ES2322796T3 - Un procedimiento de anclaje extendido para la identificacion rapida de ligandos. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento que comprende: (i) proporcionar una molécula biológica diana (MBD) que contiene o modificada para que contenga un nucleófilo reactivo cerca de un primer sitio de interés en la MBD; (ii) poner en contacto la MBD de (i) con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas en presencia de un extensor molecular pequeño (EMP) bifuncional que tiene un primer y un segundo grupo funcional, en el que el primer grupo funcional del EMP forma un enlace covalente reversible con el nucleófilo en la MBD, y el segundo grupo funcional del EMP forma un enlace covalente reversible con un grupo funcional en un miembro de dicha biblioteca para formar un complejo de MBD-EMP-miembro de la biblioteca reversible, y (iii) identificar el miembro de la biblioteca de (ii).

Description

Un procedimiento de anclaje extendido para la identificación rápida de ligandos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a un procedimiento para la identificación y caracterización rápida de parejas de unión a una molécula diana, y para proporcionar parejas de unión modificadas con mejor afinidad de unión. Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento de anclaje para la identificación rápida de fragmentos de moléculas pequeñas que se unen cerca unos de otros en una molécula diana. El procedimiento es particularmente adecuado para la identificación rápida de ligandos moleculares pequeños que se unen de forma débil cerca de sitios de interés por un conector preformado en una molécula biológica diana (MBD), tal como un polipéptido u otra macromolécula, para producir compuestos de mayor afinidad.

Descripción de la técnica relacionada

El procedimiento de descubrimiento de fármacos normalmente empieza con un cribado masivo de bibliotecas de compuestos (normalmente cientos de miles de miembros) para identificar compuestos candidatos con afinidad modesta (K_{d} \sim 1 a 10 \muM). Aunque algunas dianas son adecuadas para este procedimiento de cribado, la mayoría son problemáticas porque los compuestos candidato con afinidad moderada son difíciles de obtener. La identificación y posterior optimización de compuestos de unión más débil mejoraría la tasa de éxito, pero el cribado con concentraciones altas generalmente no se puede hacer debido a la insolubilidad del compuesto y los artefactos del ensayo. Además, el procedimiento de cribado típico no se dirige a sitios específicos para el diseño de fármacos, solo a los sitios para los que está disponible un ensayo de alto rendimiento. Finalmente, muchos procedimientos de cribado tradicionales se basan en ensayos de inhibición que a menudo están sujetos a artefactos causados por especies químicas reactivas o desnaturalizantes.

Erlanson y col., Proc. Nat. Acad Sci. USA 97:9367-9372 (2000), recientemente han descrito una nueva estrategia, llamada "anclaje" ("tethering" en inglés), para identificar de forma rápida y fiable fragmentos de fármaco pequeños solubles (\sim250 Da) que se unen con baja afinidad a un sitio diana específico en una proteína u otra macromolécula, usando un "conector" disulfuro intermedio. De acuerdo con este procedimiento, se deja reaccionar una biblioteca de moléculas que contienen disulfuro con una proteína diana que contiene cisteína en condiciones parcialmente reductoras que promueven el intercambio de tiol rápido. Si una molécula tiene incluso afinidad débil por la proteína diana, el enlace disulfuro ("conector") que une la molécula a la proteína diana será estabilizado entrópicamente. Después, los fragmentos disulfuro-conector se pueden identificar por una variedad de procedimientos, incluyendo la espectrometría de masas (EM), y mejorar su afinidad por procedimientos tradicionales tras la separación del conector disulfuro. Véase también, la publicación PCT, nº WO 00/00823, publicada el 6 de enero, 2000.

Aunque el procedimiento de anclaje de Erlanson y col. representa un avance significativo en la identificación rápida de ligandos pequeños con baja afinidad, y es una herramienta poderosa para generar compuestos candidatos de fármaco, se necesita mejorar más los procedimientos para facilitar el diseño racional de los candidatos de fármaco.

Resumen de la invención

La presente invención describe una estrategia para identificar de forma rápida y fiable ligandos que tienen una afinidad de unión intrínseca por diferentes sitios en una molécula diana, usando un procedimiento de formación de conector extendido. Este procedimiento se basa en el diseño de un extensor molecular pequeño (EMP) que forma conector, por un enlace covalente reversible, con una molécula biológica diana (MBD) en o cerca de un primer sitio de interés, y tiene un grupo químicamente reactivo que es reactivo con moléculas orgánicas pequeñas que se van a cribar por su afinidad a un segundo sitio de interés en la MBD. Por consiguiente, el EMP se usa para cribar una pluralidad de candidatos de ligando para identificar un ligando que tiene afinidad de unión intrínseca por un segundo sitio de interés en la MBD. Si se desea, se pueden diseñar más EMP basándose en la identificación del ligando con afinidad de unión por el segundo sitio de interés, y se puede repetir el cribado para identificar más ligandos que tengan afinidad de unión intrínseca por el mismo u otro(s) sitio(s) de interés en la misma MBD o similares.

Un aspecto de la invención se refiere al diseño del extensor molecular pequeño (EMP). En este aspecto, la invención se refiere a un procedimiento que comprende las etapas como en la reivindicación 1.

En una realización preferida, el grupo reactivo en la MBD es un nucleófilo, preferiblemente un grupo tiol, tiol protegido, disulfuro reversible, hidroxilo, hidroxilo protegido, amino, amino protegido, carboxilo o carboxilo protegido, y los grupos funcionales primeros preferidos en el EMP son grupos capaces de dar adiciones de tipo SN2 o formar aductos de tipo Michael con el nucleófilo.

En una realización de la invención, el EMP se diseña para que contenga un primer grupo funcional que forma un primer enlace covalente reversible con el nucleófilo o electrófilo en la MBD. El grupo reactivo en la MBD preferiblemente es un nucleófilo. El enlace covalente reversible preferiblemente es un enlace disulfuro que se forma con un tiol, tiol protegido, o enlace disulfuro reversible en la MBD. Los EMP diseñados de esta forma, después se ponen en contacto con la MBD, poniendo en contacto simultáneamente la MBD con una pluralidad de segundos candidatos de ligando orgánicos pequeños, teniendo cada candidato de ligando orgánico pequeño un grupo tiol libre, tiol protegido, o un grupo disulfuro reversible, en condiciones de intercambio de tiol, en el que un candidato de ligando que tiene afinidad por el segundo sitio de interés en la MBD forma un enlace disulfuro con el complejo de MBD-EMP, de modo que se identifica un segundo ligando. El procedimiento se puede realizar en presencia de un agente reductor de disulfuro, tal como mecaptoetanol, ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), ácido mercaptopropanoico, glutatión, cistamina, cisteína, tri(carboxietil)fosfina (TCEP) y tris(cianoetil)fosfina.

En una realización particular, el EMP se diseña basándose en la selección de una molécula orgánica pequeña que tiene un tiol o tiol protegido (monóforo disulfuro) de una biblioteca de dichas moléculas mediante una molécula biológica diana (MBD) que tiene un tiol en o cerca de un sitio de interés.

En una realización alternativa, el extensor molecular pequeño (EMP) de la etapa (iii) se diseña para contener un primer grupo funcional que forma un primer enlace disulfuro reversible con el tiol en la MBD. Los EMD diseñados de esta forma, después se ponen en contacto con la MBD, simultáneamente poniendo en contacto la MBD con una segunda biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula orgánica pequeña un tiol libre o un grupo disulfuro reversible, en condiciones de intercambio de tiol, en condiciones en las que el miembro de la segunda biblioteca que tiene afinidad, preferiblemente la mayor afinidad, por un segundo sitio de interés en la MBD (segundo ligando) forma un enlace disulfuro con el complejo de MBD-EMP.

El procedimiento se puede llevar a cabo en presencia de un agente reductor de disulfuro, tales como los listados antes.

La determinación de la afinidad de un candidato de ligando (miembro de la biblioteca) por un primer o segundo sitio de interés en la MBD, se puede llevar a cabo por competición entre diferentes miembros de la biblioteca en un grupo, o por comparación (es decir, valoración) con un agente reductor, tal como los listados antes.

En una realización particular, los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo con una biblioteca en la que cada miembro forma un enlace disulfuro. Un ejemplo de dicha biblioteca es una en la que cada miembro forma un disulfuro cistamina. Cuando los miembros de la biblioteca forman disulfuros, una relación molar preferida de agente de reducción a disulfuros totales es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1 y más preferiblemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1.

El procedimiento de anclaje se puede llevar a cabo poniendo en contacto miembros de la biblioteca de disulfuros de una vez con la MBD o en grupos de 2 o más. Cuando se usan grupos, se prefiere usar 5-15 miembros de la biblioteca por grupo.

En todas las realizaciones, la identidad de las moléculas pequeñas que se unen al EMP y/o un sitio de interés en una MBD, se puede determinar, por ejemplo, por espectrometría de masas (EM) o mediante un marcador detectable. Cuando se usa la espectrometría de masas para detectar el miembro de la biblioteca que se une a una MBD y se usan grupos, se prefiere que cada miembro del grupo difiera en peso molecular, preferiblemente en aproximadamente 10 Daltons. La identificación se puede realizar midiendo la masa del complejo MBD-miembro de la biblioteca, o liberando primero el

\hbox{miembro de la
biblioteca del complejo o usando un ensayo funcional, p. ej., ELISA,
 ensayo de enzimas, etc.}

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 comparativa es una ilustración esquemática del procedimiento de anclaje básico, para el descubrimiento de ligandos dirigidos. Una molécula diana, que contiene o modificada para que contenga un grupo tiol libre (tal como una proteína que contiene cisteína) se equilibra con una biblioteca que contienen disulfuro en presencia de un agente reductor, tal como 2-mercaptoetanol. La mayor parte de los miembros de la biblioteca tendrán poca o no tendrán afinidad intrínseca por la molécula diana, y por lo tanto por la acción de masas el equilibrio irá hacia la molécula diana no modificada. Sin embargo, si un miembro de la biblioteca presenta afinidad intrínseca por la molécula diana, el equilibrio se desplazará hacia la molécula diana modificada, que tiene unido a la misma el miembro de la biblioteca con un conector disulfuro;

la fig. 2 comparativa es una ilustración esquemática del procedimiento de anclaje extendido estático. En la primera etapa, una molécula diana que contiene o modificada para que contenga un grupo tiol libre (tal como una proteína que contiene cisteína) se modifica mediante un extensor que contiene tiol, que comprende un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente irreversible con el grupo tiol en la molécula diana, una parte con afinidad intrínseca por la molécula diana, y un grupo tiol. El complejo formado entre la molécula diana y el extensor que contiene tiol, después se puede usar para cribar una biblioteca de monóforos que contienen disulfuro para identificar un miembro de la biblioteca que tiene la afinidad de unión más alta por un segundo sitio de unión en la molécula diana. LG = ligando; PG = grupo protector; R = grupo reactivo;

la fig. 3 ilustra la estrategia de anclaje extendido dinámica, en la que el extensor es bifuncional y contiene dos grupos funcionales

\hbox{(normalmente disulfuro), cada uno
capaz de formar enlaces covalentes reversibles. R  = grupo
reactivo}

la fig. 4 ilustra la síntesis química de un extensor específico (éster de 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-4-carboxi-2-oxo-butilo del ácido 2,6-dicloro-benzoico) como se describe en el ejemplo 2;

\global\parskip0.880000\baselineskip

la fig. 5 muestra la comparación estructural entre un inhibidor tetrapeptídico de caspasa-3 y un extensor genérico sintetizado basándose en el inhibidor;

la fig. 6 muestra el espectro de masas de dos experimentos de anclaje extendido representativos.

