ES2322704T3 - Procedimiento de deteccion de la prp utilizando un antibiotico de los aminoglicosidos del grupo ii. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección de la PrP, en particular de la PrP sc , caracterizado porque se pone en presencia un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano con un antibiótico elegido entre la familia de los aminoglicósidos del grupo II.
Description
Procedimiento de detección de la PrP utilizando
un antibiótico de los aminoglicósidos del grupo II.
La presente invención se refiere a un método de
precipitación total de PrP^{sc} con sulfato de estreptomicina y
su utilización para la inmunodetección o la eliminación de la
PrP^{sc} de líquidos o de soluciones.
La proteína prión nativa o normal, designada PrP
o PrP^{c} para la proteína prión celular, es una glicoproteína
ampliamente expresada en las células linfoides y neuronales de los
mamíferos.
Cambios conformacionales de PrP^{c} conducen a
la aparición y a la propagación de la proteína patógena PrP^{sc}
que es resistente a la proteinasa K. Esta proteína patógena puede
denominarse PrP^{sc} o PrP^{res} indiferentemente. La
acumulación de PrP^{sc} en los órganos de los animales está en el
origen de numerosas enfermedades y principalmente de la tembladera
de los pequeños rumiantes, de la enfermedad caquetizante crónica (o
chronic wasting disease "CWD" en inglés) del alce y el
antílope, de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y de la
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ) en el ser
humano.
La aparición tardía después de un período de
incubación de 2 a 6 años y el desarrollo lento de los síntomas en
el ganado infectado por la EEB ha ralentizado el desarrollo de
modelos epidemiológicos. La ESB es transmisible por ingestión en el
ser humano y a conducido a la aparición de una nueva forma de
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ).
La detección de la proteína patógena PrP^{sc}
es difícil en los animales infectados sanos antes del desarrollo de
la enfermedad y sobre todo en la sangre y la orina de los animales
enfermos. En la actualidad se ha establecido que la PrP^{sc}
presente en los animales destinados a la alimentación humana se
transmite en el ser humano durante la ingestión de los tejidos
infectados. Un objetivo mayor de salud pública es por lo tanto
evitar esta transmisión al detectar la PrP^{sc} en animales
destinados al consumo humano con vista a retirarlos de la cadena
alimentaria.
La detección de la presencia de PrP^{sc} en
muestras biológicas o en animales se vuelve por lo tanto de extrema
importancia y varios equipos de investigadores desarrollan métodos
de detecciones inmunológicas (WO02/086511). Además, métodos para
complejar péptidos a la PrP^{sc}, pequeñas moléculas o inhibidores
en vista del tratamiento de vECJ son objeto de investigaciones
activas. Sin embargo, los métodos en el estado de la técnica se
chocan sin parar con la dificultad de identificar la PrP^{sc} de
manera fiable cuando está en baja cantidad en una muestra
biológica.
Los inventores han puesto en evidencia una nueva
propiedad de aminoglicósidos, y principalmente aminoglicósidos del
grupo II y más particularmente de la estreptomicina, y han
demostrado la capacidad de estos antibióticos para complejarse con
la PrP^{sc} y hacerla precipitar.
Los inventores han observado así que la adición
de un aminoglicósido del grupo II, y más particularmente la
estreptomicina, en una muestra biológica que proviene de diversos
orígenes animales y que contiene priones tiene como consecuencia
hacer aumentar la masa molecular aparente de las 3 bandas de los
priones. Esta observación y los experimentos que han seguido les
han permitido demostrar que los aminoglicósidos del grupo II se
complejan con la PrP^{sc} y que esta complejación tiene como
consecuencia precipitar la PrP^{sc} y aumentar considerablemente
las posibilidades de detección de la PrP^{sc} con respecto a los
métodos clásicamente empleados por el experto en la técnica.
La presente invención tiene por lo tanto por
objetivo un procedimiento de concentración para precipitación de la
PrP^{sc} a utilizar durante el diagnóstico de las enfermedades
debidas a los priones o por eliminación de los priones presentes en
un líquido biológico y caracterizado porque se pone en presencia una
suspensión del tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de
un organismo animal o humano con un antibiótico preferentemente
elegido dentro de la familia de los aminoglicósidos del grupo II y
preferentemente la estreptomicina.
