ES2322409T3 - Vacunas multicomponentes contra staphylococcus aureus. - Google Patents

Abstract

Composición que consiste esencialmente en: i) Proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a colágeno M55; y ii) Proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A.

Description

Vacunas multicomponentes contra Staphylococcus aureus.

La invención se refiere a productos biológicos para el tratamiento y diagnóstico de infecciones bacterianas.

Antecedentes de la invención

Los estafilococos son células esféricas Gram positivas, normalmente dispuestas en grupos irregulares arracimados. Algunos son miembros de la flora normal de las membranas de la piel y las mucosas de los seres humanos, otras causan supuración, formación de abscesos, otras infecciones piogénicas e incluso septicemia mortal. Los estafilococos patógenos a menudo hemolizan la sangre, coagulan el plasma y producen diversas enzimas y toxinas extracelulares. El tipo más común de intoxicación alimentaria está causado por una enterotoxina termoestable de estafilococos.

El género Staphylococcus tiene al menos 30 especies. Las tres principales especies de importancia clínica son Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus es coagulasa positivo, lo que le diferencia de las otras especies. S. aureus es un patógeno de gran importancia para seres humanos. Casi cualquier persona padece algún tipo de infección por S. aureus a lo largo de su vida, cuya gravedad varía desde intoxicación alimentaria o infecciones cutáneas de poca importancia hasta infecciones graves potencialmente letales. Los estafilococos coagulasa-negativos son de la flora humana normal que a veces provocan una infección, a menudo asociada con dispositivos implantados, especialmente en pacientes muy jóvenes, viejos e inmunodeprimidos. Aproximadamente el 75% de las infecciones causadas por estafilococos coagulasa negativos se deben a S. epidermidis. Las infecciones debidas a Staphylococcus warneri, Staphylococcus hominis y otras especies son menos habituales. S. saprophyticus es una causa relativamente común de infecciones del tracto urinario en mujeres jóvenes. Los estafilococos producen catalasa, lo que les diferencia de los estreptococos.

La colonización por S. aureus del cartílago articular, del que el colágeno es un componente fundamental, dentro del espacio articular parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de artritis séptica. La artritis bacteriana adquirida por vía hematogénica sigue siendo un grave problema médico. Esta enfermedad articular que progresa rápidamente y es altamente destructiva es difícil de erradicar. Habitualmente, menos del 50% de los pacientes infectados no consiguen recuperarse sin un daño articular grave. S. aureus es el patógeno predominante aislado de pacientes adultos con osteomielitis hematógena y secundaria.

En pacientes hospitalizados, las bacterias del género Staphylococcus tales como S. aureus son una causa principal de infección. Las infecciones iniciales localizadas de heridas o dispositivos médicos permanentes pueden conducir a infecciones invasivas más graves tales como septicemia, osteomielitis, mastitis y endocarditis. En infecciones asociadas con dispositivos médicos, las superficies de plástico y de metal se recubren con proteínas del plasma y de la matriz del huésped tales como fibrinógeno y fibronectina inmediatamente después de la implantación. La capacidad de S. aureus y otras bacterias estafilocócicas de adherirse a estas proteínas es esencial para el inicio de la infección. Los injertos vasculares, catéteres intravenosos, válvulas cardiacas artificiales y dispositivos de asistencia cardiaca son trombogénicos y propensos a la colonización bacteriana. Entre las bacterias estafilocócicas, S. aureus es generalmente el patógeno más dañino de dichas infecciones.

Se ha observado un aumento significativo de aislados de S. aureus que muestran resistencia a la mayor parte de los antibióticos disponibles actualmente para tratar infecciones en hospitales de todo el mundo. El desarrollo de penicilina para combatir S. aureus fue un avance fundamental en el control y tratamiento de infecciones. Desgraciadamente, rápidamente surgieron organismos resistentes a la penicilina y la necesidad de nuevos antibióticos era primordial. Con la introducción de cada nuevo antibiótico, S. aureus fue capaz de responder con \beta-lactamasas, proteínas de unión a penicilina alteradas, y proteínas de la membrana celular mutadas que permitieron persistir a la bacteria. Por consiguiente, han surgido S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) y organismos resistentes a múltiples fármacos y han establecido "cabezas de puente" de gran importancia en hospitales y clínicas particulares en todo el mundo. (Chambers, H. F., Clin Microbiol Rev, 1: 173, 1988; y Mulligan, M. E., y col., Am J Med, 94: 313, 1993) Hoy, casi la mitad de las cepas estafilocócicas que causan infecciones nosocomiales son resistentes a todos los antibióticos excepto vancomicina, y parece solo cuestión de tiempo que la vancomicina se vuelva ineficaz también.

Existe una necesidad fuerte y que aumenta rápidamente de productos terapéuticos para tratar infecciones por estafilococos tales como S. aureus que sean eficaces contra cepas resistentes a antibióticos de las bacterias. Los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos indicaron recientemente que esta meta es ahora una prioridad nacional.

MSCRAMM

La adherencia bacteriana al tejido huésped se produce cuando adhesinas específicas de la superficie microbiana denominadas MSCRAMM (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules [Componentes de la Superficie Microbiana que Reconocen Moléculas Adhesivas de la Matriz]) reconocen y se unen específicamente a componentes de la matriz extracelular (ECM), tales como fibronectina, fibrinógeno, colágeno y elastina. Muchas bacterias patógenas han demostrado reconocer y unirse específicamente a diversos componentes de la ECM en una interacción que parece representar un mecanismo de colonización de tejido huésped. Esta adherencia implica un grupo de proteínas bacterianas denominadas MSCRAMM (Patti, J., y col., Ann Rev Microbiol, 48: 585-617, 1994; Patti, J. y Hook, M., Cur Opin Cell Biol., 6: 752-758, 1994).

Los MSCRAMM en la superficie celular bacteriana y los ligandos en el tejido huésped interaccionan en un modelo de cerradura y llave dando como resultado la adherencia de bacterias al huésped. La adhesión es necesaria a menudo para la supervivencia bacteriana y ayuda a las bacterias a evitar los mecanismos de defensa del huésped y las exposiciones a antibióticos. Una vez que las bacterias se han adherido a y colonizado con éxito tejidos huéspedes, su fisiología se altera drásticamente y se secretan componentes dañinos tales como toxinas y enzimas. Además, las bacterias adherentes a menudo producen una biopelícula y rápidamente se vuelven resistentes al efecto destructor de la mayor parte de antibióticos.

Una bacteria puede expresar MSCRAMM que reconocen diversas proteínas de la matriz. Los puntos de unión al ligando en MSCRAMM parecen estar definidos por tramos contiguos relativamente cortos de secuencias de aminoácidos (motivos). Puesto que un motivo similar puede encontrarse en varias especies diferentes de bacterias, parece como si estos motivos funcionales estuvieran sometidos a transferencia interespecífica (Patti y Hook, Curr Opin Cell Biol, 6: 752-758, 1994). Además, un único MSCRAMM a veces puede unirse a varios ligandos de la ECM.

Estudios de vacunación

Históricamente, los estudios sobre la adherencia bacteriana se han centrado principalmente en bacterias Gram negativas, que expresan una amplia variedad de proteínas adhesivas fimbriales (denominadas adhesinas) en su superficie celular (Falkow, S., Cell, 65: 1099-1102, 1991). Estas adhesinas reconocen a gliconconjugados específicos expuestos en la superficie de células huésped (particularmente capas epiteliales). El empleo de las estructuras similares a lectina en la unión permite al microorganismo colonizar eficazmente las superficies epiteliales. Esto proporciona a las bacterias una excelente ubicación para la replicación y también la oportunidad de difundirse a tejidos huésped adyacentes. Se ha demostrado que la inmunización con adhesinas fimbriales puede desencadenar protección contra la exposición a microbios, tal como en otitis medias inducida por Hemophilus influenza en un modelo en chinchilla (Sirakova y col., Infect 20 Immun, 62(5): 2002-2020, 1994), Moraxella bovis en queratoconjuntivitis infecciosa bovina inducida experimentalmente (Lepper y col., Vet Microbiol, 45(2-3): 129-138, 1995) y diarrea inducida por E. coli en conejos (McQueen y col., Vaccine, 11: 201-206, 1993). En la mayor parte de los casos, la inmunización con adhesinas conduce a la producción de anticuerpos inmunes que impiden la infección inhibiendo la unión y la colonización bacterianas, así como potenciando la opsonofagocitosis bacteriana y la destrucción mediada por el complemento dependiente de anticuerpos.

El uso de moléculas que median en la adhesión de microbios patógenos a componentes del tejido huésped como componentes de vacuna se presenta como una fase importante en el desarrollo de futuras vacunas. Puesto que la adherencia bacteriana es la primera fase crítica en el desarrollo de la mayor parte de infecciones, es una diana atractiva para el desarrollo de nuevas vacunas. Una mayor comprensión de las interacciones entre MSCRAMM y componentes del tejido huésped a nivel molecular acoplado con las nuevas técnicas de tecnología de ADN recombinante han sentado las bases para una nueva generación de vacunas de subunidad. Ahora pueden producirse dominios completos o específicos de MSCRAMM, en sus formas nativa o alterada específicamente en un punto. Además, la capacidad de mezclar y emparejar MSCRAMM de diferentes microorganismos genera la posibilidad de diseñar una única vacuna que protegerá contra múltiples bacterias.

Ensayos clínicos recientes con una nueva vacuna de subunidad contra tos ferina, que consiste en los MSCRAMM purificados de Bordetella pertussis, hemaglutinina filamentosa y pertactina, además de una toxina de pertussis inactivada, son un ejemplo perfecto del éxito de este tipo de enfoque. Se demostró que varias versiones de la nueva vacuna acelular eran seguras y más eficaces que la antigua vacuna que contenía células bacterianas completas (Greco y col., N Eng J Med, 334: 341-348, 1996; Gustaffson y col., N Eng J Med, 334: 349-355, 1996).

La inmunidad natural a infecciones por S. aureus sigue siendo mal entendida. Habitualmente, los seres humanos y animales sanos muestran un alto grado de resistencia innata a infecciones por S. aureus. La protección se atribuye a barreras epiteliales y mucosales intactas y respuestas celulares y humorales normales. Los valores cuantitativos de anticuerpos para componentes de S. aureus son elevados después de infecciones graves (Ryding y col., J Med Microbiol, 43(5): 328-334, 1995), sin embargo, hasta la fecha no existen pruebas serológicas de una correlación entre los valores cuantitativos de anticuerpos y la inmunidad en seres humanos.

En las últimas décadas se han analizado preparaciones de células de S. aureus vivas, termoinactivadas y fijadas con formalina como vacunas para impedir infecciones estafilocócicas. Se diseñó un ensayo clínico multicentro para estudiar los efectos de una vacuna comercial, que consiste en un toxoide de estafilococos y estafilococos completos e inactivados, sobre la incidencia de peritonitis, infección del orificio de salida, y transporte nasal de S. aureus entre pacientes con diálisis peritoneal continua (Poole-Warren y col., Clin Nephrol., 35: 198-206, 1991). Aunque la inmunización con la vacuna desencadenaba un aumento del nivel de anticuerpos específicos para S. aureus, la incidencia de peritonitis no resultaba afectada. Análogamente, la inmunización de conejos con células completas de S. aureus no podía impedir ni modificar ninguna etapa en el desarrollo de endocarditis experimental, reducir la incidencia de abscesos renales o rebajar la carga bacteriana en riñones infectados (Greenberg, D.P., y col., Infect Immun, 55: 3030-3034, 1987).

Actualmente no existe ninguna vacuna aprobada por la FDA para la prevención de infecciones por S. aureus. Sin embargo, una vacuna para S. aureus (StaphVAX), basada en el polisacárido capsular, está siendo desarrollada actualmente por NABI (North American Biologicals Inc.). Esta vacuna consiste en polisacáridos capsulares de tipo 5 o tipo 8 conjugados con la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA). La vacuna está diseñada para inducir anticuerpos opsónicos específicos del tipo y potenciar la opsonofagocitosis (Karakawa y col., Infect Immun, 56: 1090-1095, 1988). Usando un modelo de exposición letal en ratón (Fattom y col., Infect Immun, 61: 1023-1032, 1993) se ha demostrado que la infusión intraperitoneal de IgG específica del polisacárido capsular de tipo 5 reduce la mortalidad en ratones inoculados por vía intraperitoneal con S. aureus. La vacuna de polisacárido capsular de tipo 5-rEPA también se ha usado para vacunar a diecisiete pacientes con nefropatía terminal (Welch y col., J Amer Soc Nephrol, 7(2): 247-253, 1996). La media geométrica (GM) de los niveles de anticuerpo IgG para el conjugado de tipo 5 aumentaban entre 13 y 17 veces después de la primera inmunización, sin embargo no pudieron detectarse aumentos adicionales después de inyecciones adicionales. Curiosamente, Los niveles de la GM de IgM de los pacientes vacunados eran significativamente más bajos que los de los individuos de control. Apoyada por los estudios animales, la vacuna ha completado recientemente un ensayo de Fase II en pacientes con diálisis peritoneal ambulatoria continua. El ensayo clínico demostró que la vacuna era segura pero ineficaz para impedir infecciones estafilocócicas (NABI SEC FORM 10-K405, 31/12/95). Dos posibles explicaciones para la incapacidad de StaphVAX para impedir infecciones relacionadas con la diálisis peritoneal en pacientes vacunados son que la inmunogenicidad de la vacuna era demasiado baja debido a la dosificación subóptima de la vacuna o que los anticuerpos en el torrente sanguíneo son incapaces de afectar a la infección en ciertas áreas anatómicas, tales como el peritoneo.

La sepsis relacionada con bacterias Gram positivas va en aumento. De hecho entre un tercio y la mitad de todos los casos de sepsis están causados por bacterias Gram positivas, particularmente S. aureus y S. epidermidis. En los Estados Unidos, puede estimarse que más de 200.000 pacientes desarrollarán sepsis relacionada con bacterias Gram positivas este año.

Usando un modelo en ratón (Bremell y col., Infect Immun. 59(8): 2615-2623, 1991), se ha demostrado claramente que la inmunización activa con el dominio M55 del MSCRAMM de unión a Colágeno puede proteger a los ratones contra la muerte inducida por sepsis. Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con M55 o un antígeno de control (albúmina de suero bovino) y después se expusieron por vía intravenosa con S. aureus. El ochenta y tres por ciento (35/42) de los ratones inmunizados con M55 sobrevivían en comparación con solamente el 27% de los ratones inmunizados con BSA (12/45). Esto es una recopilación de 3 estudios diferentes.

Schennings, y col., demostraron que la inmunización con proteína de unión a fibronectina de S. aureus protege contra la endocarditis experimental en ratas (Micro Pathog, 15: 227-236, 1993). Las ratas se inmunizaron con una proteína de fusión (gal-FnBP) que abarca beta-galactosidasa y los dominios de la proteína de unión a fibronectina de S. aureus responsables de la unión a fibronectina. Se demostró que los anticuerpos contra la proteína de fusión gal-FnBP bloquean la unión de S. aureus a fibronectina inmovilizada in vitro. La endocarditis en ratas inmunizadas y no inmunizadas de control se indujo mediante cateterización a través de la arteria carótida derecha, dando como resultado válvulas cardiacas aórticas dañadas que quedaron cubiertas por fibrinógeno y fibronectina. Las ratas cateterizadas se infectaron a continuación por vía intravenosa con 1x10^{5} células de S. aureus. El número de bacterias asociadas con válvulas aórticas se determinó 11/2 días después de la infección por exposición y a continuación se observó una diferencia significativa en el número de bacterias entre grupos inmunizados y no inmunizados.

Un modelo de mastitis en ratón fue usado por Mamo, y col., (Vaccine, 12: 988-992, 1994) para estudiar el efecto de la vacunación con proteínas de unión a fibrinógeno (especialmente FnBP-A) y proteína de unión a colágeno de S. aureus contra infección por exposición con S. aureus. Los ratones vacunados con proteínas de unión a fibrinógeno mostraron tasas reducidas de mastitis en comparación con los controles. El examen macroscópico de glándulas mamarias expuestas de ratones mostró que las glándulas de ratones inmunizados con proteínas de unión a fibrinógeno desarrollaron infección intramamaria moderada o no sufrían cambios patológicos en comparación con glándulas de ratones de control. Un número significativamente reducido de bacterias podía recuperarse en las glándulas de ratones inmunizados con proteínas de unión a fibrinógeno en comparación con los controles. Mamo descubrió a continuación que la vacunación con FnBP-A combinado con toxoide alfa estafilocócica no mejoraba la protección (Mamo, y col.,Vaccine, 12: 988-992, 1994). Seguidamente, Mamo, y col., inmunizaron ratones solamente con proteína de unión a colágeno, que no indujo protección contra la infección por exposición con S. aureus.

Estafilococos completos inactivados se incluyeron en un estudio de vacuna en seres humanos sometidos a diálisis peritoneal (Poole-Warren y col., Clin. Nephrol, 35: 198-206, 1991). En este ensayo clínico, una vacuna disponible en el mercado de toxoide alfa-hemolisina combinado con una suspensión de bacterias completas inactivadas) se administró por vía intramuscular diez veces a lo largo de 12 meses, con pacientes de control que recibían inyecciones de solución salina. La vacunación desencadenó aumentos significativos de los niveles de anticuerpos para células de S. aureus en el fluido peritoneal y para alfa-hemolisina en el suero. Sin embargo, la inmunización no redujo las incidencias de peritonitis, infecciones relacionadas con el catéter o colonización nasal entre los receptores de la vacuna. La falta de eficacia protectora en este ensayo se atribuyó a una formulación de vacuna subóptima.

Se han explorado proteínas secretadas como componentes de vacunas subcelulares. La toxina alfa está entre las exotoxinas estafilocócicas más potentes; tiene actividad citolítica, induce necrosis tisular y mata animales de laboratorio. La inmunización con toxina alfa destoxificada con forlmaldehído no protege a los animales de infecciones sistémicas o localizadas, aunque puede reducir la gravedad clínica de las infecciones (Ekstedt, R. D., en The Staphylococci, 385-418, 1972).

Un estudio evaluó la eficacia protectora de anticuerpos para la microcápsula de S. aureus en un modelo experimental de infección estafilocócica (Nemeth, J. y Lee, J.C., Infect. Immun. 63: 375-380, 1995). Se inmunizaron de forma activa ratas con bacterias inactivadas, microencapsuladas o se inmunizaron de forma pasiva con anticuerpos anti-suero de conejo de alto valor cuantitativo específicos para el polisacárido capsular. A los animales de control se les inyectó solución salina o se inmunizaron de forma pasiva con suero de conejo normal. A continuación se evaluó la protección contra endocarditis inducida por catéter resultante de la exposición intravenosa con la misma cepa. A pesar de tener niveles elevados de anticuerpos anticapsulares, los animales inmunizados eran susceptibles a endocarditis estafilocócica y los animales inmunizados y de control tenían cantidades similares de bacterias en la sangre.

Como se describe en la Descripción Detallada de la Invención posteriormente en este documento, varias patentes y solicitudes de patente describen las secuencias génicas para proteínas de unión a fibronectina, fibrinógeno, colágeno, elastina, y un tipo análogo de MHC II. Estos documentos muestran que las proteínas, fragmentos, o anticuerpos inmunorreactivos con esas proteínas o fragmentos pueden usarse en vacunaciones para el tratamiento de infecciones por S. aureus. El documento PCT/US97/08210 describe la vacunación de ratones con una combinación de una proteína de unión a colágeno (fragmento M55), un péptido de unión a fibronectina (FnBP-A tratada con formulina (D1-D3)) y un péptido de unión a fibrinógeno (ClfA).

La falta de protección adecuada contra infección estafilocócica que se ha observado hasta la fecha de las vacunas descritas anteriormente es probablemente el resultado de la incapacidad para generar la respuesta inmune apropiada, quizás junto con un programa de inmunización indebido o una vía de inmunización indebida. Factores adicionales que también contribuyen al mal rendimiento de las vacunas anteriores puede reflejarse en el hecho de que se ha observado que bacterias estafilocócicas tales como S. aureus regulan temporalmente la expresión de la mayor parte de su virulencia mediante los loci de genes reguladores agr y sar. Por ejemplo, S. aureus contiene dos genes que codifican proteínas de unión a fibrinógeno de la superficie celular, ClfA y ClfB. Curiosamente, ClfA se expresa de forma predominante en crecimiento exponencial temprano, mientras que ClfB se expresa más tarde en la fase de crecimiento. Por consiguiente, los antígenos que el organismo invasor presenta al huésped in vivo pueden no ser los mismos que los usados en la vacuna. Además, no todos los antígenos de S. aureus se expresan en todos los aislados. Por ejemplo, solamente aproximadamente el 50% de los aislados clínicos de S. aureus expresan el gen cna, que codifica el MSCRAMM de unión a colágeno. Para generar un inmunoterapéutico eficaz contra S. aureus, la vacuna debe ser multicomponente y contener antígenos que abarquen el ciclo de crecimiento así como incluir antígenos que son expresados por una mayoría de aislados de S. aureus.