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Salvo que se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992), proporcionan al experto en la materia una guía general para muchos términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la materia reconocerá muchos procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que se podrían usar en la práctica de la presente invención. Realmente, la presente invención no está limitada de ninguna manera a los procedimientos y materiales descritos. Para los propósitos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos:

Los términos y expresiones "diana", "molécula diana" y "MD" se usan de forma intercambiable y en el sentido más amplio y se refieren a una entidad química o biológica por la que un ligando tiene afinidad de unión intrínseca. La diana puede ser una molécula, una parte de una molécula o un agregado de moléculas. La diana es capaz de unión es capaz de unión reversible a un ligando por un enlace covalente (conector) reversible o irreversible. Los ejemplos específicos de moléculas diana incluyen polipéptidos o proteínas (p. ej., enzimas, incluyendo proteasas, p. ej., cisteína, serina y aspartil proteasas), receptores, factores de transcripción, ligandos para receptores, factores de crecimiento, citoquinas, inmunoglobulinas, proteínas nucleares, componentes de transducción de señales (p. ej. quinasas, fosfatasas, reguladores enzimáticos alostéricos, y similares, polinucleótidos, péptidos, hidratos de carbono, glicoproteínas, glicolípidos, y otras macromoléculas, tales como complejos de ácido nucleico-proteína, cromatina o ribosomas, estructuras que contienen bicapas lipídicas, tales como membranas, o estructuras derivadas de membranas, tales como vesículas. La

\hbox{definición incluye específicamente  moléculas biológicas
diana (MBD) como se define a continuación.}

Una "molécula biológica diana" o "MBD" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sola molécula biológica o una pluralidad de moléculas biológicas que son capaces de formar un complejo biológicamente relevante con otra para el que una molécula pequeña agonista o antagonista tendría importancia terapéutica. En una realización preferida, la MBD es un polipéptido que comprende dos o más aminoácidos y que tiene o se puede modificar para que tenga un grupo reactivo para unirse a miembros de una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas.

El término "polinucleótido" cuando se usa en singular o plural, en general se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que pueden ser ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Así, por ejemplo, los polinucleótidos como se definen en el presente documento incluyen, sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que incluye regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que incluye regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenarias, o más típicamente, bicatenarias o incluyen regiones mono y bicatenarias. Además, el término "polinucleótido" tal como se usa en el presente documento se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en dichas regiones pueden estar formadas de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero normalmente implican solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice a menudo es un oligonucleótido. El término "polinucleótido" incluye específicamente ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" tal como se usa este término en el presente documento. Además, los ADN o ARN que comprenden bases no habituales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, están incluidos dentro del término "polinucleótidos" como se define en el presente documento. En general, el término "polinucleótido" abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células sencillas y complejas.

Un "ligando" como se define en el presente documento es una entidad que tiene una afinidad de unión intrínseca por la diana. El ligando puede ser una molécula, o una parte de una molécula que se une a la diana. Los ligandos normalmente son moléculas orgánicas pequeñas que tienen una afinidad de unión intrínseca por la molécula diana, pero también pueden ser otras moléculas de unión específicas de secuencia, tales como péptidos (D, L o una mezcla de D y L), peptidomiméticos, hidratos de carbono complejos u otros oligómeros de unidades individuales o monómeros que se unen específicamente a la diana. El término "monóforo" se usa en el presente documento de forma intercambiable con el término "ligando" y se refiere a una unidad monómera de un ligando. El término "diáforo" indica dos monóforos unidos covalentemente para formar una unidad que tiene una afinidad mayor por la diana porque las dos unidades de monóforo o ligando se unen a dos sitios separados pero cercanos en la diana. La afinidad de unión de un diáforo que es mayor que el producto de las afinidades de los componentes individuales se denomina "avidez". El término diáforo se usa de forma independiente de si la unidad está covalentemente unida a la diana o existen de forma separada después de su liberación de la diana. El término también incluye diferentes derivados y modificaciones que se introducen con el fin de potenciar la unión a la diana.

Un "sitio de interés" en una diana, tal como se usa en el presente documento, es un sitio al que se une un ligando específico, que puede incluir una secuencia específica de subunidades monómeras, p. ej., restos de aminoácidos, o nucleótidos, y puede tener una estructura tridimensional. Normalmente, las interacciones moleculares entre el ligando y el sitio de interés en la diana no son covalentes, e incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals e interacciones electrostáticas. En el caso del polipéptido, p. ej., dianas de proteínas, el sitio de interés incluye de forma amplia los restos de aminoácidos implicados en la unión de la diana a una molécula con la que forma un complejo natural in vivo o in vitro.

Las "moléculas pequeñas" normalmente son de menos de 10 kDa de peso molecular, e incluyen, pero no se limitan, a compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos, péptidos, (poli)nucleótidos, (oligo)sacáridos y similares. Las moléculas pequeñas incluyen específicamente moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas no polímeras (p. ej., no peptídicas o polipeptídicas). Muchas compañías farmacéuticas tienen grandes bibliotecas de dichas moléculas, que se pueden cribar de forma conveniente usando el procedimiento de anclaje extendido de la presente invención. Las moléculas pequeñas preferidas tienen pesos moleculares menores que aproximadamente 300 Da y más preferiblemente menores que aproximadamente 650 Da.

El término "conector" tal como se usa en el presente documento se refiere a una estructura que incluye un resto capaz de formar un enlace reversible o covalente reversible con una diana (incluyendo moléculas biológicas diana como se han definido en lo que antecede), cerca de un sitio de interés.

La frase "extensor molecular pequeño" (EMP) tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular de aproximadamente 75 a aproximadamente 1500 daltons y que tiene un primer grupo funcional reactivo con un nucleófilo en una MD y un segundo grupo funcional reactivo con un candidato de ligando o miembros de una biblioteca de candidatos de ligando. El primer grupo funcional es reactivo con un nucleófilo en una MBD (capaz de formar un enlace covalente reversible con dicho nucleófilo), y el grupo reactivo del otro extremo del EMP es un tiol libre o protegido o un grupo que es un precursor de un tiol libre o protegido. En una realización, al menos una parte del extensor molecular pequeño es capaz de formar un enlace no covalente con un primer sitio de interés en la MBD (es decir, tiene una afinidad inherente por dicho primer sitio de interés). Están incluidas dentro de esta definición las moléculas orgánicas pequeñas (incluyendo no polímeras) que contienen metales tales como Cd, Hg y As, que pueden formar un enlace con el nucleófilo, p. ej. SH de la
MBD.

La frase "enlace covalente reversible" tal como se usa en el presente documento se refiere a un enlace covalente que se puede romper, preferiblemente en condiciones que no desnaturalizan la diana. Los ejemplos incluyen, sin limitación, disulfuros, bases de Schiff, tioésteres y similares.

La expresión "grupo reactivo" con referencia a un ligando se usa para describir un grupo o resto químico que proporciona un sitio en el que se puede formar un enlace covalente con los candidatos de ligando (p. ej., miembros de una biblioteca o compuestos orgánicos pequeños). Por lo tanto, el grupo reactivo se elige de modo que es capaz de formar un enlace covalente con los miembros de la biblioteca frente a los que se hace el cribado.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier ligando que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente la actividad biológica presentada por una diana, tal como una MBD. De una forma similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier ligando que mimetice una actividad biológica presentada por una diana, tal como una MBD, por ejemplo, cambiando específicamente la función o expresión de dicha MBD, o la eficacia de señalización por esta MBD, alterando así (aumentando o inhibiendo) una actividad biológica ya existente o provocando una nueva actividad biológica.

Las frases "modificado para contener" y "modificado para tener" se usan de forma intercambiable, y se refieren a hacer un mutante, variante o derivado de la diana, o el nucleófilo o electrófilo reactivo, incluyendo, pero no limitado a modificaciones químicas. Por ejemplo, en una proteína se puede sustituir un resto natural por un resto aminoácido que tiene una cadena lateral que contiene un nucleófilo o electrófilo. Otro ejemplo es la conversión del grupo tiol de un reto cisteína en un grupo amina.

La expresión "nucleófilo reactivo" tal como se usa en el presente documento se refiere a un nucleófilo que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional compatible en otra molécula, en condiciones que no desnaturalizan o dañan la diana, p. ej., la MBD. Los nucleófilos más relevantes son tioles, alcoholes, carbonilos activados, epóxidos, azirinas, sulfonatos aromáticos, hemiacetales y aminas. De igual forma, la expresión "electrófilo reactivo" tal como se usa en el presente documento se refiere a un electrófilo que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo funcional compatible en otra molécula, preferiblemente en condiciones que no desnaturalizar o dañan de otra forma la diana, p. ej., la MBD. Los electrófilos más importantes son iminas, carbonilos, epóxidos, aziridinas, sulfonatos y hemiacetales.

Un "primer sitio de interés" en una diana, p. ej., MBD, se refiere a un sitio que se puede poner en contacto con al menos una parte del EMP cuando está covalentemente unido al nucleófilo reactivo. El primer sitio de interés, puede, pero no tiene que tener la capacidad de formar un enlace no covalente con el EMP.

Las frases "grupo reactivo con el nucleófilo", "grupo reactivo nucleófilo", "grupo reactivo con un electrófilo" y "grupo reactivo electrófilo", tal como se usan en el presente documento, se refieren a un grupo funcional en el EMP que puede formar un enlace covalente con el nucleófilo en la MBD en condiciones que no desnaturalicen o dañen de otra forma la MBD.

La expresión "tiol protegido" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tiol que se ha hecho reaccionar con un grupo o molécula que forma un enlace covalente que lo hace menos reactivo y que se puede desproteger para regenerar un tiol libre.

La frase "ajustar las condiciones" tal como se usa en el presente documento, se refiere a someter a una diana, tal como una MBD a cualesquiera condiciones de reacción o reactivos individuales, combinación o serie, necesarios para hacer que se forme un enlace covalente entre el ligando y la diana, tal como un nucleófilo y el grupo reactivo con el nucleófilo en el EMD, o para romper un enlace covalente ya formado.

La expresión "complejo covalente" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación del EMP y la MBD que están ambos covalentemente unidos por el nucleófilo en la MBD con el grupo reactivo con el nucleófilo en el EMP, y unidos no covalentemente por una parte del extensor molecular pequeño y el primer sitio de interés en la MBD.

La frase "grupo de unión disulfuro intercambiable" tal como se usa en el presente documento se refiere a la biblioteca de moléculas cribadas con el complejo covalente que presenta el extensor molecular pequeño que contiene tiol, donde cada miembro de la biblioteca contiene un grupo disulfuro que puede reaccionar con el tiol o tiol protegido presentado en el complejo covalente para formar un nuevo enlace disulfuro cuando las condiciones de reacción se ajustan para favorecer dicho intercambio de tiol.

La frase "la afinidad más alta por el segundo sitio de interés" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la molécula que tiene mayor estabilidad termodinámica frente al segundo sitio de interés en la MBD, que se selecciona preferiblemente de la biblioteca de miembros de la biblioteca que contienen disulfuro.

Las "variantes funcionales" de una molécula en el presente documento son variantes que tienen una actividad en común con la molécula de referencia.

"Activo" o "actividad" significa una propiedad biológica y/o inmunológica cualitativa.

2. Dianas

Las dianas, tales como moléculas biológicas diana (MBD) que son útiles en la presente invención incluyen, sin limitación, moléculas, partes de moléculas y agregados de moléculas a los que se puede unir un candidato de ligando, tales como polipéptidos o proteínas (p. ej., enzimas, receptores, factores de transcripción, ligandos para receptores, factores de crecimiento, inmunoglobulinas, proteínas nucleares, componentes de transducción de señales, reguladores enzimáticos alostéricos, y similares), polinucleótidos, péptidos, hidratos de carbono, glicoproteínas, glicolípidos y otras macromoléculas, tales como complejos de ácido nucleico-proteína, cromatina o ribosomas, estructuras que contienen bicapa lipídica, tales como membranas o estructuras derivadas de membranas, tales como vesículas. La diana se puede obtener en una variedad de formas, incluyendo aislamiento y purificación de una fuente natural, síntesis química, producción recombinante y cualquier combinación de estos y otros procedimientos similares.

Las familias de dianas enzimáticas preferidas son cisteína proteasas, aspartil proteasas, serina proteasas, metaloproteasas, quinasas, fosfatasas, polimerasas e integrasas. Las dianas proteína:proteína preferidas son citoquinas de 4 hélices, citoquinas triméricas, módulos de señalización, factores de transcripción y quimioquinas.