Más precisamente, el procedimiento según la
invención comprende las etapas siguientes:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, un aminoglicósido del grupo II,
- b)
- se sitúa la solución en un tampón adecuado, y se somete a un calentamiento, luego se centrífuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- c)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
El procedimiento de la invención puede
comprender igualmente una etapa suplementaria de digestión de la
muestra a valorar con una proteinasa y principalmente la proteinasa
K. Así, el procedimiento de la invención comprende las etapas
siguientes:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o de un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, la proteinasa, por ejemplo la proteinasa K,
- b)
- se pone un aminoglicósido del grupo II,
- c)
- se sitúa la suspensión en un tampón adecuado, y se somete a un calentamiento, luego se centrífuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- d)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
Más precisamente, el procedimiento de la
invención comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparación de una suspensión al 10% por homogeneización del fluido biológico o del tejido obtenido de organismo animal o humano en 5% de solución de glucosa,
- b)
- se añade, a los 100 \mul de la suspensión obtenida, la proteinasa K luego se incuba a 37ºC durante una hora,
- c)
- se añade, a la suspensión, un aminoglicósido del grupo II luego se incuba una segunda hora a 37ºC,
- d)
- se sitúa la suspensión en un tampón adecuado, y se somete a un calentamiento, luego se centrífuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- e)
- se suspende el precipitado en 50 \mul de una solución de 50% v/v de urea 8M y del tampón Laemmli desnaturalizado como describe Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685. Después de una agitación vortex vigorosa, se calienta 5 mn a 100ºC, se centrifuga a 12000 g y se recuperan los líquidos sobrenadantes para hacerlos migrar sobre SDS PAGE,
- f)
- después de migración sobre un gel de electroforesis, principalmente una electroforesis unidimensional sobre gel de poliacrilamida dodecil-sulfato al 15% (SDS PAGE) como describe Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685, las proteínas se transfieren por electroforesis sobre membranas de nitrocelulosas y son inmunoelectrotransferidas a temperatura ambiente durante 60 minutos con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope específico constituido por aminoácidos 126-160. El anticuerpo secundario (1/5000) es un anticuerpo de cabra dirigido contra las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de ratones conjugadas a la peroxidasa de rábano (IgG H+L); los borrones se lavan luego y las señales se detectan por quimioluminiscencia bien con un kit ECL (Amersham) sobre películas (Biomex light, Kodak) o con un super Signal Ultra (Pierce) y visualización sobre Fluor S. Multimager (BioRad).
El procedimiento de la invención presenta la
ventaja de no necesitar ultracentrifugación. El procedimiento de la
invención se refiere igualmente a la complejación del aminoglicósido
del grupo II con las proteínas del prión y la precipitación de las
proteínas del prión por dicho aminoglicósido.
Siguiendo un modo de realización de la
invención, el tejido biológico deriva o se obtiene a partir de un
cerebro o de otro tejido animal o humano, o de un fluido biológico
tal como líquido cefalorraquídeo o suero.
La proteinasa utilizada en el procedimiento
según la invención es una proteinasa elegida por su capacidad para
digerir las proteínas presentes que incluye las formas normales de
la proteína del prión, y por su incapacidad para digerir las formas
patológicas de esta proteína. Ventajosamente, se trata de la
proteinasa K.
Según un procedimiento de la realización
preferido de la invención, el tejido previamente a ponerlo en
contacto con dicho aminoglicósido del grupo II, se homogeneiza en
una solución de glucosa. Preferentemente, se trata de una solución
de glucosa al 5%.
La etapa de calentamiento después de haber
añadido 100 \mul del tampón Laemmli a la suspensión que resulta
de poner en contacto la muestra biológica con la proteinasa K y el
aminoglicósido del grupo II, corresponde a un aumento de
temperatura comprendido entre 60 y 150ºC, preferentemente
aproximadamente 100ºC.
Siguiendo un modo de realización preferido de la
invención, el aminoglicósido del grupo II es la estreptomicina o
uno de sus derivados.
La invención tiene igualmente por objetivo la
utilización de tal aminoglicósido del grupo II para la
precipitación, la detección incluso en detección por
inmunohistoquímica y/o el diagnóstico de la PrP^{sc}.
La invención tiene también por objetivo la
utilización de tal aminoglicósido del grupo II para la eliminación
del PrP^{sc} de un fluido biológico.
