ES2323025T3 - Nuevo biotensioactivo de lipopolisacarido. - Google Patents
Nuevo biotensioactivo de lipopolisacarido. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2323025T3 ES2323025T3 ES98123614T ES98123614T ES2323025T3 ES 2323025 T3 ES2323025 T3 ES 2323025T3 ES 98123614 T ES98123614 T ES 98123614T ES 98123614 T ES98123614 T ES 98123614T ES 2323025 T3 ES2323025 T3 ES 2323025T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- lipopolysaccharide
- eps
- acid
- water
- biotensive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S516/00—Colloid systems and wetting agents; subcombinations thereof; processes of
- Y10S516/905—Agent composition per se for colloid system making or stabilizing, e.g. foaming, emulsifying, dispersing, or gelling
- Y10S516/914—The agent contains organic compound containing nitrogen, except if present solely as NH4+
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S516/00—Colloid systems and wetting agents; subcombinations thereof; processes of
- Y10S516/905—Agent composition per se for colloid system making or stabilizing, e.g. foaming, emulsifying, dispersing, or gelling
- Y10S516/914—The agent contains organic compound containing nitrogen, except if present solely as NH4+
- Y10S516/915—The compound contains -C[=O]NHH where substitution may be made for the hydrogen
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S516/00—Colloid systems and wetting agents; subcombinations thereof; processes of
- Y10S516/905—Agent composition per se for colloid system making or stabilizing, e.g. foaming, emulsifying, dispersing, or gelling
- Y10S516/917—The agent contains organic compound containing oxygen
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S516/00—Colloid systems and wetting agents; subcombinations thereof; processes of
- Y10S516/905—Agent composition per se for colloid system making or stabilizing, e.g. foaming, emulsifying, dispersing, or gelling
- Y10S516/917—The agent contains organic compound containing oxygen
- Y10S516/918—The compound contains carboxylic acid ester group
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO BIO-SUPERFICIOACTIVO DE LIPOPOLISACARIDOS, A UNA CEPA DE ACINETOBACTER CALCOACETICUS QUE PRODUCE ESTE BIO-SUPERFICIOACTIVO Y A UN PROCEDIMIENTO PARA SU PREPARACION. EL BIO-SUPERFICIOACTIVO TIENE UNA ELEVADA CAPACIDAD DE EMULSION, PROMUEVE LA BIODEGRADACION DE HIDROCARBUROS EN AGUA Y FAVORECE LA ADHERENCIA DE MICROORGANISMOS A LA ZONA DE CONTACTO AGUA/ACEITE.
Description
Nuevo biotensioactivo de lipopolisacárido.
La presente invención se refiere a un nuevo
biotensioactivo de lipopolisacárido, a una cepa de Acinetobacter
calcoaceticus que produce este biotensioactivo, a un
procedimiento para la preparación del biotensioactivo y a su
utilización en los campos energético y medioambiental.
Son bien conocidos los fenómenos que resultan de
la fuga de contaminantes de hidrocarburo en entornos acuosos. El
principal mecanismo con el que reacciona el ecosistema frente a la
contaminación por hidrocarburos consiste en la biodegradación por
la flora hidrocarbonoclasta.
El petróleo, que en condiciones normales es un
líquido que es sustancialmente inmiscible en agua, tiende a
extenderse sobre la superficie del agua en forma de una capa fina
("mancha").
Con respecto a la biodegradación, debe
considerarse como positivo cualquier fenómeno que pueda romper y
dispersar la "mancha". De hecho, una solubilización parcial o
adhesión sobre partículas sólidas en suspensión o el emulsionamiento
en agua favorece la acción de microorganismos a los que se les
facilita una superficie de unión más amplia.
Basándose en estas consideraciones, se ha
producido una amplia gama de agentes emulsionantes/dispersantes
sintéticos, cuya utilización sin embargo es todavía objeto de
opiniones opuestas debido a la toxicidad y persistencia en el medio
ambiente de estos productos.
Esto explica que en los últimos años se haya
estudiado ampliamente la posibilidad de utilizar biotensioactivos
de origen microbiano. De hecho, los biotensioactivos son
biodegradables y, por lo tanto, potencialmente menos tóxicos que
los compuestos sintéticos utilizados en la actualidad.
Un grupo de biotensioactivos de particular
interés está representado por biopolímeros de lipopolisacárido
producidos a partir de cepas de Acinetobacter
calcoaceticus.
En la actualidad, el único producto disponible
en el mercado es Emulsan, un lipopolisacárido polianiónico obtenido
mediante la fermentación de la cepa Acinetobacter
calcoaceticus RAG1 ATCC 31012 (patente US nº 3.941.692, patente
US nº 4.395.354).
Este biotensioactivo es responsable de la
formación y estabilización de emulsiones de aceite/agua y se utiliza
esencialmente para el transporte de petróleos crudos pesados en
asociación con agentes tensioactivos sintéticos (documento PCT WO
8501.889) y para la limpieza de tanques.
Emulsan también puede utilizarse en campos tales
como los cosméticos (documentos EP 242.296, DE 3.610.384, JP
62.286.914, JP 62.289.508) y los detergentes (documento JP
62.297.397).
Es conocido que la dispersión de aceite en agua
producida por un biotensioactivo, además de aumentar la superficie
de la interfase agua/aceite, también modifica sus características.
Esto puede provocar una variación en la afinidad entre la
superficie del aceite y los microorganismos.
En particular, puede cambiar la afinidad de la
flora hidrocarbonoclasta cuya adhesión a la interfase agua/aceite
es una suposición esencial para la activación de procesos de
biodegradación.
Actualmente, no es posible predecir a
priori si un agente dispersante mejorará o inhibirá la adhesión
de células a hidrocarburos, principalmente debido a que el fenómeno
está gobernado por complejas interacciones entre la membrana
celular y la superficie del aceite.
Sin embargo, puede suponerse que los
biotensioactivos de lipopolisacárido, debido a su estructura lineal
y alto peso molecular, modifican enormemente las características de
la interfase agua/aceite, determinando así una variación
significativa en la capacidad de adhesión de los
microorganismos.
De hecho se ha descubierto que el
biotensioactivo polimérico Emulsan inhibe la adhesión de
microorganismos a la interfase agua/aceite [E. Rosenberg et
al., Infect. Immun., 39, 1024-1028 (1983)]. En
otras palabras, la superficie del aceite cubierta con el
biotensioactivo se vuelve menos análoga a la biomasa y se reduce la
capacidad de adhesión a la misma.
También se ha observado que Emulsan reduce la
biodegradación de alcanos lineales y otros hidrocarburos saturados,
así como compuestos aromáticos, en un 50\div90%, por parte de
cultivos mixtos o cultivos purificados, [J.M. Foght et al.,
Appl. Environ. Microbiol., 55, 36-42 (1989)].
Como resultado, este grupo de agentes
emulsionantes no es adecuado para resolver problemas de tipo
ambiental que pueden tener lugar en el caso de escape de petróleos
crudos en agua.
Ahora se ha descubierto que es posible superar
las desventajas de la técnica conocida descrita anteriormente
mediante la utilización de una nueva cepa de Acinetobacter
calcoaceticus.
En particular, esta cepa produce un
biotensioactivo de lipopolisacárido hexocelular (también indicado en
la presente memoria con el término EPS) que presenta una excelente
capacidad para formar y estabilizar emulsiones de aceite/agua y al
mismo tiempo favorece la adhesión de microorganismos a la interfase
agua/aceite y promueve la biodegradación de hidrocarburos en
agua.
Se depositaron muestras de esta cepa el
22.07.1997, en el Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) donde
recibieron el número de depósito CBS 962.97.
En consecuencia un objeto de la presente
invención se refiere a la cepa A. calcoaceticus CBS
962.97.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a un biotensioactivo obtenido a partir de A. calcoaceticus
CBS 962.97.
Un objeto más de la presente invención se
refiere a un procedimiento para la preparación de este
biotensioactivo caracterizado por la utilización de la cepa A.
calcoaceticus CBS 962.97.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a la utilización del biotensioactivo así obtenido en los campos
energético y medioambiental.
Otros objetos de la presente invención resultan
evidentes a partir de la descripción y los ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Espectro de FT-IR de
EPS II en estado sólido en una pastilla de KBr.
Figura 2: Espectro de RMN de EPS II hidrolizado
con HCl 5 M a 105º durante 4 horas y luego extraído con éter.
Figura 3: Parte de la figura 2 que comprende
desde 4,5 hasta 5,5 ppm. Pueden observarse 3 hidratos de carbono a
partir de las tres parejas de dobletes referentes a las formas
\alpha y \beta en las que A,A'=
2-amino-2,6-didesoxialdohexosa,
B,B'= glucosamina y C,C'= hidrato de carbono sin identificar, S=
disolvente.
Figura 4: Espectro de RMN de protón de
2-amino-2,6-didesoxialdohexosa
que representa el constituyente principal del esqueleto del
polisacárido de EPS II.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de aislar una cepa microbiana
productora de biotensioactivo que puede emulsionar productos del
petróleo, se utilizaron muestras de suelo tomadas de lugares
contaminados por hidrocarburos (petróleo crudo, gasóleo y
gasolina).
