JPH0670754A - シュードモナス・アエルギノーザおよびｌ−ラムノースのバイオテクノロジー的製造方法へのその使用 - Google Patents
シュードモナス・アエルギノーザおよびｌ−ラムノースのバイオテクノロジー的製造方法へのその使用Info
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- JPH0670754A JPH0670754A JP5153090A JP15309093A JPH0670754A JP H0670754 A JPH0670754 A JP H0670754A JP 5153090 A JP5153090 A JP 5153090A JP 15309093 A JP15309093 A JP 15309093A JP H0670754 A JPH0670754 A JP H0670754A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 発酵法によるラムノ脂質およびＬ−ラムノー
スの製造。 【構成】 シュードモナス・アエルギノーザ型の細菌を
発酵に用いる培養液１リットルあたり７０〜１２０ｇの
濃度でラムノ脂質を合成する。Ｌ−ラムノースはそれら
ラムノ脂質の加水分解により培養液から直接に、すなわ
ち、菌体物質の複雑な分離を行うことなく、または加水
分解前にラムノ脂質を単離することなく、回収すること
ができる。
スの製造。 【構成】 シュードモナス・アエルギノーザ型の細菌を
発酵に用いる培養液１リットルあたり７０〜１２０ｇの
濃度でラムノ脂質を合成する。Ｌ−ラムノースはそれら
ラムノ脂質の加水分解により培養液から直接に、すなわ
ち、菌体物質の複雑な分離を行うことなく、または加水
分解前にラムノ脂質を単離することなく、回収すること
ができる。
Description
【０００１】デオキシ糖であるＬ−ラムノース（６−デ
オキシ−Ｌ−マンノース）は様々な有機化合物の製造の
ためのキラル成分として極めて適切である。Ｌ−ラムノ
ースまたはその誘導体は、医薬品および植物防護剤合成
のほか動植物細胞の細胞学、微生物学、免疫生物学、お
よび香気（アロマ）生産の分野においてもますますその
用途を広げている。例えばＬ−ラムノースを出発化合物
として用いて２,５−ジメチル−４−ヒドロキシ−２,３
−ジヒドロフラン−３−オン(FuraneolR)を製造できる
が、それはさらに食品および香水産業における各種芳香
物質の成分として用いられる。
オキシ−Ｌ−マンノース）は様々な有機化合物の製造の
ためのキラル成分として極めて適切である。Ｌ−ラムノ
ースまたはその誘導体は、医薬品および植物防護剤合成
のほか動植物細胞の細胞学、微生物学、免疫生物学、お
よび香気（アロマ）生産の分野においてもますますその
用途を広げている。例えばＬ−ラムノースを出発化合物
として用いて２,５−ジメチル−４−ヒドロキシ−２,３
−ジヒドロフラン−３−オン(FuraneolR)を製造できる
が、それはさらに食品および香水産業における各種芳香
物質の成分として用いられる。
【０００２】糖であるＬ−ラムノースは化学的経路によ
って入手し得るものの極めて困難が伴う。しかしなが
ら、それは様々な天然の給源から酸または酵素加水分解
後の抽出により、例えばフラボノイドクリコシドである
ヘスペリジン、ルチン、ナリンギン(naringine)、クエ
ルシトリン(quercitrin)から、あるいは例えばアラビア
ゴムまたは海藻から得ることができる〔Biotechnology
およびBioengineering, Vol. 33, p. 365(1989), R. J.
Linhardt et al.；EP-A-0 317 033；JPA 62263；米国
特許No. 5,077,206, Cheetham et al.〕。一部有機溶媒
を用いたプロセス集約的(process-intensive)なＬ−ラ
ムノース単離諸段階、さらには後処理で得られる芳香族
系の潜在的に有毒な廃棄物、および組成が変動する、ま
た季節リズムに依存する天然給源の成分は酸加水分解プ
ロセスにとって不利であることがわかる。
って入手し得るものの極めて困難が伴う。しかしなが
ら、それは様々な天然の給源から酸または酵素加水分解
後の抽出により、例えばフラボノイドクリコシドである
ヘスペリジン、ルチン、ナリンギン(naringine)、クエ
ルシトリン(quercitrin)から、あるいは例えばアラビア
ゴムまたは海藻から得ることができる〔Biotechnology
およびBioengineering, Vol. 33, p. 365(1989), R. J.
Linhardt et al.；EP-A-0 317 033；JPA 62263；米国
特許No. 5,077,206, Cheetham et al.〕。一部有機溶媒
を用いたプロセス集約的(process-intensive)なＬ−ラ
ムノース単離諸段階、さらには後処理で得られる芳香族
系の潜在的に有毒な廃棄物、および組成が変動する、ま
た季節リズムに依存する天然給源の成分は酸加水分解プ
ロセスにとって不利であることがわかる。
【０００３】米国特許Ｎｏ．５,０７７,２０６はいくつ
かの酵素、そして次いでいくつかの精製段階を用いた植
物材料からのＬ−ラムノースの製造方法をクレームして
いる。この方法の欠点は植物材料に起源する糖類、特に
グルコースからＬ−ラムノースを分離することが（分子
量も含めて）それら糖類の強い化学構造的類似性の故に
困難なところにある。
かの酵素、そして次いでいくつかの精製段階を用いた植
物材料からのＬ−ラムノースの製造方法をクレームして
いる。この方法の欠点は植物材料に起源する糖類、特に
グルコースからＬ−ラムノースを分離することが（分子
量も含めて）それら糖類の強い化学構造的類似性の故に
困難なところにある。
【０００４】Ｌ−ラムノースは様々な目の細菌、例えば
アルカリゲネス(Alcaligenes)、アシネトバクター(Acin
etobacter)、クレブシエラ(Klebsiella)、ストレプトコ
ッカス(Streptococcus)またはラクトバチラス(Lactobac
illus)などを用いた発酵により、ラムノース含有ヘテロ
多糖の形で製造することもできる。〔Enzyme Microb. T
echnol., Vol. 10, p. 198(1988), M. Graber et al.；
J. Amer. Chem. Soc., Vol. 71, p. 4124(1945), F. G.
Jarvisおよび M. J. Johnson；J. Bacteriol., Vol. 6
8, p. 645(1954), G. HauserおよびM. L. Karnovsk
y〕。
アルカリゲネス(Alcaligenes)、アシネトバクター(Acin
etobacter)、クレブシエラ(Klebsiella)、ストレプトコ
ッカス(Streptococcus)またはラクトバチラス(Lactobac
illus)などを用いた発酵により、ラムノース含有ヘテロ
多糖の形で製造することもできる。〔Enzyme Microb. T
echnol., Vol. 10, p. 198(1988), M. Graber et al.；
J. Amer. Chem. Soc., Vol. 71, p. 4124(1945), F. G.
Jarvisおよび M. J. Johnson；J. Bacteriol., Vol. 6
8, p. 645(1954), G. HauserおよびM. L. Karnovsk
y〕。
【０００５】この方法の欠点は、通常粘性に関連した低
収率、およびヘテロ多糖の加水分解後に必要とされる各
種糖の混合物からのＬ−ラムノースの困難な分離（理
由：上記参照）である。更なる文献には、クレブシエラ
の細菌を用いた発酵により製造されたラムノース含有ヘ
テロ多糖が記載されている。ラムノース収率は、培養液
に対し約１７ｇ／リットルである〔Commission of the
European Communities,ECLAIR Program, Contract No.
AGRE-0011-C, Report No. 2(final report)1991〕。
収率、およびヘテロ多糖の加水分解後に必要とされる各
種糖の混合物からのＬ−ラムノースの困難な分離（理
由：上記参照）である。更なる文献には、クレブシエラ
の細菌を用いた発酵により製造されたラムノース含有ヘ
テロ多糖が記載されている。ラムノース収率は、培養液
に対し約１７ｇ／リットルである〔Commission of the
European Communities,ECLAIR Program, Contract No.
AGRE-0011-C, Report No. 2(final report)1991〕。
【０００６】６−デオキシ糖の更なる生物的給源は糖脂
質であり、それらは発酵により製造できる〔Microbiolo
gical Sciences Vol. 3, No. 5, p. 145 (1986), D. G.
