ES2323080T3 - Composiciones vacunales obtenidas a partir de streptomyces. - Google Patents

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Maximo Martinez Benitez
Leonora Gonzalez Mesa
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CT DE QUIMICA FARMACEUTICA
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INSTITUTO FINLAY CENTRO DE INVESTIGACION-PRODUCCION DE VACUNAS Y SUEROS
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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la inmunología, específicamente con el control de enfermedades infecciosas causadas por micobacterias, basado en el uso de vacunas para la prevención de estas enfermedades. Con la presente invención se desarrollaron vacunas basadas en el uso de cepas vivas de Streptomyces expresando o no antígenos de M. tuberculosis, las cuales demostraron su capacidad protectora frente al reto con BCG y M. tuberculosis después de ser administradas por distintas vías. Forma parte de la presente invención el uso de cepas de Streptomyces para la expresión de antígenos heterólogos de interés vacunal.

Description

Composiciones vacunales obtenidas a partir de Streptomyces.
Objeto de la invención
La presente invención se relaciona con el campo de la inmunología, específicamente con el control de enfermedades infecciosas causadas por micobacterias, específicamente con el desarrollo de vacunas basadas en el uso de cepas vivas de Streptomyces que expresan o no antígenos de M. tuberculosis, las cuales demostraron su capacidad protectora frente al reto con BCG y M. tuberculosis después de ser administradas por distintas vías.
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Antecedentes de la invención
Entre las micobacterias se encuentran patógenos importantes para el hombre y los animales, entre ellas Mycobacterium tuberculosis que causa la tuberculosis, Mycobacterium leprae el cual es responsable de la lepra, Mycobacterium avium y Mycobacterium intracelulare productores de la tuberculosis en pacientes inmunodeprimidos, así como otras micobacterias que con menor frecuencia causan enfermedades en el humano (Somner HM, Good RC. Mycobacterium. En: Manual of clinical Microbiology, 4 ed. Washington D.C: An society for Microbiology; 1985. p.216-248., Orme IM. Immunity to mycobacteria. Current Opinión in Immunology. 1993; 5: 497-502).
En el caso de los animales, se destacan Mycobacterium avium subsp. para la tuberculosis el cual causa la Enfermedad de Jones en rumiantes y Mycobacterium bovis, que causa la tuberculosis del ganado vacuno (Dannenberg Am.Patogenesis of tuberculosis: native and acquired resístanse in animals and humans. In Leive L, Schelesinger D (eds). Mycrobiology. 1984, p344-354).
Entre las enfermedades micobacterianas más importantes en el hombre se encuentra la tuberculosis (TB) que constituye un problema de salud en todo el mundo y es la primera causa de muerte asociada a enfermedades infecciosas, a pesar de la vacunación con BCG y del uso de un gran número de drogas para su control (Dolin PJ, Raviglione MK, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull Who. 2001; 72: 213).
Se estima que la tercera parte de la población mundial ha sido infectada por el Mycobacterium tuberculosis. Cada año 8 millones de personas en todo el mundo desarrollan la TB activa y mueren 3 millones. La coinfección con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), representa del 3 al 5% de los casos (Dolin PJ, Raviglione MK, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000. Bull Who. 1994; 72: 213).
Debido a la gran extensión de la enfermedad se requieren del desarrollo de nuevos y mejores métodos diagnósticos, preparados vacunales y agentes terapéuticos (Collins FM. Tuberculosis: The Return of an Old Enemy. Critical Reviews in Microbiology. 1993; 19: 1-16).
En cuanto al tratamiento, este se basa en combinaciones de medicamentos, administrados a relativamente altas dosis, por largos períodos de tiempo y con toxicidad asociada, lo cual dificulta la implementación de los programas de tratamiento controlado (McCarthy M. Experts see progress in fight against tuberculosis Lancet. 2002; 359:2005). En este sentido, sería deseable la disminución de los tiempos de tratamiento, favoreciendo de esta forma la aplicación de los programas de control y el cumplimiento del mismo, lo que evitaría el surgimiento de cepas resistentes. La disminución de las dosis de los fármacos empleados sería también un elemento de utilidad que disminuiría la toxicidad del tratamiento.
