ES2321243T3 - Ligandos de acido nucleico que se unen a las adn polimerasas y las inhiben. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION PRESENTA LIGANDOS DE OLIGONUCLEOTIDOS DE ALTA AFINIDAD POR LA POLIMERASA TAQ TERMOESTABLE Y LA POLIMERASA TTH. ESPECIFICAMENTE, ESTA INVENCION PRESENTA LIGANDOS DE ADN CON CAPACIDAD PARA UNIRSE A LAS POLIMERASAS TAQ Y TTH Y LOS METODOS PARA OBTENER DICHOS LIGANDOS. LOS LIGANDOS SON CAPACES DE INHIBIR LAS POLIMERASAS A TEMPERATURA AMBIENTAL.
Description
Ligandos de ácido nucleico que se unen a las ADN
polimerasas y las inhiben.
En la presente invención se describen
procedimientos para identificar y preparar ligandos de ácido
nucleico con alta afinidad por las ADN polimerasas, específicamente
para las ADN polimerasas termoestables. En una realización
preferida, la ADN polimerasa se selecciona de entre la polimerasa
Taq, una polimerasa termoestable aislada de Thermus
aquaticus, o la polimerasa Tth, una ADN polimerasa y
transcriptasa inversa termoestable aislada de Thermus
thermophilus. No obstante, el procedimiento de esta invención
puede extenderse a la identificación y preparación de cualquier ADN
polimerasa térmicamente estable. El procedimiento utilizado en la
presente invención para identificar tales ligandos de ácido nucleico
se denomina SELEX, un acrónimo (en inglés) de Evolución Sistemática
Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial. También se describen
en la presente invención un procedimiento mejorado para realizar la
Reacción en Cadena de la Polimerasa usando los ligandos de ácido
nucleico de esta invención. En la presente invención específicamente
se describen ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad por la
polimerasa Taq y polimerasa Tth. La invención incluye ligandos de
ADN de alta afinidad, los cuales se unen a la polimerasa Taq y
polimerasa Tth, inhibiendo de ese modo su capacidad para
polimerizar la síntesis del ADN a temperaturas ambiente. En esta
invención se incluyen además interruptores de ácido nucleico. Los
ligandos de ácido nucleico de esta invención, con unión dependiente
de la temperatura a las ADN polimerasas, son ejemplo de ligandos
cuyas propiedades deseables puede activarse y desactivarse en base
a cualquier número de condiciones de reacción.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es
una técnica recientemente desarrollada que ha tenido un impacto
significativo en muchas áreas de la ciencia. La PCR es un
procedimiento rápido y sencillo para amplificar específicamente una
secuencia diana de ADN de forma exponencial. (Saiki et al.
(1985) Science 230:1350; Mullis y Faloona (1987) Methods Enzymol.
155:335). De forma resumida, el procedimiento consiste en sintetizar
un grupo de cebadores que tienen secuencias nucleotídicas
complementarias del ADN que flanquea la secuencia diana. Los
cebadores se mezclan a continuación con una solución del ADN diana,
una polimerasa de ADN termoestable, y los cuatro desoxinucleótidos
(A, T, C y G). La solución se calienta entonces hasta una
temperatura suficiente para separar las hebras de ADN
complementarias (aproximadamente 95ºC), y se enfría a continuación
hasta una temperatura suficiente para permitir que los cebadores se
unan a las secuencias flanqueantes. La mezcla de reacción se
caliente entonces de nuevo (hasta aproximadamente 72ºC) para
permitir el progreso de la síntesis del ADN. Después de un breve
período de tiempo, la temperatura de la reacción se incrementa de
nuevo hasta una temperatura suficiente para separar el recién
formado ADN de doble hebra, completándose de este modo el primer
ciclo de la PCR. La mezcla de reacción se enfría entonces y se
repite el ciclo. Por tanto, la PCR consiste en ciclos repetitivos
de fusión, hibridación y síntesis del ADN. Veinte ciclos de
replicación pueden rendir una amplificación de hasta un millón de
veces de la secuencia diana de ADN. La capacidad para amplificar una
única molécula de ADN mediante la PCR tiene aplicaciones en la
microbiología ambiental y alimentaria (Wernars et al. (1991)
Appl. Env. Microbiol. 57:1914-1919; Hill y Keasler
(1991) Int. J. Food Microbiol. 12:67-75), en la
microbiología clínica (Wages et al. (1991) J. Med. Virol.
33:58-63; Sacramento et al. (1991) Mol. Cell
Probes 5:229-240; Laure et al. (1988) Lancet
2:538), en la oncología (Kumar y Barbacid (1988) Oncogene
3:647-651; McCormick (1989) Cancer Cells
1:56-61; Crescenzi et al. (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:4869), en la prognosis de enfermedades genéticas
(Handyside et al. (1990) Nature 344:768-770),
en los bancos de sangre
\hbox{(Jackson (1990) Transfusion
30:51-57) y en las ciencias forenses (Higuchi et
al . (1988) Nature (London) 332:543).}
La disponibilidad de ADN polimerasas
termoestables, tales como la polimerasa de ADN Taq, ha simplificado
y mejorado la PCR. Originalmente, sólo estaban disponibles
polimerasas sensibles al calor, tales como la ADN polimerasa de
E. coli, para su uso en la PCR. Sin embargo, las polimerasas
sensibles al calor se destruyen a las temperaturas necesarias para
fundir el ADN de doble hebra, y debe añadirse polimerasa adicional
después de cada ciclo de la PCR. La polimerasa de ADN Taq, aislada
de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, es estable
hasta los 95ºC, y su uso en la PCR ha eliminado la necesidad de
añadir de forma repetitiva de polimerasas sensibles a la
temperatura después de cada ciclo térmico. Adicionalmente, puesto
que la polimerasa Taq puede usarse a temperaturas más elevadas, ha
mejorado la especificidad y sensibilidad de la PCR. La razón de la
especificidad mejorada y que a temperaturas más elevadas, la unión
de los promotores a sitios distintos de los deseados (fenómeno
denominado "mispriming") está significativamente reducida.
Desde su descubrimiento, la Reacción en Cadena
de la Polimerasa ha sido modificada para varias aplicaciones, tales
como la PCR in situ, en la cual el límite de detección de la
hibridación in situ tradicional se ha llevado hasta el nivel
de la copia única (Haase et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:4971-4975), y la PCR con transcriptasa
inversa (RT-PCR), en donde una secuencia de ARN se
convierte en su copia de ADN (ADNc) mediante la transcriptasa
inversa (RT) antes de ser amplificada por la PCR, convirtiendo el
ARN en un sustrato para la PCR (Kawasaki (1991) "Amplification of
RNA in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications",
editores Innis et al., Academic Press Inc., San Diego, CA,
21-27). Sin embargo, las transcriptasas inversas
víricas mesofílicas a menudo son incapaces de sintetizar moléculas
de ADNc de longitud completa, porque no pueden "leer a lo
largo" de las estructuras secundarias estables de las moléculas
de ARN. Esta limitación se ha superado recientemente mediante el
uso de una polimerasa aislada de Thermus thermophilus
(polimerasa Tth). La polimerasa Tth es una polimerasa termoestable
que puede funcionar como transcriptasa inversa y como ADN polimerasa
(Myers y Gelfand (1991) Biochemistry 30:7662-7666).
La transcripción inversa realizada a una temperatura elevada usando
la polimerasa Tth elimina las estructuras secundarias del ARN
plantilla, haciendo posible la síntesis de ADNc de longitud
completa.
Aunque se ha hecho un progreso significativo en
la tecnología de la PCR, la amplificación de oligonucleótidos que
no son diana debida a reacciones secundarias, tales como el cebado
incorrecto del ADN de fondo y/o la oligomerización del cebador,
todavía presenta un problema significativo. Esto es especialmente
cierto en las aplicaciones de diagnóstico en las cuales la PCR se
lleva a cabo en un medio que contiene ADN de fondo, mientras que el
ADN puede estar presente en una única copia (Chou et al.
(1992) Nucleic Acid Res. 20:717-1723). Se ha
determinado que estas reacciones secundarias a menudo ocurren cuando
todos los reactivos se han mezclado a temperatura ambiente antes de
iniciarse el ciclado térmico.
Se han descrito dos procedimientos que minimizan
estas reacciones secundarias. En el primer procedimiento,
denominado PCR "de arranque en caliente (hot start)" (Chou
et al. (1992) Nucleic Acid Res. 20:1717-1723;
D'Aquila et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:3749), todos los
reactivos se calientan a 72ºC antes de añadir el reactivo final,
usualmente la polimerasa. En la PCR "de arranque en caliente"
mediada por cera, un componente o componentes cruciales para la
actividad de la polimerasa se separa físicamente, a baja
temperatura, del resto de la mezcla de reacción mediante una capa
de cera que se funde a partir del calentamiento en el primer ciclo
(Chou et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1717; Horton et
al. (1994) BioTechniques 16:42). La PCR "de arranque en
caliente" tiene ciertas desventajas; la obligatoriedad de
reabrir los tubos antes de iniciar el termociclado incrementa la
contaminación entrecruzada y el pipeteado repetido la hace tediosa a
la hora de manipular un número elevado de muestras. Un reactivo que
pueda colocarse directamente en la mezcla de reacción, junto con el
resto de los componentes de reacción, e inhiba la polimerasa a
temperatura ambiente será útil para superar las limitaciones
asociadas con la PCR "de arranque rápido". Aunque este
procedimiento incrementa la especificidad, reduciendo de ese modo
los productos secundarios, el procedimiento es inconveniente para
tratar un número elevado de muestras, la mezcla de reacción puede
contaminarse más fácilmente, y el procedimiento es propenso a
errores.
En el segundo procedimiento, se añade al mezcla
de reacción completa un anticuerpo neutralizante contra la
polimerasa Taq (denominado como Taqstart). Este anticuerpo inhibe la
actividad polimerasa a temperatura ambiente (Kellogg et al.
(1994) BioTechniques 16:1134-1137), pero se inactiva
mediante desnaturalización por calor una vez la reacción se ha
termociclado, haciendo activa la polimerasa. El inconveniente de
esta estrategia para reducir los productos secundarios es que el
anticuerpo anti-Taq debe almacenarse a -20ºC hasta
su uso, lo que significa que los equipos de detección deben
empaquetarse y enviarse en condiciones controladas, lo que
incrementa su coste. Además, para una única PCR se necesita una
cantidad significativa de anticuerpo (\sim1 \mug de
anticuerpo/5 U de polimerasa Taq).
La EP-0592035-A2
describe el uso de inhibidores de la ADN polimerasa en la PCR, en
donde el inhibidor se inactiva irreversiblemente a la temperatura
elevada usada en la PCR.
El desarrollo de ligandos de ácido nucleico de
elevada afinidad capaces de inhibir las polimerasas Taq y Tth
termoestables evitaría la necesidad del procedimiento "de arranque
rápido" y superaría las limitaciones asociadas con el segundo
procedimiento. Pueden desarrollarse inhibidores de ácido nucleico
que son extremadamente específicos y tienen una afinidad elevada.
Puesto que los ácidos nucleicos con más estables que las proteínas
a temperatura ambiente, pueden evitarse los problemas de empaquetado
y transporte asociados con el uso de anticuerpos. Adicionalmente,
pueden identificarse ácidos nucleicos que, al igual que los
anticuerpos, pierdan su afinidad por la polimerasa a temperaturas
más elevadas, permitiendo la activación de la polimerasa cuando se
desee. El potencial del cebado incorrecto en la PCR mediado por los
propios inhibidores basados en ácidos nucleicos funcionando como
cebadores (además de los cebadores específicos usados en la
reacción) puede eliminarse cubriendo sus extremos 3'.
Las estructuras mediante rayos-X
de cristales de varias ADN polimerasas han indicado que se pliegan
en estructuras tridimensionales similares. (Para una revisión,
consultar Joyce y Steitz (1994) Annu. Rev. Biochem. 63:777). El
dominio C-terminal responsable de la polimerización
se organiza en tres subdominios que representan la "palma",
"dedos", y "pulgar", anatómicamente análogos a la mano
derecha. La polimerasa Tth y la polimerasa Taq son un 93% similares
y un 88% idénticas a nivel de secuencia de aminoácidos (Abramson
(1995) en "PCR Strategies" (Academic Press, Nueva York). Ambas
carecen de actividad 3'-5' exonucleasa, pero
contienen actividad 5'-3' exonucleasa (Abramson
(1995) en "PCR Strategies" (Academic Press, Nueva York);
Tindall y Kunkel (1988) Biochemistry 27:6008). Por tanto, puede
esperarse que los ligandos de ácido nucleico inhibidores se
comporten de forma similar a ambos enzimas, así como a otras
polimerasas termoestables. Esto haría posible el uso de un único
inhibidor para una cierto número de enzimas termoestables.
Se ha desarrollado un procedimiento para la
evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión
altamente específica a moléculas diana. Este procedimiento,
Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento
Exponencial, denominado SELEX, se describe en la solicitud de
patente estadounidense con número de serie 07/536.428 (WO
91/19813), titulada "Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment", actualmente abandonada, en la solicitud
de patente estadounidense con número de serie 07/714,131, registrada
el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", que
actualmente es la patente estadounidense nº 5.475.096, en la
solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/931.473,
registrada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid
Ligands", que actualmente es la patente estadounidense nº
5.270.163 (consultar también PCT/US91/04078).
Cada una de estas solicitudes, conjuntamente
denominadas en la presente invención como las Solicitudes de
Patente SELEX, describe un procedimiento fundamentalmente novedoso
para preparar un ligando de ácido nucleico contra cualquier
molécula diana deseada.
El procedimiento SELEX implica la selección de
una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones paso a paso
de la unión, reparto y amplificación, usando el mismo esquema
general de selección, para conseguir virtualmente cualquier
criterio de afinidad de unión y selectividad deseado. Partiendo de
una mezcla de ácidos nucleicos, que preferiblemente comprende un
segmento de una secuencia aleatoria, el procedimiento SELEX incluye
los pasos de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones
favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de
aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las
molécula diana, disociar los complejos de ácido
nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos
disociados a partir de los complejos de ácido
nucleico-diana para rendir una mezcla de ácidos
nucleicos enriquecida en ligando, a continuación reiterar los pasos
de unión, reparto, disociación y amplificación a través de tantos
ciclos como se desee para obtener ligandos de ácido nucleico de
elevada afinidad por la molécula diana.