Se llevó a cabo el aislamiento mediante fases
sucesivas de enriquecimiento y purificación en tierra salina que
contenía un hidrocarburo (por ejemplo fueloil, petróleo crudo,
aceite de vaselina, n-hexadecano o gasóleo) como
única fuente de carbono según el procedimiento de
Bushnell-Haas (J. Bateriol., 41,
653-673 (1940)), aunque pueden utilizarse otras
técnicas convencionales.
Se sometió a prueba la capacidad emulsionante de
los diversos fenotipos, de manera preliminar, por medio del
"ensayo de grietas" [Krigsvoll et al., "Microbial
emulsification of crude oil" en las Actas del 5º Congreso
Europeo de Biotecnología, vol. I, páginas 221-224,
Copenhagen, julio de 1990].
El procedimiento consiste en poner un cultivo
puro en contacto con un hidrocarburo, por ejemplo, petróleo crudo,
y en verificar la fractura del menisco de aceite que se obtiene en
presencia de un biotensioactivo.
Los resultados obtenidos mostraron la presencia
de una única cepa con una alta capacidad emulsionante. Esta cepa se
distinguió de manera preliminar con la abreviatura
ER-96.
Para la caracterización de la cepa
ER-96, se hizo referencia a los procedimientos
descritos en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. I,
página 306, Krieg & Holt Eds., 1984, Williams & Wilkins,
Baltimore, y en "The Biology of Acinetobacter", Towner,
Bergogne-Bérézin and Fewson eds., 1991, Plenum
Press, Nueva York. A continuación en la presente memoria, se
proporciona una lista de las características taxonómicas de la cepa
ER-96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en los resultados de las pruebas
morfológicas, fisiológicas y en cultivo, fue posible asignar la
cepa ER-96 de la presente invención al grupo
Acinetobacter y, más específicamente, a la especie
Acinetobacter calcoaceticus.
El examen de la cepa ER-96
también mostró características que la distinguen de otras cepas de
A. calcoaceticus descritas en la bibliografía de patentes:
A. calcoaceticus RAG-1 (Rosenberg, E.),
productora de Emulsan; A. calcoaceticus 217 (Tanaka, Y.),
productora de un nuevo biotensioactivo (documento
EP-401700).
Las características de las cepas
ER-96, RAG-1 y 217 se indican en la
tabla 1 a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se ha observado que cuando se cultiva la cepa
ER-96 en un medio líquido usando un hidrocarburo tal
como, por ejemplo, n-hexadecano, petróleo crudo,
gasóleo u otros productos, como fuente de carbono, ésta se emulsiona
a medida que crecen las células.
Si se cultiva la cepa ER-96
usando una fuente de carbono que es soluble en agua, tal como etanol
por ejemplo, no puede observarse directamente el emulsionamiento,
pero si se añaden hidrocarburos al cultivo, éstos se emulsionan
inmediatamente.
También se ha observado que si se cultiva la
cepa ER-96 usando etanol como fuente de carbono, y
durante la fermentación se toman alícuotas del caldo de cultivo y
se retiran las células, por ejemplo, mediante centrifugación, el
sobrenadante sin células emulsiona los hidrocarburos de una manera
muy estable y esta capacidad aumenta hasta el final de la
fermentación. Este resultado indica que el biotensioactivo producido
por la cepa ER-96 se libera en el caldo de
fermentación.
Las emulsiones de hidrocarburos en agua
obtenidas usando el biotensioactivo producido por la cepa
ER-96 permanecen estables durante meses. Durante un
periodo de tiempo y en condiciones estáticas, las gotas de aceite
dispersas ascienden hasta la superficie debido a la menor densidad
pero no hay coalescencia y la crema formada puede redispersarse muy
fácilmente.
La producción del biotensioactivo puede seguirse
midiendo la capacidad emulsionante del caldo de fermentación.
Para este fin, pueden utilizarse diversos
métodos que consisten en diluir una alícuota de caldo de cultivo,
sin células, con agua o con un tampón adecuado, añadir una cierta
cantidad de hidrocarburos, agitar esta mezcla y medir la turbidez
de la emulsión.
El sistema, que es extremadamente reproducible,
utilizado en la presente invención es una variación del
procedimiento descrito por Gutnick et al. [documento EP
16.546]: se añaden 50 \mul de una mezcla de hexadecano y
2-metilnaftaleno (1:1) a 3,25 ml de una disolución
de biotensioactivo en tampón
tris-hidroximetilaminometano 20 mM, pH 7,2, que
contiene MgSO_{4} 10 mM y se agita la mezcla completa; se mide la
densidad óptica de la emulsión a 620 nm en una cubeta con un camino
óptico de 1 cm.
Las unidades de capacidad emulsionante de
Eniricerche (1 UE) se refieren a la cantidad de biotensioactivo que
en las condiciones descritas anteriormente, producen una densidad
óptica de 1.
En consecuencia, la capacidad emulsionante
especificada se define como la capacidad emulsionante de 1 mg de
producto.
Continuando la investigación, se descubrió que
sometiendo el caldo de fermentación sin células y que contiene el
biotensioactivo, a diálisis, éste no se dializa, lo que indica la
naturaleza polimérica de este biotensioactivo.
El caldo de fermentación sin células y
liofilizado se indicó con la expresión EPS bruto.
Para determinar la estructura y las propiedades
del biotensioactivo, se aisló éste y se purificó.
Pueden utilizarse diversas técnicas para este
fin, tales como por ejemplo precipitación selectiva con sulfato de
amonio, concentración y desalación del caldo de fermentación por
medio de membranas de ultrafiltración en espiral tales como,
membranas planas o de fibras huecas, o también absorción selectiva
sobre un soporte sólido.
Según una forma de realización de la presente
invención, se hizo precipitar el biotensioactivo polimérico
mediante la adición de sulfato de amonio al caldo de fermentación.
El precipitado obtenido con concentraciones de sulfato de amonio
que oscilaban desde el 30 hasta el 40% del valor de saturación,
recuperado mediante centrifugación, dializado frente a agua y
liofilizado se denominó EPS.
Se demostró que este biotensioactivo consiste en
aproximadamente el 20-25% en peso de proteínas (kit
de ensayo de proteína Bio-Rad), aproximadamente el
65-70% en peso de un lipopolisacárido y el
porcentaje restante de iones metálicos, esencialmente magnesio y
sodio.
Se demostró que la capacidad emulsionante
específica de EPS es de 93 UE/mg (correspondiente a 428 UG/mg, en
el que UG se refiere a las unidades definidas por Gutnick et
al. [documento EPA 16546] para Emulsan que corresponde a 330
UG/mg).
\vskip1.000000\baselineskip
Para facilitar la caracterización fisicoquímica
y estructural del lipopolisacárido presente en el biotensioactivo,
se purificó EPS adicionalmente para eliminar cualquier posible
contaminación por parte de ácidos nucleicos y para separar el
lipopolisacárido de las proteínas y los iones metálicos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La retirada de los ácidos nucleicos puede
llevarse a cabo enzimáticamente con una nucleasa, mientras que puede
retirarse la fracción proteica mediante digestión enzimática o
tratamiento con fenol caliente o mediante una combinación de
ambos.
Según una forma de realización de la presente
invención, el EPS, sin ácidos nucleicos, se trató en primer lugar
con una proteasa y luego con fenol caliente según el procedimiento
de O. Westphal & K. Jann ["Methods in Carbohydrate
Chemistry", R.L. Whistler Ed., vol. V, páginas
83-91, Academic Press, Nueva York, 1965].
Se lavó el extracto acuoso con etil éter,
posteriormente se dializó frente a agua, EDTA sódico, agua, NaCl,
agua, HCl, agua, y luego se liofilizó. El biotensioactivo de
lipopolisacárido sin proteínas se denominó EPS II.
Se demostró que la capacidad emulsionante
específica de EPS II es aproximadamente la mitad (48 UE/mg) de la
de EPS.
La caracterización fisicoquímica de EPS II
proporcionó los siguientes resultados:
- -
- un peso molecular, determinado por HPLC-SEC (cromatografía de exclusión por tamaños), de aproximadamente 1.556.400 daltons.
- -
- análisis elemental (%): C = 44,5; H = 7,33; N = 4,99; O = 40,6; S = 0.
- -
- espectro infrarrojo (FT-IR).
Haciendo referencia a la figura 1: 3418
cm^{-1} (OH, NH); 2924-2854 cm^{-1} (CH); 1735
cm^{-1} (CO de ácido y éster) 1656-1550 cm^{-1}
(CO de amida); 1037 cm^{-1} (COC glucosídico).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de EPS II tal cual disuelto en
D_{2}O (agua deuterada) mostró la estructura de un polisacárido
que contiene cadenas alifáticas; además de la presencia de grupos
metileno, se observan señales muy intensas relacionadas con la
presencia de grupos metilo y acetilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron los azúcares aminados en EPS II
hidrolizado con el procedimiento de Z. Dische [Methods of Biochem.
Anal., 2, 352-358 (1967)] que consiste en desaminar
los azúcares con ácido nitroso, destruir el reactivo en exceso con
carbamato de amonio y hacer reaccionar los azúcares desaminados con
indol en HCl.