De acuerdo con la presente invención, la diana es una MBD, e incluso más preferiblemente es un polipéptido, en especial una proteína. Los polipéptidos, incluidas las proteínas, que son útiles en el presente documento como dianas para la unión de ligandos, preferiblemente ligandos moleculares orgánicos pequeños, incluyen casi cualquier polipéptido (incluyendo polipéptidos cortos también llamados péptidos) o proteína que comprende dos o más sitios de unión de interés, y que tengan o sean capaces de ser modificados para tener un grupo reactivo para la unión a una molécula orgánica pequeña u otro ligando (p. ej., péptido). Los polipéptidos de interés se pueden obtener en el comercio, de forma recombinante, por síntesis química, por purificación de una fuente natural, o de otra forma, y para la mayoría de los casos son proteínas, en particular proteínas asociadas con una enfermedad o afección humana específica, tal como proteínas receptores de superficie celular y solubles, tales como receptores de superficie celular linfocíticos, tales como proteasas (p. ej., serina, cisteína y aspartil proteasas) y timidilato sintasa, receptores de esteroides, proteínas nucleares, enzimas alostéricas, factores de coagulación, quinasas (tanto serina como treonina) y desfosforilasas (o fosfatasas, sea serina/treonina o proteína-tirosina fosfatasas, p. ej., PTP, en especial PTP1B), enzimas bacterianas, enzimas fúngicas y enzimas víricas (en especial asociadas con el VIH, influenza, rinovirus y VSR), moléculas de transducción de señales, factores de transcripción, proteínas o enzimas asociadas con la síntesis o degradación de ADN y/o ARN, inmunoglobulinas, hormonas, receptores para diferentes citoquinas incluyendo, por ejemplo, eritropoyetina (EPO), receptor del factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), receptor del factor estimulador de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), trombopoyetina (TPO), interleuquinas, p. ej. IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placental humano (LPL), CNTF, oncostatina, diferentes quimioquinas y sus receptores, tales como RANTES MIP\beta, IL-8, diferentes ligandos y receptores para tirosina quinasa, tales como insulina, factor de crecimiento 1 de tipo insulina (IGF-1), factor de crecimiento epidérmico (EGF), heregulina-\alpha y heregulina-\beta, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento placental (PLGF), factores de crecimiento tisulares (TGF-\alpha y TGF-\beta), factores de crecimiento de nervios (NGF), diferentes neurotrofinas y sus ligandos, otras hormonas y receptores tales como, factores morfogénicos óseos, hormona folículo estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH), hormonas triméricas incluyendo factor de necrosis tisular (TNF) y ligando CD40, factor de apoptosis 1 y 2 (AP-1 y AP-2), p53, bax/bcl2, mdm2, caspasas, y proteínas y receptores que comparten 20% o más de identidad de secuencia con estos.

Un grupo importante de dianas de inflamación e inmunología incluyen: IgE/IgER, ZAP-70, Ick, syk, ITK/BTK, TACE, Catepsina S y F, CD11a, LFA/ICAM, VLA-4, CD28/B7, CTLA4, TNF alfa y beta, (y los receptores de TNF p55 y p75), CD40L, p38 map quinasa, IL-2, IL-4,11-13, IL-15, Rac 2, PKC zeta, IL-8, TAK-1, jnk, IKK2 y IL-18.

Otras dianas específicas importantes también incluyen: caspasas 1, 3, 8 y 9, IL-1/receptor de IL-1, BACE, VIH integrasa, PDE IV, Hepatitis C helicasa, Hepatitis C proteasa, rinovirus proteasa, triptasa, cPLA (fosfolipasa A2 citosólica), CDK4, quinasa c-jun, adaptadores tales como Grb2, GSK-3, AKT, MEKK-1, PAK-1, raf, TRAF 1-6, Tie2, ErbB 1 y 2, FGF, PDGF, PARP, CD2, receptor C5a, CD4, CD26, CD3, TGF-alfa, NF-kB, IKK beta, STAT 6, neuroquinina-1, PTP-1B, CD45, Cdc25A, SHIP-2, TC-PTP, PTP-alfa, LAR y p53 humano, bax/bcl2 y mdm2.

La MBD de interés se elegirá de modo que tenga o se modifique para tener un grupo reactivo que sea capaz de formar un enlace covalente reversible o irreversible con un ligando que tiene afinidad intrínseca por un sitio de interés en la diana. Por ejemplo, muchas dianas tienen de forma natural grupos reactivos (por ejemplo, grupos amina, tiol, aldehídos, cetona, hidroxilo, y similares) a los cuales se pueden unir covalentemente ligandos, tales como miembros de una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas. Por ejemplo, los polipéptidos a menudo tienen aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas (p. ej., cisteína, lisina, arginina y similares). Además, la tecnología sintética actualmente permite la síntesis de moléculas biológicas diana usando, por ejemplo, sintetizadores de péptidos o ácidos nucleicos automáticos, que tienen grupos químicamente reactivos en sitios de interés predeterminados. Como tal, un grupo químicamente reactivo se puede introducir por síntesis en la MBD, durante la síntesis automática.

En una realización particular, la diana comprende al menos un primer grupo reactivo que, si la diana es un polipéptido, puede o no estar asociado con un resto cisteína de ese polipéptido, y preferiblemente está asociado con un resto cisteína del polipéptido, si el conector elegido es un grupo tiol libre o protegido (véase a continuación). La diana preferiblemente contiene, o se modifica para que contenga, solo un número limitado de grupos tiol libres o protegidos, preferiblemente no más de aproximadamente 5 grupos tiol, más preferiblemente no más de aproximadamente 2 grupos tiol, más preferiblemente no más de un grupo tiol libre, aunque también serán útiles los polipéptidos que tengan más grupos tioles libres. La diana, tal como la MBD, de interés se puede obtener o seleccionar inicialmente de modo que ya tenga el número deseado de grupos tiol, o se puede modificar para que tenga el número deseado de grupos tiol.

Cuando la diana es un polipéptido, un conector se puede unir, por ejemplo, al polinucleótido en una base en cualquier amina exocíclica o cualquier carbono vinílico, tal como la posición 5 ó 6 de pirimidinas, posiciones 8 ó 2 de purinas, en los carbonos 5' ó 3' en la cadena principal de fosfatos de azúcar, o en átomos de fósforo entre nucleótidos. Sin embargo, también se puede introducir un conector en otras posiciones, tales como la posición 5 de la timidina o uracilo. En el caso de un ADN bicatenario, por ejemplo, un conector se puede situar en un hueco mayor o menor, cerca del sitio de interés, pero no tan cerca para que de como resultado impedimento estérico, lo cual puede interferir con la unión del ligando a la diana en el sitio de interés.

Los expertos en la materia son conscientes de diferentes técnicas recombinantes, químicas, de síntesis y/u otras técnicas, que se pueden usar de forma rutinaria para modificar una diana, p. ej., un polipéptido de interés, de modo que tenga un número deseado de grupos tiol libres que están disponibles para la unión covalente a un candidato de ligando que comprende un grupo tiol libre. Dichas técnicas incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido diana, de modo que codifique un polipéptido con un número diferente de restos cisteína. Se prefiere en particular la mutagénesis dirigida usando la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.683.195 presentada el 28 de julio 1987; y Current Protocols In Molecular Biology, capítulo 15 (Ausubel y col., ed., 1991). También se conocen otras técnicas de mutagénesis dirigida en la materia, y se describen, por ejemplo, en las siguientes publicaciones: Ausubel y col., véase antes, capítulo 8; Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2ª edición (Sambrook y col., 1989); Zoller y col., Methods Enzymol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, DNA 3:479-488 (1984); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987); Brake y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646 (1984); Botstein y col., Science 229:1193 (1985); Kunkel y col., Methods Enzymol. 154:367-82 (1987), Adelman y col., DNA 2:183 (1983); y Carter y col., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986). También se puede usar la mutagénesis de casete (Wells y col., Gene, 34:315 [1985]), y la mutagénesis de selección por restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 [1986]).

Las variantes de secuencia de aminoácidos con más de una sustitución de aminoácido se pueden generar de varias formas. Si los aminoácidos están situados cerca unos de otros en la cadena del polipéptido, se pueden mutar simultáneamente, usando un oligonucleótido que codifique todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están situados a cierta distancia unos de otros (p. ej., separados por más de diez aminoácidos), es más difícil generar un solo oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, se puede usar uno de dos procedimientos alternativos. En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que se va a sustituir. Los oligonucleótidos después se hibridan con el molde de ADN monocatenario simultáneamente, y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más ciclos de mutagénesis para producir el mutante deseado.

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Se pueden poner fuentes de nuevos grupos reactivos, p. ej., cisteínas en cualquier sitio en la diana. Por ejemplo, si se introduce una cisteína en la superficie de la proteína en una zona que se sabe que es importante para las interacciones proteína-proteína, se pueden seleccionar moléculas pequeñas que se unan y bloqueen esta superficie.

Las siguientes tablas ilustran moléculas biológicas diana (MBD) que se pueden usar de acuerdo con la presente invención.

TABLAS DE DIANAS

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3. Sitio(s) de interés

De forma amplia, el "sitio de interés" en una diana particular, tal como una molécula biológica diana (MBD), se define por los restos que están implicados en la unión de la diana a la molécula con la que forma un complejo natural in vivo o in vitro. Si la diana es un péptido, polipéptido o proteína, el sitio de interés se define por los restos de aminoácidos que participan en la unión (normalmente por asociación no covalente) de la diana a un
ligando.

Cuando, por ejemplo, la molécula biológica diana es una proteína que ejerce su efecto biológico por la unión a otra proteína, tal como hormonas, citoquinas u otras proteínas implicadas en la señalización, puede formar un complejo natural in vivo con una o más proteínas distintas. En este caso, el sitio de interés se define como los restos de contacto críticos implicados en una interfase de unión proteína:proteína particular. Los restos de contacto críticos se definen como aquellos aminoácidos en la proteína A que hacen contacto directo con los aminoácidos en la proteína B, y cuando se mutan a alanina, disminuyen la afinidad de unión en al menos 10 veces y preferiblemente al menos 20 veces, medido con un ensayo de unión directa o competición (p. ej., ELISA o RIA). Véase (A Hot Spot of Binding Energy in a Hormone-Receptor Interface, de Clackston y Wells, Science 267:383-386 (1995) y Cunningham y Wells J. Mol. Biol., 234:554-563 (1993)). También están incluidos en la definición de un sitio de interés, los restos de aminoácidos de la proteína B que están dentro de aproximadamente 4 angstroms de los restos de contacto críticos identificados en la proteína A.

Se puede usar el análisis por aminoácidos de barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están los aminoácidos relativamente pequeños, neutros. Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina normalmente es un aminoácido de barrido preferido dentro de este grupo, porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). La alanina también se prefiere normalmente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra con frecuencia en posiciones tanto escondidas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol.Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución por alanina no da cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isostérico.

Cuando la molécula biológica diana es una enzima, el sitio de interés puede incluir aminoácidos que están en contacto con, o caen dentro de aproximadamente 4 angstroms de un sustrato, inhibidor, activador, cofactor o modulador alostérico de la enzima unido. A modo de ilustración, cuando la enzima es una proteasa, el sitio de interés incluiría el canal de unión de sustrato de P4 a P4', restos implicados en la función catalítica (p. ej., tríada catalítica) y cualquier sitio de unión de cofactor (p. ej., Zn). Para proteína quinasas, el sitio de interés incluiría el canal de unión de sustrato (como antes) además del sitio de unión de ATP. Para las deshidrogenasas, el sitio de interés incluiría la región de unión del sustrato así como el sitio ocupado por NAD/NADH. En las hidrolasas tales como PDE4, el sitio de interés incluiría todos los restos en contacto con el sustrato AMPc, así como los restos implicados en la unión de los cationes divalentes catalíticos (Xu, R. X. y col. Science, 288:1822-1825 (2000)).

Para una enzima regulada alostéricamente, tal como la glicógeno fosforilasa B, el sitio de interés incluiría todos los restos en la región de unión del sustrato, restos en contacto con el inhibidor alostérico natural glucosa-6-fosfato, y los restos en sitios alostéricos nuevos tales como los identificados en la unión de otros inhibidores tales como CP320626 (Oikonomakos N.G., y col. Structure Fold Des. 8:575-584 (2000)).