Cooper；Surfactant Sci. Series, Vol. 25, p. 89(19
87), Christoph SyldatkおよびFritz Wagner；Biotechn
ologyおよびBioengineering, Vol. 33, p. 365(1989),
R. J. Linhardt et al.；米国特許4 933 281, Daniels
et al.；米国特許4 814 272, Wagner et al.〕。
質であり、それらは発酵により製造できる〔Microbiolo
gical Sciences Vol. 3, No. 5, p. 145 (1986), D. G.
Cooper；Surfactant Sci. Series, Vol. 25, p. 89(19
87), Christoph SyldatkおよびFritz Wagner；Biotechn
ologyおよびBioengineering, Vol. 33, p. 365(1989),
R. J. Linhardt et al.；米国特許4 933 281, Daniels
et al.；米国特許4 814 272, Wagner et al.〕。
【０００７】ラムノ脂質が細菌シュードモナス・アエル
ギノーザ（緑膿菌；Pseudomonas aeruginosa)から形成
されることは長い間知られている〔J. Amer. Chem.
Soc.,Vol. 71, p. 4124(1949), F. G. Jarvis et al.；
J. Bacteriol., Vol. 68, p.645(1954) George Hauser
およびManfred L. Karnovsky〕。多くの刊行物および特
許が発酵によるシュードモナス・アエルギノーザによる
ラムノ脂質の製造に関係している〔AppliedおよびEnvir
onmental Microbiology, Vol. 51, No. 5, p.985(198
6), H. E. Reiling et al.；J. Chem. Techn. Biotechn
ol., Vol. 45, p. 249(1989), K. Venkata Ramana et a
l.；米国特許4 933 281, Daniels et al.；ドイツ特許
出願公開明細書2 150 375, 1972；米国特許4 814 272,
Wagner etal.〕。
ギノーザ（緑膿菌；Pseudomonas aeruginosa)から形成
されることは長い間知られている〔J. Amer. Chem.
Soc.,Vol. 71, p. 4124(1949), F. G. Jarvis et al.；
J. Bacteriol., Vol. 68, p.645(1954) George Hauser
およびManfred L. Karnovsky〕。多くの刊行物および特
許が発酵によるシュードモナス・アエルギノーザによる
ラムノ脂質の製造に関係している〔AppliedおよびEnvir
onmental Microbiology, Vol. 51, No. 5, p.985(198
6), H. E. Reiling et al.；J. Chem. Techn. Biotechn
ol., Vol. 45, p. 249(1989), K. Venkata Ramana et a
l.；米国特許4 933 281, Daniels et al.；ドイツ特許
出願公開明細書2 150 375, 1972；米国特許4 814 272,
Wagner etal.〕。
【０００８】シュードモナス・アエルギノーザの培養液
には主に四種類のラムノ脂質すなわちラムノ脂質１〜４
が存在するが、それらは１または２個のＬ(＋)−ラムノ
ース単位と１または２個のβ−ヒドロキシデカン酸から
成っている〔Z. Naturforsch. 40 c, p. 61(1985), C.
Syldatk et al.〕。
には主に四種類のラムノ脂質すなわちラムノ脂質１〜４
が存在するが、それらは１または２個のＬ(＋)−ラムノ
ース単位と１または２個のβ−ヒドロキシデカン酸から
成っている〔Z. Naturforsch. 40 c, p. 61(1985), C.
Syldatk et al.〕。
【０００９】
【化１】
【００１０】新しい刊行物は、シュードモナス・エルギ
ノーザが他のラムノ脂質を形成することを示している
〔Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1045, p. 18
9, (1990) N. B. Rendell et al.〕。しかしながら量の
ために、これらはラムノ脂質１〜４と競合できない。そ
れらはＬ−ラムノースおよびβ−ヒドロキシデカン酸の
ほかに、さらに３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロ
キシドデカン酸または３−ヒドロキシドデカ−５−エン
酸から構成される。
ノーザが他のラムノ脂質を形成することを示している
〔Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 1045, p. 18
9, (1990) N. B. Rendell et al.〕。しかしながら量の
ために、これらはラムノ脂質１〜４と競合できない。そ
れらはＬ−ラムノースおよびβ−ヒドロキシデカン酸の
ほかに、さらに３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロ
キシドデカン酸または３−ヒドロキシドデカ−５−エン
酸から構成される。
【００１１】グルコース、グリセロール、ｎ−アルカ
ン、脂肪アルコールおよび脂肪酸のほか、植物油例えば
大豆油またはオリーブ油などもラムノ脂質製造用炭素源
として通している〔Z. Naturforsch. 40 c, p. 61(198
5), C. Syldatk et al.；Surfactant Sci. Series, Vo
l. 25, p. 89(1987), C. Syldatk et al.；Appliedおよ
びEnvironmental Microbiology, Vol. 51, No. 5, p. 9
85(1986), H. E. Reilinget al.；Biotechnologyおよび
Bioengineering, Vol. 33, p. 365(1989), R. J.Linhar
dt et al.；Agr. Biol. Chem. Vol. 35, No. 5, p. 686
(1971), H. Hisatsuka et al.；米国特許4 814 272, Wa
gner et al.〕。
ン、脂肪アルコールおよび脂肪酸のほか、植物油例えば
大豆油またはオリーブ油などもラムノ脂質製造用炭素源
として通している〔Z. Naturforsch. 40 c, p. 61(198
5), C. Syldatk et al.；Surfactant Sci. Series, Vo
l. 25, p. 89(1987), C. Syldatk et al.；Appliedおよ
びEnvironmental Microbiology, Vol. 51, No. 5, p. 9
85(1986), H. E. Reilinget al.；Biotechnologyおよび
Bioengineering, Vol. 33, p. 365(1989), R. J.Linhar
dt et al.；Agr. Biol. Chem. Vol. 35, No. 5, p. 686
(1971), H. Hisatsuka et al.；米国特許4 814 272, Wa
gner et al.〕。
【００１２】ラムノ脂質相互の割合およびそれらの収率
は本質的に培養条件に依存する〔Z.Naturforsch. 40 c,
p. 61(1985), C. Syldatk et al.；Tenside Surf. De
t. 27, 5, p. 302(1990), J. L. Parra et al.〕。すな
わち、Parra et al. はオリーブ油を炭素源として用い
たときは主としてＲＬ１およびＲＬ３が形成されること
を示した。
は本質的に培養条件に依存する〔Z.Naturforsch. 40 c,
p. 61(1985), C. Syldatk et al.；Tenside Surf. De
t. 27, 5, p. 302(1990), J. L. Parra et al.〕。すな
わち、Parra et al. はオリーブ油を炭素源として用い
たときは主としてＲＬ１およびＲＬ３が形成されること
を示した。
【００１３】今までに発酵により達成されたラムノ脂質
の最高収率は米国特許４ ９３３ ２８１(Daniels et a
l.)に記載されている。それらのクレームによると、コ
ーン油を炭素源として用いた場合にはシュードモナス・
アエルギノーザ株の発酵後にラムノ脂質を培地から３０
