ES2323560T3 - Desarrollo a termino de animales a partir de oocitos no nucleados reconstituidos con nucleos de celulas somaticas adultas. - Google Patents

Abstract

Un método para clonar un mamífero no humano que comprende las etapas de: (a) recogida de un núcleo de una célula cúmulo de un mamífero no humano adulto; (b) inserción de al menos una porción del núcleo que incluye los cromosomas en un oocito enucleado para formar un oocito renucleado; (c) permitir al oocito renucleado desarrollarse en un embrión; y (d) permitir al embrión desarrollarse en una cría viva.

Description

Desarrollo a término de animales a partir de oocitos no nucleados reconstituidos con núcleos de células somáticas adultas.

Antecedentes del invento

El invento se refiere al clonaje de mamíferos no humanos mediante la inserción de un núcleo de una célula somática adulta en un oocito no nucleado de tal modo que el oocito hospedante forma un embrión y puede desarrollarse en un animal vivo. En una realización del invento, la inserción de un núcleo se logra mediante microinyección accionada mediante un dispositivo piezoeléctrico.

La producción rápida de grandes cantidades de animales casi idénticos es muy deseable. Por ejemplo, se espera que se puedan obtener amplios beneficios médicos cuando los animales casi idénticos sean también animales generados mediante ingeniería genética (por ejemplo transgénicos). Grandes animales alterados genéticamente pueden actuar como "factorías" farmacéuticas vivas produciendo agentes farmacéuticos valiosos en su leche u otros fluidos o tejidos (un método de producción a veces referido como "pharming" (granjeo)) o actuar como órganos vivos o "factorías" celulares para órganos humanos o células que no serán rechazadas por el sistema inmune humano. La producción de grandes cantidades de animales de investigación casi idénticos, tales como ratones, cobayas, ratas, y hámsters es también deseada. Por ejemplo, el ratón es un modelo de investigación primario para el estudio de la biología en mamíferos, y la disponibilidad de ratones casi idénticos, transgénicos o no transgénicos, sería muy beneficioso para el análisis de, por ejemplo, el desarrollo embrionario, enfermedades de humanos, y para ensayar nuevos fármacos. Así, por una variedad de razones, (por ejemplo, en el contexto de cría de animales de granja, o la interpretación de datos generados en ratones), puede ser deseado producir de modo fiable crías de un animal en particular que sean genéticamente idénticas a los padres.

Además, con respecto a la transgénesis, los protocolos actuales para generar animales transgénicos no están lo suficientemente avanzados para garantizar el control programado de la expresión génica en el contexto del animal entero. Aunque es posible minimizar efectos de "posición" deletéreos causados por la manera casi al azar en que el transgen se integra en el genoma hospedante, diferencias pueden existir en los niveles de expresión del transgen entre individuos que llevan la misma construcción transgénica insertada en el mismo locus con el mismo número de copia. Así, aún generando cantidades modestas de animales transgénicos que produzcan los niveles deseados de cualquier proteína(s) recombinante(s) dada(s) puede ser bastante largo y costoso. Estos problemas pueden ser exacerbados debido a que el número de generaciones transgénicas es con frecuencia baja (comúnmente sólo una) debido a la baja eficacia, y a que varios progenitores son infértiles.

Una aproximación para resolver estos problemas es "clonar" genéticamente animales casi idénticos a partir de las células de animales adultos transgénicos o no transgénicos que tienen un rasgo deseado o producen un producto diana al nivel deseado. En este extremo, las colonias de animales genéticamente casi idénticos (clones) podrían ser generadas relativamente de forma rápida a partir de las células de un únicos animal adulto. Por otro lado, el clonaje selectivo y fiable de animales adultos que producen rendimientos aumentados de leche y carne podrían producir rápidamente grandes cantidades de buenos productores. El clonaje de animales a partir de células somáticas adultas podría ser también beneficioso en cuanto a la reproducción de mascotas (por ejemplo, perros, gatos, caballos, pájaros, etc.) y especies raras o en peligro de extinción. Como se usa aquí, "clonaje" se refiere al desarrollo completo hasta edad adulta de un animal cuyo ADN no mitocondrial pueda ser derivados a partir de una célula donante somática a través de la transferencia de cromosomas nucleares a partir de células donantes somáticas a una célula recipiente (tal como un oocito) del cual los cromosomas residentes han sido retirados.

En el desarrollo de mamíferos normales, los oocitos sufren una parada en el desarrollo en el estadío de la vesícula germinal en profase de la primera división meiótica. Tras la estimulación apropiada (por ejemplo, un aumento en plasma de la hormona luteinizante), la meiosis se reanuda, la vesícula germinal se rompe, la primera división meiótica se completa y el oocito se detiene en metafase de la segunda meiosis ("Met II"). los oocitos en Met II pueden ser entonces ovulados y fertilizados. Una vez fertilizados, el oocito completa la meiosis con la extrusión del segundo cuerpo polar y la formación de un pronúcleo macho y hembra. Los embriones empiezan a desarrollarse sufriendo una serie de divisiones mitóticas antes de diferenciar en células especificas, dando como resultado la organización de tejidos y órganos. Este programa de desarrollo asegura la transición con éxito desde oocito a cría.

Aunque las células de embriones tempranos han sido considerados clásicamente como totipotentes (esto es, que son capaces de desarrollarse en un nuevo individuo per se), esta totipotencia se pierde tras un número pequeño de divisiones, variando ese número entre especies (por ejemplo, embriones murinos y bovinos). Los mecanismos subyacentes a esta aparente pérdida de totipotencia son poco conocidos pero se cree que reflejan cambios sutiles en el entorno del ADN afectando la expresión génica, que son llamados colectivamente "reprogramación". Sin estar unidos por teoría, se cree que las técnicas de clonaje podrían posiblemente bien subvertir o mimetizar la "reprogramación".

Dados los enormes beneficios prácticos del clonaje, ha habido un interés proporcionalmente inmenso en superar las barreras tecnológicas y desarrollar nuevas técnicas para la fusión de células embrionarias o bien células fetales con oocitos enucleados. Hasta la fecha, sin embargo, hay una falta de protocolos documentados que han generado de manera reproducible un desarrollo completo de clones desde células somáticas adultas. Por ejemplo, se ha documentado que cuando cúmulos bovinos de núcleos celulares fueron inyectados en oocitos enucleados que fueron entonces electroactivados, 9% de 351 oocitos inyectados desarrollaron hasta blastocistos, pero ninguno se desarrolló a término. Igualmente, la fusión mediada por el virus Sendai de timocitos de ratón adulto con oocitos MetII enucleados, tras la activación de treinta a sesenta minutos más tarde con 7% de etanol, resultó en un 75% de 20 oocitos que alcanzaron el estadío de 2-células, pero ninguno se desarrolló mas allá del estadío de 4 células.

Un reciente reportaje describe la electrofusión de "células de glándulas mamarias" cultivadas con oocitos enucleados para producir una única cría de oveja viva, que fue llamada "Dolly" (Wilmut, I. y otros (1997), Nature 385, 810-813). Dolly fue descrita que se había desarrollado a partir de uno de 434 oocitos enucleados electrofusionados con células derivadas a partir de glándula mamaria que había sido cultivada durante cinco días en condiciones de deprivación de suero. Según el método descrito que había sido usado para clonar a Dolly, la "célula de glándula mamaria" fue insertada mediante micropipeta en el espacio perivitelino de un oocito enucleado. Wilmut describió que las células fueron inmediatamente sometidas a un pulso eléctrico para inducir la fusión de membrana y activar el oocito para desencadenar la reactivación del ciclo celular. El embrión resultante (además de 28 otros en el experimento) fue transferido en un recipiente adecuado y, en esta único caso, el embarazo procedió a la producción de Dolly. Sin embargo, debido a que la "célula de glándula mamaria" fue de una línea celular establecida a partir de una oveja de 6 años de edad que estaba en su tercer trimestre de embarazo, se había expresado públicamente la duda acerca de la identidad de las células a partir de la que el núcleo donante fue obtenido, e incluso de si la célula era de origen adulto.