- -
- Se determinaron otros azúcares con el procedimiento de Dubois et al., [Anal. Chem. 28, 350-356 (1956)] usando un patrón de glucosa.
- -
- Se demostró la ausencia de glucosa determinada con la prueba UV de Boehringer (hexocinasa, ATP, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y NADP).
- -
- Ácidos grasos esterificados [I. Stern & B. Shapiro, J. Clin. Path., 6, 158-160 (1953); patrón de dipalmitato de sacarosa (SERVA): los radicales ácido esterificados mediante reacción con hidroxiamina se transforman en ácidos hidroxámicos que proporcionan una coloración púrpura con cloruro férrico.
Se demostró que EPS II consiste en un esqueleto
de heteropolisacárido unido mediante un enlace éster a una fracción
lipídica que consiste en radicales ácido saturados y/o insaturados
con una longitud de la cadena lipófila de 10 a 18 carbonos y en el
que dicha fracción consiste en aproximadamente el
5-20% de lipopolisacárido.
Para identificar los constituyentes de la
fracción lipídica se llevó a cabo una hidrólisis alcalina del EPS
II con el fin de obtener directamente ésteres metílicos de ácidos
grasos (según el protocolo nº 969.33 de la Asociación de Químicos
Analíticos Oficiales ["Official Methods of Analysis of AOAC
International", P. Cunnif Ed., 16ª ed., vol. II, nº 41,1.28,
AOAC Int. (1995)].
En la práctica se trató el EPS II en el punto de
ebullición con metanol-sosa en presencia de
trifluoruro de boro como catalizador para la formación de ésteres
metílicos de ácidos grasos. Posteriormente se extrajeron los
ésteres con n-heptano y se identificaron los ácidos
grasos mediante cromatografía de gases / espectrometría de
masas.
Los resultados mostraron la presencia de ácido
dodecanoico (ácido láurico) como producto principal, ácido
3-hidroxi-dodecanoico como producto
secundario y cantidades menores de ácidos
2-hidroxidodecanoico, hexadecanoico (ácido
palmítico), octadecanoico (ácido esteárico) y octadecenoico (ácido
oleico).
\newpage
Una comparación con Emulsan mostró las
siguientes diferencias:
Aunque la cantidad de ácidos grasos puede variar
entre muestras y en relación con las condiciones de crecimiento, el
ácido dodecanoico y el ácido
3-hidroxi-dodecanoico están siempre
presentes como productos principales y dentro de un intervalo del
95 al 50% y el ácido dodecanoico es generalmente predominante con
respecto a ácido
3-hidroxi-dodecanoico.
Se llevó a cabo la caracterización del esqueleto
del polisacárido de EPS II mediante hidrólisis ácida del polímero,
en una atmósfera inerte, incubando a 105ºC durante 4 horas. Tras el
enfriamiento se retiró el ácido a vacío, se rompió el precipitado
resultante y se extrajo con etil éter, y entonces se disolvió en
D_{2}O y se sometió a análisis de RMN.
El espectro de RMN del protón completo se indica
en la figura 2, mientras que la figura 3 muestra una ampliación de
la región del espectro anterior (figura 2) entre 4,5 y 5,5 ppm, que
comprende las señales de los protones referentes a carbono en la
posición 1 de monosacáridos en general.
Estas señales generalmente son dobles debido a
la presencia simultánea en disolución de formas anoméricas \alpha
y \beta del monosacárido. El espectro de la figura 3 muestra 3
pares de dobletes referentes a 3 especies de monosacáridos, uno de
los cuales es predominante con respecto a los otros dos.
Para identificar los monosacáridos que forman el
esqueleto de polisacárido de EPS II se llevó a cabo una hidrólisis
ácida preparativa. En primer lugar, se determinaron las condiciones
de hidrólisis más adecuadas incubando alícuotas de EPS II a 100ºC
durante diversos tiempos con diferentes concentraciones de HCl. Se
siguieron las hidrólisis por la determinación tanto de azúcares
aminados como de azúcares reductores [J.T. Park & M.J. Johnson,
J. Biol. Chem., 181, 149 (1949)]. Se identificaron las mejores
condiciones en una hidrólisis con HCl 0,5 M durante 6 horas.
Basándose en estos resultados, se disolvió el
EPS II en HCl 0,5 M, y bajo una cubierta de gas de N_{2}, se
sometió a ebullición con reflujo durante 6 horas. Se enfrió la
disolución, se concentró a vacío y se extrajo tres veces con
volúmenes iguales de etil éter. Posteriormente se evaporó la
disolución, entonces, se diluyó con agua y volvió a concentrarse a
vacío; se repitió este tratamiento tres veces antes del secado.
Se añadió el producto seco a agua y entonces se
trató según el esquema descrito por R.W. Weath [Methods Enzymol.,
8, 60-78 (1966)]. Se cargó el producto hidrolizado
en una columna de resina catiónica fuerte en forma de de H^{+} y
posteriormente se eluyó la columna con agua hasta que el pH del
eluato había retornado a la neutralidad.
La fracción no retenida por la resina y que
estaba constituida por azúcares neutros y/o ácidos se caracterizó
sólo parcialmente: se encontró una reacción positiva para la prueba
de Dubois, negativa para la prueba de azúcar aminado, positiva para
ácidos urónicos [T. Bitter & H.H. Muir, Anal. Biochem., 4,
330-334 (1962)].
La columna, sobre la cual se habían fijado los
aminoazúcares, se eluyó de manera isocrática con HCl 0,3 M. Se
analizaron las fracciones recogidas para los azúcares reductores y
se observaron dos picos cromatográficos. Las fracciones referentes
a los picos se juntaron, se secaron y se añadieron a agua varias
veces para retirar el HCl y entonces se liofilizaron y se
sometieron a análisis de RMN.
El primer pico se identificó como glucosamina:
el espectro de RMN del protón era igual al de una muestra comercial
de glucosamina\cdotHCl (Fluka). El espectro del segundo pico
(figura 4) concordaba con el de una aminohexosa con un metilo en la
posición 6 (en lugar de -CH_{2}OH), más específicamente, se
demuestra que el compuesto es una
2-amino-2,6-didesoxialdohexosa
y representa aproximadamente el 70-80% del esqueleto
de polisacárido.
La presencia del grupo amino en la posición 2
también se confirmó mediante la reacción
Rondle-Morgan que generó un cromóforo con absorción
máxima a 530 nm [C.J.M. Rondle & W.T.J. Morgan, Biochem. J., 61,
586 (1955); N. Suzuki, Biochem. Biophys. Acta, 177,
371-373 (1969)].
En conclusión, los resultados experimentales
indican que el lipopolisacárido comprende una cadena de
heteropolisacárido que consiste en el 70-80% de una
2-amino-2,6-didesoxihexosa,
el 5-10% de glucosamina y el 15-20%
de uno o más azúcares no aminados. Se demuestra que los grupos
amino están totalmente o casi totalmente acetilados.
Las principales diferencias con los agentes
bioemulsionantes de la técnica conocida se indican en la tabla 3 a
continuación.
La caracterización funcional del biotensioactivo
de la presente invención se refiere principalmente al estímulo para
la biodegradación de petróleo crudo en agua de mar y al estímulo de
la adhesión de las células microbianas a la superficie de
hidrocarburos.
Para este fin se llevaron a cabo dos tipos de
experimentos en los que se registró la degradación de un petróleo
crudo en agua de mar en la parte de flora microbiana
hidrocarbonoclasta adaptada para crecimiento en hidrocarburos y
también flora microbiana autóctona de agua de mar.
La experimentación se llevó a cabo incubando la
flora microbiana anterior con petróleo crudo en presencia de y sin
el biotensioactivo producido por A. calcoaceticus
ER-96 y también comparando el efecto inducido por
este biotensioactivo con el de un agente dispersante comercial.
Se usaron tanto EPS bruto como EPS con el fin
que de separar los efectos debidos a sustancias nutritivas
posiblemente presentes en el caldo de fermentación de los
referentes al biotensioactivo, con los mismos resultados.
Para medir la biodegradación del petróleo crudo,
los cultivos, tras diversos tiempos de incubación, se mezclaron con
Freon-113®, se centrifugaron, y se determinaron los
hidrocarburos residuales en los extractos orgánicos mediante
espectrofotometría en infrarrojo según el procedimiento EPA 418.1
[en "Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes", J.F.
Kopp & G.D. McKee Eds., informe nº
EPA-600/4-79-020
(1983)].
Los resultados mostraron que una flora
microbiana adaptada para el crecimiento en
n-hexadecano había degradado en presencia de EPS
bruto, tras 14 días de incubación, el 75% del petróleo crudo
inicial. Se demostró que este valor era aproximadamente 6 veces el
de sin EPS y aproximadamente 3 veces superior al obtenido con el
agente dispersante comercial.
También se observó que la biodegradación en
presencia de EPS es el doble y también aumenta la biomasa en 5
órdenes (desde 1,10^{4} hasta 3,10^{9}) lo que en el control sin
EPS aumenta solamente cien veces.
Además el análisis de cromatografía de gases de
las variaciones en las razones entre n-heptadecano y
pristano y entre n-octadecano y fitano mostraron
que también estos índices en presencia de EPS varían mucho más que
en los controles sin EPS.