A pesar de los avances en el sector de composiciones para el tratamiento de infecciones por bacterias estafilocócicas tales como S. aureus, sigue existiendo una necesidad de proporcionar un producto más eficaz, y preferentemente uno que muestre una inmunización de amplio espectro contra bacterias estafilocócicas de diversas cepas, y para proteínas particulares que pueden expresarse en diferentes etapas de la fase de crecimiento bacteriano.

Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar una nueva composición terapéutica para inmunización contra infecciones por S. aureus.

Descripción resumida de la invención

Se ha descubierto que el tratamiento de infecciones estafilocócicas puede mejorar significativamente mediante inmunización con algunas combinaciones seleccionadas de proteínas de unión bacterianas o fragmentos de las mismas, o anticuerpos para esas proteínas o fragmentos. Las proteínas o fragmentos pueden usarse en vacunas activas y los anticuerpos en vacunas pasivas. Como alternativa, Las combinaciones pueden usarse para seleccionar mezclas de sangre de donantes para la preparación de productos sanguíneos purificados para inmunización pasiva. Mediante la cuidadosa selección de las proteínas, fragmentos o anticuerpos, se proporciona una vacuna que otorga protección contra un amplio espectro de cepas bacterianas de estafilococos y contra proteínas que se expresan en diferentes etapas de la curva de crecimiento logarítmico.

La vacuna y productos descritos en este documento responden a la urgente necesidad de la comunidad médica de un sustituto para antibióticos de molécula pequeña, que están perdiendo eficacia rápidamente. Las vacunas son una mejora significativa respecto a la técnica anterior, que aunque mostraba generalmente el uso de MSCRAMM para otorgar inmunización, no mostraba qué combinaciones del gran número de MSCRAMM conocidos deben usarse para otorgar una protección superior.

La invención proporciona una composición que consiste esencialmente en:

i) Proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a colágeno M55; y

ii) Proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A.

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La invención también proporciona una composición que consiste esencialmente en:

i) Proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a colágeno M55;

ii) Proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A;

iii) Proteína ClfB de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A; y

iv) Proteína FnBPA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibronectina DUD4.

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Como se describe posteriormente, se conocen las proteínas y péptidos a usar en la composición que se unen a fibronectina, fibrinógeno, colágeno, y elastina. Como alternativa, pueden identificarse nuevas proteínas de unión a fibronectina, fibrinógeno, colágeno y elastina, o los epítopos de las mismas para su uso en la composición. Se conocen métodos de identificación de un péptido de un dominio de unión de una proteína de unión que se une al ligando de elección. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una proteína o péptido candidato con el ligando en condiciones eficaces para permitir la unión del ligando al dominio de unión de una proteína de unión, e identificar un péptido candidato positivo que se une al ligando.

Los anticuerpos que se unen a los dominios de unión de las proteínas o péptidos de la composición pueden generarse administrando a un animal una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de la combinación de proteínas o péptidos, incluso aunque el péptido no se una específicamente a la ECM.

La combinación de las proteínas MSCRAMM aisladas, recombinantes o sintéticas, o fragmentos activos de las mismas o proteínas de fusión de las mismas, también son útiles como herramientas de investigación científica para identificar puntos de unión estafilocócicos en las moléculas de la ECM del huésped, promoviendo de este modo una comprensión del mecanismo de patología bacteriana y el desarrollo de terapias anti-bacterianas. Además, las proteínas aisladas, recombinantes o sintéticas, o partes antigénicas de las mismas (incluyendo fragmentos portadores de epítopos), o proteínas de fusión de las mismas pueden administrarse a animales como inmunógenos o antígenos, en solitario o en combinación con un adyuvante, para la producción de antisueros reactivos con proteínas MSCRAMM. Además, las proteínas pueden usarse para cribar antisueros para pacientes hiperinmunes de los que pueden obtenerse anticuerpos que tienen una muy alta afinidad por las proteínas. Los anticuerpos aislados a partir de los antisueros son útiles para la detección específica de bacterias estafilocócicas o proteínas de unión, como herramientas de investigación, o como tratamientos terapéuticos contra infección estafilocócica.

Las proteínas, o fragmentos activos de las mismas, y anticuerpos para las proteínas son útiles para el tratamiento de infecciones a partir de infecciones estafilocócicas de bacterias tales como S. aureus como se ha descrito anteriormente; para el desarrollo de vacunas anti-Staphylococcus para inmunización activa o pasiva; y, cuando se administran en forma de composición farmacéutica a una herida o se usan para recubrir dispositivos médicos o biomateriales poliméricos in vitro e in vivo, tanto las proteínas como los anticuerpos son útiles como agentes bloqueantes para impedir o inhibir la unión de bacterias estafilocócicas a la zona de la herida o a biomateriales.

Preferentemente, el anticuerpo obtenido de animales se modifica de modo que sea menos inmunogénico en el paciente al que se administra. Por ejemplo, si el paciente es un ser humano, el anticuerpo pude "humanizarse" transplantando las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo obtenido de hibridoma en un anticuerpo monoclonal humano según lo descrito por Jones 20 y col., (Nature 321: 522-525 (1986)) o Tempest y col. (Biotechnology 9: 266-273 (1991)).

También se describen kits que son útiles como agente de diagnóstico para la detección de infecciones estafilocócicas. Los anticuerpos anti-MSCRAMM así como los polipéptidos MSCRAMM de la presente invención, son útiles como agentes de diagnóstico para detectar infección por bacterias estafilocócicas, puesto que los polipéptidos son capaces de unirse a moléculas de anticuerpo producidas en animales, incluyendo seres humanos que están infectados por bacterias estafilocócicas tales como S. aureus, y los anticuerpos son capaces de unirse a bacterias estafilocócicas particulares o antígenos de las mismas.

Pueden incluirse agentes de diagnóstico en un kit que también puede incluir instrucciones de uso y otros reactivos apropiados. El kit también puede contener un medio para evaluar el producto del ensayo, por ejemplo, una tabla de colores, o una tabla de referencia numérica. El polipéptido o anticuerpo puede marcarse con un medio de detección que permite la detección del polipéptido MSCRAMM cuando éste está unido a un anticuerpo, o para la detección del anticuerpo anti-polipéptido MSCRAMM cuando éste está unido a bacterias del género Staphylococcus.

El medio de detección puede ser un agente de marcado fluorescente tal como isocianato de fluoresceína (FIC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), y similares, una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), glucosa oxidasa o similares, un elemento radiactivo tal como ^{125}I o ^{51}Cr que produce emisiones de rayos gamma, o un elemento radiactivo que emite positrones que producen rayos gamma al chocar con electrones presentes en la solución de ensayo, tales como ^{11}C, ^{15}O o ^{13}N. La unión del medio de detección se conoce bien en el sector. Por ejemplo, moléculas de anticuerpo monoclonal anti-polipéptido MSCRAMM producidas por un hibridoma pueden marcarse metabólicamente mediante la incorporación de aminoácidos que contienen radioisótopo en el medio de cultivo, o pueden conjugarse o acoplarse polipéptidos a un medio de detección a través de grupos funcionales activados.

Los kits de diagnóstico de la presente invención pueden usarse para detectar la presencia de una cantidad de bacterias del género Staphylococcus o anticuerpos anti-Staphylococcus en una muestra de fluido corporal tal como suero, plasma u orina. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, una composición de polipéptido MSCRAMM o anticuerpo anti-polipéptido MSCRAMM de la presente invención está unida a un soporte sólido habitualmente mediante adsorción a partir de un medio acuoso. Las matrices sólidas útiles se conocen bien en el sector, e incluyen dextrano reticulado; agarosa; poliestireno; cloruro de polivinilo; poliacrilamida reticulada; nitrocelulosa o materiales a base de nylon; tubos, placas o los pocillos de placas de microvaloración. Los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención pueden usarse como agentes de diagnóstico en forma de solución o como un polvo sustancialmente seco, por ejemplo, en forma liofilizada.

Breve descripción de las figuras de los dibujos

La Fig. 1 es una representación esquemática de los péptidos usados en la vacuna ilustrativa, MSCRAMM IV. Este dibujo ilustra las características esenciales de las proteínas MSCRAMM CNA de unión a colágeno, MSCRAMM ClfA de unión a fibrinógeno, MSCRAMM ClfB de unión a fibrinógeno y MSCRAMM FnBPA de unión a fibronectina. Los MSCRAMM se muestran con regiones indicadas que se expresaban como proteínas recombinantes y se usaban para generar anticuerpos en conejos inmunizados con MSCRAMM IV. Todas las proteínas se diseñaron con una marca de histidina amino terminal para facilitar la purificación mediante cromatografía de metal quelante.

La Fig. 2 es un gráfico de la evolución temporal de la respuesta inmune en Macacos de la India (Macacus rhesus) vacunados con MCSCRAMM como se muestra mediante los cambios en los valores cuantitativos de anticuerpos contra los MSCRAMM CNA, ClfA, ClfB y FnBPA, respectivamente. Los valores cuantitativos se analizaron mediante ELISA y se midieron como cambios de absorbancia (cuantificada a 405 nm) durante cada semana en el transcurso de un periodo de tratamiento de seis meses después de la inmunización original con el antígeno.

La Fig. 3 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen sdrF de S. epidermidis y la secuencia de aminoácidos codificada por ésta.

La Fig. 4 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen sdrG de S. epidermidis y la secuencia de aminoácidos codificada por ésta.

La Fig. 5 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen sdrH de S. epidermidis y la secuencia de aminoácidos codificada por ésta.

Descripción detallada

Se describen composiciones adecuadas para su uso como vacunas que incluyen al menos:

(i) Una proteína, péptido o dominio de unión a colágeno (o una secuencia apropiada de la misma mutada de forma dirigida) tal como CNA, o una proteína, fragmento o dominio con homología con respecto a ésta suficientemente alta, en combinación con una proteína de unión a fibrinógeno, preferentemente Factor de aglutinación A ("ClfA") o Factor de aglutinación B ("ClfB"), o un fragmento útil de los mismos o una proteína o fragmento con homología con respecto a éstas suficientemente alta;

(ii) una proteína o péptido de unión a fibronectina (o una secuencia apropiada de la misma mutada de forma dirigida), o una proteína o fragmento con homología con respecto a ésta suficientemente alta, en combinación con las proteínas de unión a fibrinógeno A y B (ClfA y ClfB), o fragmentos útiles de las mismas o proteínas o fragmentos con homología con respecto a éstas suficientemente alta; o

(iii) la proteína de unión a fibrinógeno A (ClfA) y la proteína de unión a fibrinógeno B (ClfB), o fragmentos útiles de las mismas o una proteína o fragmento con homología con respecto a éstas suficientemente alta; o

(iv) proteína o péptido de unión a fibronectina (o una secuencia apropiada de la misma mutada de forma dirigida), o una proteína o fragmento con homología con respecto a ésta suficientemente alta, en combinación con la proteína de unión a fibrinógeno A y B (ClfA y ClfB), o un fragmento útil de las mismas o una proteína o fragmento con homología con respecto a éstas suficientemente alta; y una proteína de unión a colágeno o fragmento útil de la misma, o una proteína o fragmento con homología con respecto a ésta suficientemente alta;

(v) componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con una proteína o péptido de unión a elastina o una proteína o fragmento con homología con respecto a ésta suficientemente alta; o

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(vi) componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con una proteína o péptido de unión a un tipo análogo de MHC II, proteína o fragmento con homología con respecto a ésta suficientemente alta; o

(vi) componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con un componente bacteriano para aumentar la tasa de fagocitosis de una bacteria estafilocócica tal como S. aureus; o

(vii) componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con las proteínas de unión a la matriz extracelular SdrC, SdrD o SdrE, o fragmentos útiles de las mismas, tales como un motivo de secuencia de aminoácidos consenso o variable, o proteínas o fragmentos con homología con respecto a éste suficientemente alta; o

(viii) componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con las proteínas de unión a la matriz extracelular SdrF, SdrG o SdrH, o fragmentos útiles de las mismas, tales como un motivo de secuencia de aminoácidos consenso o variable, o proteínas o fragmentos con homología con respecto a éste suficientemente alta, de modo que una vacuna creada a partir de dichos componentes también será útil para inmunizar a un paciente contra infección por bacterias coagulasa negativas tales como S. epidermidis así como bacterias coagulasa positivas tales como S. aureus; o

(ix) las proteínas de unión a la matriz extracelular SdrC, SdrD y SdrE o fragmentos útiles de las mismas, tales como un motivo de secuencia de aminoácidos consenso o variable, o una proteína o fragmento con homología con respecto a éste suficientemente alta.

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En estas realizaciones pueden usarse fragmentos de proteína aislados a partir de variantes de tipo salvaje o de origen natural o péptidos sintéticos o recombinantes correspondientes a variantes de tipo salvaje, de origen natural o mutaciones introducidas que no corresponden a un dominio de unión de origen natural de una proteína de unión.

Los péptidos aislados deben ser de una longitud suficiente para permitir la generación de un anticuerpo que se una tanto al péptido aislado como al dominio de unión, y bloquee la unión de la proteína de unión a su ligando. En algunos aspectos, se prefieren péptidos que comprenden al menos aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 22, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45 o aproximadamente 50 aminoácidos contiguos. En otros aspectos preferidos de la invención, el péptido aislado comprende al menos aproximadamente 6 aminoácidos contiguos de la secuencia de tipo salvaje del dominio de unión.

Las composiciones de péptido o anticuerpo aislado se usan para generar una respuesta inmunológica en un animal. En este aspecto, las composiciones comprenden además preferentemente un adyuvante. Se conocen muchos adyuvantes para su uso en vacunaciones y se adaptan fácilmente a esta composición. La composición de péptido o proteína aislada se dispersa preferentemente en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

El péptido aislado puede enlazarse con una secuencia de aminoácidos seleccionada para preparar una proteína de fusión. Como ejemplo no limitante, puede prepararse una proteína de fusión que comprende al menos un primer péptido de un dominio de unión de una proteína de unión unida de forma operativa a una secuencia de aminoácidos seleccionada. En una realización, si el péptido es un dominio de unión a fibronectina, el primer péptido no se une específicamente a fibronectina. En aspectos preferidos, el primer péptido está unido a una molécula portadora o secuencia de aminoácidos seleccionada, incluyendo, aunque sin limitación, hemocianina de lapa californiana (KLH) y albúmina de suero bovino (BSA).

Se describen composiciones inmunológicas, incluyendo vacuna, y otras composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas MSCRAMM seleccionadas o el ADN que codifica dichas proteínas MSCRAMM. La combinación de proteínas de unión, o fragmentos activos o antigénicos de las mismas, o proteínas de fusión de las mismas pueden formularse y empaquetarse, en solitario o en combinación con otros antígenos, usando métodos y materiales conocidos por los expertos en la materia para vacunas. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y pueden proporcionar inmunidad de anticuerpos o inmunidad celular tal como la producida mediante linfocitos T tales como linfocitos T citotóxicos o Linfocitos T CD4+.

Pueden prepararse vacunas para su uso en inmunizaciones activas y pasivas. Preferentemente el material antigénico se dializa exhaustivamente para retirar moléculas de poco peso molecular no deseadas y/o se liofiliza para una formulación más fácil en un vehículo deseado.

I. Definiciones

Las expresiones proteína FnBP-A, proteína FnBP-B, proteína ClfA, proteína ClfB, proteína SdrC, proteína SdrD, proteína SdrE, proteína SdrF, proteína SdrG, proteína SdrH, proteína CNA, proteína EbpS y proteína MHCII se definen en este documento como inclusivas de los subdominios FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS y MHCII, respectivamente, fragmentos activos o antigénicos de proteínas FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS y MHCII, y proteínas o fragmentos que tienen una homología suficiente alta con éstas. Fragmentos activos de proteínas FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS y MHCII se definen en este documento como péptidos o polipéptidos capaces de bloquear la unión de bacterias del género Staphylococcus a la ECM del huésped. Fragmentos antigénicos de proteínas FnBP-A, FnBP-B, ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE, SdrF, SdrG, SdrH, CNA, EbpS y MHCII se definen en este documento como péptidos o polipéptidos capaces de producir una respuesta inmunológica.

El término "adhesina" como se usa en este documento incluye proteínas y péptidos de origen natural o sintéticos o recombinantes que puedan unirse a proteínas de la matriz extracelular y/o mediar en la adherencia a células huésped.

El término "aminoácido" como se usa en este documento incluye aminoácidos de origen natural y sintéticos e incluye, aunque sin limitación, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamato, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina.

Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de las mismas, que se une a un epítopo específico. El término como se usa en este documento incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, quiméricos, de cadena sencilla, biespecíficos, híbridos humano/simio y humanizados así como fragmentos Fab, incluyendo los productos de una biblioteca de expresión de un fragmento Fab de inmunoglobulina.

La frase "molécula de anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales como se usa en este documento contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una parte inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina.

Como se usa en este documento, una proteína o péptido "equivalente antigénicamente funcional" es uno que incorpora un epítopo que es inmunológicamente capaz de reaccionar de forma cruzada con uno o más epítopos obtenidos de cualquiera de las proteínas MSCRAMM particulares descritas (por ejemplo, FnB-B, FnB-A, FnBP-B y FnBP-A) u obtenidos de cualquiera de los componentes bacterianos particulares descritos (por ejemplo, ácidos teicoicos, toxina alfa y polisacárido capsular de tipo 5). Equivalentes antigénicamente funcionales, o secuencias epitópicas, pueden diseñarse o predecirse en primer lugar y después analizarse, o simplemente puede analizarse directamente su reactividad cruzada.

Como se usa en este documento, "pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo, "ug" o "\mug" significan microgramo, "mg" significa miligramo, "ul" o "\mul" significan microlitro, "ml" significa mililitro, "l" significa litro.

Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.

Un "clon" es una población de células obtenida de una única célula o ancestro común por mitosis.

Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN de doble cadena que se transcribe y traduce a un polipéptido in vivo cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, aunque sin limitación, secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariota, secuencias de ADN genéticas de ADN eucariota (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción estarán situadas habitualmente en posición 3' con respecto a la secuencia codificante. "Molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de cadena sencilla o una hélice de doble cadena. Esta expresión se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a cualquier forma terciaria particular. Por lo tanto, esta expresión incluye ADN de cadena doble que se encuentra, entre otros, en moléculas de ADN lineales (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al analizar la estructura de moléculas de ADN de doble cadena particulares, las secuencias pueden describirse en este documento según la convención habitual de proporcionar solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene la secuencia homóloga al ARNm. Las secuencias de control transcripcional y traduccional son "secuencias reguladoras de ADN", tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que posibilitan la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped.

Una "secuencia de control de la expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la trascripción y la traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control transcripcional y traduccional en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante a ARNm, que a continuación se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificante.

Como se usa en este documento, la expresión "proteínas de la matriz extracelular," o ECM, se refiere a cuatro familias generales de macromoléculas, colágenos, glicoproteínas estructurales, proteoglicanos y elastinas, incluyendo fibronectina y fibrinógeno, que proporcionan apoyo y modulan el comportamiento celular.

"Cantidades inmunológicamente eficaces" son aquellas cantidades capaces de estimular una respuesta de células B y/o células T.

Como se usa en este documento, la expresión "vacuna in vivo" se refiere a la inmunización de animales con proteínas para desencadenar una respuesta humoral y celular que protege contra una exposición posterior al patógeno.

El término "ligando" se usa para incluir moléculas, incluyendo aquellas en tejidos huéspedes, a las que atacan las bacterias patógenas.

La expresión "antígenos de MHC II" como se usa en este documento se refiere a moléculas de la superficie celular que son responsables de los rechazos rápidos de los injertos y son necesarias para la presentación de antígenos a las células T.

La frase "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solamente una especie de punto de combinación del anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antígeno particular.

El término "oligonucleótido," como se usa en este documento se define como una molécula constituida por dos o más nucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función y uso en última instancia del oligonucleótido.