En la solicitud de patente norteamericana Nº 09/132,104, ahora patente norteamericana 6331659, compartida por los autores, de la que la presente solicitud es una continuación-en-parte, los autores describen y reivindican un método de clonaje de animales a partir de células somáticas adultas, como se ejemplifica mediante la producción con éxito de ratones fértiles clonados a partir de cúmulos de núcleos celulares adultos. Los autores describen también que el método podría ser usado con éxito para producir clones de los ratones clonados. Puesto que la fuente de células de cúmulos del donante es hembra, todos los ratones clonados producidos fueron hembras.

En las partes en que se usan los términos "mamífero", "animal" o "embrión" a lo largo de la descripción del invento, hay que entender que se refieren a animales, mamífero o embriones no humanos.

Sumario del invento

El presente invento es una extensión del método del invento para incluir la producción con éxito de crías clonadas, vivas de células de cúmulos de mamíferos adultos no humanos. En particular, el método del invento proporciona crías clonadas, vivas de células de cúmulos a partir de animales machos adultos, que muestran que el método del invento no está limitado a producir animales hembra clonados. En una realización del invento, las células de cúmulos se cultivan durante un período de tiempo previo a su uso como donantes nucleares para producir animales clonados.

El método del invento para clonar animales a partir de células somáticas adultas mediante la inserción directa del núcleo de las células somáticas (o una porción del contenido nuclear que incluye al menos el material cromosómico mínimo capaz de mantener el desarrollo) en el citoplasma de un oocito enucleado, y facilitar el desarrollo embrionario del oocito reconstituido da como resultado crías vivas. Como se usa aquí, el término "célula somática adulta" se refiere a una célula de un animal postnato, que no es por tanto una célula fetal ni una célula embrionaria, y que no es del lineaje del gameto. Las crías viables resultantes son un clon de el animal que originalmente proporcionó el núcleo de las células somáticas para la inyección en el oocito. el invento es aplicable al clonaje de todos los mamíferos no humanos, tales como primates, óvidos, bóvidos, porcinos, ursinos, felinos, caninos, equinos, roedores y similares.

En una realización del invento, la célula somática adulta donante es "2n"; esto es, posee el complemento diploide de cromosomas como se ha visto en G0 o G1 de la célula. La célula donante puede ser obtenida a partir de una fuente in vivo o puede ser a partir de una línea celular cultivada. Un ejemplo de una fuente in vivo del núcleo 2n donante (es decir, en fase G0 o G1) es una célula cúmulo. Las células cúmulo ( en latín significa "un pequeño montículo") son así llamadas debido a que forman una masa sólida (un montón) de células foliculares que rodean el óvulo en desarrollo previo a la ovulación. Tras la evolución en algunas especies, tales como ratones, muchas de estas células permanecen asociadas con el oocito (para formar el ooforo del cúmulo) y, en ratones, más del 90% están en G0/G1 y, por lo tanto, son 2n.

En otra realización del invento, la célula somática adulta del donante es "2C a 4C"; esto es, contiene de una a dos veces el contenido genómico diploide, como resultado de la replicación durante la fase S del ciclo celular. Esta célula donante puede ser obtenida a partir de una fuente in vivo o in vitro de células dividiéndose de modo activo.

Una realización del método del invento incluye las etapas de (i) permitir al núcleo (o porción del mismo incluyendo los cromosomas) estar en contacto con el citoplasma del oocito enucleado durante un período de tiempo (por ejemplo hasta alrededor de 6 horas) tras la inserción en el oocito, pero previa a la activación del oocito, y (ii) activar el oocito. En estar realización, el núcleo es insertado en el citoplasmas del oocito enucleado mediante un método que no activa el oocito de modo concomitante.

Cuando se emplea un núcleo donante que tiene cromosomas 2n, el método incluye además la etapa de interrumpir el ensamblaje de microtúbulos y/o microfilamentos durante el período de tiempo tras la inserción del núcleo en el oocito enucleado para suprimir la formación de una cuerpo polar y mantener el número de cromosomas 2n. Cuando, por ejemplo, un núcleo donante 4n es empleado, esta etapa del método es omitida de tal modo que un cuerpo polar se forma, y la ploidía del oocito renucleado puede ser reducida a 2n.

En una realización preferida del invento, el núcleo es insertado mediante microinyección y, más preferiblemente, mediante microinyección accionada mediante un dispositivo piezoeléctrico. El uso de un micromanipulador piezo-eléctrico permite la recogida e inyección del núcleo donante a ser realizado con un aguja única. Por otro lado, la enucleación del oocito y la inyección del núcleo de la célula donante pueden ser realizados rápidamente y eficientemente y, por consiguiente, con menos trauma para el oocito que con métodos previamente documentados, tal como la fusión de la célula donante y el oocito mediada mediante reactivos químicos que promueven la fusión, mediante electricidad o mediante un virus fusogénico.

La introducción del material nuclear mediante microinyección es distinta de la fusión celular, temporal y topológicamente. Mediante el método de microinyección, la membrana plasmática de la célula donante es perforada (para permitir la extracción del núcleo) en una o más etapas que son temporalmente separadas a partir del suministro del núcleo (o una porción de la misma incluyendo al menos los cromosomas) en un oocito enucleado, siguiendo también la perforación de la membrana plasmática. Eventos de perforación separados no son una característica de la fusión celular.

Además, la separación espacio temporal de la eliminación del núcleo y la introducción permite la introducción controlada de materiales además del núcleo. La facilidad para eliminar citoplasma externo y para introducir materiales o reactivos adicionales puede ser altamente deseable. Por ejemplo los aditivos pueden modular ventajosamente el desarrollo embrionario del oocito renucleado. Tal reactivo puede comprender un anticuerpo, un inhibidor de transducción de señales farmacológico, o combinaciones de los mismos, en los que el anticuerpo y/o el inhibidor son dirigidos frente y/o inhiben la acción de proteínas u otras moléculas que tienen un papel regulador negativo en la división celular o desarrollo embrionario. el reactivo puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos, tal como un plásmido recombinante o una construcción de vector transformante, que puede ser expresado durante el desarrollo del embrión para codificar proteínas que tiene un potencial efecto positivo en el desarrollo y/o una secuencia de ácidos nucleico que se integra en el genoma de la célula para formar una célula transformada y un animal alterado genéticamente. La introducción de un reactivo en una célula puede tomar parte previamente a, durante, o tras la combinación de un núcleo con un oocito enucleado.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A es una fotomicrografía de un oocito ovulado vivo rodeado por células de cúmulos. la recubierta del óvulo, la zona pelúcida, aparece como una zona relativamente clara alrededor del oocito.

Figura 1B es una fotomicrografía tomada 10 minutos después de la inyección de un núcleo de células de cúmulos en el citoplasma de un oocito enucleado, mostrando el núcleo de la célula de cúmulo intacto dentro del citoplasma del oocito. Los oocitos inyectados con núcleos de células de cúmulos fueron fijadas, teñidas y fotografiadas con un microscopio de contraste de fase.