Finalmente, la invención se refiere igualmente a
la utilización de un kit de diagnóstico de las patologías ligadas a
la presencia de PrP^{sc}, caracterizado porque comprende tal
aminoglicósido del grupo II.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen que se
refieren a la amplificación de la detección de la PrP^{sc} cuando
la muestra biológica se pone en presencia de un aminoglicósido del
grupo II.
Se hará referencia en estos ejemplos a los
dibujos en anexo en los que:
\bullet la figura 1A es un ejemplo comparativo
de la detección después de electroforesis sobre gel de
poliacrilamida al 15%, transferencia e inmunodetección, de
PrP^{sc} en una muestra de cerebro de cordero alcanzado la
tembladera y puesto en presencia de cantidades cada vez más
importantes de estreptomicina;
\bullet la figura 1B es un gráfico de
comparación del peso molecular medio medido de cada banda PrP^{sc}
de la figura 1B antes y después de la mezcla con cantidades
crecientes de estreptomicina;
\bullet la figura 2 es un ejemplo comparativo
de la detección después de electroforesis sobre gel de
poliacrilamida al 15%, transferencia e inmunodetección, de
PrP^{sc}, respectivamente en el líquido sobrenadante y en los
precipitados, obtenidos derivados de la segunda hora de incubación
de una suspensión muy rica en proteína PrP^{sc} en ausencia y
presencia de una cantidad variable de estreptomicina;
\bullet la figura 3 muestra la adición al
mismo tiempo de la proteinasa K y de estreptomicina a una
suspensión
que contiene una baja cantidad de la PrP^{sc}
tiene como consecuencia la desaparición de la PrP^{sc} del
líquido sobrenadante y su aparición en los precipitados;
\bullet las figuras 4A, 4B y 4C muestran,
después de electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 15%,
transferencia e inmunodepresión, el aumento del umbral de detección
de la PrP^{sc} durante la adición de cantidades crecientes de
estreptomicina;
\bullet la tabla de la figura 5 se refiere al
ejemplo 5 y presenta una comparación de los resultados del
diagnóstico de la PrP^{sc} sobre 97 cerebros de animales
obtenidos por la técnica según la invención con aquellos obtenidos
por la técnica de referencia;
\bullet la figura 6 muestra imágenes en
microscopía de sonda de barrido (también denominado SPM por sus
siglas en inglés) en modo sin contacto para películas secadas de la
proteína prión recombinante (recPrP) sola (A), de recPrP en
presencia de estreptomicina (B) y de estreptomicina sola (C);
\bullet la figura 7A es un ejemplo comparativo
de la detección después de electroforesis sobre gel al 12% de
bis-tris acrilamida, transferencia e
inmunodetección, de la proteína prión en muestras de líquido
cefalorraquídeo (LCR) de pacientes alcanzados por la enfermedad de
Creutzfeld-JaKob (ECJ+) y de pacientes no alcanzados
por la ECJ (EJC-) tratados con una gama de estreptomicina. La tabla
7B resume los depósitos efectuados en las pistas de la figura
7A;
\bullet la figura 8A muestra los resultados de
un western blot, de muestras de LCR(+) y de LCR (-) a la EJC
digeridos o no por la proteinasa K según una gama de concentración
y tratados o no con la estreptomicina. La revelación inmunológica
se asegura con un anticuerpo anti-prión. La tabla 8B
resume los depósitos efectuados en las pistas de la figura 8A.
Las muestras biológicas sobre las que los
ejemplos 2 y 3 descritos a continuación se realizaron se obtuvieron
a partir de homogeneizado de cerebro bovino situado en una solución
de glucosa al 5%. Se utilizaron volúmenes de 100 \mul de esta
suspensión, que corresponde a 10 mg de tejido cerebral, se
utilizaron para los experimentos que siguen. Cada muestra está
constituida por lo tanto por 100 \mul, en los que se añade
proteinasa K. Después de una hora a 37ºC se añade o no
estreptomicina. La solución se agita bajo vortex y se incuba a 37ºC
durante otra hora. Después de añadir 100 \mul de tampón Laemmli
desnaturalizado, se calienta a 100ºC durante 5 mn y se centrifuga a
12000 g durante 5 minutos, luego se recuperan los líquidos
sobrenadantes para hacerlos migrar sobre SDS-PAGE.