Se ha modificado el procedimiento SELEX básico
para conseguir un cierto número de objetivos. Por ejemplo, la
solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/960.093
(WO 94/09158), registrada el 14 de octubre de 1992, titulada
"Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure",
describe el uso de SELEX conjuntamente con la electroforesis en gel
para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características
estructurales específicas, tales como el ADN doblado. La solicitud
de patente estadounidense con número de serie 08/123.935 (WO
95/08003), registrada el 17 de septiembre de 1993, titulada
"Photoselection of Nucleic Acid Ligands" describe un
procedimiento basado en SELEX para seleccionar ligandos de ácido
nucleico que contienen grupos fotorreactivos capaces de unirse a,
y/o entrecruzarse con, y/o fotoinactivar una molécula diana. La
solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/134.028
(WO 95/07364), registrada el 7 de octubre de 1993, titulada
"High-Affinity Nucleic Acid Ligands That
Discriminate Between Theophylline and Caffeine", describe un
procedimiento para identificar ligandos de ácido nucleico
específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente
relacionadas, denominado Counter-SELEX. La solicitud
de patente estadounidense con número de serie 08/143.564 (WO
95/08003), registrada el 25 de octubre de 1993, titulada
"Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment:
Solution SELEX", describe una procedimiento basado en SELEX que
consigue un reparto altamente eficiente entre oligonucleótidos que
tienen una afinidad elevada y baja por una molécula diana. La
solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/964.624,
registrada el 21 de octubre de 1992, titulada "Methods of
Producing Nucleic Acid Ligands", que actualmente es la patente
estadounidense nº 4.496.938, describe procedimientos para obtener
ligandos de ácido nucleico mejorados una vez se ha realizado la
SELEX. La solicitud de patente estadounidense con número de serie
08/400.440 (WO 96/27605), registrada el 8 de marzo de 1995,
titulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential
Enrichment: Chemi-SELEX", describe
procedimientos para unir covalentemente un ligando a su
diana.
diana.
El procedimiento SELEX abarca la identificación
de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad que contienen
nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al
ligando, tales como una estabilidad in vivo mejorada, o
características de suministro mejoradas. Los ejemplos de tales
modificaciones incluyen las sustituciones químicas en posiciones de
la ribosa y/o del fosfato y/o de la base. Se describen ligandos de
ácido nucleico, que contienen nucleótidos modificados, identificados
mediante SELEX, en la solicitud de patente estadounidense con
número de serie 08/117.991 (WO 95/07364), registrada el 8 de
septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands
Containing Modified Nucleotides", la cual describe
oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados
químicamente en las posiciones 5- y 2'- de las pirimidinas. La
solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/134.028
(WO 95/07364), ver más arriba, describe ligandos de ácido nucleico
altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos
modificados con 2'-amino (2'-NH2),
2'-fluoro (2'-F), y/o
2'-O-metilo
(2'-OMe). La solicitud de patente estadounidense con
número de serie 08/264.029 (WO 95/35102), registrada el 22 de junio
de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified
Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement", describe
oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas modificadas en
2'.
El procedimiento SELEX abarca la combinación de
oligonucleótidos seleccionados con otras unidades funcionales
oligonucleotídicas y no oligonucleotídicas, según se describe
respectivamente en la solicitud de patente estadounidense con
número de serie 08/284.063 (US 5.478.105), registrada el 2 de agosto
de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment: Chimeric SELEX" y en la solicitud de patente
estadounidense con número de serie 08/234.997 (US 5.683.867),
registrada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution
of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX". Estas
solicitudes permiten la combinación de un amplio elenco de formas y
otras propiedades, y las propiedades de replicación y amplificación
efectiva, de los oligonucleótidos, con las propiedades deseables de
otras moléculas.
Este descubrimiento incluye procedimientos para
identificar y producir ligandos de ácido nucleico para polimerasas
de ADN. Específicamente se incluyen procedimientos para identificar
ligandos de ácido nucleico para ADN polimerasas termoestables
útiles en la Reacción en Cadena de la Polimerasa, incluyendo las
polimerasas Taq y Tth, y los ligandos de ácido nucleico
identificados y producidos de ese modo. Más particularmente, se
proporcionan secuencias de ADN que son capaces de unirse
respectivamente de forma específica a las polimerasas Taq y Tth,
inhibiendo de ese modo su capacidad para catalizar la síntesis de
ADN a temperatura ambiente. El procedimiento puede extenderse para
identificar y producir ligandos de ácido nucleico para cualquier ADN
polimerasa termoestable, y los ligandos identificados y producidos
de ese modo.
En este descubrimiento se incluye además un
procedimiento para identificar ligandos de ácido nucleico y
secuencias de ligando de ácido nucleico para las polimerasas Taq y
Tth, el cual comprende los pasos de (a) preparar una mezcla
candidata de ácidos nucleicos, (b) repartir los miembros de dicha
mezcla candidata en base a la afinidad por las polimerasas Taq o
Tth, y (c) amplificar las moléculas seleccionadas para rendir una
mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácido
nucleico con una afinidad relativamente elevada por la unión
respectivamente a las polimerasas Taq y Tth.
En esta invención se incluye un procedimiento
mejorado para llevar a cabo la Reacción en Cadena de la Polimerasa,
el cual comprende el paso de incluir un ligando de ácido nucleico
que inhibe la polimerasa termoestable a temperatura ambiente, pero
que se disocia de la polimerasa a temperaturas elevadas. Ambos
ligandos de ácido nucleico se identifican de acuerdo con el
procedimiento de este descubrimiento.
Más específicamente, la presente invención
incluye los ligandos de ADNss contra la polimerasa Taq y polimerasa
Tth identificados de acuerdo con el procedimiento descrito más
arriba, incluyendo aquellos ligandos listados en las Tablas
2-5 (SEC. Nº ID: 7-73). También se
incluyen los ligandos de ADN para la polimerasa Taq y polimerasa
Tth que son sustancialmente homólogos de cualquier de los ligandos
proporcionados, y que tienen sustancialmente la misma capacidad
para unir e inhibir la actividad de la polimerasa Taq y de la
polimerasa Tth. También se incluyen en esta invención los ligandos
de ADN para la polimerasa Taq y polimerasa Tth que tienen
sustancialmente la misma forma estructural que los ligandos
presentados en la presente invención, y que tienen sustancialmente
la misma capacidad para unir e inhibir la actividad de la polimerasa
Taq y de la polimerasa Tth.
La presente invención incluye también secuencias
de nucleótidos modificados que se basan en los ligandos de ADN
identificados en la presente invención, y en mezclas de los
mismos.
Los ligandos de ácido nucleico de la presente
invención pueden funcionar como "interruptores" en el sentido
en que "encienden" o "apagan" la Reacción en Cadena de la
Polimerasa dependiendo de la temperatura de la mezcla de reacción.
La presente invención, por tanto, incluye también un procedimiento
para identificar y preparar secuencias de ligando de ácido nucleico
y secuencias de ligando de ácido nucleico que funcionan como
interruptores, el cual comprende los pasos de (a) preparar una
mezcla candidata de ácidos nucleicos, (b) repartir los miembros de
dicha mezcla candidata en base a la afinidad por las polimerasas Taq
o Tth, y (c) amplificar las moléculas seleccionadas usando la
molécula diana para rendir una mezcla de ácidos nucleicos
enriquecida en secuencias de ácido nucleico con una afinidad
relativamente elevada por la unión respectivamente a las
polimerasas Taq y Tth sólo a temperaturas inferiores a la
temperatura de amplificación.
Por tanto, la presente invención incluye
procedimientos para la identificación de interruptores de ácido
nucleico. Los interruptores de ácidos nucleicos son ácidos nucleicos
identificados mediante el proceso SELEX, en donde la propiedad
deseada del ácido nucleico puede "encenderse" o "apagarse"
dependiendo de la manipulación de algún parámetro del entorno. Los
interruptores de ácido nucleico pueden identificarse mediante la
manipulación del paso de reparto de SELEX para seleccionar ácidos
nucleicos que proporcionen resultados opuestos, a menudo uniéndose
a la diana, en base a una alteración en un parámetro del medio de
reacción. Los ejemplos en este caso demuestran interruptores de
ácidos nucleicos que se encienden y apagan en base a la
temperatura, sin embargo, el procedimiento de esta invención pueden
extenderse para identificar y preparar ligandos de ácido nucleico
que funcionen como interruptores en base a condiciones distintas de
la temperatura, incluyendo pero no limitándose al pH, la
concentración de iones específicos, por ejemplo, Mg^{++}.
La Figura 1A muestra las afinidades de unión de
grupos de ADN enriquecidos después de 12 rondas de SELEX (o) y del
grupo aleatorio de ADN no seleccionado (\bullet) para la
polimerasa Taq. La Figura 1B muestra las afinidades de unión de
grupos de ADN enriquecidos después de 10 rondas de SELEX (o) y del
grupo aleatorio de ADN no seleccionado (\bullet) para la
polimerasa Tth.
La Figura 2A muestra un análisis de unión
entrecruzada del grupo de ADN enriquecido para la polimerasa Taq
(o), y del grupo de ADN enriquecido para la polimerasa Tth
(\bullet), con la polimerasa Tth. La Figura 2B muestra un
análisis de unión entrecruzada del grupo de ADN enriquecido para la
polimerasa Taq (o), y del grupo de ADN enriquecido para la
polimerasa Tth (\bullet), con la polimerasa Taq.
La Figura 3A ilustra una curva de unión del
ligando 30 (\bullet) y el ligando 21 (\bullet) a la polimerasa
Taq. La Figura 3B ilustra una curva de unión del ligando 30
(\bullet) y el ligando 21 (o) a la polimerasa Tth.
La Figura 4 ilustra la polimerización del
ADN.
La Figura 5A ilustra un ensayo de actividad
polimerasa para las polimerasas Taq y Tth, llevado a cabo a
temperaturas diferentes con diferentes tiempos de incubación. El
ADN se resolvió en un gel de poliacrilamida al 15% en condiciones
desnaturalizantes. Los datos en el Panel A se obtuvieron con la
polimerasa Taq y el grupo enriquecido seleccionado para la
polimerasa Taq, mientras que los del Panel B se obtuvieron con la
polimerasa Tth y el grupo enriquecido seleccionado para la
polimerasa Tth. La plantilla sin tratar, de horquilla de ADN marcada
en el extremo 5' (carril 1); la plantilla marcada en una mezcla de
reacción que carece de polimerasa (carril 2); la incubación de la
mezcla de reacción completa durante 24 minutos a temperatura
ambiente en ausencia de (carril 3) y en presencia del grupo
enriquecido (carril 4). Los carriles 5, 6, y 7 muestran las
incubaciones de las mezclas de reacción completas, en presencia del
grupo enriquecido, durante 5 minutos respectivamente a 37ºC, 50ºC y
60ºC. Los carriles 8 y 9 muestran las incubaciones de las mezclas de
reacción completas en presencia (carril 8) y ausencia (carril 9)
del grupo enriquecido a 70ºC durante 5 minutos. El carril 10 muestra
la movilidad en gel del ADN del grupo marcado en el extremo. Los
esquemas a la derecha de los geles ilustran las posiciones del ADN
corto, marcado en su extremo, inicial y del producto extendido de la
polimerasa.
Las Figuras 5B y 5C ilustran un segundo ensayo
de actividad polimerasa para las polimerasas Taq y Tth, realizado a
tres temperaturas diferentes. El ADN se resolvió en un gel de
poliacrilamida al 15% en condiciones desnaturalizantes. Los datos
en la Figura 5B se obtuvieron con la polimerasa Taq, y los datos en
la Figura 5C se obtuvieron con la polimerasa Tth. Los carriles
1-3 muestran los productos obtenidos en ausencia de
cualquier inhibidor a partir de la incubación respectivamente a
temperatura ambiente, a 30ºC y 37ºC, durante 5 minutos. Los carriles
4-6 muestran los datos obtenidos con el grupo de
secuencia aleatoria no seleccionada; los carriles
7-9 con el grupo enriquecido para la polimerasa
Taq; los carriles 10-12 con el grupo enriquecido
para la polimerasa Tht; los carriles 13-15 con el
anticuerpo Taqstart durante incubaciones de 5 minutos a las tres
temperaturas indicadas. Los esquemas a la derecha indican el ADN
corto inicial marcado en el extremo y el producto extendido de la
polimerasa.
Las Figuras 5D y 5E ilustran un tercer ensayo de
actividad polimerasa para las polimerasas Taq y Tth, resuelto sobre
un gel de poliacrilamida al 15% en condiciones desnaturalizantes. La
Figura 5D muestra la actividad de la polimerasa Taq en presencia
del grupo enriquecido que no ha sido sometido a ciclado térmico,
mientras que la Figura 5E muestra la actividad de la polimerasa Taq
en presencia de un grupo que se ha ciclado térmicamente. Los
carriles 1-5 indican la cantidad de producto formado
a lo largo de incubaciones de 5 minutos respectivamente a 20ºC,
25ºC, 30ºC, 35ºC y 40ºC. Los carriles 6-10 muestran
la actividad de la polimerasa Taq, en presencia del grupo
enriquecido, a lo largo de incubaciones de 5 minutos respectivamente
a 20ºC, 25ºC, 30ºC, 35ºC y 40ºC. Los esquemas a la derecha ilustran
el ADN corto, marcado en el extremo, de inicio y el producto
extendido de la polimerasa.
La Figura 6 ilustra el efecto de la temperatura
sobre la inhibición de la polimerasa Taq (Figura 6A) y la
polimerasa Tth (Figura 6B) mediante los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.:
50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) (carriles 1-10). El
ADN se resolvió en un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones
desnaturalizantes. Los carriles 11-15 ilustran la
formación de producto en ausencia de un inhibidor. El lado derecho
del autorradiograma ilustra esquemáticamente la plantilla marcada
en 5' antes y después de la extensión con polimerasa. Las Figuras 6C
y 6D muestran el porcentaje de producto formado en presencia del
ligando TQ21 (o) y del ligando TQ30 (\bullet) usando
respectivamente la polimerasa Taq (Figura 6C) y la polimerasa Tth
(Figura 6D). La cantidad de producto se cuantificó mediante
PhosphorImager y se normalizó respecto el producto formado en
ausencia de un inhibidor a la misma temperatura, para obtener el
porcentaje de producto (Figuras 6C y 6D (abscisas)).
La Figura 7 ilustra la inhibición reversible de
la polimerasa Taq por parte del ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50). El
ADN se resolvió en un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones
desnaturalizantes. Los carriles 1-5 muestran los
productos obtenidos en ausencia de cualquier inhibidor a partir de
la incubación entre 20ºC-40ºC. Los carriles
6-10 muestran los productos formados a partir de la
incubación entre 20ºC-40ºC en presencia del ligando
TQ30 que no había sido termociclado (Figura 7A) y del ligando TQ30
que había sido sometido a 25 rondas de termociclado.
La Figura 8 ilustra el efecto de la
concentración de ligando sobre la inhibición de la polimerasa Taq
(Figura 8A) y de la polimerasa Tth (Figura 8B) por parte de los
ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) (\bullet) y TQ21 (SEC. Nº ID.:
59) (o). La cantidad de producto formada en presencia de diversas
concentraciones de inhibidor, en los ensayos de extensión de la
plantilla, se cuantificó mediante PhosphorImager y se normalizó
respecto la cantidad de producto formado en ausencia de un
inhibidor, para obtener el porcentaje de producto (abscisas).
