mRNA). El mRNA se traduce a su vez en una
proteína. Cada una de las regiones codificadoras del DNA se
denomina gen.
La síntesis de cadenas de RNA (ácido
ribonucleico) implica la transcripción de determinadas regiones
génicas por acción de enzimas denominadas
RNA-polimerasas. Una cadena antiparalela de RNA,
complementaria al molde de DNA, se obtiene de esa manera. Cada A
del DNA se corresponderá con una U en el RNA, cada C con una G, cada
G con un C y cada T con una A. La molécula de RNA se caracteriza
también porque es menos estable que el DNA. Además, el resto
azucarado en el RNA es ribosa en lugar de desoxirribosa como sucede
en el DNA. El RNA se distingue además del DNA por la sustitución de
uracilo (U) en lugar de timina (T).
- DNA Matriz
- 5'- - - - - - - - - - - - ACGTAG - - - - - -3'
- mRNA sintetizado
- 3'- - - - - - - - - - - - UGCAUC - - - - - -5'
\vskip1.000000\baselineskip
En células eucariotas, el mRNA sintetizado es
procesado en los núcleos (procesamiento por corte y empalme) para
dar como resultado el mRNA maduro. Este procesamiento no se constata
en bacterias.
El mRNA maduro se usa luego como matriz para ser
traducido en una proteína, en un proceso en el que el RNA de
transferencia (tRNA, pequeñas cadenas de RNA que portan aminoácidos
y que los alinean de manera específica para que formen una
proteína) y los ribosomas son los principales participantes. Tres
bases del mRNA (triplete o codón) codifican cada uno de los
aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia AUG en el mRNA codifica el
aminoácido metionina. Las cadenas de RNA se traducen de este modo
en una secuencia peptídica específica, que al final se pliega dando
lugar a una proteína activa. La síntesis de proteínas se denomina
"expresión".
La cantidad de proteína expresada depende, entre
otros factores, de la presencia de determinadas regiones de DNA
denominadas promotores, que afectan a la velocidad a la que el
proceso de expresión tiene lugar. Además, existen secuencias de DNA
que indican la terminación de la transcripción (terminadores) y
codones que indican el final de la traducción (codones de
terminación).
La tecnología del DNA implica el aislamiento de
fragmentos de DNA, ya sean naturales o sintéticos, y su inserción
dentro de células (es decir, células de bacterias, levaduras,
insectos y mamíferos) para hacerlas capaces de producir proteínas
heterólogas tales como EPO. Las proteínas obtenidas mediante la
tecnología del DNA recombinante se denominan proteínas
recombinantes.
El campo de aplicación de la tecnología del DNA
recombinante no se limita a las células en cultivo, ya que los
genes se pueden también incorporar a organismos multicelulares (es
decir, plantas, insectos, mamíferos y peces).
La expresión de proteínas heterólogas requiere
los siguientes elementos:
\sqbullet Un gen que codifica la proteína
deseada. El gen se puede obtener usando diferentes técnicas tales
como:
\sqbullet Aislamiento a partir de genotecas de
DNA genómico.
\sqbullet Síntesis in vitro de cadenas
de DNA. Existen equipos comercialmente disponibles que sintetizan
cadenas de DNA relativamente cortas, haciendo posible sintetizar un
gen in vitro.
\sqbullet Amplificación. Tecnología que
permite replicar varias veces un fragmento de DNA, tal como un
gen.
\sqbullet Otras, es decir, el gen se obtiene a
partir de genotecas de cDNA sintetizadas a partir de mRNA.
\sqbullet Promotores activos que expresan una
proteína en la célula de interés.
\sqbullet Terminadores adecuados para que la
transcripción se termine de manera correcta.
\sqbullet Vectores. Construcciones genéticas
tales como plásmidos o virus que dirigen el gen con su promotor y
terminador hacia la región más interna de la célula de interés,
incorporando el gen, o bien en un cromosoma, o bien
extracromosómicamente. En determinados casos el gen incorporado
puede permanecer indefinidamente en la célula y puede ser
transmitido a su progenie, o se puede perder en un plazo de tiempo
relativamente corto. Existen múltiples sistemas de vectores, tales
como los plásmidos, y los virus naturales o modificados. También es
posible usar medios físicos de introducción de DNA tales como la
microinyección en células o en núcleos. Los virus y plásmidos se
obtienen de la naturaleza y se modifican genéticamente in
vitro para conseguir las características deseadas.
\sqbullet Otros. De manera adicional, pueden
ser necesarios otros elementos genéticos para mejorar la selección
de las células que reciben el gen (es decir, otro gen que confiere
resistencia a antibióticos) o para amplificar el número de copias
de ese gen en cada célula (amplificación genética).
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores y genes deben ser lo más simples
posible para reducir el tiempo necesario para desarrollar el
sistema. Una consideración fundamental es que la simplicidad
genética no debe desatender la productividad ni la calidad de la
proteína producida.
Para conseguir la expresión de la proteína de
interés, el correspondiente gen conveniente se transfecta con los
vectores adecuados en el interior de la célula hospedadora. La
transfección se puede realizar mediante diferentes técnicas tales
como electroporación, precipitación con fosfato cálcico y el uso de
liposomas, entre otras técnicas disponibles.
El gen de interés puede ir asociado a otros
genes ya conocidos para conferir resistencia, por ejemplo, a
antibióticos tales como la geneticina, o a agentes tóxicos tales
como el metotrexato (MTX). Esta asociación permite la selección de
las células transfectadas de una manera estable, es decir, las
células seleccionadas son capaces de reproducir y transmitir el gen
de interés a su progenie. La asociación también permite seleccionar
las células recombinantes que muestran el nivel de expresión más
alto de la proteína de interés.
El producto recombinante así obtenido se
identifica por su peso molecular, por su secuencia de aminoácidos y
por su actividad biológica, entre otros ensayos aplicables.