Los precipitados se recuperan igualmente y se les añade 50 \mul de
una solución al 50% v/v de urea 8M y el tampón de laemmli. Después
de una agitación vigorosa bajo vortex, se calienta a 100ºC durante
5 mn y se centrifuga a 12000 g durante 5 minutos, luego se recuperan
los líquidos sobrenadantes para hacerlos migrar sobre
SDS-PAGE.
Ejemplo
1
El ejemplo 1 se refiere a las figuras 1A y 1B
relativas a los ensayos en los que se añadieron concentraciones
crecientes (0 \mug; 62,5 \mug; 125 \mug; 500 \mug y 2000
\mug) de estreptomicina a cantidades constantes de la PrP^{sc}
extraída del equivalente de 920 \mug de cerebro de un cordero
alcanzado de tembladera luego la mezcla se centrifugó. El líquido
sobrenadante se utilizó para la detección inmunológica por Western
Blot (figura 1A) y la medida de la masa molecular media de las
bandas de PrP^{sc} (figura 1B). Los resultados muestran que el
incremento de la cantidad de estreptomicina, a saber una adición de
0; 62,5, 125, 500, 1000 y 2000 \mug permite constatar que a las
concentraciones más bajas de estreptomicina, la banda de proteína
no glicosidada es la primera en mostrar un aumento de la masa
molecular aparente. Luego, la complejación se refiere a la banda de
la proteína mono-glicosidada y finalmente la
proteína bi-glicosidada se compleja cuando la
concentración de estreptomicina es la más importante.
El número de moléculas de estreptomicina ligadas
a cada una de las bandas de PrP^{sc} a una concentración dada se
evaluó midiendo el peso molecular de cada banda. Los inventores han
estimado que el aumento del peso molecular aparente de cada una de
las bandas de PrP^{sc} en presencia de 2000 \mug de
estreptomicina corresponde al acoplamiento de 10 a 12 moléculas de
estreptomicina por banda de PrP^{sc}.
Ejemplo
2
El ejemplo 2 se refiere a la figura 2 relativa a
los ensayos en los que se añadieron concentraciones
crecientes
(0 \mul; 5 \mul; 10 \mul; 20 \mul) de estreptomicina a 1 g/ml a cantidades constantes de muestra biológica preparada como se ha indicado anteriormente. En ausencia de estreptomicina, todas las bandas de PrP^{sc} se identificaron como que estaban en el líquido sobrenadante. Y progresivamente, serán detectadas simultáneamente en el precipitado y en el líquido sobrenadante. La cantidad de PrP^{sc} presente en el líquido sobrenadante disminuye progresivamente mientras que la cantidad aumenta progresivamente en los precipitados. La adición de 20 \mul de estreptomicina precipitó totalmente el PrP^{sc} que entonces solo se detectó en los precipitados.
(0 \mul; 5 \mul; 10 \mul; 20 \mul) de estreptomicina a 1 g/ml a cantidades constantes de muestra biológica preparada como se ha indicado anteriormente. En ausencia de estreptomicina, todas las bandas de PrP^{sc} se identificaron como que estaban en el líquido sobrenadante. Y progresivamente, serán detectadas simultáneamente en el precipitado y en el líquido sobrenadante. La cantidad de PrP^{sc} presente en el líquido sobrenadante disminuye progresivamente mientras que la cantidad aumenta progresivamente en los precipitados. La adición de 20 \mul de estreptomicina precipitó totalmente el PrP^{sc} que entonces solo se detectó en los precipitados.
Ejemplo
3
El ejemplo 3 se refiere a la figura 3.
Se repitió el experimento del ejemplo 2 pero con
la misma muestra de cerebro diluido al 1/25 con respecto al ejemplo
2 y disminuyendo el período de incubación a una hora después de la
adición simultánea de la proteinasa K y la estreptomicina a las
suspensiones de cerebro. El resultado es que solo se detectaron
bandas de PrP^{sc} en el líquido sobrenadante en ausencia de
estreptomicina y en el precipitado en presencia de cualquier
concentración de estreptomicina.
Ejemplo
4
El ejemplo 4 se refiere a las figuras 4A, 4B y
4C.
A partir de una dilución madre de 1:2 en serie
de un homogeneizado al 10% de cerebro bovino infectado con EEB en
una solución de glucosa al 5% se prepararon 3 juegos de tubos que
contenían cada uno 100 \mul de la misma dilución.