Figura 1C es una fotomicrografía que muestra la transformación del núcleo en cromosomas aparentemente desorganizado 3 horas tras la inyección del núcleo. La desorganización refleja una situación inusual en el cual crómatidas únicas, condensadas están cada una unidas a un único polo del huso, y no están por tanto alineadas en una placa de metafase.

Figura 1D es una fotomicrografía tomada 1 hora tras la activación del oocito con Sr^{2-} mostrando cromosomas segregados en dos grupos (mb= cuerpo medio).

Figuras 1E y 1E' son fotomicrografías tomadas 5 horas tras la activación del oocito con Sr^{2-} que muestra dos pseudopronúcleos con un número variable de estructuras discernibles de tipo nucleolo distintas por óvulo. El tamaño y número de pseudopronúcleos variados, sugieren una segregación "al azar" de cromosomas tras la activación del oocito.

Figura 1F es una fotomicrografía de blastocistos vivos producidos tras la inyección de oocitos enucleados con núcleos de células de cúmulos.

Figura 2A es una fotografía (en primer plano) de una Cumulina (ratón clonado) de cuatro semanas de edad con su madre adoptiva.

Figura 2B es una fotografía de Cumulina a los 2,5 meses con las crías que produjo tras aparearse con un macho CD-1 (albino).

Figura 2C es una fotografía de dos ratones derivados de B6C3F1, clonados, agutí jóvenes (centro) en frente de su madres albina de adopción (CD-1), un oocito donante B6D2F1 (negro, derecha), y el donante de células de cúmulos B6C3F1 (agutí, izquierda). Las dos crías agutí en el centro son clones (hermanas "gemelas" idénticas) del donante de células de cúmulos agutí y son dos de las crías descritas en las Series C (véase el texto) y la Tabla 2.

Figura 3 representa el genotipado de ADN de los donantes y las crías en la Serie C (véase texto y tabla 2) que corrobora la identidad genética entre las crías clonadas y los donantes de células de cúmulos, y entre oocitos donantes no idénticos y hembras hospedantes adoptantes. El ADN de placenta de las seis crías de la serie C clonadas (carriles 10-15) fue comparada con ADN a partir de las tres hembras donantes de células de cúmulos (carriles 1-3), las tres hembras recipientes de oocitos (carriles 4-6), y las tres hembras hospedantes (carriles 7-9). El ADN testigo fue de ratones C57BL/6 (carril 16), C3H (carril 17), DBA/2 (carril 18), B6C3F1 (carril 19) y B6D2F1 (carril 20). Escalera de patrones de bandas de ADN de 100 pares de bases (pb) son mostrados a la izquierda de las Figs. 4A y 4B. La figura 3A ilustra el genotipado por PCR usando el marcador específico de cepa D1Mit46. La Figura 3B ilustra el genotipado por PCR usando el marcador específico de cepa D2Mit102. El ADN amplificado por PCR (fig 3A y fig 3B) del ratón F1 hibrido exhibe una banda en gel adicional no observada en el ADN de las cepas parentales consanguíneas (carriles 16-20). Esta banda extra corresponde a un heteroduplex derivado de los dos productos parentales cuya conformación resulta en la migración del gen anómalo. La Figura 3 C ilustra el genotipado por transferencia Southern de los loci Emv específicos de cepa (Emv1, Emv2 e Emv3).

La Figura 4 es una representación esquemática del procedimiento de clonaje del presente invento.

Descripción detallada del invento

El ciclo mitótico asegura que cada célula que se divide done igual material genético a las dos células hijas. La síntesis del ADN no tiene lugar a través de la división del ciclo celular pero está restringida a una parte de ella, a saber, la fase sintética (o fase "S") antes de mitosis. Un intervalo de tiempo (G2) tiene lugar tras la síntesis del ADN y antes de la división celular; otro intervalo (G1) tiene lugar tras la división y antes de la siguiente fase S. El ciclo celular consiste así en la fase M (mitótica), una fase G1 (el primer intervalo), la fase S, una fase G2 (el segundo intervalo), y de vuelta a M. Muchas células que no están en división en los tejidos (por ejemplo, todos los fibroblastos restantes) suspenden el ciclo tras la mitosis previamente a la fase S. tales células "quiescentes" que han salido del ciclo celular antes de la fase S, se dice que están en el estadío G0. las células que entran en G0 pueden permanecer en este estadío de modo temporal o durante períodos muy largos. Las células de Sertoli y las neuronas, por ejemplo, característicamente no se dividen en animales adultos pero permanecen en G0. Más del 90% de células de cúmulos que rodean a los oocitos recientemente ovulados (de ratón) están en G0 o G1. Los núcleos de las células en G0 o G1 tienen un contenido en ADN diploide (2n), es decir, tienen dos copias de cada cromosoma morfológicamente distintas (de tipos de cromosomas autonómicos n-1) los núcleos de las células en G2 tiene un contenido en ADN 4C, es decir, durante la fase S, el ADN en cada una de las dos copias de cada uno de los distintos cromosomas ha sido replicado.

El presente invento describe un método para generar clones de mamíferos no humanos. En el método, cada clon se desarrolla a partir de un oocito enucleado que ha recibido el núcleo (o una porción de la misma incluyendo, al menos, los cromosomas) de una célula somática adulta. Según el invento, los ratones clonados nacieron siguiendo la microinyección de los núcleos de las células de cúmulos (es decir, células de folículos ováricos ovulados) en oocitos enucleados mediante el método del invento.

Animales no humanos adicionales tales como, pero sin limitarse a, primates, ganado vacuno, cerdos, gatos, perros, caballos, y similares pueden también ser clonados mediante el método del invento. El método del invento es mostrado aquí para proporcionar una tasa elevada de desarrollo con éxito de embriones en el estadio de mórula/blastocisto, una tasa elevada de implantación de embriones transferidos en animales adoptantes recipientes, y una tasa de éxito mayor del 2% de mamíferos recién nacidos resultantes. La magnitud de estas eficiencias significa que el método del invento es fácilmente reproducible.

Las etapas y subetapas de una realización del método del invento para clonar como animales no humanos son ilustradas en el ejemplo de la Figura 4. Brevemente, los oocitos son recogidos (1) a partir de un animal donante de oocitos y la placa Met II es retirada (2) para formar un oocito enucleado (óvulo cromosómicamente "vacío"). Las células somáticas son recogidas (3) a partir de un donante adulto, las células que se ven sanas son seleccionadas (4), y su núcleo (o los constituyentes nucleares incluyendo los cromosomas) son obtenidos (5). Un núcleo único es inyectado (6) en el citoplasma de una oocito enucleado. Se permite que el núcleo resida dentro del citoplasma del oocito enucleado (7) durante hasta 6 horas, tiempo durante el cual la condensación del cromosoma puede ser observada. El oocito es entonces activado (8) en presencia de un inhibidor del ensamblaje de microtúbulos y/o microfilamentos (9) para suprimir la formación de un cuerpo polar. Durante este período de tiempo de activación, la formación de los pseudo-pronúcleos puede ser observada. Los óvulos que forman pseudo-pronúcleos son seleccionados y colocados en cultivos embrionarios (10). Los embriones son entonces transferidos (11) a madres sustitutas de adopción, para permitir el nacimiento (12) de las crías vivas.