Las herramientas (es decir, las enzimas de
restricción) y las técnicas que dieron lugar a la tecnología del
DNA recombinante se desarrollaron por vez primera a principios de la
década de los años 70 y su desarrollo fue seguido por una intensa y
amplia utilización de las mismas. Más en particular, las técnicas de
ingeniería genética utilizadas en el momento actual para producir
EPO implican lo siguiente:
1. El uso de genes de EPO que incluyen
fragmentos de regiones no codificadoras situadas en 5' del primer
ATG traducido, y en 3' del codón de terminación del gen. De modo
convencional se piensa que la presencia de elementos de control de
la expresión situados en las regiones no codificadoras del gen, es
necesaria para conseguir una elevada producción de EPO. Véase la
Patente de EE. UU. núm. 5.688.679 (concedida a Powell).
2. La utilización de vectores de expresión con
promotores diferente, se basaba en la premisa de que una combinación
de promotores induce una producción más alta de EPO. Hasta ahora,
el uso de un único promotor incluido en el vector ha dado como
resultado un nivel bajo de expresión de la proteína. Véanse la
Patente de EE. UU. núm. 4.703.008 (concedida a Lin), Patente de EE.
UU. núm. 4.677.195 (concedida a Hewick y col.) y Patente de EE. UU.
núm. 5.688.679 (concedida a Powell). La producción media de EPO
usando un único promotor es de 200 \mu/l/día. La producción
máxima de EPO descrita usando un único promotor es de 10
mg/l/día.
3. La potencial inestabilidad de los sistemas
genéticos debido a la complejidad de las construcciones genéticas
utilizadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de obtener las células productoras de
EPO reivindicadas, el DNA genómico se extrae primero de glóbulos
blancos humanos. El gen que codifica EPO se obtiene a partir del DNA
genómico aislado. Para conseguir esto, el gen se amplifica usando
cebadores adecuados para evitar la aparición de regiones no
codificadoras 5' y 3', del gen de EPO. Estos cebadores incluyen
sitios de restricción en sus extremos 5' que permanecen en ambos
extremos del gen aislado para facilitar su posterior clonación.
El gen amplificado se clona después en un vector
bacteriano y se secuencia. Una vez verificada la secuencia
obtenida, el gen se clona en los sitios Xho I - Hind III de un
vector de expresión en células eucariotas que alberga únicamente el
promotor temprano de SV40 y su terminador. El vector confiere
resistencia a geneticina y ampicilina.
Las células CHO se cotransfectan posteriormente
con dos vectores: 1) el vector de expresión de EPO, y 2) un vector
que confiere resistencia a metotrexato. Las células productoras de
EPO transfectadas de manera estable se seleccionan conforme a su
resistencia a geneticina. El nivel de expresión de EPO se detecta a
través de la selección de las células amplificadas resistentes a
concentraciones crecientes de metotrexato.
Por último, se seleccionan clones conforme a su
nivel de productividad medido mediante radioinmunoensayo. Los
sobrenadantes de los cultivos de los clones más productivos se usan
para ensayar la identidad de la EPO producida mediante
SDS-PAGE, transferencia Western, tratamiento con
glucanasa seguido de SDS-PAGE, isoelectroenfoque y
un análisis de la secuencia de proteínas completa. La actividad
biológica in vivo de la EPO producida se determina mediante
un ensayo en ratones ex-hipóxicos y policitémicos
usando como referencia el estándar internacional correspondiente al
estándar de EPO.
La presente invención se refiere a células
hospedadoras manipuladas por ingeniería genética con vectores
recombinantes que incluyen una secuencia de nucleótidos que
codifica EPO, y a la producción de polipéptidos de EPO o sus
porciones mediante técnicas recombinantes, según se define en las
reivindicaciones.
Las construcciones recombinantes se pueden
introducir en células hospedadoras usando técnicas muy conocidas
tales como infección, transducción, transfección, transvección,
conjugación, electroporación y transformación. El vector puede ser,
por ejemplo, un fago, un plásmido, un vector vírico o un vector
retrovírico.
Los polinucleótidos se pueden unir a un vector
que contiene un marcador de selección para su propagación en un
hospedador. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un
precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico, o en un
complejo con un lípido con carga. Si el vector es un virus, se puede
empaquetar in vitro usando una línea celular de
empaquetamiento adecuada y se puede transducir luego en células
hospedadoras.
Se prefieren los vectores que comprenden
regiones de control que actúan en cis con respecto al polinucleótido
de interés. El hospedador puede aportar factores convenientes que
actúan en trans, aportados por un vector complementario o aportados
por el propio vector tras su introducción en el hospedador.
En algunas realizaciones preferidas a este
respecto, los vectores proporcionan una expresión específica, que
puede ser inducible y/o específica del tipo de célula.
Particularmente preferido entre esos vectores son los vectores
inducibles por factores medioambientales que son fáciles de
manipular, tales como la temperatura y aditivos nutricionales.
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención incluyen vectores derivados de cromosomas, vectores
derivados de episomas y vectores derivados de virus, p. ej.,
vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de
episomas de levaduras, de elementos cromosómicos de levaduras, de
virus tales como baculovirus, papovavirus, virus de la viruela
bovina, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la
seudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de sus
combinaciones, tales como cósmidos y fagómidos.
El inserto de DNA debe estar operativamente
unido a un promotor vírico adecuado, según se define en las
reivindicaciones, tal como el promotor P_{L} del fago lambda, los
promotores lac, trp y tac de E. coli,
los promotores temprano y tardío de SV40, y los promotores de las
LTR retrovíricas, por nombrar unos cuantos. El experto en la
técnica conocerá otros promotores víricos adecuados. Las
construcciones de expresión contendrán además sitios de iniciación
y terminación de la transcripción, y en la región que se transcribe,
contendrán un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La
porción codificadora de los transcritos maduros expresados por las
construcciones incluirá un codón (AUG o GUG) de iniciación a la
traducción situado en su comienzo y un codón de terminación situado
en la posición correcta al final del polipéptido que ha de ser
traducido.
Como se indica, los vectores de expresión
preferiblemente incluirán al menos un marcador de selección. Más
preferiblemente, dos vectores de expresión incluirán un total de dos
marcadores. Esos marcadores incluyen los de resistencia de
metotrexato, dihidrofolato-reductasa o neomicina.