El surgimiento de cepas con resistencia múltiple a drogas es un problema creciente en la actualidad que demanda el desarrollo de nuevas alternativas terapéuticas para el elevado número de pacientes que las alberga (50 millones) y para el creciente número de casos con estas características que se presentarán en el futuro (McCarthy M, News. Experts see progress in fight against tuberculosis. Lancet. 2002; 359:2005; Hopewell PC. Tuberculosis Control: How the world has changed since 1990. Bull. World Health Org 2002, 80:427, Freire M, Rosigno G Joining forces to develop weapons against TB: together we must. Bull. World Health Org 2002, 80:429).
Adicionalmente, existen múltiples especies de micobacteria que producen enfermedad en el hombre para las que no se cuenta con un tratamiento adecuado.
El BCG es la única vacuna antituberculosa existente actualmente para uso humano. En el mundo han sido administradas alrededor de tres billones de dosis. Su eficacia varía ampliamente dependiendo de la cepa empleada, el estado nutricional, fondo genético, envejecimiento y presencia de infecciones intercurrentes. Se considera que su uso solo es eficaz en la prevención de las formas graves de la enfermedad (miliar y meningea) en la infancia y que no tiene valor para la prevención de la tuberculosis pulmonar, por lo que es muy urgente la necesidad de desarrollar nuevos preparados vacunales (Hirsch LS, Johnson-JL, Ellner JJ. Pulmonary tuberculosis. Curr-Opin-Pulm-Med1999;5(3):143-50; Jacobs GG, Johonson JL, Wallis RS. Tuberculosis vaccines: how close to human testing. Tuber Lung Did 1997;78:159-169; Ginsberg AM. What's new in tuberculosis vaccines? Bull. World Health Org 2002,
80:483).
Las estrategias mas importantes de desarrollo de vacunas contra la tuberculosis incluyen el uso de cepas inactivadas, cepas atenuadas genéticamente o no, vacunas de ácidos nucleicos, vacunas de subunidades y cepas vivas atenuadas expresando antígenos de M. tuberculosis.
Las vacunas inactivadas tienen como desventaja el hecho de que por tratarse de microorganismos muertos, estos tienen una capacidad protectora disminuida, debido fundamentalmente por la imposibilidad de persistir "in vivo" y la falta de expresión de proteínas relevantes para la protección como son las proteínas de secreción.
En el caso de las cepas atenuadas genéticamente o no, su principal desventaja es la posibilidad de reversión a la virulencia después de administradas, lo cual genera preocupaciones desde el punto de vista de su seguridad en humanos.
Las vacunas de ácidos nucleicos, a pesar de constituir una estrategia promisoria, hasta el momento en general en humanos no han logrado niveles de inmunogenicidad adecuados.
En cuanto a las vacunas de subunidades, por tratarse de componentes purificados a partir del microorganismo u obtenidos por vía recombinante, se plantea que no poseen el mismo potencial de inmunogenicidad que los microorganismos vivos, lo cual dificulta el logro de respuestas protectoras, fundamentalmente en lo referido a la estimulación de respuestas celulares de tipo de células T Auxiliadoras tipo 1 (TH 1).
La estrategia de expresión de antígenos de interés vacunal en cepas vivas atenuadas es una de las estrategias más prometedoras en el campo del desarrollo de vacunas de nueva generación contra la tuberculosis, sin embargo, hasta el momento no se han llevado ensayos clínicos con esta variante. Un elemento de importancia de esta estrategia radica en la selección del vector de expresión, que en dependencia de la cepa seleccionada podría implicar complicaciones desde el punto de vista regulatorio similares a las que se confronta con el uso de cepas vivas atenuadas.