Así, una realización del método del invento para clonar un mamífero no humano comprende las siguientes etapas: (a) recoger un núcleo de célula somática, o una porción del mismo que contenga al menos los cromosomas, de una célula somática de un mamífero adulto; (b) insertar al menos la porción del núcleo de célula somática en un oocito enucleado para formar un oocito renucleado; (c) permitir al oocito renucleado desarrollarse en un embrión; y (d) permitir al embrión desarrollarse para desarrollarse en una cría viva. Cada una de estas etapas está descrita a continuación en detalle. El núcleo de células somáticas (o constituyentes nucleares que contiene los cromosomas) pueden ser recogidos a partir de una célula somática que tiene más de cromosomas 2n (por ejemplo, uno que tiene una o dos veces el contenido genómico diploide normal). Preferiblemente, el núcleo de célula somática es recogido a partir de una célula somática que tiene cromosomas 2n. Preferiblemente, el núcleo de células somáticas es insertado en el citoplasma del oocito enucleado. La inserción del núcleo es lograda preferiblemente mediante microinyección y, más preferiblemente, mediante microinyección accionada por dispositivo piezoeléctrico.

La activación del oocito puede tomar lugar previamente a, durante, o tras la inserción del núcleo de células somáticas. En una realización, la etapa de activación tiene lugar desde cero hasta alrededor de seis horas tras la inserción del núcleo de células somáticas para permitir que el núcleo esté en contacto con el citoplasma del oocito durante un período de tiempo previo a la activación del oocito. La activación puede ser logada mediante diversos medios incluyendo, pero no se limita a, electroactivación, o exposición a alcohol etílico, factores citoplasmáticas de esperma, péptidos miméticos del ligando del receptor en oocitos, estimuladores de liberación de Ca^{2+} farmacológicos (por ejemplo cafeina), ionóforos de Ca^{2+} (por ejemplo, A2318, ionomicina) moduladores de señalización de fosfoproteínas, inhibidores de la síntesis de proteínas, y similares, o combinaciones de los mismos. En una realización del invento, la activación se logra exponiendo la célula a iones de estroncio (Sr^{2+}).

Los oocitos activados, renucleados inyectados con cromosomas 2n son expuestos preferiblemente a un agente de interrupción de la formación de microtúbulos y/o microfilamentos, (descritos a continuación) para impedir la formación de un cuerpo polar, conservando así todos los cromosomas del núcleo donante dentro del oocito hospedante renucleado. Los oocitos activados, renucleados inyectados con núcleos 2C a 4C preferiblemente no están expuestos a tal agente, para permitir la formación de un cuerpo polar para reducir el número de cromosomas a 2n.

La etapa de permitir que el embrión se desarrolle puede incluir la subetapa de transferir el embrión a una hembra madre adoptiva sustituta, en el que el embrión se desarrolla en un feto viable. El embrión puede ser transferido en cualquier estadío, desde el estadío de dos células hasta mórula/blastocisto, como es sabido por aquellos con experiencia en la técnica.

Las realizaciones del presente invento pueden tener una o más de las siguientes ventajas, así como otras ventajas no citadas. Primero, la transferencia del núcleo (o transferencia de constituyentes nucleares incluyendo los cromosomas mediante microinyección es aplicable a una amplia variedad de tipos celulares- bien hechas crecer in vitro o in vivo, independiente de su tamaño, morfología, estadío del desarrollo del donante, y similares. Segundo, la transferencia del núcleo mediante microinyección permite el control cuidadoso (por ejemplo minimización) del volumen del citoplasma celular y núcleoplasma del donante del núcleo introducido en el oocito enucleado en el momento de la inyección nuclear, ya que el material extraño puede "envenenar" el potencial desarrollo. Tercero, la transferencia del núcleo mediante microinyección permite la coinfección controlada cuidadosamente (con el núcleo donante) de agentes adicionales en el oocito al tiempo de la inyección nuclear. Estas están ejemplificadas a continuación. Cuatro, la transferencia del núcleo mediante la microinyección permite un período de exposición del núcleo donante al citoplasma del oocito enucleado previamente a la activación. Esta exposición puede permitir el remodelado/reprogramación de la cromatina que favorece el desarrollo embrionario subsiguiente. Quinto, la transferencia del núcleo mediante microinyección permite un amplio rango de opciones para el protocolo de activación subsiguiente (en una realización, el uso de Sr^{2+}). Diferentes protocolos de activación pueden ejercer diferentes efecto en el potencial de desarrollo. Sexto, la activación puede estar en presencia de agentes de interrupción de la formación de microtúbulos y/o microfilamentos (en una realización, citocalasina b) para impedir la extrusión del cromosoma, y modificadores de la diferenciación celular (en una realización, dimetilsulfóxido) para favorecer un resultado del desarrollo favorable. Séptimo, en una realización, la transferencia del núcleo es mediante microinyección accionado mediante un dispositivo piezoeléctrico, permitiendo el procesado rápido y eficaz de muestras y por lo tanto reduciendo el trauma a las células que son sometidas a manipulación. Esto es, en parte, debido a que la preparación del núcleo somático y la introducción en el oocito enucleado puede ser realizado con la misma aguja de inyección (en contraste con protocolos de microinyección convencional que requieren al menos un cambio de aguja de inyección entre la ruptura de la zona pelúcida y la función de la membrana plasmática del oocito). Por otro lado, el oocito de algunas especies (por ejemplo, ratón) no son susceptibles de microinyección usando agujas convencionales, mientras que microinyección accionado mediante dispositivo piezoeléctrico permite una tasa de éxito elevada. Finalmente, no sólo etapas individuales en el presente invento, sino la relación entre ellas en conjunto, da como resultado una eficacia de clonaje elevada. Las etapas individuales están ahora presentes en mayor detalle para mostrar como se ordenan con respecto la una a la otra en el presente invento.

Los oocitos recipientes

El estadío de maduración in vivo del oocito en enucleación y transferencia nuclear ha sido documentada que es significativa con respecto al éxito de métodos de transferencia nuclear. En general, los informes de transferencia nuclear de mamíferos describen el uso de oocitos Met II como recipientes. Los oocitos Met II son del tipo activados normalmente mediante espermatozoides fertilizantes. Se conoce que la composición química del citoplasma del oocito cambia a lo largo del proceso de maduración. Por ejemplo, un actividad citoplasmática asociada con la maduración, factor promotor de metafase ("MPF"), es máxima en oocitos inmaduros en metafase de la primera divisón meiótica ("Met I"), disminuyendo con la formación y expulsión del primer cuerpo polar ("Pbl"), y alcanzando de nuevo niveles elevados de Met II. La actividad MPF permanece elevada en oocitos detenido en Met II, disminuyendo rápidamente tras la activación del oocito. Cuando un núcleo de células somáticas es inyectado en el citoplasma de un oocito Met II (es decir, uno con elevada actividad MPF), su envuelta nuclear se rompe y la cromatina se condensa, dando como resultado la formación de cromosomas en metafase.

Los oocitos pueden ser usados en el método del invento incluyendo oocitos tanto inmaduros (por ejemplo estadío GV) y maduros (es decir estadío Met II). Los oocitos maduros pueden ser obtenidos, por ejemplo, introduciendo un animal no humano para superovular mediante inyecciones de hormonas gonadotrópicas y otras (por ejemplo, administración de secuencia de gonadotropinas coriónicas equinas y humanas) y recogida quirúrgica de óvulos poco después de la ovulación (por ejemplo 80-84 horas tras el comienzo del ciclo estrogénico en el gato doméstico, 72-96 horas tras el comienzo de el ciclo estrogénico en la vaca y 13-15 horas tras el comienzo del ciclo estrogénico en el ratón). Cuando sólo es posible obtener oocitos inmaduros, estos son cultivados en un medio promotor de la maduración hasta que han progresado a Met II; esto es conocido como maduración in vitro ("IVM"). Los métodos para IVM de oocitos bovinos inmaduros son descritos en el documento de patente WO 98/07841, y para los oocitos de ratón inmaduros en Eppig y Telfer (Methods in Enzymology 225, 77-84, Academia Press, 1993).