Los vectores preferidos confieren resistencia a metotrexato y a
antibióticos derivados de la neomicina, tales como la
geneticina.
Las células hospedadoras especialmente
preferidas son células de mamíferos que comprenden CHO, COS, BHK,
Namalwa y HeLa. Las células hospedadoras preferidas son las células
CHO. En la técnica se conocen medios y condiciones de cultivo
adecuados para las células hospedadoras anteriormente descritas.
Un método preferido para obtener EPO a partir de
las células hospedadoras de la invención (según las
reivindicaciones) es realizar el cultivo en medios que comprenden
insulina. Específicamente, ese cultivo comprende separar el
sobrenadante que comprende EPO e insulina, de las células
hospedadoras de la invención, concentrar el sobrenadante y congelar
el producto concentrado. Preferiblemente, el medio de cultivo
comprende entre 0,5 mg y 20 mg de insulina por litro de medio de
cultivo.
Entre los vectores eucarióticos preferidos,
pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG se encuentran disponibles
procedentes de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL se
encuentran disponibles procedentes de Pharmacia. Otros
vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el experto
en la técnica.
Los vectores especialmente preferidos son pDHFR
y pVex 1. El vector pDHFR incluye el DNA que codifica la
dehidrofolato-reductasa (DHFR) de ratón, cuya
expresión está controlada por el promotor temprano del virus SV40 y
su señal de poliadenilación. El vector pVex 1-EPO
comprende el DNA que codifica el polipéptido de EPO del SEQ ID NO:
1, un elemento que confiere resistencia a antibióticos derivados de
la neomicina, un promotor temprano del virus SV40 y la señal de
poliadenilación del virus SV40.
Los promotores de eucariotas incluyen el
promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de la
timidina-quinasa de HSV, los promotores temprano y
tardío de SV40, los promotores de las LTR retrovíricas, tales como
los del virus del sarcoma de Rous (RSV) y los promotores de la
metalotioneína, tales como el promotor de la
metalotioneína-I. Un promotor especialmente
preferido es el promotor vírico temprano de SV40.
La introducción de la construcción en la célula
hospedadora se puede efectuar mediante transfección con fosfato
cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano,
transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación,
transducción, infección u otros métodos. Esos métodos se encuentran
descritos en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como
Davis y col., "Basic Methods in Molecular Biology"
(1986).
Un método especialmente preferido para efectuar
la introducción de la construcción de la invención en una célula
hospedadora es mediante transfección con fosfato cálcico.
La transcripción del DNA que codifica el
polipéptido de la presente invención, en eucariotas superiores, se
puede incrementar insertando una secuencia estimuladora en el
vector. Los estimuladores son elementos de DNA que actúan en cis,
normalmente de un tamaño que varía entre de 10 pb a 300 pb, que
actúan para incrementar la actividad transcripcional de un promotor
en un tipo de célula hospedadora determinado. Ejemplos de
estimuladores incluyen el estimulador de SV40, que está situado en
el lado tardío del origen de replicación en la posición de los 100
pb a los 270 pb, el estimulador del promotor temprano de
citomegalovirus, el estimulador del polioma situado en el lado
tardío del origen de replicación, y estimuladores de adenovirus.
Para la secreción de la proteína traducida en el
lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el
medio extracelular, se pueden incorporar señales de secreción
apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden se
endógenas en relación con el polipéptido o pueden ser señales
heterólogas.
El polipéptido se puede expresar en forma
modificada, tal como en forma de una proteína de fusión, y puede
incluir no solamente señales de secreción, sino también regiones
heterólogas funcionales adicionales. Así, por ejemplo, una región
de aminoácidos adicionales, en particular, de aminoácidos con carga,
se puede añadir a la terminación-N del polipéptido
para mejorar su estabilidad y persistencia en la célula hospedadora,
ya sea durante la purificación o durante su manipulación y
almacenamiento posteriores. Asimismo, se pueden añadir restos
peptídicos al polipéptido para facilitar su purificación.
La proteína EPO se puede recuperar y purificar a
partir de los cultivos de las células recombinantes mediante
métodos muy conocidos que incluyen la precipitación en sulfato
amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de
intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía en hidroxilapatito y cromatografía en presencia de
lectinas.
Un método preferido para purificar la EPO
producida por las células de la invención comprende tratar los
sobrenadantes de los cultivos celulares que comprenden EPO con una
combinación de las siguientes etapas: (a) precipitación
diferencial, (b) cromatografía de interacción hidrófoba, (c)
diafiltración, (d) cromatografía de intercambio aniónico, (e)
cromatografía de intercambio catiónico y (f) cromatografía de
exclusión molecular. Preferiblemente, dichas etapas se realizan en
el siguiente orden: (a), (b), (c), (d), (e) y (f).
Un método preferido para usar la EPO producida
por las células de la presente invención comprende su liofilización
para convertirla en una forma adecuada para inyección en seres
humanos, para tratar enfermedades. De manera específica, el
procedimiento de liofilización preferido comprende poner la EPO en
forma de una composición farmacéutica, introducir esta primera
composición de EPO en un envase, en el que dicho envase está a una
temperatura igual o menor que -30ºC; incubar dicha composición de
EPO a una temperatura igual o menor que -30ºC, a presión
atmosférica, durante un tiempo igual o mayor que 4 horas; incubar
dicha composición a una presión igual o menor que 30 micrómetros
absolutos durante un tiempo igual o mayor que una hora; y hacer una
subida de temperatura igual o menor que 3ºC por hora, hasta
alcanzar al menos 25ºC, manteniendo los valores de presión a unos
valores iguales o menores que 5 micrómetros absolutos.
Una composición farmacéutica preferida para su
liofilización comprende EPO, azúcar, sales y albúmina humana. Una
composición especialmente preferida para su liofilización comprende
EPO, manitol, NaCl, NaH_{2}PO y
Na_{2}HPO_{4}\cdot12 H_{2}O.
Na_{2}HPO_{4}\cdot12 H_{2}O.