En conclusión, el biotensioactivo de la presente
invención estimula la biodegradación de hidrocarburos en agua de
mar en la parte de tanto la flora microbiana hidrocarbonoclasta
adaptada para el crecimiento en hidrocarburos como la flora
microbiana autóctona. Es importante recordar que a este respecto
Emulsan presenta un efecto de inhibición.
Para determinar la capacidad de EPS para
promover la adhesión de microorganismos hidrocarbonoclastas a
hidrocarburos, se utilizó el procedimiento adoptado para Emulsan
[E. Rosenberg et al. [Infect. Immun., 39,
1024-1028, 1983]. El procedimiento consiste en
mezclar una suspensión microbiana con una cierta cantidad de
hidrocarburos y medir la reducción en turbidez de la suspensión
microbiana debido a adhesión.
Se encontró que, en contraposición directa con
lo que se produce con Emulsan, EPS promueve la adhesión de las
células bacterianas a la interfase agua/hidrocarburo.
De hecho, utilizando tanto un cultivo puro de
Arthrobacter sp. como la flora heterótrofa total presente en
agua de mar, la adhesión fue desde 2 hasta 4 veces superior con EPS
que el control sin EPS.
En conclusión, además de las diferencias en
estructura de los dos biotensioactivos, hay evidencia experimental
de que hay un comportamiento funcional diferente de EPS con respecto
a Emulsan: 1) la biodegradación de hidrocarburos en agua que
Emulsan inhibe y que EPS parece promover y 2) la adhesión a la
interfase agua/aceite que aumenta en lugar de disminuir con el
biotensioactivo de la presente invención.
El biotensioactivo de la presente invención es
por lo tanto particularmente adecuado para el tratamiento de
"derrames de petróleo" tanto en el mar como en agua
interior.
Se obtiene la producción del biotensioactivo
mediante cultivo de la cepa A. calcoaceticus
ER-96 en un medio de cultivo que contiene fuentes
de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, y sales minerales.
Las fuentes de carbono asimilables comprenden
por ejemplo etanol, sodio, palmitato, ácido oleico, aceite de soja,
etc.
Estas fuentes se utilizan generalmente a una
concentración comprendida entre 0,2 y 5% con respecto a la mitad
del cultivo, y preferentemente entre 1 y 3%.
Las fuentes de nitrógeno pueden seleccionarse,
por ejemplo, de sales de amonio minerales, tales como nitrato de
amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, bicarbonato de amonio
o materiales que contienen nitrógeno orgánico o inorgánico tal como
peptona, extracto de levadura o extracto de carne, y también puede
utilizarse amoniaco.
Las fuentes de fósforo comprenden fosfato de
amonio, fosfato de sodio, fosfato de potasio dibásico o monobásico,
etc.
Los siguientes cationes y aniones son igualmente
adecuados en el contexto de la presente invención: potasio, sodio,
magnesio, hierro, calcio, manganeso, cobalto, cobre, zinc,
molibdeno, fosfatos, sulfatos y cloruros. Se utilizan generalmente
concentraciones comprendidas entre 1 y 100 mM.
La fermentación se lleva a cabo en un medio
agitado y extremadamente aireado, a una temperatura comprendida
entre 25 y 37ºC, preferentemente entre 28 y 32ºC.
Aire comprimido estéril se hace circular en el
medio de fermentación en una cantidad comprendida entre 0,2 y 1
vol/vol/minuto.
El pH del medio de fermentación se mantiene
dentro de valores comprendidos entre 6,5 y 7,5 y preferentemente
entre 6,8 y 7,2. La regulación del pH puede llevarse a cabo, por
ejemplo, mediante la adición de una disolución acuosa básica tal
como una disolución acuosa de amoniaco, hidróxido de potasio,
hidróxido de sodio.
Resulta preferido mantener el pH en el valor
deseado utilizando hidróxido de amonio 10 M.
La espuma que se forma en la fermentación puede
controlarse mediante la adición de un agente antiespuma adecuado
seleccionado de los disponibles en el mercado tal como por ejemplo
polipropilenglicol, o con dispositivos mecánicos.
El procedimiento de fermentación puede llevarse
a cabo de manera discontinua, con alimentación discontinua o de
manera continua.
Al final de la fermentación el biotensioactivo
puede aislarse y purificarse utilizando una de las técnicas
conocidas. Alternativamente el caldo de fermentación como tal o sin
células, puede utilizarse directamente.
La determinación de la concentración de
lipopolisacárido en el caldo de cultivo durante y al final de las
fermentaciones de la cepa productora pueden llevarse a cabo de dos
maneras: la primera consiste en medir la capacidad emulsionante del
caldo de fermentación y obtener la concentración de Enispol por
medio de una curva de calibración; la segunda consiste en
determinar los azúcares aminados y también en este caso obtener la
concentración de EPS por medio de una curva de calibración.
Los ejemplos siguientes se proporcionan
únicamente para describir la presente invención con mayor detalle y
no deben considerarse limitativos del alcance de la invención.
Se colocaron porciones de 150 g de una mezcla de
suelos contaminados, para favorecer la reactivación de la biomasa,
en matraces de 2000 ml que contenían 500 ml de medio
Bushnell-Haas (BHB) con la siguiente composición
por litro de agua destilada:
1 g de KH_{2}PO_{4}; 1 g de
K_{2}HPO_{4}; 1 g de NH_{4}NO_{3}; 0,2 g de
MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O; 0,02 g de CaCl_{2}\cdot2 H_{2}O;
0,05 g de FeCl_{3}; pH 7,0 con NaOH 0,1 N; 100 mg/l de extracto de
levadura.
Se incubaron los matraces durante 8 horas a 22ºC
en un agitador orbital a 200 revs/min.
Se utilizaron alícuotas de 10 ml de los caldos
de cultivo como inóculos de un conjunto de matraces de 500 ml
conteniendo cada uno 100 ml de medio mineral tamponado (BMM)
modificado según Mills et al. [Can. J. Microbiol., 24,
552-557 (1978)] que contenía por litro de agua
destilada:
5 g de NaCl; 1 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O,
0,7 g de KCl, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 3 g de Na_{2}HPO_{4}, 1
g de NH_{4}NO_{3}, pH 7,2 y un 1% de una fuente de carbono
hidrocarbonada seleccionada de fueloil AGIP®, petróleo crudo
"Forties" y aceite de vaselina Carlo Erba®. Se incubaron los
matraces a 22ºC, en un agitador orbital a 200 revs/min., durante 10
días.
Entonces se utilizaron los caldos de cultivo
para llevar a cabo una serie de tres subcultivos para cada una de
las fuentes de carbono utilizadas.
Se inocularon los diversos caldos de cultivo en
matraces de 50 ml que contenían cada uno 20 ml de BMM y 0,1 ml de
la fuente de carbono, incubando posteriormente a 22ºC en un agitador
orbital a 200 revs/min. durante 5 días.
Se llevó a cabo el aislamiento de los fenotipos
microbianos individuales presentes en los caldos de cultivo
enriquecidos sembrando en placa en medio de caldo
"LAB-LEMCO" (OXOID) con agar al 2%. Se
incubaron las placas a 22ºC durante 48 horas.
Se seleccionaron entre todas las colonias
desarrolladas las que diferían aparentemente entre sí en
características morfológicas y/o pigmentación.
Se aislaron estas colonias y se inocularon en
matraces de 50 ml que contenían 20 ml de BHB y un 1% de
petróleo crudo "Arabia ligero". Se incubaron los matraces
durante 7 días a 22ºC en una incubadora orbital a 200 revs/min.
Se pusieron tiras de los cultivos puros
individuales así obtenidos en placas de medio BHB con agar al
2%.
Se administró la fuente de carbono en fase
gaseosa, colocando un disco de papel de filtro empapado con una
mezcla de petróleo crudo/aceite de vaselina/gasóleo mediante
autotracción (50:40:10), en la tapa de la placa. Se incubaron las
placas durante 7 días a 22ºC en un horno.
Se suspendieron las colonias retiradas de cada
placa en BHB a diversas diluciones y se utilizaron para la
"ensayo de grietas" [Krigsvoll et al., "Microbial
emulsification of crude oil" en las Actas del 5º Congreso
Europeo de Biotecnología, vol. I, páginas 221-224,
Copenhague, julio de 1990].
Para este fin se utilizaron placas de
poliestireno con 24 orificios de prueba, introduciendo 1 ml de
suspensión microbiana en cada orificio de prueba y llenando
cuidadosamente con 0,025 ml de petróleo crudo. Se examinaron
inmediatamente los orificios de prueba bajo el microscopio (10 X)
para observar la fractura del menisco de aceite, lo que indica la
presencia de tensioactivos.
Entre las diversas cepas que dieron una señal
positiva, se demostró que solamente una podía producir un
biotensioactivo con una alta capacidad emulsionante. Se indicó esta
cepa con la abreviatura ER-96 y se identificó
posteriormente como Acinetobacter calcoaceticus.