〜５０ｇ／リットルの濃度で単離できる。精製ラムノ脂
質を得るために単離が行われる。引き続いて行われる単
離ラムノ脂質の加水分解ではＬ−ラムノースおよびヒド
ロキシデカン酸が反応生成物として形成される。
の最高収率は米国特許４ ９３３ ２８１(Daniels et a
l.)に記載されている。それらのクレームによると、コ
ーン油を炭素源として用いた場合にはシュードモナス・
アエルギノーザ株の発酵後にラムノ脂質を培地から３０
〜５０ｇ／リットルの濃度で単離できる。精製ラムノ脂
質を得るために単離が行われる。引き続いて行われる単
離ラムノ脂質の加水分解ではＬ−ラムノースおよびヒド
ロキシデカン酸が反応生成物として形成される。
【００１４】前記特許に含まれる実施例、特に実施例３
はクレーム中に示された３０〜５０ｇ／リットルのラム
ノ脂質濃度が培養液中に存在する濃度に関するものであ
ることを明らかにしている。
はクレーム中に示された３０〜５０ｇ／リットルのラム
ノ脂質濃度が培養液中に存在する濃度に関するものであ
ることを明らかにしている。
【００１５】今般、驚くべきことに、発酵液中に７０〜
１２０ｇ／リットルのラムノ脂質濃度が達成されるシュ
ードモナス・アエルギノーザの発酵によるＬ−ラムノー
スの製造方法を見出した。Ｌ−ラムノースの製造は、培
養液からの菌体塊の複雑な分離を伴うことなく、また加
水分解前にラムノ脂質を単離することなく行われる。
１２０ｇ／リットルのラムノ脂質濃度が達成されるシュ
ードモナス・アエルギノーザの発酵によるＬ−ラムノー
スの製造方法を見出した。Ｌ−ラムノースの製造は、培
養液からの菌体塊の複雑な分離を伴うことなく、また加
水分解前にラムノ脂質を単離することなく行われる。
【００１６】すなわち、本発明は次のものに関する。 １．ラムノ脂質を７０〜１２０ｇ／リットル（培養液）
の濃度で合成するシュードモナス・アエルギノーザ。 ２．ラムノ脂質をシュードモナス・アエルギノーザの発
酵により７０〜１２０ｇ／リットル（培養液）の濃度で
合成しそして該ラムノ脂質をＬ−ラムノースに加水分解
することより成るＬ−ラムノースの製造方法。
の濃度で合成するシュードモナス・アエルギノーザ。 ２．ラムノ脂質をシュードモナス・アエルギノーザの発
酵により７０〜１２０ｇ／リットル（培養液）の濃度で
合成しそして該ラムノ脂質をＬ−ラムノースに加水分解
することより成るＬ−ラムノースの製造方法。
【００１７】本発明を次に詳述する。それはクレームの
内容によっても規定される。発酵は実験室規模（リット
ル範囲の発酵量）のほか工業規模（例えば２０〜５０ｍ
3規模）でも行うことができる。特に断らない限り百分
率データは重量に関するものである。
内容によっても規定される。発酵は実験室規模（リット
ル範囲の発酵量）のほか工業規模（例えば２０〜５０ｍ
3規模）でも行うことができる。特に断らない限り百分
率データは重量に関するものである。
【００１８】微生物としては、ラムノ脂質を培養上清中
に分泌するすべての細菌株を発酵させることができる。
それら微生物は、強化培養によりそれらの自然環境から
単離される。この手順は当業者に知られている。簡潔に
述べれば次のとおりである。
に分泌するすべての細菌株を発酵させることができる。
それら微生物は、強化培養によりそれらの自然環境から
単離される。この手順は当業者に知られている。簡潔に
述べれば次のとおりである。
【００１９】強化条件はそれらの下である生物がうまく
競合する条件である。油または脂肪を好む微生物、例え
ばシュードモナス・アエルギノーザには、油、脂肪およ
び／または炭化水素を含有する最小培地が炭素源として
用いられる。これらの環境条件を作りそして自然環境中
に存在するような混合集団を接種する。このタイプの強
化栄養液中では、所望の細菌株が通り、すべての随伴生
物を凌ぐ増殖を示す。強化株は数回同じ栄養液に移しそ
して固体栄養培地上に分布させることにより容易に単離
できる。短い間隔をおいて行われる頻繁な“液−液接種
〃は、主として好まれる菌体の排泄物あるいは自己溶解
生成物さえも利用するであろうような随伴生物の増殖を
防ぐ(Allg. Mikrobiologie(General Microbiology)by
H. G. Schlegel, 6th Edition, p. 182, G. Thieme Ver
lag Stuttgart, New York)。
競合する条件である。油または脂肪を好む微生物、例え
ばシュードモナス・アエルギノーザには、油、脂肪およ
び／または炭化水素を含有する最小培地が炭素源として
用いられる。これらの環境条件を作りそして自然環境中
に存在するような混合集団を接種する。このタイプの強
化栄養液中では、所望の細菌株が通り、すべての随伴生
物を凌ぐ増殖を示す。強化株は数回同じ栄養液に移しそ
して固体栄養培地上に分布させることにより容易に単離
できる。短い間隔をおいて行われる頻繁な“液−液接種
〃は、主として好まれる菌体の排泄物あるいは自己溶解
生成物さえも利用するであろうような随伴生物の増殖を
防ぐ(Allg. Mikrobiologie(General Microbiology)by
H. G. Schlegel, 6th Edition, p. 182, G. Thieme Ver
lag Stuttgart, New York)。
【００２０】水サンプルの強化培養から単離された細菌
を用いるのが好ましい。特に油および脂肪処理作業で得
られる水サンプルが用いられる。使用した水サンプルは
工場水に起源する。この水サンプルから単離された株は
the German Collection of MicroorganismsおよびCell
Cultures GmbH(Mascheroder Weg 1 B, W-3300 Brunswic
k, ドイツ)によりシュードモナス・アエルギノーザとし
て分類された。シュードモナス・アエルギノーザの菌体
は杆状で直径が約０.６〜０.８μｍであり、また約１.
５〜３.０μｍの長さがあり、移動性である。単離後
に、シュードモナス・アエルギノーザの変異誘発を行
う。シュードモナス・アエルギノーザは自体知られた方
法で化学変異誘発剤Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を用いて変異誘発され
る。シュードモナス・アエルギノーザの変異誘発後、生
産菌株を単離するための菌体単離をフローサイトメトリ
ーを用いて行う。この過程で、懸濁されたＭＮＮＧ処理
細胞の光学的性質をフローの中で測定した。このように
して典型的または異なる大きさと形の菌体を様々な栄養
培地に自動的に単離した。
を用いるのが好ましい。特に油および脂肪処理作業で得
られる水サンプルが用いられる。使用した水サンプルは
工場水に起源する。この水サンプルから単離された株は
the German Collection of MicroorganismsおよびCell
Cultures GmbH(Mascheroder Weg 1 B, W-3300 Brunswic
k, ドイツ)によりシュードモナス・アエルギノーザとし
て分類された。シュードモナス・アエルギノーザの菌体
は杆状で直径が約０.６〜０.８μｍであり、また約１.
５〜３.０μｍの長さがあり、移動性である。単離後
に、シュードモナス・アエルギノーザの変異誘発を行
う。シュードモナス・アエルギノーザは自体知られた方
法で化学変異誘発剤Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を用いて変異誘発され
る。シュードモナス・アエルギノーザの変異誘発後、生
産菌株を単離するための菌体単離をフローサイトメトリ
ーを用いて行う。この過程で、懸濁されたＭＮＮＧ処理
細胞の光学的性質をフローの中で測定した。このように
して典型的または異なる大きさと形の菌体を様々な栄養
培地に自動的に単離した。
【００２１】次の準備を有する商業的に入手可能なサイ
トフローメーターが用いられる：アルゴンレーザー（波
長：４８８ｍ、電力：２０mW）；菌体の大きさと形を評
価するための光学信号前方散乱光および９０°散乱光の
測定装置；自動選別ユニット。個々の菌体の選別は当業
者に知られた二種類の栄養培地、すなわちグリセロール
最小栄養培地および大豆油最小培地で行った。栄養培地
を３７℃でインキュベート後、クローンを得るべく増殖
させた個々の菌体のラムノ脂質生産性を振盪フラスコお
よび小型発酵槽中で試験した。
トフローメーターが用いられる：アルゴンレーザー（波
長：４８８ｍ、電力：２０mW）；菌体の大きさと形を評
価するための光学信号前方散乱光および９０°散乱光の
測定装置；自動選別ユニット。個々の菌体の選別は当業
者に知られた二種類の栄養培地、すなわちグリセロール
最小栄養培地および大豆油最小培地で行った。栄養培地
を３７℃でインキュベート後、クローンを得るべく増殖
させた個々の菌体のラムノ脂質生産性を振盪フラスコお
よび小型発酵槽中で試験した。
【００２２】このようにして、シュードモナス・アルゴ
ンレーザーの二つの高効率変異菌を単離することができ