Las células hospedadoras de la presente
invención, según se definen en las reivindicaciones, pueden
comprender vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico de
EPO producida por Lin, "DNA Sequences Encoding
Erythropoietins", Patente de EE. UU. núm. 4.703.008. Sus
variantes pueden estar presentes en la naturaleza, tal como en
forma de variantes alélicas naturales. Por "variante alélica"
se entiende una de las varias formas alternativas de un gen que
ocupa un locus determinado en un cromosoma de un organismo. Genes
II, Lewin, compilador. Se pueden producir variantes no
presentes en la naturaleza usando métodos de mutagénesis conocidos
en la técnica.
Esas variantes incluyen las producidas por
sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las
sustituciones, deleciones o adiciones pueden incluir uno o más
nucleótidos. Las variantes pueden ser modificadas en regiones
codificadoras o en regiones no codificadoras o en ambas. Las
modificaciones en las regiones codificadoras pueden producir
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, conservativas
o no conservativas. Entre estas modificaciones se encuentran las
sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no modifican
las propiedades y actividades de la proteína EPO o de sus porciones.
También a este respecto se encuentran las sustituciones
conservativas. Sumamente preferidas son las moléculas de ácido
nucleico que codifican la proteína EPO que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO: 1.
La solicitud describe moléculas de ácido
nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que tiene una
secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en el 90%, y más
preferiblemente que es idéntica al menos en el 95%, 97%, 98% o 99%
a, (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de
EPO que tiene la secuencia de aminoácidos completa del SEQ ID NO:
1, o (b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia
de nucleótidos del apartado (a).
Por supuesto que, debido a la degeneración del
código genético, una persona con una experiencia normal en la
técnica reconocerá de manera inmediata que un gran número de las
moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia idéntica al
menos en el 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido de EPO, codificarán un
polipéptido "que posee actividad de proteína EPO". De hecho,
debido a que todas y cada una de las variantes degeneradas de estas
secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipéptido, esto
resultará evidente para el experto en la técnica. En la técnica se
reconocerá también que, de esas moléculas de ácido nucleico que no
son variantes degeneradas, un número razonable codificará también
un polipéptido que posee actividad de EPO. Esto es debido a que el
experto en la técnica tiene pleno conocimiento de las sustituciones
de aminoácidos que, o bien tienen menos probabilidad, o bien no
tienen probabilidad alguna, de afectar significativamente a la
función de la proteína (p. ej., reemplazando un aminoácido
alifático por un segundo aminoácido alifático).
Por ejemplo, una orientación acerca de cómo
realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas,
se proporciona en Bowie, J.U. y col., "Deciphering the Message
in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid
Substitutions", Science, 247:
1306-1310 (1990), en donde los autores indican que
existen dos planteamientos principales para estudiar la tolerancia
de una secuencia de aminoácidos frente al cambio. El primer método
se basa en el proceso de la evolución, en el que las mutaciones son
aceptadas o rechazadas por la selección natural. El segundo
planteamiento usa la ingeniería genética para introducir cambios de
aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado, y
selecciones o escrutinios para identificar secuencias que conserven
la funcionalidad. Como los autores afirman, estos estudios han
revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las
sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además qué cambios
de aminoácidos tienen probabilidad de ser permisivos en una
determinada posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los
residuos de aminoácidos que se encuentran ocultos requieren cadenas
laterales no polares, mientras que son pocas las características de
las cadenas laterales de superficie que generalmente se conservan.
Otras de estas sustituciones fenotípicamente silenciosas se
encuentran descritas en Bowie, J.U. y col., supra, y en las
referencias bibliográficas en ella citadas.
La invención reivindicada se explica mejor por
medio de los ejemplos que se describen a continuación.
Se extrajeron 10 ml de sangre de un sujeto
humano, varón, adulto y clínicamente sano, y se añadieron a un tubo
de ensayo que contenía EDTA 10 mM (pH 8). La sangre se transfirió en
partes alícuotas de 5 ml a dos tubos de ensayo de 50 ml, a los que
se añadieron 45 ml de una disolución que contenía sacarosa 0,3 M,
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM y Tritón X
100 al 1%.
Las disoluciones se incubaron luego en hielo
durante 10 minutos y se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 g a
4ºC. Los sobrenadantes se desecharon y los sedimentos se lavaron
varias veces con una disolución de NaCl 0,075 M que contenía EDTA
0,025 M (pH 8), seguido de una centrifugación durante 10 minutos a
1000 g y a 4ºC.
Los sedimentos resultantes así obtenidos se
resuspendieron en 3 ml de una disolución de Tris-HCl
10 mM (pH 8), NaCl 400 mM, EDTA 2 mM (pH 8). Se añadieron luego 200
\mul de SDS (dodecilsulfato sódico) al 10% y 500 \mul de
proteinasa K (1 mg/ml en SDS al 1% y EDTA 2 mM pH 8) y las
disoluciones se incubaron toda la noche a 37ºC. Después de la
adición de 1 ml de una disolución saturada de NaCl a cada uno de los
tubos de ensayo, las disoluciones que contenían el DNA genómico se
centrifugaron a 2500 g durante 15 minutos.
Cada sobrenadante se transfirió a un tubo de
ensayo de 15 ml en el que se añadió un volumen de isopropanol. Los
tubos se mezclaron con cuidado mediante inversión y se almacenaron a
temperatura ambiente hasta que se formó un precipitado de DNA. El
DNA genómico se recuperó luego con una pipeta Pasteur de vidrio con
el extremo en forma de gancho.
El DNA se puso en un tubo de ensayo de 2 ml y se
añadió 1 ml de etanol al 70%. Pasado un minuto, el sobrenadante se
desechó y el precipitado se dejó secar. Después de haberse secado,
el precipitado se disolvió en 500 \mul de tampón de TE
(Tris-HCl 10 mM pH 8 - EDTA 1 mM).