Se reactivaron células liofilizadas de A.
calcoaceticus ER-96 en medio de caldo
"Lab-Lemco" (OXOID CM 15) y se inoculó un
matraz de 250 ml que contenía 50 ml de medio de cultivo (T1) que
contenía por litro: 10 g de etanol, 10 g de KH_{2}PO_{4}, 4,0 g
de NH_{4}Cl, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2,08 mg de
CaCl_{2}, 2,08 mg de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 1,73 mg de
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 2,12 mg de Na_{2}MoO_{4}, 1,49 mg
de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 2,52 mg de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O,
2,43 mg de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH ajustado a 7,4 con NaOH,
con este cultivo (5%).
Se incubó el matraz en un agitador orbital a 180
revs/min., a 30ºC durante 48 horas y entonces se utilizó para
inocular un matraz de 2 l, provisto de rompeolas, que contenía 500
ml de medio T1.
Se prolongó el cultivo durante 48 horas en las
condiciones anteriores y se utilizó posteriormente para inocular
(5%) un fermentador de 14 l Chemap®, con rompeolas, que contenía 10
l de caldo de cultivo T2 que presentaba la misma composición que el
medio T1, pero con 7 g/l de KH_{2}PO_{4}, 10 g/l de NH_{4}Cl y
1 g/l de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O.
Se llevó a cabo la fermentación con una aeración
de 0,5 l/l por minuto, a 30ºC, agitación con 2 turbinas a 700
revs/min.
Se corrigió automáticamente el pH a 7 con NaOH y
se controló el espumado con polipropilenglicol (PPG 2000).
Tras 22 horas, el caldo de fermentación se
centrifugó para eliminar las células y se liofilizó el sobrenadante
(que forma EPS bruto). Se obtuvieron 700 mg/l de producto y
3,7 g/l (peso seco) de biomasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la fermentación en las mismas
condiciones de funcionamiento descritas en el ejemplo 2, pero
utilizando NH_{4}OH 10 M para corregir el pH a 7.
Se obtuvieron 1,3 g/l de producto y 4,2 g/l
(peso seco) de biomasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó A. calcoaceticus
ER-96 en las mismas condiciones de operación que el
ejemplo 3. Cuando la densidad óptica a 660 nm del caldo de cultivo
alcanzó un valor de 4, se añadió una disolución de etanol acuoso al
47,5% al caldo de fermentación con una tasa de flujo tal como para
imponer un tiempo de duplicación de 24 horas de las células. Tras
83 horas de cultivo, se interrumpió la fermentación. El rendimiento
de EPS fue de 6,7 g/l, el de las células 13 g/l (peso seco).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó A. calcoaceticus
ER-96 con el mismo procedimiento que el ejemplo 4,
excepto que el espumado se controló mecánicamente con la
utilización del desespumante Fundafoam® (Chemap); además, la
concentración inicial de etanol era de 5 ml/l. Tras 14 horas,
cuando la densidad óptica a 660 nm del caldo de cultivo había
alcanzado un valor de 4,5, se inició la adición de etanol, en una
cantidad tal como para imponer un tiempo de duplicación de 16
horas. Se prolongó la fermentación durante 90 horas. Se obtuvieron
20 g/l de EPS y 21 g/l de biomasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó A. calcoaceticus
ER-96 en las mismas condiciones de funcionamiento
que el ejemplo 4, pero utilizando ácido oleico en lugar de etanol
como única fuente de carbono. Tras 83 horas el rendimiento de EPS
fue de 7,5 g/l, el de las células 24,8 g/l (peso seco).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células de A. calcoaceticus
ER-96 adoptando el mismo procedimiento que el
ejemplo 6, pero utilizando aceite de soja en lugar de ácido oleico
como única fuente de carbono. Tras 72 horas de fermentación el
rendimiento de EPS fue de 15 g/l, el de las células 20 g/l (peso
seco).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células de A. calcoaceticus
ER-96 en un fermentador de 14 litros Chemap® que
contenía 10 l de medio T2 al cual se habían añadido 20 g/l de
etanol. Se añadió etanol adicionalmente en diversos momentos según
se requirió y se mantuvo el pH a 7 con amoniaco.
\newpage
Se llevó a cabo la fermentación con aeración
(0,5 l/l por minuto) durante 70 horas, a 30ºC. Al final se enfrió
el cultivo hasta temperatura ambiente y se retiraron las células
mediante centrifugación (Alfa-Laval® LAPX 202).
Se añadió sulfato de amonio (166 g/l) al
sobrenadante (10,4 l) que se dejó con agitación durante una noche y
entonces se centrifugó (13.000 x g_{max};
Sorvall-DuPont® RC-5B).
Se añadió sulfato de amonio (57 g/l) al
sobrenadante limpio y tras 4 horas de agitación se recuperó el
precipitado mediante centrifugación, se disolvió con una cantidad
mínima de agua, se dializó frente a agua y se liofilizó.
Se obtuvieron de 38,5 g de EPS con una capacidad
emulsionante específica de 93 UE/mg.
Se determinó la capacidad emulsionante con una
modificación del procedimiento de Gutnick et al. [documento
EPA 16546]. En la práctica, 3,25 ml de una disolución de EPS en un
tampón de tris-hidroximetilaminometano
(Tris-HCl) 50 mM que se lleva a pH 7,2 con HCl y
contenía MgSO_{4} 10 mM se introdujeron en un tubo de ensayo de
vidrio de borosilicato de 25 x 80 mm, con una tapa de rosca y junta
de teflón y se añadieron 50 \mul de una mezcla de
n-hexadecano y 2-metilnaftaleno
(1:1; v/v). Se agitó la mezcla a 800 impulsos/min. con un agitador
vertical que presentaba una amplitud de 10 mm ("Agitest"
Bioblock) durante 5 minutos, entonces se vertió el contenido total
del tubo de ensayo en una cubeta de vidrio y se determinó la
absorbancia a 620 nm. La cantidad de biotensioactivo que en las
condiciones convencionales descritas anteriormente proporciona una
densidad óptica de 1 se define con Unidades de capacidad
emulsionante de Eniricerche (1 UE). Por consiguiente, se definió la
capacidad emulsionante específica como la capacidad emulsionante de
1 mg de producto.
Se demostró que el EPS consiste en
aproximadamente el 22% de proteínas (kit de ensayo de proteína
Bio-Rad), aproximadamente el 67% de un
lipopolisacárido y el porcentaje restante de iones metálicos,
esencialmente magnesio y sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una fermentación de A.
calcoaceticus ER-96 en las mismas condiciones
que el ejemplo 4. Al final, se añadieron 1660 g de sulfato de
amonio a 10 l de este caldo de cultivo. Tras una noche a 4ºC con
agitación, se centrifugó la suspensión (13.000 x g_{max}) y se
añadieron 434 g de sulfato de amonio al sobrenadante resultante
(7,6 litros).
Tras una noche a 4ºC, se centrifugó la
suspensión y se disolvió el precipitado en 2 l de agua y se
concentró mediante paso a través de una membrana de ultrafiltración
en espiral con un punto corte de 10.000 Daltons (Amicon S1Y1O)
hasta un volumen de 400 ml.
Entonces se diluyó de nuevo con agua la
disolución hasta 2 litros y volvió a concentrarse hasta 400 ml y se
repitió este tratamiento 10 veces. La retención final (1 l), a la
que se habían añadido 1 l de tampón Tris-HCl 0,1 M
que contenía MgCl_{2} 10 mM pH 7,2 y 500 unidades de benzonasa
grado I (Benzon Nuclease®, Merck), se mantuvo a 25ºC durante 3
horas para destruir cualquier ADN y ARN posiblemente presente.
Se concentró la disolución así obtenida hasta 1
litro, se añadieron 1 l de tampón Tris-HCl 50 mM que
contenía EDTANa_{2}, 0,2 M y 1,4-ditiotreitol 2
mM, pH 8 y se incubó la mezcla completa en presencia de 32 mg de
papaína (Calbiochem) a 25ºC durante una noche.
Se calentó hasta 70ºC la mezcla reducida hasta 1
litro y entonces se añadió un volumen igual de fenol redestilado y
precalentado hasta 70ºC, según el procedimiento de O. Westphal &
K. Jann ("Methods in Carbohydrate Chemistry" elaborado por
R.L. Whistler, vol. V, páginas 83-91, Academic
Press, Inc., Nueva York, 1965). Tras 15 minutos a 70ºC con
agitación vigorosa, se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y
se separó la emulsión formada mediante centrifugación a 23.000 x
g_{max}.
Se extrajo la fase fenólica tres veces con un
volumen igual de agua y se juntaron los extractos acuosos y, tras
haberse extraído tres veces con un volumen igual de éter, se
concentraron con la membrana hasta 500 ml. Tras la adición de 500
ml de EDTANa_{2} 0,1 M pH 8, volvió a concentrarse la
disolución hasta 500 ml y se repitió este tratamiento 6
veces.
veces.
Posteriormente, utilizando el mismo
procedimiento, se añadieron 10 litros de H_{2}O (20 veces), 10
litros de NaCl 0,1 M (20 veces) 10 litros de HCl 50 mM (20 veces) y
10 litros de H_{2}O (20 veces) y se eluyó. Se liofilizó la
disolución resultante obteniendo 6,9 g de EPS II con una capacidad
emulsionante específica de 48 UE/mg.
Se analizó el EPS II obtenido tal como se
describió en el ejemplo 9 y se determinaron las siguientes
características:
- -
- Pérdida en el secado (70ºC; a vacío; 16 horas): 3,7% (p/p).