La Figura 9 ilustra esquemáticamente el corte de
la secuencia de ADN de 97 nucleótidos (Exo-Sub)
(5'-TTC
GAGCGTG AATCTGAATT CGCGGCTAGC CAGCTTTTGC TG GCTAGCCG CGGTGGGAAA CTGAGGTAGG TGTTTTCACC TACCTCAG TT TCCCACC-3' (SEC. Nº ID.: 75)), con dos tallos-bucles predichos con una hebra desplazada, catalizada por la actividad 5'-3' exonucleasa de las polimerasas Taq y Tth. La polaridad de la secuencia plegada se indica mediante la flecha pequeña. El corte mediado por la actividad exonucleasa de las polimerasas de ADN se espera que ocurra cerca de la unión de la hebra desplazada y la hélice, y que resulte en dos fragmentos de 20 nucleótidos y 77 nucleótidos. Los círculos rellenos en los dos extremos de la molécula indican marcas radiactivas.
GAGCGTG AATCTGAATT CGCGGCTAGC CAGCTTTTGC TG GCTAGCCG CGGTGGGAAA CTGAGGTAGG TGTTTTCACC TACCTCAG TT TCCCACC-3' (SEC. Nº ID.: 75)), con dos tallos-bucles predichos con una hebra desplazada, catalizada por la actividad 5'-3' exonucleasa de las polimerasas Taq y Tth. La polaridad de la secuencia plegada se indica mediante la flecha pequeña. El corte mediado por la actividad exonucleasa de las polimerasas de ADN se espera que ocurra cerca de la unión de la hebra desplazada y la hélice, y que resulte en dos fragmentos de 20 nucleótidos y 77 nucleótidos. Los círculos rellenos en los dos extremos de la molécula indican marcas radiactivas.
La Figura 10 ilustra la detección de una diana
con un número bajo de copias usando la amplificación mediante la
PCR estándar, la PCR "de arranque en caliente", y la
amplificación mediante la PCR en presencia de los inhibidores de
oligonucleótido TQ30 y TQ21 ("PCR NeXstart"). La Figura 10A
ilustra una comparación de la amplificación realizada en
condiciones estándares (carriles 1-3) con las de la
PCR "de arranque en caliente" (carriles 4-6)
para detectar la diana en \sim10 y 50 copias. La Figura 10B
ilustra una comparación de las amplificaciones de PCR realizadas en
presencia de oligonucleótido no específico (NS) (carriles
1-3), con las del TQ21 (carriles
4-6) y TQ30 (carriles 7-9) para
detectar la diana en \sim10 y 50 copias. La Figura 10C ilustra la
detección de una diana con un número bajo de copias (según se
indica) en presencia de los inhibidores oligonucleotídicos TQ21 y
TQ30. En ambas (B) y (C), los inhibidores oligonucleotídicos se
usaron a una concentración de 50 nM. M indica los estándares de
peso molecular. Las flechas en cada panel muestran la posición en
los geles del ADN de 203 p.b. específico de la diana.
La Figura 11 ilustra el efecto de la
concentración de ligandos truncados, Trunc.1-30
(SEC. Nº ID.: 75) (\bullet), Trnc.2-30 (SEC. Nº
ID.: 76) (\sqbullet) y Trnc.3-30 (SEC. Nº ID.: 77)
(o), sobre la actividad de la polimerasa Taq. La cantidad de
producto formada en presencia de diversas concentraciones de
inhibidor se cuantificó mediante PhosphorImager, y se normalizó
respecto la cantidad de producto formado en ausencia de un inhibidor
para obtener el porcentaje de producto (abscisas).
La Figura 12 ilustra el efecto de la
concentración de inhibidor de los ligandos truncados,
Trunc.1-30 (\bullet), Trnc.2-30
(\sqbullet) y Trnc. 3-30 (\blacktriangle), sobre
la actividad del fragmento Stoffel. La cantidad de producto formada
en presencia de diversas concentraciones de inhibidor se cuantificó
mediante PhosphorImager, y se normalizó respecto la cantidad de
producto formado en ausencia de un inhibidor para obtener el
porcentaje de producto (abscisas).
La Figura 13 ilustra las características de
afinidad e inhibición del ligando truncado Trnc.21 (SEC Nº ID.:
70). La Figura 13A ilustra una curva de unión del ligando Trnc.21 a
la polimerasa Taq. La Figura 13B ilustra el efecto de la
concentración de Trnc.21 sobre la actividad de la polimerasa Taq
(\bullet) y la polimerasa Tth (o). Los valores IC_{50} para la
polimerasa Taq y la polimerasa Tth son respectivamente 21 y 36.5
nM. La Figura 13C ilustra el efecto de la temperatura sobre la
inhibición de la polimerasa Taq (\bullet) y de la polimerasa Tth
(o) por parte del Trnc.21. La cantidad de producto formado en
presencia del inhibidor a una temperatura determinada se normalizó
respecto a la formada en ausencia de un inhibidor a la misma
temperatura para obtener el porcentaje de producto. Los valores de
IT_{50} calculados para la polimerasa Taq y la polimerasa Tth son
respectivamente 34ºC y 35,6ºC.
La Figura 14 ilustra la afinidad y
características de inhibición del homodímero
(D.30-D.30) (SEC Nº ID.: 71). La Figura 14A ilustra
una curva de unión para el homodímero (D.30-D.30) a
la polimerasa Taq (K_{d} = 47,5 \pm 5 pM). La Figura 14B
ilustra el efecto de las concentraciones de ligando dimérico
(\bullet) y monomérico (o) sobre la actividad de la polimerasa
Taq.
\hbox{El valor de IC _{50} del Trnc.2-30
(monómero) es 48 nM, mientras que el del D.30-D.30
(dímero) es 14 nM.}
La Figura 15 ilustra las características de
inhibición del heterodímero D.21-D.30 (SEC Nº ID.:
72). La Figura 15A ilustra el efecto de la concentración de
D.21-D.30 sobre la actividad de la polimerasa Taq
(\bullet) y la polimerasa Tth (o). Los valores de IC_{50} para
la inhibición de estas dos polimerasas son aproximadamente 30 nM.
La Figura 15B ilustra el efecto de la temperatura sobre la
inhibición de la polimerasa Taq (\bullet) y de la polimerasa Tth
(o) por parte del heterodímero D.21-D.30.
\hbox{El valor de IT _{50} para la polimerasa Taq es 41ºC,
mientras que para la polimerasa Tth es 34,5ºC.}
La Figura 16 ilustra el efecto de los dNTS y del
ADN plantilla en horquilla sobre la afinidad de unión del Trnc.21 a
la polimerasa Taq. Figura 16A. Análisis de unión a filtro de
nitrocelulosa del Trnc.21 en presencia de dNTP 1 mM. Los círculos
rellenos (\bullet) indican la unión en ausencia de plantilla de
ADN en horquilla, mientras que los círculos vacíos (o) indican la
unión en presencia de plantilla de ADN en horquilla 250 nM. Los
valores de Kd calculados en estas condiciones son aproximadamente
2,5 nM. La Figura 6B ilustra el efecto de la concentración de dNTO
sobre la unión del Trnc.21 a la polimerasa Taq. En este experimento
la unión de Trnc.21 marcado radiactivamente a polimerasa Taq 1 nM se
monitorizó en presencia de diferentes concentraciones de dNTP.
Esta solicitud describe el aislamiento de
ligandos de ácido nucleico a polimerasas de ADN. Específicamente,
esta solicitud describe el aislamiento de ligandos de ácido nucleico
a polimerasas termoestables útiles en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa. En una realización preferida, la ADN polimerasa se
selecciona de entre la polimerasa Taq o polimerasa Tth, no
obstante, el procedimiento de esta invención puede ampliarse a la
identificación y purificación de ligandos de ácido nucleico de
elevada afinidad para cualquier polimerasa de ADN termoestable. Los
ligandos de ácido nucleico se identificaron a través del
procedimiento conocido como SELEX. SELEX se describe en la
solicitud de patente estadounidense con número de serie 07/536.428
(WO 91/19813), titulada "Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment", actualmente abandonada, en la solicitud
de patente estadounidense con número de serie 07/714,131,
registrada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid
Ligands", que actualmente es la patente estadounidense nº
5.475.096, en la solicitud de patente estadounidense con número de
serie 07/931.473, registrada el 17 de agosto de 1992, titulada
"Nucleic Acid Ligands", que actualmente es la patente
estadounidense nº 5.270.163 (consultar también PCT/US91/04078).
Estas solicitudes se denominan conjuntamente las Solicitudes de
Patentes SELEX.
En su forma más básica, el proceso SELEX puede
definirse por la siguiente serie de pasos:
- 1)
- Se preparar una mezcla candidata de ácidos nucleicos con secuencias diferentes. La mezcla candidata generalmente incluye regiones de secuencias fijas (es decir, cada uno de los miembros de la mezcla candidata contiene las mismas secuencias en la misma ubicación) y regiones de secuencias aleatorias. Las regiones de secuencia fija se seleccionan: (a) para ayudar en los pasos de amplificación descritos más abajo, (b) para imitar una secuencia que se sabe se une a la diana, o (c) para potenciar la concentración de una determinada disposición estructural de los ácidos nucleicos en la mezcla candidata. Las secuencias aleatorias pueden ser totalmente aleatorias (es decir, la probabilidad de hallar una base en cualquier posición es de una sobre cuatro) o sólo parcialmente aleatoria (por ejemplo, la probabilidad de hallar una base en cualquier ubicación puede seleccionarse a cualquier nivel entre el 0 y 100 por ciento).
- 2)
- La mezcla candidata se pone en contacto con la diana seleccionada en condiciones favorables a la unión entre la diana y los miembros de la mezcla candidata. En estas circunstancias, puede considerarse que la interacción entre la diana y los ácidos nucleicos de la mezcla candidata es formadora de pares ácido nucleico-diana entre la diana y aquellos ácidos nucleicos que tienen la afinidad más intensa por la diana.
- 3)
- Los ácidos nucleicos con la afinidad más elevada por la diana se separan de los ácidos nucleicos con una afinidad menor por la diana. Puesto que en la mezcla candidata sólo un número extremadamente pequeño de secuencias (y posiblemente sólo una molécula de ácido nucleico) correspondiente a los ácidos nucleicos con la máxima afinidad, generalmente es deseable establecer el criterio de reparto de tal forma que una cantidad significativa de ácidos nucleicos en la mezcla candidata (aproximadamente el 5-10%) sea retenida durante el reparto.
- 4)
- Aquellos ácidos nucleicos seleccionados durante el reparto como poseedores de una afinidad relativamente elevada por la diana se amplifican a continuación para crear una nueva mezcla candidata que está enriquecida en ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente elevada por la diana.
- 5)
- Repitiendo los pasos de reparto y amplificación anteriores, la mezcla candidata nuevamente formada contiene menos y menos secuencias únicas, y el grado promedio de afinidad de los ácidos nucleicos por la diana generalmente incrementará. Llevado al extremo, el proceso SELEX rendirá una mezcla candidata que contendrá una o un número pequeño de ácidos nucleicos únicos que representarán los ácidos nucleicos de la mezcla candidata original que tienen las afinidad más elevada por la molécula diana.
Las Solicitudes de Patente SELEX describen y
elaboran este proceso con gran detalle. Se incluyen dianas que
pueden usarse en el proceso; procedimientos para repartir ácidos
nucleicos en una mezcla candidata; y procedimientos para amplificar
ácidos nucleicos seleccionados para generar mezclas candidatas
enriquecidas. Las Solicitudes de Patentes SELEX también describen
ligandos obtenidos para un cierto número de especies dianas,
incluyendo dianas proteicas en donde la proteína es y no es una
proteína unidora de ácido nucleico.
El proceso SELEX proporciona ligandos de elevada
afinidad de una molécula diana. Esto representa un logro singular
que no tiene precedentes en el campo de la investigación en ácidos
nucleicos. La presente invención aplica el procedimiento SELEX a
las dianas específicas de los inhibidores de ácido nucleico de las
ADN polimerasas, particularmente las polimerasas Taq y Tth. En la
sección de ejemplos de más abajo, se describen los parámetros
experimentales usados para aislar e identificar los inhibidores de
ácido nucleico de las polimerasas Taq y Tth.
En la solicitud de patente estadounidense
pendiente de tramitación, y en condiciones normales concedida, con
número de serie nº 07/964.624, registrada el 21 de octubre de 1992
(`624), que actualmente es la patente estadounidense nº 5.496.938,
se describen procedimientos para obtener ligandos de ácido nucleico
mejorados una vez se ha realizado la SELEX. La solicitud `624,
titulada "Methods of Producing Nucleic Acid Ligands", se
incorpora específicamente en la presente invención por
referencia.
Ciertos términos usados para describir la
invención en la presente memoria se definen como sigue:
- "Ligando de ácido nucleico" tal y como se utiliza en la presente invención es un ácido nucleico que ocurre de forma no natural y que tiene una acción deseable sobre una diana. Una acción deseable incluye, pero no se limita a la unión de la diana, cambiar catalíticamente la diana, reaccionar con la diana de una forma que modifica/altera la diana o la actividad funcional de la diana, unirse covalentemente a la diana como en un inhibidor suicida, facilitar la reacción entre la diana y otra molécula. En la realización preferida, la acción tiene afinidad de unión específica por una molécula diana, siendo semejante molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido, la cual se une al ligando de ácido nucleico a través de un mecanismo que predominantemente depende del emparejamiento de bases de Watson/Crick o de la unión de la triple hélice, en donde el ligando de ácido nucleico no es un ácido nucleico que tienen la función fisiológica conocida de ser unido por la molécula diana. Los ligandos de ácido nucleico incluyen los ácidos nucleicos que son identificados a partir de una mezcla candidata de ácidos nucleicos, siendo dicho ligando de ácido nucleico un ligando de una diana determinada, mediante el procedimiento que comprende: a) poner en contacto la mezcla candidata con la diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por la diana respecto a la mezcla de candidatos pueden separarse del resto de la mezcla de candidatos; b) separar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada del resto de la mezcla de candidatos; y c) amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada para rendir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando.
- "Mezcla de candidatos" es una mezcla de ácidos nucleicos de secuencias diferentes, de la cual se selecciona un ligando deseado. La fuente de una mezcla de candidatos puede ser ácidos nucleicos, o fragmentos de los mismos, que ocurren de forma natural, ácidos nucleicos sintetizados químicamente, ácidos nucleicos sintetizados enzimáticamente, o ácidos nucleicos preparados mediante una combinación de las técnicas precedentes. En una realización preferida, cada ácido nucleico tiene secuencias fijas que rodean una región aleatoria para facilitar el proceso de amplificación.