Las MBD contienen, o se modifican para que contengan un resto reactivo en o cerca de un sitio de interés. Preferiblemente, las MBD contienen o se modifican para que contengan un resto aminoácido que contiene tiol en o cerca de un sitio de interés. En este caso, después de seleccionar una MBD, se calcula el sitio de interés. Una vez conocido el sitio de interés, se lleva a cabo un procedimiento de determinación de qué resto de aminoácido en o cerca del sitio de interés hay que modificar. Por ejemplo, una modificación preferida resulta de la sustitución de un resto situado cerca del sitio de interés por un resto cisteína.

La elección de qué resto en o cerca del sitio de interés modificar, se determina basándose en los siguientes criterios de selección. Primero, se obtiene una descripción tridimensional de la MBD de una de varias fuentes bien conocidas. Por ejemplo, la estructura terciaria de muchas MBD se ha determinado por experimentos de cristalografía de rayos X. Estas estructuras de rayos X están disponibles en una amplia variedad de fuentes, tales como el Protein Databank (PDB) que se puede encontrar en internet en http://www.rcsb.org. Las estructuras terciarias también se pueden encontrar en la Protein Structure Database (PSdb) que se encuentra en el Pittsburg Supercomputer Center en http://www.psc.com.

Además, la estructura terciaria de muchas proteínas y complejos de proteínas, se ha determinado mediante procedimientos de modelización basados en ordenador. Por lo tanto, ahora están ampliamente disponibles los modelos de conformaciones tridimensionales de proteínas.

Una vez conocida la estructura tridimensional de la MBD, se hace una medición basándose en un modelo estructural del tipo salvaje o una forma variante de la molécula biológica diana, desde cualquier átomo de un aminoácido dentro del sitio de interés a lo largo de la superficie de la proteína para una distancia de aproximadamente 10 angstroms. Las variantes que se han modificado para contener grupos reactivos deseados (p. ej., grupos tiol o restos que contienen tiol) se basan en la identificación de uno o más aminoácidos de tipo salvaje en la superficie de la molécula biológica diana que caen dentro de un radio de aproximadamente 10 angstroms desde el sitio de interés. Para el propósito de esta medición, cualquier aminoácido que tenga al menos un átomo que caiga dentro de aproximadamente 10 angstroms de ratio desde cualquier átomo de un aminoácido dentro del sitio de interés, es un resto potencial para modificar a un resto que contiene tiol.

Los restos preferidos para la modificación son los que son accesibles al disolvente. La accesibilidad al disolvente se puede calcular por modelos estructurales usando procedimientos numéricos (Lee, B. & Richards, F. M., J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971); Shrake, A. & Rupley, J. A., J. Mol. Biol. 79:351-371 (1973)) o analíticos (Connolly, M. L., Science 221:709-713 (1983); Richmond, T. J., J. Mol. Biol. 178:63-89 (1984)) convencionales. Por ejemplo, una potencial variante de cisteína se considera que es accesible al disolvente si la superficie específica combinada del carbono beta (CB) o el azufre gamma (SG) es mayor que 21 \ring{A}^{2} cuando se calcula por el procedimiento de Lee y Richards (Lee, B. & Richards, F. M., J. Mol. Biol. 55:379-400 (1971)). Este valor representa aproximadamente 33% de la superficie específica teórica accesible a una cadena lateral de cisteína, como describen Creamer y col. (Creamer, T. P. y col., Biochemistry 34:16245-16250 (1995)).

También se prefiere que el resto que se va a mutar a cisteína, u otro resto de aminoácido que contenga tiol, no participe en el enlace de hidrógeno con átomos de la cadena principal, o que como mucho, interaccione con la cadena principal por solo un enlace de hidrógeno. También se prefieren menos los restos naturales en los que la cadena lateral participa en múltiples (>1) enlaces de hidrógeno con otras cadenas laterales. También se prefieren menos las variantes para las que todos los rotámeros estándar (ángulo chi1 de -60º, 60º o 180º) pueden introducir contactos estéricos desfavorables con los átomos de N, CA, C, O o CB de cualquier otro resto. Los contactos desfavorables se definen como distancias interatómicas que son menores que 80% de la suma de los radios de van der Waals de los átomos que participan.

Los restos naturales que caen dentro las regiones altamente flexibles de la proteína son menos preferidos. En las estructuras derivadas de los datos de rayos X, las regiones altamente flexibles se pueden definir como segmentos en los que los átomos de la cadena principal tienen una baja densidad electrónica o factores de temperatura altos (>4 desviaciones típicas por encima del factor de temperatura medio para la estructura). En las estructuras obtenidas por datos de RMN, las regiones altamente flexible se pueden definir como segmentos que tienen <5 restricciones experimentales (obtenidas de datos de distancia, acoplamiento diédrico, y enlace de H) por resto, o regiones que presentan una alta variabilidad (> 2,0 A^{2} desviación de RMS) entre los modelos en el conjunto. Además, son más preferidos los restos encontrados en las regiones "rígidas" convexas adyacentes a superficies cóncavas, mientras que los que están en regiones cóncavas son restos cisteína menos preferidos para modificar. La convexidad y la concavidad se pueden calcular basándose en los vectores de superficie (Duncan, B.S. & Olson, A.J., Biopolymers 33:219-229 (1993)) o determinando la accesibilidad de sondas de agua puestas a lo largo de la superficie molecular (Nicholls, A. y col., Proteins 11:281-296 (1991); Brady, G.P., Jr. & Stouten, P. F. J. Comput. Aided Mol. Des. 14:383-401 (2000)). Los restos que tienen una conformación de la cadena principal que está nominalmente prohibida para los aminoácidos L (Ramachandran, G.N. y col., J. Mol. Biol. 7:95-99 (1963); Ramachandran, G.N. & Sasisekharahn, V. Adv. Prot. Chem. 23:283-437 (1968)) son dianas menos preferidas para la modificación a una cisteína. Las conformaciones prohibidas normalmente dan un valor positivo del ángulo fi.

Otras variantes preferidas son aquellas en las que cuando mutaran a cisteína y se unieran por un enlace disulfuro a un alquil- conector, tendrían una conformación que dirige los átomos de este conector hacia el sitio de interés. Se pueden usar dos procedimientos generales para identificar estas variantes preferidas. En un primer procedimiento, se hace una búsqueda de estructuras únicas (Hobohm, U. y col., Protein Science 1:409-417 (1992)) en el Protein Databank (Berman, H. M., y col., Nucleic Acids Research 28:235-242 (2000)) para identificar fragmentos estructurales que contienen una cisteína unida por disulfuro en la posición j en la que los átomos de la cadena principal de los restos j-1 y j+1 del fragmento se pueden superponer sobre los átomos de la cadena principal de los restos i-1 y i+1 de la molécula diana con una RMSD menor que 0,75 A^{2}. Si se identifican fragmentos que ponen el átomo de CB del resto unido por disulfuro a la cisteína en la posición j más cerca de cualquier átomo del sitio de interés que el átomo de CB del resto i (cuando se ha mutado a cisteína), la posición i se considera preferida. En un procedimiento alternativo, el resto en la posición i está computacionalmente "mutado" a una cisteína y rematado con un grupo S-metilo por un enlace disulfuro.

Se proporcionan más detalles de identificación de sitio(s) de interés en las dianas de la invención, en la solicitud en tramitación junto con la presente nº de serie 60/310.725, presentada el 7 de agosto, 2001.

4. Extensor molecular pequeño (EMP) EMP dinámico

De acuerdo con la invención, el EMP es un EMP de doble enlace covalente reversible (extensor "doble disulfuro"), es decir, este EMP es bifuncional y contiene dos grupos funcionales (normalmente disulfuro) capaces de formar enlaces covalentes reversibles. Este EMP forma un enlace covalente reversible primero o "dinámico" por un primer grupo funcional en el EMP con el nucleófilo en la MBD, formando así un complejo de MBD-EMP reversible (7 abajo). Opcionalmente el EMP también forma un enlace no covalente con un primer sitio de interés en la MBD (la parte del EMP que forma un enlace no covalente con la MBD se denomina en el presente documento EMP'). Además, el EMP contiene o se modifica para que contenga un segundo grupo funcional capaz de formar un segundo enlace reversible con un miembro de una biblioteca de una segunda biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas, teniendo cada molécula un grupo funcional capaz de formar un enlace reversible con el primer o segundo grupo funcional del EMP. El complejo de MBD-EMP y la segunda biblioteca se someten a condiciones en las que el miembro de la biblioteca que tiene la mayor afinidad por un segundo sitio de interés en la MBD forma un enlace reversible con el complejo de MBD-EMP (8 abajo). Preferiblemente, los enlaces covalentes son disulfuros, que pueden ser reversibles en presencia de un agente de reducción.

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El procedimiento de anclaje extendido dinámico se ilustra en la figura 3, en la que una MBD que contiene o se modifica para que contenga un tiol o tiol protegido se incuba con una primera biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas que contienen un tiol o tiol protegido (un monóforo que contiene disulfuro) en condiciones, tales como con un agente de reducción, en las que al menos un miembro de la biblioteca forma un enlace disulfuro uniendo el miembro de la biblioteca seleccionada con la MBD. Opcionalmente, este procedimiento se repite con una biblioteca de MBD que difieren entre sí por la posición del tiol o tiol protegido, es decir, diferentes mutantes de cisteína de la misma proteína. Preferiblemente, cada miembro de la biblioteca de moléculas pequeñas difiere en peso molecular de cada uno de los otros miembros de la biblioteca. Preferiblemente, la biblioteca de moléculas pequeñas contiene 1-100 miembros, más preferiblemente 5-15 y lo más preferiblemente aproximadamente 10 miembros. Opcionalmente, el miembro seleccionado de la biblioteca de moléculas pequeñas (monóforo seleccionado) también forma un enlace no covalente con un primer sitio de interés en la MBD. El monóforo seleccionado, o un derivado del mismo, después se modifica para que contenga un segundo tiol o tiol protegido formando así un extensor "disulfuro doble". Después, este extensor disulfuro doble sintético se incuba con la MBD en presencia de una segunda biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas que contienen un tiol o tiol protegido (la biblioteca puede ser la misma o diferente de la primera biblioteca) en condiciones, tales como con un agente de reducción como el mercaptoetanol, en las que un miembro de la segunda biblioteca forma un enlace disulfuro que une el miembro seleccionado de la biblioteca con la MBD por el extensor disulfuro doble, como se ha mostrado en 8 antes. Opcionalmente, después se sintetiza un diáforo basado en los dos miembros (monóforos) seleccionados de las bibliotecas.

Existen dos estrategias básicas para sintetizar un extensor "disulfuro doble". En la primera, la síntesis del extensor dinámico procede de forma genérica, es decir por modificación del conector monóforo sin ninguna modificación de la parte del monóforo que forma un enlace no covalente con la MBD. A modo de ilustración, el extensor normalmente surge del cribado de una biblioteca de monóforos disufuro como se muestra en la figura 3. Un monóforo típico seleccionado de la biblioteca o grupo contendrá un conector de 2 ó 3 unidades de metileno entre el disulfuro que une el monóforo a la cisteína de la MBD y la parte del monóforo que se une de forma no covalente al primer sitio de interés de la MBD. Este conector monóforo se puede obtener como se muestra abajo para producir un extensor disulfuro doble, en el que "R" o grupo variable del monóforo permanece invariable y se convierte en la parte del extensor (EMP') que se une de forma no covalente con el primer sitio de interés de la MBD.

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Aquí, el monóforo se derivatiza en el metileno más cercano al nitrógeno de la cistamina para producir un extensor disulfuro doble dinámico 1 o en el propio nitrógeno de la cistamina para producir el extensor disulfuro doble dinámico 2 simétrico.

Alternativamente, cuando el monóforo es un derivado de ácido 3-mercaptopropiónico, el carbono alfa se puede derivatizar para producir un extensor disulfuro doble dinámico genérico de la forma mostrada en 3 a continuación.

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Opcionalmente, el nitrógeno de la amida se puede derivatizar con un acilo o sulfonilo para producir un extensor de la forma mostrada en 4 antes.