Como se usa en este documento, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y no producen habitualmente una reacción alérgica o perjudicial similar inaceptable cuando se administran a un ser humano.

El término "cebador" como se usa en este documento se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural como en una digestión por restricción purificada o producido de forma sintética, que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se sitúa en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de un cebador, que es complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una ADN polimerasa y a temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser de cadena sencilla o de cadena doble y debe ser lo suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente del cebador y uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico habitualmente contiene 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Los cebadores en este documento se seleccionan para que sean sustancialmente complementarios a diferentes cadenas de una secuencia de ADN diana particular. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus respectivas cadenas. Por lo tanto, no es necesario que la secuencia del cebador refleje la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento nucleotídico no complementario puede unirse al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia del cebador siendo complementaria a la cadena. Como alternativa, pueden intercalarse bases o secuencias más largas no complementarias en el cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga la suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena para hibridar con ésta y formar de este modo la plantilla para la síntesis del producto de extensión.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Para los propósitos de definición de la presente invención, la secuencia promotora está limitada en su extremo 3' por el punto de iniciación de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. En la secuencia promotora se encontrará un punto de iniciación de la transcripción (convenientemente definido mapeando con nucleasa SI), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procariotas contienen secuencias Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10 y -35.

Un "replicón" es un elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como unidad autónoma de replicación de ADN in vivo; es decir, capaz de replicarse bajo su propio control.

Como se usan en este documento, las expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN de cadena doble en o cerca de una secuencia de nucleótidos palindrómica específica.

Una "secuencia señal" puede incluirse antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un péptido señal, N-terminal con respecto al polipéptido, que comunica con la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido en los medios, y este péptido señal es retirado por la célula huésped antes de que la proteína abandone la célula. Las secuencias señal pueden encontrarse asociadas con diversas proteínas nativas de procariotas y eucariotas.

Como se usa en este documento, la expresión "mutágeno dirigido" se refiere a un compuesto que puede aumentar la tasa a la que se producen mutaciones en cierto punto dentro de la molécula de ADN.

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Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido en el interior de la célula. El ADN transformante puede estar o no integrado (unido covalentemente) en ADN cromosómico completando el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y de mamífero por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a células eucariotas, una célula transformada de forma estable es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que es heredado por células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra mediante la capacidad de la célula eucariota de establecer líneas celulares o clones constituidas por una población de células hijas que contienen el ADN transformante.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN para provocar la replicación del segmento unido.

El térmico "herida" se usa en este documento para referirse a la capa celular epitelial, y otras estructuras superficiales sobre tejido, dañadas de forma mecánica, química o mediante otra influencia.

Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se indica una cantidad de una composición peptídica que es capaz de generar una respuesta inmune en el animal receptor. Esto incluye tanto la generación de una respuesta de anticuerpos (respuesta de células B), y/o la estimulación de una respuesta inmune citotóxica (respuesta de células T). La generación de dicha respuesta inmune será útil en la producción de biorreactivos útiles, por ejemplo, CTL y, más particularmente, anticuerpos reactivos, para uso en realizaciones de diagnóstico, y también será útil en diversas realizaciones profilácticas o terapéuticas.

Las combinaciones seleccionadas de proteínas de unión bacterianas o fragmentos de las mismas en la composición usada incluyen aquellas que se unen a fibronectina, fibrinógeno, colágeno y elastina. Cualquiera de dichas proteína, péptido, fragmento de los mismos, o secuencia sustancialmente homóloga a estos puede usarse en la presente invención. A continuación se proporcionan ejemplos ilustrativos. Además, proteínas bacterianas o fragmentos de unión a análogos de MHC II.

II. Mscramm de unión a fibronectina

La Fibronectina (Fn) es una glicoproteína de 440 kDa que se encuentra en la ECM y en los fluidos corporales de animales. La función biológica primaria de la fibronectina parece estar relacionada con su capacidad para servir como sustrato para la adhesión de células que expresan las integrinas apropiadas. Varias especies bacterianas han demostrado unirse a fibronectina específicamente y adherirse a un sustrato que contiene fibronectina. La mayor parte de los aislados de S. aureus se unen a Fn, pero lo hacen en medidas diferentes, lo que refleja variaciones en el número de moléculas de MSCRAMM expresadas en la superficie celular bacteriana. La interacción entre Fn y S. aureus es altamente específica (Kuusela, P., Nature, 276: 718-20, 1978). La unión a Fn está mediada por dos proteínas expuestas en superficie con pesos moleculares de 110 kDa, llamadas FnBP-A y FnBP-B. El punto de unión a Fn primario consiste en un motivo de 35-40 aminoácidos, repetido de tres a cinco veces. Los genes para estos se han clonado y secuenciado (Jonsson, K., y col., Eur. J. Biochem., 202: 1041-1048, 1991).

El documento WO-A-85/05553 describe proteínas de la superficie celular bacteriana que tienen capacidad de unión a fibronectina, fibrinógeno, colágeno y/o laminina.

Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.320.951 y 5.571.514 a nombre de Hook, y col., describen la secuencia génica de la proteína de unión a fibronectina A (fnbA), y productos y métodos basados en esta secuencia.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.175.096 a nombre de Hook y col., describe la secuencia génica de fnbB, una molécula híbrida de ADN (fnbB) y productos biológicos y métodos basados en esta secuencia.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.652.217 describe una proteína aislada y purificada que tiene actividad de unión que es codificada por una molécula híbrida de ADN de S. aureus de secuencia definida.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.440.014 describe un péptido de unión a fibronectina en la unidad de homología D3 de una proteína de unión a fibronectina de S. aureus que puede usarse para la vacunación de rumiantes contra mastitis causada por infecciones estafilocócicas, para el tratamiento de heridas, para bloquear receptores de proteínas, para la inmunización otros animales o para el uso en un ensayo de diagnóstico.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.189.015 describe un método para el tratamiento profiláctico de la colonización de una cepa bacteriana de S. aureus que tiene la capacidad de unirse a fibronectina en un mamífero, que incluye administrar al mamífero que necesita tratamiento una cantidad profiláctica y terapéuticamente activa de una proteína que tiene propiedades de unión a fibronectina, para impedir la generación de infecciones causadas por una cepa bacteriana de S. aureus que tiene la capacidad de unirse a fibronectina, donde la proteína tiene un peso molecular de 87 kDa a 165 kDa.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.416.021 describe una proteína de unión a fibronectina que codifica ADN de Streptococcus dysgalactiae, junto con un plásmido que incluye ADN que codifica una proteína de unión a fibronectina de S. dysgalactiae contenida en E. coli, ADN que codifica una proteína de unión a fibronectina de S. dysgalactiae y un microorganismo de E. coli transformado con ADN que codifica una proteína de unión a fibronectina de S. dysgalactiae.

Se ha observado que los anticuerpos para proteína de unión a fibronectina de tipo salvaje no inhiben sustancialmente la capacidad de S. aureus para unirse a fibronectina, y por lo tanto no muestran un efecto terapéutico significativo, in vivo. El documento PCT/US98/01222 describe anticuerpos que bloquean la unión de fibronectina a proteínas de unión a fibronectina. Los anticuerpos se generaron contra una secuencia mutada de forma dirigida de proteína de unión a fibronectina que no se une a fibronectina. Se identificó que existe una rápida complejación de fibronectina con proteínas de unión a fibronectina y fragmentos in vivo. Los epítopos peptídicos que no se unen a fibronectina, incluso aunque se basen en un dominio de unión a fibronectina de una proteína de unión a fibronectina, no forman un complejo con fibronectina in vivo. Esto permite preparar anticuerpos contra el epítopo peptídico no complejado, que inhiben o bloquean la unión de fibronectina a proteínas de unión a fibronectina.

III. Mscramm de unión a colágeno

El colágeno es el principal constituyente del cartílago. Las proteínas de unión a Colágeno (Cn) son expresadas habitualmente por cepas estafilocócicas. El MSCRAMM de unión a Cn de S. aureus se adhiere al cartílago en un proceso que constituye una parte importante del mecanismo patogénico en infecciones estafilocócicas. (Switalski, y col. Mol. Micro. 7(1), 99-107, 1993) se descubrió que la unión a Cn por S aureus juega un papel en al menos, pero no solamente, artritis y septicemia. Se han identificado CNA con pesos moleculares de 133, 110 y 87 kDa (Patti, J., y col., J. Biol. Chem., 267: 4766-4772, 1992). Las cepas que expresan CNA con pesos moleculares diferentes no difieren en su capacidad de unión a Cn (Switalski, L.M., y col., Mol. Microbiol., 7: 99-107, 1993).

Las cepas estafilocócicas recuperadas de las articulaciones de pacientes a los que se diagnosticó artritis séptica u osteomielitis casi invariablemente expresan una CBP, mientras que un número significativamente menor de aislados obtenidos de infecciones de heridas expresan esta adhesina (Switalski y col., Mol. Microbiol., 7: 99-107, 1993). Análogamente, las cepas de S. aureus aisladas de los huesos de pacientes con osteomielitis a menudo tienen un MSCRAMM que reconoce a la proteína específica del hueso, sialoproteína ósea (BSP) (Ryden y col., Lancet, 11: 515-518, 1987). La colonización por S. aureus del cartílago articular en el espacio articular parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de la artritis séptica.

El documento PCT WO 92/07002 describe una molécula híbrida de ADN que incluye una secuencia de nucleótidos de S. aureus que codifica una proteína o polipéptido que tiene actividad de unión a colágeno y un plásmido o fago que comprende la secuencia de nucleótidos. También se describen una cepa de E. coli que expresa la proteína de unión a colágeno, un microorganismo transformado con el ADN recombinante, el método para producir una proteína o polipéptido de unión a colágeno y la secuencia proteica de la proteína o polipéptido de unión a colágeno.

Se ha descrito la clonación, secuenciación y expresión de un gen cna, que codifica una CBP de S. aureus (Patti, J., y col., J. Biol. Chem., 267: 4766-4772, 1992). El gen cna codifica una adhesina de 133 kDa que contiene elementos estructurales característicos de proteínas superficiales aisladas de bacterias Gram-positivas.

Recientemente, el punto de unión al ligando se ha localizado en la mitad N-terminal de la CBP (Patti, J. y col., Biochemistry, 32: 11428-11435, 1993). Mediante el análisis de la actividad de unión a Col de proteínas recombinantes correspondientes a diferentes segmentos del MSCRAMM, se identificó un fragmento de proteína de 168 aminoácidos de longitud (correspondiente a los restos de aminoácidos 151-318) que tenía actividad de unión a Col apreciable. Truncamientos cortos de esta proteína en el extremo N o C produjeron una pérdida de actividad de unión al ligando pero también produjeron cambios conformacionales en la proteína según lo indicado por espectroscopía de dicroismo circular.

Patti y col. (J of Biol Chem., 270, 12005-12011, 1995) describen un epítopo de unión a colágeno en la adhesina de S. aureus codificada por el gen cna. En su estudio, los autores sintetizaron péptidos obtenidos de la secuencia de dicha proteína y los usaron para producir anticuerpos. Algunos de estos anticuerpos inhiben la unión de la proteína a colágeno.

El documento PCT/US97/08210 describe que algunos epítopos identificados de la proteína de unión a colágeno (M55, M33, y M17) pueden usarse para generar anticuerpos protectores. La solicitud también describe la estructura cristalina de la CBP que proporciona información crítica necesaria para identificar composiciones que interfieren con, o bloquean completamente, la unión de Col a las CBP. El punto de unión al ligando en la CBP de S. aureus y un péptido de 25 aminoácidos se caracterizaba porque inhibía directamente la unión de S. aureus a Col de tipo II marcado con 125I.

IV. Mscramm de unión a fibrinógeno

La fibrina es el componente principal de los coágulos sanguíneos, y el fibrinógeno/fibrina es una de las principales proteínas del plasma depositada en biomateriales implantados. Existen bastantes pruebas que sugieren que la adherencia bacteriana a fibrinógeno/fibrina es importante en el inicio de la infección relacionada con dispositivos. Por ejemplo, como demostraron Vaudaux y col., S. aureus se adhiere a plástico in vitro que se ha recubierto con fibrinógeno de manera dependiente de la dosis (J. Infect. Dis. 160: 865-875 (1989)). Además, en un modelo que mimetiza un coágulo sanguíneo o daño a una válvula cardiaca, Herrmann y col. demostraron que S. aureus se une ávidamente mediante un puente de fibrinógeno a plaquetas que se adhieren a superficies (J. Infect. Dis. 167: 312-322 (1993)). S. aureus puede adherirse directamente a fibrinógeno en los coágulos sanguíneos formados in vitro, y puede adherirse a células endoteliales cultivadas mediante fibrinógeno depositado desde el plasma que actúa como puente (Moreillon y col., Infect. Immun. 63: 4738-4743 (1995); Cheung y col., J. Clin. Invest. 87: 2236-2245 (1991)). Como demostraron Vaudaux y col. y Moreillon y col., los mutantes defectuosos en el factor de aglutinación de la proteína de unión a fibrinógeno (ClfA) muestran adherencia reducida a fibrinógeno in vitro, a catéteres explantados, a coágulos sanguíneos y a válvulas cardiacas dañadas en el modelo en rata para endocarditis (Vaudaux y col., Infect. Immun. 63: 585-590 (1995); Moreillon y col., Infect. Immun. 63: 4738-4743 (1995)).

Una adhesina para fibrinógeno, a menudo denominada como "factor de aglutinación", se sitúa en la superficie de células de S. aureus. La interacción entre bacterias y fibrinógeno en solución da como resultado la aglutinación instantánea de células bacterianas. El punto de unión en el fibrinógeno se sitúa en el extremo C de la cadena gamma de la glicoproteína dimérica fibrinógeno. La afinidad es muy alta y la aglutinación se produce a bajas concentraciones de fibrinógeno. Los científicos han demostrado recientemente que el factor de aglutinación también promueve la adherencia a fibrinógeno en fase sólida, a coágulos sanguíneos y a válvulas cardiacas dañadas (McDevitt y col., Mol. Microbiol. 11: 237-248 (1994); Vaudaux y col., Infect. Immun. 63: 585-590 (1995); Moreillon y col., Infect. Immun. 63: 4738-4743 (1995)).

Se han descubierto dos genes en S. aureus que codifican dos proteínas de unión a Fg, ClfA y ClfB. El gen, clfA, se clonó y secuenció y se descubrió que codifica un polipéptido de 92 kDa. ClfA se une a la cadena gamma de fibrinógeno, y ClfB se une a las cadenas alfa y beta (Eidhin, y col., Mol Micro, vol. 30, p. 245-257, 1998). ClfB es una proteína asociada a la pared celular con un peso molecular predicho de 88 kDa y un peso molecular aparente de 124 kDa que se une a fibrinógeno soluble e inmovilizado y actúa como un factor de aglutinación.

El gen para una proteína de factor de aglutinación, denominada ClfA, se clonó, secuenció y analizó con detalle a nivel molecular (McDevitt y col., Mol. Microbiol. 11: 237-248 (1994); McDevitt y col., Mol. Microbiol. 16: 895-907 (1995)). La proteína predicha está compuesta por 933 aminoácidos. Una secuencia señal de 39 restos se encuentra en el extremo N seguida de una región de 520 restos (región A), que contiene el dominio de unión a fibrinógeno. Una región de 308 restos (región R), compuesta por 154 repeticiones del dipéptido serina-aspartato, le sigue. La secuencia de la región R está codificada por la repetición de 18 pares de bases GAY TCN GAY TCN GAY AGY en la que Y es igual a pirimidinas y N es igual a cualquier base. El extremo C de ClfA tiene elementos presentes en muchas proteínas superficiales de bacterias gram-positivas tales como un motivo LPDTG, que es responsable de anclar la proteína a la pared celular, un ancla de membrana y restos cargados positivamente en el extremo C terminal.

La alfa integrina plaquetaria IIb\beta3 reconoce el extremo C de la cadena gamma de fibrinógeno. Éste es un suceso crucial en el inicio de la formación de coágulos sanguíneos durante la coagulación. ClfA y alfa IIb\beta3 parecen reconocer de forma precisa los mismos puntos en la cadena gamma de fibrinógeno puesto que ClfA puede bloquear la agregación plaquetaria, y un péptido correspondiente al extremo C de la cadena gamma (198-41 1) puede bloquear tanto la integrina como ClfA que interactúa con fibrinógeno (McDevitt y col., Eur. J. Biochem. 247: 416-424 (1997)). El punto de unión a fibrinógeno de alfa IIb\beta3 está cerca de, o se solapa con, un determinante de unión a Ca2+ denominado como una "mano EF". La región A de ClfA tiene varios motivos similares a una mano EF. Una concentración de Ca2+ en el intervalo de 3-5 mM bloquea estas interacciones ClfA-fibrinógeno y cambia la estructura secundaria de la proteína ClfA. Las mutaciones que afectan a la mano EF de ClfA reducen o impiden las interacciones con fibrinógeno. Ca2+ y la cadena gamma de fibrinógeno parecen unirse al mismo o a sitios que se solapan, en la región A
de ClfA.

La cadena alfa de la integrina leucocitaria, alfa MB2, tiene una inserción de 200 aminoácidos (dominio A o I) que es responsable de actividades de unión al ligando. Un nuevo motivo de punto de adhesión dependiente de iones metálicos (MIDAS) en el dominio I es necesario para la unión al ligando. Entre los ligandos reconocidos está el fibrinógeno. El punto de unión en fibrinógeno está en la cadena gamma (restos 190-202). Recientemente se describió que Candida albicans tiene una proteína superficial, alfa Intlp, que tiene proteínas reminiscentes de integrinas eucariotas. La proteína superficial tiene homología en la secuencia de aminoácidos con el dominio I de M\beta2, incluyendo el motivo MIDAS. Además, Intlp se une a fibrinógeno.

La región A de ClfA también muestra cierto grado de homología en la secuencia con alfa Intlp. El examen de la secuencia de la región A de ClfA mostró un motivo MIDAS potencial. Las mutaciones en el supuesto catión que coordina restos en la parte DxSxS del motivo MIDAS en ClfA dan como resultado una reducción significativa de la unión a fibrinógeno. O'Connell y col., han demostrado que un péptido correspondiente al punto de unión de la cadena gamma para alfa M\beta2 (190-202) inhibe las interacciones CIfA-fibrinógeno (O'Connell, J. Biol. Chem., en prensa, 1998). Por lo tanto, parece que ClfA puede unirse a la cadena gamma del fibrinógeno en dos puntos diferentes. Los puntos de unión al ligando en ClfA son similares a los empleados por integrinas eucariotas e implican motivos de mano EF y MIDAS de unión a cationes divalentes.

También se conoce la proteína de unión a fibrinógeno, ClfB. En este documento se usa la proteína así como anticuerpos para la proteína y kits de diagnóstico que incluyen la proteína o sus anticuerpos. ClfB tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 88 kDa y un peso molecular aparente de aproximadamente 124 kDa. ClfB es una proteína asociada a la pared celular y se une tanto a fibrinógeno soluble como inmovilizado. Además, ClfB se une a las cadenas alfa y beta de fibrinógeno y actúa como factor de aglutinación.

Se han descubierto proteínas relacionadas con las ClfA y ClfB de unión a fibrinógeno, que se unen a la matriz extracelular. Las proteínas SdrC, SdrD y SdrE están relacionadas en la secuencia primaria y organización estructural con las proteínas ClfA y ClfB, y también se sitúan en la superficie celular. Con la región A de estas proteínas situada en la superficie celular, las proteínas pueden interactuar con las proteínas en el plasma, la matriz extracelular o con moléculas en la superficie de células huésped. SdrC puede unirse a las proteínas de la matriz extracelular, por ejemplo, vitronectina. SdrE también se une a la matriz extracelular, por ejemplo, SdrE se une a sialoproteína ósea (BSP).

Se ha descubierto que en la región A de SdrC, SdrD, SdrE, ClfA, y ClfB, existe una secuencia de aminoácidos altamente conservada que puede usarse para obtener un motivo consenso TYTFTDYVD. El motivo puede usarse en vacunas multicomponentes para otorgar inmunidad de amplio espectro contra infecciones bacterianas, y también pueden usarse para producir anticuerpos monoclonales o policlonales que otorgan inmunidad pasiva de amplio espectro. En una realización alternativa, puede usarse cualquier combinación del motivo de secuencia variable obtenido de las familias de proteínas Sdr y Clf, (T/I) (Y/F) (T/V) (F) (T) (D/N) (Y) (V) (D/N), para otorgar inmunidad o para producir anticuerpos protectores.