- "Ácido nucleico" significa ADN, ARN, de hebra sencilla o de doble hebra, y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a las que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga, polarizabilidad, puentes de hidrógeno, interacción electrostática, y fluxionalidad adicional a las bases del ligando de ácido nucleico o al ligando de ácido nucleico en su conjunto. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a las modificaciones del azúcar en la posición 2', las modificaciones de la pirimidina en la posición 5, las modificaciones de la purina en la posición 8, las modificaciones en las aminas exocíclicas, la sustitución de la 4-tiouridina, la sustitución del 5-bromo o 5-yodo-uracilo, las modificaciones del esqueleto, las metilaciones, las combinaciones de emparejamiento de bases inusuales, tales como las isobases de isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones incluyen también las modificaciones 3' y 5' tales como el recubrimiento (capping).
- La metodología "SELEX" implica la combinación de la selección de ligandos de ácido nucleico, los cuales interacción con una diana de una manera deseable, por ejemplo, uniéndose a una proteína, con la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. La iteración cíclica de los pasos de selección/amplificación permite la selección de uno o un número pequeño de ácidos nucleicos, los cuales interaccionan con la diana con la máxima intensidad, de entre un grupo que contiene un número muy elevado de ácidos nucleicos. Los ciclos del proceso de selección/amplificación se continúan hasta que se alcanza un objetivo seleccionado. En la presente invención, la metodología SELEX se emplea para obtener ligandos de ácido nucleico para las polimerasas Taq y Tth. La metodología SELEX se describe en las Solicitudes de Patentes SELEX.
- "Diana" significa cualquier compuesto o molécula de interés para la cual se desea un ligando. Una diana puede ser una proteína, un péptido, un carbohidrato, un polisacárido, una glicoproteína, una hormona, un receptor, un antígeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, una análogo de estado de transición, un cofactor, un inhibidor, un fármaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento, etcétera, sin limitación. En esta solicitud, la diana es una ADN polimerasa. En una realización preferida la ADN polimerasa es la polimerasa Taq y la polimerasa Tth.
- Un "ligando lábil" tal y como se utiliza en la presente invención es un ligando de ácido nucleico identificado mediante el proceso SELEX, el cual tiene una afinidad enormemente disminuida por su diana en base a un ajuste de un parámetro del entorno. En la realización preferida, el parámetro del entorno es la temperatura, y la afinidad de un ligando por su diana está disminuida a temperaturas elevadas.
- "ADN polimerasa" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a cualquier enzima que cataliza la síntesis de ADN mediante la adición de unidades de desoxirribonucleótido a una cadena de ADN, usando ADN o ARN (transcriptasa inversa) como plantilla. Las ADN polimerasas termoestables se aíslan de microorganismos que prosperan a temperaturas superiores a 40ºC.
- Un "interruptor" se refiere a cualquier compuesto que funciona para "encender" o "apagar" una reacción dependiendo de alguna condición o condiciones de reacción específicas. En la presente invención, los ligandos de ácido nucleico funcionan para "encender" o "apagar" la PCR dependiendo de la temperatura de la reacción. Un interruptor puede operar en base a otras condiciones de reacción, incluyendo el pH, la fuerza iónica, o la presencia o ausencia de iones específicos. Los interruptores de ácido nucleico se identifican mediante el procedimiento SELEX a través de la selección apropiados de técnicas de reparto. Los parámetros de reparto se determinan con objeto de que se seleccionen ácidos nucleicos que tienen las características interruptoras deseadas.
En la presente invención, el experimento SELEX
se realizó con objeto de identificar ligandos de ácido nucleico con
elevada afinidad específica por las polimerasas Taq y Tth a partir
de una biblioteca degenerada que contenía 30 posiciones aleatorias
(30N) (Ejemplo 1). Aunque pueden identificarse ligandos de ARN o ADN
para este propósito, los ejemplos siguientes describen la
identificación de ligandos de ADN. El experimento SELEX se diseñó
para identificar oligonucleótidos que unen e inhiben las polimerasas
a baja temperatura (temperatura ambiente), pero no a temperaturas
más elevadas (>40ºC). Esto se consiguió usando la polimerasa
diana para amplificar las moléculas seleccionadas por afinidad en
la PCR a una temperatura elevada. En semejantes condiciones, no se
esperaba que las secuencias de ADN que inhiben las polimerasas Taq y
Tth a temperatura elevada se amplificaran y propagaran durante la
selección. Esta invención incluye los ligandos de ADNss específicos
para la polimerasa Tth mostrados en la Tabla 3 (SEC. Nº ID.:
7-35) y la polimerasa Taq mostrados en la Tabla 3
(SEC. Nº ID.: 36-66, 76, 77), y los ligandos de
ácido nucleico mostrados en las Tablas 4 y 5 (SEC. Nº ID.:
67-74), identificador mediante los procedimientos
descritos en el Ejemplo 1. Esta invención incluye además ligandos de
ADN para las polimerasas Taq y Tth que inhiben la función de la
polimerasas Taq y Tth.
El ámbito de los ligandos cubierto por esta
invención se extiende a todos los ligandos de ácido nucleico de las
polimerasas Taq y Tth, modificados y no modificados, identificados
de acuerdo con el procedimiento SELEX. Más específicamente, esta
invención incluye las secuencias de ácido nucleico que son
sustancialmente homólogas a los ligandos mostrados en las Tablas
2-5. Por sustancialmente homólogas se quiere
significar un grado de homología de secuencia primaria superior al
70%, más preferiblemente superior al 80%. Una revisión de las
homologías de secuencia de los ligandos de Taq y Tth mostrados en
las Tablas 2-5 muestra que las secuencias con poca
o ninguna homología primaria pueden tener sustancialmente la misma
capacidad para unir respectivamente la polimerasa Taq y Tth. Por
estas razones, esta invención incluye también ligandos de ácido
nucleico que tienen sustancialmente la misma capacidad para unir
las polimerasas Taq y Tth que los ligandos de ácido nucleico
mostrados en las Tablas 2-5. Sustancialmente la
misma capacidad para unir la polimerasa Taq o Tth significa que la
afinidad se halla dentro de unos pocos órdenes de magnitud de la
afinidad de los ligandos descritos en la presente invención. Entre
las capacidades de los especialistas con formación ordinaria en la
técnica se halla claramente el establecer si una secuencia
determinada
- -sustancialmente homóloga con las descritas específicamente en la presente invención- - tiene sustancialmente la misma capacidad para unir respectivamente las polimerasas Taq y Tth.
- -sustancialmente homóloga con las descritas específicamente en la presente invención- - tiene sustancialmente la misma capacidad para unir respectivamente las polimerasas Taq y Tth.
Esta invención incluye también los ligandos tal
y como se han descrito más arriba, en donde dichos ligandos inhiben
la función de otras polimerasas de ADN termoestables, incluyendo,
pero no limitándose al fragmento Stoffel, la polimerasa Tbr, la
polimerasa Tlf, y la transcriptasa inversa de
M-MLV.
Esta invención incluye también los ligandos tal
y como se ha descrito más arriba, en donde ciertas modificaciones
químicas se realizan con objeto de incrementar la estabilidad in
vivo o in vitro del ligando, o para potenciar o mediar
la unión u otras características deseables del ligando, o el
suministro del ligando. Los ejemplos de tales modificaciones
incluyen las sustituciones químicas en posiciones del azúcar y/o del
fosfato y/o de la base de una determinada secuencia de ácido
nucleico. Consultar, por ejemplo, la solicitud de patente
estadounidense con número de serie 08/117.991 (WO 95/07364),
registrada el 9 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity
Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides". Otras
modificaciones son conocidas por alguien con formación ordinaria en
la técnica. Tales modificaciones pueden hacerse después de la SELEX
(modificación de ligandos sin modificar identificados previamente) o
por incorporación en el proceso de SELEX.
Los ligandos de ácido nucleico para las
polimerasas Taq y Tth descritos en la presente invención son útiles
como reactivos en la Reacción en Cadena de la Polimerasa.
La presente invención incluye un procedimiento
mejorado para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa, en
donde una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico que
ha de amplificarse se mezcla con 1) cebadores que son
complementarios de secuencias que flanquean la secuencia a
amplificar, 2) una polimerasa termoestable, y 3) un ligando de
ácido nucleico que es capaz de inhibir la polimerasa a temperaturas
ambiente. El ligando de ácido nucleico inhibidor puede
inmovilizarse sobre un soporte sólido. A continuación se siguen los
pasos normales de la PCR - - -fundido, hibridación y
síntesis- - - mediante iteración cíclica térmica de la
mezcla. La presencia del ligando de ácido nucleico impide que la
mezcla amplifique el ADN de fondo, impidiendo cualquier síntesis a
temperaturas inferiores antes o durante la iteración. La presente
invención incluye también una equipo de PCR que comprende una ADN
polimerasa termoestable y un ligando de ácido nucleico que inhibe
dicha polimerasa a temperaturas ambiente, aunque permite que ocurra
la síntesis durante los ciclos de temperatura elevada del proceso
de la PCR. La presente invención incluye también un procedimiento
para mejorar la PCR, tal y como será entendido por los
especialistas en la técnica, incluyendo el paso de añadir a la
polimerasa termoestable un ligando de ácido nucleico que inhibe
dicha polimerasa a temperaturas ambiente, aunque permite que ocurra
la síntesis durante los ciclos de temperatura elevada del proceso de
la PCR.
El Ejemplo 1 describe los procedimientos
experimentales usados en la selección de ligando de ácido nucleico
para ambas, las polimerasas Taq y Tth. En la Tabla 2 se detallan las
secuencias de ADNss obtenidas de 10 rondas de selección realizadas
con la polimerasa Tth. Se secuenciaron veintinueve clones
individuales procedentes de la selección con polimerasa Tth (sólo
la región de nucleótidos variable se muestra en la Tabla 2). Los
ligandos se agruparon en familias basadas en homología de secuencia
primaria.
Las secuencias de ADNss obtenidas de 12 rondas
de selección realizadas con la polimerasa Taq se detallan en la
TABLE 3. De las cuarenta y dos secuencias analizadas de la selección
con la polimerasa Taq, treinta y tres eran únicas. Las letras
mayúsculas indican la región aleatoria de 30 nucleótidos que está
flanqueada por las regiones de secuencia fija
5'-TTCTCGGTTG GTCTCTGGCG GAGC- y -TCTTGTGTAT
GATTCGCTTT TCCC-3' para formar las secuencias de
longitud completa. Las letras minúsculas en algunas de las
secuencias indican la secuencia 5' fija. El número de clones
portadores de la misma secuencia se indica entre paréntesis. Las
secuencias se agruparon en tres familias en base a la similitud de
secuencia. Los motivos de secuencia conservados en las familias I y
II están encuadrados. Ambas familias contenían una secuencia
consenso diferente;
5'-A/_{G}A/_{G}TGTG/_{A}CAGTAT/_{G}C-3'
para la Familia I, y
5'-A/_{G}CGTTTTG-3' para la
Familia II. En la Familia I, las regiones 5' y 3' de la secuencia
consenso mostraron potencial para el emparejamiento de bases entre
ellas (subrayadas en la Tabla 3). Adicionalmente, la covariación
observada en estas regiones sugiere la existencia de una posible
estructura tallo-bucle. En la mayoría de los
ligandos las regiones de emparejamiento potencial de bases se
extendía más allá de la región consenso. Por contra, los ligandos
de la Familia II no tienen un motivo estructura secundario
obvio.
Las curvas de unión representativas del clon 30
(TQ30 (SEC. Nº ID.: 50)) de la Familia I y del clon 21 (TQ21 (SEC.
Nº ID.: 59)) de la Familia II, se muestran en la Figura 3. En ambos
casos, los ligandos muestran una unión estrecha a las dos
polimerasas, con valores de K_{d} en el rango picomolar bajo; los
valores de K_{d} del TQ30 son \pm 1 pM para la polimerasa Taq y
28 \pm 4 pM para la polimerasa Tth, mientras que los del TQ21 son
36 \pm 4 pM y 10 \pm 2 pM respectivamente para las polimerasa
Taq y la polimerasa Tth. Se examinaron varios ligandos mas de las
dos familias, Los valores de K_{d} oscilaron de 0,04 a 9 nM para
la polimerasa Taq y de 0,01 a 0,3 nM para la polimerasa Tth.
El Ejemplo 2 (Figuras 5-9)
describe un cierto número de ensayos de inhibición de la polimerasa
y demuestra que los ligandos de la invención son capaces de inhibir
la interacción de ambos, las polimerasas Taq y Tth, a temperaturas
inferiores a 40ºC. En el Ejemplo 2, el ADN en horquilla diseñado
(DNA-HP; 5'-ATGCCTAAGT TTCGAACGCG
GCTAGCCAGC TTTTGCTGGC TAGCCGCGT-3' (SEC. Nº ID.: 6)
se usa como una plantilla para medir la capacidad de los grupos de
ADN enriquecidos, así como, de los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y
TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) procedentes de la selección con polimerasa
Taq, para inhibir la actividad polimerasa en una variedad de
condiciones. Este ensayo detecta la síntesis de relleno, dirigida
por la plantilla, de 15 nucleótidos sobre una horquilla de ADN
plegada hacia atrás.
La Figura 5A muestra los resultados de los
ensayos de inhibición llevados a cabo a diferentes temperaturas con
diferentes tiempos de incubación usando los grupos enriquecidos de
ligandos de ADN. La actividad de ambas, las polimerasas Taq y Tth
es generalmente bajo a temperaturas bajas, e incrementa a medida que
la temperatura se incrementa, como puede observarse comparando el
carril 3 (reacción a temperatura ambiente) con los carriles
6-9 (reacción a 50, 60 y 70ºC, respectivamente). Los
grupos enriquecidos inhiben la actividad de sus respectivas
polimerasas a temperatura ambiente (carril 4), pero no a
50ºC-70ºC. El carril 10 muestra la movilidad del
grupo marcado radiactivamente como una referencia para detectar la
posible extensión de moléculas de ADN en el grupo que puedan servir
como plantilla para las polimerasas. La ausencia de bandas marcadas
radiactivamente migrando en la proximidad o por encima del grupo
marcado en los carriles 6-9 indica la ausencia de
polimerización del grupo de
ADNss.
ADNss.