Estado de la técnica relevante también incluye DATABASE WPI Section Ch, Week 200379 Derwent Publications Ltd., London, GB; Class B04, AN 2003-849754 XP002334575 KIM C J ET AL.: "Microorganism Streptomyces sp. Amlk-335 producing cyclo(proline-phenylalanine) and cyclo(leucine-proline) useful for preparing an antimicrobial and anticancer composition" & KR 2003 055 089 A (KOREA RES INST BIOSCIENCE & BIOTECHNOLOG) 2 julio 2003 (2003-07-02) en donde se describe el uso terapéutico como composición antimicrobiana y anticáncer de compuestos aislados de Streptomyces y DONALD TREMBALY ET AL.: "High-level hetrologus and secretion in Streptomyces lividans of two mayor antigenic proteins from Mycobacterium tuberculosis" CANADIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, vol. 48, 2002, páginas 43-48, XP002334573, que describe la producción eteróloga y secreción de dos antígenos micobacterianos mediante Streptomyces lividans.
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Breve descripción de la invención
Teniendo en cuenta que Streptomyces y M. tuberculosis pertenecen a la misma clase, que comparten una gran cantidad de genes y antígenos, unido al hecho de la probada inocuidad de Streptomyces para el hombre y la amplia utilización que estas bacterias han tenido en la producción de fármacos para uso humano, así como el amplio desarrollo de métodos de expresión de proteínas heterólogas en este sistema, incluyendo proteínas de M. tuberculosis, se diseñó, mediante la presente invención, el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis que emplean como principio activo cepas vivas de Streptomyces, las cuales pueden expresar o no antígenos de M. tuberculosis, y que son administradas por distintas vías, incluyendo la mucosal.
Las preparaciones vacunales de la presente invención comprenden una variedad de principios activos derivados del microorganismo Streptomyces, entre los que se encuentran:
\bullet Streptomyces (cepa salvaje)
\bullet Streptomyces recombinante que expresa el antígeno Apa de M. tuberculosis
La cepa salvaje utilizada en la presente invención es una cepa industrial, no patógena, de amplia utilización en la producción de medicamentos para el hombre.
Sorprendentemente se observó una marcada inmunogenicidad humoral y celular de las cepas después de su administración por distintas vías. Las respuestas obtenidas se dirigieron contra los antígenos de la cepa utilizada en la inmunización (Streptomyces), contra el antígeno de M. tuberculosis expresado en la misma (Apa), así como contra otros antígenos de M. tuberculosis y BCG (Ejemplo 1), lo cual confirmó la comunidad de antígenos existente entre Streptomyces y Micobacteria y la amplia reactividad cruzada de los mismos. Este hecho avaló la posibilidad del uso de estas cepas como vacunas frente a M. tuberculosis.
Otro hecho que avala su uso es su incapacidad para colonizar y para causar lesiones histopatológicas en el hospedero, hechos que reafirman su inocuidad (Ejemplo 2)
\newpage
Estas cepas son aplicables profilácticamente para la prevención de la tuberculosis, quedando demostrado en todas las vías de administración utilizadas, la inducción de un estado de protección frente a M. tuberculosis y BCG
(Ejemplo 3).
Las composiciones de la presente invención produjeron una disminución significativa de los niveles de infección pulmonar con BCG y M. tuberculosis en un modelo de infección en ratones (Ejemplo 3).
La presente invención aborda de manera novedosa la prevención de las enfermedades causadas por micobacterias, en particular contra la tuberculosis, a través del empleo de vacunas basadas en cepas de Streptomyces. Es de particular novedad el empleo de cepas de Streptomyces, aspecto éste no conocido en modo alguno a partir del estado del arte. Resulta igualmente novedoso que dichas cepas resultaron efectivas tanto por la vía mucosal como parenteral.
Resultó significativo que las cepas de Streptomyces pueden ser utilizadas como vectores vivos de expresión de antígenos de interés vacunal lo cual no ha sido reportado en el estado del arte abriendo la posibilidad de utilización de estas cepas para la expresión de antígenos no micobacterianos permitiendo su uso para la prevención y tratamiento de enfermedades alérgicas, tumorales, autoinmunes y en la prevención del embarazo.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Western blot. Tiras de Nitrocelulosa con extractos de Streptomyces (1) y BCG (2) fueron estudiados frente a un pooles de sueros de animales inmunizados con Streptomyces (Grupo 2).