V. Mscramm de unión a elastina

El papel principal de la elastina es conferir la propiedad de elasticidad reversible a tejidos y órganos (Rosenbloom, J., y col., FASEB J., 7: 1208-1218, 1993). La expresión de elastina es mayor en el pulmón, piel y vasos sanguíneos, pero la proteína se expresa ampliamente en huéspedes mamíferos para S. aureus. Se descubrió que la unión de S. aureus a elastina era rápida, reversible, de alta afinidad y específica de ligando. Además, una proteína de unión a elastina de la superficie celular (EbpS) de 25 kDa se aisló y se propuso para mediar en la unión de S. aureus a la ECM del huésped rica en elastina. EbpS se une a una región en el fragmento N-terminal de 30 kDa de elastina.

El documento PCT/US97/03106 describe las secuencias génicas para una proteína de unión a elastina. Los datos de la secuencia de ADN descritos indican que el marco abierto de lectura ebps consiste en 606 pb, y codifica un nuevo polipéptido de 202 aminoácidos. La proteína EbpS tiene una masa molecular predicha de 23.345 daltons y un pI de 4,9. EbpS se expresaba en E. coli como una proteína de fusión con restos de polihistidina unidos al extremo N. Un anticuerpo policlonal generado contra EbpS recombinante interactuaba específicamente con la EbpS de la superficie celular de 25 kDa e inhibía la unión a elastina estafilocócica. Además, la EbpS recombinante se unía específicamente a elastina inmovilizada e inhibía la unión de Staphylococcus aureus a elastina. Un producto de degradación de EbpS recombinante que carece de los primeros 59 aminoácidos de la molécula y un Fragmento C-terminal de EbpS recombinante escindido con CNBr, sin embargo, no interactuaba con elastina. Estos resultados sugieren fuertemente que EbpS es la molécula de superficie celular que media en la unión de Staphylococcus aureus a elastina. El descubrimiento de que algunas construcciones de EbpS recombinante no interactúan con elastina sugiere que el punto de unión a elastina en EbpS está contenido en los primeros 59 aminoácidos de la molécula.

Varios criterios independientes indican que EbpS es la proteína superficial que media en la unión a elastina celular. En primer lugar, rEbpS se une específicamente a elastina inmovilizada e inhibe la unión de células de S. aureus a elastina de manera dependiente de la dosis. Estos resultados establecen que EbpS es una proteína de unión a elastina que es funcionalmente activa en forma soluble. En segundo lugar, un anticuerpo generado contra rEbpS reconoce una proteína de 25 kDa expresada en la superficie celular de células de S. aureus. Además de la similitud de tamaño y reactividad del anticuerpo, más pruebas de que esta proteína de 25 kDa es EbpS de la superficie celular son proporcionadas por el experimento que muestra que la unión de la proteína de 25 kDa a IgG anti-rEbpS inmovilizada se inhibe en presencia de un exceso de rEbpS no marcada. Finalmente, fragmentos Fab preparados a partir del anticuerpo anti-rEbpS, pero no a partir de su control pre-inmune, inhiben la unión de S. aureus a elastina. Este resultado sugiere que la topología de EbpS de la superficie es tal que el punto de unión a elastina es accesible para interactuar con ligandos (es decir elastina y el fragmento Fab anti-rEbpS) y no está oculta en los dominios de la membrana o la pared celular. Los datos compuestos demuestran que EbpS es la proteína de la superficie celular responsable de la unión de S. aureus a elastina.

El presente y los anteriores descubrimientos sugieren la existencia de una forma precursora intracelular de EpbS funcionalmente activa de 40 kDa que requiere procesamiento en el extremo C antes de la expresión en superficie. Esta noción se basa en las siguientes observaciones: i) existe una proteína de unión a elastina intracelular de 40 kDa que nunca se detecta durante experimentos de marcado en la superficie celular, ii) la EbpS de 25 kDa y la proteína de unión a elastina de 40 kDa tienen una secuencia N-terminal idéntica, y iii) existe un único gen para EbpS. Puesto que el tamaño del marco abierto de lectura ebps no es suficiente para codificar una proteína de 40 kDa, en un primer momento los inventores desecharon esta hipótesis. Sin embargo, sus estudios con rEbpS demostraron que aunque el tamaño real de la proteína recombinante es de 26 kDa, ésta migra de forma aberrante como una proteína de 45 kDa en SDS-30 PAGE. Este descubrimiento sugiere que la EbpS nativa de longitud completa, con un tamaño predicho de 23 kDa, puede estar migrando en SDS-PAGE como el precursor intracelular de 40 kDa, y que la forma superficial de 25 kDa de EbpS es realmente una forma más pequeña de la molécula procesada en el extremo C. Aunque EbpS carece de un péptido señal N-terminal y otras señales conocidas de clasificación y anclaje, este suceso de proceso intracelular propuesto puede explicar algunas cuestiones relativas a cómo EbpS es dirigida a la superficie celular. De hecho, se han identificado péptidos señal C-terminales en varias proteínas bacterianas (Fath, M.J. y Kolter, R., Microbiol. Rev., 57: 995-1017, 1993) y se han descrito medios alternativos para anclar proteínas a la superficie de las células en bacterias gram positivas (Yother, J. y White, J.M., J. Bacteriol., 176: 2976-2985, 1994).

Usando fragmentos solapantes de EbpS y construcciones recombinantes, se mapeo el punto de unión a elastina en EbpS con respecto al dominio amino terminal de la molécula (PCT/US97/03106). A continuación se usaron péptidos sintéticos solapantes que abarcan los aminoácidos 14-34 para definir mejor el dominio de unión. Entre estos, los péptidos correspondientes a los restos 14-23 y 18-34 específicamente inhibía la unión a elastina en más del 95%. La secuencia hexamérica ^{18}Thr-Asn-Ser-His-Gln-Asp^{23} es común a todos los péptidos sintéticos activos y fragmentos proteolíticos y recombinantes de EbpS. Una prueba adicional de que esta secuencia es importante para la unión a elastina era la pérdida de actividad cuando Asp^{23} se sustituía por Asn en el péptido sintético correspondiente a los restos 18-34. Sin embargo, el hexámero sintético TNSHQD por si mismo no inhibía la unión estafilocócica a elastina. Estos descubrimientos indican que aunque la presencia de la secuencia TNSHQD es esencial para la actividad de EbpS, son necesarios aminoácidos flanqueantes en la dirección N- o C-terminal y la cadena lateral carboxilo de Asp^{23} para el reconocimiento de la elastina.

VI. Proteínas análogas de MHC II, (map)

Además de fibrinógeno, fibronectina, colágeno y elastina, las cepas de S. aureus se asocian con otras proteínas eucariotas adhesivas, muchas de las cuales pertenecen a la familia de proteínas de la matriz adhesivas, tales como vitronectina. (Chatwal y col., Infect. Immun., 55: 1878-1883, 1987). La Patente de Estados Unidos Nº 5.648.240 describe un segmento de ADN que comprende un gen que codifica una adhesina de amplio espectro de S. aureus que tiene un peso molecular de aproximadamente 70 kDa. La adhesina es capaz de unirse a fibronectina o vitronectina e incluye una unidad que mimetiza al MHC II de aproximadamente 30 aminoácidos. Análisis adicionales de las especificidades de unión de esta proteína muestran que ésta se parece funcionalmente a un antígeno de MHC II en que se une a péptidos sintéticos. Por lo tanto, además de mediar en la adhesión bacteriana a proteínas de la ECM, puede jugar un papel en infecciones estafilocócicas suprimiendo el sistema inmune del huésped. La patente reivindica además un vector recombinante que incluye la secuencia de ADN especificada, una célula huésped recombinante transformada con el vector y ADN que hibrida con el ADN de la secuencia especificada. También se describe una composición que incluye una proteína o polipéptido codificado por la secuencia de ADN especificada y un método para inducir una respuesta inmune en un animal que incluye administrar una composición inmunogénica que incluye la proteína o polipéptido codificada. Un método para preparar un análogo proteico del antígeno de MHC II que comprende las etapas de insertar la secuencia de ADN especificada en un vector de expresión adecuado y cultivar una célula huésped transformada con el vector en condiciones para producir el análogo proteico del antígeno de MHC II se reivindica adicionalmente en la patente.

VII. Proteínas de SDR de Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis, una bacteria coagulasa-negativa, es un habitante común de la piel humana y una causa frecuente de infecciones por cuerpos extraños. La patogénesis está facilitada por la capacidad del organismo para, en primer lugar adherirse a, y posteriormente formar biopelículas sobre, dispositivos médicos permanentes tales como válvulas artificiales, dispositivos ortopédicos y catéteres de diálisis intravenosa y peritoneal. Las infecciones relacionadas con dispositivos pueden comprometer el éxito del tratamiento médico y aumentar significativamente la mortalidad de los pacientes. Por consiguiente, la capacidad de desarrollar vacunas que puedan controlar o impedir brotes de infección por S. epidermidis es de gran importancia, al igual que el desarrollo de vacunas multicomponentes que puedan impedir o tratar infección por un amplio espectro de bacterias, incluyendo tanto bacterias coagulasa positivas como coagulasa negativas al mismo tiempo.

Tres proteínas de Sdr (región de repetición de serina-aspartato (SD)) que son expresadas por S. epidermidis se han denominado como SdrF, SdrG y SdrH, y las secuencias de aminoácidos de estas proteínas y sus secuencias de ácido nucleico se muestran en las Fig. 3-5, respectivamente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición útil como vacuna que incluye los componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con una proteína SdrF, SdrG o SdrH. Además, pueden generarse anticuerpos para estas proteínas usando medios convencionales, y pueden emplearse anticuerpos para las proteínas SdrF, SdrG o SdrH en cualquiera de las combinaciones anteriores que emplean anticuerpos para las otras adhesinas descritas en este documento. Las composiciones y vacunas que incluyen una proteína de SDR tal como SdrF, SdrG o SdrH pueden usarse por lo tanto para tratar un amplio espectro de infecciones bacterianas, incluyendo aquellas provocadas tanto por bacterias coagulasa positivas como por coagulasa negativas.

VIII. Componentes bacterianos

Se describe una composición que incluye los componentes de cualquiera de las realizaciones anteriores en combinación con un componente bacteriano, preferentemente polisacáridos capsulares de tipo 5 o tipo 8, para aumentar la tasa de opsonización y fagocitosis de S. aureus.

Los estafilococos contienen polisacáridos antigénicos, tales como polisacárido capsular de tipo 5 y 8, y proteínas así como otras sustancias importantes en la estructura de la pared celular. El peptidoglicano, un polímero polisacarídico que contiene subunidades enlazadas, proporciona el exoesqueleto rígido de la pared celular. El peptidoglicano es destruido por ácidos fuertes o la exposición a lisozima. Es importante en la patogénesis de la infección. Desencadena la producción de interleucina-1 (pirógeno endógeno) y anticuerpos opsónicos por los monocitos. Puede ser un quimioatrayente para leucocitos polimorfonucleares, tener actividad similar a endotoxinas, producir un fenómeno de Shwartzman localizado y activar el complemento.

Los ácidos teicoicos, por ejemplo ácido lipoteicoico, que son polímeros de glicerol o ribotol fosfato, están enlazados al peptidoglicano y pueden ser antigénicos. Pueden encontrarse anticuerpos antiteicoicos detectables mediante difusión en gel en pacientes con endocarditis activa debida a S. aureus.

La proteína A es un componente de la pared celular de muchas cepas de S. aureus que se une a la parte Fc de moléculas de IgG excepto IgG3. La parte Fab de IgG unida a la proteína A es libre de combinarse con un antígeno específico. La proteína A se ha convertido en un importante reactivo en inmunología y tecnología de laboratorio de diagnóstico; por ejemplo, la proteína A con moléculas de IgG unidas dirigidas contra un antígeno bacteriano específico aglutinarán bacterias que tienen ese antígeno ("coaglutinación").

Algunas cepas de S. aureus tienen cápsulas, que inhiben la fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares a menos que estén presentes anticuerpos específicos. La mayoría de las cepas de S. aureus tienen coagulasa, o factor de aglutinación, en la superficie de la pared celular; la coagulasa se une de forma no enzimática a fibrinógeno, produciendo la agregación de las bacterias.

Los estafilococos pueden producir enfermedades a través de su capacidad para multiplicarse y difundirse ampliamente en tejidos y a través de su producción de muchas sustancias extracelulares. Algunas de estas sustancias son enzimas; otras se consideran como toxinas, aunque pueden funcionar como enzimas. Muchas de las toxinas están bajo el control genético de plásmidos; algunas pueden estar bajo control cromosómico y extracromosómico; y para otras el mecanismo de control genético no está bien definido.

A. Catalasa: Los estafilococos producen catalasa, que convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La prueba de la catalasa diferencia los estafilococos, que son positivos, de los estreptococos, que son negativos.

B. Coagulasa: S. aureus produce Coagulasa, una proteína similar a una enzima que coagula plasma oxalado o citrado en presencia de un factor contenido en muchos sueros. El factor del suero reacciona con la Coagulasa para generar actividades de esterasa y coagulación, de manera similar a la activación de protrombina a trombina. La acción de la Coagulasa evita la cascada normal de coagulación en plasma. La coagulasa puede depositar fibrina en la superficie de estafilococos, alterando quizás su ingestión por células fagocíticas o su destrucción dentro de dichas células. La producción de coagulasa se considera sinónima del potencial patógeno invasivo. Sin embargo, las bacterias coagulasa negativas tales como S. epidermidis también platean una amenaza de infección grave.

C. Otras Enzimas: Otras enzimas producidas por estafilococos incluyen una hialuronidasa, o hialuronato-liasa; astafiloquinasa que produce fibrinolisis pero que actúa mucho más lentamente que la estreptoquinasa; proteinasas; lipasas; y \beta-lactamasa.

D. Exotoxinas: Éstas incluyen varias toxinas que son letales para animales al ser inyectadas, causan necrosis en la piel, y contienen hemolisinas solubles que pueden separarse mediante electroforesis. La toxina alfa (hemolisina) es una proteína heterogénea que puede lisar eritrocitos y dañar plaquetas y es probablemente idéntica a los factores letales y dermonecrótico de la exotoxina. La toxina alfa también ejerce una potente acción sobre el músculo liso vascular. La toxina beta degrada la esfingomielina y es tóxica para muchos tipos de células, incluyendo glóbulos rojos humanos. Estas toxinas y dos más, las toxinas gamma y delta; son antigénicamente distintas y no tienen relación con las lisinas estreptocócicas. La exotoxina tratada con formalina da un toxoide no tóxico pero antigénico, pero éste no tiene utilidad clínica.

E. Leucocidina: Esta toxina de S. aureus puede destruir leucocitos expuestos de muchos animales. Su papel en estafilococos patógenos puede no destruir leucocitos y puede ser fagocitado de forma tan eficaz como las variedades no patógenas. Sin embargo, son capaces de una multiplicación intra-celular muy activa, mientras que los organismos no patógenos tienden a morir en el interior de la célula. Los anticuerpos para leucocidina pueden jugar un papel en la resistencia a infecciones estafilocócicas recurrentes.

F. Toxina Exfoliante: Esta toxina de S. aureus incluye al menos dos proteínas que producen la descamación generalizada del síndrome de la piel escaldada estafilocócica. Los anticuerpos específicos protegen contra la acción exfoliante de la toxina.

G. Toxina del síndrome de choque tóxico. La mayor parte de las cepas de S. aureus aisladas de pacientes con síndrome de choque tóxico producen una toxina llamada toxina 1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1), que es la misma que la enterotoxina F y exotoxina C pirógena. TSST-1 es el superantígeno prototípico que promueve las manifestaciones del género Proteus del síndrome de choque tóxico. En seres humanos, la toxina se asocia con fiebre, choque, e implicación multisitémica, incluyendo un sarpullido descamate. En conejos, la TSST-1 produce fiebre, una mayor susceptibilidad a los efectos de lipopolisacáridos bacterianos y otros efectos biológicos similares al síndrome de choque tóxico, pero el sarpullido y la descamación no se producen.

H. Enterotoxinas: Existen al menos seis (A-F) toxinas solubles producidas por aproximadamente el 50% de las cepas de S. aureus. Al igual que TSST-1, las enterotoxinas son superantígenos que se unen a moléculas del MHC de clase II, produciendo la estimulación de células T. Las enterotoxinas son termoestables (resisten el hervido durante 30 minutos) y son resistentes a la acción de enzimas intestinales. Una causa importante de intoxicación alimentaria, las enterotoxinas se producen cuando S. aureus crece en alimentos con carbohidratos y proteínas. El gen para la producción de enterotoxina puede estar en el cromosoma, pero un plásmido puede tener una proteína que regula la producción de toxina activa. La ingestión de 25 \mug de enterotoxina B por seres humanos o monos produce vómitos y diarrea. El efecto emético de la enterotoxina es probablemente el resultado de la estimulación del sistema nervioso central (centro del vómito) después de que la toxina actúe sobre receptores neurales en el intestino. Las enterotoxinas pueden evaluarse mediante ensayos con precipitina (difusión en gel).

También existen muchas otras proteínas antigénicas producidas por organismos estafilocócicos. Éstas incluyen los MSCRAMM mencionados anteriormente, así como: proteína de unión a sialoproteína ósea, proteína de unión a clusterina, proteína de unión a heparin sulfato, proteína de unión a trombospondina, proteína de unión a transferrina y proteína de unión a vitronectina. S. aureus expresa además factores de virulencia tales como fosfatidil fosfolipasa, y reguladores de la expresión de toxina tales como proteína Rap.

IX. Proteínas y péptidos con homología sustancial o función equivalente a las descritas en este documento

Las composiciones descritas pueden incluir, según se desee, proteínas o péptidos de secuencias completa, fragmentos de proteínas o péptidos, epítopos aislados, proteínas de fusión, o cualquier alternativa que se una a la ECM diana, ya sea en forma de un tipo salvaje, un mutante dirigido o una secuencia que sea sustancialmente homóloga a estos.

Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente el 70%, (preferentemente al menos aproximadamente el 80%, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90 o el 95%) de los nucleótidos coinciden en la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando software convencional disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de Southern en, por ejemplo, condiciones astringentes como se han definido para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del alcance de un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982; DNA Cloning, Vols, I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)].

Cuando se usa junto con secuencias de aminoácidos, la expresión "sustancialmente similar" significa una secuencia de aminoácidos que no es idéntica a las secuencias publicadas, pero que produce una proteína que tiene la misma funcionalidad y actividades, porque un aminoácido se sustituye por otro aminoácido similar, o porque el cambio (ya sea sustitución, eliminación o inserción) no afecta sustancialmente al punto activo de la proteína. Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente el 70%, (preferentemente al menos aproximadamente el 80%, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90% o el 95%) de los aminoácidos coinciden en la longitud definida de las secuencias.

También debe entenderse que cada uno de los polipéptidos MSCRAMM de la presente invención puede formar parte de una proteína más grande. Por ejemplo, un polipéptido ClfA de la presente invención puede fusionarse en su extremo N o extremo C a un polipéptido ClfB, o a un polipéptido de unión a no fibrinógeno o combinaciones de los mismos. Los polipéptidos que pueden ser útiles para este propósito incluyen polipéptidos obtenidos de cualquiera de las proteínas MSCRAMM, y variantes serotípicas de cualquiera de los anteriores. Los polipéptidos no MSCRAMM que pueden ser útiles para este propósito incluyen cualquiera de los componentes bacterianos descritos anteriormente.

Pueden hacerse modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y segmentos de ADN que los codifican y obtenerse aún una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con características deseables. Lo siguiente es un análisis basado en el cambio de aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación equivalente, o incluso mejorada. Los cambios de aminoácidos pueden conseguirse cambiando los codones de la secuencia de ADN, según la Tabla 1. Un experto en la materia debe entender que los codones especificados en la Tabla 1 son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tienen una T sustituida por U. Manteniendo la nomenclatura convencional (J. Biol. Chem., 243: 3552-3559, 1969), las abreviaturas para los restos de aminoácidos se muestran adicionalmente en la Tabla I.