Enucleación de oocitos

Preferiblemente, el oocito es expuesto a un medio que contiene un agente de interrupción de la formación de microtúbulos y/o microfilamentos previamente a y durante la enucleación. La interrupción de la formación de microfilamentos y/o microtúbulos confiere fluidez a la membrana celular y el citoplasma cortical subyacentes, tal que una porción del oocito envuelto dentro de una membrana puede ser fácilmente aspirada en una pipeta con daño mínimo a las estructuras celulares. Un agente de alteración de microtúbulos de elección es la citocalasina B (5 ug/ml). otros agentes interruptores de microtúbulos, tales como nocodazol, 6-dimetilaminopurina y colchicina, son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Los agentes de interrupción de microfilamentos son también conocidos e incluyen, pero no se limitan a, citocalasina D, jasplaquinolida, latrunculina A, y similares.

En una realización preferida del invento, la enucleación del oocito Met II se logra mediante la aspiración usando una micropipeta accionada mediante dispositivo piezoeléctrico. A lo largo de la microcirugía de enucleación, el oocito Met II es anclado mediante una pipeta de sujeción convencional y la punta plana de una pipeta de enucleación manejada pro un dispositivo piezoeléctrico (diámetro interno \approx7 um) es puesta en contacto con la zona pelúcida. Una unidad manejada por un dispositivo piezoeléctrico adecuado es vendida bajo el nombre de Piezo Micromanipulador/Piezo Impar Drive Unit por Prime Tech Ltd. (Tsukuba, Ibaraki-ken, Japon) la unida utiliza el efecto piezoeléctrico para avanzar, de una manera altamente controlada, y una manera rápida, el soporte de la pipeta (de inyección) un distancia muy corta (aproximadamente 0,5 um). La intensidad e intervalo entre cada pulso puede variar y están reguladas mediante una unidad de control. El pulso piezoeléctrico (por ejemplo, intensidad = 1-5, velocidad = 4-16) son aplicadas para avanzar (o perforar) la pipeta a través de la zona pelúcida mientras que mantienen una presión negativa pequeña dentro de la pipeta. De esta manera, la punta de la pipeta pasa rápidamente a través de la zona pelúcida y es así avanzada hasta una posición adyacente a la placa Met II (discernible como una región translúcida en el citoplasma de los oocitos Met II de varias especies, que yacen con frecuencia próximos al primer cuerpo polar). El citoplasma del oocito que contiene la placa de metafase (que contiene el complejo cromosoma-huso) es entonces succionado suave y dinámica-mente en la pipeta de inyección en un volumen mínimo y la pipeta de inyección (que ahora contiene los cromosomas Met II) es retirada suavemente. El efecto de este procedimiento es causar un pellizco de esa parte del citoplasma del oocito que contiene los cromosomas Met II. La pipeta de inyección es entonces retirada limpiamente de la zona pelúcida, y los cromosomas son descargados en medio adyacente en preparación para retirada microquirúrgica de los cromosomas del siguiente oocito. Cuando es apropiado, los lotes de oocitos pueden ser cribados para confirmar la enucleación completa. Para los oocitos con citoplasma granular (tal como oocitos porcinos, ovinos y felinos), la tinción con fluorocromos específicos de ADN (por ejemplo Hoeschst 33342) y un examen breve con iluminación de UV baja (potenciada por una monitor de vídeo de intensificación de imagen) son ventajosos para determinar la eficiencia de enucleación.

La enucleación del oocito Met II puede ser lograda mediante otros métodos, tales como el descrito en la patente norteamericana Nº 4,994.384. Por ejemplo, la enucleación puede ser lograda microquirúrgicamente usando una micropipeta convencional, a diferencia de una micropipeta manejada por un dispositivo piezoeléctrico. Esto puede ser logrado haciendo un corte en la zona pelúcida del oocito con una aguja de cristal a lo largo del 10-20% de su circunferencia próxima a la posición de los cromosomas Met II (el huso está situado en el córtex del oocito mediante microscopía de interferencia diferencial). El oocito es colocado en una pequeña gota de medio que contiene citocalasina B en una cámara de micromanipulación. Los cromosomas son eliminados con una pipeta de enucleación que tiene una punta sin afilar, biselada.

Tras la enucleación, los oocitos están listos para ser reconstituidos con núcleos de células somáticas adultas. Se prefiere preparar oocitos enucleados durante las dos horas después de la inserción del núcleo donador.

Preparación de núcleos de células somáticas adultas

Las células derivadas de poblaciones crecidas in vivo o in vitro y que contienen células con cromosomas 2n (por ejemplo, las que están en G0 o G1) o mayores de cromosomas 2C (por ejemplo, las que están en G2, que son normalmente 4C) pueden ser donantes nucleares adecuados. Según el invento, las células son células foliculares (cúmulos) obtenidas de un mamífero adulto y dispersadas mecánicamente y/o enzimáticamente (por ejemplo, mediante hialuronidasa). La suspensión celular dispersada resultante puede ser colocada en una cámara de micromanipulación que facilita el examen detallado, selección y manipulación de células individuales para evitar las que tiene ciertas características (por ejemplo, que exhiben estadíos avanzados de apoptosis, necrosis o división). Aspiración suave y repetida y de células seleccionadas de esta manera causan la ruptura de las membranas plasmáticas y permiten que el núcleo correspondiente sea recogido. Los núcleos seleccionados individualmente son entonces aspirados en una pipeta de inyección, descrita a continuación, para inserción en oocitos enucleados.

Inserción de núcleos donantes en oocitos enucleados

Los núcleos (o constituyentes nucleares incluyendo los cromosomas) pueden ser inyectados directamente en el citoplasma del oocito enucleado mediante una técnica de microinyección. En un método preferido de inyección de núcleos a partir de células somáticas en oocitos enucleados, se usa una micropipeta manejada por un dispositivo piezoeléctrico, en el cual se puede usar esencialmente el equipamiento y técnicas descritas anteriormente (con respecto a la enucleación de oocitos), con modificaciones detalladas aquí.

Por ejemplo, una pipeta de inyección es preparada, como se ha descrito previamente, de tal modo que tenga una punta plana con un diámetro interior de alrededor de 5 \mum. La aguja de inyección contiene mercurio cerca de la punta y está resguardada en la unidad accionada por un dispositivo piezoeléctrico según las instrucciones del vendedor. La presencia de una gota de mercurio cerca de la punta de la pipeta de inyección aumenta la velocidad y, por tanto, la capacidad de penetración. La punta de una pipeta de inyección que contiene núcleos seleccionados individual-mente es puesta en contacto próximo con la zona pelúcida de un oocito enucleado y varios pulsos piezoeléctricos (usando controladores de establecimiento de escalas de intensidad 1-5, velocidad 4-6) son aplicados para avanzar la pipeta mientras que se mantiene una ligera presión negativa dentro de ellos. Cuando la punta de la pipeta ha pasado a través de la zona pelúcida, el tapón de la zona resultante es expulsado al espacio perivitelino y el núcleo es empujado hacia delante hasta que está cerca de la punta de la pipeta. La punta de la pipeta es entonces adherida a la membrana plasmática y hecha avanzar (hacia la cara opuesta del oocito) hasta que la pipeta sujeta casi alcance el lado opuesto del córtex del oocito. La membrana plasmática del oocito es ahora invaginada en profundidad alrededor de la punta de la aguja de inyección. Tras la aplicación de uno a dos pulso piezoeléctricos (típicamente, intensidad 1-2, velocidad 1), el oolema se perfora en la punta de la pipeta, como se indica mediante una rápida relajación del oolema, que puede ser claramente visible. El núcleo es entonces expulsado en el ooplasma con una cantidad mínima (alrededor de 6 pL) de medio acompañante. La pipeta es entonces retirada suavemente, dejando el núcleo nuevamente introducido dentro del citoplasma del oocito. Este método es realizado dinámicamente, típicamente en lotes de 10-15 oocitos enucleados que el resto del tiempo son mantenidos en condiciones de cultivo.