Figura 2: Western blot. Tiras de Nitrocelulosa con extractos de BCG (1) y Streptomyces (2) fueron estudiados frente a un pooles de sueros de animales inmunizados con BCG (Grupo 3).
Figura 3: Western blot. Tiras de Nitrocelulosa con extractos de BCG (1) y Streptomyces (2) fueron estudiados frente a un pooles de sueros de animales inmunizados con Solución Salina (Grupo 1).
Figura 4: Experimento de reto con BCG. Los valores representan el logaritmo medio de las CFU/mg de tejido pulmonar. Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre el grupo inmunizado con Streptomyces y los grupos inmunizados con BCG y Solución Salina (SS).
Ejemplos
La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos.
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Ejemplo 1 Estudio de Inmunogenicidad Animales
Ratones Balb/c machos de 8-10 semanas suministrados por el CENPALAB, Cuba, fueron usados en los experimentos.
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BCG
Cepa viva liofilizada de BCG (InterVax, Biological Limited, Canada).
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Streptomyces lividans
Cepa 1326, no transformada genéticamente (Streptomyces) y transformada expresando la proteína ApA de Mycobacterium tuberculosis (Streptomyces-ApA).
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Esquema de Inmunización
40 ratones Balb/c fueron divididos en 4 grupos de 10 animales cada uno (Tabla 1).
El grupo 1 recibió Solución Salina (SS) y fue usado como control.
Los animales de los grupos 2 y 3 recibieron 10^{5} CFU de Streptomyces por la vía intraperitoneal (IP) con un intervalo de 3 semanas entre las dosis. Los animales del grupo 3 recibieron Streptomyces-ApA con el mismo esquema.
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Los animales de grupo 4 se inmunizaron con el mismo protocolo pero utilizando 10^{5} CFU de BCG en cada inmunización, 21 días después de la última inmunización se tomaron muestras de sangre de cada animal.
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TABLA 1 Estudio de inmunogenicidad
1 
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Western Blot
Extractos proteicos de Streptomyces, BCG y la proteína recombinante ApA de M. tuberculosis de separaron por SDS-PAGE (laemmli) A, UK. Nature 1970; 227(6): 680-685) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 \mum usando un sistema semiseco (NovaBlot II, Pharmacia, Sweeden).
Las membranas se bloquearon con seroalbúmina bovina (BSA) 2% en PBS durante 2 horas a 37ºC, fueron lavadas e incubadas por 1 hora a 37ºC e incubadas con pooles de suero de los animales de los diferentes grupos diluidos 1:150 en PBS.
Después del lavado las membranas se incubaron durante 1 hora a 37 grados centígrados con un conjunto polivalente anti inmunoglunilas de ratón (Sigma), diluido 1:1500Ater y reveladas con Diaminobenzidine y H_{2}O como sustrato.
El resultado obtenido del estudio de inmunogenicidad demostró la inducción de anticuerpos específicos contra los antígenos de Streptomyces en los animales inmunizados con el microorganismo. (Figura 1).
Adicionalmente, los animales inmunizados reconocieron proteínas de BCG, demostrando la reactividad cruzada con micobacterias de la respuesta producida. (Figura 1).
El resultado es altamente relevante, ya que demuestra el potencial inmunizante de Streptomyces contra las micobacterias.
La reactividad cruzada contra Streptomyces producida después de la inmunización con BCG también fue demostrada. (Figura 2).
El suero de los animales inmunizados con SS no fueron reactivos frente a antígenos de Streptomyces o BCG. (Figura 3).
El grupo de animales inmunizados con Streptomyces-ApA mostraron un similar patrón de respuesta que los animales inmunizados con Streptomyces (resultados no mostrados). En este grupo de animales, el reconocimiento de la proteína ApA se demostró por Western Blot (resultado no mostrado).
Este resultado demuestra la capacidad de Streptomyces de ser usado como un vector vivo para la expresión de antígenos heterólogos, en particular de M. tuberculosis.