Por ejemplo, algunos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en la estructura de una proteína sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión al antígeno de anticuerpos o puntos de unión en moléculas de sustrato. Puesto que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, pueden realizarse algunas sustituciones en la secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica y, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por lo tanto, los inventores contemplan que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones descritas, o secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

TABLA I

1

Al realizar dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático del aminoácido para otorgar función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en el sector (Kyte y Doolittle, J Mol Biol, 157(1): 105-132, 1982, incorporado en este documento como referencia). Se acepta que el relativo carácter hidropático del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se le he asignado un índice hidropático en base a sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, supra 1982), estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina
(-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

En el sector se sabe que algunos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o valor hidropático similar y siguen dando como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, se sigue obteniendo una proteína de funcionalidad biológica equivalente. Al realizar dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro del intervalo entre \pm2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro del intervalo entre \pm1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro del intervalo entre \pm0,5. En el sector también se entiende que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente en base a la hidrofilia. La patente de estados unidos 4.554.101, afirma que la mayor hidrofilia media local de una proteína, según se rige por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la Patente de Estados Unidos 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilia se han asignado a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+1,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilia similar y seguir obteniendo una proteína biológicamente equivalente, y en particular, una inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia están dentro del intervalo entre \pm2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro del intervalo entre \pm1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro del intervalo entre \pm0,5.

Como se ha resumido anteriormente, por lo tanto las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilia, carga, tamaño y similares. Las sustituciones ejemplares que tienen en cuenta diversas de las anteriores características son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse químicamente. Los polipéptidos sintéticos se preparan usando las técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida o técnicas de condensación peptídica, o cualquier combinación de las mismas, pueden incluir aminoácidos naturales y no naturales. Los aminoácidos usados para la síntesis peptídica pueden ser resina de aminoácido Boc convencional (N^{a}-t-butiloxicarbonilo N^{a}-amino protegido) con los protocolos convencionales de desprotección, neutralización, acoplamiento y lavado del procedimiento en fase sólida original de Merrifield [J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)], o los aminoácidos de base lábil 9-fluorenilmetoxicarbonilo N^{a}-amino protegido (Fmoc) descritos en primer lugar por Carpino y Han [J. Org. Chem., 37: 3403-3409 (1972)]. Los aminoácidos Fmoc y Boc N^{a}-amino protegidos pueden obtenerse de Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, o Peninsula Labs u otras compañías químicas familiares para los expertos en la materia. Además, el método de la invención puede usarse con otros grupos N^{a}-protectores que son familiares para los expertos en la materia. La síntesis peptídica en fase sólida puede conseguirse mediante técnicas familiares para los expertos en la materia y proporcionadas, por ejemplo, en Stewart y Young, 1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields y col., Int. J. Pept. Protein es. 35: 161-214 (1990), o usando sintetizadores automatizados, tales como los comercializados por ABS. Por lo tanto, los polipéptidos de la invención pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D- y L-aminoácidos, y diversos aminoácidos "de diseño" (por ejemplo, \beta-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, y Na-metil aminoácidos, etc.) para transmitir propiedades especiales. Los aminoácidos sintéticos incluyen ornitina por lisina, fluoro-fenilalanina por fenilalanina, y norleucina por leucina o isoleucina. Además, al asignar aminoácidos específicos en fases de acoplamiento específicas, pueden generarse a-hélices, giros \beta, láminas \beta, giros \beta y péptidos cíclicos.

Se seleccionarán subunidades de péptidos que otorgan propiedades químicas y estructurales. Por ejemplo, los péptidos que comprenden D-aminoácidos serán resistentes a proteasas específicas de L-aminoácidos in vivo. Además, puede preverse preparar péptidos que tienen propiedades estructurales mejor definidas, y el uso de peptidomiméticos, y enlaces peptidomiméticos, tales como enlaces éster, para preparar péptidos con nuevas propiedades. En otra realización, puede generarse un péptido que incorpora un enlace peptídico reducido, es decir, R_{1}-CH_{2}-NH-R_{2}, donde R_{1} y R_{2} son restos o secuencias de aminoácidos. Un enlace peptídico reducido puede introducirse como subunidad dipeptídica. Dicha molécula sería resistente a la hidrólisis de enlaces peptídicos, por ejemplo, actividad proteasa. Dichos péptidos proporcionarían ligandos con función y actividad únicas, tales como semi-vidas prolongadas in vivo debido a la resistencia a degradación metabólica, o actividad proteasa. Además, se sabe bien que, en algunos sistemas, péptidos forzados (estructuralmente) muestran una mayor actividad funcional (Hruby, Life Sciences, 31: 189-199 (1982)); (Hruby y col., Biochem J, 268: 249-262 (1990)].

Los siguientes aminoácidos no clásicos pueden incorporarse en el péptido para introducir motivos conformacionales particulares: 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilato (Kazmierski et al., J. Am. Chem. Soc., 113: 2275-2283, 1991); (2S,3S)-metil-fenilalanina, (2S,3R)-metil-fenilalanina, (2R,3S)-metil-fenilalanina y (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby, Tetrahedron Lett., 1991); ácido 2-aminotetrahidro-naftalen-2-carboxílico (Landis, Tesis Doctoral, Universidad de Arizona, 1989); hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxilato (Miyake y col, J. Takeda Res. Labs., 43: 53-76, 1989); \beta-carbolina (D y L) (Kazmierski, Tesis Doctoral, "Universidad de Arizona" 1988); HIC (ácido histidin isoquinolin carboxílico) (Zechel y col, Int. J. Pep. Protein Res., 43, 1991); e HIC (histidin urea cíclica) (Dharanipragada).

Los siguientes análogos de aminoácidos y peptidomiméticos pueden incorporarse en un péptido para inducir o favorecer estructuras secundarias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidon-6-carboxílico), un análogo de dipéptido que induce giro \beta (Kemp y col., J. Org. Chem., 50: 5834-5838 (1985)]; análogos inductores de lámina \beta [Kemp y col., Tetrahedron Lett., 29: 5081-5082 (1988)]; análogos inductores de giro \beta (Kemp y col., Tetrahedron Lett., 29: 5057-5060 (1988)]; análogos inductores de alfa-hélice [Kemp y col., Tetrahedron Lett., 29: 4935-4938 (1988)]; análogos inductores de giro \beta [Kemp y col., J. Org. Chem., 54: 109: 115 (1989)]; y análogos proporcionados por las siguientes referencias: Nagai y Sato, Tetrahedron Lett., 26: 647-650 15 (1985); DiMaio y col., J. Chem. Soc. Perkin Trans., p. 1687 (1989); también un análogo de giro Gly-Ala (Kahn y col., Tetrahedron Lett., 30: 2317, 1989); isóstero de enlace amida (Jones y col., Tetrahedron Lett., 29: 3853-3856, 1989); tetrazol (Zabrocki y col., J. Am. Chem. Soc.; 110: 5875-5880, 1988); DTC (Samanen y col., Int. J. Protein Pep. Res., 35: 501:509, 1990); y análogos mostrados en Olson y col., (J. Am. Chem. Sci., 112: 323-333, 1990) y Garvey y col., (J. Org. Chem., 56: 436, 1990). Miméticos de giros beta y protuberancias beta (beta bulges) restringidas conformacionalmente, y péptidos que los contienen, se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.440.013, expedida el 8 de agosto de 1995 a nombre de Kahn.

X. Usos para composiciones de MSCRAMM y anticuerpo

Las composiciones de proteínas descritas en este documento pueden usarse para el tratamiento de heridas, para bloquear receptores de proteínas o para inmunización (vacunación). En el último caso, el cuerpo crea anticuerpos específicos, que pueden proteger contra la invasión por cepas bacterianas que comprenden dicha proteína de la superficie celular, y con lo que los anticuerpos bloquean la adherencia de las cepas bacterianas a un tejido dañado.

La composición de proteínas puede dispersarse en una solución salina isotónica estéril, opcionalmente con la adición de un agente dispersante farmacéuticamente aceptable. Además pueden usarse diferentes tipos de adyuvantes para sostener la liberación en el tejido, y de este modo exponer al péptido durante más tiempo al sistema inmunitario de un cuerpo.

Las proteínas, moléculas de ácido nucleico o anticuerpos son útiles para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno y un huésped mamífero responsable de la infección, tal como la adhesión de bacterias, particularmente bacterias gram positivas, a proteínas de la matriz extracelular de mamíferos en dispositivos permanentes o a proteínas de la matriz extracelular en heridas; para bloquear la invasión de células de mamífero mediada por proteínas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de la matriz extracelular de mamífero y proteínas bacterianas que median en el daño tisular; y para bloquear el avance normal de la patogénesis en infecciones iniciadas de forma diferente a la implantación de dispositivos permanentes o técnicas quirúrgicas. Los dispositivos médicos de biomateriales poliméricos a recubrir con los anticuerpos, proteínas y fragmentos activos descritos en este documento incluyen, aunque sin limitación, grapas, suturas, válvulas cardiacas de sustitución, dispositivos de asistencia cardiaca, lentes de contacto rígidas y blandas, implantes de lentes intraoculares (cámara anterior, cámara posterior o de la fascia), otros implantes tales como lentes intraoculares "corneal inlays", queratoprótesis, endoprótesis vasculares, dispositivos de epiqueratofaquia, derivación para el glaucoma, grapas retinales, indentaciones esclerales, prótesis dentales, dispositivos tiroplásticos, dispositivos laringoplásticos, injertos vasculares, prótesis de tejido blandas y rígidas incluyendo, aunque sin limitación, bombas, dispositivos eléctricos incluyendo estimuladores y registradores, prótesis de oído, marcapasos, laringe artificial, implantes dentales, implantes mamarios, implantes de pene, tendones cráneo/faciales, articulaciones artificiales, tendones, ligamentos, meniscos, y discos, huesos artificiales, órganos artificiales incluyendo páncreas artificial, corazones artificiales, extremidades artificiales, y válvulas cardiacas; endoprótesis, alambres, alambres guía, catéteres intravenosos y del sistema nervioso central, dispositivos láser y de angioplastia con globo, dispositivos vasculares y cardiacos (tubos, catéteres, globos), dispositivos de asistencia ventriculares, componentes de diálisis sanguínea, oxigenadores sanguíneos, dispositivos uretrales/ureterales/urinarios (catéteres de Foley, endoprótesis, tubos y globos), catéteres de vías respiratorias (tubos y manguitos endotraqueales y de traqueotomía), tubos de alimentación enteral (incluyendo tubos nasogástricos, intragástricos y yeyunales), tubos de drenaje de heridas, tubos usados para drenar las cavidades corporales tales como las cavidades pleural, peritoneal, craneal y pericárdica, bolsas de sangre, tubos de ensayo, tubos de recogida de sangre, vacutainers, jeringas, agujas, pipetas, puntas de pipeta y tubos para intubación sanguínea.

El término "recubierto" o "recubrir", como se usan en este documento, significan aplicar la proteína, anticuerpo, o fragmento activo a una superficie del dispositivo, preferentemente una superficie externa que estaría expuesta a infección por S. aureus. No es necesario recubrir completamente la superficie del dispositivo con la proteína, anticuerpo o fragmento activo.

XI. Preparación de proteínas, ADN y anticuerpos

El lector experto puede emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante para preparar las proteínas, péptidos y composiciones de anticuerpo descritas en este documento. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y col, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); Current Protocols in Molecular Biology Volúmenes I-III (Ausubel, R. @-I ed., 1994); Cell Biology: A Laboratory Handbook Volúmenes I-III (J. E. Celis, ed., 1994); Current Protocols in Immunology Volúmenes I-III (Coligan, J. E., ed., 1994); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds., 1985); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed.1, (1986); Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984).

La referencia a anticuerpos en toda la memoria descriptiva incluye anticuerpos policlonales y monoclonales completos, y partes de los mismos, en solitario o conjugados con otros grupos. Las partes de anticuerpos incluyen fragmentos Fab y F(ab)2 y anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos pueden prepararse in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro usando técnicas de ADN recombinante. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En una realización preferida, un anticuerpo es un anticuerpo policlonal. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en el sector (Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antybodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1988).

En resumen, un anticuerpo policlonal se prepara inmunizando un animal con un inmunógeno que comprende un polipéptido de la presente invención y recogiendo antisueros de ese animal inmunizado. Puede usarse una amplia gama de especies animales para la producción de antisueros. Habitualmente un animal usado para la producción de anti-antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster o una cobaya. Debido al relativamente gran volumen de sangre de los conejos, un conejo es la elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales.

Los anticuerpos, policlonales y monoclonales, específicos para epítopos de MSCRAMM pueden prepararse usando técnicas de inmunización convencionales, como sabrán generalmente los expertos en la materia. Una composición que contiene epítopos antigénicos de MSCRAMM de unión particular (péptidos sintéticos, mutados específicamente en un punto o péptidos truncados) puede usarse para inmunizar uno o más animales experimentales, tales como un conejo o ratón, que después pasará a producir anticuerpos específicos contra péptidos MSCRAMM que contienen epítopos.

Pueden obtenerse antisueros policlonales, después de dejar un tiempo para la generación de anticuerpos, simplemente extrayendo sangre del animal y preparando muestras de suero de la sangre completa.

La cantidad de composición inmunógena usada en la producción de anticuerpos policlonales varía dependiendo de la naturaleza del inmunógeno, así como del animal usado para la inmunización. Pueden usarse diversas vías para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede supervisarse tomando muestras de la sangre del animal inmunizado a intervalos diversos después de la inmunización. También puede administrarse una segunda inyección de refuerzo. El proceso de reforzar y valorar cuantitativamente se repite hasta que se alcanza un valor cuantitativo adecuado. Cuando se obtiene un nivel de inmunogenicidad deseado, puede extraerse la sangre del animal inmunizado y el suero puede aislarse y almacenarse.

Una de las características importantes proporcionadas por la presente invención es un suero policlonal que es relativamente homogéneo con respecto a la especificidad de los anticuerpos en su interior. Habitualmente, el antisuero policlonal se obtiene de diversos "clones" diferentes, es decir, células B de diferente linaje. Los anticuerpos monoclonales, por el contrario, se definen como procedentes de células productoras de anticuerpos con una célula B antecesora común, de ahí su "mono" clonalidad.

Cuando se usan péptidos como antígenos para generar sueros policlonales, se espera una variación considerablemente menor de la naturaleza clonal de los sueros que si se empleara un antígeno completo. Desafortunadamente, si están presentes fragmentos incompletos de un epítopo, el péptido puede asumir muy bien múltiples (y probablemente no nativas) conformaciones. Como resultado, incluso los péptidos cortos pueden producir antisueros policlonales con especificidades relativamente plurales y, desafortunadamente, un antisuero que no reacciona o reacciona mal con la molécula nativa.

Se producen antisueros policlonales según la presente invención contra péptidos de los que se ha predicho que comprenden epítopos completos e intactos. Se cree que estos epítopos son, por lo tanto, más estables en sentido inmunológico y por lo tanto expresan una diana inmunológica más consecuente para el sistema inmune. En este modelo, el número de clones de células B potenciales que responderán a este péptido es considerablemente menor y, por lo tanto, la homogeneidad de los sueros resultantes será mayor. En diversas realizaciones, la presente invención proporciona antisueros policlonales en los que la clonalidad, es decir, el porcentaje de clones que reaccionan con el mismo determinante molecular, es de al menos 80%. Se contempla una clonalidad incluso mayor (90%, 95% o
mayor).

Para obtener anticuerpos monoclonales, también se inmuniza inicialmente un animal experimental, a menudo preferentemente un ratón, con una composición que contiene un epítopo obtenido de MSCRAMM. A continuación, después de un periodo de tiempo suficiente para permitir la generación de anticuerpos, se obtiene una población de células esplénicas o linfáticas del animal. Las células esplénicas o linfáticas se fusionan a continuación con líneas celulares, tales como estirpes de mieloma humanas o de ratón, para producir hibridomas que secretan anticuerpos. Estos hibridomas pueden aislarse para obtener clones individuales que a continuación pueden cribarse para la producción de anticuerpos para el péptido deseado. Después de la inmunización, las células esplénicas se retiran y se fusionan, usando un protocolo de fusión convencional con células de plasmacitoma para producir hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra epítopos obtenidos de MSCRAMM. Los Hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para los antígenos seleccionados se identifican usando técnicas convencionales, tales como ELISA y métodos de transferencia de Western. A continuación pueden cultivarse clones de hibridoma en medios líquidos y los sobrenadantes del cultivo pueden unificarse para proporcionar los anticuerpos monoclonales específicos de epítopo obtenido de MSCRAMM.

Las líneas celulares inmortales productoras de anticuerpos también pueden crearse mediante técnicas diferentes de la fusión, tales como transformación directa de Linfocitos B con ADN oncogénico, o transfecciones con virus Epstein-Barr. Véase, por ejemplo, M. Schreier y col., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling y col., Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas (1981); Kennett y col., Monoclonal Antibodies (1980); véase también las Patentes de Estados Unidos Nº. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; y 4.493.890.

Se propone que los anticuerpos monoclonales de la presente invención encontrarán aplicaciones útiles en procedimientos inmunoquímicos convencionales, tales como métodos de ELISA y Transferencia de Western, así como otros procedimientos que pueden utilizar anticuerpos específicos para los epítopos de MSCRAMM. Adicionalmente, se propone que los anticuerpos monoclonales específicos para los péptidos obtenidos de MSCRAMM particulares pueden utilizase en otras aplicaciones útiles. Por ejemplo, su uso en protocolos inmunoabsorbentes puede ser útil para purificar especies peptídicas nativas o recombinantes o variantes sintéticas o naturales de las mismas.

En general, los anticuerpos poli- y monoclonales contra estos péptidos pueden usarse en diversas realizaciones. Por ejemplo, pueden emplearse en protocolos de clonación de anticuerpos para obtener ADNc o genes que codifican los péptidos descritos en este documento o proteínas relacionadas. También pueden usarse en estudios de inhibición para analizar los efectos de péptidos obtenidos de MSCRAMM en células o animales. Los anticuerpos anti-epítopo de MSCRAMM también serán útiles en estudios de inmunolocalización para analizar la distribución de MSCRAMM durante diversos eventos celulares, por ejemplo, para determinar la distribución específica celular o tisular de los péptidos de MSCRAMM en diferentes condiciones fisiológicas. Una aplicación particularmente útil de dichos anticuerpos es en la purificación de MSCRAMM nativos o recombinantes, por ejemplo, usando una columna de afinidad por anticuerpos. El funcionamiento de todas estas técnicas inmunológicas será conocido por los expertos en la materia a la luz de la presente descripción.

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla son conocidas por los expertos en la materia y se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778 y pueden usarse para producir anticuerpos de cadena sencilla para las proteínas descritas en este documento. Puede usarse tecnología de presentación en fagos para seleccionar genes de anticuerpos que tienen actividades de unión a MSCRAMM, o partes antigénicas de los mismos, a partir de genes v amplificados por PCR de linfocitos de seres humanos cribados para tener anticuerpos para MSCRAMM o bibliotecas sin tratamiento previo. Los anticuerpos biespecíficos tienen dos dominios de unión al antígeno donde cada dominio está dirigido contra un epítopo diferente.

El anticuerpo puede marcarse directamente con una marca detectable para la identificación y cuantificación de una bacteria estafilocócica tal como S. aureus. Las marcas para uso en inmunoensayos generalmente son conocidas por los expertos en la materia e incluyen enzimas, radioisótopos, y sustancias fluorescentes, luminescentes y cromogénicas incluyendo partículas coloreadas tales como oro coloidal y perlas de látex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos inmunoadsorbentes ligados a enzimas (ELISA).

Como alternativa, el anticuerpo puede marcarse indirectamente mediante reacción con sustancias marcadas que tienen afinidad por inmunoglobulina, tales como proteína A o G o segundos anticuerpos. El anticuerpo puede conjugarse con una segunda sustancia y detectarse con una tercera sustancia marcada que tenga afinidad por la segunda sustancia conjugada con el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y el conjugado de anticuerpo-biotina detectarse usando avidina o estreptavidina marcada. Análogamente, el anticuerpo puede conjugarse a un hapteno y el conjugado de anticuerpo-hapteno detectarse usando anticuerpo anti-hapteno marcado. Estos y otros métodos de marcado de anticuerpos y evaluación de conjugados son bien conocidos por los expertos en la materia. También pueden usarse anticuerpos para las proteínas de unión en instalaciones o laboratorios de producción para aislar cantidades adicionales de la proteína, tal como mediante cromatografía de afinidad.

En general, la preparación de anticuerpos biespecíficos también es bien conocida en el sector, según ejemplifican Glennie y col. (J Immunol, 139: 2367-2375, 1987). Se han empleado anticuerpos biespecíficos clínicamente, por ejemplo, para tratar a pacientes de cáncer (Bauer y col, Vox Sang, 61: 156-157, 1991). Un método para la preparación de anticuerpos biespecíficos implica la preparación por separado de anticuerpos que tienen especificidad por diferentes epítopos de uno o más dominios de unión a fibronectina de una o más proteína o proteínas de unión a fibronectina.