Puesto que la actividad de las polimerasas
termoestables es baja a temperatura ambiente, el período de
incubación en el ensayo se incrementó hasta 16 horas. Las Figuras 5B
y 5C muestran los resultados de la incubación de 16 horas de la
plantilla con la dos polimerasas en presencia de grupos
seleccionados y del grupo aleatorio. Además, la inhibición mediada
por grupos seleccionados se comparó con la del anticuerpo
anti-Taq (Taqstart). Los datos en la Figura 5B se
obtuvieron con la polimerasa Taq, y los datos en la Figura 5C se
obtuvieron con la polimerasa Tth. En las tres temperaturas
estudiadas, temperatura ambiente, 30ºC y 37ºC, el grupo aleatorio
no mostró inhibición de las dos polimerasas (comparar los carriles
1-3 con 4-6), sugiriendo que la
inhibición causada por el grupo enriquecido es específica de la
secuencia. El grupo seleccionado para la polimerasa Taq inhibió
completamente la actividad polimerasa a lo largo de una incubación
de 16 horas a temperatura ambiente (carril 7), pero no a 30ºC y más
(carriles 8 & 9). Aunque el grupo seleccionado para la
polimerasa Tth mostró unión a la polimerasa Taq, fue incapaz de
inhibir la polimerasa Taq (carriles 10-12). Tal y
como se esperaba, el anticuerpo Taqstart inhibió la actividad
polimerasa a las tres temperaturas investigadas (carriles
12-15). Sin embargo, el grupo del ADNss seleccionado
para la polimerasa Tth no inhibió la actividad enzimática a lo
largo de una incubación de 16 horas (comparar los carriles
1-3 con 4-6). Por contra, el mismo
grupo fue capaz de inhibir la actividad enzimática a lo largo de
períodos breves de incubación. El grupo seleccionado para la
polimerasa Taq fue capaz de inhibir parcialmente (> 50%) la
actividad Tth a lo largo de una incubación de 16 horas a
temperatura ambiente (carril 10). El anticuerpo Taqstart no tuvo
efecto alguno sobre la actividad de la Tth (carriles
13-15).
El uso del anticuerpo Taqstart está limitado a
una vez en una reacción de la PCR. Una vez se ha desnaturalizado a
temperatura elevada no puede renaturalizarse de vuelta a su forma
nativa. Sin embargo, los ligandos de ácido nucleico con estructuras
secundarias simples tiene el potencial de renaturalizarse de vuelta
a su forma nativa después de superar un ciclo térmico. Se llevó a
cabo un experimento para investigar si la capacidad inhibidores del
grupo de ADN seleccionado para la polimerasa Taq podía restablecerse
después del calentamiento (Figuras 5D y 5E). La Figura 5D muestra
la inhibición de la actividad Taq entre 20ºC-40ºC
por parte del grupo de ADN seleccionado que no ha sido sometido a
termociclado. A lo largo de 45 minutos de incubación, el grupo
inhibió completamente la actividad Taq a 20ºC y 25ºC. Durante este
período relativamente corto de incubación, el grupo exhibió >70%
de inhibición a 30ºC. Puede observarse un perfil de inhibición muy
similar con el grupo de ADN que se ha sometido a dos ciclos de la
PCR con la polimerasa Taq en ausencia del ADN plantilla. Este
resultado demuestra que la inhibición mediada por el ADNss es
reversiblemente sensible a la temperatura y que puede restablecerse
incluso después de la
PCR.
PCR.
La Figura 6 muestra el rango de temperaturas en
las cuales las secuencias TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº
ID.: 59) (Tabla 3) son inhibidores de las ADN polimerasas Taq y Tth.
Los ensayos de extensión de la horquilla representados en esta
figura se realizaron a las temperaturas indicadas, durante 1 hora,
usando 250 nM del ligando respectivo (carriles
1-10). Tal y como se anticipaba, los ligandos de
ADNss no inhibieron ninguna polimerasa a temperaturas >40ºC
(Figuras 6A y 6B). Las temperaturas a las que se genera el 50% del
producto durante el ensayo de una hora (valores IT_{50}) para el
ligando TQ30 son respectivamente 41ºC y 29ºC para las polimerasas
Taq y Tth. Los valores respectivos para el ligando TQ21 son 37ºC y
29ºC. Las afinidades de unión de los dos ligandos para estas
polimerasas disminuyen a temperaturas más elevadas (no se muestran
los datos), de acuerdo con su actividad inhibidora disminuida a
temperatura elevada. En los ensayos de extensión de la horquilla,
aproximadamente el 2% de la plantilla en horquilla inicial no fue
extendida por la ADN polimerasa, presumiblemente debido a un
plegado incorrecto.
La Figura 7 ilustra que la inhibición de la
polimerasa Taq por parte del ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) es
térmicamente reversible, y que puede restablecerse incluso después
de la CR. Los ensayos de extensión de la horquilla representados en
esta figura se realizaron a las temperaturas indicadas, durante 10
minutos, en un volumen de reacción de 100 ml, con 5 U de polimerasa
Taq, en ausencia (carriles 1-5) y en presencia
(carriles 6-10) de ligando TQ30 (50 nM). En la
Figura 7A, el ligando TQ30 no se ha sometido a termociclado. En la
Figura 7B, el ligando TQ30 se sometió a 25 rondas de termociclado
con polimerasa Taq (30 segundos a 90ºC; 1 minuto a 50ºC, 30
segundos a 72ºC) y se enfrió a temperatura ambiente antes de añadir
la plantilla en horquilla marcada radiactivamente (250 nM). Como
puede observarse en la Figura 7, en ambos casos el ligando TQ30
inhibió la polimerasa a temperaturas inferiores a 40ºC.
Adicionalmente, la muestra que experimentó el termociclado mostró
una inhibición idéntica o más efectiva que la muestra no sometida a
termociclado.
La Figura 8 demuestra el efecto de la
concentración de ligando sobre la inhibición de las polimerasas Taq
y Tth. La concentración de inhibidor necesaria para producir el 50%
del producto en el ensayo de horquilla (valores IC_{50}) para el
TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) fue respectivamente
6,5 nM y 10 nM para la inhibición de la polimerasa Taq a
temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC) a lo largo de una
incubación de 16 horas (Figura 8A). Puesto que la concentración de
polimerasa Taq usada en el ensayo es 12,5 nM, la inhibición del
enzima por parte del TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) es probable que sea el
resultado de una unión estequiométrica. Cuando se ensayó a 30ºC a
lo largo de 1 hora, los valores de IC_{50} incrementaron
aproximadamente tres veces (22 nM para el TQ30 y 67 nM para el TQ21;
no se muestran los datos). Los valores de IC_{50} del TQ30 y TQ21
para la inhibición de la polimerasa Tth fueron respectivamente 60 y
36 nM, a temperatura ambiente (Figura 8B). En conjunto, estos
oligonucleótidos son inhibidores más efectivos para la polimerasa
Taq, el enzima usado en la selección, que para la polimerasa
Tth.
Tth.
Para excluir la posibilidad de que la inhibición
observada de la extensión de la plantilla se deba a la unión
preferente de ligandos seleccionados a la polimerasa, y a su
utilización subsiguiente como sustrato, se incubaron los ligandos
TQ21 y TQ30 marcados radiactivamente con las dos ADN polimerasas
durante 16 horas (Ejemplo 2, no se muestran los datos). El ligando
TQ30 no mostró productos de extensión a partir de su incubación con
cualquiera de los enzimas, indicando que no es un sustrato de la
actividad polimerasa. Sin embargo, el TQ21 dio lugar a una banda de
peso molecular más elevado, indicativa de una extensión de secuencia
a partir de su incubación con ambas polimerasas. La extensión
parcial observada del ligando TQ21 se eliminó efectivamente
bloqueando la disponibilidad del grupo 3'-OH
mediante el recubrimiento del extremo 3' con un engarce de
etilenglicol usando condiciones estándares. Las construcciones de
oligonucleótidos recubiertas en 30 son inhibidores tan efectivos
como las moléculas sin recubrir (no se muestran los datos). Estos
resultados indican que los ligandos de ADNss son sustratos pobres
para la actividad polimerasa, y que los dos tipos de ligandos
probablemente se colocan sobre las ADN polimerasas de forma
diferente; el TQ21 se une a las polimerasa de tal forma que su
extremo 3' puede ser prolongado (aunque pobremente), mientras que el
TQ30 no puede ser extendido después de su unión.
La reversibilidad térmica de la interacción de
los ligandos de ácido nucleico con las polimerasas Taq y Tth
plantea la posibilidad de usar una matriz de afinidad generada con
tales ligandos, para capturar la polimerasa después de una
amplificación, para usarla en una amplificación subsiguiente. Para
investigar la posibilidad de la captura por afinidad, se prepararon
cuentas de afinidad que contenían los ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.:
50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) según se describe en el Ejemplo 1.
Después de la extensión de la plantilla en horquilla con las
polimerasas Taq y Tth en un tampón de PCR que contenía heparina, se
mezcló la reacción con cuentas de afinidad o cuentas control según
se describe en el Ejemplo 2, las cuentas se lavaron minuciosamente
y se expusieron a continuación a una alícuota reciente de mezcla de
reacción que contenía todos los reactivos excepto la polimerasa.
Después de incubarlas durante 5 minutos adicionales a 70ºC para
permitir la extensión sobre la plantilla recién añadida, las
mezclas de reacción se analizaron sobre un gel de poliacrilamida al
8% en condiciones desnaturalizantes. En las mezclas de reacción que
contenían las cuentas control no hubo extensión de la plantilla en
la segunda ronda de amplificación. Por contra, en las mezclas de
reacción que contenían cuentas de afinidad no hubo diferencia en
los productos de extensión en ambas la primera y segunda ronda de
amplificación, indicando que las cuentas de afinidad contenían
ambos, el ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y el TQ21, exitosamente
capturaban la dos polimerasas después de la primera ronda de la
PCR.
Tal y como se ha discutido más arriba, además de
su capacidad para catalizar la síntesis de polinucleótidos, tanto
la polimerasa Taq como la polimerasa Tth poseen también actividad
exonucleasa 5'-3' (Joyce y Steitz (1987) Trends
Biochem. Sci. 12:288; Longley et al. (1990) Nucleic Acids
Res. 18:7317). El sustrato preferido para la actividad exonucleasa
5'-3' es un ADNss desplazado (o una estructura
parecida a un tenedor) teniendo lugar el corte cerca de la unión
dúplex/ADNss. Para estudiar el efecto de los inhibidores de
oligonucleótidos sobre la actividad exonucleasa
5'-3' de las polimerasas, se diseñó un sustrato de
ADN (Exo-Sub) que contenía un ADNss desplazado en
una horquilla (Ejemplo 3, Figura 9). El marcado radiactivo del
sustrato Exo-Sub en ambos extremos 5' y 3' permitió
la detección de los dos fragmentos de ADN producidos por la
actividad exonucleasa. Los dos fragmentos de ADN etiquetados, que
procedían de la actividad exonucleasa, aparecían ambos en presencia
y ausencia de los inhibidores de oligonucleótidos (no se muestran
los datos), sin embargo, la cantidad de productos de corte
generados en presencia de los inhibidores de oligonucleótidos era
algo inferior a la producida en ausencia de los inhibidores,
indicando que los inhibidores de oligonucleótidos ejercen cierto
efecto inhibidor sobre la actividad exonucleasa de los enzimas.
Puesto que estos oligonucleótidos inhibían completamente las
actividades polimerasa de los dos enzimas a 250 nM, su efecto sobre
la actividad exonucleasa se considera marginal.
Los ensayos de inhibición usando otras
polimerasas de ADN disponibles comercialmente y los ligandos TQ21
(SEC. Nº ID.: 59) y TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) como inhibidores, se
describen en el Ejemplo 4. Se examinaron cuatro enzimas
termoestables (lo polimerasa Tbr de Thermus brockianus, la
polimerasa Tfl de Thermus flavus, la polimerasa Tma de
Thermotoga maritima, y la polimerasa Tli de Thermococcus
litoralis); tres enzimas mesofílicos (fragmento Klenow de DNAP1
(KF) de E. coli, ADN polimerasa de T4 y ADN polimerasas de
T7); y cuatro transcriptasas inversas (RT) (RT del
VIH-I, RT del VMA (virus de la mieloblastosis
aviaria) y RT del VLM-M (virus de la leucemia
múrida de Moloney), y su mutante que carece de actividad ARNasa H
(SuperScript II).
De las seis polimerasas termoestables examinadas
(incluyendo las polimerasas Taq y Tth), las cuatro polimerasas
derivadas de especies de Thermus (Taq, Tth, Tbr y Tlf) fueron
inhibidas por los dos oligonucleótidos seleccionados, sugiriendo
que estos enzimas comparten un elevado grado de similitud. Tal y
como se ha afirmado más arriba, se ha descrito que la polimerasa
Tth y la polimerasa Taq son un 93% similares y un 88% idénticas a
nivel de secuencia de aminoácidos (Abramson (1995) en "PCR
Strategies" (Academic Press, Nueva York). La polimerasa Tfl se
ha descrito que es un 93% similar y 86% idéntica a la polimerasa Taq
a nivel de aminoácidos (D. Gelfand, comunicación personal). Por
otro lado, la polimerasa Tma de Thermotoga maritima y la
polimerasa Tli de Thermococcus litoralis no fueron inhibidas
por ninguno de los ligandos. La polimerasa Tli comparte poca
homología de secuencia con los enzimas de eubacterias (Ito y
Braithwaite (1991) Nucleic Acids Res. 19:4045). Se ha descrito que
la polimerasa Tma es un 61% similar y un 44% idéntica a la
polimerasa Taq a nivel de aminoácidos (Abramson (1995) en "PCR
Strategies" (Academic Press, Nueva York), aunque los ligandos de
oligonucleótidos no inhiben la
polimerasa.
polimerasa.
De las cuatro transcriptasas inversas ensayadas,
las RT del VIH-I y VMA (virus de la mielobastosis
aviaria) no se inhibieron. Por otra parte, la RT del
VLM-M (virus de la leucemia múrida de moloney) y su
mutante sin actividad RNasa H (SuperScript II) fueron inhibidas por
los dos ligandos de oligonucleótidos.
Las ADN polimerasa mesofílicas, tales como el
fragmento Klenow de la ADNP1 de E. coli (KF), la ADNP de T4
y la ADNP de T7 no fueron inhibidas por ningún ligando a una
concentración de 0,5 mM, a pesar de la similitud de los dominios
polimerasa de la polimerasa Taq y del KF (Kim et al. (1995)
Nature (London) 376:612; Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem.
264: 6427). Por tanto, parece que los inhibidores de
oligonucleótidos son generalmente bastante específicos. Estos
resultados son similares al comportamiento de los ligandos de ácido
nucleico identificados mediante selección in vitro para otras
transcriptasas inversas (Tuerk y MacDougal (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci, U.S.A. 89:6988; Chen y Gold (1994) Biochemistry 31:8746;
Schneider et al. (1995) Biochemistry 34:
9599).
9599).
El Ejemplo 5 (Figura 10) describe un cierto
número de amplificaciones de la PCR comparando las técnicas
estándares de la PCR, la PCR "de arranque en caliente", y la
PCR usando el TQ30 y TQ21 para facilitar la detección de una diana
con un número bajo de copias mediante la PCR en ausencia de
condiciones "de arranque en caliente". Se utilizó un sistema
de cebador-plantilla diseñado para detectar un
fragmento de ADN de 203-pares de bases (p.b.)
procedente del LTR (repetición terminal larga) del
VIH-2, según describieron Respess et al.