La concentración de la disolución de DNA se
calculó midiendo la absorbancia de una dilución 1:1000 de la
disolución a 260 nm. Se supuso que 50 \mug de DNA genómico eran
equivalentes a 1 unidad de OD. Se preparó una disolución que
contenía 500 ng de DNA genómico por \mul de tampón de TE.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de EPO se preparó a partir de
500 ng del DNA genómico humano obtenido en el Ejemplo 1. Lo que
viene a continuación se añadió a 1 \mul de la disolución
resultante del Ejemplo 1, colocada en un tubo de ensayo de 0,5 ml:
400 ng de cada uno de los cebadores EPO 1 y EPO 2, una disolución
acuosa de una concentración 2,5 mM de cada uno de los
desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 2,5 unidades de la
DNA-polimerasa Taq (Perkin Elmer) en un volumen
final de 100 litros usando el tampón recomendado por el fabricante.
Se usó un termociclador y se programó para 30 ciclos de: 1 minuto a
93ºC, 1 minuto a 55ºC y 3 minutos a 72ºC. De esta reacción, se
obtuvo un fragmento de DNA de aproximadamente 2170 pares de bases,
que contenía el gen de EPO.
Las secuencias de nucleótidos de los cebadores
utilizados fueron las siguientes:
EPO 1: 5' GAATTCTCGAGATGGGGGTGCACGGTGAG 3' (SEQ
ID NO: 2). Este cebador corresponde a las primeras bases que se
tradujeron del gen de EPO, con un sitio de reconocimiento para la
enzima Xho I y con otro sitio de reconocimiento para la enzima Eco
RI en el extremo 5'. Estos sitios se usaron en las posteriores
etapas de clonación.
EPO 2: 5' AAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA 3' (SEQ ID
NO: 3). Este cebador es complementario a las últimas bases
traducidas y al codón de terminación del gen de EPO. Un sitio de
reconocimiento para la enzima Hind III se añadió en el extremo 3'
del cebador. Este sitio se usó en las posteriores etapas de
clonación.
\newpage
La secuencia de nucleótidos obtenida fue la
siguiente (SEQ ID NO: 4):
El primer codón atg traducido, así como el codón
de "terminación" tga están subrayados. Las secuencias de los
sitios de restricción utilizados en la clonación se muestran en
letra cursiva negrita. Se debe destacar que más de un único codón
puede codificar el mismo aminoácido, y que por consiguiente, la
proteína EPO podría ser traducida desde diferentes moldes de mRNA
que tuvieran diferentes secuencias de nucleótidos pero que no
obstante codificaran EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó un fragmento de aproximadamente 2170
pares de bases que contenía el DNA que codifica EPO. Los extremos
del DNA se hicieron romos mediante tratamiento con el fragmento de
Klenow de la DNA-polimerasa y se clonaron en el
sitio Sma I de un vector M13mp18, siguiendo técnicas estándar de
biología molecular. Los plásmidos recombinantes se cortaron con las
enzimas Xho I y Hind III. La presencia del inserto se verificó
mediante electroforesis de los fragmentos de restricción en un gel
de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etidio. Se seleccionó un
clon positivo (dos bandas, una de ellas con aproximadamente 2200
pares de bases y la otra banda que correspondía al vector
linearizado). El gen de EPO insertado se secuenció conforme a la
técnica de Sanger usando un kit de secuenciación T7
(Pharmacia). Algunas regiones del gen de EPO se secuenciaron
de nuevo con un secuenciador automático 370 A de Applied
Biosystems International. En cada uno de los sistemas de
secuenciación, se siguieron los protocolos recomendados por los
fabricantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pVex 1 se construyó siguiendo las
técnicas estándar de biología molecular. Consistió en:
a. Fragmentos del vector pBR322 bacteriano, que
llevan un origen de replicación bacteriano y que confieren
resistencia a ampicilina, para la amplificación y selección del
vector en E. coli.
b. Inmediatamente aguas abajo de a), viene un
promotor temprano del virus SV40, que permitió la expresión del gen
clonado en 3' desde este elemento.
c. Inmediatamente aguas abajo de b), vienen los
sitios de clonación Xho I y Hind III, que permitieron la inserción
de los genes que iban a ser expresados.
d. Inmediatamente aguas abajo de c), viene la
señal de poliadenilación del virus SV40, que permite la
poliadenilación correcta de los transcritos específicos del gen
clonado en c).
e. Inmediatamente aguas abajo de d), viene el
promotor de la TK y el gen que codifica la
neomicina-fosfotransferasa con su señal de
poliadenilación. Estos elementos permiten la selección de las
células transfectadas de manera estable a través del uso de la
neomicina y de antibióticos derivados de la neomicina tales como la
geneticina. El extremo 3' de e) está unido al extremo 5' de a).
El vector pVex 1 se depositó el 16 de abril de
1999 en DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b,
D-38124 Braunschweig, Alemania, y se le adjudicó
el número de acceso DSM 12776.
El vector pDHFR confiere resistencia a
ampicilina para la selección en bacterias. Este vector incluye el
cDNA que codifica la dihidrofolato-reductase (DHFR)
de ratones, cuyo nivel de expresión está controlado por el promotor
temprano del virus SV40 y por su señal de poliadenilación. El nivel
de expresión de EPO conseguido con el vector pVex
1-EPO (véase el Ejemplo 5) se aumenta varias veces
con la amplificación de los genes de DHFR y EPO en un medio de
cultivo que contiene concentraciones crecientes de metotrexato
(MTX).
El vector pDHFR se depositó el 16 de abril de
1999 en DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b,
D-38124 Braunschweig, Alemania, y se le adjudicó
el número de acceso DSM 12777.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon M13mp18 que contiene el gen que codifica
EPO, clonado según se describe en el Ejemplo 3, se cortó con las
enzimas Xho I - Hind III. El fragmento así obtenido, de
aproximadamente 2,2 kb, se aisló y clonó de nuevo usando los mismos
sitios de restricción del vector pVex 1. Un clon positivo
pVex-EPO se aisló y se analizó, demostrándose que
la secuencia codificadora de EPO, SEQ ID NO: 4, no había cambiado
durante los procedimientos de clonación.