た。これらの変異菌は発酵、従ってＬ−ラムノースの製
造に用いるのに特に好ましかった。それらは未変異シュ
ードモナス・アエルギノーザと同様に杆状であり、約
０.６〜０.８μｍの直径を有し、約１.５〜３.０μｍの
長さがありそして移動性である。
ンレーザーの二つの高効率変異菌を単離することができ
た。これらの変異菌は発酵、従ってＬ−ラムノースの製
造に用いるのに特に好ましかった。それらは未変異シュ
ードモナス・アエルギノーザと同様に杆状であり、約
０.６〜０.８μｍの直径を有し、約１.５〜３.０μｍの
長さがありそして移動性である。
【００２３】シュードモナス・アエルギノーザの高効率
変異菌はブダペスト条約の規定に従って１９９２年６月
１６日、the German Collection of Microorganisms an
d Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1 B, W-3300
Brunswick, ドイツにＤＳＭ７１０７およびＤＳＭ ７１
０８の名称の下に寄記された。このタイプの変異菌は他
の方法で、物理的手段、例えば紫外線またはＸ線による
照射などにより、あるいは他の化学的変異誘発剤例えば
エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）または２−ヒドロ
キシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）などを用
いて生産することもできる。以下に記載の手順はすべて
のシュードモナス・アエルギノーザ単離物にあてはま
る。
変異菌はブダペスト条約の規定に従って１９９２年６月
１６日、the German Collection of Microorganisms an
d Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1 B, W-3300
Brunswick, ドイツにＤＳＭ７１０７およびＤＳＭ ７１
０８の名称の下に寄記された。このタイプの変異菌は他
の方法で、物理的手段、例えば紫外線またはＸ線による
照射などにより、あるいは他の化学的変異誘発剤例えば
エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）または２−ヒドロ
キシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）などを用
いて生産することもできる。以下に記載の手順はすべて
のシュードモナス・アエルギノーザ単離物にあてはま
る。
【００２４】シュードモナス・アエルギノーザを植物油
を炭素源として含む培地で発酵する。植物油の例は菜
種、オリーブ、コーンおよびヒマワリ油である。植物油
のほかに、その培地は付加的に一以上の窒素源、サルフ
ェートおよびマグネシウムイオンおよびカリウムおよび
クロライドイオン、一以上の燐源および微量元素を含ん
でいなければならない。特に使用される植物油は約１０
０〜２５０ｇ／リットル（栄養液）の濃度の大豆油であ
るがその場合、１２５ｇ／リットル〜１６５ｇ／リット
ルの濃度が好ましい。使用可能な窒素源は当業者に知ら
れた窒素源、例えば５〜５０ｇ／リットル（栄養液）の
（ＮＨ4)2ＳＯ4などであるが１５ｇ／リットル濃度のＮ
ａＮＯ3を用いるのが好ましい。
を炭素源として含む培地で発酵する。植物油の例は菜
種、オリーブ、コーンおよびヒマワリ油である。植物油
のほかに、その培地は付加的に一以上の窒素源、サルフ
ェートおよびマグネシウムイオンおよびカリウムおよび
クロライドイオン、一以上の燐源および微量元素を含ん
でいなければならない。特に使用される植物油は約１０
０〜２５０ｇ／リットル（栄養液）の濃度の大豆油であ
るがその場合、１２５ｇ／リットル〜１６５ｇ／リット
ルの濃度が好ましい。使用可能な窒素源は当業者に知ら
れた窒素源、例えば５〜５０ｇ／リットル（栄養液）の
（ＮＨ4)2ＳＯ4などであるが１５ｇ／リットル濃度のＮ
ａＮＯ3を用いるのが好ましい。
【００２５】サルフェートおよびマグネシウムイオンを
利用可能とするために、０.０１〜２ｇ／リットル、好
ましくは０.５ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏが用
いられる。生産に必要なカリウムおよびクロライドイオ
ンは、０.１〜５ｇ／リットル（１ｇ／リットルが好ま
しい）のＫＣｌを用いることにより利用可能とすること
ができる。０.００１〜０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液は
燐源として、また培地を緩衝するために用いられる。好
ましくは、６.５ｇ／リットルの７５％強度燐酸、およ
び８.９ｇ／リットルの３３％強度水酸化ナトリウム溶
液がこの目的に用いられる。
利用可能とするために、０.０１〜２ｇ／リットル、好
ましくは０.５ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏが用
いられる。生産に必要なカリウムおよびクロライドイオ
ンは、０.１〜５ｇ／リットル（１ｇ／リットルが好ま
しい）のＫＣｌを用いることにより利用可能とすること
ができる。０.００１〜０.１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液は
燐源として、また培地を緩衝するために用いられる。好
ましくは、６.５ｇ／リットルの７５％強度燐酸、およ
び８.９ｇ／リットルの３３％強度水酸化ナトリウム溶
液がこの目的に用いられる。
【００２６】クエン酸ナトリウムの水性溶液に溶解され
た各種金属塩を含むＦｅＣｌ3含有微量元素溶液を、培
地滅菌後に４〜５倍濃度で添加するか、または好ましく
は様々な時点で当初濃度で４〜５回発酵液に添加する。
栄養液のpHは発酵開始時にpH５.５〜７.５、好ましくは
約pH６.３とするべきであり、また発酵中にコントロー
ルする必要はない。
た各種金属塩を含むＦｅＣｌ3含有微量元素溶液を、培
地滅菌後に４〜５倍濃度で添加するか、または好ましく
は様々な時点で当初濃度で４〜５回発酵液に添加する。
栄養液のpHは発酵開始時にpH５.５〜７.５、好ましくは
約pH６.３とするべきであり、また発酵中にコントロー
ルする必要はない。
【００２７】通気は、撹拌発酵液に吹き込まれる滅菌空
気を用いて行われる。通気速度は、０.０２〜０.５ＶＶ
Ｍ（空気容量／発酵液容量／分）であり、また発酵槽の
幾何構造、撹拌器の幾何構造、エネルギー入力に依存す
るが、特に発酵液のその時の状態に依存する。典型的に
は増殖期では約０.３±０.０５ＶＶＭに設定され、そし
て生産期には０.１±０.０３ＶＶＭに設定される。
気を用いて行われる。通気速度は、０.０２〜０.５ＶＶ
Ｍ（空気容量／発酵液容量／分）であり、また発酵槽の
幾何構造、撹拌器の幾何構造、エネルギー入力に依存す
るが、特に発酵液のその時の状態に依存する。典型的に
は増殖期では約０.３±０.０５ＶＶＭに設定され、そし
て生産期には０.１±０.０３ＶＶＭに設定される。
【００２８】発酵液の泡立ち方によっては、約５〜１５
ml／リットル（培養液）の商業的に入手し得るシリコー
ン消泡剤、例えばSilicone Antifoam Agent VP 1133(Wa
ckerChemie GmbH(ミュンヘン、ドイツ))、を発酵中に添
加する。発酵温度は２０℃〜４０℃、好ましくは約３０
〜３５℃である。発酵時間は約４〜１１日間、好ましく
は６〜８日間である。シュードモナス・アエルギノーザ
株は個々に、あるいは混合培養として発酵させることが
できる。ＤＳＭ ７１０７および７１０８はいずれも実
験室規模および工業規模の発酵に極めて適切である。前
記発酵条件下に、前記微生物は、主としてラムノ脂質１
および３（図１）を形成するところそのラムノ脂質の容
量全生産性(volumetric overall productivity)は約７
０〜１２０ｇ／リットル（培養液）である。ここでは３
０〜５０ｇ／リットルのＬ−ラムノース濃度が得られ
る。
ml／リットル（培養液）の商業的に入手し得るシリコー
ン消泡剤、例えばSilicone Antifoam Agent VP 1133(Wa
ckerChemie GmbH(ミュンヘン、ドイツ))、を発酵中に添
加する。発酵温度は２０℃〜４０℃、好ましくは約３０
〜３５℃である。発酵時間は約４〜１１日間、好ましく
は６〜８日間である。シュードモナス・アエルギノーザ
株は個々に、あるいは混合培養として発酵させることが
できる。ＤＳＭ ７１０７および７１０８はいずれも実
験室規模および工業規模の発酵に極めて適切である。前
記発酵条件下に、前記微生物は、主としてラムノ脂質１
および３（図１）を形成するところそのラムノ脂質の容
量全生産性(volumetric overall productivity)は約７
０〜１２０ｇ／リットル（培養液）である。ここでは３
０〜５０ｇ／リットルのＬ−ラムノース濃度が得られ