Una segunda estrategia implica derivatizar la parte del monóforo que se une de forma no covalente al primer sitio de interés en la MBD. La derivatización se lleva a cabo preferiblemente en un sitio que altera mínimamente la unión del monóforo al primer sitio de interés como se ilustra a continuación.

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Aquí, el conector dinámico se muestra unido al tiol de la MBD formando el complejo de MBD-EMP, en el que R' es el radical cistamina. Este complejo después se puede poner en contacto con un monóforo disulfuro o biblioteca de monóforos disulfuro para obtener un compuesto unido que tiene una afinidad mayor por la MBD que el EMP o el monóforo seleccionado solos.

A continuación se muestra un segundo ejemplo de un EMP diseñado a partir de un monóforo disulfuro que se une a la MBD. Este EMP dinámico se puede poner en contacto con la MBD en presencia de uno o más monóforos disulfuro para formar un complejo de MBD-EMP-monóforo covalente, en el que el EMP tiene una afinidad por el primer sitio de interés y el monóforo tiene una afinidad para el segundo sitio de interés en la MBD.

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La detección e identificación de la estructura del complejo de MBD-EMP-monóforo se puede llevar a cabo por espectrometría de masas o inhibición en un ensayo funcional (p. ej., ELISA, ensayo enzimático, etc.).

Los EMP a menudo se diseñan para una MBD o familia de MBD particular. Por ejemplo, los derivados de quinazolina son capaces de formar extensores estáticos o dinámicos con el receptor EGF o una quinasa "RD". En el caso del receptor EGF, la cys 773 es un nucleófilo adecuado para una extensor quinazolina estático o dinámico, como se muestra a continuación;

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en los que R^{1} está unido a la cys 773 por una aceptor de Michael o disulfuro,

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R^{1} se selecciona de

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R^{2} es -(CH_{2})_{n}-SR' y -C(=O)-(CH_{2})_{n}-SR';

R^{3}, R^{4} y R^{5} son -O-(CH_{2})_{n}-SR' y -(CH_{2})_{n}-SR';

R^{6} son, -(CH_{2})_{n}-SR'; en el que n es 1, 2, ó 3 y

R' es H, un disulfuro o un grupo protector de tiol.

Se pueden usar miméticos o sustitutos de fosfotirosina (P-tyr), fosfoserina (P-ser) y fosfotreonina (P-thr) como extensores en la presente invención para identificar fragmentos que interaccionan con subsitios cercanos para mejorar la especificidad o afinidad por una fosfatasa diana. Así pues, el anclaje extendido que usa sustratos conocidos o inhibidores como "anclas" para encontrar fragmentos cercanos por anclaje covalente estándar con el extensor, es una realización preferida de la presente invención.

Los miméticos de fosfotirosina (P-tyr) son ejemplos de EMP que se pueden diseñar para fosfatasas como PTP-1B, LAR, etc. Los miméticos de PTP-1B P-tyr conocidos derivatizados con ácido mercaptopropiónico y/o cistamina o las formas protegidas de los mismos, mostrados a continuación, se unen al sitio activo de un mutante PTP-1B cys.

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Dicho compuesto se puede usar como un extensor dinámico para seleccionar un segundo fragmento por anclaje covalente como se ha descrito antes. El compuesto mostrado antes, cuando se une a la diana y se valora frente a mercaptoetanol, presenta una BME_{50} (la concentración de mercaptoetanol que, en el equilibrio, es capaz de desplazar 50% del compuesto unido de la diana) de aproximadamente 2,5 mM. Cuando se usa un extensor dinámico, se prefiere medir la BME_{50} para el extensor dinámico y cribar un segundo fragmentos por anclaje covalente con una concentración de tiol total (BME + tioles biblioteca) de o inferior a la BME_{50} del extensor dinámico. Por ejemplo, con el extensor dinámico mostrado antes que tiene una BME_{50} de 2,5 mM, la concentración de tiol total en la segunda etapa de cribado de fragmentos debería ser 2,5 mM o menor, y más preferiblemente aproximadamente 2 veces menos, p. ej., aproximadamente 1 mM o menor. Alternativamente, el extensor dinámico se puede convertir en un extensor estático quitando la parte de concentración de tiol total del segundo cribado de fragmentos. Cuando se convierte un extensor dinámico en un extensor estático, es importante mantener el mismo recuento de átomos de modo que la unión no covalente del extensor estático a la diana no se distorsione. Por razones similares, es importante minimizar la introducción de otros átomos o grupos voluminosos. Teniendo estos factores en mente, el extensor dinámico anterior se puede convertir en los extensores estáticos definidos a continuación.

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en los que R^{1} se selecciona de

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y en los que R^{2} se selecciona de

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En otra realización más de la invención, un extensor puede ser un péptido reversiblemente unido a la MBD. En esta realización, el péptido tiene aproximadamente 2-15 restos de longitud, preferiblemente de 5 a 10 restos, y puede estar compuesto de alfa-aminoácidos naturales y/o artificiales. Un ejemplo de dicho extensor peptídico es un péptido fragmento de p53 de hélice alfa (o péptidos no naturales conocidos más pequeños) que son capaces de unirse al dominio N-terminal de MDM2 en una hendidura hidrófoba profunda con afinidades nM. Se sabe que BCL-2 y BCL-xL también contienen surcos profundos de unión de péptidos análogos al de MDM2. Los péptidos que se unen a estas dianas también pueden ser extensores peptídicos útiles de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un fragmento de péptido de p53 puede formar un enlace reversible (p. ej., disulfuro) por un tiol (p. ej., cys) existente o un tiol introducido (cys introducida, cistamina derivatizada con el extremo carboxilo o ácido mercaptopropanoico por el extremo amino) en el péptido con un tiol existente o introducido en la MBD. En este caso, se formará un complejo de MBD-extensor peptídico que se puede usar para seleccionar un fragmento de tiol o disulfuro en un posterior cribado de anclaje covalente. Este extensor peptídico dinámico tendrá otro tiol libre o protegido (p. ej., uno de los anteriores no usados para formar el complejo de MBD-extensor peptídico) que se pone en contacto con una biblioteca de fragmentos de tiol o tiol protegido en condiciones adecuadas para formar un enlace disulfuro covalente con un fragmento que tiene afinidad por la MBD.

Dicho extensor peptídico también puede ser un péptido sintético tal como el péptido "Z-WQPY" en el que la MBD es el receptor IL-1. Aquí, se puede usar el péptido FEWTPGYWQPYALPL o fragmentos, mutantes o análogos del mismo, como extensor dinámico como se ha descrito antes, para descubrir fragmentos por anclaje covalente, en el que el conector disulfuro está en o con el extensor y el enlace no covalente está entre el fragmento seleccionado y la MBD.

En la técnica se conocen otros procedimientos químicos disponibles para formar un enlace covalente reversible o irreversible entre grupos reactivos en un EMP y una diana o ligando, respectivamente, o entre dos ligandos, y se describen en textos básicos, tales como por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, 4ª edición, 1992. Se describen aminaciones reductoras entre aldehídos y cetonas y aminas, por ejemplo, en March y col., véase antes, en la página 898-900; procedimientos alternativos para preparar aminas en la página 1276; reacciones entre aldehídos y cetonas y derivados de hidrazida para dar hidrazonas y derivados de hidrazona tales como semicarbazonas en las pág. 904-906; formación de enlace amida en la pág. 1275; formación de ureas en la pág. 1299; formación de tiocarbamatos en la pág. 892; formación de carbamatos en la pág. 1280; formación de sulfonamidas en la pág. 1296; formación de tioéteres en la pág. 1297; formación de disulfuros en la pág. 1284; formación de éteres en la pág. 1285; formación de ésteres en la pág. 1281; adiciones a epóxidos en la pág. 368; adiciones a aziridinas en la pág. 368; formación de acetales y cetales en la pág. 1269; formación de carbonatos en la pág. 392; formación de denaminas en la pág. 1264, metátesis de alcanos en las pág. 1146-1148 (véase también Grubbs y col., Acc. Chem. Res. 28:446-453 [1995]); acoplamientos catalizados por metales de transición de haluros de arilo y sulfonatos con alcanos y acetileno, p. ej., reacciones de Heck, en las pág. 717-178; la reacción de haluros de arilo y sulfonatos con reactivos organometálicos, tales como reactivos de organoboro, en la pág. 662 (véase también, Miyaura y col., Chem. Rev. 95:2457 [1995]); reactivos de organoestaño y organocinc, formación de oxazolidinas (Ede y col., Tetrahedron Letts. 28:7119-7122 [1997]); formación de tiazolidinas (Patek y col., Tetrahedron Letts. 36:2227-2230 [1995]); aminas unidas por grupos amidina por acoplamiento de aminas por imidoésteres (Davies y col., Canadian J. Biochem., c50:416-422 [1972]), y similares. En particular, las bibliotecas de moléculas pequeñas que contienen disulfuro se pueden hacer a partir de ácidos carboxílicos y cistamina protegida disponibles en el comercio (p. ej., mono-BOC-cistamina) adaptando el procedimiento de Parlow y col., Mol. Diversity 1:266-269 (1995), y se pueden cribar por la unión a polipéptidos que contienen, o se han modificado para que contengan, cisteínas reactivas.

Aunque normalmente se prefiere que la unión del EMP no desnaturalice la diana, el complejo de MBD-EMP también se puede formar en condiciones desnaturalizantes, seguido de replegado del complejo por procedimientos conocidos en la técnica. Además, el EMP y el enlace covalente no deben alterar sustancialmente la estructura tridimensional de la diana, de modo que los ligandos reconozcan y se unan a un sitio de interés en la diana con especificidad de sitio útil. Finalmente, el EMP debe ser sustancialmente no reactivo con otros sitios en la diana en las condiciones de reacción y de ensayo.

5. Detección e identificación de ligandos unidos a una diana

Los ligandos unidos a una diana se pueden detectar e identificar rápidamente por espectroscopía de masas (EM). La EM detecta las moléculas basándose en la relación masa a carga (m/z) y así se pueden resolver las moléculas basándose en sus tamaños (revisado en Yates, Trends Genet. 16:5-8 [2000]). Un espectrómetro de masas primero convierte las moléculas en iones en fase gaseosa, después los iones individuales se separan basándose en sus relaciones m/z y finalmente se detectan. Un analizador de masas, que es una parte integrada de un espectrómetro de masas, usa una propiedad física (p. ej., campos eléctricos o magnéticos, o tiempo de vuelo [TOF]) para separar los iones de un valor de m/z particular, que después golpean el detector de iones. Los espectrómetros de masas pueden generar datos rápidamente y por lo tanto tienen un gran potencial para el análisis de alto rendimiento. La EM ofrece una herramienta muy versátil que se puede usar para el descubrimiento de fármacos. La espectroscopía de masas se puede usar sola o combinada con otros medios para la detección e identificación del ligando compuesto orgánico unido a la diana. Las técnicas que usan espectroscopía de masas son bien conocidas en la técnica y se han usado para una variedad de aplicaciones (véase, por ejemplo, Fitzgerald y Siuzdak, Chemistry & Biology 3:707-715 [1996]; Chu y col., J. Am. Chem. Soc. 118:7827-7835 [1996]; Siudzak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11290-11297 [1994]; Burlingame y col., Anal. Chem. 68: 599R-651R [1996]; Wu y col., Chemistry & Biology 4:653-657 [1997]; y Loo y col., Am. Reports Med. Chem. 31:319-325 [1996]).

Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado por el uso de la EM. De hecho, se puede usar cualquier otra técnica adecuada para la detección del aducto formado entre la molécula diana biológica y el miembro de la biblioteca. Por ejemplo, se pueden usar varias técnicas cromatográficas tales como cromatografía de líquidos, cromatografía de capa fina y similares, para separar los componentes de la mezcla de reacción, para así potenciar la capacidad de identificación de la molécula orgánica unida covalentemente. Dichas técnicas cromatográficas se pueden usar combinadas con la espectroscopía de masas o separadas de la espectroscopía de masas. Opcionalmente, se puede acoplar una sonda marcada (de forma fluorescente, radiactiva o de otra forma) al compuesto orgánico liberado, para facilitar así su identificación usando cualquiera de las técnicas anteriores. En otra realización más, la formación de los nuevos enlaces libera una sonda marcada, que después se puede seguir. También se puede usar un ensayo funcional sencillo, tal como un ensayo ELISA o enzimático, para detectar la unión cuando se produce la unión del extensor o el segundo fragmento a la diana en una zona esencial para la que mide el ensayo (p. ej., unión a un "punto caliente" en un ELISA de proteína:proteína o unión en el bolsillo de unión del sustrato, para un ensayo enzimático). Otras técnicas que pueden ser útiles para identificar el compuesto orgánico unido a la molécula diana incluyen, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN), electroforesis capilar, cristalografía de rayos X, y similares, todas las cuales serán bien conocidas para el experto en la materia.