Los anteriores ejemplos se realizaron conforme a
técnicas convencionales de biología molecular. Véanse, Brown,
"Gene Cloning", (Chapman y Hall, Londres, Inglaterra,
1995); Watson y col., "Recombinant DNA, 2^{nd} Ed.",
(Scientific American Books, Nueva York, Nueva York, 1992);
Sambrook y col., "Molecular Cloning. A Laboratory
Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989);
Bishop y col., "Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical
Approach", (IRL Press, 1987); Davis y col.,
"Basic Methods in Molecular Biology", (Elsevier
Science Publishing Co., Nueva York, Nueva York, 1986).
\vskip1.000000\baselineskip
Una línea de células CHO (Ovario de Hámster
Chino) mutagenizada, deficiente en el gen de la enzima DHFR
(CHO-DHFR^{-}), se usó para facilitar la
amplificación génica con MTX. Durante todo el procedimiento las
células se hicieron crecer en atmósfera de CO_{2} al 5% a
37ºC.
Las células CHO se cotransfectaron siguiendo la
técnica del fosfato cálcico que, usando una placa de Petri de 90
mm, se realizó de la siguiente manera:
(1) El medio de cultivo
(alfa-MEM, con el 10% de suero de ternera fetal) se
reemplazó por medio de nueva aportación 4-8 horas
antes de la transfección.
(2) Se añadieron 500 \mul de una disolución de
HEPES 10 g/l (pH 7,1), 500 \mul de una disolución de NaCl 16
g/l, 10 \mul de una disolución de Na_{2}HPO_{4} 35 mM y 10
\mul de una disolución de 35 mM de NaH_{2}PO_{4} a un tubo de
ensayo de 5 ml.
(3) En un tubo de ensayo diferente, de 1,5 ml,
se añadió una disolución con 60 \mul de CaCl_{2} 2 M y 10
\mug de cada uno de los vectores de DNA que iba a ser transfectado
(pVex-EPO y pDHFR). Se añadió agua hasta que se
alcanzó un volumen final de 500 \mul. El plásmido pDHFR descrito
en el Ejemplo 2, está basado en el plásmido pBR 322, que es
resistente a ampicilina. El plásmido pDHFR es capaz de replicarse en
E. Coli y lleva el gen de DHFR clonado entre el promotor
temprano de SV40 y su terminador. El plásmido pDHFR codifica la
expresión de la proteína DHFR en células CHO. Esta proteína confiere
resistencia a metotrexato, el cual se puede luego usar para
seleccionar las células que muestren una elevada productividad de
eritropoyetina.
(4) La disolución que contiene DNA y CaCl_{2}
se añadió gota a gota al tubo de ensayo que contenía HEPES, al
tiempo que se hacía burbujear aire para obtener una mezcla rápida y
para minimizar la concentración local. Este método facilitó la
formación de partículas muy pequeñas que contenían DNA y fosfato
cálcico, a las que las células incorporan de manera más
afectiva.
(5) La disolución se dejó reposar durante 30
minutos y se añadió luego a la placa de Petri que contenía las
células.
(6) La disolución se distribuyó entre las
células mediante agitación suave. Las células se dejaron toda la
noche en un incubador en atmósfera de CO_{2} al 5% y a 37ºC.
(7) Las células se lavaron dos veces con tampón
de PBS (8 g de NaCl; 0,2 g de KCl; 1,44 g Na_{2}HPO_{4}, 0,24 g
de NaH_{2}PO_{4}, se añadió agua hasta completar 1 litro y el pH
se ajustó a 7,4 con HCl). Después se añadió medio de cultivo de
nueva aportación.
La selección con geneticina (G 418) a una
concentración de 600 g/ml comenzó 24 horas después de la
transfección. Las células que incorporaron el plásmido
pVex-EPO fueron capaces de resistir al antibiótico,
mientras que el resto murió pasados 25 días. Se seleccionaron las
colonias resistentes y se ensayó su productividad. Los tres clones
más productores se seleccionaron a partir de los clones
aislados.
Aprovechando las construcciones genéticas usadas
en la invención, se llevó a cabo una selección con respecto a cada
uno de los tres clones usando MTX, como agente de selección
secundario, a concentración 10^{-8} M, 10^{-7} M, 10^{-6} M y
10^{-5} M. Para este fin, el medio de cultivo se cambió por medio
alfa-MEM sin nucleótidos, complementado con suero de
ternera fetal dializado al 10%. Es esencial realizar el
procedimiento de diálisis conforme al siguiente protocolo: se
pusieron 100 ml de suero en una bolsa de diálisis con un valor de
exclusión de 3000 kDa (con un valor de exclusión más alto, se
podrían perder factores de crecimiento y las células no serían
capaces de crecer y reproducirse), la bolsa se cerró herméticamente,
se sumergió por completo en un recipiente que contenía 5 litros de
agua bidestilada y se dejó sin agitación durante 12 horas a 4ºC.
Después de esta etapa, el agua se desechó y se cambió, dejando la
bolsa reposar durante un período adicional de 12 horas a 4ºC. La
bolsa de diálisis se extrajo luego y se recuperó el suero. La
diálisis durante períodos de tiempo más cortos, con volúmenes más
pequeños o sin reposición del agua sería ineficaz ya que cualquier
traza de nucleótidos en el suero afectará de manera adversa a la
selección con MTX. Por otra parte, la diálisis durante períodos de
tiempo más largos sería también ineficaz debido a que algunas
proteínas necesarias para el crecimiento celular pueden precipitar
impidiendo la maduración celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones que crecieron en concentraciones
10^{-7} M y 10^{-6} M de MTX se aislaron y amplificaron en el
medio alfa-MEM de nueva aportación sin nucleótidos,
complementado con el 10% de suero de ternera fetal dializado. Una
vez crecidos, el sobrenadante del cultivo se ensayó con respecto a
la producción y secreción de EPO. Para este fin, se usó un
inmunoensayo específico.
El procedimiento anteriormente descrito concluyó
con la selección de un clon de células hospedadoras recombinantes
que habían producido 50 000 \mug de eritropoyetina/litro de medio
de cultivo, por día.