る。
【００２９】Ｌ−ラムノースの回収はラムノ脂質の直接
加水分解により、すなわち、菌体物質を分離することな
く、またＬ−ラムノースに加水分解する前にラムノ脂質
を単離することなく行われる。ラムノ脂質のほかに、依
然未消化の植物油、主として大豆油、死菌体、微生物に
より消費されないすべての培地成分、脂肪酸、消泡剤、
溶存塩および特にそれ以上詳述はしない他の細菌代謝生
成物が培養液に見出される。
加水分解により、すなわち、菌体物質を分離することな
く、またＬ−ラムノースに加水分解する前にラムノ脂質
を単離することなく行われる。ラムノ脂質のほかに、依
然未消化の植物油、主として大豆油、死菌体、微生物に
より消費されないすべての培地成分、脂肪酸、消泡剤、
溶存塩および特にそれ以上詳述はしない他の細菌代謝生
成物が培養液に見出される。
【００３０】発酵液を更に後処理するために、その中に
含まれる細菌をまず、全発酵槽内容物を８０〜１２０
℃、好ましくは１００℃に加熱し、そしてこの温度を１
５〜９０分間、好ましくは６０分間維持することにより
死滅させる。
含まれる細菌をまず、全発酵槽内容物を８０〜１２０
℃、好ましくは１００℃に加熱し、そしてこの温度を１
５〜９０分間、好ましくは６０分間維持することにより
死滅させる。
【００３１】冷却培養ブロス（これは本質的に水性乳濁
液である）の更なる後処理工程は特許出願公開明細書Ｐ
ＣＴ−ＥＰ ９１−０１７５６（“膜分離法による精製
糖脂質の製造方法”）および特許出願公開明細書ＰＣＴ
−ＥＰ ９１−０１４２６（“ラムノ脂質からのＬ−ラ
ムノースの製造方法”）に記載されている。
液である）の更なる後処理工程は特許出願公開明細書Ｐ
ＣＴ−ＥＰ ９１−０１７５６（“膜分離法による精製
糖脂質の製造方法”）および特許出願公開明細書ＰＣＴ
−ＥＰ ９１−０１４２６（“ラムノ脂質からのＬ−ラ
ムノースの製造方法”）に記載されている。
【００３２】理論シーケンスとしてのラムノース単離用
後処理工程は次のとおりである： １．熱−不活性化培養液の酸性化。 ２．３０,０００〜３００,０００ダルトンの分離限界を
有する膜を用いた限外濾過による濃縮。 ３．同膜を用いた透析濾過による脱塩。 ４．０〜３のpHおよび１２０〜１５０℃の温度での脱塩
濃縮液の加水分解。 ５．水性ラムノース含有相の脂質相からの分離。 ６．脱色剤例えば活性炭またはベントナイトによる処
理、またはイオン交換クロマトグラフィーによる水性相
のpH３〜８での精製。 ７．濃縮水性相からのＬ−ラムノースの結晶化。
後処理工程は次のとおりである： １．熱−不活性化培養液の酸性化。 ２．３０,０００〜３００,０００ダルトンの分離限界を
有する膜を用いた限外濾過による濃縮。 ３．同膜を用いた透析濾過による脱塩。 ４．０〜３のpHおよび１２０〜１５０℃の温度での脱塩
濃縮液の加水分解。 ５．水性ラムノース含有相の脂質相からの分離。 ６．脱色剤例えば活性炭またはベントナイトによる処
理、またはイオン交換クロマトグラフィーによる水性相
のpH３〜８での精製。 ７．濃縮水性相からのＬ−ラムノースの結晶化。
【００３３】熱不活性化培養液の酸性化は酸、ラムノ脂
質の連続加水分解を行ってＬ−ラムノースとする場合は
特にＨ2ＳＯ4、あるいは“バッチ式加水分解の場合は特
にＨＣｌまたはＨ2ＳＯ4を用いて行われる。これらの酸
性条件では、通常ならば限外濾過膜を通過し得る糖脂質
は保持される。限外濾過の後、同膜での透析濾過によ
り、水の永続添加および濾液除去によって塩を部分的に
洗出する。塩濃度は伝導率測定により濾過中に測定され
る。伝導率測定は商業的に入手し得る電極を用いて行わ
れる。
質の連続加水分解を行ってＬ−ラムノースとする場合は
特にＨ2ＳＯ4、あるいは“バッチ式加水分解の場合は特
にＨＣｌまたはＨ2ＳＯ4を用いて行われる。これらの酸
性条件では、通常ならば限外濾過膜を通過し得る糖脂質
は保持される。限外濾過の後、同膜での透析濾過によ
り、水の永続添加および濾液除去によって塩を部分的に
洗出する。塩濃度は伝導率測定により濾過中に測定され
る。伝導率測定は商業的に入手し得る電極を用いて行わ
れる。
【００３４】この手順（濃縮および洗浄）の結果とし
て、水性の２〜３倍濃縮液が形成されるが、これは本質
的に、次の成分を含有する：未代謝脂肪酸および大豆油
残渣、塩（伝導率は約２０％に低下）、死細胞、消泡
剤、ラムノ脂質および他の細菌性の比較的高分子量代謝
生成物。ラムノ脂質のこの手順において完全に保持され
る。
て、水性の２〜３倍濃縮液が形成されるが、これは本質
的に、次の成分を含有する：未代謝脂肪酸および大豆油
残渣、塩（伝導率は約２０％に低下）、死細胞、消泡
剤、ラムノ脂質および他の細菌性の比較的高分子量代謝
生成物。ラムノ脂質のこの手順において完全に保持され
る。
【００３５】ラムノ脂質の化学的加水分解は予め単離す
ることなく、前述の如く処理された培養液で直接行われ
る。化学的加水分解は均質状態で、すなわち撹拌しなが
ら行われる。その加水分解の後、水性相と脂質含有相と
は当業者に知られた方法により分離される。Ｌ−ラムノ
ースは水性相から単離される。
ることなく、前述の如く処理された培養液で直接行われ
る。化学的加水分解は均質状態で、すなわち撹拌しなが
ら行われる。その加水分解の後、水性相と脂質含有相と
は当業者に知られた方法により分離される。Ｌ−ラムノ
ースは水性相から単離される。
【００３６】第一工程（酸性化工程）でＨ2ＳＯ4を用い
たときは、水性相をＣａ（ＯＨ)2またはＣａＣＯ3で処
理してＨ2ＳＯ4を除去する。その水性相は脱色剤処理に
より、またはイオン交換クロマトグラフィーにより、pH
３〜８で最終的に精製される。加水分解の際に小量形成
されるヒドロキシデカン酸は単離されない。
たときは、水性相をＣａ（ＯＨ)2またはＣａＣＯ3で処
理してＨ2ＳＯ4を除去する。その水性相は脱色剤処理に
より、またはイオン交換クロマトグラフィーにより、pH
３〜８で最終的に精製される。加水分解の際に小量形成
されるヒドロキシデカン酸は単離されない。
【００３７】３．実施例 3.1. 実施例１： シュードモナス・アエルギノーザ単離物の生産： ａ） 強化培養 微生物は工場自体の水サンプルから得られる。これを行
うために、約１０mlの廃水サンプルを、２００mlの強化
培地（無機塩培地、下記参照）を含む５００ml三角フラ
スコ中、振盪装置上、３７℃で３日間インキュベートす
る。
うために、約１０mlの廃水サンプルを、２００mlの強化
培地（無機塩培地、下記参照）を含む５００ml三角フラ
スコ中、振盪装置上、３７℃で３日間インキュベートす
る。
【００３８】無機塩培地： １５ｇ／リットルのオリーブ油 １０ｇ／リットルのＮａＮＯ3 ０.１ ｇ／リットルのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.４ ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６.８ ｇ／リットルのＫＨ2ＰＯ4 ８.７ ｇ／リットルのＫ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ ５ml／リットルの微量塩 脱イオン水
【００３９】微量塩： １ｇ／リットルのクエン酸鉄(III) ０.２ｇ／リットルのＭｎＳＯ4 ０.１ｇ／リットルのＺｎＣｌ2 ０.０２５ｇ／リットルのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.０２ｇ／リットルの四ホウ酸ナトリウム ０.０１ｇ／リットルのモリブデン酸ナトリウム ０.００４ｇ／リットルのＣｏＣｌ2 脱イオン水
【００４０】２mlの第一強化培養液を同じ培地を含む第
二フラスコ中、前述の如くに再びインキュベートする。
このプロセスを更に４回繰り返す。
二フラスコ中、前述の如くに再びインキュベートする。
このプロセスを更に４回繰り返す。
【００４１】ｂ） 単離 最終強化培養の培養液を、１０ｇ／リットルのグルコー
ス、４ｇ／リットルのカゼインペプトン、４ｇ／リット
ルの肉エキス、０.５ｇ／リットルの酵母エキス、０.５
ｇ／リットルの肝エキスおよび２.５ｇ／リットルのＮ
ａＣｌを含む完全培地を含む寒天プレート上にプレート
する。３７℃でインキュベート後、シュードモナス・ア
エルギノーザがクローンとして単離される。
ス、４ｇ／リットルのカゼインペプトン、４ｇ／リット
ルの肉エキス、０.５ｇ／リットルの酵母エキス、０.５
ｇ／リットルの肝エキスおよび２.５ｇ／リットルのＮ
ａＣｌを含む完全培地を含む寒天プレート上にプレート
する。３７℃でインキュベート後、シュードモナス・ア
エルギノーザがクローンとして単離される。
【００４２】ｃ） ＭＮＮＧ変異誘導 実施例１、パラグラフｂで得られたクローンを完全培地
中、３７℃で２４時間培養する。次に培地を新鮮な完全
培地を用いて１：１０希釈する。菌体を振盪装置上、３
７℃で２時間再生させる。菌体を遠心分離により分離
し、tris−マレイン酸緩衝液（pH６）中で洗浄しそして