Las variantes de microinyección alternativas, en el que una pipeta de inyección convencional es empleada, pueden ser usadas para insertar el núcleo donante. Un ejemplo de un método de microinyección adecuado que emplea una pipeta convencional, para insertar núcleos de esperma en oocitos de hámster, es descrito en Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perreault, S. D. y R. G. Kleinfeld, Biology of Reproduction 44, 440-447 (1991), la descripción de la cual que se refiere a tal método es aquí incorporada mediante referencia.

Activación del oocito hospedante

En una realización del invento, los oocitos renucleados son devueltos a condiciones de cultivo durante 0-6 horas previamente a la activación. Así, en una realización del invento, los oocitos pueden ser activados en cualquier momento hasta aproximadamente 6 horas (el período latente) tras la renucleación, bien mediante electroactivación, inyección de una o mas sustancias activadores de oocitos, o transferencia de oocitos en medio que contiene una o más sustancias activadores de oocitos.

Los reactivos capaces de proporcionar un estímulo activador (o combinación de estímulos activadores), incluyen, pero no se limitan a, factor de activación citoplasmático de esperma, y ciertos compuesto farmacológicos (por ejemplo Ca^{2+} y otros moduladores de transducción de señales), que pueden ser introducidos mediante microinyección tras, o concomitantemente con, la renucleación. Algunos estímulos activadores son proporcionados tras la transferencia de oocitos renucleados (bien inmediatamente o tras un período latente) a un medio que contiene uno o más miembros de un de un subgrupo de compuesto activadores, incluyendo estimuladores de liberación de Ca^{2+} (por ejemplo, cafeína, ionóforos de Ca^{2+} tales como A 23187 e ionomicina, y etanol), moduladores de señalización de fosfoproteínas (por ejemplo, 2-aminopurina, estaurosporina, y esfingosina), inhibidores de la síntesis de proteínas (por ejemplo, A 23187, ciclohexamida), 6-dimetilaminopurina, o combinaciones de las precedentes (por ejemplo 6-dimetilaminopurina e ionomicina). En una realización del invento, la activación de oocitos de ratón es lograda cultivando durante 1-6 horas en medio CZB libre de Ca^{2+} que contiene de 2 a 10 mM Sr^{2+}.

En realizaciones del invento en las que el estímulo de activación es aplicada al mismo tiempo con o tras la enucleación, los oocitos renucleados son transferidos a un medio que contiene uno o más inhibidores del ensamblaje de microtúbulos y/o microfilamentos (por ejemplo, 5 \mum/ml de citocalasina B) o agentes, tales como los descritos anteriormente, para inhibir la extrusión de cromosomas (vía un "cuerpo polar") durante o justo tras la aplicación del estímulo activador.

En una realización del invento los oocitos enucleados pueden ser activados previamente a la renucleación. Los métodos de activación pueden ser como se describen anteriormente. Tras la exposición a un estímulo activador, los oocitos pueden ser cultivados durante hasta aproximadamente 6 horas previamente a la inyección de un núcleo celular somático 2n como se describe anteriormente. en esta realización, cromosomas derivados somáticamente transforman directamente en estructuras de tipo pronúcleo en los oocitos renucleados, y no hay necesidad de suprimir la extrusión de "cuerpos polares" mediante el cultivo con un agente que impide la citoquinesis, tal como la citocalasina B.

Desarrollo de embriones para producir fetos y crías viables

Tras la formación del pronúcleo, los embriones pueden ser dejados desarrollar mediante el cultivo en un medio que no contiene un agente de interrupción de microtúbulos. El cultivo puede continuar hasta el estadío de 2-8 células o estadío de mórula/blastocisto, tiempo al cual el embrión puede ser transferido en el oviducto o útero de una madre de adopción.

Alternativamente, el embrión puede ser dividido y las células expandidas clonalmente, para el propósito de mejorar el rendimiento. Alternativamente o adicionalmente, puede ser posible aumentar el rendimiento de embriones viables logrado por medio del presente invento mediante la expansión clonal de donantes y/o si se hace uso de el proceso de transferencia (nuclear) en serie, mediante el cual los constituyentes de los embriones resultantes pueden ser transferidos de nuevo al oocito enucleado, según el método del invento descritos anteriormente, para generar un nuevo embrión. En una realización adicional del invento, el embrión pronuclear es cultivado in vivo tras la transferencia directa en un recipiente adecuado.

Modulación de división celular o desarrollo embrionario

En una realización del invento, la renucleación de un oocito permite la introducción, antes de, durante o después de la combinación de un núcleo con el oocito enucleado, de uno o más agentes con el potencial de alterar el desarrollo saliente del embrión. Alternativamente o adicionalmente, los agentes pueden ser introducidos antes de o a continuación de la renucleación. Por ejemplo, el núcleo puede ser coinyectado con anticuerpos dirigidos contra las proteínas con funciones reguladoras hipotéticas con el potencial de influir en el resultado del método del invento. Dichas moléculas pueden incluir, pero no están limitadas a, proteínas implicadas en el transporte de vesículas (por ejemplo, sinaptotagminas), las cuales pueden mediar la comunicación cromatina-ooplasma (por ejemplo, moléculas de puntos de control del ciclo celular dañadas de ADN tales como chkl), algunas con un papel putativo en la señalización de oocitos (por ejemplo, STAT3) o algunas que modifican el ADN (por ejemplo, metiltransferasa de ADN). Miembros de estas clases de moléculas pueden ser también dianas (indirectas) de los agentes farmacológicos moduladores introducidos por microinyección y que tienen funciones análogas a las de los anticuerpos. Ambos anticuerpos y agentes farmacológicos trabajan mediante la unión a sus moléculas diana respectivas. En el caso en que la diana tiene un efecto inhibidor en el resultado del desarrollo, esta unión reduce la función diana, y en el caso en que la diana tiene un efecto positivo en el resultado del desarrollo, la unión favorece esta función. Alternativamente, la modulación de funciones importantes en el proceso de clonación puede ser lograda directamente mediante la inyección de proteínas (por ejemplo, las de las clases anteriores) mejor que con los agentes que se unen a éstas.

En una realización adicional del invento, el ácido ribonucleico (RNA) o ácido desoxirribonucleico (ADN) puede ser introducido en el oocito por microinyección antes de o a continuación de la renucleación. Por ejemplo, la inyección de ADN recombinante que alberga las señales activas en cis necesarias puede resultar en la transcripción de secuencias presentes en el ADN recombinante por factores de transcripción coinyectados o residentes, y las expresiones subsiguientes de proteínas codificadas con un efecto antagónico a los factores inhibidores del desarrollo, o con un efecto positivo en el desarrollo embrionario. Así mismo, la transcripción puede poseer actividad antisentido contra los mRNAs que codifican las proteínas inhibidoras del desarrollo. Alternativamente, la regulación antisentido puede ser lograda por inyección de ácidos nucleicos (o sus derivados) que son capaces de ejercer un efecto inhibidor por interacción directa con sus dianas de ácidos nucleicos sin la transcripción previa dentro el oocito.