La célula hospedadora recombinante descrita en
este ejemplo, se depositó el 16 de abril de 1999 en el
DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania, y se le adjudicó el número de acceso
DSM ACC2397.
La efectividad del proceso de transcripción en
la célula se verificó según se describe en el Ejemplo 8. La
secuencia de la proteína obtenida se identificó siguiendo el
procedimiento descrito en el Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó RNA total a partir de las células
productoras de EPO, conforme al siguiente protocolo:
Una placa de Petri de 90 mm de diámetro, que
contenía células confluentes, se lavó dos veces con 10 ml de tampón
de PBS. A continuación se añadieron 2 ml de tampón de GTC y se
distribuyeron uniformemente sobre la placa. El tampón de GTC se
componía de: 50 g de tiocianato de guanidinio; 0,5 g de
N-Lauroilsarcosina, 2,5 ml de citrato sódico 1 M
(pH 7), 0,7 ml de \beta-mercaptoetanol, 0,33 ml de
agente antiespumante (SIGMA) al 30% y 100 ml de H_{2}O c.s.p.
(pH 7,0).
Después las células se lisaron. El lisado
produjo una disolución sumamente viscosa. La disolución se
transfirió a un tubo de ensayo de 15 ml, y el procedimiento
anteriormente descrito se repitió una vez más usando 2 ml de tampón
de GTC.
El tubo de ensayo de 15 ml se agitó
vigorosamente durante 1 minuto para romper el DNA. Luego se preparó
un gradiente de cloruro de cesio. Para este fin, 4 ml de una
disolución que contenía CsCl (95,97 g de CsCl y 2,5 ml de acetato
sódico 1 M, (pH 5,4), y se añadió agua hasta que se alcanzó un
volumen de 100 ml) se añadieron a un tubo de ensayo para
ultracentrífuga. Sobre esta disolución, y sin mezclar, se añadió
luego la suspensión de las células en GTC. El tubo de ensayo se
rellenó a continuación con tampón de GTC y se ultracentrifugó a 31
000 rpm durante 20 horas a 20ºC.
Durante la centrifugación, el RNA se depositó en
el fondo del tubo de ensayo formando un sedimento y el DNA obtenido
mostró una banda a la mitad del gradiente de cloruro de cesio. El
sobrenadante se desechó para eliminar completamente el DNA. El
sedimento que contenía RNA se dejó secar durante 5 minutos y después
se disolvió en 200 \mul de agua y se transfirió a un tubo de
ensayo de 1,5 ml. A continuación se añadieron 200 \mul de acetato
sódico 0,4 M, (pH 4,8) y 2 volúmenes de etanol, la disolución
resultante se mezcló perfectamente y se dejó reposar durante 30
minutos a -80ºC. La disolución se centrifugó luego en una
microcentrífuga a 14 000 rpm durante 15 minutos, el sobrenadante se
desechó y el precipitado se lavó con 1 ml de etanol al 80%. El
sedimento se secó y se redisolvió en 100 \mul de agua. La
concentración de una dilución 1:100 de la disolución de RNA se
midió a 260 nm (1 unidad de OD corresponde aproximadamente a 40
\mug de RNA). Todas las disoluciones y elementos usados estaban
libres de
RNasas.
RNasas.
Se preparó el cDNA específico siguiendo las
instrucciones de un kit destinado a ese fin (cDNA Synthesis
System Plus, Amersham - núm. de catálogo RPN 1256). El
oligonucleótido EPO 2 fue el cebador usado.
El cinco por ciento del cDNA así obtenido se
amplificó usando 400 ng de cada uno de los oligonucleótidos EPO 2 y
EPO 3, una concentración 2,5 mM de cada uno de los desoxinucleótidos
en el tampón adecuado y 2,5 unidades de la
DNA-polimerasa Taq, en un volumen total de 100
\mul. Se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación de la
siguiente manera: 1 minuto a 93ºC, 1 minuto a 55ºC y 1 minuto a
72ºC.
EPO 3 se sintetizó de la misma manera descrita
para EPO 1 y EPO 2 y su secuencia (5' GAATTCCATGGGGGTG
CACGAATGTCC 3') (SEQ ID NO: 5) corresponde a las primeras 20 bases que codifican el cDNA de EPO, y a un sitio de reconocimiento para la enzima Eco RI. El sitio de reconocimiento para la enzima Eco RI se añadió para facilitar las posteriores etapas de clonación.
CACGAATGTCC 3') (SEQ ID NO: 5) corresponde a las primeras 20 bases que codifican el cDNA de EPO, y a un sitio de reconocimiento para la enzima Eco RI. El sitio de reconocimiento para la enzima Eco RI se añadió para facilitar las posteriores etapas de clonación.
Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 600
pares de bases y se clonó en los vectores M13mp18 y M13mp19. Usando
el método de secuenciación de Sanger, el inserto se secuenció en
ambas direcciones para obtener la secuencia completa.
Debido a la elevada autocomplementariedad de
algunas regiones del gen, la cual da lugar a muchas y muy ambiguas
compactaciones en la autorradiografía, se usó un kit que utiliza la
DNA-polimerasa Taq y bases modificadas. Se
obtuvieron resultados de más baja calidad, pero las compactaciones
se resolvieron. El kit usado fue el Gene aTaq de
Pharmacia-LKB Biotechnology.
La secuencia completa del cDNA de la
eritropoyetina humana se aisló y se clonó, mostrándose que
codificaba EPO. Por consiguiente, se encontró que el gen clonado en
las células y su producto de transcripción estaban completos y que
su secuencia era la correcta de EPO.
\vskip1.000000\baselineskip
La EPA obtenida mediante el cultivo de las
células hospedadoras según se ilustra en el ejemplo que precede, se
purificó de nuevo para ser sometida a distintos ensayos de calidad e
identificación.