再び取り込んで、振盪装置上、３７℃で１５〜２０分間
ＭＮＮＧ（０.４〜０.８mg／ml）で処理する。菌体をtr
is−マレイン酸緩衝液中で３回繰り返し洗浄後、変異誘
発菌体懸濁液を３７℃で２４時間、完全培地中で培養す
る。次いでフローナイトメトリーを用いて菌体単離を行
う。
中、３７℃で２４時間培養する。次に培地を新鮮な完全
培地を用いて１：１０希釈する。菌体を振盪装置上、３
７℃で２時間再生させる。菌体を遠心分離により分離
し、tris−マレイン酸緩衝液（pH６）中で洗浄しそして
再び取り込んで、振盪装置上、３７℃で１５〜２０分間
ＭＮＮＧ（０.４〜０.８mg／ml）で処理する。菌体をtr
is−マレイン酸緩衝液中で３回繰り返し洗浄後、変異誘
発菌体懸濁液を３７℃で２４時間、完全培地中で培養す
る。次いでフローナイトメトリーを用いて菌体単離を行
う。
【００４３】個々の菌体の選別を次の栄養培地で行う： 最小栄養培地： ２０ｇ／リットルのグリセロール（または大豆油 ＊
＊） １０ｇ／リットルのＮａＮＯ3 １ｇ／リットルのＫＣｌ １ｇ／リットルのＮａＣｌ ０.０２ｇ／リットルのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ６.８ｇ／リットルのＫＨ2ＰＯ4 ８.７ｇ／リットルのＫ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ml／リットルの微量元素溶液 ＊ ２０ｇ／リットルの寒天 脱イオン水 滅菌前にpH６.５にpH調節 ＊ 滅菌後に添加 ＊＊ 注入するすぐ前に加熱栄養培地を均質化
＊） １０ｇ／リットルのＮａＮＯ3 １ｇ／リットルのＫＣｌ １ｇ／リットルのＮａＣｌ ０.０２ｇ／リットルのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ６.８ｇ／リットルのＫＨ2ＰＯ4 ８.７ｇ／リットルのＫ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２ml／リットルの微量元素溶液 ＊ ２０ｇ／リットルの寒天 脱イオン水 滅菌前にpH６.５にpH調節 ＊ 滅菌後に添加 ＊＊ 注入するすぐ前に加熱栄養培地を均質化
【００４４】微量元素溶液： １ｇ／リットルのクエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ０.１４ｇ／リットルのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ０.７ｇ／リットルのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.６ｇ／リットルのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.６ｇ／リットルのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.４ｇ／リットルのＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ 脱イオン水
【００４５】このようにして得られた菌株を以下に記述
する発酵に用いる。 3.2. 実施例２： Ｌ−ラムノース生産のための工業規模でのバッチ式発酵 ａ） 前培養 ４リットルの前培養栄養液（表１）中のシュードモナス
・アエルギノーザＤＳＭ ７１０７株の第一前培養を振
盪フラスコ内で作る（各々５００mlの栄養液を含む２リ
ットル三角フラスコ、３０℃、２００rpm、２０時
間）。第一前培養全体を第二前培養（３５０リットル）
の接種に用いる。
する発酵に用いる。 3.2. 実施例２： Ｌ−ラムノース生産のための工業規模でのバッチ式発酵 ａ） 前培養 ４リットルの前培養栄養液（表１）中のシュードモナス
・アエルギノーザＤＳＭ ７１０７株の第一前培養を振
盪フラスコ内で作る（各々５００mlの栄養液を含む２リ
ットル三角フラスコ、３０℃、２００rpm、２０時
間）。第一前培養全体を第二前培養（３５０リットル）
の接種に用いる。
【００４６】これを行うために、ＤＳＭ ７１０７株を
ね１８０リットル空気／分の通気速度、３００rpmの撹
拌速度および２８℃の温度で１６時間、３５０リットル
の複合前培養栄養液(表１)を含む４５０リットル発酵槽
内で好気的に発酵させる。
ね１８０リットル空気／分の通気速度、３００rpmの撹
拌速度および２８℃の温度で１６時間、３５０リットル
の複合前培養栄養液(表１)を含む４５０リットル発酵槽
内で好気的に発酵させる。
【００４７】表１：前培養栄養溶液： １０ｇ／リットルのグルコース ５ｇ／リットルのカゼインペプトン １ｇ／リットルの酵母エキス ０.１ｇ／リットルのＮａＣｌ 水 その第二前培養全体を主培養の接種に用いる。
【００４８】ｂ） 主培養 表２に示される栄養液１７ｍ3を約３０ｍ3の公称容量を
有する発酵槽内に用意する： 表２：主培養栄養液： ６.４７ｇ／リットルの７５％強度Ｈ3ＰＯ4 約８.９４ｇ／リットルの３３％強度ＮａＯＨ ０.５ ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／リットルのＫＣｌ １５ｇ／リットルのＮａＮＯ3 １２５ｇ／リットルの大豆油 水 これを行うために、所要量の水を導入後、Ｈ3ＰＯ4およ
びＮａＯＨを用いてpHを６.８に設定する。残りの栄養
液成分を添加後、Ｈ2ＳＯ4を用いてpHをpH６.２に直
す。
有する発酵槽内に用意する： 表２：主培養栄養液： ６.４７ｇ／リットルの７５％強度Ｈ3ＰＯ4 約８.９４ｇ／リットルの３３％強度ＮａＯＨ ０.５ ｇ／リットルのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／リットルのＫＣｌ １５ｇ／リットルのＮａＮＯ3 １２５ｇ／リットルの大豆油 水 これを行うために、所要量の水を導入後、Ｈ3ＰＯ4およ
びＮａＯＨを用いてpHを６.８に設定する。残りの栄養
液成分を添加後、Ｈ2ＳＯ4を用いてpHをpH６.２に直
す。
【００４９】４５分間滅菌後、約６.３のpHに設定され
る。別の容器内で、微量元素（表３）含有液を滅菌す
る。これを行うために、次の物質を１５０リットルの脱
イオン水に溶解しそして滅菌する： 表３：微量元素液： ２mg／リットルのクエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ０.２８mg／リットルのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １.４mg／リットルのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １.２mg／リットルのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １.２mg／リットルのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.８mg／リットルのＭｎＳＯ4・１Ｈ2Ｏ 脱イオン水 濃度データは１リットルの主培養に関するものである。
この微量元素溶液を滅菌条件下に接種前に主発酵槽に添
加し、そして約２０、４０および７０時間の発酵時間後
に更に３回添加する。
る。別の容器内で、微量元素（表３）含有液を滅菌す
る。これを行うために、次の物質を１５０リットルの脱
イオン水に溶解しそして滅菌する： 表３：微量元素液： ２mg／リットルのクエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ０.２８mg／リットルのＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １.４mg／リットルのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １.２mg／リットルのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １.２mg／リットルのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.８mg／リットルのＭｎＳＯ4・１Ｈ2Ｏ 脱イオン水 濃度データは１リットルの主培養に関するものである。
この微量元素溶液を滅菌条件下に接種前に主発酵槽に添
加し、そして約２０、４０および７０時間の発酵時間後
に更に３回添加する。
【００５０】前発酵槽の全内容物（３５０リットル）を
接種物として用いる。発酵温度は３０℃とする。最初の
１０時間の発酵においては２５０ｍ3／時の空気を用
い、１０時間目から３０時間目は４００ｍ3／時、そし
て３０時間目からは１００〜７５ｍ3／時を用いて通気
を行う。発泡をコントロールするために、別途滅菌した
シリコーン消泡剤ＶＰ １１３３(Wacker)を用い、これ
を発酵溶液の泡立ち方に応じて、泡電極を用いて少量ず
つ発酵槽に定量供給する。使用した撹拌コンポーネント
は直径が１０４０mm（スターラーφ：発酵槽φ＝０.