6. Preparación de moléculas conjugadas (p. ej., diáforos)

Los elementos conectores que son útiles para la unión de dos o más ligandos moleculares orgánicos para producir una molécula conjugada serán multifuncionales, preferiblemente bifuncionales, moléculas de reticulación que pueden funcionar para unir covalentemente al menos dos moléculas orgánicas entre sí por grupos funcionales reactivos que tienen estas moléculas. Los elementos conectores tendrán al menos dos, y preferiblemente solo dos, grupos funcionales reactivos que estén disponibles para la unión de al menos dos moléculas orgánicas, en los que estos grupos funcionales pueden estar en cualquier parte en el conector, preferiblemente a cada extremo del conector y donde estos grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes, dependiendo de si las moléculas orgánicas que se van a unir tienen los mismos o diferentes grupos funcionales. Los elementos conectores que son útiles en el presente documento pueden ser de cadena lineal, ramificada, aromáticos, y similares, preferiblemente de cadena lineal, y en general tendrán al menos aproximadamente 2 átomos de longitud, más generalmente más de aproximadamente 4 átomos de longitud y a menudo tantos como aproximadamente 12 o más átomos de longitud. Los elementos conectores generalmente comprenderán átomos de carbono, saturados de hidrógeno o insaturados, y por lo tanto pueden comprender alcanos, alquenos o alquinos y/u otros heteroátomos incluyendo nitrógeno, azufre, oxígeno y similares, que pueden estar sustituidos o no sustituidos, preferiblemente con grupos alquilo, alcoxilo, hidroxialquilo o hidroxialquilo. Los elementos conectores que son útiles serán de longitudes variables, proporcionando así un medio para optimizar las propiedades de unión de un compuesto ligando conjugado preparado a partir de estos. El primer compuesto orgánico que se une covalentemente a la biomolécula diana puede tener él mismo un grupo químicamente reactivo que proporciona un sitio par la unión a un segundo compuesto orgánico. Alternativamente, la primera molécula orgánica se puede modificar (sea químicamente, por unión de un compuesto que comprende un grupo químicamente reactivo con el mismo, o de otra forma) antes del cribado frente a una segunda biblioteca de compuestos orgánicos.

7. Compuestos identificados por el procedimiento de la invención

Los ligandos identificados por el procedimiento de la invención normalmente sirven como compuestos candidatos para el desarrollo de más variantes y derivados diseñados siguiendo técnicas conocidas. En particular, los ligandos identificados (incluyendo monóforos, diáforos, y estructuras más complejas) son sensibles a la química médica y maduración de afinidad, y se pueden optimizar rápidamente usando el diseño ayudado por la estructura. El presente procedimiento de anclaje extendido es superior frente a otras técnicas conocidas, incluyendo la química combinatoria, en cuanto que permite más modificaciones químicas enfocadas a los ligandos que ya se ha mostrado que se unen a diferentes sitios en una diana, p. ej., una MND.

8. Usos de los compuestos identificados

El procedimiento de la presente invención es una técnica poderosa para generar candidatos de fármacos, que permite la identificación de dos o más fragmentos que se unen débilmente o con afinidad de unión moderada a una diana en sitios cercanos uno de otro, y la síntesis de diáforos o moléculas más grandes que comprenden los fragmentos identificados (monóforos) covalentemente unidos entre sí para producir compuestos de mayor afinidad. Los diáforos o compuestos multiméricos similares incluyendo más compuestos ligando, son herramientas valiosas en el diseño racional de fármacos, que se puede modificar y optimizar más usando procedimientos de química médica y diseño ayudado por la estructura.

Los diáforos identificados de acuerdo con la presente invención y los candidatos de fármacos modificados y fármacos diseñados a partir de estos, se pueden usar, por ejemplo, para regular una variedad de procedimientos biológicos in vitro e in vivo, que requieren o dependen de la interacción específica del sitio de dos moléculas. Las moléculas que se unen a un polinucleótido se pueden usar, por ejemplo, para inhibir o prevenir la activación de genes bloqueando el acceso de un factor necesario para la activación al gen diana, o reprimir la transcripción estabilizando el ADN dúplex o interfiriendo con la maquinaria de transcripción.

9. Composiciones farmacéuticas

Los ligandos identificados de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, y los compuestos que comprenden dichos ligandos, así como los análogos de dichos compuestos, se pueden usar en composiciones farmacéuticas para prevenir y/o tratar una enfermedad o afección diana. La enfermedad o afección diana depende de la función biológica/fisiológica de la diana, p. ej., la MBD a la que se unen el ligando o los compuestos diseñados basándose en dicho(s) ligando(s). Los ejemplos de dichas enfermedades y afecciones se listan en la tabla anterior de MBD.

Las formas adecuadas de composiciones farmacéuticas, en parte dependen del uso o la vía de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica, por inhalación o por inyecciones. Dichas formas deberían permitir que el agente o composición alcancen una célula diana, esté presente la célula diana en un huésped multicelular o en un cultivo. Por ejemplo, los agentes o composiciones farmacológicas inyectadas en el torrente sanguíneo deberían ser solubles. Se conocen otros factores en la técnica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que previenen que el agente o composición ejerza su efecto.

El principio activo, cuando sea adecuado, también se puede formular en forma de sales farmacéuticamente aceptables (p. ej., sales de adición de ácido) y/o complejos. Las sales farmacéuticamente aceptables no son tóxicas a la concentración a la que se administran. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido tales como las que contienen sulfato, hidrocloruro, fosfato, sulfonato, sulfamato, sulfato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, ciclohexilsulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato.

Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden obtener a partir de ácidos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfónico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfónico, ácido ciclohexilsulfámico y ácido quínico. Dichas sales se pueden preparar, por ejemplo, haciendo reaccionar la forma de ácido o base libre del producto con uno o más equivalentes del ácido o base adecuado en un disolvente o medio en el que la sal es insoluble, o en un disolvente tal como agua, que después se separa a vacío o por liofilización, o por intercambio de iones de una sal existente por otro ion en una resina de intercambio iónico adecuada.

También se pueden usar vehículos o excipientes para facilitar la administración del compuesto. Los ejemplos de vehículos y excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diferentes azúcares tales como lactosa, glucosa o sacarosa, o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y disolventes fisiológicamente compatibles. Las composiciones o composiciones farmacéuticas se pueden administrar por diferentes vías incluyendo, pero no limitado, a vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intrapericárdica, intracoronaria, subcutánea, intramuscular, oral, tópica o transmucosa.

La isotonicidad deseada de las composiciones se puede lograr usando cloruro sódico u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato sódico, propilenglicol, polioles (tales como manitol y sorbitol), u otros solutos inorgánicos u orgánicos.

Las técnicas y los ingredientes para hacer formulaciones farmacéuticas en general se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, Mack Publishing Co., Easton PA, 1990. Véase también Wang y Hanson "Parental Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parental Science and technology, Technical Report nº 19, Supp. 42-2S (1988). El médico puede determinar mejor el formato de administración adecuado para cada enfermedad o afección individualmente, y también en vista de la afección del paciente.

Las composiciones farmacéuticas se preparan mezclando los ingredientes siguiendo procedimientos generalmente aceptados. Por ejemplo, los componentes seleccionados se pueden mezclar simplemente en una mezcladora u otro dispositivo estándar para producir una mezcla concentrada que después se puede ajustar a la concentración y viscosidad finales por la adición de agua o agente espesante y posiblemente un tampón para controlar el pH o un soluto adicional para controlar la tonicidad.

Las cantidades de diferentes compuestos para usar en las composiciones de la invención que se van a administrar, se pueden determinar por procedimientos estándar. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz es entre aproximadamente 100 mg/kg y 10^{-12} mg/kg dependiendo de la edad y tamaño del paciente, y la enfermedad o trastorno asociado con el paciente. En general, es una cantidad entre aproximadamente 0,05 y 50 mg/kg del individuo que se va a tratar. La determinación de la dosis real depende del criterio del médico habitual.

10. Descripción de realizaciones preferidas

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención se usan para identificar ligandos de bajo peso molecular que se unen al menos a dos sitios de interés diferentes en proteínas diana a través de conectores disulfuro intermedios formados entre un primer ligando y la proteína y un grupo reactivo del primer ligando y un segundo ligando, respectivamente.

Los ligandos de bajo peso molecular cribados en realizaciones preferida de la invención, en su mayor parte serán moléculas químicas pequeñas que serán menores de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, normalmente menores de aproximadamente 1500 daltons de tamaño, más normalmente menores de aproximadamente 750 daltons de tamaño, preferiblemente menos de aproximadamente 500 daltons de tamaño, a menudo menos de aproximadamente 250 daltons de tamaño, y lo más a menudo menos de aproximadamente 200 daltons de tamaño, aunque moléculas orgánicas mayores de 2000 daltons de tamaño también serán útiles en el presente documento. En una realización preferida, dichas moléculas químicas pequeñas son moléculas orgánicas pequeñas distintas de polipéptidos o polinucleótidos. En otra realización preferida, las moléculas orgánicas pequeñas no son polímeras, es decir no son péptidos, polipéptidos, polinucleótidos, etc.

Las moléculas orgánicas se pueden obtener de una fuente comercial o no comercial. Por ejemplo, un gran número de compuestos químicos orgánicos pequeños se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales, tales como Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI y Sigma Chemical Co., Sr. Louis, MO, o se pueden obtener por síntesis química. Los procedimientos de la presente invención se usan preferiblemente para cribar bibliotecas de compuestos orgánicos pequeños que llevan los grupos reactivos adecuados, preferiblemente grupos tiol o tiol protegido.

En los últimos años, las bibliotecas combinatorias, que normalmente tienen de docenas a cientos de miles de miembros, se han convertido en una herramienta principal para el descubrimiento de ligandos y el desarrollo de fármacos. En general, las bibliotecas de compuestos orgánicos que son útiles en el presente documento comprenderán al menos 2 compuestos orgánicos, a menudo al menos aproximadamente 25 compuestos orgánicos diferentes, más a menudo al menos aproximadamente 100 compuestos orgánicos diferentes, normalmente al menos aproximadamente 300 compuestos orgánicos diferentes, preferiblemente al menos aproximadamente 2500 compuestos orgánicos diferentes, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 5000 o más compuestos orgánicos diferentes. Las poblaciones se pueden seleccionar o construir de modo que cada molécula individual de la población se pueda separar espacialmente de las otras moléculas de la población (p. ej., en un pocillo de microvaloración separado) o dos o más miembros de la población pueden combinarse si los procedimientos de deconvolución están disponibles. Normalmente, cada miembro de la biblioteca de moléculas orgánicas será de la misma clase química (es decir, todos los miembros de la biblioteca son aldehídos, todos los miembros son aminas primarias, etc.), sin embargo, las bibliotecas de compuestos orgánicos también pueden contener moléculas de dos o más clases químicas diferentes.