Aunque se conocen muchos métodos en el sector para la preparación de anticuerpos biespecíficos, el método de Glennie y col., (1987 supra) implica la preparación de fragmentos peptídicos F(ab'Y)2 de los dos anticuerpos seleccionados, seguida de la reducción de cada uno para proporcionar fragmentos Fab'YSH diferentes. Los grupos SH de uno de los dos socios a acoplar se alquilan a continuación con un reactivo reticulante tal como o-fenilenmaleimida para proporcionar grupos maleimida libres en un socio. A continuación este socio puede conjugarse con el otro por medio de un enlace tioéter, para dar el heteroconjugado F (ab'Y)2 deseado.

Debido a la facilidad de preparación, alto rendimiento y reproducibilidad, el método de Glennie y col., (1987 supra) se prefiere a menudo para la preparación de anticuerpos biespecíficos, sin embargo, existen muchos otros enfoques que pueden emplearse y que están previstos por los inventores. Por ejemplo, se conocen otras técnicas donde se realiza reticulación con SPDP o proteína A, o se prepara una construcción específica (Titus y col, J Immunol., 138: 4018-4022, 1987; Tutt y col, Eur J Immunol, 21: 1351-1358, 1991).

Otro método para producir anticuerpos biespecíficos es mediante la fusión de dos hibridomas para formar un cuadroma (Flavell y col, Br. J Cancer, 64(2): 274-280, 1991; Pimm y col, J. Cancer Res Clin Oncol, 118: 367-370, 1992; French y col, Cancer Res, 51: 2358-2361, 1991; Embleton y col., Br. J Cancer, 63(5): 670-674, 1991). Como se usa en este documento, el término "cuadroma" se usa para describir la fusión productiva de dos hibridomas de células B. Usando ahora técnicas convencionales, se fusionan dos hibridomas productores de anticuerpos para dar células hijas, y a continuación se seleccionan aquellas células que hayan mantenido la expresión de ambas series de genes de inmunoglobulina de clonotipo.

Un método preferido para generar un cuadroma implica la selección de un mutante deficiente en una enzima de al menos uno de los hibridomas parentales. Esta primera línea celular de hibridoma mutante se fusiona a continuación a células de un segundo hibridoma que han sido expuestas de forma letal, por ejemplo, a yododoacetamida, excluyendo su supervivencia continuada. La fusión de células permite el rescate del primer hibridoma adquiriendo el gen para su deficiencia enzimática del hibridoma tratado de forma letal, y el rescate del segundo hibridoma a través de la fusión al primer hibridoma. Se prefiere, aunque no es necesaria, la fusión de inmunoglobulinas del mismo isotipo, pero de diferente subclase. Un anticuerpo de subclases mezcladas permite el uso en un ensayo alternativo para el aislamiento de un cuadroma preferido.

Con más detalle, un método de desarrollo y cribado de cuadroma implica obtener una línea de hibridoma que secrete el primer mAb seleccionado y hacerla deficiente para la enzima metabólica esencial, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT). Para obtener mutantes deficientes del hibridoma, se cultivan células en presencia de concentraciones en aumento de 8-azaguanina (1 x 10^{7} M a 1 x 10^{-5} M). Los mutantes se subclonan mediante dilución limitante y se ensaya su sensibilidad a hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT). El medio de cultivo puede consistir en, por ejemplo, DMEM suplementado con FCS al 10%, L-Glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina 1 mM:

Una línea celular de hibridoma complementaria que produce el segundo MAb deseado se usa para generar los cuadromas mediante técnicas de fusión celular convencionales (Galfre y col, Methods Enzymol, 73: 1-46, 1981), o usando el protocolo descrito por Clark y col (Int J Cancer, 2: 15-17, 1988). En resumen, 4,5 x 10^{7} primeras células sensibles a HAT se mezclan con 2,8 x solución salina tamponada con fosfato) durante 30 minutos en hielo antes de la fusión. La fusión celular se induce usando polietilenglicol (PEG) y las células se colocan en placas de microcultivo de 96 pocillos. Se seleccionan los cuadromas usando medio que contiene Hat. Se identifican los cultivos que contienen anticuerpos biespecíficos usando, por ejemplo, un ELISA específico de isotipo en fase sólida y tinción de inmunofluorescencia específica de isotipo.

En una realización de identificación para identificar el anticuerpo biespecífico, los pocillos de placas de microvaloración (Falcon, Becton Dickinson Labware) se recubren con un reactivo que interactúa específicamente con uno de los anticuerpos de hibridoma parentales y que carece de reactividad cruzada con ambos anticuerpos. Las placas se lavan, se bloquean, y los sobrenadantes (SN) a ensayar se añaden a cada pocillo. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 2 horas, los sobrenadantes se descartan, las placas se lavan y se añade conjugado diluido de anticuerpo anti-fosfatasa alcalina durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan y un sustrato de fosfatasa, por ejemplo, p-Nitrofenil fosfato (Sigma, St. Louis) se añade a cada pocillo. Las placas se incuban, se añade NaOH 3 N a cada pocillo para interrumpir la reacción, y se determinan los valores de DO410 usando un lector de
ELISA.

En otra realización de identificación, se usan placas de microvaloración pre-tratadas con poli-L-lisina para unir una de las células diana a cada pocillo, a continuación las células se fijan, por ejemplo usando glutaraldehído al 1%, y se ensaya su capacidad para unirse a la célula intacta de los anticuerpos biespecíficos. Además, FACS, tinción de inmunofluorescencia, anticuerpos específicos de idiotipo, ensayos de competencia de unión al antígeno, y otros métodos comunes en el sector de caracterización de anticuerpos pueden usarse junto con la presente invención para identificar cuadromas preferidos.

Después del aislamiento del cuadroma, los anticuerpos biespecíficos se purifican de otros productos celulares. Esto puede conseguirse mediante diversos procedimientos de aislamiento de proteínas, conocidos por los expertos en la materia de purificación de inmunoglobulina. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos se conocen bien en el sector (Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988).

Por ejemplo, los sobrenadantes de cuadromas seleccionados se pasan por columnas de sepharose de proteína A o proteína G para unirlos a IgG (dependiendo del isotipo). Los anticuerpos unidos se eluyen a continuación con, por ejemplo, un tampón de citrato a pH 5,0. Las facciones eluídas que contienen los BsAb, se dializan contra un tampón isotónico. Como alternativa, el eluato también se pasa por una columna de sepharose anti-inmunoglobulina. A continuación se eluye el BsAb con cloruro de magnesio 3,5 M. A continuación se ensaya la actividad de unión de los BsAb purificados de esta manera mediante, por ejemplo, un ELISA específico de isotipo y ensayo de tinción de inmunofluorescencia de las células diana, como se ha descrito anteriormente.

Los BsAb purificados y anticuerpos parentales también pueden caracterizarse y aislarse mediante electroforesis SDS PAGE, seguida de tinción con plata o Coomassie. Esto es posible cuando uno de los anticuerpos parentales tiene un mayor peso molecular que el otro, donde la banda de los BsAb migra a medio camino entre la de los dos anticuerpos parentales. La reducción de las muestras verifica la presencia de cadenas pesadas con dos pesos moleculares aparentes diferentes.

Además, actualmente está disponible tecnología recombinante para la preparación de anticuerpos que permiten en general la preparación de genes de anticuerpo recombinante que codifican un anticuerpo que tiene la especificidad doble deseada (Van Duk y col., Int J. Cancer, 43: 344-349, 1989). Por lo tanto, después de seleccionar los anticuerpos monoclonales que tienen las características de unión más preferidas, los respectivos genes para estos anticuerpos pueden aislarse, por ejemplo, mediante cribado inmunológico de una biblioteca de expresión en fagos (Oi y Morrison, 1986; Winter y Milstein, 1991). A continuación, a través de la reorganización de dominios codificantes de Fab, puede obtenerse fácilmente la construcción quimérica apropiada.

Los anticuerpos monoclonales humanizados son anticuerpos de origen animal que han sido modificados usando técnicas de ingeniería genética para sustituir secuencias marco de la región constante y/o región variable por secuencias humanas, al tiempo que conservan la especificidad antigénica original.

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Dichos anticuerpos se obtienen habitualmente de anticuerpos de roedor con especificidad contra antígenos humanos. Dichos anticuerpos son generalmente útiles para aplicaciones terapéuticas in vivo. Esta estrategia reduce la respuesta del huésped al anticuerpo extraño y permite la selección de las funciones efectoras humanas.

Las técnicas para producir inmunoglobulinas humanizadas las conocen bien los expertos en la materia. Por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.693.762 describe métodos para producir, y composiciones de, inmunoglobulinas humanizadas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Cuando se combinan en un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en seres humanos y conservan sustancialmente la misma afinidad que la inmunoglobulina donadora por el antígeno, tal como una proteína u otro compuesto que contiene un epítopo.

Otras Patentes de Estados Unidos que muestran la producción de anticuerpos útiles en la presente invención incluyen la Patente de Estados Unidos Nº 5.565.332, que describe la producción de anticuerpos quiméricos usando un enfoque combinatorio; 4.816.567 que describe preparaciones de inmunoglobulina recombinante y 4.867.973 que describe conjugados de anticuerpo-agente terapéutico.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.565.332 describe métodos para la producción de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, que tienen la misma especificidad de unión que un anticuerpo parental pero que tienen características humanas aumentadas. Pueden obtenerse anticuerpos humanizados mediante intercambio de cadenas, quizás usando tecnología de presentación en fagos, siempre que dichos métodos sean útiles en la presente invención (Patente de Estados Unidos Nº 5.565.332).

Usando los antígenos peptídicos descritos en este documento, la presente invención también proporciona métodos para generar una respuesta inmune, métodos que comprenden generalmente administrar a un animal, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición peptídica obtenida de MSCRAMM. Los animales preferidos incluyen mamíferos, y particularmente seres humanos. Otros animales preferidos incluyen múridos, bóvidos, équidos, suidos, cánidos y félidos. La composición puede incluir epítopos peptídicos obtenidos de MSCRAMM parcial o significativamente purificados, obtenidos de fuentes naturales o recombinantes, cuyas proteínas o péptidos pueden obtenerse de forma natural o sintetizarse químicamente, o como alternativa producirse in vitro a partir de células huésped recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican dichos epítopos. A menudo se preferirán péptidos más pequeños que incluyen epítopos reactivos, tales como aquellos de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. Las proteínas o péptidos antigénicos también pueden combinarse con otros agentes, tales como otras composiciones de péptidos o ácidos nucleicos de estafilococos o estreptococos, si se desea. La composición también puede incluir componentes bacterianos producidos por estafilococos tales como aquellos descritos anteriormente, obtenidos a partir de fuentes naturales o recombinantes, proteínas que pueden obtenerse de forma natural o sintetizarse químicamente, o como alternativa producirse in vitro a partir de células huésped recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican dichos péptidos.

Las inmunoformulaciones ya sean para vacunación, tratamiento, o para la generación de anticuerpos útiles en la detección de estafilococos y estreptococos, o prevención de la adhesión bacteriana a componentes de la ECM tales como fibronectina, colágeno, elastina, fibrinógeno o vitronectina pueden comprender fragmentos peptídicos antigénicos mutados en un sitio específicamente, truncados u obtenidos de forma sintética de estas proteínas.

Medios adicionales contemplados por los inventores para generar una respuesta inmune en un animal incluyen administrar al animal, o sujeto ser humano, una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de ácido nucleico que codifica un epítopo peptídico, o una cantidad inmunológicamente eficaz de un organismo vivo atenuado que incluye y expresa dicha composición de ácido nucleico.

Las cantidad de ADN expresable o ARN transcrito a introducir en un receptor de vacuna tendrá un intervalo de dosificación muy amplio y puede depender de la fuerza de los promotores transcripcionales y traduccionales usados. Además, la magnitud de la respuesta inmune puede depender del nivel de expresión de la proteína y de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, la dosis eficaz varía de aproximadamente 1 ng a 5 mg, 100 ng a 2,5 mg, 1 \mug a 750 \mug, y preferentemente de aproximadamente 10 \mug a 300 \mug de ADN se administra directamente en tejido muscular. Inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel, y otros modos de administración tales como administración intraperitoneal, intravenosa, o por inhalación también son adecuados. También se contempla que puedan proporcionarse vacunaciones de refuerzo. Después de la vacunación con un polinucleótido inmunógeno de MSCRAMM, también se contempla el refuerzo con proteína inmunógena de MSCRAMM tal como el producto génico M55.

El polinucleótido puede estar "desnudo", esto es, sin asociar con ninguna proteína, adyuvante u otros agentes que afectan al sistema inmune del receptor. En este caso, es deseable que el polinucleótido esté en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, aunque sin limitación, solución salina estéril o solución salina tamponada estéril. Como alternativa, el ADN puede estar asociado con liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en el sector, como una mezcla de ADN-liposoma, o el ADN puede estar asociado con un adyuvante conocido en el sector para reforzar las respuestas inmunes, tal como una proteína u otro portador. También pueden usarse agentes que ayudan en la captación celular de ADN, tales como, aunque sin limitación, iones de calcio. Estos agentes se denominan generalmente en este documento como reactivos que facilitan la transfección y portadores farmacéuticamente aceptables. Las técnicas para recubrir microproyectiles recubiertos con polinucleótido se conocen en el sector y también son útiles junto con la presente invención. Para el ADN previsto para uso humano puede ser útil tener el producto final de ADN en un portador o solución tampón farmacéuticamente aceptable. Los portadores o soluciones tampón farmacéuticamente aceptables se conocen en el sector e incluyen las descritas en diversos textos tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

Se describe un polinucleótido que comprende secuencias contiguas de ácido nucleico capaces de expresarse para producir un producto génico después de la introducción de dicho polinucleótido en tejidos eucariotas in vivo. El producto génico codificado preferentemente actúa como inmunoestimulante o como un antígeno capaz de generar una respuesta inmune. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico en esta realización codifican un epítopo inmunogénico de MSCRAMM, y opcionalmente una citoquina o un elemento coestimulador de células T, tal como un miembro de la familia B7 de proteínas.

Existen varias ventajas de la inmunización con un gen en lugar de con su producto génico. La primera es la relativa simplicidad con la que un antígeno nativo o casi nativo puede presentarse al sistema inmune. Las proteínas de mamífero expresadas de forma recombinante en bacterias, levadura, o incluso células de mamífero a menudo requieren un tratamiento exhaustivo para asegurar la antigenicidad apropiada. Una segunda ventaja de la inmunización con ADN es el potencial de que el inmunógeno entre en la ruta del MHC de clase I y provoque una respuesta de células T citotóxicas. La inmunización de ratones con ADN que codifica la nucleoproteína A del virus de la gripe (NP) provocaba una respuesta CD8^{+} a NP que protegía a los ratones contra la exposición con cepas heterólogas del virus de la gripe. (Montgomery, D. L. y col., Cell Mol Biol, 43(3): 285-292, 1997; Ulmer, J. y col., Vaccine, 15(8): 792-794, 1997).

La inmunidad mediada por células es importante para controlar la infección. Puesto que la inmunización con ADN puede provocar respuestas inmunes humorales y mediadas por células, su mayor ventaja puede ser que proporciona un método relativamente sencillo para estudiar un gran número de genes de S. aureus para su potencial de vacuna.

La inmunización mediante inyección con ADN también permite el fácil ensamblaje de vacunas multicomponentes de subunidad. La inmunización simultánea con múltiples genes del virus de la gripe se ha descrito recientemente. (Donnelly, J. y col., Vaccines, 55-59, 1994). La inclusión en una vacuna de S. aureus de genes cuyos productos activan respuestas variadas y múltiples del sistema inmune también puede proporcionar una protección concienzuda frente a una posterior exposición.

Se proporciona además una composición que comprende un segmento de ácido nucleico aislado que codifica un péptido de un dominio de unión de una proteína de unión, donde el péptido se une específicamente o no a su ligando. También se contempla que puedan manipularse organismos atenuados para expresar productos génicos de MSCRAMM recombinantes y ser ellos mismos vehículos de administración para la invención. Se prefieren particularmente especies bacterianas atenuadas tales como Mycobacterium, y en particular M bovis, M smegmatis, o BCG. Como alternativa, pox-, polio-, adeno-, u otros virus, y bacterias tales como especies de Salmonella, Shigella, Listeria, Streptococcus también pueden usarse junto con los métodos y composiciones descritos en este documento.

La tecnología de ADN desnudo, a menudo denominada como inmunización genética, ha demostrado ser útil para la protección contra organismos infecciosos. Dichos segmentos de ADN podrían usarse en diversas formas incluyendo ADN desnudo y ADN de plásmido, y pueden administrarse al sujeto de diversas maneras incluyendo inoculaciones parenteral, mucosal, y la llamada "pistola génica" basada en microproyectiles. El uso de composiciones de ácido nucleico de la presente invención en dichas técnicas de inmunización se propone por lo tanto como una estrategia de vacunación útil contra al menos infección estreptocócica y estafilocócica.

Los expertos en la materia reconocen que un programa de dosificación óptima de un régimen de vacunación con ADN puede incluir hasta de cinco a seis, pero preferentemente de tres a cinco, o aún más preferentemente de una a tres administraciones de la entidad inmunizadora administrada a intervalos de cómo mínimo dos a cuatro semanas, hasta como máximo de cinco a diez años, u ocasionalmente a intervalos incluso más largos.

Aspectos particulares se refieren al uso de vectores plasmídicos para la clonación y expresión de péptidos recombinantes, y epítopos peptídicos particulares que comprenden epítopos nativos o con el sitio de unión específicamente mutado. La generación de vectores recombinantes, transformación de células huésped, y expresión de proteínas recombinantes es bien conocida por los expertos en la materia. Se prefieren huéspedes procariotas para la expresión de las composiciones peptídicas de la presente invención. Un ejemplo de un huésped procariota preferido es E. coli, y en particular, las cepas de E. coli ATCC 69791, BL21(DE3), JMIOI, XLI-Blue^{TM}, RRI, LE392, B, \chi^{776} (ATCC 31537), y W3110 (F, \lambda, prototróficas, ATCC 273325). Como alternativa, pueden usarse otras especies de Enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium y Serratia marcescens, o incluso otros huéspedes Gram-negativos incluyendo diversas especies de Pseudomonas en la expresión recombinante de las construcciones genéticas descritas en este documento. Los huéspedes adicionales pueden incluir huéspedes eucariotas y procariotas bien conocidos, tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras, y células animales, tales como células CHO, R1.1, B-W y L-M, células de riñón de Mono Verde Africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y BMT10), células de insecto (por ejemplo, Sf9), y células humanas y células vegetales en cultivo tisular.

Puede emplearse una gran diversidad de combinaciones de huésped/vector de expresión para en la expresión del ADN. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos. por ejemplo, plásmidos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fagos, por ejemplo, los muchos derivados del fago \lambda, por ejemplo, NM989, y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN de fago filamentoso de cadena sencilla; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2 \mu o derivados del mismo; vectores útiles en células eucariotas, tales como vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores obtenidos de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares.

Como se conoce bien en el sector, las secuencias de ADN pueden expresarse uniéndolas de forma operativa a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar a un huésped unicelular apropiado. Dicha unión operativa de una secuencia de ADN de la presente invención a una secuencia de control de la expresión, por supuesto, incluye, si no forma ya parte de la secuencia de ADN, la disposición de un codón de iniciación, ATG, en el marco de lectura correcto cadena arriba de la secuencia de ADN.

Cualquiera de una amplia diversidad de secuencias de control de la expresión - secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN unida de forma operativa a ésta - puede usarse en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano o tardío de virus SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las principales regiones operadora y promotora del fago \lambda, las regiones de control de la proteína de la envuelta fd, el promotor para 3-fosfo-glicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasa ácida (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de emparejamiento a de levadura, y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.

Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de la expresión y huéspedes funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN. Ni todos los huéspedes funcionarán igual de bien con los mismos sistemas de expresión. Sin embargo, un experto en la materia será capaz de seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresión, y huéspedes apropiados sin mucha experimentación para conseguir la expresión deseada sin alejarse del alcance de la presente invención. Por ejemplo, al seleccionar un vector, hay que considerar el huésped puesto que el vector debe funcional en él. El número de copias del vector, la capacidad de controlar este número de copias, y la expresión de cualesquiera otras proteínas codificadas por el vector, tales como marcadores de antibióticos, también se considerarán.