４：１）の４個のタービンを有するラジアルスターラー
である。最初の１０時間の発酵における回転速度は５０
rpmとし、そして１０時間目からは７５rpmとする。
接種物として用いる。発酵温度は３０℃とする。最初の
１０時間の発酵においては２５０ｍ3／時の空気を用
い、１０時間目から３０時間目は４００ｍ3／時、そし
て３０時間目からは１００〜７５ｍ3／時を用いて通気
を行う。発泡をコントロールするために、別途滅菌した
シリコーン消泡剤ＶＰ １１３３(Wacker)を用い、これ
を発酵溶液の泡立ち方に応じて、泡電極を用いて少量ず
つ発酵槽に定量供給する。使用した撹拌コンポーネント
は直径が１０４０mm（スターラーφ：発酵槽φ＝０.
４：１）の４個のタービンを有するラジアルスターラー
である。最初の１０時間の発酵における回転速度は５０
rpmとし、そして１０時間目からは７５rpmとする。
【００５１】前述の発酵条件下では、１６７時間の発酵
時間の間に、培養液１リットルあたり、約７８ｇのラム
ノ脂質、およびＬ−ラムノース約３２ｇのＬ−ラムノー
ス含量を生産することができる。発酵完了後、発酵液全
体を発酵槽中で１００℃に加熱し、そしてこの温度で１
時間撹拌して生産菌株を死滅させる。結晶性Ｌ−ラムノ
ースまでの更なる後処理工程は特許文献ＰＣＴ／ＥＰ
９１−０１７５６およびＰＣＴ／ＥＰ ９１−０１４２
６と同様にして行う。
時間の間に、培養液１リットルあたり、約７８ｇのラム
ノ脂質、およびＬ−ラムノース約３２ｇのＬ−ラムノー
ス含量を生産することができる。発酵完了後、発酵液全
体を発酵槽中で１００℃に加熱し、そしてこの温度で１
時間撹拌して生産菌株を死滅させる。結晶性Ｌ−ラムノ
ースまでの更なる後処理工程は特許文献ＰＣＴ／ＥＰ
９１−０１７５６およびＰＣＴ／ＥＰ ９１−０１４２
６と同様にして行う。
【００５２】3.3. 実施例３： Ｌ−ラムノース生産のための工業規模のフェッド−バッ
チ(Fed-batch)式発酵 実施例１におけると同様の組成を有する１８.５ｍ3の主
培養培地に３５０リットルの前培養（同じく実施例１に
記載）を接種する。使用した生産菌株はシュードモナス
・アエルギノーザＤＳＭ ７１０８である。接種前およ
び２０、４０、７０および１２０時間の発酵時間の後、
微量元素液（実施例１参照）を各々滅菌条件下に添加す
る。
チ(Fed-batch)式発酵 実施例１におけると同様の組成を有する１８.５ｍ3の主
培養培地に３５０リットルの前培養（同じく実施例１に
記載）を接種する。使用した生産菌株はシュードモナス
・アエルギノーザＤＳＭ ７１０８である。接種前およ
び２０、４０、７０および１２０時間の発酵時間の後、
微量元素液（実施例１参照）を各々滅菌条件下に添加す
る。
【００５３】通気速度は次のとおり変える：発酵開始時
に２５０ｍ3／時、１０時間発酵後は３５０ｍ3／時およ
び３０時間発酵後は泡形成の強度に応じて１００〜１３
０ｍ3／時の空気。最初の１０時間の発酵においては混
合物を５０rpmで撹拌し、次に７５rpmで撹拌する。発酵
の７２時間目から１０９時間目まで、更に５６４リット
ルの大豆油を連続計量給入する。発泡コントロールは、
実施例１と同様の方法で行う。前記発酵条件の下では、
９日間で培養液中に９５ｇ／リットルのラムノ脂質およ
び３９〜４０ｇ／リットルのＬ−ラムノース含量が生産
される。実施例１に記載の如く培養液を更に後処理す
る。
に２５０ｍ3／時、１０時間発酵後は３５０ｍ3／時およ
び３０時間発酵後は泡形成の強度に応じて１００〜１３
０ｍ3／時の空気。最初の１０時間の発酵においては混
合物を５０rpmで撹拌し、次に７５rpmで撹拌する。発酵
の７２時間目から１０９時間目まで、更に５６４リット
ルの大豆油を連続計量給入する。発泡コントロールは、
実施例１と同様の方法で行う。前記発酵条件の下では、
９日間で培養液中に９５ｇ／リットルのラムノ脂質およ
び３９〜４０ｇ／リットルのＬ−ラムノース含量が生産
される。実施例１に記載の如く培養液を更に後処理す
る。
【００５４】3.4. 実施例４： ３００リットル規模Ｌ−ラムノース生産のためのバッチ
式発酵 ３００リットルの主培養培地（実施例１におけると同様
の組成）を公称容量４５０リットルの発酵槽で滅菌す
る。シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ ７１０８
株の振盪フラスコ前培養（実施例１と同様の培地）４リ
ットルを用いて接種を行う。
式発酵 ３００リットルの主培養培地（実施例１におけると同様
の組成）を公称容量４５０リットルの発酵槽で滅菌す
る。シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ ７１０８
株の振盪フラスコ前培養（実施例１と同様の培地）４リ
ットルを用いて接種を行う。
【００５５】次の発酵条件を設定する：発酵温度は３０
℃である。撹拌は発酵の初めには３００rpmで、そして
３０時間目からは４００rpmで行う。発酵の１０時間目
までは混合物を８０リットル／分で通気し、発酵の１０
時間目からは１２０リットル／分で、また発酵の３０時
間目からは３０リットル／分で通気する。接種前と２
０、４０および７０時間の発酵後、実施例１と同様の微
量元素（各場合について４リットルの脱イオン水中で滅
菌）を添加する。１１２時間の発酵時間の後、１１.３k
gの大豆油を再び滅菌条件下に添加する。泡立ち方によ
っては、シリコーン消泡剤ＶＰ １１３３（Wacker)を必
要に応じ計量給入する。前記発酵条件下では、培養液１
リットルあたり約１１２ｇのラムノ脂質および約４６ｇ
／リットルのＬ−ラムノースが１１日で形成される。そ
の培養液を次いで実施例１に記載の如くに後処理する。
℃である。撹拌は発酵の初めには３００rpmで、そして
３０時間目からは４００rpmで行う。発酵の１０時間目
までは混合物を８０リットル／分で通気し、発酵の１０
時間目からは１２０リットル／分で、また発酵の３０時
間目からは３０リットル／分で通気する。接種前と２
０、４０および７０時間の発酵後、実施例１と同様の微
量元素（各場合について４リットルの脱イオン水中で滅
菌）を添加する。１１２時間の発酵時間の後、１１.３k
gの大豆油を再び滅菌条件下に添加する。泡立ち方によ
っては、シリコーン消泡剤ＶＰ １１３３（Wacker)を必
要に応じ計量給入する。前記発酵条件下では、培養液１
リットルあたり約１１２ｇのラムノ脂質および約４６ｇ
／リットルのＬ−ラムノースが１１日で形成される。そ
の培養液を次いで実施例１に記載の如くに後処理する。
【００５６】以上、本発明を詳細に説明したが、本発明
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １．培養液１リットルあたり７０〜１２０ｇの濃度でラ
ムノ脂質を合成するシュードモナス・アエルギノーザ。 ２．シュードモナス・アエルギノーザの発酵により培養
液１リットルあたり７０〜１２０ｇの濃度でラムノ脂質
を合成しそしてそれらラムノ脂質をＬ−ラムノースに加
水分解することより成るＬ−ラムノースの製造方法。 ３．シュードモナス・アエルギノーザにより生産されそ
して培養液中に含まれるラムノ脂質をそれらを予め単離
することなくＬ−ラムノースに加水分解することにより
成る前項１記載の方法。 ４．シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ ７１０７
および／またはＤＳＭ７１０８が発酵される前項１また
は２記載の方法。
はさらに次の実施態様によってこれを要約して示すこと
ができる。 １．培養液１リットルあたり７０〜１２０ｇの濃度でラ
ムノ脂質を合成するシュードモナス・アエルギノーザ。 ２．シュードモナス・アエルギノーザの発酵により培養
液１リットルあたり７０〜１２０ｇの濃度でラムノ脂質
を合成しそしてそれらラムノ脂質をＬ−ラムノースに加
水分解することより成るＬ−ラムノースの製造方法。 ３．シュードモナス・アエルギノーザにより生産されそ
して培養液中に含まれるラムノ脂質をそれらを予め単離
することなくＬ−ラムノースに加水分解することにより
成る前項１記載の方法。 ４．シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ ７１０７
および／またはＤＳＭ７１０８が発酵される前項１また
は２記載の方法。
【００５７】５．ラムノ脂質が培養液１リットルあたり
３０〜５０ｇの濃度のＬ−ラムノースに加水分解される
前項１または２記載の方法。 ６．一以上の植物油、特に大豆油が培地に炭素源として
添加される前項１記載の方法。 ７．発酵時間が４〜１１日間である前項１記載の方法。 ８．通気速度が０.０２〜０.５ＶＶＭである前項１記載
の方法。 ９．シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ７１０７。 １０．シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ７１０
８。
３０〜５０ｇの濃度のＬ−ラムノースに加水分解される
前項１または２記載の方法。 ６．一以上の植物油、特に大豆油が培地に炭素源として
添加される前項１記載の方法。 ７．発酵時間が４〜１１日間である前項１記載の方法。 ８．通気速度が０.０２〜０.５ＶＶＭである前項１記載
の方法。 ９．シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ７１０７。 １０．シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ７１０
８。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:385） (72)発明者 ラインハルト・ローテルト ドイツ連邦共和国デー−6272ニーデルンハ ウゼン．イートシユタイナーシユトラーセ 86 (72)発明者 ヨハネス・マイヴエス ドイツ連邦共和国デー−6270イートシユタ イン．テーオドーア−フリートナー−シユ トラーセ39
Claims (4)
- 【請求項１】 培養液１リットルあたり７０〜１２０ｇ
の濃度でラムノ脂質を合成するシュードモナス・アエル
ギノーザ。 - 【請求項２】 シュードモナス・アエルギノーザの発酵
により培養液１リットルあたり７０〜１２０ｇの濃度で
ラムノ脂質を合成しそしてそれらラムノ脂質をＬ−ラム
ノースに加水分解することより成るＬ−ラムノースの製