En una realización preferida, la molécula biológica diana (MBD) es un polipéptido que contiene o se ha modificado para que contenga un grupo tiol, grupo tiol protegido o enlace disulfuro reversible. Después, la MBD se ha reaccionar con un extensor molecular pequeño (EMP), que incluye una parte que tiene afinidad por un primer sitio de interés en la MBD y un grupo reactivo con el tiol, tiol protegido o enlace disulfuro reversible en la MBD. Como se ha discutido antes, la unión entre la MBD y el EMP es un enlace covalente reversible (anclaje extendido "dinámico") para formar un complejo de MBD-EMP. El complejo de MBD-EMP después se usa para cribar una biblioteca de monóforos que contiene disulfuro para identificar un miembro de la biblioteca que tenga afinidad intrínseca, más preferiblemente la mayor afinidad intrínseca, para un segundo sitio de unión (sitio de interés) en la molécula diana. En una realización preferida, el grupo reactivo en la MBD es un grupo tiol libre que aporta el extensor, y la biblioteca está hecha de compuestos de peso molecular pequeño que contienen grupo tiol reactivo. Para que el conector disulfuro capture el ligando más estable, la reacción debe hacerse por intercambio rápido para permitir el equilibrio. En una realización preferida, la reacción se lleva a cabo en presencia de una cantidad catalítica de un agente de reducción tal como 2-mercaptoetanol. El equilibrio termodinámico alcanzado en presencia de un agente de reducción favorecerá la formación de un enlace disulfuro entre un grupo tiol del extensor en la MBD modificada y un grupo tiol en un miembro de la biblioteca que tiene actividad intrínseca por la MBD. Por lo tanto, dos ligandos diferentes con afinidad intrínseca por dos sitios diferentes en la misma MBD se unirán covalentemente para formar un diáforo. El diáforo se unirá a la MBD con una afinidad mayor que cualquiera de las unidades de monóforo que lo constituyen. Las unidades de monóforo en un diáforo pueden ser de la misma o diferentes clases químicas. Por la "misma clase química" se entiende que cada componente monóforo es del mismo tipo químico, es decir, ambos son aldehídos o aminas,
etc.

En una realización particular, la diana puede estar presente en un chip puesto en contacto con los candidatos de ligando. En este caso, el enlace covalente que une el primer ligando a la diana se puede formar con el chip, en cuyo caso, el chip se convertirá en parte del enlace covalente, representando una clase especial de "extensores moleculares pequeños".

La biblioteca de los candidatos de ligando, p. ej., ligandos moleculares orgánicos pequeños, se puede unir a una superficie sólida, p. ej., presentados en perlas, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 98/11436 publicada el 19 de marzo, 1998. En una realización particular, las perlas se modifican para introducir grupos reactivos, p. ej., un nivel bajo de grupos sulfhidrilo. Se sintetiza entonces una biblioteca de candidatos de ligandos sobre las perlas modificadas. Posteriormente, la biblioteca se incuba, en condiciones oxidantes, con la diana que contiene o modificada para que contenga un grupo reactivo, p. ej., un grupo sulfhidrilo, de modo que pueda formarse un enlace disulfuro entre la diana y el sulfhidrilo en la perla. Después, las perlas se lavan en presencia de un agente de reducción, seguido de incubación en presencia de un agente de neutralización de sulfhidrilo, tal como yodoacetato. Después, las perlas se pueden lavar en condiciones desnaturalizantes para eliminar cualquier diana no unida covalentemente.

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Ejemplos

La invención se ilustra mejor por los siguientes ejemplos no limitantes. Salvo que se indique lo contrario, todos los procedimientos de biología molecular estándar se llevan a cabo de acuerdo con protocolos descritos en (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, vols. 1-3, editado por Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, vols. 1-2, editado por Ausbubel, F.,Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Seidman, J.G., Smith, J., y Struhl, K., Wiley Interscience, 1987).

El concepto del procedimiento básico de anclaje lo han descrito Erlanson y col, véase antes, y en la publicación PCT nº WO 00/00823. El procedimiento de "anclaje extendido" se ilustra en esta solicitud usando la caspasa 3 como una molécula biológica diana (MBD). Las caspasas son una familia de cisteína proteasas, que se sabe que participan en el inicio y la ejecución de la muerte celular programada (apoptosis). La primera caspasa (ahora denominada caspasa-1) se diseñó originalmente como enzima convertidora de inerleuquina-1\beta (ICE) (Thornburry y col., Nature 356:768-774 [1992]; Cerretti y col., Science 356:97-100 [1992]). Posteriormente se han identificado y caracterizado un gran número de caspasas que forman una familia de caspasas. Actualmente hay al menos 10 miembros en la familia (caspasa-1 a caspasa-10). Las caspasas se expresan en las células en una forma enzimáticamente inactiva y se convierten en activadas por escisión proteolítica en respuesta a un estímulo apoptótico. La forma de proenzima inactiva consiste en un dominio grande y uno pequeño (subunidad) además de un dominio N-terminal inhibidor. La activación de la caspasa implica el procesamiento de la proenzima en las subunidades grande y pequeña, lo cual ocurre internamente dentro de la molécula. Las caspasas son activadas por autoagregación y autoprocesamiento (como en el inicio de la apoptosis), o por escisión por una caspasa activada corriente arriba (como en la fase de ejecución de la apoptosis). Para una revisión, véase, por ejemplo, Cohen G.M., Biochem. J. 326:1-16(1997).

Basándose en un inhibidor de caspasa tetrapeptídico conocido (Ator y Dolle, Current Pharmaceutical Design 1:191-210 (1995)), se sintetizó un extensor: éster de 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-4-carboxi-2-oxo-butilo del ácido 2,6-dicloro-benzoico (mostrado como compuesto 5 en la figura 4), cuya síntesis se describe en el siguiente Ejemplo 2. En la figura 4 se muestra una estructura genérica de extensor. La caspasa se modificó haciéndola reaccionar con el extensor (Ejemplo 3) y posteriormente se usó como una molécula biológica diana para cribar la biblioteca de disulfuros como se describe en el Ejemplo 1, usando el procedimiento de anclaje extendido.

Todos los materiales disponibles en el comercio se usaron como se recibieron. Todos los compuestos sintetizados se caracterizaron por RMN de ^{1}H [Espectrómetro Bruker (Billerica, MA) DMX400 MHz] y HPLC-EM (Hewlett-Packard Series 1100 MSD).

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Ejemplo 1

Bibliotecas de disulfuros

Las bibliotecas de disulfuro se sintetizaron usando la química estándar, a partir de las siguientes clases de compuestos: aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos, aminas, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Por ejemplo, los miembros de la biblioteca que contienen disulfuro se hicieron a partir de ácidos carboxílicos disponibles en el comercio y cistamina protegida con mono-N-(terc-butoxicarbonilo) (mono-BOC-cistamina), adaptando el procedimiento de Parlow y colaboradores (Parlow y Normansell, Mol. Diversity 1: 266-269 [1995]). Brevemente, se inmovilizaron 260 \mumol de cada ácido carboxílico sobre 130 \mumol equivalentes de 4-hidroxi-3-nitrobenzofenona sobre resina de poliestireno, usando 1,3-diisopropilcarbodiimida (DIC) en N,N-dimetilformamida (DMF). Después de 4 h a temperatura ambiente, la resina se aclaró con DMF (x2), diclorometano (DCM, x3) y tetrahidrofurano (THF, x1), para separar el ácido no acoplado y la DIC. Los ácidos se escindieron de la resina por formación de amida con 66 \mumol de cistamina protegida como mono-BOC en THF. Después de reacción durante 12 h a temperatura ambiente, se evaporó el disolvente, y el grupo BOC se eliminó de la mitad no acoplada de cada disulfuro usando ácido trifluoroacético al 80% (TFA) en DCM. Los productos se caracterizaron por HPLC-EM, y esos productos que estaban sustancialmente puros se usaron sin más purificación. Se hicieron un total de 530 compuestos usando esta metodología.

También se construyeron bibliotecas a partir de cistamina protegida como mono-BOC y una variedad de cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. En el caso de los cloruros de sulfonilo, se acoplaron 10 \mumol de cada cloruro de sulfonilo con 10,5 \mumol de cistamina protegida como mono-BOC en THF (con diisopropiletilamina al 2%) en presencia de 15 mg de poli(4-vinilpiridina). Después de 48 h, la poli(4-vinilpiridina) se separó por filtración y se evaporó el disolvente. El grupo BOC se separó usando TFA al 50% en DCM. En el caso de los isotiocianatos, se acoplaron 10 \mumol de cada isocianato o isotiocianto con 10,5 \mumol de cistamina protegida como mono-BOC en THF. Después de reacción durante 12 h a temperatura ambiente, el disolvente se evaporó, y el grupo BOC se eliminó usando TFA al 50% en DCM. Se hicieron un total de 212 compuestos usando esta metodología.

Finalmente, se construyeron bibliotecas basadas en oxima haciendo reaccionar 10 \mumol de aldehídos o cetonas específicos con 10,5 \mumol de HO(CH_{2})_{2}S-S(CH_{2})_{2}ONH_{2} en metanol/cloroformo 1:1 (con ácido acético al 2% añadido) durante 12 h a temperatura ambiente para dar el producto oxima. Se hicieron un total de 448 compuestos usando esta metodología.

Los miembros individuales de la biblioteca se volvieron a disolver en acetonitrilo o dimetilsulfóxido a una concentración final de 50 ó 100 mM. Después se juntaron partes alícuotas de cada uno de estos en grupos de 8-15 compuestos discretos, cada miembro del grupo con un peso molecular único.

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Ejemplo 2

Síntesis del extensor (EMP)

Para el procedimiento de anclaje extendido, se sintetizó el extensor (éster de 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-4-carboxi-2-oxo-butilo del ácido 2,6-dicloro-benzoico mostrado como compuesto 5 en la figura 4), usando una serie de reacciones químicas como se muestran en la figura 4 y se describe a continuación.

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Síntesis del éster de 4-terc-butilo del ácido 2-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-succínico (compuesto 2, Figura 4)

Se mezclaron éster de pentafluorofenilo del ácido acetilsulfanil-acético (1,6 g, 5,3 mmol) y H-Asp(OtBu)-OH (1 g, 5,3 mmol) en 20 ml de diclorometano seco (DCM). Después, se añadieron 1,6 ml de trietilamina (11,5 mmol), y la reacción se dejó que avanzara a temperatura ambiente durante 3,5 horas. La capa orgánica después se extrajo con 3 x 15 ml de carbonato sódico 1 M, las fracciones acuosas combinadas se acidificaron con 100 ml de hidrógenosulfato sódico 1 M y se extrajeron con 3 x 30 ml de acetato de etilo. Las fracciones orgánicas combinadas se aclararon con 30 ml de hidrógenosulfato sódico 1 M, 30 ml de NaCl 5 M, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para dar 1,97 g

\hbox{de un jarabe casi
incoloro que se usó sin más purificación  Pm = 305 (encontrado 306,
M+1).}

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Síntesis del éster de terc-butilo del ácido 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-5-cloro-4-oxo-pentanoico (compuesto 3, Figura 4)

El ácido libre (compuesto 2) se disolvió en 10 ml de tetrahidrofurano seco (THF), se enfrió a 0ºC, y se trató con 0,58 ml de N-metil-morfolina (5,3 mmol) y 0,69 de cloroformiato de isobutilo. Se formó inmediatamente un precipitado blanco denso, y después de 30 minutos la reacción se filtró a través de una frita de vidrio y se transfirió a un nuevo matraz con 10 ml adicionales de THF. Mientras tanto, se preparó el diazometano haciendo reaccionar 1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina (2,3 g, 15,6 mmol) con 7,4 ml de disolución acuosa de KOH al 40% y 25 ml de éter dietílico durante 45 minutos a 0ºC. Después la capa de éter amarilla se decantó en la reacción que contenía el anhídrido mixto, y la reacción se dejó avanzar mientras se calentaba lentamente a temperatura ambiente a lo largo de un periodo de 165 minutos. La reacción se enfrió a 8ºC y se añadieron gota a gota 1,5 ml de HCl 4 N en dioxano (total 6 mmol). Esto dio como resultado mucho burbujeo, y la solución amarilla se volvió incolora. La reacción se dejó avanzar durante dos horas mientras se calentaba gradualmente a temperatura ambiente y después se inactivó con 1 ml de ácido acético glacial. El disolvente se separó a presión reducida y el residuo se volvió a disolver en 75 ml de acetato de etilo, se aclaró con 2 x 50 ml de disolución saturada de bicarbonato sódico, 50 ml de NaCl 5 M, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó a sequedad antes de purificación por cromatografía ultrarrápida usando cloroformo:acetato de etilo 90:10 para dar 0,747 g de aceite amarillo

\hbox{claro (2,2 mmol, 42%
a partir de (1)). Esperado Pm = 337,7, encontrado 
338-(M+1).}

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Síntesis del éster de 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-4-terc-butoxicarbonil-2-oxo-butilo del ácido 2,6-dicloro-benzoico (compuesto 4, Figura 4)

Se disolvió clorometilcetona (compuesto 3) (0,25 g, 0,74 mmol) en 5 ml de N,N-dimetilformamida seca (DMF), a la que se añadieron 0,17 g de ácido 2,6-diclorobenzoico (0,89 mmol) y 0,107 g de KF (1,84 mmol). La reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente durante 19 horas, momento en el que se diluyó con 75 ml de acetato de etilo, se aclaró con 2 x 50 ml de solución saturada de bicarbonato sódico, 50 ml de hidrógenosulfato sódico 1 M, 50 ml de NaCl 5 M, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se secó a presión reducida para dar un jarabe amarillo que por HPLC-EM se puso de manifiesto que era aproximadamente 75% de producto y 25% sin reaccionar (3). Este se usó sin más purificación. Esperado Pm = 492,37, encontrado 493 (M+1).