Al seleccionar una secuencia de control de la expresión, normalmente se considerarán diversos factores. Estos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa del sistema, su controlabilidad y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen particular a expresar, particularmente con respecto a potenciales estructuras secundarias. Los huéspedes unicelulares adecuados se seleccionarán considerando, por ejemplo, su compatibilidad con el vector seleccionado, sus características de secreción, su capacidad para plegar proteínas correctamente y sus requisitos de fragmentación, así como la toxicidad para el huésped del producto codificado por las secuencias de ADN a expresar, y la facilidad de purificación de los productos de expresión. Considerando estos y otros factores, un experto en la materia será capaz de construir diversas combinaciones de vector/secuencia de control de la expresión/huésped que expresarán las secuencias de ADN que codifican los componentes de la presente invención en fermentación o en un cultivo animal a gran escala.

En algunas realizaciones, también se contempla que los segmentos de ácido nucleico descritos en este documento se usarán para transfectar células huésped apropiadas. La tecnología para la introducción de ADN en células es bien conocida por los expertos en la materia. Se han descrito cuatro métodos generales para administrar un segmento nucleico al interior de células: (1) métodos químicos (Graham y VanDerEb, Virology, 54 (2): 536-539, 1973); métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell, 22(2): 479-488, 30 1980), electroporación (Wong y Neuman, Biochim Biophys Res Commun, 107(2): 584-587, 1982; Fromm y col., Proc Natl Acad Sci USA, 82(17): 5824-5828, 1985) y la pistola génica (Yang y col., Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4144-4148, 1990); (3) vectores virales (Eglitis y Anderson, Bio/techniques, 6(7): 608-614, 1988); y (4) mecanismos mediados por receptor (Wagner, y col., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13): 6099-6103, 1992).

Las secuencias de ADN que codifican MSCRAMM pueden prepararse sintéticamente o clonarse. La secuencia de ADN puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos de MSCRAMM. En general, se seleccionarán codones preferidos para el huésped pretendido si la secuencia va a usarse para la expresión. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleótidos solapantes preparados mediante métodos convencionales y ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair y col., Science, 223: 1299 (1984); Jay y col., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).

Las secuencias de ADN sintéticas permiten la construcción conveniente de genes que expresarán análogos de MSCRAMM. Como alternativa, puede prepararse ADN que codifica análogos mediante mutagénesis dirigida de genes o ADNc nativos de MSCRAMM, y pueden prepararse análogos directamente usando síntesis polipeptídica convencional. Un método general para la incorporación específica en un punto de aminoácidos no naturales en proteínas se describe en Noren y col., Science. 244: 182-188 (abril de 1989). Este método puede usarse para crear análogos con aminoácidos no naturales.

XII. Oligonucleótidos antisentido y ribozimas

La preparación de oligonucleótidos antisentido y ribozimas puede usarse para interferir con la expresión del MSCRAMM a nivel traduccional. Este enfoque utiliza ácido nucleico antisentido y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm específico, enmascarando el ARNm con un ácido nucleico antisentido o escindiéndolo con una ribozima.

Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a al menos una parte de una molécula de ARNm específica. En la célula, hibridan con ese ARNm específico, formando una molécula de cadena doble. La célula no traduce un ARNm en esta forma de cadena doble. Por lo tanto, los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la expresión de ARNm en proteínas. Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y moléculas que hibridan con el codón de iniciación AUG serán particularmente eficaces, puesto que son fáciles de sintetizar y es más probable que planteen menos problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en células que producen MSCRAMM. Se han usado métodos antisentido para inhibir la expresión de muchos genes in vitro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor y col., 1988).

Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad de escindir específicamente otras moléculas de ARN de cadena sencilla de manera en parte análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. Las ribozimas se descubrieron a partir de la observación de que ciertos ARNm tienen la capacidad de escindir sus propios intrones. Modificando la secuencia de nucleótidos de estos ARN, los investigadores han sido capaces de diseñar moléculas que reconocen secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ARN y escindirlas (Cech, 1988.). Puesto que son específicas de secuencia, solamente se inactivan ARNm con secuencias particulares.

Los investigadores han identificado dos tipos de ribozimas, el tipo Tetrahymena y de tipo "cabeza de martillo". (Hasselhoff y Gerlach, Nature, 334(6183): 585-591, 1988) Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases, mientras que las de tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de once a dieciocho bases. Cuando más larga sea la secuencia de reconocimiento, más probable es que se encuentre exclusivamente en las especies de ARNm diana. Por lo tanto, las ribozimas de tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena para inactivar una especie de ARNm específica, y las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases son preferibles a secuencias de reconocimiento más cortas.

Las secuencias de ADN descritas en este documento pueden usarse por lo tanto para preparar moléculas antisentido contra, y ribozimas que escinden, ARNm para MSCRAMM y sus ligandos.

XIII. Composiciones farmacéuticas

Se proporciona una composición farmacéutica que comprende las proteínas de unión, los péptidos, los anticuerpos, o los ácidos nucleicos como se ha descrito anteriormente opcionalmente en combinación con componentes bacterianos, en un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para tratar infección por S. aureus. Las composiciones se usan habitualmente en la preparación de una formulación de inmunización que opcionalmente incluye un adyuvante y otros aditivos habituales. Las composiciones también pueden comprender kits de diagnóstico como se describen en este documento.

Métodos para preparar composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos, análogos o fragmentos activos como ingredientes activos se entienden bien en el sector. Habitualmente, dichas composiciones se preparan en forma de inyectables, en forma de soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El ingrediente terapéutico activo se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH que mejoran la eficacia del ingrediente activo.

Un polipéptido, análogo o fragmento activo puede formularse en la composición terapéutica en forma de sales farmacéuticamente aceptables neutralizadas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres del polipéptido o molécula de anticuerpo) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Las composiciones terapéuticas que contienen el polipéptido, análogo o fragmento activo se administran convencionalmente por vía intravenosa, como mediante inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para seres humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido; es decir, portador, o vehículo.

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Las composiciones se administran de manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado de inhibición o neutralización de la capacidad de unión a MSCRAMM deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que es necesario administrar dependen del juicio del médico y son características para cada individuo. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas pueden variar de aproximadamente 0,1 a 20, preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10, y más preferentemente de uno a varios, miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo por día y depende de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración inicial y dosis de refuerzo también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una hora o más mediante una posterior inyección u otra administración. Como alternativa, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones de diez nanomolar a diez micromolar en la sangre.

Las composiciones terapéuticas pueden incluir además una cantidad eficaz de MSCRAMM/ antagonista de MSCRAMM o análogo del mismo, y uno o más de los siguientes ingredientes activos: un antibiótico, un esteroide.

La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como ingredientes activos generalmente se comprende bien en el sector, como ejemplifican las Patentes de Estados Unidos Nº 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770. Habitualmente, dichas vacunas se preparan como inyectables, en forma de soluciones o suspensiones líquidas, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El ingrediente activo inmunogénico se mezcla a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores de pH, o adyuvantes que mejoran la eficacia de la
vacuna.

La preparación de dichas composiciones que están esencialmente libres de endotoxina puede conseguirse siguiendo la metodología publicada, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.271.147 describe métodos para la preparación de proteínas de membrana de Neisseria meningitidis para uso en vacunas.

Las composiciones inmunológicas, tales como vacunas, y otras composiciones farmacéuticas pueden usarse en solitario o en combinación con otros agentes bloqueantes para proteger contra infecciones humanas y animales causadas por bacterias estafilocócicas tales como S. aureus. En particular, las composiciones pueden usarse para proteger a seres humanos contra endocarditis o para proteger a seres humanos o rumiantes contra mastitis causada por infecciones estafilocócicas. La vacuna también puede usarse para proteger animales cánidos y équidos contra infecciones estafilocócicas similares.

Para potenciar la inmunogenicidad, las proteínas pueden conjugarse a una molécula portadora. Los portadores inmunogénicos adecuados incluyen proteínas, polipéptidos o péptidos tales como albúmina, hemocianina, tiroglobulina y derivados de las mismas, particularmente albúmina de suero bovino (BSA) y hemocianina de lapa californiana (KLH), polisacáridos, carbohidratos, polímeros y fases sólidas. Otras sustancias obtenidas de proteínas o no obtenidas de proteínas son conocidas por los expertos en la materia. Un portador inmunogénico habitualmente tiene un peso molecular de al menos 1.000 daltons, preferentemente mayor de 10.000 daltons. Las moléculas portadoras a menudo contienen un grupo reactivo para facilitar la conjugación covalente al hapteno. El grupo ácido carboxílico o el grupo amina de los aminoácidos o el grupo azúcar de las glicoproteínas a menudo se usan de esta manera. Los portadores que carecen de dichos grupos a menudo pueden hacerse reaccionar con un compuesto químico apropiado para producirlos. Preferentemente, una respuesta inmune se produce cuando el inmunógeno se inyecta en animales tales como ratones, conejos, ratas, cabras, ovejas, cobayas, pollos, y otros animales, lo más preferentemente ratones y conejos. Como alternativa, un péptido antigénico múltiple que comprende múltiples copias de la proteína o polipéptido, o un polipéptido antigénica o inmunológicamente equivalente puede ser lo suficientemente antigénico para mejorar la inmunogenicidad sin el uso de un portador.

La proteína o proteínas de MSCRAMM puede administrarse con un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la respuesta inmunogénica contra el conjugado. En este momento, el único adyuvante usado ampliamente en seres humanos ha sido alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio). La Saponina y su componente purificado Quil A, Adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes usados en investigación y en aplicaciones veterinarias tienen toxicidades que limitan su uso potencial en vacunas humanas. Sin embargo, preparaciones químicamente definidas tales como muramil dipéptido, monofosforil lípido A, conjugados de fosfolípidos tales como los descritos por Goodman-Snitkoff y col. (J. Immunol. 147: 410-415, 1991) encapsulación del conjugado en el interior de un proteoliposoma según lo descrito por Miller y col., (J. Exp. Med. 176: 1739-1744, 1992) e incorporado como referencia en este documento, y encapsulación de la proteína en vesículas lipídicas tales como vesículas lipídicas Novasome^{TM} (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH) también pueden ser útiles.

En algunas realizaciones, los inventores contemplaban el uso de liposomas y/o nanocápsulas para la introducción de péptidos o segmentos de ácido nucleico particulares en células huésped. En particular, los péptidos maloniltirosilo y fosfotirosilo de la presente invención pueden formularse para administración en solución con DMSO o encapsulados en liposomas.

Dichas formulaciones pueden preferirse para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos, péptidos y/o anticuerpos descritas en este documento. La formación y uso de liposomas es conocida generalmente por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Couvreur y col, FEBS Lett, 84: 323-326, 1977; y Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 5: 1-20, 1988 que describe el uso de liposomas y nanocápsulas en la terapia de antibiótico dirigido de infecciones y enfermedades bacterianas intracelulares). Recientemente, se desarrollaron liposomas con una estabilidad en suero y semi-vidas en circulación mejorados (Gabizon y Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA, 85: 6949-6953, 1988; Allen y Choun, FEBS Lett, 223: 42-46, 1987).

Los liposomas se han usado con éxito con varios tipos celulares que normalmente son resistentes a la transfección mediante otros procedimientos incluyendo suspensiones de células T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Muller y col., DNA Cell Biol, 9(3): 221-229, 1990). Además, los liposomas están libres de las restricciones de longitud del ADN que son típicas de los sistemas de administración basados en virus. Los liposomas se han usado eficazmente para introducir genes, fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción y efectores alostéricos en diversas líneas celulares animales cultivadas. Además, se han completado varios ensayos clínicos con éxito que examinaban la eficacia de administración de fármacos mediada por liposomas (Lopez-Berestein y col, Cancer Drug Review, 2(3): 183-189, 1985; Sculier y col, Eur J Cancer Clin Oncol, 24(3): 527-538, 1988). Además, varios estudios sugieren que el uso de liposomas no está asociado con respuestas autoinmunes, toxicidad o localización gonadal después de la administración sistémica (Mori y Fukatsu, Epilepsia, 33(6): 994-1000, 1992).

Los liposomas están formados por fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas concéntricas multilamelares (también llamadas vesículas multilamelares (MLV). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 micrómetros. La sonicación de MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen una solución acuosa en el núcleo.

Los liposomas tienen muchas semejanzas a las membranas celulares y se contempla su uso junto con la presente invención como portadores para las composiciones peptídicas. Son muy adecuados, puesto que pueden atraparse sustancias solubles en agua y en lípidos, es decir, en los espacios acuosos y dentro de la propia bicapa, respectivamente. Es posible que los liposomas portadores de fármacos puedan emplearse incluso para la administración en un sitio específico de agentes activos modificando selectivamente la formulación liposomal.

Además de las enseñanzas de Couvreur y col. (FEBS Lett, 84: 323-326,1977; y Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 5: 1-20, 1988), puede utilizarse la siguiente información para generar formulaciones liposomales. Los fosfolípidos pueden formar diversas estructuras diferentes a liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido con respecto a agua. A proporciones bajas el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera marcadamente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio de una estructura ordenada y empaquetada de forma próxima, conocida como el estado en gel, a una estructura menos ordenada empaquetada de forma más suelta, conocida como el estado fluido. Esto produce a una temperatura de transición de fase característica un aumento de permeabilidad a iones, azúcares y fármacos.

Además de la temperatura, la exposición a proteínas puede alterar la permeabilidad de liposomas. Algunas proteínas solubles tales como el citocromo C se unen, deforman y penetran en la bicapa, causando de este modo cambios de permeabilidad. El colesterol inhibe esta penetración de proteínas, aparentemente empaquetando a los fosfolípidos de forma más compacta. Se contempla que las formaciones de liposoma más útiles para administración de antibiótico e inhibidor contendrán colesterol.

La capacidad para atrapar solutos varía entre diferentes tipos de liposomas. Por ejemplo, las MLV son moderadamente eficaces para atrapar solutos, pero las SUV son extremadamente ineficaces. Las SUV ofrecen la ventaja de homogeneidad y reproducibilidad en la distribución de tamaño, sin embargo, y las vesículas unilamelares grandes (LUV) ofrecen un compromiso entre el tamaño y la eficacia de atrapamiento. Éstas se preparan mediante evaporación y son de tres a cuatro veces más eficaces para atrapar solutos que las MLV.

Además de las características del liposoma, un determinante importante en el atrapamiento de compuestos son las propiedades fisicoquímicas del propio compuesto. Los compuestos polares son atrapados en los espacios acuosos y los compuestos no polares se unen a la bicapa lipídica de la vesícula. Los compuestos polares se liberan a través de permeación o cuando la bicapa se rompe, pero los compuestos no polares permanecen afiliados con la bicapa a menos que esta se rompa mediante temperatura o exposición a lipoproteínas. Ambos tipos muestran velocidades máximas de salida a la temperatura de transición de fase.

Los liposomas inteactúan con células mediante cuatro mecanismos diferentes: Endocitosis por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial tales como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, mediante fuerzas hidrofóbicas o electrostáticas débiles no específicas, o mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana plasmática mediante inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con liberación simultánea del contenido liposomal en el citoplasma; y mediante transferencia de lípidos liposomales a membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación del contenido del liposoma. A menudo es difícil determinar qué mecanismo es operativo y más de uno pueden operar al mismo tiempo.

El destino y la disposición de liposomas inyectados por vía intravenosa dependen de sus propiedades físicas, tales como tamaño, fluidez y carga superficial. Pueden persistir en tejidos durante horas o días, dependiendo de su composición, y las semi-vidas en sangre varían desde minutos a varias horas. Los liposomas más grandes, tales como MLV y LUV, son captados rápidamente por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial; pero la fisiología del sistema circulatorio impide la salida de dichas grandes especies en la mayoría de los puntos. Estos pueden salir solamente en lugares en los que existan grandes aberturas o poros en el endotelio capilar, tales como los sinusoides del hígado o bazo. Por lo tanto, estos órganos son el punto predominante de captación. Por otro lado, las SUV muestran una distribución en tejido más amplia pero siguen siendo altamente secuestrados en el hígado y bazo. En general, este comportamiento in vivo limita la potencial dirección de liposomas a solamente aquellos órganos y tejidos accesibles a su gran tamaño. Estos incluyen la sangre, hígado, bazo, médula ósea y órganos linfoides.

La dirección generalmente no es una limitación en términos de la presente invención. Sin embargo, si se desea una dirección específica, están disponibles métodos para conseguir esto. Pueden usarse anticuerpos para unirse a la superficie del liposoma y para dirigir el anticuerpo y su contenido de fármaco a receptores antigénicos específicos situados en la superficie de un tipo celular particular. También pueden usarse determinantes de carbohidratos (componentes de la superficie celular de glicoproteínas o glicolípidos que juegan un papel en el reconocimiento, interacción y adhesión célula a célula) como puntos de reconocimiento puesto que tienen un potencial para dirigir liposomas a tipos celulares particulares. Principalmente, se contempla que la inyección intravenosa de preparaciones liposomales se usaría, pero también pueden preverse otras vías de administración.

Las nanocápsulas pueden atrapar generalmente compuestos de manera estable y reproducible (Henry-Michelland y col, Int J. Pharm, 35: 121-127, 1987). Para evitar efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1 micrómetros) deben diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Nanopartículas de polialquilcianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención, y dichas partículas pueden prepararse fácilmente, según lo descrito por Couvreur y col, (supra, 1977 y 1988).

Los métodos de administración adecuados incluyen, aunque sin limitación, administración tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica.

Para administración tópica, la composición se formula en forma de una pomada, crema, gel, loción, gotas (tales como gotas oculares o gotas para el oído), o soluciones (tales como enjuagues bucales). Vendajes para heridas o quirúrgicos, suturas y aerosoles pueden impregnarse con la composición. La composición puede contener aditivos convencionales, tales como conservantes, disolventes para promover la penetración y emolientes. Las formulaciones tópicas también pueden contener portadores convencionales tales como bases de crema o pomada, etanol, o alcohol oleílico.

Una vacuna se envasa en una dosificación única para inmunización mediante administración parenteral (es decir, intramuscular, intradérmica o subcutánea) o administración nasofaríngea (es decir, intranasal). La vacuna se inyecta lo más preferentemente por vía intramuscular en el músculo deltoide. La vacuna se combina preferentemente con un portador farmacéuticamente aceptable para facilitar la administración. El portador es habitualmente agua o una solución salina tamponada, con o sin un conservante. La vacuna puede liofilizarse para resuspensión en el momento de la administración o en solución.

El portador al que puede conjugarse la proteína también puede ser un sistema polimérico de liberación retardada. Los polímeros sintéticos son particularmente útiles en la formulación de una vacuna para realizar la liberación controlada de antígenos. Por ejemplo, la polimerización de metacrilato de metilo en esferas que tienen diámetros de menos de un micrómetro ha sido descrita por Kreuter, J., Microcapsules And Nanoparticles In Medicine And Pharmacology, M. Donbrow (Ed). CRC Press, p. 125-148.

La microencapsulación de la proteína también dará una liberación controlada. Varios factores contribuyen a la selección de un polímero particular para microencapsulación. La reproducibilidad de la síntesis polimérica y del proceso de microencapsulación, el coste de los materiales y proceso de microencapsulación, el perfil toxicológico, los requisitos para cinéticas de liberación variables y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y los antígenos son todos factores que deben considerarse. Son ejemplos de polímeros útiles policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres poliamidas, poli (d,l-lacturo-co-glicólido) (PLGA) y otros polímeros biodegradables. El uso de PLGA para la liberación controlada de antígenos es revisado por Eldridge, J.H., y col. Current Topics In Microbiology And Immunology, 146: 59-66 (1989).

La dosis preferida para administración al ser humano es de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 1 mg/kg. A partir de este intervalo, pueden determinarse dosificaciones equivalentes para mayores pesos corporales. La dosis debe ajustarse para adecuarse al individuo al que se administra la composición y variará con la edad, peso y metabolismo del individuo. La vacuna puede contener adicionalmente estabilizantes tales como timerosal (sal sódica de mercurio etil(2-mercaptobenzoato-S)) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) o conservantes fisiológicamente aceptables.