El ADN recombinante (linear o de otra forma) introducido por el método del invento puede comprender una réplica funcional que contiene uno o más genes funcionales, expresados bajo el control de un promotor que exhibe desde un perfil de expresión del desarrollo estrecho hasta uno amplio. Por ejemplo, el promotor puede dirigir la expresión inmediata, pero breve en la que el promotor es activo sólo en el zigoto temprano. El ADN introducido puede ser o bien, perdido en algún punto durante el desarrollo embrionario, o integrar a uno o más loci genómicos, para ser replicado de forma estable a través de la vida del individuo transgénico resultante. En una realización, las construcciones de ADN que codifican las proteínas "antienvejecimiento" putativas, tales como telomerasa o superóxido dismutasa, pueden ser introducidas en el oocito mediante micro-inyección. Alternativamente, tales proteínas pueden ser inyectadas directamente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran el método del invento y el desarrollo de las crías vivas de los oocitos inyectados con núcleos de célula somática adultas. En particular, los ejemplos ilustran la clonación de los ratones a partir de los oocitos enucleados inyectados con núcleos aislados de las células de cúmulos de ratón adulto. Los ejemplos descritos aquí se pretende que sean solo ejemplos de oocitos animales no humanos, células cúmulos de adultos no humanos, y medios que pueden ser usados en el proceso del invento, y no se pretende que sean limitantes, como otros ejemplos de realizaciones del invento que podrían ser reconocidos fácilmente por los expertos en la técnica.

Reactivos

Todos los compuestos inorgánicos y orgánicos fueron adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario.

El medio usado para el cultivo de oocitos después de la microcirugía fue el medio CZB (Chatot, y otros, 1989. J. Reprod. Fert. 86, 679-688), complementado con D-glucosa 5,56 mM. El medio CZB comprende NaCl 81,6 mM, KCl 4,8 mM, CaCl_{2} 1,7 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, KH_{2}PO_{4} 1,8 mM, NaHCO_{3} 25,1 mM, Na_{2}EDTA 0,1 mM, Na. lactato 31 mM, Na. piruvato 0,3 mM, penicilina G 7 U/mL, sulfato de estreptomicina 5 U/mL, y albúmina de suero bovina
4 mg/mL.

El medio para la colección de oocito a partir de los oviductos, tratamientos subsiguientes y la micro manipulación fue un CZB modificado que contenía Hepes 20 mM, una cantidad reducida de NaHCO_{3} (5 mM) y albúmina de suero bovina a 3 mg/mL. Este medio es aquí llamado Hepes-CZB. El pH del CZB y de los medios Hepes-CZB fue de aproximadamente 7,5. Para los propósitos de micro inyección, se prefirió reemplazar la BSA en el Hepes-CZB con polivinil alcohol 0,1 mg/mL (PVA, soluble en agua fría, masa molecular promedio 10 X 10^{3}) porque el PVA mantiene la pared de la pipeta de inyección menos pegajosa después de un periodo de tiempo más largo que el BSA y fue beneficioso durante el uso repetido de una única pipeta para transferencias de núcleo/oocito múltiple.

El medio usado para la activación de los oocitos reconstituidos fue CZB libre de Ca^{2+} que contenía ambos SrCl_{2} 10 mM y citocalasina B 5 \mug/ml. Una disolución patrón de Sr^{2-} (100 mM en agua destilada) fue almacenada a temperatura ambiente. Una disolución patrón de citocalasina B (500 \mug/ml en dimetilsulfóxido DMSO) fue almacenada a -20ºC. Inmediatamente antes del uso, la disolución patrón Sr^{2-} fue diluida 1:10 con CZB libre de Ca^{2+} tal que la concentración final de Sr^{2+} fue de 10 mM. La disolución patrón de citocalasina B fue diluida con CZB libre de Ca^{2+} tal que la concentración de citocalasina final fue de 5 \mug/ml en una concentración final de DMSO del 1%.

El medio usado para el aislamiento de las células del cerebro fue un medio de aislamiento de núcleos (NIM), que consiste en KCl 123,0 mM, NaCl 2,6 mM, NaH_{2}PO_{4} 7,8 mM, KH_{2}PO_{4} 1,4 mM, Na_{2}EDTA 3 mM. Su valor de pH fue ajustado a 7,2 por adición de una cantidad pequeña de HCl 1 M. El NIM complementado con PVP (masa molecular promedio 3 X 10^{3}, ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA) fue usado para resuspender las células del cerebro antes de la inyección.

Otros medios usados en los ejemplos son descritos donde corresponde apropiado.

Animales

Ratones hembra B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2), B6C3F1 (C57BL/6 x C3H/He) y DBA/2, de 5 a 10 semanas de edad, fueron usados como donantes de oocitos. Ratones hembra C57BL/6, C3H/He, DBA/2, B6D2F1 y B6C3F1, de 5 a 10 semanas de edad, fueron usados como los donantes de núcleos de células de cúmulos. Las madres adoptivas fueron hembras CD-1 emparejadas con machos vasectomizados de la misma cepa.

Todos los animales usados en estos ejemplos fueron mantenidos de acuerdo con las pautas del Servicio de Animales de Laboratorio de la Universidad de Hawaii y los preparados por el Comité para el cuidado y el uso de Animales de Laboratorio del Instituto del Consejo de Investigación Nacional de Recursos de Laboratorio (DHEW publicación no. [NIH] 80-23, revisado en 1985). El protocolo de cuidado y tratamiento de animales fue revisado y aprobado por el Comité para el cuidado y el uso de Animales de la Universidad de Hawai.

Ejemplo 1 Preparación de célula somática

Las células cúmulos de los oviductos de ratón fueron aisladas para el uso como fuente de núcleos de células somáticsa adulta para la inyección en los oocitos de ratón enucleados. Las derivaciones de los ratones clonados producidos en las Series A-D de la Tabla 2, y descritas a continuación, son también descritas en Wakayama, y otros, 1998, Nature 394, 369-374.

Las hembras B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2 usadas en las Series A y B), B6C3F1 (C57BL/6 x C3H/He usadas en las Series C) o el ratón clonado B6C3F1 producido en las Series D fueron inducidos a súper ovular por inyecciones intravenosas consecutivas de 5 a 7,5 unidades de gonadotrofina coriónica equina (eCG) y 5 a 7,5 unidades de gonadotrofina coriónica humana (hCG). Trece horas después de la inyección de hCG, los complejos de oocito-cúmulos (véase la Figura 1A) fueron recogidos de los oviductos y tratados en un medio CZB-Hepes complementado con hialuronidasa testicular bovina (0,1% [w/v], 300 U/mg, ICN Biochemicals, Costa Mesa, CA) para dispersar las células de cúmulos. Las células de cúmulos de tamaño medio (de 10-12 \mum de diámetro) fueron las más encontradas comúnmente (>70% y estas fueron seleccionadas para la inyección). Siguiendo la dispersión, las células fueron transferidas al CZB-Hepes que contiene 10% (w/v) de polivinilpirrolidona (peso molecular promedio, 360,000 daltones) y mantenidas a temperatura ambiente por más de 3 horas antes de la inyección.

Ejemplo 2 La enucleación de los oocitos sin fertilizar maduros

En este ejemplo, los oocitos Met II murinos fueron recogidos, enucleados y subsiguientemente micro inyectados con núcleos aislados de las células del Ejemplo 1 usando una pieza de micropipeta accionada eléctricamente. Todas las manipulaciones, cultivos e inserciones de los núcleos celulares fueron realizados bajo una capa de aceite mineral, preferiblemente que contiene Vitamina E como un antioxidante, tal como el disponible a partir de E.R. Squibb and Sons, Princeton, NJ.