- -
- Análisis elemental (%): C= 44,5; H= 7,33; N= 4,99; O= 40,6; S= 0.
- -
- Cenizas (900ºC): 3,6% (p/p).
- -
- Proteínas [ensayo de proteína Bio-Rad; M. Bradford, Anal. Biochem., 72 248 (1976), patrón de \gamma-globulina bovina]: 58,6 mg/g.
- -
- Metales (espectroscopía de absorción y emisión o atómica): Na = 7800; Ca < 10; Mg = 60; Mn = 1; Cu = 3; Co < 10; Ni < 2; Fe < 10 (en ppm).
\vskip1.000000\baselineskip
Haciendo referencia a la figura 1: 3417,5
cm^{-1} (OH, NH); 2924-2853 cm^{-1} (CH); 1735
cm^{-1} (CO de éster y ácido) 1655-1554 cm^{-1}
(CO de amida); 1038 cm^{-1} (COC glucosídico).
\vskip1.000000\baselineskip
Se registraron los espectros de protón y
^{13}C de EPS II disuelto en D_{2}O. Se demostró que los
espectros concuerdan con la estructura de un polisacárido que
contiene cadenas alifáticas, pero así como la presencia de grupos
metileno se observaron señales muy intensas con respecto a la
presencia de grupos metilo y acetilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hidrolizó el EPS II en HCl 5 M, a 100ºC
durante 30 minutos y se neutralizó. Entonces se determinaron los
azúcares aminados con el procedimiento de Z. Dische [Methods of
Biochem. Anal., 2, 352-358 (1967)] que consiste en
desaminar los azúcares con ácido nitroso, destruyendo el reactivo en
exceso con carbamato de amonio y haciendo reaccionar los azúcares
desaminados con indol en HCl.
Utilizando N-acetilglucosamina
como patrón se encontró un valor de 604 mg/g.
- -
- Otros azúcares [Dubois et al., Anal. Chem. 28, 350-356 (1956); patrón de glucosa]: 190 mg/g.
- -
- Glucosa (Prueba UV de Boehringer: hexocinasa, ATP, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y NADP): ausente.
- -
- Peso molecular: esto se determinó con análisis por HPLC-SEC (cromatografía de exclusión por tamaños) en columnas Styragel 10^{6}, Styragel 10^{5} y Styragel 10^{4} de Waters, utilizando dimetilsulfóxido como fase móvil y pululanos como patrones (Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Japón). Se encontró un valor de 1.556.400 daltons.
- -
- Ácidos grasos esterificados [I. Stern & B. Shapiro, J. Clin. Path., 6, 158-160 (1953); dipalmitato de sacarosa como patrón (SERVA)]: se transforman los radicales ácido esterificados mediante reacción con hidroxiamina en ácidos hidroxámicos que proporcionan una coloración morada con cloruro férrico; se encontró 1,15 meq/g.
Suponiendo un peso molecular promedio de 182,32
(radical laurilo) se calculó un contenido en ácidos grasos de 209,7
mg/g.
\vskip1.000000\baselineskip
Para caracterizar la fracción lipídica del
biotensioactivo se utilizó el protocolo nº 969.33 de la Asociación
de Químicos Analíticos Oficiales ["Official Methods of Analysis of
AOAC International", P. Cunnif Ed., 16ª ed., vol. II, nº
41,1.28, AOAC Int. (1995)].
\newpage
En la práctica se trató el EPS II en el punto de
ebullición con metanol-sosa en presencia de
trifluoruro de boro como catalizador para la formación de ésteres
metílicos de ácidos grasos.
Entonces se extrajeron los ésteres en
n-heptano y se identificaron los ácidos grasos
mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas.
En un funcionamiento tal como se describió
anteriormente se identificaron los siguientes productos:
- -
- ácido dodecanoico (ácido láurico) como producto principal;
- -
- ácido 3-hidroxi-dodecanoico como producto secundario y
- -
- cantidades menores de ácidos 2-hidroxidodecanoico, hexadecanoico (ácido palmítico), octadecanoico (ácido esteárico) y octadecenoico (ácido oleico).
Se llevó a cabo la caracterización del esqueleto
de polisacárido de EPS II mediante hidrólisis ácida del
polímero.
Se disolvieron 80 mg de EPS II en 8 ml de HCl 5
M y se incubaron, en una atmósfera inerte, durante 4 horas a 105ºC.
Tras enfriar hasta temperatura ambiente se retiró el HCl a
vacío.
Se rompió el precipitado resultante y se extrajo
con etil éter, entonces se disolvió en D_{2}O y se sometió a
análisis de RMN.
El espectro de RMN del protón completo se indica
en la figura 2.
La figura 3 muestra una ampliación de la región
del espectro anterior entre 4,5 y 5,5 ppm, que comprende las
señales de los protones referentes al carbono en la posición 1 de
monosacáridos en general.
Estas señales generalmente son dobles debido a
la presencia simultánea en disolución de formas anoméricas \alpha
y \beta del monosacárido. El espectro de la figura 3 muestra 3
pares de dobletes referentes a 3 especies de monosacáridos en una
razón de 7:2:1.
Para identificar los monosacáridos que forman la
fracción de polisacárido de EPS II, se llevó a cabo una hidrólisis
ácida preparativa.
En primer lugar, se determinaron las condiciones
de hidrólisis más adecuadas incubando alícuotas de EPS II a 100ºC
durante diversos tiempos con diferentes concentraciones de HCl. Se
siguieron las hidrólisis por la determinación tanto de azúcares
aminados como de azúcares reductores [J.T. Park & M.J. Johnson,
J. Biol. Chem., 181, 149 (1949)]. Se identificaron las mejores
condiciones en una hidrólisis con HCl 0,5 M durante 6 horas.
Basándose en estos resultados, se disolvieron
500 mg de EPS II en 500 ml de HCl 0,5 M y se sometió a ebullición
con reflujo durante 6 horas, bajo una cubierta de gas de
N_{2}.
Entonces se enfrió la disolución, se concentró
hasta 50 ml a vacío y se extrajo tres veces con volúmenes iguales
de etil éter.
Se evaporó la disolución resultante hasta 10 ml,
se diluyó hasta 100 ml con agua y volvió a concentrarse hasta 10 ml
a vacío. Se repitió este tratamiento tres veces antes de secar
mediante rotavapor.
Se añadió el producto seco a 200 ml de H_{2}O
y entonces se trató según el esquema descrito por R.W. Weath
[Methods Enzymol., 8, 60-78 (1966)].
Se cargó el producto hidrolizado en una columna
(1,2 cm d.i. x 50 cm h) de Dowex® 50 X-4, resina
catiónica fuerte de 200-400 de malla, en forma de
H^{+}, y posteriormente se eluyó la columna con agua hasta que el
pH del eluato era neutro.
La fracción presente en el eluato, no retenida
por la resina, está constituida por azúcares neutros y/o ácidos y
representaba aproximadamente el 20% del total. Su caracterización
mostró una reacción positiva para la prueba de Dubois, negativa
para la prueba de azúcar aminado y positiva para ácidos urónicos [T.
Bitter & H.H. Muir, Anal. Biochem., 4, 330-334
(1962)].
La columna, en la cual se habían fijado los
aminoazúcares, se eluyó de manera isocrática con HCl 0,3 M. Se
analizaron las fracciones recogidas para determinar los azúcares
reductores y se observaron dos picos cromato-
gráficos.
gráficos.
Se juntaron las fracciones referentes a estos
picos, se secaron y se añadieron a agua varias veces para eliminar
el HCl. Entonces se liofilizaron las fracciones y se sometieron a
análisis de RMN.
Se identificó el primer pico, que era
aproximadamente el 10% del total, como glucosamina; el espectro de
RMN del protón era igual al de una muestra comercial de
glucosamina\cdotHCl (Fluka). El espectro del segundo pico (figura
4) concordaba con el de una aminohexosa con un metilo en la posición
6. Más específicamente, se demostró que el compuesto era una
2-amino-2,6-didesoxialdohexosa.
La presencia del grupo amino en la posición 2
también se confirmó mediante la reacción
Rondle-Morgan que generó un cromóforo con absorción
máxima a 530 nm [C.J.M. Rondle & W.T.J. Morgan, Biochem. J., 61,
586 (1955); N. Suzuki, Biochem. Biophys. Acta, 177,
371-373 (1969)].
\vskip1.000000\baselineskip
Alícuotas (7,5 mg) de EPS bruto, preparado
liofilizando un caldo de cultivo obtenido tal como se describe en
el ejemplo 4, tras quitarle las células mediante centrifugación, se
introdujeron en una serie de matraces de 250 ml que contenía cada
uno 50 ml de agua de mar con una carga total de bacterias
heterótrofas de 1,1\cdot10^{3} UFC (Unidades Formadoras de
Colonia)/ml y un contenido en nitrógeno y fósforo de 4 y 0,9 ppm
respectivamente.
Entonces se introdujeron en los matraces 150 mg
de petróleo crudo "combinación Belahim", del que se ha
eliminado previamente la fracción más volátil calentando hasta 80ºC
durante 20 horas.
Se prepararon paralelamente controles sin EPS y
una segunda serie de matraces que contenían una agente dispersante
comercial utilizado por la autoridades portuarias italianas para
tratar derrames de petróleo en el mar.