(1994) en Interscience Conference on Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 94:110. Las amplificaciones mediante la PCR se
realizaron con 0, 10 y 50 copias de la diana del LTR del
VIH-2. En condiciones de PCR normal, la
identificación de la banda de diana correcta estuvo comprometida
por la presencia de un cierto número de bandas no específicas
(Figura 10A, carriles 1-3). La amplificación
realizada en condiciones "de arranque en caliente" eliminó las
bandas no específicas (Figura 10A, carriles 4-6).
Los resultados de la amplificación realizada en presencia de una
secuencia de ADNss de 78-nucleótidos no específica,
que contenía secuencias fijas 5' y 3' idénticas que el TQ21 y TQ30
(Figura 10B, carriles 1-3) fueron similares a los
obtenidos mediante la PCR sin usar condicione "de arranque en
caliente". Sin embargo, la adición tanto del TQ21 (Figura 10B,
carriles 4-6) como del TQ30 (Figura 10B, carriles
7-9) llevada a cabo en condiciones estándares (sin
"arranque en caliente") eliminó las bandas no específicas sin
afectar al rendimiento de la banda específica de la diana. Fue de
particular importancia la observación de que cuando el número de
copia de la diana era bajo, la detección de la señal era muy
eficiente (Figura 10B, comparar el carril con los carriles 5 y 8).
El efecto de los inhibidores de oligonucleótidos fue similar cuando
se usó la polimerasa Tth en lugar de la polimerasa Taq (no se
muestran los datos) para detectar un número bajo de copias del LTR
del VIH-2. El rendimiento potenciado de la banda
específica de la diana obtenidos con los inhibidores de
oligonucleótidos en la PCR incrementa la sensibilidad de la
reacción, facilitando la detección de la diana presente con
aproximadamente sólo 3 copias (Figura
10C).
10C).
Los inhibidores de oligonucleótidos usados en el
experimento descrito en la Figura 10 no tenían protegidos sus
extremos 3', permitiendo potencialmente que iniciaran la
amplificación de forma no específica, y complicando aún más el
resultado de la PCR. Sin embargo, no se detectaron bandas
adventicias, lo que sugiere que en este sistema, el recubrimiento
3' de los inhibidores de oligonucleótidos no era necesario para
eliminar la generación de bandas no específicas.
Típicamente, no todos los nucleótidos en una
secuencia de longitud completa son necesarios para su función. Por
tanto, es deseable la identificación de secuencias de ADN truncadas
que retienen la función de la secuencia completa. Para los
experimentos de truncación se escogieron los ligandos TQ30 (SEC. Nº
ID.: 50) de la Familia I y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59) de la Familia II
(consultar Tabla 4). Las selecciones por afinidad de fragmentos
anillados con extremo etiquetado generados a partir de las
secuencias de longitud completa de ambos ligandos, seguidas por el
análisis en gel de secuenciación, según se describe en el Ejemplo 2,
no proporcionó límites identificables. Por tanto, los dos ligandos
se sometieron a análisis de supresión. Las formas suprimidas
secuencialmente se ensayaron en función de su capacidad para inhibir
las polimerasas en el ensayo de extensión de la horquilla, para
identificar truncaciones
funcionales.
funcionales.
La región variable de 30 nucleótidos del TQ30,
que contenía el motivo de secuencia conservado con la estructura de
tallo-bucle predicha (Trnc.A-30
(SEC. Nº ID.: 74); Tabla 5) inhibe la polimerasa Taq a 25ºC con el
mismo alcance que la secuencia de longitud completa (no se muestran
los datos). No obstante, a temperaturas más elevadas la eficacia de
la inhibición es menor que la de la secuencia de longitud completa.
A 30ºC, por ejemplo, la inhibición de la polimerasa Taq por el
Trnc.A-30 (250 nM) es aproximadamente del 82%,
mientras que la secuencia de longitud completa inhibió totalmente
el enzima a esta temperatura y concentración. La sensibilidad
térmica incrementada del Trnc.A-30 puede deberse a
la presencia de un hélice interrumpida con pares de bases
A-T, una hélice propensa a fundirse a una
temperatura baja.
En consecuencia, se diseñaron tres variantes de
tallo-bucle del Trnc.A-30, las
cuales contenían tallos no interrumpidos con elevada proporción de
pares de bases G-C. En estas variantes, el motivo de
secuencia conservado identificado en la Familia I estaba inalterado
(Tabla 5), pero los tallos tenían varias longitudes. A una
concentración de inhibidor de 250 nM, el Trnc.1-30
(SEC. Nº ID.: 67) y el Trnc.2-30 (SEC. Nº ID.: 68)
inhibieron aproximadamente el 95% de la actividad de la polimerasa
Taq, mientras que el Trnc.3-30 (SEC. Nº ID.: 69)
inhibió sólo aproximadamente el 60% de la actividad polimerasa (ver
más abajo). El Trnc.3-30 que contenía el tallo más
corto (7 pares de bases) de las tres variantes era un inhibidor
pobre para la polimerasa Taq, indicando que se requieren contactos
adicionales en el tallo para una interacción productiva. Para
determinar si la inhibición disminuida observada con el
Trnc.3-30 se debe a su afinidad reducida por la
unión a la polimerasa, se calcularon las afinidades de las tres
variantes por su unión a la polimerasa Taq. Los valores de K_{d}
se hallan en el rango 2-3 nM (Tabla 5), indicando
que las tres variantes tenían afinidades similares. Por tanto, la
ausencia de inhibición causada por el Trnc.3-30 no
se debe a la ausencia de unión, sino presumiblemente a su
incapacidad para bloquear el sitio activo. Las afinidades de las
tres variantes por la unión a la polimerasa Taq son aproximadamente
75 veces inferiores a las de la molécula de longitud completa (la
K_{d} de la secuencia de longitud completa es 40 pM), y
aproximadamente 3-5-veces inferior a
la del Trnc.A-30. Los valores de IC_{50} de las
tres construcciones disminuyeron con la disminución en la longitud
del tallo; 25, 50 y 186 nM respectivamente para el
Trnc.1-30, Trnc.2-30 y
Trnc.3-30. Este resultado está de acuerdo con la
noción de que los ligandos con tallos más largos son inhibidores
más efectivos. El valor de IC_{50} de la secuencia de longitud
completa es 22 nM. Los ensayos de extensión de horquilla se
realizaron a 30ºC durante 1
hora.
hora.
Aunque el TQ30 de longitud completa inhibe la
polimerasa Tth, ni el Trnc.1-30 ni el
Trnc.2-30 inhiben la polimerasa Tth, a pesar del
hecho de que el enzima es completamente inhibido por el ligando de
longitud completa.
El fragmento Stoffel (61 kD) es una forma
truncada de la polimerasa Taq que carece de actividad exonucleasa
5'-3' y es similar a la ADN polimerasa KlenTaq de 67
kD (67 kD). La actividad polimerasa del fragmento Stoffel fue
inhibida completamente por el TQ30 de longitud completa, así como
por los tres formas truncadas. Los valores IC_{50} de las tres
formas truncados son, Trnc. 1-30 = 2,7 nM,
Trnc.2-30 = 5,9 nM y Trnc.3-30 =
10,3 nM (Figura 12). En conjunto, las tres formas truncadas del
TQ30 son más efectivas inhibiendo el fragmento Stoffel que la
polimerasa Taq (comparar la Figura 11 con la Figura 12). Los valores
de IC_{50} de estas formas truncadas para la inhibición del
fragmento Stoffer son un orden de magnitud mejores que los de la
polimerasa Taq. El valor de IT_{50} para la inhibición del
fragmento Stoffer por parte del Trnc.2-30 fue 38ºC
(no se muestran los datos). Sorprendentemente, la secuencia TQ21,
que inhibe tanto la polimerasa Taq como la Tth, no inhibe el
fragmento Stoffel. Esto sugiere que el sitio de unión del TQ21 sobre
el fragmento Stoffel está, bien parcialmente o completamente
suprimido, o ha sido reorganizado a partir de la truncación de la
proteína.
A diferencia de los ligandos de la Familia I,
tales como el TQ30, la región variable de
30-nucleótidos del ligando de la Familia II, TQ21,
no inhibe ni la polimerasa Taq ni la Tth (no se muestran los datos),
indicando que los nucleótidos adicionales de las regiones fijas son
necesarios para la inhibición. El análisis de supresión de la
secuencia TQ21 de longitud completa condujo a la identificación de
una secuencia de 51-meros (Trnc.21 (SEC. Nº ID.:
70) (Tabla 4)) que retuvo la capacidad de inhibir tanto la
polimerasa Taq como la Tth. Además de la región aleatoria de
30-nucleótidos completa, la secuencia del Trnc.21
contenía 9 y 12 nucleótidos a partir respectivamente de las
regiones fijas 5' y 3' (Tabla 4). En contraste con las formas
truncadas del TQ30, las cuales mostraban una afinidad disminuida
por la polimerasa Taq, el Trnc.21 mostró una afinidad incrementada;
la K_{d} del Trnc.21 por la unión a la polimerasa Taq es de 9 pM
(Figura 13A), una afinidad aproximadamente 4 veces mayor que la de
la secuencia de longitud completa. El valor de IC_{50} del Trnc.21
para la inhibición de la polimerasa Taq es de 21 nM (Figura 13B),
aproximadamente 3 veces inferior al valor para la secuencia de
longitud completa. Los valores de IT_{50} calculados para la
polimerasa Taq y la polimerasa Tth son respectivamente 34ºC y
35,6ºC (Figura 13C). Los ensayos de extensión de la horquilla se
realizaron entre las temperaturas de 35 y 50ºC durante 1 hora con
Trnc.21 250 mM. Por tanto, en base a la afinidad y a los valores de
IC_{50} e IT_{50}, la forma truncada del TQ21 es un inhibidor
mejora que la secuencia de longitud completa. De forma similar a la
secuencia de longitud completa, el Trnc.21 no inhibió la actividad
del fragmento
Stoffel.
Stoffel.
La multimerización de ligandos incrementa la
concentración local efectiva, resultando en un mayor tiempo de
residencia con la diana (avidez). En base a su moderada afinida por
la polimerasa Taq, se seleccionó el Trnc.2-30 para
la síntesis de un homodímero (Tabla 4). El homodímero
(D.30-D.30) (SEC. Nº ID.: 71) (Tabla 4) de
Trnc.2-30 se sintetizó en una orientación
cola-con-cola (unido en los extremos
3') usando el dímeros simétrico CPG como soporte en una síntesis
química en fase sólida usando procedimientos estándares.
La afinidad del dímero D.30-D.30
por la unión a la polimerasa Taq es de 40 pM (Figura 14A),
aproximadamente 75-veces superior a su forma
monomérica. El valor de IC_{50} del homodímeros es de 14 nM,
aproximadamente 3,5 veces inferior al de la forma monomérica
(Figura 14B). Por tanto, la dimerización del TQ30 truncado produjo
una inhibidor más efectivo de la polimerasa Taq.
También se prepararon dos secuencias
heterodiméricas en las que dos formas monoméricas truncadas, el
Trnc.2-30 y el Trnc-21 (Tabla 4), se
unieron mediante un engarce que contenía 3 timinas. En
D.21-D.30 (SEC. Nº ID.: 72) la secuencia
Trnc-21 se colocó en el extremo 5' de la molécula,
mientras que en D.30-D.21 (SEC. Nº ID.: 73) ocupa
el extremo 3' de la molécula. A diferencia del TQ30 de longitud
completa, sus formas truncadas no inhiben la polimerasa Tth. El
Trnc-2, por otra parte, inhibió ambas polimerasas
Taq y Tth, pero no el fragmento Stoffel. Asumiendo que las unidades
monoméricas son capaces de funcionar independientemente, después de
ser atadas en una única secuencia, la combinación de los dos
ligandos truncados proporcionará una única secuencia que puede
inhibir las tres polimerasas. A la concentración de inhibidor más
baja (62,5 nM) el efecto inhibidor de los dos heterodímeros sobre
la polimerasa Taq es mayor que el de los dos monómeros. El efecto de
los heterodímeros sobre la polimerasa Tth es idéntico al del
monómero Trnc-21. El fragmento Stoffer no pudo
extender completamente la plantilla en horquilla en presencia de
los dos heterodímeros. En contraste, los productos parcialmente
extendidos fueron menos abundantes en presencia de la secuencia
Trnc.2-30 monomérica. La ausencia de la extensión
completa de la plantilla en horquilla sugiere que los heterodímeros
no suprimen la actividad del fragmento Stoffel.
El heterodímero D.21-D.30 tiene
un valor de IC_{50} de aproximadamente 30 nM para la inhibición de
las polimerasas Taq y Tth (Figura 15A). Los valores de IT_{50}
para la inhibición de las polimerasas Taq y Tth son respectivamente
41ºC y 34,5ºC (Figura 15B). El D.21-D.30 inhibe el
fragmento Stoffel con un valor de IC_{50} de 15,5 nM y un valor
de IT_{50} de 38ºC (no se muestran los datos). La K_{d} del
heterodímero D.21-D.30 ligando para la polimerasa
Taq es similar al del Trnc-21 (10 pM), lo que
sugiere que la proteína preferentemente se une al motivo de
secuencia con una elevada afinidad de unión.
La ubicación de las dos unidades monoméricas en
el dímero parece no tener un efecto global sobre la inhibición de
ninguna de las tres polimerasas. Las dos unidades monoméricas
diferentes no muestran un efecto perjudicial cuando se combinan en
un dímero. Como se esperaba, los heterodímeros mostraron la
capacidad de inhibir las tres polimerasas de forma bastante
efectiva, indicando que, en general, las funciones de las unidades
monoméricas en los heterodímeros son mutuamente excluyentes.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
explicar e ilustrar la presente invención y no se pretende que sean
limitantes de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La polimerasa Taq recombinante (rTaq; Mr 94 kDa)
suspendida en un tampón consistente en KCl 100 mM,
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), EDTA 0,1 mM, 50% de
glicerol (v/v) y 0,2% de Tween 20, y la polimerasa Tth recombinante
(rTth Mr 94 kDa) suspendida en un tampón consistente en
Bicine-KOH 50 mM (pH 8,3), KCl 90 mM y 50% de
glicerol (v/v) se compraron a Roche Molecular Systems, Inc.
(Alameda, CA). Las ADN polimerasas Taq, Tth y UlTma se obtuvieron
de Perkin Elmer. La polimerasa Ultma es una forma suprimida de la
polimerasa Tma que carece de la actividad exonucleasa
5'-3' del tipo salvaje. Las ADN polimerasas Tli y
Tfl se compraron a Promega. La polimerasa Tbr (Thermalase Tbr) se
obtuvo de Amresco Inc. Los fosforamiditos CPG de engarce
3'-3' con ramificación simétrica y
C-6 Thiolmodifier se obtuvieron de Clontech (Palo
Alto, CA). La cuentas de yodoacetilo ULTRALINK^{TM} se compraron
a Pierce Chemicals (Rockford, IL). Los enzimas usados en el marcado
radiactivo del ADN se obtuvieron de Boehringer Mannheim
(Indianapolis, IN). Todos los otros reactivos y compuestos químicos
eran de grado analítico y se compraron a fuentes comerciales
estándares.
Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante la
química de cianoetil-fosforamidito en fase sólida
estándar, y se purificaron mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida desnaturalizante para homogeneizarlos en tamaño
antes de usarlos. El homodímero simétrico se sintetizó con CPG de
engarce 3'-3' de ramificación simétrica. La
concentración de ADN se basó en 33 \mug/mL = 1 unidad de
A_{260}.
Veinticinco nanomoles del ligando TQ21 (SEC. Nº
ID.: 59) o TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) (Tabla 3) que contenían un grupo
tiol en el extremo 5' se desprotegieron con AgNO_{3} y
ditiotreitol (DTT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El exceso de DTT se eliminó mediante cuatro extracciones
secuenciales con volúmenes iguales de acetato de etilo. El ligando
desprotegido se mezcló a continuación con 500 \muL de cuentas de
yodoacetilo ULTRALIN^{TM} que se habían lavado dos veces en un
tampón consistente en Tris-HCl 50 mM (pH 8,3) y EDTA
5 mM. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente
durante 2 horas sobre una plataforma rotatoria. Los sitios sin
reaccionar sobre las cuentas de yodoacetilo se recubrieron haciendo
reaccionar la mezcla con 50 \mul de una solución de cisteína 0,5
M en el mismo tampón durante 15 minutos. Las cuentas de control se
prepararon haciendo reaccionar 500 \muL de cuentas de yodoacetilo
con 500 \mul de cisteína 0,5 M. Después de la reacción, las
cuentas se lavaron cinco veces con 500 \muL de un tampón de PCR
consistente en heparina 75 \muM, MgCl_{2} 12,5 mM, KCl 50 mM y
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3).
El procedimiento SELEX se ha descrito con
detalle en la patente estadounidense nº 5.270.163. Los experimentos
SELEX con ambas polimerasas se realizaron usando la plantilla y los
cebadores mostrados en la Tabla 1. La selección con la polimerasa
Taq se llevó a cabo a temperatura ambiente en un tampón consistente
en Tris-HCl 10 mM (pH 8,3; a 22ºC), KCl 50 mM y
MgCl_{2} 2,5 mM (tampón unidor para Taq). La selección con la
polimerasa Tth se llevó a cabo en un tampón que contenía
Bicina-KOH 50 mM (pH 8,3; a 25ºC), KCl 90 mM y
Mn(OAc)_{2} 3,5 mM (tampón unidor para Tth).
Cada experimento SELEX se inició con 5 nnmoles
de ADN de hebra simple (ADNss) sintético, purificado en gel, del
grupo de secuencia aleatoria, consistente en una región aleatoria de
30 nucleótidos, flanqueada por regiones 5' y 3' de estructura fija
(Tabla 1). En una ronda de selección típica, el ADNss suspendido en
el tampón de unión apropiado se calentó a 90ºC durante 3 minutos, se
enfrió sobre hielo, y a continuación se llevó a temperatura
ambiente. Una vez equilibrado a temperatura ambiente, el ADN se
incubó durante 15 minutos con la polimerasa diana apropiada, en
presencia de 2 nnmoles de ARNt como un competidor y albúmina de
suero bovino al 0,01% (hSA). Los complejos de
polimerasa-ADN se separaron del ADN no nido mediante
filtración en nitrocelulosa a través de un filtro de nitrocelulosa
prehumedecido (0,45 \muM, Millipore) bajo succión. El filtro se
lavó inmediatamente con 20 mL del tampón de unión, 20 mL de urea 0,5
M en el tampón unidor, y urea 0,5 M en agua. El ADN retenido en el
filtro se eluyó y aisló mediante precipitación con etanol en
presencia de ARNt portador (5 \mug).
El ADN aislado se amplificó mediante la PCR con
el Equipo Cebador I (Tabla 1). Una de las hebras cebadoras contenía
tres biotinas contiguas en el extremo 5'. La hebra no biotinilada
del ADN dúplex resultante se aisló mediante electroforesis en gel
en condiciones desnaturalizantes (Pagratis et al., en
preparación) y se usó en la siguiente ronda de selección. En las
rondas subsiguientes, antes de incubarlos con la polimerasa diana,
los grupos de ADN se pasaron a través de filtros de nitrocelulosa
(contraselección) para eliminar secuencias de ADN que se unieran al
filtro de nitrocelulosa. El número de picomoles de polimerasa diana
se disminuyó gradualmente durante el curso de la SELEX para
incrementar la presión selectiva en busca de secuencias con elevada
afinidad de unión. La cantidad de ADN en cada selección se mantuvo
al menos cinco veces superior a la cantidad de proteína para
garantizar la competición en busca de secuencias de ADN con elevada
afinidad de unión.
El progreso de la SELEX se monitorizó mediante
análisis de unión al filtro de nitrocelulosa de los grupos
enriquecidos. Los grupos enriquecidos que mostraban la afinidad de
unión más elevada se amplificaron mediante PCR con el Equipo de
Cebadores II para incorporar sitios de restricción BamHI y EcoRI en
los extremos del ADN dúplex resultante. Este ADN se purificó en gel
y se digirió con BamHI y EcoRI, y se clonó en el vector plasmídico
pUC18 previamente digerido con los mismos enzimas usando técnicas
estándares. (Sambrook et al. (1989), en "Molecular
Cloning: A laboratory Manual", 2ª ed., Parte 3, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los clones se
aislaron y secuenciaron mediante la técnica de secuenciación dideoxi
estándar (equipo Sequenase de U.S. Biochemical, Cleveland, OH).
Para aislar las moléculas de ADN que se unen con
fuerza respectivamente a la polimerasa Taq y a la polimerasa Tth,
se usó el procedimiento de reparto del filtro de nitrocelulosa tal y
como se utiliza en la solicitud de patente de la SELEX. De forma
resumida, los grupos de ^{32}P-ADNss purificados
en gel se suspendieron en el tampón de unión, se calentaron hasta
80ºC, se enfriaron sobre hielo, y a continuación se llevaron a
temperatura ambiente. El AND (5-10 pM) se incubó a
continuación durante 15 minutos a temperatura ambiente, con
distintas cantidades de la polimerasa diana, en 50 \muL del tampón
de unión apropiado, el cual contenía 0,1 \mug de ARNt y un 0,01%
de hSA. La concentración de ADN se mantuvo más baja que 100 pM para
garantizar el equilibrio en presencia de concentraciones de
proteína en exceso. Transcurridos 15 minutos las mezclas de
reacción se pasaron a través de filtros de matriz mixta
nitrocelulosa/acetato de celulosa previamente humedecidos (0,45 mm
de tamaño de poro, Millipore Corporation, Bedford, MA) y los filtros
se lavaron inmediatamente con 5 mL de tampón de unión. La cantidad
de ADN unida a los filtros se cuantificó midiendo la radiactividad
de los filtros mediante recuento de centelleo en líquido. La
cantidad de ADN unido a los filtros en ausencia de proteína se usó
para la corrección de fondo. El porcentaje de ADN de entrada
retenido sobre cada filtro se representó frente al log de la
correspondiente concentración de polimerasa (Figuras 1 y 2). Para
obtener las constantes de disociación (K_{d}) de los ligandos de
AND respectivamente para las polimerasas Taq y Tth se usó el
procedimiento no lineal de los mínimos cuadrados. (Schneider et
al. (1995) Biochemistry 34:9599; 40 Jellinek et al.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 90:11227-
11231).
11231).
El grupo de secuencia aleatoria no seleccionada
se une a la polimerasa Tth con una K_{d} estimada de
aproximadamente 70 nM (Figura 1B, (\bullet)), mientras que la
K_{d} de la unión de este grupo a la polimerasa Taq es
aproximadamente de 50-100 nM (Figura 1A, (o)).
Después de 12 rondas de selección, la K_{d} de unión a la
polimerasa Taq fue de 3,5 nM (Figura 1A, (o)). Rondas adicionales de
selección no resultaron en una mejora adicional de la afinidad. Por
tanto, la afinidad resultante del grupo enriquecido por la
polimerasa Taq se mejoró significativamente en comparación con el
grupo aleatorio no seleccionado. Se obtuvieron resultados similares
con la polimerasa Tth, en donde el grupo procedente de la 10ª ronda
mostró una K_{d} de 5 nM (Figura 1B, (o)).
El grupo del ADNss seleccionado para la
polimerasa Taq mostró una unión muy estrecha a la polimerasa Tth
con una K_{d} de 0,2 nM (Figura 2A, (o)). Este resultado no es
sorprendente, puesto que la identidad de secuencia de aminoácidos
entre las dos polimerasas es aproximadamente del 87% (Asakura et
al. (1993) J. Ferment. Bioeng. 76:265-269). El
grupo seleccionado para la unión a la polimerasa Tth unió la
polimerasa Taq de manera diferente, con la saturación de la unión
alrededor del nivel del 50% (Figura 2B, (o)), sugiriendo que
aproximadamente la mitad de las secuencias en el grupo no están
interaccionando con la polimerasa Taq. En base al 50% de
saturación, la K_{d} estimada es de 0,3 nM.
En la Tabla 2 se detallan las secuencias de
ADNss obtenidas de 10 rondas de selección realizadas con la
polimerasa Tth. Se secuenciaron veintinueve clones individuales
procedentes de la selección con polimerasa Tth (sólo la región
variable de 30-nucleótidos se muestra en la Tabla
2). Las secuencias se agruparon en dos familias en base a la
similitud de secuencia. Las secuencias de ADNss obtenidas de 12
rondas de selección realizadas con la polimerasa Taq se detallan en
la Tabla 3. Se aislaron treinta y tres secuencias únicas. Las
letras minúsculas en algunas de las secuencias indican la secuencia
5' fija y las letras mayúsculas ilustran la región aleatoria de 30
nucleótidos. Las secuencias se agruparon en tres familias en base a
la similitud de secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los ensayos de inhibición de polimerasa se
realizaron usando el ADN plantilla (DNA-HP;
5'-ATGCCTAAGT TTCGAACGCG GCTAGCCAGC TTTTGCTGGC
TAGCCGCGT-3' (SEC. Nº ID.: 6)), marcada en el
extremo 5' con la quinasa de polinucleótidos del T4 y
^{32}P-\gamma-ATP, y se
purificaron mediante electroforesis en gel en condiciones
desnaturalizantes (Figura 4). En un procedimiento experimental
representativo, 0,25 pmoles de polimerasa Taq (5 U) o 0,125 pmoles
(2,5 U) de polimerasa Tth se mezclaron con 5 pmoles (250 nM) del
grupo enriquecido, del grupo aleatorio, o con un ligando de ADN
específico, en el tampón estándar de la PCR (20 \muL). Se
añadieron cinco pmoles (250 nM) de DNA-HP plantilla
marcado, y la mezcla se incubó a diferentes temperaturas durante un
determinado período de tiempo. La reacción se detuvo añadiendo EDTA
hasta una concentración final de 125 mM (5 \muL de EDTA 0,5 M).
El ADN se resolvió sobre un gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes. Los geles se visualizaron mediante
autorradiografía, y el porcentaje de ADN unido se cuantificó
mediante PhosphoImager. Las variaciones en este procedimiento
general para reacción específicas se mencionan en
memoria.
memoria.
El orden en el que se añaden los inhibidores de
oligonucleótidos a la mezcla de reacción es irrelevante con tal que
la plantilla se añada en último lugar. Los oligonucleótidos
requieren iones Mg^{++}, un componente esencial de la PCR, para
funcionar, y parecen tolerar muchos sistemas de tampón.
La Figura 5 ilustra los resultados de los
ensayos de actividad polimerasa usando los grupos de ADN
enriquecidos. Las Figuras 6-9 ilustran los
resultados de los ensayos de actividad polimerasa usando los
ligandos TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) y TQ21 (SEC. Nº ID.: 59).
Los valores de IC_{50} (la concentración de
inhibidor necesaria para producir el 50% del producto en el ensayo)
se obtuvieron usando el ensayo de extensión de la horquilla. En un
ensayo de inhibición típica, una reacción de 20 \muL contenía
0,25 pmoles de polimerasa Taq (5 U) ó 0,125 pmoles de polimerasa Tth
(2,5 U), el inhibidor de oligonucleótidos (a diferentes
concentraciones), Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50
mM, MgCl_{2} 2,5 mM, y 1 mM de cada dNTP. El sustrato de ADN en
horquilla con el extremo 5' marcado (DNA-HP;
5'-ATGCCTAAGT TTCGAACGCG GCT AGCCAGC TTTTGCTGGC
TAGCCGCGT-3') se añadió a continuación hasta una
concentración final de 250 nM, y la reacción se incubó a 30ºC
durante 1 hora. La reacción se detuvo añadiendo 5 \muL de EDTA 0,5
M (pH 8.0) seguidos por tampón de carga en gel de formamida. Los
productos de la extensión se resolvieron sobre geles de
poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes. La cantidad
de productos de extensión se cuantificó mediante PhosphoImager. Las
cantidades de productos formados en presencia de inhibidor se
normalizó respecto el producto formado en ausencia de un inhibidor
para obtener el porcentaje de producto.
Las reacciones de extensión de la horquilla
fueron las mismas que las descritas arriba, excepto que la
concentración de inhibidor era 250 nM. El tiempo de incubación a
cada temperatura era de 1 hora. La cantidad de producto se
cuantificó mediante PhosphorImager, y se normalizó respecto el
producto formado en ausencia de un inhibidor a la misma temperatura
para obtener el porcentaje de producto.
En un procedimiento experimental representativo,
se incubó ligando TQ30 (SEC. Nº ID.: 50), TQ21 ó TQ21 (recubierto
en 3' con un engarce de etilenglicol) (aproximadamente 3 pmoles)
marcado en el extremo 5', en 20 \muL del tampón de unión y 1 mM
de cada dNTP, en ausencia y presencia de 5 U de polimerasa Taq o 2,5
U de polimerasa Tth, durante 16 horas a temperatura ambiente. El
recubrimiento del extremo 30' del TQ21 se realizó con un engarce de
etilenglicol ("3'-Spacer C3" de Glen Research)
usando condiciones estándares conocidas en el estado de la
técnica.
técnica.
Las reacciones de captura por afinidad se
realizaron a 70ºC durante 5 minutos en un volumen de reacción de
100 mL que contenía: heparina 75 \muM, MgCl_{2} 12,5 mM, 1 mM de
cada dNTP, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), 5 U
de polimerasa Taq ó 2,5 U de polimerasa Tth, y plantilla de ensayo
en horquilla con el extremo 5' marcado (DNA-HP) 250
nM. Transcurridos 5 minutos la mezcla de reacción se diluyó tres
veces y se enfrió a 4ºC. Después de 1 ronda de síntesis, se
añadieron 15 \muL de cuentas (bien cuentas de afinidad o cuentas
control, preparadas tal y como se describió más arriba) a la mezcla
de reacción a 4ºC y se mezclaron con delicadeza durante 10 minutos.