A cada tubo del primer juego de dilución (de
puro a 1/64) se añadieron 1 \mug de proteinasa K en un volumen
de
10 \mul.
10 \mul.
A cada tubo del segundo juego (de 1/2 a 1/256)
se añadieron simultáneamente 5 \mul de estreptomicina y 1 \mug
de proteinasa K en un volumen de 10 \mul.
A cada tubo del tercer juego (de 1/2 a 1/256) se
añadieron simultáneamente 10 \mul de estreptomicina y 1 \mug de
proteinasa K en un volumen de 10 \mul.
Todos los tubos se incubaron a 37ºC durante una
hora luego se añadieron 100 \mul de tampón Laemmli
desnaturalizado. Se calentó a 100ºC durante cinco minutos se
centrifugó a 12000 g durante 5 minutos, y se recuperaron los
líquidos sobrenadantes del primer juego de tubos por deposición
sobre SDS-PAGE. Los líquidos sobrenadantes de los
tubos del segundo y tercer juego de tubos se eliminaron y se
añadieron en cada tubo 50 \mul de urea 8M al 50% v/v y del tampón
Laemmli desnaturalizado. Después de una agitación vortex vigorosa,
se calentó 5 mn a 100ºC, se centrifugó a 12000 g y se recuperaron
los líquidos sobrenadantes para los segundos y tercer juego de
tubos,
La figura 4A muestra que el límite de detección
de PrP^{sc} detectado en ausencia de estreptomicina está en
1/16.
La figura 4B muestra la cantidad de PrP^{sc}
precipitada en presencia de 5 \mul de estreptomicina: la
PrP^{sc} se detectó hasta la dilución 1/128, lo que muestra un
umbral de detección ampliamente aumentado.
La figura 4C muestra la cantidad de PrP^{sc}
precipitada en presencia de 10 \mul de estreptomicina: la figura
4C muestra que incluso sobre las muestras más diluidas (1/256), la
detección es posible y es representativa.
Ejemplo
5
Ejemplo
comparativo
La técnica de referencia está basada en la
extracción de la PrP^{sc} a partir de 1,2 ml de homogeneizado
cerebral (Madec et al., Microbial Pathogenesis, 28 (2000)
353-362). Los homogeneizados se forzaron a través
de una aguja de diámetro 0,4 mm antes de ser tratados durante una
hora a 37ºC con 10 \mug de proteinasa K por 100 mg de tejido
cerebral. Después de haber añadido sarkosyl (10%) y 10 mM de tampón
Tris (pH 7,4), las muestras se incubaron durante 15 mn a
temperatura ambiente luego se centrifugaron a 245,000 g durante 4
horas a 20ºC sobre un cojín de sacarosa al 10% (Beckman TL 100
ultracentrífuga). El precipitado se volvió a poner finalmente en
suspensión en
50 \mul de tampón desnaturalizado Laemmli calentado durante 5 mn a 100ºC y se centrifugó todavía durante 5 mn a 12000 g. Se recuperaron los líquidos sobrenadantes para migración sobre SDS PAGE.
50 \mul de tampón desnaturalizado Laemmli calentado durante 5 mn a 100ºC y se centrifugó todavía durante 5 mn a 12000 g. Se recuperaron los líquidos sobrenadantes para migración sobre SDS PAGE.
Según la técnica de la invención, se utilizaron
100 \mul de suspensión cerebral obtenida después de trituración
del cerebro descrito en la técnica de referencia. Se añadieron 1
\mug de proteinasa K y se incubaron una primera vez durante una
hora. Se añadieron luego 20 \mug de estreptomicina K y se
incubaron una segunda vez durante una hora. Se añadieron luego 100
\mul de tampón desnaturalizado Laemmli. Después de 5 mn de
calentamiento a 100ºC, se centrifugó 2 mn a 12000 g. Se eliminaron
los líquidos sobrenadantes, luego se añadieron 50 \mul de 50% v/v
de urea 8M y del tampón desnaturalizado Laemmli. Después de una
agitación vortex vigorosa, se calentó 5 mn a 100ºC y se centrifugó
todavía durante 2 mn a 12000 g. Se recuperaron los líquidos
sobrenadantes para la migración sobre SDS PAGE.