Se incubaron los matraces en condiciones
aerobias en un agitador orbital a 100 revs/min. a 22ºC, tomando
muestras de prueba en el tiempo cero y en diferentes intervalos de
tiempo para determinar el contenido en biomasa e hidrocarburos. Se
determinó la biomasa por medio de un recuento de las bacterias
heterótrofas totales realizado en medio de cultivo con agar con
triptona-peptona de soja (Oxoid, CM 131). Se
dosificaron los hidrocarburos extrayendo cada matraz individual con
1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano
(Freon®-113), midiendo la extinción a 2930 cm^{-1}, que
corresponde a la absorción máxima, y obteniendo la concentración de
hidrocarburos por medio de una curva de calibración formada con un
patrón que consiste en
n-hexadecano/iso-octano/clorobenceno
en una razón volumétrica 15/15/10.
Se indican los resultados en la tabla 4. Se
expresa la cantidad de residual hidrocarburos en porcentaje con
respecto a la cantidad presente en el tiempo cero.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores indicados en la tabla muestran que
la degradación con EPS tras 14 días es 5,9 veces superior al
control y 3,1 veces superior con respecto al agente dispersante
comercial.
\vskip1.000000\baselineskip
Para separar los efectos debidos a sustancias
nutritivas posiblemente presentes en el caldo de fermentación de
los referentes al biotensioactivo, se utilizó EPS preparado tal como
se describe en el ejemplo 8.
En este experimento se utilizaron diferentes
cantidades de EPS, desde 0,75 hasta 7,5 mg/50 ml de agua de mar con
una carga total de bacterias heterótrofas de 1\cdot10^{4}
U.F.C./ml a la cual se habían añadido 150 mg de petróleo crudo.
Tras 45 días de incubación se determinaron los siguientes
parámetros: la biomasa, la cantidad de petróleo crudo degradado y
las razones, medidas con análisis de cromatografía de gases (columna
capilar Supelco SPB1) del extracto en Freon, entre: (a) las
cantidades de n-heptadecano
(n-C_{17}) y pristano y (b) las cantidades de
n-octadecano (n-C_{18}) y fitano.
Estas razones se consideran generalmente importantes índices de
biodegradación [P. Sveum et al., en "Hydrocarbon
bioremediation" bajo la supervisión de R.H. Hinchee et
al., Lewis Publisher, Boca Ratón; páginas
163-174 (1994)]. Se prepararon 7 matraces para cada
una de las siguientes mezclas:
- 1)
- agua de mar (50 ml) + petróleo (150 mg)
- 2)
- agua de mar (50 ml) + petróleo (150 mg) + EPS (0,75 mg)
- 3)
- agua de mar (50 ml) + petróleo (150 mg) + EPS (3,75 mg)
- 4)
- agua de mar (50 ml + petróleo (150 mg) + EPS (7,50 mg)
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestran los resultados en las tablas
5-7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la capacidad de EPS de inducir la
adhesión de células bacterianas a hidrocarburos con la prueba de E.
Rosenberg et al. [Infect. Immun., 39,
1024-1028 (1983)]. Esta prueba consiste en agitar
vigorosamente una suspensión celular con una cierta cantidad de
n-hexadecano y medir el número de células que
permanecen unidas a la interfase agua-petróleo
midiendo la disminución en turbidez de la suspensión.
Para este fin se tomó una unidad de colonia
aislada de la cepa Arthrobacter sp. FA-17
(Colección Eniricerche) de un cultivo de mantenimiento en agar
nutritivo (Oxoid, CM 003B) y se utilizó como inóculo de un
subcultivo en un matraz, en 50 ml de caldo de infusión cerebro
corazón (Oxoid, CM 225B).
Se retiraron 0,1 ml de caldo de este subcultivo,
se incubaron durante una noche en un agitador orbital a 30ºC y 150
rpm, para un inóculo adicional de un cultivo en un matraz de 125 ml
que contenía 50 ml de caldo de infusión cerebro corazón. Se mantuvo
el matraz en el agitador orbital durante 18 horas a 30ºC y 150 rpm
hasta que se alcanzó la fase de crecimiento estacionario. Entonces
se recogieron las células mediante centrifugación, se lavaron y
resuspendieron dos veces con 50 ml de disolución de tampón PUM (que
contenía por litro: 22,2 g de K_{2}HPO_{4}\cdot3H_{2}O;
7,26 g de K_{2}PO_{4}; 1,8 g de urea; 0,2 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; pH 7,1).
Entonces se resuspendieron alícuotas de células
lavadas en tampón PUM (volumen final de 4 ml) en cuatro tubos de
vidrio de borosilicato (14 x 140 mm) en diversas razones para dar
valores de extinción a 400 nm de 0 a 1,5. Entonces se añadieron 0,2
ml de una disolución que contenía 2,1 mg/ml de EPS bruto y 1 ml de
n-hexadecano a todos los tubos. Se prepararon
cuatro duplicados de la misma manera con la misma concentración de
células y de nuevo conteniendo 1 ml de
n-hexadecano, pero, en lugar de de EPS, 0,2 ml de
tampón; se introdujeron solamente 4,2 ml de tampón y 1 ml de
n-hexadecano en otro tubo, que actuó como blanco. Se
agitaron los tubos con una mezcladora con vórtice durante 120
segundos y entonces se dejó reposar durante 15 minutos en un horno
regulado por termostato a 30ºC para permitir que las fases de
agua/hidrocarburo se separasen. Se retiró la fase acuosa de cada
tubo y se midió su densidad óptica a 400 nm. Se indican los
resultados en la tabla 8.
Para determinar la capacidad de EPS para
promover la adhesión de flora bacteriana marina endógena a
n-hexadecano, se llevó a cabo un experimento
análogo al del ejemplo 13, pero utilizando un cultivo mixto de
bacterias aisladas de una muestra de agua de mar tomada de Ostia
Lido (Roma).
Para este fin, se inseminaron 0,1 ml de agua de
mar, inmediatamente tras la retirada, mediante la aplicación con
espátula en la superficie de un medio de cultivo con agar con
triptona-peptona de soja (OXOID CM 131), que
contenía NaCl 24 g/l.
Se recogieron las colonias que se hicieron
crecer con un asa estéril en tampón PUM, en un tubo bacteriano
de
19 x 180 mm, hasta que se obtuvieron suspensiones celulares de una concentración adecuada.
19 x 180 mm, hasta que se obtuvieron suspensiones celulares de una concentración adecuada.
Se realizó la medición de la adhesión de las
células a n-hexadecano tal como se describe en el
ejemplo 14. Se indican los resultados en la tabla 9.
Claims (17)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Biotensioactivo de lipopolisacárido producido por la cepa de Acinetobacter calcoaceticus CBS 962.97 en el que el lipopolisacárido está constituido por una cadena de polisacárido constituida por azúcar 2-amino-2,6-didesoxialdohexosa y glucosamina y uno o más azúcares no aminados, en el que los grupos amínicos de los azúcares aminados están en su totalidad o sustancialmente en su totalidad en forma acetilada, y en el que dicha cadena de polisacárido está unida con un enlace éster a una fracción lipídica constituida por radicales ácidosaturados y/o insaturados con una longitud de la cadena lipófila de 10 a 18 átomos de carbono de los cuales el 95-50% está constituido por ácido dodecanoico y ácido 3-hidroxi-dodecanoico y en el que el ácido dodecanoico está presente en una cantidad superior al ácido 3-hidroxi-dodecanoico. - 2. Biotensioactivo según la reivindicación 1, en el que la cadena de polisacárido está constituida por 70-80% de 2-amino-2,6-didesoxialdohexosa, 5-10% de glucosamina y 15-20% de uno o más azúcares no aminados.
- 3. Biotensioactivo según la reivindicación 1, en el que el ácido dodecanoico forma 70-80% de la fracción lipídica.
- 4. Biotensioactivo según la reivindicación 1, que comprende además 20-25% en peso de proteínas.
- 5. Cepa de Acinetobacter calcoaceticus CBS 962.97 que produce un biotensioactivo de lipopolisacárido según la reivindicación 1.
- 6. Procedimiento para la preparación de un biotensioactivo de lipopolisacárido en asociación con moléculas proteicas, en el que el lipopolisacárido está constituido por una cadena de polisacárido está constituida en su mayor parte por azúcar 2-amino-2,6-didesoxialdohexosa y glucosamina y uno o más azúcares no aminados, en el que los grupos amínicos de los azúcares aminados están en su totalidad o casi en su totalidad en forma acetilada, y en el que esta cadena de polisacárido está unida con un enlace éster a una fracción lipídica constituida por radicales ácidosaturados y/o insaturados con una longitud de la cadena lipófila de 10 a 18 átomos de carbono de los cuales el 95-50% está constituido por ácido dodecanoico y ácido 3-hidroxi-dodecanoico y en el que el ácido dodecanoico es predominante con respecto al ácido 3-hidroxi-dodecanoico, en el que dicho procedimiento comprende:
- (a)
- cultivar la cepa de Acinetobacter calcoaceticus CBS 962.97 que produce dicho biotensioactivo de lipopolisacárido en un medio de cultivo adecuado que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y microelementos; y
- (b)
- retirar las células del medio de cultivo y recuperar el sobrenadante acelular caracterizado porque presenta una actividad emulsionante.