En un gel desnaturalizante de
SDS-PAGE, la EPO se identificó en forma de una banda
ancha de peso molecular de más de 30 kDa, como se esperaba para
EPO. Véase la Figura 1. La banda fue reconocida por anticuerpos
monoclonales y policlonales contra EPO humana en un ensayo de
"transferencia Western", como se esperaba para EPO. Véase la
Figura 2. El tratamiento con glucanasas demostró la existencia de
las cadenas glucosídicas en la cantidad y tamaño esperados para
EPO. Véase la Figura 3. Se demostró que la EPO producida estaba
compuesta por una serie de especies con puntos isoeléctricos
variables desde 3,0 hasta 4,5, como se esperaba para EPO. Véase la
Figura 4.
La secuencia de aminoácidos completa de la
proteína aislada, purificada a partir del sobrenadante del cultivo
de las líneas de células transfectadas, mostró una homología total
con la eritropoyetina humana natural cuya secuencia de 165
aminoácidos es la siguiente (SEQ ID NO: 1):
La presencia de los cuatro sitios de
glucosilación a lo largo de la cadena de 165 aminoácidos, así como
la estructura de carbohidrato compleja, y en particular, los
residuos terminales de ácido siálico, que caracterizan a EPO se
verificaron. Estos resultados fueron apoyados aún más por un ensayo
de actividad biológica de la proteína producida mediante un ensayo
en ratones ex-hipóxicos y policitémicos que mostró
una concordancia completa con el estándar internacional de EPO.
La productividad alcanzada, medida mediante un
inmunoensayo específico, fue de 50 mg de EPO por litro de medio de
cultivo, por día.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
<110> Sterrenbeld Biotechnologie North
America, Inc.
\hskip1cmCarcagno, Carlos Miguel
\hskip1cmCriscuolo, Marcelo
\hskip1cmMelo, Carlos
\hskip1cmVidal, Juan Alejandro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Células hospedadoras que expresan
eritropoyetina humana recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1792.002PC02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> AR
99-01-00679
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-02-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> AR
98-01-05609
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-11-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (10)
1. Una célula hospedadora que comprende un
primer vector y un segundo vector, en la que dicho primer vector
comprende:
(i) una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido de eritropoyetina que consiste en la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de
nucleótidos no incluye regiones no codificadoras 5' y 3' del gen de
EPO;
(ii) un promotor vírico; y
(iii) un terminador vírico;
y en la que dicho segundo vector comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica
dihidrofolato-reductasa (DHFR).
2. La célula hospedadora depositada como DSM
ACC2397.
3. La célula hospedadora de la reivindicación
1, en la que dicho promotor vírico y terminador vírico comprende un
promotor temprano y un terminador de un virus SV40.
4. La célula hospedadora de la reivindicación
1, en la que dicho primer vector comprende pVex 1, depositado como
DSM 12776.
5. La célula hospedadora de la reivindicación
1, en la que dicho segundo vector comprende pDHFR, depositado como
DSM 12777.
6. La célula hospedadora de la reivindicación
1, en la que dicha célula hospedadora es resistente a
anti-bióticos derivados de la neomicina y a
metotrexato.
7. La célula hospedadora de la reivindicación
1, en la que dicha célula hospedadora es una célula de mamífero.
8. La célula hospedadora de la reivindicación
1, en la que dicha célula hospedadora comprende una célula CHO.
9. Un método para producir un polipéptido de
EPO, que comprende:
(a) cultivar la célula hospedadora de la
reivindicación 1 en un medio con metotrexato;
(b) aislar las células viables resultantes de la
etapa (a);
(c) amplificar las células resultantes de la
etapa (b) en un medio sin metotrexato; y
(d) aislar dicho polipéptido a partir del
sobrenadante de células de la etapa (c).
10. El método de la reivindicación 9, que
además comprende aislar las células viables (b) que producen dicho
polipéptido en una concentración de 50 mg de EPO por litro de medio
y por día.
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|---|---|---|---|---|
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| BR9917606A (pt) | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
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Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| NZ210501A (en) | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| IL77081A (en) * | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | Dna sequence encoding human erythropoietin process for the preparation thereof and a pharmaceutical composition of human erythropoietin |
| JPS62501010A (ja) * | 1984-12-04 | 1987-04-23 | ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド | エリトロポエチンの生産方法 |
| US5641663A (en) * | 1985-11-06 | 1997-06-24 | Cangene Corporation | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces |
| JPS62171696A (ja) * | 1986-01-23 | 1987-07-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
| JPH02485A (ja) * | 1987-08-03 | 1990-01-05 | Yuu Honshiyo | 新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体 |
| IL95064A0 (en) * | 1990-07-12 | 1991-06-10 | Yeda Res & Dev | Molecular cloning of tnf binding protein |
| US5997856A (en) * | 1988-10-05 | 1999-12-07 | Chiron Corporation | Method and compositions for solubilization and stabilization of polypeptides, especially proteins |
| AU2309692A (en) * | 1991-07-03 | 1993-02-11 | Cryolife, Inc. | Method for stabilization of biomaterials |
| JPH05194253A (ja) * | 1992-01-16 | 1993-08-03 | Kirin Brewery Co Ltd | 水溶性ポリペプチドホルモンを含む徐放性微小粒子状製剤及びその製造法 |
| JP3790567B2 (ja) * | 1994-09-30 | 2006-06-28 | 武田薬品工業株式会社 | 徐放剤 |
| IL118201A (en) * | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
| DE19539574A1 (de) * | 1995-10-25 | 1997-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren |
| JPH09238688A (ja) * | 1996-03-11 | 1997-09-16 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトｍｃｐ−１レセプタータンパク質の製造法および用途 |
| US6632648B1 (en) * | 1996-05-14 | 2003-10-14 | Elan Drug Delivery Limited | Methods of terminal sterilization of fibrinogen |
| US5851984A (en) * | 1996-08-16 | 1998-12-22 | Genentech, Inc. | Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides |
| EP0935663A2 (en) * | 1996-10-25 | 1999-08-18 | G.D. SEARLE & CO. | Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists |
| JPH10273447A (ja) * | 1997-01-29 | 1998-10-13 | Takeda Chem Ind Ltd | 徐放性マイクロスフィア、その製造法および用途 |
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