Los resultados presentes en la tabla 1: en
conclusión, la utilización de sulfato de estreptomicina permite una
mejor detección de casos bajamente positivos y además permite evitar
una ultracentrifugación larga y costosa.
Ejemplo
6
Se prepararon muestras de recPrP (proteína prión
recombinante) diluyendo una solución de recPrP (42 \muM) con un
volumen equivalente de agua o con una solución de estreptomicina (1
g/ml); la referencia para la estreptomicina sola se preparó
utilizando una solución de 0,5 g/ml.
Las muestras se prepararon por deposición de 10
\mul de estas soluciones sobre mica recientemente clivada y
secado durante 24 horas a 37ºC.
Se efectuó un análisis por imagen por medio de
un Thermomicroscope Explorer AFM equipado con un escáner trípode
100 \mum, en modo sin contacto, utilizando frecuencias de
resonancia elevadas (F_{0} = 320 kHz) de viga flexible piramidal
con sondas de silicona con una frecuencia de barrido de 1 Hz. El
tratamiento de las imágenes se realizó con el programa informático
SPMlab 5.1 y se presenta no filtrado.
Se concluye de la figura 6 que la imágenes de
recPrP solas muestran una estructura de agregados circulares
característicos. Las películas de estreptomicina sola muestran una
organización de superficie pseudo-cristalina. Las
películas que contienen la mezcla muestran una superficie amorfa: no
se constata ninguna organización cristalina o globular. La
interacción entre la estreptomicina y la PrP inhibe por lo tanto las
propiedades de organización de superficie de los dos componentes de
la mezcla.
Ejemplo
7
Se tomaron muestras de extracciones
post-mortem de líquido cefalorraquídeo (LCR)
preferentemente no hemolizados y sin deshechos celulares en
pacientes no alcanzados por la EJC y en pacientes alcanzados por la
EJC. Se pusieron en contacto una muestra de LCR de paciente no
alcanzado por la ECJ y una muestra de LCR de paciente alcanzado por
la ECJ con una solución de estreptomicina, según una gama de
concentración comprendida entre 0,05 g/mL y 0,2 g/mL (0,05 - 0,1 y
0,2 g/mL). Después de homogeneización con vortex, las muestras se
incubaron durante 1 hora a 37ºC luego se centrifugaron durante 5
minutos a 12000 g.
Los precipitados obtenidos se retomaron con
tampón de extracción proteica. Después de calentamiento a 100ºC
durante 10 minutos, las muestras se centrifugaron de nuevo durante 5
minutos a 12000 g. 15 \muL de cada líquido sobrenadante se
depositaron sobre gel SDS-PAGE (iniciales del inglés
de electroforesis en gel de poliacrilamida en dodecilsulfato
sódico) 12% bis-tris acrilamida. En paralelo, se
depositaron 5 \muL de un extracto de PrP^{sc} cerebral diluido
al 1/100 en el tampón de desnaturalización como control positivo.
Este extracto se preparó según el protocolo de referencia utilizado
para el diagnóstico de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob. La migración electroforética se
realizó con voltaje constante (220 V) durante 40 minutos en tampón
de migración 1 vez concentrado. Las proteínas se transfirieron
luego sobre una membrana de PVDF activada por sistema
semi-seco entre dos electrodos de grafito, durante
1 hora a potencia constante (1 W). La revelación inmunológica
directa se aseguró entonces por el anticuerpo
anti-prión AC23 (que reconoce la región definida por
los aminoácidos 145-154 de la PrP humana y las
regiones homólogas de PrP animales) a 0,5 \mug/ml acoplada a la
peroxidasa de rábano.
La figura 7A muestra que la estreptomicina se
une bien a la proteína prión en ausencia de digestión por la
proteína K. En efecto, después de tratamiento con la estreptomicina
a 0,1 g/mL y 0,2 g/mL, solo se observó una banda y su peso
molecular aparente se desplazó de una manera proporcional a la
concentración de estreptomicina. El tamaño aparente de esta banda
es de aproximadamente 50 kDa para 0,1 g/mL de estreptomicina y
aproximadamente de 80 kDa para
0,2 g/mL de estreptomicina. Además, el perfil de la banda (aspecto no curvado, arrastre) sugiere una agregación molecular.