Ejemplo 2 Estudio de biodistribución Animales
Ratones Balb/c machos de 8-10 semanas suministrados por el CENPALAB, Cuba, fueron usados en los experimentos.
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BCG
Cepa viva liofilizada de BCG (InterVax, Biological Limited, Canada).
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Streptomyces lividans
Cepa 1326, no transformada genéticamente (Streptomyces) y transformada expresando la proteína ApA de Mycobacterium tuberculosis (Streptomyces-ApA).
El estudio se llevó a cabo con 48 ratones, distribuidos en 8 grupos de 6 animales (Tabla 2). Los animales del grupo 1 recibieron 200\mul de SS IP y los animales del grupo 5 recibieron 50 \mul SS IN.
Los animales de los grupos 2, 3 y 4 recibieron Streptomyces en dosis de 10^{5}, 10^{3} y 10^{2} respectivamente en 200 \mul de agua destilada (IP).
Los animales de los grupos 6, 7 y 8 recibieron Streptomyces en dosis de 10^{3}, 10^{2} 10^{1} respectivamente en 50 \mul de agua destilada por vía intranasal (IN).
Después de 30 días los animales fueron sacrificados y el corazón, pulmón, hígado, bazo y riñón fueron estudiados hispatológicamente (3 animales) y microbiológicamente (3 animales).
El estudio hispatológico fue realizado mediante tinción con Hematoxilina y Eosina.
El estudio microbiológico se efectuó utilizando medio YEME (Tobias Kieser, Mervyn J. Viv., Mark J. Buttner, Perth F. Charter, David A. Hopwood. Practical Streptomyces Genetics. Crowes, Norwich. England. 2000).
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TABLA 2 Estudio de biodistribución de Streptomyces
2
En el estudio de biodistribución el microorganismo no fue evidente en los órganos estudiados.
El estudio hispatológico no demostró lesiones en los órganos estudiados. Resultados similares se obtuvieron con Streptomyces-ApA (resultado no demostrado).
Tomando en consideración estos estudios, podemos concluir que Streptomyces es seguro, demostrándose la posibilidad de su uso como vacuna viva sin efectos adversos.
Debe destacarse que además de seguras estas cepas inducen una adecuada respuesta inmune (Figura 1).
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Ejemplo 3 Experimentos de reto Animales
Ratones Balb/c machos de 8-10 semanas suministrados por el CENPALAB, Cuba, fueron usados en los experimentos.
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BCG
Cepa viva liofilizada de BCG (InterVax, Biological Limited, Canada).
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Streptomyces lividans
Cepa 1326, no transformada genéticamente (Streptomyces) y transformada expresando la proteína ApA de Mycobacterium tuberculosis (Streptomyces-ApA).
Fueron estudiados 26 animales distribuidos en 3 grupos (Tabla 3).
Los animales fueron inmunizados IP en 3 oportunidades con intervalos de 2 semanas.
El Grupo 1 con SS, el Grupo 2 con 10^{5} CFU de Streptomyces y el Grupo 3 con 10^{5} CFU de BCG.
3 semanas después de la última inmunización los animales fueron retados con 0,5 x 10^{6} CFU de BCG IN. 24 horas después los animales fueron sacrificados y los pulmones extraídos para estudios microbiológicos.
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Estudios microbiológicos
Los macerados de pulmón fueron sembrados en Medio Ogawa (Manial de la OXID. Cuarta Edición. 1981 Editados por OXID Limited, England) e incubados por 28 días a 37ºC. Después del periodo de incubación, las CFU fueron contadas y el número de CFU/mg de tejido determinadas.
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Procesamiento estadístico
La comparación estadística entre grupos se hizo con el método de Kruskal-Wallis y la prueba de Comparaciones Múltiples de distribución libre.
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TABLA 3 Experimento de Reto
3
En el grupo inmunizado con Streptomyces hubo una disminución significativa en las CFU de BCG en los pulmones comparado con los grupos inmunizados con BCG y SS (Figura 4). Resultados similares se obtuvieron con el grupo inmunizado con Streptomyces-ApA (resultados no mostrados).