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Síntesis del éster 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-4- carboxi-2-oxo-butilo del ácido 2,6-dicloro-benzoico

El producto de la etapa previa (compuesto 4) se disolvió en 10 ml de DCM seco, se enfrió a 0ºC, y se trató con 9 ml de ácido trifluoroacético (TFA). Después la reacción se retiró del baño de hielo y se dejó calentar a temperatura ambiente a lo largo de un periodo de una hora. El disolvente se separó a presión reducida, y el residuo se volvió a disolver dos veces en DCM y se evaporó para separar el TFA residual. El producto bruto se purificó por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa para dar 101,9 mg (0,234 mmol, 32% a partir de (3)) de polvo blanco higroscópico. Esperado PM = 436,37, encontrado 437 (M+1). Este se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) para dar una solución madre 50 mM.

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Ejemplo 3

Modificación de la caspasa 3 con extensor

La caspasa 3 se clonó, se sobreexpresó y se purificó usando técnicas estándar (Rotonda y col., Nature Structural Biology 3(7):619-625 (1996)). A 2 ml de una disolución de caspasa 0,2 mg/ml se añadieron 10 ml de éster de 3-(2-acetilsulfanil-acetilamino)-4-carboxi-2-oxo-butilo del ácido 2,6-dicloro-benzoico 50 mM (compuesto 5, Fig. 3) sintetizado como se ha descrito en el Ejemplo 2, y la reacción se dejó avanzar a temperatura ambiente durante 3,5 horas, momento en el que la espectroscopía de masas puso de manifiesto la modificación completa de la subunidad grande de la caspasa 3 (Pm 16861 Da, calculado Pm 16860 Da). El tioéster se desprotegió por adición de 0,2 ml de hidroxilamina 0,5 M tamponada con tampón de PBS, y dejando que la reacción avanzara durante 18 horas, momento en el que la subunidad grande tenía una masa de 16819 Da (calculada 16818 Da). La proteína se concentró en una unidad Ultrafree 5 MWCO (Millipore) y el tampón se intercambió a TES 0,1 M pH 7,5 usando una columna Nap-5 (Amersham Pharmacia Biotech). La estructura de la caspasa-3 "extendida" resultante se muestra en la
figura 6.

Después la proteína se cribó frente a la biblioteca de disulfuro preparada como se ha descrito antes en el Ejemplo 1, y usando la metodología descrita a continuación en el Ejemplo 4.

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Ejemplo 4

Cribado de la biblioteca de disulfuro

En un experimento típico, se añadió 1 \mul de una solución de DMSO que contenía una biblioteca de 8-15 compuestos que contenían disulfuro a 49 \mul de tampón que contenía proteína modificada con extensor. Cuando se usó la espectroscopía de masas para la identificación del ligando unido, los compuestos se eligieron de modo que cada uno tenía un peso molecular único. Por ejemplo, estos pesos moleculares difieren en al menos 10 unidades de masa atómica, de modo que la deconvolución no es ambigua. Aunque se eligieron normalmente grupos de 8-15 compuestos que contenían disulfuro para el cribado debido a la facilidad de la deconvolución, también se pueden usar grupos mayores. La proteína estaba presente en una concentración de \sim15 \muM, y cada uno de los miembros de la biblioteca de disulfuros estaba presente en \sim0,2 mM, y por lo tanto, la concentración total de todos los miembros de la biblioteca de disulfuros era \sim2 mM. La reacción se hizo en un tampón que contenía fosfato potásico 25 mM (pH 7,5) y 2-mercaptoetanol 1 mM, aunque se pueden usar otros tampones y agentes de reducción. Las reacciones se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante al menos 30 min. Estas condiciones se pueden variar considerablemente dependiendo de la facilidad con la que la proteína ioniza en el espectrómetro de masas, la reactividad de la(s) cisteína(s) específica(s),
etc.

Después de equilibrar la caspasa-3 conjugada con aspartilo (Ejemplo 3) y la biblioteca (Ejemplo 1), la reacción se inyectó en un HPLC HP1100 y se cromatografió en una columna C_{18} unida a un espectrómetro de masas (Finnigan-MAT LCQ, San Jose, CA). Se hizo la deconvolución de los iones con cargas múltiples de la proteína con software disponible (XCALIBUR) para llegar a la masa de la proteína. Después, la identidad de cualquier miembro de la biblioteca unido por un enlace disulfuro a la proteína se determinó fácilmente restando la masa conocida de la proteína no modificada de la masa observada. Este procedimiento supone que la unión de un miembro de la biblioteca no cambia notablemente las características de ionización de la propia proteína, una suposición conservadora porque en muchos casos la proteína será al menos 20 veces mayor que cualquier miembro dado de la biblioteca. Esta suposición se confirmó demostrando que moléculas pequeñas seleccionadas por una proteína no son seleccionadas por otras proteínas.

Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 6. El espectro en el lado derecho de la figura 6 muestra el resultado de hacer reaccionar la caspasa-3 "extendida" (sintetizada como se describe en el ejemplo 3), con una molécula que contiene disulfuro identificada de un grupo como modificación de la caspasa-3 extendida. El pico predominante obtenido (masa de 17,094) corresponde a la caspasa-3 covalentemente unida al ligando molecular pequeño que tiene una afinidad intrínseca por un segundo sitio de interés en la caspasa-3, dando como resultado el compuesto diáforo mostrado encima del pico.

\newpage

El espectro de masas mostrado en el lado izquierdo es una espectro de masas de deconvolución de caspasa-3 no modificada (una diana polipeptídica que contiene cisteína), y el mismo ligando molecular pequeño que contiene disulfuro usado antes. El espectro pone de manifiesto un pico predominante correspondiente a la masa de la caspasa-3 no modificada (16,614 Da). Un pico significativamente más pequeño representa el disulfuro de la caspasa-3 unido al 2-aminoetanotiol (masa combinada: 16,691 Da). Obsérvese que aquí el ligando molecular pequeño no se selecciona porque su sitio de unión está demasiado lejos de la cisteína reactiva y no se ha introducido extensor.

El compuesto candidato inicial, identificado como se ha descrito antes, se modificó después con el fin de evaluar la importancia relativa de diferentes sustituyentes en la unión específica a la caspasa-3.

Claims (14)

1. Un procedimiento que comprende:

(i) proporcionar una molécula biológica diana (MBD) que contiene o modificada para que contenga un nucleófilo reactivo cerca de un primer sitio de interés en la MBD;

(ii) poner en contacto la MBD de (i) con una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas en presencia de un extensor molecular pequeño (EMP) bifuncional que tiene un primer y un segundo grupo funcional, en el que el primer grupo funcional del EMP forma un enlace covalente reversible con el nucleófilo en la MBD, y el segundo grupo funcional del EMP forma un enlace covalente reversible con un grupo funcional en un miembro de dicha biblioteca para formar un complejo de MBD-EMP-miembro de la biblioteca reversible, y

(iii) identificar el miembro de la biblioteca de (ii).

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el extensor molecular pequeño bifuncional también forma un enlace no covalente con el primer sitio de interés en la MBD.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo en condiciones tales que el EMP forma un enlace covalente reversible con un grupo funcional en un miembro de dicha biblioteca que tiene la mayor afinidad por un segundo sitio de interés en la MBD.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el primer y segundo grupos funcionales en el EMP bifuncional son tioles libres o tioles protegidos.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que en la biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas cada miembro tiene un tiol libre o grupo de unión de disulfuro intercambiable.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo en condiciones de intercambio de tiol en las que el EMP forma un enlace disulfuro con el miembro de la biblioteca que tiene la mayor afinidad por el segundo sitio de interés en la MBD.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que las condiciones de intercambio de tiol se dan por la adición de un agente de reducción de disulfuro seleccionado del grupo que consiste en mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), ácido mercaptopropanoico, glutatión, cistamina, cisteína, tri(carboxietil)fosfina (TCEP) y tris(cianoetil)fosfina.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, que además comprende la etapa de sintetizar una molécula que consiste esencialmente en el extensor molecular pequeño, en el que el primer grupo funcional ya no es reactivo con el nucleófilo de la MBD, y el enlace disulfuro entre el segundo grupo funcional y el miembro de la biblioteca identificado en la etapa (i) se sustituye por un grupo diferente.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el enlace disulfuro se sustituye por un grupo alquilo.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende la etapa de sintetizar derivados de la molécula.

11. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el nucleófilo reactivo es un tiol.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la MBD se selecciona del grupo que consiste en receptores de superficie celular linfocíticos, enzimas, receptores de esteroides, proteínas nucleares, inhibidores enzimáticos alostéricos, factores de coagulación, serina/treonina quinasas y desfosforilasas, treonina quinasas y desfosforilasas, enzimas bacterianas, enzimas fúngicas y enzimas víricas, moléculas de transducción de señales, factores de transcripción, proteínas asociadas con la síntesis o degradación de ADN y/o ARN, inmunoglobulinas, hormonas, receptores de citoquinas, quimioquinas y sus receptores, ligandos y receptores para tirosina quinasa, neurotrofinas y sus ligandos, y otras hormonas y receptores.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la MBD se selecciona del grupo que consiste en eritropoyetina (EPO), receptor del factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), receptor del factor estimulador de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), trombopoyetina (TPO), interleuquinas, p. ej. IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-11, IL-12, hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placental humano (LPL), CNTF, oncostatina, RANTES MIP\beta, IL-8, insulina, factor de crecimiento 1 de tipo insulina (IGF-1), factor de crecimiento epidérmico (EGF), heregulina-\alpha y heregulina-\beta, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento placental (PLGF), factores de crecimiento tisulares (TGF-\alpha y TGF-\beta), factores de crecimiento de nervios (NGF), factores morfogénicos óseos, hormona folículo estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH), factor de necrosis tisular (TNF), factor de apoptosis 1 y 2 (AP-1 y AP-2) y
mdm2.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la MBD se selecciona del grupo que consiste en IgE/IgER, ZAP-70, Ick, syk, ITK/BTK, TACE, Catepsina S y F, CD11a, LFA/ICAM, VLA-4, CD28/B7, CTLA4, TNF alfa y beta, (y los receptores de TNF p55 y p75), CD40L, p38 map quinasa, IL-2, IL-4,IL-13, IL-15, Rac 2, PKC zeta, IL-8, TAK-1, jnk, IKK2, IL-18, caspasas 1, 3, 8 y 9, IL-1/receptor de IL-1, BACE, VIH integrasa, PDE IV, Hepatitis C helicasa, Hepatitis C proteasa, rinovirus proteasa, triptasa, cPLA (fosfolipasa A2 citosólica), CDK4, quinasa c-jun, adaptadores tales como Grb2, GSK-3, AKT, MEKK-1, PAK-1, raf, TRAF 1-6, Tie2, ErbB 1 y 2, FGF, PDGF, PARP, CD2, receptor C5a, CD4, CD26, CD3, TGF-alfa, NF-kB, IKK beta, STAT 6, neuroquinina-1, PTP-1B, CD45, Cdc25A, SHIP-2, TC-PTP, PTP-alfa, LAR y p53 humano, bax/bcl2 y mdm2.