0,2 g/mL de estreptomicina. Además, el perfil de la banda (aspecto no curvado, arrastre) sugiere una agregación molecular.
Ejemplo
8
Un LCR de paciente no alcanzado por la ECJ y un
LCR de paciente alcanzado para la ECJ son digeridos por la
proteinasa K, utilizada a 0,5 \mug/mL o 1 \mug/mL. En paralelo,
una alícuota de cada muestra no se sometió a digestión por la
proteinasa K. La digestión se realizó a 37ºC durante 1 hora bajo
agitación suave. Después de la digestión, las muestras se incubaron
durante 1 hora a 37ºC en presencia de estreptomicina a 50 mg/mL de
concentración final, luego se procedió a una centrifugación durante
5 minutos a 12000 g.
Las proteínas se extrajeron luego y se
desnaturalizaron por calentamiento en presencia de tampón de
desnaturalización proteica luego se analizaron en western blot
conforme al protocolo del ejemplo 7. La revelación inmunológica
directa se realizó con ayuda del anticuerpo AC23 (utilizado a 0,5
\mug/ml) acoplado a la peroxidasa de rábano.
\newpage
La figura 8A muestra que una banda única, de
baja intensidad, se observa cuando la muestra se trató con
estreptomicina. Esta banda, de aproximadamente 35 kDa de masa
molecular aparente, es visible para la muestra negativa únicamente
en ausencia de digestión por la proteinasa K (pista 5 del gel LCR
(-)) mientras que es visible para la muestra positiva cualquiera
que sea la concentración de proteinasa K utilizada (pistas 5, 6 y 7
del gel LCR (+)), característico de la forma resistente de la
proteína prión.
La detección de la proteína prión en el LCR se
hace posible por la utilización de la estreptomicina. En efecto, en
ausencia de digestión por la proteinasa K, la detección de la PrP
total (celular o patológica) se amplifica en presencia de
estreptomicina y, de manera inesperada, la PrP^{sc} se detecta
preferentemente. Después de digestión por la proteinasa K, esta
tecnología permite poner en evidencia una señal significativamente
diferente entre los LCR derivados de pacientes no alcanzados por el
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y los LCR
derivados de pacientes alcanzados por esta misma enfermedad. La
estreptomicina presenta por lo tanto un interés para la detección
de la PrP^{res} en los fluidos biológicos.
Además, los aminoglicósidos tal como la
estreptomicina pueden utilizarse para la eliminación de la
PrP^{sc} por el hecho de la precipitación de la PrP^{sc}
después de contacto con los aminoglicósidos.
Claims (12)
1. Procedimiento de detección de la PrP, en
particular de la PrP^{sc}, caracterizado porque se pone en
presencia un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un
organismo animal o humano con un antibiótico elegido entre la
familia de los aminoglicósidos del grupo II.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, un aminoglicósido del grupo II,
- b)
- se sitúa la solución en un tampón adecuado, y se la somete a un calentamiento, luego se centrifuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- c)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, proteinasa K,
- b)
- se pone un aminoglicósido del grupo II,
- c)
- se sitúa la suspensión en un tampón adecuado, y se la somete a un calentamiento, luego se centrifuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- d)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho tejido
biológico deriva o se obtiene de un cerebro u otro tejido animal o
humano.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque dicha proteinasa
es una proteinasa K.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el tejido o el
fluido biológico, previamente a ponerse en contacto con dicho
aminoglicósido, se homogeneiza en una solución de glucosa.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa de
calentamiento corresponde a un aumento de temperatura comprendido
entre 60 y 150ºC.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho
aminoglicósido del grupo II es la estreptomicina.
9. Utilización de un aminoglicósido del grupo II
para la precipitación, la detección y/o el diagnóstico de la
PrP^{sc} incluso durante la detección en inmunohistoquímica.
10. Utilización in vitro de un
aminoglicósido del grupo II para la eliminación de la PrP^{sc} de
un tejido o de un fluido biológico.
11. Utilización de un kit que comprende un
aminoglicósido del grupo II para el diagnóstico de patologías
ligadas a la presencia de la PrP^{sc} como la tembladera de los
pequeños rumiantes, la enfermedad caquetizante crónica del alce y
del antílope, la encefalopatía espongiforme bovina y la enfermedad
de Creutzfeldt-Jacob.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho aminoglicósido del grupo II es la
estreptomicina.
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