Los sobrenadantes que contenían la plantilla marcada se retiraron
después de la centrifugación y se guardaron para su análisis en
gel. Las cuentas se lavaron cinco veces con 100 \muL de un tampón
consistente en heparina 75 \muM, MgCl_{2} 12,5 mM, KCl 50 mM y
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3). Después de 2 rondas de
síntesis, las cuentas lavadas se mezclaron con una alícuota
reciente de la mezcla de reacción que contenía la totalidad de los
reactivos excepto la polimerasa. Después de incubarla a 70ºC durante
5 minutos, la mezcla de reacción se recuperó y analizó mediante
electroforesis en
gel.
gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los ensayos de inhibición de exonucleasas se
realizaron usando la plantilla diseñada,
5'-TTCGAGCGTG AATCT
GAATT CGCGGCTAGC CAGCTTTTGC TGGCTAGCCG CGGTGGGAAA CTGAGGTAGG TGTTTTCACC TAC
CTCAG TTTCCCACC-3' (Exo-sub) (SEC. Nº ID.: 75), marcada en el extremo 5' (usando [\gamma^{32}P]-ATP y la quinasa de polinucleótido de T4) y en el extremo 3' usando ([\alpha^{32}P]-ddATP y desoxiterminal transferasa). En un procedimiento experimental representativo, 5 U de la polimerasa Taq ó 2,5 U de la polimerasa Tth se mezclaron con 250 nM de ligando TQ30 o ligando TQ21 en el tampón de PCR estándar (20 \muL), seguidos por la adición del Exo-Sub doblemente marcados (250 nM, añadido en último lugar). Después de incubarlas durante 16 horas a temperatura ambiente, las reacciones se apagaron mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 0,1 mM. Los productos del corte se resolvieron sobre geles de poliacrilamida al 8% en condiciones desnaturalizantes.
GAATT CGCGGCTAGC CAGCTTTTGC TGGCTAGCCG CGGTGGGAAA CTGAGGTAGG TGTTTTCACC TAC
CTCAG TTTCCCACC-3' (Exo-sub) (SEC. Nº ID.: 75), marcada en el extremo 5' (usando [\gamma^{32}P]-ATP y la quinasa de polinucleótido de T4) y en el extremo 3' usando ([\alpha^{32}P]-ddATP y desoxiterminal transferasa). En un procedimiento experimental representativo, 5 U de la polimerasa Taq ó 2,5 U de la polimerasa Tth se mezclaron con 250 nM de ligando TQ30 o ligando TQ21 en el tampón de PCR estándar (20 \muL), seguidos por la adición del Exo-Sub doblemente marcados (250 nM, añadido en último lugar). Después de incubarlas durante 16 horas a temperatura ambiente, las reacciones se apagaron mediante la adición de EDTA hasta una concentración final de 0,1 mM. Los productos del corte se resolvieron sobre geles de poliacrilamida al 8% en condiciones desnaturalizantes.
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Ejemplo
4
La inhibición mediante el TQ21 (SEC. Nº ID.: 50)
y el TQ30 (SEC. Nº ID.: 50) se ensayó con (A) polimerasas de ADN
termofílicas, (B) ADNP mesofílicas (polimerasa Taq como control), y
transcriptasas inversas, y (C) RT. Todas las reacciones se llevaron
a cabo en un volumen de 20 \muL con la plantilla en horquilla HP
(Ejemplo 2) en presencia de 1 mM de cada dNTP, usando 250 ó 500 nM
de ligando TQ21 o TQ30. Las condiciones de reacción específicas
para cada polimerasa fueron como sigue:
- Polimerasas termostables: polimerasa Tma: polimerasa UlTma (6 U), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, 10 mM KCl, MgCl_{2} 2,5 mM y 0,002% Tween 20 (v/v); polimerasa Tbr (2 U), Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y 0,01% de Triton X-100; polimerasa Tli (3 U) y polimerasa Tfl (5 U), Tris-HCl 10 mM; pH 9,0, KCl 50 mM y 0,1% de Triton X-100.
- Polimerasas mesofílicas: Todas las incubaciones incluyendo la polimerasa Taq (5 U) (un control interno para el tampón) se realizaron en un tampón consistente en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, KCl 40 mM, MgCl_{2} 5 mM, y DTT 7,5 mM (fragmento Klenow (5 U); ADN polimerasa de T4 (4 U); ADN polimerasa de T7 (7 U).
- Transcriptasas inversas. Todas las incubaciones se realizaron en un tampón consistente en Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, NaCl 60 mM, Mg(OAc)_{2} 6 mM, y DTT 10 mM. (RT de VIH-1 (0,56 pmoles); RT de VMA (1 U); RT de VML-M (10 U); Superscript II (Ssript II) (10 U).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Las amplificaciones con PCR se realizaron usando
un sistema que amplifica un producto de 203-p.b.
específico para la diana, procedente de la LTR 2 del
VIH-35, según describieron Respess et al.
(1994) en Interscience Conference on Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 94:110). Todas las amplificaciones con PCR se llevaron
a cabo en presencia de 1,3 \mug de ADN placentario humano, 0,4 mM
de cada dNTP, 25 pmoles de cada cebador, Tris-HCl
10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 2,5 mM, 10% de glicerol, 5 U de
polimerasa Taq y la plantilla (el número aproximado de copias se
indica en las Figuras 10A-10C) en 100 \muL de
volumen de reacción. El termociclado se realizó a 50ºC durante 2
minutos, seguido por 94ºC durante 30 segundos; 60ºC durante 30
segundos; 72ºC durante 30 segundos, y a continuación una
hibridación autoextendida a 60ºC en incrementos de 1ºC durante 5
ciclos. Esto siguió una amplificación de 35 ciclos a 90ºC durante 30
segundos; 65ºC durante 30 segundos; 72ºC durante 30 segundos.
La PCR "de arranque en caliente" se realizó
usando cuentas "AmpliWax" (de Perkin Elmer) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Todas las otras amplificaciones con
PCR se realizaron sin condiciones "de arranque en
caliente".
La PCR "NeXstart" se realizó usando los
ligandos TQ30 y TQ21 (concentración final 50 nM) como inhibidores.
Una amplificación se realizó en presencia de un oligonucleótido no
específico (concentración final 50 nM) con propósito de
comparación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{1} \begin{minipage}[t]{138mm} La región recuadrada indica
el elemento de secuencia conservada con la estructura de
tallo-bucle predicha identificada en las secuencias
de la Familia I; las líneas verticales significan emparejamientos de
bases del tipo Watson-Crick; los círculos muestran
un emparejamiento de bases G-T poco habitual.
\end{minipage} \cr \cr ^{2} \begin{minipage}[t]{138mm}
Los valores de K _{d} se midieron mediante la técnica de unión a
filtro de nitrocelulosa descrita en el Ejemplo I.
\end{minipage} \cr \cr ^{3} \begin{minipage}[t]{138mm}
Las transiciones por fusión (Tm) se midieron en un tampón de PCR que
contenía Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl _{2} 2
mM, pH 8,3, con una rampa de temperatura de 1ºC/min.
\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: LARRY GOLD SUMEDHA JAYASENA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: LIGANDOS DE ÁCIDO NUCLEICO INHIBIDORES PARA ADN {}\hskip4,8cm POLIMERASAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 77
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOLICITANTE: Swanson and Bratschun, L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 8400 East Prentice Ave.,Suite 200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Denver
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 80111
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,44 MB de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WordPerfect 6.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/______
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/487.426
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 7-JUNE-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/487,720
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 7-JUNE-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/484,557
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 7-JUNE-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Barry J. Swanson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33,215
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: NEX43C/PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (303) 793-3333
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (303) 793-3433
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N en las posiciones 1, 2, y 3 es biotina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 74 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 74 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION PARA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LENGTH: 79 base pairs
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 51 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIÓN: N en la posición 28 es un fosforamidito con orientación invertida {}\hskip3,9cm (enlace 3'-3')
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. Nº ID.: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LAS SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,3cm
Claims (32)
1. Procedimiento mejorado para realizar la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en donde dicha mejora
comprende el paso de añadir a la ADN polimerasa termoestable un
ligando de ácido nucleico que se une a e inhibe dicha polimerasa a
temperaturas ambientes, aunque permite que la polimerasa esté
activada en los ciclos de temperatura elevada de la PCR.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en donde el procedimiento para realizar la PCR comprende:
- a)
- mezclar una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico que ha de amplificarse con cebadores que son complementarios de las secuencias que flanquean la secuencia a amplificar, una ADN polimerasa termoestable, y un ligando de ácido nucleico que es capaz de inhibir la polimerasa a temperaturas ambiente, aunque permite que la polimerasa esté activada en los ciclos de temperatura elevada de la PCR; y
- b)
- realizar los pasos de la PCR de fundir el ácido nucleico diana, hibridar los cebadores con el ácido nucleico diana, y sintetizar el ácido nucleico diana, mediante la iteración cíclica térmica de la mezcla.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en donde el ligando de ácido nucleico es ADN.
4. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho ligando de ácido nucleico es
de hebra simple.
5. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha polimerasa es una
transcriptasa inversa.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha polimerasa se deriva de
especies del género Thermus.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha polimerasa termoestable es
la polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) o la polimerasa de
Thermus thermophilus (Tth).
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho ligando de ácido nucleico se
selecciona del grupo consistente en las secuencias detalladas en la
Tabla 2 (SEC. Nº ID.: 7-35), Tabla 3 (SEC. Nº ID.:
36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC. Nº ID.:
67-73) o Tabla 5 (SEC. Nº ID.: 74), a las
correspondientes secuencias complementarias de las mismas.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho ligando de ácido nucleico
tiene un grado de homología de secuencia primaria muy superior al
70% respecto, y tiene sustancialmente la misma capacidad de unir la
polimerasa Taq o Tth que, un ligando seleccionado del grupo
consistente en las secuencias detalladas en la Tabla 2 (SEC. Nº
ID.: 7-35), Tabla 3 (SEC. Nº ID.:
36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC. Nº ID.:
67-73) o Tabla 5 (SEC. Nº ID.: 74), a las
correspondientes secuencias complementarias de las mismas.
10. El procedimiento de la reivindicación 9 en
donde dicho grado de homología de secuencia primaria es muy
superior al 80%.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho ligando de ácido nucleico es
la SEC. Nº ID.: 50, o un ligando de ácido nucleico que tiene
sustancialmente la misma capacidad de unir e inhibir la actividad
de la polimerasa que la SEC. Nº ID.: 50.
12. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho ligando de ácido nucleico es
la SEC. Nº ID.: 59, o un ligando de ácido nucleico que tiene
sustancialmente la misma capacidad de unir e inhibir la actividad
de la polimerasa que la SEC. Nº ID.: 59.
13. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la inhibición por el ligando es
térmicamente reversible.
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el ligando tiene un recubrimiento
en 3' (3'-cap).
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la PCR es la PCR "de
arranque en caliente".
16. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la temperatura elevada es
superior a 40ºC.
\newpage
17. Equipo de PCR que comprende una ADN
polimerasa termoestable y un ligando de ácido nucleico que se une a
e inhibe dicha polimerasa a temperaturas ambiente, aunque permite
que la polimerasa esté activada en las temperaturas elevadas usadas
en el proceso de la PCR.
18. El equipo de la PCR según la reivindicación
17, en donde el ligando de ácido nucleico es ADN.
19. El equipo de la PCR según la reivindicación
17, en donde el ligando de ácido nucleico es de hebra simple.
20. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 19, en donde dicha polimerasa es una
transcriptasa inversa.
21. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 20, en donde dicha polimerasa se deriva
de especies del género Thermus.
22. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 21, en donde dicha polimerasa termoestable
es la polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) o la polimerasa
de Thermus thermophilus (Tth).
23. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en donde dicho ligando de ácido
nucleico se selecciona del grupo consistente en las secuencias
detalladas en la Tabla 2 (SEC. Nº ID.: 7-35), Tabla
3 (SEC. Nº ID.: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC. Nº
ID.: 67-73) o Tabla 5 (SEC. Nº ID.: 74), a las
correspondientes secuencias complementarias de las mismas.
24. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en donde dicho ligando de ácido
nucleico tiene un grado de homología de secuencia primaria muy
superior al 70% respecto, y tiene sustancialmente la misma
capacidad de unir la polimerasa Taq o Tth que, un ligando
seleccionado del grupo consistente en las secuencias detalladas en
la Tabla 2 (SEC. Nº ID.: 7-35), Tabla 3 (SEC. Nº
ID.: 36-66, 76, 77), Tabla 4 (SEC. Nº ID.:
67-73) o Tabla 5 (SEC. Nº ID.: 74), a las
correspondientes secuencias complementarias de las mismas.
25. El equipo de la PCR según la reivindicación
24 en donde dicho grado de homología de secuencia primaria es muy
superior al 80%.
26. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en donde dicho ligando de ácido
nucleico es la SEC. Nº ID.: 50, o un ligando de ácido nucleico que
tiene sustancialmente la misma capacidad de unir e inhibir la
actividad de la polimerasa que la SEC. Nº ID.: 50.
27. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en donde dicho ligando de ácido
nucleico es la SEC. Nº ID.: 59, o un ligando de ácido nucleico que
tiene sustancialmente la misma capacidad de unir e inhibir la
actividad de la polimerasa que la SEC. Nº ID.: 59.
28. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en donde la inhibición por el ligando
es térmicamente reversible.
29. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 22, en donde el ligando tiene un
recubrimiento en 3' (3'-cap).
30. El equipo de la PCR según una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 29, en donde la temperatura elevada es
superior a 40ºC.
31. Procedimiento para identificar un
interruptor de ácido nucleico, que comprende:
- a)
- preparar una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos;
- b)
- poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una afinidad incrementada por la diana respecto a la mezcla de candidatos pueden separarse del resto de la mezcla de candidatos;
- c)
- separar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada del resto de la mezcla de candidatos, en donde los ácidos nucleicos de afinidad incrementada se separan adicionalmente en base a su ausencia de afinidad por la diana a partir de la variación de un parámetro del entorno; y
- d)
- amplificar los ácidos nucleicos de afinidad incrementada separados adicionalmente en el paso C) para rendir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácido nucleico con una afinidad y especificidad relativamente superior por la unión a la diana, y ausencia de afinidad por la diana a partir de la variación de un parámetro del entorno, de manera que los ligandos de ácido nucleico de la diana pueden identificarse.
32. El procedimiento según la reivindicación 31,
en donde el parámetro del entorno es la temperatura.
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