Los animales inmunizados con Streptomyces y Streptomyces-ApA fueron protegidos frente al reto con M. tuberculosis (resultados no mostrados).
Los resultados anteriores demuestran la capacidad protectora de Streptomyces contra micobacterias y apoyan su uso como vacunas para la prevención de las infecciones por micobacterias.
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Ventajas de la solución propuesta
El uso de este tipo de cepas como vacunas frente a las infecciones por micobacterias en especial frente a la tuberculosis tiene como ventajas el uso de cepas no patógenas lo que permite el uso de las cepas vivas en humanos, lo cual garantiza una adecuada inmunogenicidad y estimulación de las respuestas inmunes relevantes para la protección.
Otra ventaja de este tipo de cepas es el amplio conocimiento de su genética y el elevado grado de desarrollo de los métodos de transformación genética y de expresión en altos niveles de proteínas heterólogas en estos hospederos entre las que se incluyen las de M. tuberculosis lo que permite el desarrollo de cepas de Streptomyces expresando altos niveles de proteínas de M. tuberculosis, de preferencia en forma secretada lo que garantiza una elevada inmunogenicidad y capacidad protectora.
Otra de las ventajas radica en la amplia experiencia que existe con el uso industrial de estas cepas para la producción de medicamentos de uso humano lo que garantiza la producción industrial de estas vacunas.
En el caso particular de infecciones por micobacterias la demostración de la capacidad protectora de la administración por vía de mucosas asegura la inducción de respuestas protectoras a nivel de la puerta de entrada del microorganismo. La vía de administración mucosal asegura una vía fácil y versátil de aplicación en el sitio de entrada de estos microorganismos, favoreciendo el bloqueo de la infección y por lo tanto el efecto profiláctico.
Otra de las ventajas es el amplio espectro de actividad contra distintos tipos de micobacteria demostrado por la protección inducida frente a M. tuberculosis y BCG, lo que garantiza su uso para la prevención de un amplio espectro de enfermedades por micobacterias.
También las cepas de Streptomyces transformadas genéticamente y expresando antígenos de interés vacunal no micobacterianos pueden ser utilizadas para la profilaxis o terapéutica de enfermedades infecciosas no micobacterianas, autoinmunes, alérgicas, tumorales, así como la prevención del embarazo.

Claims (12)

1. Composiciones vacunales obtenidas a partir Streptomyces caracterizadas porque comprenden como principio activo una o más cepas salvajes del género Streptomyces o cepas mutantes o recombinantes derivadas de las mismas, así como un excipiente apropiado.
2. Composición vacunal según la reivindicación 1 caracterizada porque dichas cepas de Streptomyces son cepas vivas.
3. Composición vacunal según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque dichas cepas de Streptomyces son Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor y Streptomyces Sp.
4. Composición vacunal según la reivindicación 1 caracterizada porque dichas cepas recombinantes de Streptomyces expresan uno o más antígenos heterólogos de interés vacunal.
5. Composición vacunal según la reivindicación 4 caracterizada porque dichas cepas recombinantes de Streptomyces expresan uno o más antígenos de Mycobacterium Tuberculosis.
6. Uso de la composición vacunal de las reivindicaciones de la 1 a la 5 para la prevención o terapéutica de enfermedades infecciosas.
7. Uso según la reivindicación 6 para la prevención o terapéutica de infecciones causadas por micobacterias.
8. Uso según la reivindicación 7 para la prevención o terapéutica de la tuberculosis.
9. Uso de la composición vacunal de las reivindicaciones de la 1 a la 5 para la prevención o terapéutica de enfermedades tumorales.
10. Uso de la composición vacunal de las reivindicaciones de la 1 a la 5 para la prevención o terapéutica de enfermedades autoinmunes.
11. Uso de la composición vacunal de las reivindicaciones de la 1 a la 5 para la prevención o terapéutica de enfermedades alérgicas.
12. Uso de la composición vacunal de las reivindicaciones de la 1 a la 5 para la prevención del embarazo.
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