- 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el cultivo en la etapa a) se lleva a cabo a una temperatura comprendida en el intervalo de 25 a 37ºC.
- 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la temperatura está comprendida en el intervalo de 28 a 32ºC.
- 9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el cultivo en la etapa a) se lleva a cabo a un pH comprendido en el intervalo de 6,5 a 7,5.
- 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el pH está comprendido en el intervalo de 6,8 a 7,2.
- 11. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que tras retirar las células microbianas (etapa b) se purifica el biotensioactivo de lipopolisacárido y se aísla del medio de fermentación.
- 12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la purificación se lleva a cabo mediante precipitación selectiva con sulfato de amonio, concentración y desalación del caldo de fermentación por medio de membranas de ultrafiltración en espiral, tales como membranas planas o de fibras huecas, o absorción selectiva sobre un soporte sólido.
- 13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el biotensioactivo de lipopolisacárido purificado está desproteinizado.
- 14. Utilización del biotensioactivo de lipopolisacárido según la reivindicación 1, para la biodegradación de hidrocarburos en agua.
- 15. Utilización del biotensioactivo de lipopolisacárido según la reivindicación 1, para formar y estabilizar una emulsión de aceite/agua.
- 16. Utilización del biotensioactivo de lipopolisacárido según la reivindicación 1, para la estimulación por adhesión de las células microbianas a una interfase agua/aceite de hidrocarburos en agua.
- 17. Composición que contiene el biotensioactivo de lipopolisacárido según la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97MI002809A IT1296987B1 (it) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Biosurfattante lipopolisaccaridico |
| ITMI97A2809 | 1997-12-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2323025T3 true ES2323025T3 (es) | 2009-07-03 |
Family
ID=11378399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98123614T Expired - Lifetime ES2323025T3 (es) | 1997-12-19 | 1998-12-10 | Nuevo biotensioactivo de lipopolisacarido. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6063602A (es) |
| EP (1) | EP0924221B1 (es) |
| JP (1) | JPH11269203A (es) |
| AT (1) | ATE423142T1 (es) |
| CA (1) | CA2255157C (es) |
| DE (1) | DE69840562D1 (es) |
| ES (1) | ES2323025T3 (es) |
| IT (1) | IT1296987B1 (es) |
| PT (1) | PT924221E (es) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6512014B2 (en) * | 2000-12-13 | 2003-01-28 | Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Limited | Compositions containing bioemulsifiers and a method for their preparation |
| ITMI20011496A1 (it) * | 2001-07-13 | 2003-01-13 | Enitecnologie Spa | Composizioni bifasiche disperdenti per prodotti oleosi |
| ZA200408750B (en) | 2002-05-23 | 2006-11-29 | Unilever Plc | Article and process for cleaning fabrics |
| RU2337069C1 (ru) * | 2007-04-02 | 2008-10-27 | Закрытое акционерное общество "Биоойл" | Препарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов |
| DE102007028030A1 (de) * | 2007-06-14 | 2008-12-24 | Universität Karlsruhe (Th) | Biotenside und deren Herstellung |
| KR100866526B1 (ko) * | 2007-09-14 | 2008-11-03 | 전남대학교산학협력단 | 차량 폐유 또는 선박 누출유 분해를 위한 조성물 및 방법 |
| EP2201098B1 (en) * | 2007-10-18 | 2013-08-28 | Unilever PLC | Method for producing a foaming agent |
| US20100112139A1 (en) * | 2008-03-28 | 2010-05-06 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Foaming Agents Comprising Hydrophobin |
| AU2009304092B2 (en) * | 2008-10-16 | 2013-09-05 | Unilever Plc | Hydrophobin solution containing antifoam |
| CA2745522A1 (en) | 2008-12-16 | 2010-06-24 | Unilever Plc | Method for extracting hydrophobin from a solution |
| CA2704702C (en) * | 2009-06-02 | 2018-06-12 | Unilever Plc | Aerated baked products |
| US20110151100A1 (en) * | 2009-12-19 | 2011-06-23 | Satyanarayana Ganti | Green Process for Production of Biosurfactants or Biopolymers through Waste Oil Utilization |
| CN103052704A (zh) | 2010-07-22 | 2013-04-17 | 荷兰联合利华有限公司 | 用于提高清洁的鼠李糖脂和酶的组合物 |
| US20120252066A1 (en) * | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Heng Meng H | Methods of foam control |
| JP6539400B1 (ja) * | 2018-10-24 | 2019-07-03 | 株式会社アンチエイジング・プロ | Ｌｐｓ高含有組成物の製造方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3941692A (en) * | 1973-04-03 | 1976-03-02 | David Gutnick | Cleaning of cargo compartments |
| US4395354A (en) * | 1979-02-22 | 1983-07-26 | Petroleum Fermentations N.V. | αEmulsans |
| CA1149302A (en) * | 1979-02-22 | 1983-07-05 | David L. Gutnick | Emulsans |
| US4883757A (en) * | 1984-11-30 | 1989-11-28 | Petroleum Fermentations N.V. | Bioemulsifier production by Acinetobacter calcoaceticus strains |
| DD240389A1 (de) * | 1985-08-19 | 1986-10-29 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur produktion von biomulgatoren |
| JP2911544B2 (ja) * | 1989-06-05 | 1999-06-23 | ライオン株式会社 | 新規アシネトバクター・カルコアセティカス及び新規バイオサーファクタント |
-
1997
- 1997-12-19 IT IT97MI002809A patent/IT1296987B1/it active IP Right Grant
-
1998
- 1998-12-10 ES ES98123614T patent/ES2323025T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-10 AT AT98123614T patent/ATE423142T1/de active
- 1998-12-10 PT PT98123614T patent/PT924221E/pt unknown
- 1998-12-10 EP EP98123614A patent/EP0924221B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-10 DE DE69840562T patent/DE69840562D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-16 US US09/212,409 patent/US6063602A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 CA CA2255157A patent/CA2255157C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 JP JP10361201A patent/JPH11269203A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69840562D1 (de) | 2009-04-02 |
| EP0924221B1 (en) | 2009-02-18 |
| ITMI972809A1 (it) | 1999-06-19 |
| JPH11269203A (ja) | 1999-10-05 |
| CA2255157C (en) | 2010-03-30 |
| ATE423142T1 (de) | 2009-03-15 |
| PT924221E (pt) | 2009-05-21 |
| CA2255157A1 (en) | 1999-06-19 |
| EP0924221A3 (en) | 2000-12-06 |
| EP0924221A2 (en) | 1999-06-23 |
| US6063602A (en) | 2000-05-16 |
| IT1296987B1 (it) | 1999-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fujita et al. | Characterization of a bioflocculant produced by Citrobacter sp. TKF04 from acetic and propionic acids | |
| Mulligan et al. | Biosurfactants | |
| US6063602A (en) | Lipopolysaccharide biosurfactant | |
| Calvo et al. | Application of bioemulsifiers in soil oil bioremediation processes. Future prospects | |
| Kaplan et al. | Reconstitution of emulsifying activity of Acinetobacter calcoaceticus BD4 emulsan by using pure polysaccharide and protein | |
| Hejzlar et al. | Microbial polymers in the aquatic environment—I: Production by activated sludge microorganisms under different conditions | |
| Berg et al. | Identification and characterization of a soil bacterium with extracellular emulsifying activity | |
| Chopade | Production of bioemulsifier by Acinetobacter species isolated from healthy human skin | |
| US4230801A (en) | Production of α-emulsans | |
| US4395354A (en) | αEmulsans | |
| JPH0670754A (ja) | シュードモナス・アエルギノーザおよびｌ−ラムノースのバイオテクノロジー的製造方法へのその使用 | |
| EP0016546B1 (en) | Extracellular microbial lipoheteropolysaccharides and derivatives, their preparation and compositions containing them, and their uses | |
| RU2482179C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus atropheus - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ | |
| US4380504A (en) | ψ-Emulsans | |
| US4311831A (en) | Apo-ψ-emulsans | |
| RU2181701C2 (ru) | Биопрепарат "авалон" для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, способ его получения | |
| US4395353A (en) | Polyanionic heteropolysaccharide biopolymers | |
| RU2126041C1 (ru) | Штамм микромицета fusarium sp. n 56 для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов | |
| Heymann et al. | The isolation and characterization of volutin granules as subcellular components involved in biological phosphorus removal | |
| RU2180276C1 (ru) | Олеофильный биопрепарат, используемый для очистки нефтезагрязненной почвы | |
| Khamis et al. | Microbial surfactants: Classifications, properties, recovery, and applications | |
| Kim et al. | Biological modification of hydrophobic group in Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 emulsan | |
| RU2785601C1 (ru) | Штамм Pseudomonas putida для биодеградации гептила, штамм Rhodococcus erythropolis для биодеградации авиационного керосина и способ биоремедиации почвы, загрязненной компонентами ракетных топлив | |
| JP2010119352A (ja) | 新規なフコイダン資化性微生物 | |
| Temitope et al. | Biosurfactant producing abilities of some bacteria isolated from bitumen contaminated soils |