XIV Kits

También se describe un kit que comprende un anticuerpo anti-MSCRAMM o un antígeno de MSCRAMM para la detección y diagnóstico de infecciones causadas o exacerbadas por bacterias estafilocócicas tales como S. aureus o S. epidermidis. El kit preferido contiene suficiente anticuerpo para unirse sustancialmente a todo el antígeno en la muestra en aproximadamente diez minutos o menos, o el suficiente antígeno para unirse a anticuerpos para MSCRAMM. El anticuerpo o antígeno puede inmovilizarse en un soporte sólido, y puede marcarse con un agente detectable, como se ha descrito anteriormente. El kit contiene opcionalmente un medio para detectar el agente detectable. Si el anticuerpo o antígeno está marcado con un fluorócromo o marca radiactiva, habitualmente no se proporcionarán medios para detectar el agente, puesto que se espera que el usuario tenga un espectrofotómetro, contador de centelleo o microscopio apropiado. Si el agente detectable es una enzima, puede proporcionarse un medio para detectar el agente detectable con el kit, e incluiría habitualmente un sustrato para la enzima en cantidad suficiente para detectar todo el complejo antígeno-anticuerpo. Un medio preferido para detectar un agente detectable es un sustrato que es convertido por una enzima en un producto coloreado. Un ejemplo común es el uso de la enzima peroxidasa de rábano picante con 2,2'-azino-di-[3-etil-benzotiazolina sulfonato] (ABTS).

El kit puede contener opcionalmente un agente de lisado que lisa las células presentes en la muestra de fluido corporal. Los agentes de lisado incluyen tensioactivos tales como Tween-80, Nonidet P40, y Triton X-100. Preferentemente, el agente de lisado se inmoviliza en el soporte sólido junto con el anticuerpo.

El kit también puede contener una solución tampón para lavar el sustrato entre las fases. La solución tampón es habitualmente una solución fisiológica tal como tampón fosfato, solución salina fisiológica, tampón citrato o tampón Tris.

El kit puede incluir opcionalmente diferentes concentraciones de un antígeno preformado para calibrar el ensayo. El kit puede contener adicionalmente una representación visual o numérica de cantidades de antígeno en un ensayo patrón calibrado para propósitos de referencia. Por ejemplo, si se usa un ensayo que produce un producto coloreado, puede incluirse una hoja que proporcione una representación de intensidades en aumento asociadas con diferentes cantidades de antígeno.

El kit puede incluir opcionalmente dos anticuerpos en el sistema de detección. El primer anticuerpo que está presente en pequeñas cantidades es específico para el antígeno que está siendo evaluado. El segundo anticuerpo proporcionado en mayores cantidades se usa para detectar al primer anticuerpo. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo de conejo para detectar el antígeno LOOH/amina, y a continuación puede usarse un anticuerpo anti-IgG de conejo para detectar el anticuerpo de conejo unido. También se usan habitualmente anticuerpos y anti-anticuerpos de
cabra.

Como ejemplo no limitante, se proporciona un kit para la detección del estado de peroxidación lipídica de un paciente que incluye un anticuerpo de conejo específico para el anticuerpo deseado, anticuerpo anti-IgG de conejo en cantidades suficientes para detectar al primer anticuerpo unido, una enzima conjugada al segundo anticuerpo y un sustrato para la enzima que cambia de color al ser expuesto a la enzima. Además, puede prepararse un kit usando uno o más antígenos de MSCRAMM tales como el dominio M55 de la proteína de unión a colágeno y la proteína de unión a fibrinógeno ClfA, y este kit permitirá la detección de muestras con anticuerpos para MSCRAMM de unión a colágeno y de unión a fibrinógeno.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la presente invención. Los expertos en la materia deben entender que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas que los inventores han descubierto que funcionan bien en la puesta en práctica de la invención, y por lo tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su puesta en práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deben, a la luz de la presente descripción, entender que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen.

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Ejemplo 1 Preparación de Protovacuna de MSCRAMM de Cuatro Componentes

Una serie de proteínas recombinantes, que representan dominios de los MSCRAMM de unión a colágeno, Fn, y Fbg (Figura 1), se sobreexpresaron en E. coli y se purificaron por afinidad mediante cromatografía de metal quelante como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Joh y col., Biochemistry. 33 (20): 6086-6092, 1994; Patti y col., J. Biol. Chem. 270, 12005-12011, 1995; McDevitt y col., Mol. Micro. 11 (2): 237-248, 1994; Ni Eidhin y col., Infect. Immun. Submitted, 1998). Se usó lo siguiente: aminoácidos contenidos en los MSCRAMM de unión a colágeno recombinante expresados a partir de cna (M55); aminoácidos contenidos en los MSCRAMM de unión a fibrinógeno recombinante expresados a partir de clfA (pCF40); aminoácidos contenidos en los MSCRAMM de unión a fibrinógeno recombinante expresados a partir de clfB (Región A); y aminoácidos contenidos en los MSCRAMM de unión a fibronectina recombinante (DUD4, tales como los descritos en la Solicitud de Estados Unidos pendiente de tramitación Nº de serie 09/010.317, incorporada en este documento como referencia). La proteína de MSCRAMM de unión a FN DUD4 se trató con formalina (formalina al 5% durante una noche, 4ºC) antes de combinarla con la M55, Región A de ClfA, y Región A de ClfB.

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Ejemplo 2 Ejemplo de cultivo de cepas de E. coli para la producción de proteínas recombinantes

Cultivos durante una noche de células JM101 o TOP de E. coli (Stratagene) que alojaban a los plásmidos recombinantes se diluyeron a 1:50 en 1 l de caldo Luria Broth (Gibco BRL) que contenía 50 mg/ml de ampicilina. Las células de E. coli se cultivaron hasta que el cultivo alcanzó una DO_{600} de 0,5-0,8. La expresión de las proteínas recombinantes se indujo añadiendo IPTG a una concentración final de 0,2 mM. Después de un periodo de inducción de tres horas, se recogieron las células mediante centrifugado, se resuspendieron en 15 ml de Tampón A (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9) y se lisaron mediante el paso a través de una Prensa francesa dos veces a 20.000 libras/pulgada^{2}. Los restos celulares se retiraron mediante centrifugado a 50.000 X g durante 10 minutos y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,45 mM.

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Ejemplo 3 Purificación de proteínas recombinantes que contienen HIS_{6} expresadas a partir de plásmidos recombinantes basados en pQE-30 (Qiagen®; Qiagen Inc., Chatsworth, CA) o PV-4

Las proteínas recombinantes se purificaron mediante cromatografía de metal quelante inmovilizado, usando una columna de ácido iminodiacético/Sepharose® 6B Fast Flow (Sigma, St. Louis, MO) cargada con Ni^{2+}; (Porath y col. 1975; Hochuli y col. 1988). Las proteínas marcadas con HIS_{6} se purificaron mediante cromatografía de afinidad por metal quelante inmovilizado. Más específicamente, una columna que contenía ácido iminodiacético Sepharose® 6B FF, conectada a un sistema FPLC® (Pharmacia), se cargó con Ni^{++} 150 mM y se equilibró con tampón A (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,9). Después del equilibrado, el sobrenadante bacteriano se aplicó a la columna y la columna se lavó con 10 volúmenes de lecho de tampón A. Posteriormente, la columna se eluyó con tampón B (imidazol 200 mM, NaCl 0,5 M, Tris 20 mM, pH 7,9). Se supervisó la proteína en el eluato mediante la absorbancia a 280 nm y las fracciones pico se analizaron mediante SDS-PAGE. Se retiró la endotoxina de las proteínas recombinantes purificadas mediante extracción con detergente con Triton X-114 al 1% seguido de cromatografía de afinidad por metal quelante y paso a través de una columna de polimixcina B-sepharose. El nivel de endotoxina se cuantificó usando un ensayo cromogénico de lisado de Amebocitos de Limulus (Bio Whittaker, Walkersville, MD).

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Ejemplo 4 Inmunización de Animales con Vacuna de MSCRAMM de Cuatro Componentes Mscramm IV Macacos de la India

100 mg de M55 (1 EU/mg), ClfA (2,5 EU/mg), ClfB (<1,0 EU/mg), y DUD4 (<10 EU/mg) se mezclaron conjuntamente para formar la vacuna de MSCRAMM IV. El cóctel se mezcló con TiterMax^{TM} Gold (CytRX, Norcross, GA) en una proporción 1:1. Dos Macacos de la India hembras, ID#495Z & 664U (\sim9,4 kg), fueron vacunados por vía intramuscular (IM) en el cuadriceps de la pata trasera con 200 \mul de la vacuna. Veintiocho días después, a los dos monos se les administró un refuerzo IM con 200 \mul de la misma formulación de vacuna. Dos monos hembra adicionales, ID#215W & 203U (\sim8,0 kg), fueron inmunizados con el MSCRAMM IV que se mezcló en una proporción 1:1 con hidróxido de aluminio (Alhidrogel al 2%; Superfos, Dinamarca). Veintiocho días después los dos monos recibieron un refuerzo IM de 200 \mul de la misma formulación de vacuna.

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El régimen clínico seguido se describe a continuación.

2

Los 4 animales experimentaron seroconversión después de la inmunización inicial. Niveles de anticuerpo >3 veces por encima del fondo podían detectarse mediante ELISA 106 días después de la vacunación primaria. Los cuatro animales recibían otra inmunización de refuerzo en la 21ª semana del estudio. A cada animal se le administraba un refuerzo de cuatro inyecciones subcutáneas de 125 \mul de la vacuna para un refuerzo total de 600 \mul de la vacuna. Niveles de anticuerpo al menos 3 veces por encima del fondo, y como máximo de 15 veces por encima del fondo, podían detectarse mediante ELISA 189 días después de la vacunación primaria. Véase la Figura 2. No se detectaron reacciones adversas en el punto de la inyección mediante observación directa por parte de veterinarios. Además, los perfiles enzimáticos del hígado, hemograma, y perfiles de hematología estaban dentro del intervalo normal para los Macacos de la India.

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Ejemplo 5 Análisis de muestras de plasma de los monos vacunados se analizaron mediante ELISA

Placas de microvaloración Immulon-2 (Dynex Technologies, Chantilly, VA) se recubrieron durante una noche a 4ºC con 10 \mug/ml (50 \mul) del MSCRAMM de unión a colágeno (M55), MSCRAMM de unión a fibrinógeno (clfA; pCF44), MSCRAMM de unión a fibrinógeno (ClfB; Región A), y el MSCRAMM de unión a fibronectina (DUD4). Cincuenta microlitros de las muestras de plasma diluidas se añadieron a los pocillos recubiertos con MSCRAMM y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Tampón de lavado que consistía en PBS que contenía Tween-20 al 0,05% vol/vol, una solución bloqueante de BSA al 1% p/vol, tween-20 al 0,05% en PBS, y tampón de dilución de anticuerpos que consiste en PBS que contenía BSA al 0,1%, Tween-20 al 0.05%. La incubación con anticuerpos primario y secundario era durante 60 minutos a 25ºC. El anticuerpo secundario era inmunoglobulina G de cabra anti-mono conjugada con fosfatasa alcalina, (Rockland, Gilbertsville, PA), diluida 3500 veces en tampón de dilución de anticuerpos. Se revelaron placas de ELISA durante 30 minutos a 37ºC con 1 mg/ml de p-nitrofenil fosfato (Sigma) en dietanolamina 1 M, MgCl_{2} 0,5 mM, pH 9,8, y se cuantificaron a 405 nm en un lector HTS 7000 Bio-Assay de Perkin Elmer. Cada muestra de plasma se diluyó 100 veces en solución salina tamponada con fosfato, que contenía Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,1%, pH 7,4. Los datos del ELISA se muestran en la Figura 2.

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Ejemplo 6 Ensayos de Inhibición

La cepa 601 de S. aureus resistente a meticilina (Smeltzer, M. S., Gene. 196: 249-159, 1997) se cultivó en agitación constante durante 15 h a 37ºC en caldo BHI. Se preparó una dilución de 1:100 del cultivo durante una noche en BHI y las bacterias se cultivaron a 37ºC hasta una fase exponencial media. Las bacterias se recogieron mediante centrifugado, se lavaron tres veces en PBS estéril, pH 7,4, y a continuación se resuspendieron en un tampón de carbonato (NaHCO_{3} 50 mM, pH 8,5). Las bacterias se mezclaron con 1 mg/ml de FITC (Sigma; F-7250) en NaHCO_{3} 50 mM, pH 8,5 y se incubaron en un agitador tipo noria en la oscuridad 1 h a 25ºC. La reacción de marcado con FITC se interrumpió mediante centrifugado de las células bacterianas y retirando el sobrenadante que contenía el FITC que no reaccionó. Las bacterias marcadas se lavaron tres veces en PBS para retirar el FITC no incorporado, se resuspendieron en PBS, se ajustaron a \sim1 X 10^{8} cfu/ml y se almacenaron a -20ºC en PBS, pH 7,4.

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Ejemplo 7 Purificación de IgG de Monos Inmunizados

Se purificó IgG a partir del plasma de mono mediante cromatografía de afinidad en resina de alta capacidad PROSEP®-A (Bioprocessing Inc., Princeton, NJ). En resumen, el plasma se descongeló y se pasó a través de un filtro de 0,45 \mu. El plasma se aplicó a una columna portátil que contenía resina de alta capacidad PROSEP®-A. El material no unido se retiró lavando la columna exhaustivamente con PBS. La IgG se eluyó de la columna con citrato sódico 0,1 M, pH 3,0. El pH de la IgG eluída se neutralizaba inmediatamente a pH 6,8-7,4 mediante la adición de Tris 1 M, pH 9,0. A continuación se dializó la IgG en PBS, pH 7,4, se concentró y se filtró en un filtro esterilizado. La concentración de la IgG purificada se determinó mediante absorbancia a 280 nm.

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Ejemplo 8 ELISA de Inhibición Competitiva

Placas con fondo negro de 96 pocillos de Costar se recubrieron durante una noche a 4ºC o a temperatura ambiente durante 2 h con una solución de 10 mg/ml de componentes de la matriz que consistía en colágeno bovino, fibrinógeno humano y fibronectina bovina en PBS, pH 7,4. Las placas recubiertas con proteína de la matriz se lavaron tres veces con PBS, Tween 20 al 0,05% y después se bloquearon con PBS, BSA al 1%. Las placas bloqueadas se lavaron tres veces con PBS, Tween 20 al 0,05%. Una alícuota de 500 \mul de células de S. aureus marcadas con FITC se mezclaron con una cantidad en aumento de IgG de mono purificada en PBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,1%. Las células marcadas y la IgG se mezclaron en un agitador de tipo noria durante 1 h a 25ºC. Cincuenta \mul de la mezcla de células marcadas/IgG se añadieron a cada pocillo en la placa de microvaloración y se incubaron a 25ºC en una plataforma agitadora. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS, Tween 20 al 0,05%. La cantidad de bacterias unidas a las proteínas de la matriz inmovilizadas se determinó en un lector HTS 7000 Bio-Assay de Perkin Elmer con el filtro de excitación ajustado a 485 nm y el filtro de emisión ajustado a 535 nm.

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Ejemplo 9 Modelo Animal de Sepsis

Usando un modelo de sepsis en ratón (Bremell, T. A., y col., Infect. Immun. 62 (7): 2976-2985, 1992) hemos demostrado que la inmunización pasiva con IgG purificada de Macacos de la India inmunizados con el MSCRAMM IV puede proteger a ratones contra muerte inducida por sepsis. Se inmunizaron ratones NMRI macho que no habían experimentado tratamiento previo de 5-8 semanas i.p. el día -1 con 20 mg de IgG purificada de Macacos de la India inmunizados con MSCRAMM IV (n = 12), o IgG de Macacos de la India no inmunizados (n = 13). El día 0, los ratones se expusieron i.v. con 2,4 x 10^{7} CFU/ratón de la cepa LS-1 de S. aureus. La mortalidad y el cambio de peso se supervisaron en los 3 días siguientes. Tres días después de la inoculación 3/13 ratones (13%) estaban muertos en el grupo de control, en comparación con 0/12 ratones (0%) en el grupo de control. La mortalidad en el grupo de control el día 13 era del 53,8% (7/13) en comparación con solamente el 16,2% (2/12) para el grupo inmunizado pasivamente con MSCRAMM IV. Los ratones de control mostraban un descenso significativo de su peso corporal en comparación con los ratones inmunizados pasivamente con IgG de MSCRAMM IV (28,0 \pm 2,5% vs 21,3 \pm 3,1%; p<0,01).

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Ejemplo 10 Vacunas multicomponentes Que Contienen M55 (MSCRAMM de unión a Colágeno) y ClfA (MSCRAMM de unión a Fibrinógeno)

Sesenta ratones hembra Swiss Webster recibieron un total de 50 \mug de ovoalbúmina, M55 (MSCRAMM de unión a colágeno) o una combinación de proteínas M55 y ClfA (MSCRAMM de unión a fibrinógeno) mediante una inyección subcutánea. La inyección primaria se preparó emulsionando los antígenos en Adyuvante completo de Freund. Los ratones recibieron una segunda inyección de 25 \mug de proteína total en Adyuvante Incompleto de Freund 14 días después de la inyección primaria. Se administró una inyección final de 25 \mug de proteína total en PBS 28 días después de la inyección primaria. Se obtuvieron muestras posteriores a la extracción de sangre de todos los ratones dos semanas después de la inyección final para determinar los valores cuantitativos de anticuerpo contra las diferentes proteínas de MSCRAMM. A continuación se expusieron los ratones (42 días después de la inyección primaria) mediante una única inyección intravenosa con 1,2 X 10^{8} CFU de S. aureus 601. El día 5 después de la exposición, se sacrificaron los ratones y se recogieron sus riñones. A continuación se homogeneizaron los riñones y se colocaron en placas de agar sangre. Las placas se incubaron a 37ºC durante una noche y se determinó la carga bacteriana en los riñones mediante recuentos de colonias. Los resultados del experimento mostraban una diferencia de dos log en la carga bacteriana entre el grupo de ovoalbúmina (7,03 \pm 0,93 log CFU/g) y el grupo de M55/ClfA (4,83 \pm 3,04 log CFU/g, p = 0,006). También se observó una diferencia de carga bacteriana en el grupo de M55 (5,86 \pm 3,42 log CFU/g, p = 0,003) en comparación con el grupo de ovoalbúmina.

La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede proporcionar inmunidad por anticuerpos o inmunidad celular tal como la producida por linfocitos T tales como linfocitos T citotóxicos o Linfocitos T CD4+.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 9708210 W [0024] [0095]

\bullet WO 8505553 A [0081]

\bullet US 5320951 A [0082]

\bullet US 5571514 A, Hook [0082]

\bullet US 5175096 A, Hook [0083]

\bullet US 5652217 A [0084]

\bullet US 5440014 A [0085]

\bullet US 5189015 A [0086]

\bullet US 5416021 A [0087]

\bullet US 9801222 W [0088]

\bullet WO 9207002 A [0091]

\bullet US 9703106 W [0107] [0110]

\bullet US 5648240 A [0111]

\bullet US 4554101 A [0129] [0130]

\bullet US 5440013 A, Kahn [0135]

\bullet US 4341761 A [0150]

\bullet US 4399121 A [0150]

\bullet US 4427783 A [0150]

\bullet US 4444887 A [0150]

\bullet US 4451570 A [0150]

\bullet US 4466917 A [0150]

\bullet US 4472500 A [0150]

\bullet US 4491632 A [0150]

\bullet US 4493890 A [0150]

\bullet US 4946778 A [0153]

\bullet US 5693762 A [0171]

\bullet US 5565332 A [0172] [0173] [0173]

\bullet US 4816567 A [0172]

\bullet US 4867973 A [0172]

\bullet US 4608251 A [0206]

\bullet US 4601903 A [0206]

\bullet US 4599231 A [0206]

\bullet US 4599230 A [0206]

\bullet US 4596792 A [0206]

\bullet US 4578770 A [0206]

\bullet US 4271147 A [0207]

\bullet US 010317 A [0237]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

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Claims (6)

1. Composición que consiste esencialmente en:

i) Proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a colágeno M55; y

ii) Proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A.

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2. Composición que consiste esencialmente en:

i) Proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a colágeno M55;

ii) Proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A;

iii) Proteína ClfB de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A; y

iv) Proteína FnBPA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a fibronectina DUD4.

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3. Composición que consiste esencialmente en:

i) ácido nucleico que codifica la proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a colágeno M55; y

ii) ácido nucleico que codifica la proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A.

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4. Composición que consiste esencialmente en:

i) ácido nucleico que codifica la proteína CNA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a colágeno M55;

ii) ácido nucleico que codifica la proteína ClfA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A;

iii) ácido nucleico que codifica la proteína ClfB de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a fibrinógeno de la Región A; y

iv) ácido nucleico que codifica la proteína FnBPA de Staphylococcus aureus, o un fragmento de la misma, que comprende el dominio de unión a fibronectina DUD4.

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5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para inhibir la colonización microbiana de un animal.

6. Vacuna que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.