造方法。 - 【請求項３】 シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ
７１０７。 - 【請求項４】 シュードモナス・アエルギノーザＤＳＭ
７１０８。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4220437 | 1992-06-25 | ||
| DE4220437:2 | 1992-07-31 | ||
| DE4225283:0 | 1992-07-31 | ||
| DE4225283 | 1992-07-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0670754A true JPH0670754A (ja) | 1994-03-15 |
Family
ID=25915930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5153090A Pending JPH0670754A (ja) | 1992-06-25 | 1993-06-24 | シュードモナス・アエルギノーザおよびｌ−ラムノースのバイオテクノロジー的製造方法へのその使用 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5501966A (ja) |
| EP (1) | EP0575908B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0670754A (ja) |
| AT (1) | ATE190665T1 (ja) |
| DE (1) | DE59309972D1 (ja) |
| DK (1) | DK0575908T3 (ja) |
| ES (1) | ES2145019T3 (ja) |
| FI (1) | FI104735B (ja) |
| NO (1) | NO311096B1 (ja) |
| SG (1) | SG55120A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018514222A (ja) * | 2015-05-05 | 2018-06-07 | ロゴス テクノロジーズ， エルエルシー．Ｌｏｇｏｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌｌｃ． | 高収量および高力価でラムノリピッドを生産するための半連続方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000029604A1 (en) * | 1998-11-18 | 2000-05-25 | The University Of Akron | Production of biological materials by simultaneous aerobic and anaerobic respiration |
| JP2002331572A (ja) * | 2001-05-08 | 2002-11-19 | Chisso Corp | 発泡ポリプロピレン樹脂シートの成形方法及び発泡成形体 |
| KR100427300B1 (ko) * | 2001-11-28 | 2004-04-14 | 한국생명공학연구원 | 미생물의 휴식세포를 이용한 생물계면활성제의 생산방법 |
| EP1415538A1 (en) * | 2002-11-04 | 2004-05-06 | Puratos Naamloze Vennootschap | Rhamnolipids in bakery products |
| US20070025950A1 (en) * | 2005-07-28 | 2007-02-01 | Elson Melvin L | Composition and method for treating cellulite |
| CN1328371C (zh) * | 2005-09-01 | 2007-07-25 | 北京未名凯拓农业生物技术有限公司 | 一株铜绿假单胞菌及其培养方法与应用 |
| DE102007028030A1 (de) | 2007-06-14 | 2008-12-24 | Universität Karlsruhe (Th) | Biotenside und deren Herstellung |
| SG188566A1 (en) * | 2010-09-17 | 2013-04-30 | Tecnifar Ind Tecnica Farmaceutica S A | Antibacterial phage, phage peptides and methods of use thereof |
| CN104830889B (zh) * | 2015-03-06 | 2019-01-25 | 西安海格生物技术研究所有限公司 | 一种铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂的基因重组方法 |
| BR102017000578B1 (pt) | 2017-01-11 | 2019-04-02 | Natura Cosméticos S.A. | Processo de obtenção de ramnolipídeo produzido por pseudomonas ou enterobacter utilizando o resíduo de semente de andiroba ou murumuru |
| EP3577126B1 (en) | 2017-02-06 | 2023-09-06 | Stepan Company | Decolorization of concentrated rhamnolipid composition |
| WO2019027878A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Logos Technologies Llc | ENHANCED PRODUCTION OF RHAMNOLIPIDS USING AT LEAST TWO SOURCES OF CARBON |
| CN112079709B (zh) * | 2019-06-12 | 2023-03-28 | 万华化学集团股份有限公司 | 一种由鼠李糖脂水解制备3-羟基癸酸的方法 |
| CN112481335A (zh) * | 2019-09-11 | 2021-03-12 | 万华化学集团股份有限公司 | 一种鼠李糖脂发酵方法 |
| CN111134125B (zh) * | 2020-01-20 | 2021-10-29 | 浙江大学 | 一种生物农药与植物生长调节复合剂及制备方法 |
| CN111892254B (zh) * | 2020-09-02 | 2022-08-16 | 浙江一清环保工程有限公司 | 一种资源化利用餐厨废水、鱼粉废水发酵产鼠李糖脂的方法 |
| CN112625885A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-04-09 | 天津渤化永利化工股份有限公司 | 一种利用丁辛醇生产装置尾气制备鼠李糖脂的系统及方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4814953B1 (ja) * | 1970-10-14 | 1973-05-11 | ||
| EP0135099A3 (de) * | 1983-08-09 | 1987-05-13 | Petrotec Systems AG | Verfahren zur Herstellung von Tensiden |
| DE3405664A1 (de) * | 1984-02-17 | 1985-09-05 | Wintershall Ag, 3100 Celle | Verfahren zur biotechnischen herstellung von rhamnolipiden und rhamnolipide mit nur einem ss-hydroxidecancarbonsaeurerest im molekuel |
| JPS62293A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Ｌ−ラムノ−スの製造法 |
| GB2194247A (en) * | 1986-08-19 | 1988-03-02 | Allelix Inc | Mutant microorganisms |
| US4933281A (en) * | 1987-03-17 | 1990-06-12 | The University Of Iowa Research Foundation | Method for producing rhamnose |
| GB8727223D0 (en) * | 1987-11-20 | 1987-12-23 | Unilever Plc | Preparing l-rhamnose |
-
1993
- 1993-06-18 DK DK93109771T patent/DK0575908T3/da active
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- 1995-06-05 US US08/462,027 patent/US5658793A/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| JP2018514222A (ja) * | 2015-05-05 | 2018-06-07 | ロゴス テクノロジーズ， エルエルシー．Ｌｏｇｏｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌｌｃ． | 高収量および高力価でラムノリピッドを生産するための半連続方法 |
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| EP0575908B1 (de) | 2000-03-15 |
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| US5501966A (en) | 1996-03-26 |
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