La enucleación de los oocitos fue lograda por aspiración con una micropipeta accionada por un dispositivo piezoeléctrico usando el Piezo Micromanipulator Model MB-U de Prime Tech Ltd (Tsukuba, baraki-ken, Japón). Esta unidad usa el efecto piezoeléctrico para avanzar el soporte de la pipeta una distancia muy pequeña (aproximadamente 0,5 \mum) a la vez, a una velocidad muy alta. La intensidad y la velocidad del pulso fueron reguladas por el controlador.

Los oocitos (obtenidos 13 horas después de la inyección hCG de las hembras activadas con eCG) fueron liberados del oóforo del cúmulo y mantenidos en un medio CZB a 37,5ºC en aproximadamente 5% (v/v) de CO_{2} en aire mientras se requirió. Un grupo de oocitos (normalmente 15-20 en número) fue transferido en una gotita (alrededor de 10 \mul) de CZB-Hepes que contiene 5 \mug/ml de citocalasina B, que ha sido colocada previamente en la cámara de operación en la bandeja del microscopio. Después un oocito fue sostenido por una pipeta que sostiene oocitos, su zona pelúcida fue "perforada" por aplicación de varios pulsos piezoeléctricos en la punta de una pipeta de enucleación (alredor de 10 \mum en un diámetro interno). El complejo huso-cromosoma Met II, distinguido como una mancha traslucida en el ooplasma, fue arrastrado en la pipeta con una cantidad pequeña de ooplasma de acompañamiento, después fue retirado con cuidado del oocito hasta que un puente citoplasmático extendido fue retirado mediante un pinchazo. Después, todos los oocitos en un grupo (normalmente 20 oocitos) fueron enucleados (lo que duró 10 minutos), se transfirieron al CZB libre de citocalasina B y mantenidos ahí durante alrededor de 2 horas a 37,5ºC. Según se evaluó mediante fijación y tinción de los oocitos, como se describe anteriormente, la eficacia de la enucleación fue
del 100%.

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Ejemplo 3 Inserción de núcleos de células somáticas adultas en los oocitos enucleados

Para la inyección de los núcleos donantes en los oocitos enucleados preparados como se describe anteriormente, una cámara de micro inyección fue preparada empleando la cubierta (de aproximadamente 5 mm de profundidad) de una placa de plástico (100 mm x 15 mm: Falcon Plastics, Oxnard, CA, catalogue no. 1001). Una fila que consiste en dos gotitas redondas y una gota alargada fue colocada a lo largo de la línea central de la placa. La primera gotita (aproximadamente 2 \muL: 2 mm de diámetro) fue lavada por la pipeta (que contenía CZB-Hepes 12% [p/v] PVP, peso molecular promedio, 360, 000 daltones). La segunda gotita (aproximadamente 2 \muL; 2 mm de diámetro) contenía una suspensión de células donantes en el CZB-Hepes. La tercera gotita alargada (6 \muL; 2 mm de ancho y 6 mm de larga) fue de un medio CZB-Hepes para los oocitos. Cada una de estas gotitas fue cubierta con aceite mineral. La placa fue colocada en la bandeja de un microscopio invertido con lentes ópticas de contraste de Modulación Hoffman.

La micro inyección de núcleos de células donantes en los oocitos fue lograda por el método de microinyección por dispositivo piezoeléctrico descrito previamente. Los núcleos fueron retirados de sus células somáticas respectivas y sujetas a una aspiración suave dentro y fuera de la pipeta de inyección (aproximadamente 7 \mum de diámetro interno) hasta que sus núcleos quedaron "desnudos" o casi desnudos (es decir, desprovistos claramente de material citoplasmático visible). Después que el núcleo "desnudo" fue arrastrado profundamente en la pipeta, la célula siguiente fue arrastrada por la misma pipeta. Estos núcleos fueron inyectados uno por uno en los oocitos enucleados.

Para la inyección del núcleo, un volumen pequeño (alrededor de 0,5 \muL) de mercurio fue colocado cerca del terminal próximo de la pipeta de inyección, que fue después conectada a la unidad de función del dispositivo piezoeléctrico descrito anteriormente. Después de que el mercurio ha sido empujado hacia delante de la punta de la pipeta, un volumen pequeño del medio (aproximadamente 10 pL) fue aspirado en la pipeta.

Un oocito enucleado fue colocado en una bandeja del microscopio en una gota del medio CZB que contenía 5 \mug/mL de citocalasina B. El oocito fue mantenido por una pipeta de sujeción mientras la punta de la pipeta de inyección fue puesta en contacto íntimo con la zona pelúcida. Varios pulsos del dispositivo piezoeléctrico (por ejemplo, de intensidad 1-2, velocidad 1-2) fueron dados para avanzar la pipeta mientras una presión negativa ligera fue aplicada dentro. Cuando la punta de la pipeta hubo pasado a través de la zona pelúcida, la pieza cilíndrica de la zona en la pipeta fue expulsada al espacio perivitelino. Después que el núcleo donante fue empujado hacia delante hasta que estuvo cerca de la punta de la pipeta de inyección, la pipeta fue avanzada mecánicamente hasta que su punta casi alcanzó el lado opuesto del córtex del oocito. El oolema fue pinchado al aplicar 1 ó 2 pulsos piezoeléctricos (típicamente, de intensidad 1-2, velocidad 1) y el núcleo fue expulsado dentro del ooplasma con un volumen mínimo (alrededor de 6 pL) del medio de acompañamiento. A veces, se recuperó tanto medio como fue posible. La pipeta fue después retirada con cuidado, dejando el núcleo del ooplasma. Cada oocito fue inyectado con un núcleo. Aproximadamente 5-20 oocitos fueron micro inyectados por este método en un intervalo entre 10-15 minutos. Todas las inyecciones fueron realizadas a temperatura ambiente, normalmente en el intervalo de 24º-28ºC. Todas las manipulaciones fueron realizadas a temperatura ambiente (24º a 26ºC). Cada núcleo fue inyectado en un oocito enucleado separado en menos de 10 minutos después de la denudación.

La Figura 1B ilustra un núcleo de célula cúmulo en un oocito enucleado a los 10 minutos de la inyección.

Algunos oocitos que contenían un núcleo inyectado fueron después activados inmediatamente como se describe en el Ejemplo 4. Otros oocitos similares fueron incubados por un período de tiempo de alrededor de 6 horas antes de la activación.

Ejemplo 4 Activación del oocito

A continuación de la inyección del núcleo de célula somática, algunos grupos de oocitos fueron colocados inmediatamente en CZB libre de Ca^{2+} que contenía ambos Sr^{2+} 10 mM y citocalasina B 5 \mug/mL durante 6 horas. Grupos adicionales de oocitos enucleados inyectados con núcleos de célula cúmulos fueron dejados en CZB a 37,5ºC bajo 5% (v/v) de CO_{2} en aire durante alrededor de 1 hora hasta 6 horas, preferiblemente alrededor de 1 hasta alrededor de 3 horas, durante cuyo tiempo el núcleo dentro del oocito se descondensó y transformó en cromosomas visibles. Los oocitos fueron después incubados durante alrededor de 6 hasta alrededor de 7 horas en CZB libre de Ca^{2+} que contenía ambos Sr^{2+} 10 mM y citocalasina B 5 \mug/mL durante 6 horas para la activación. El tratamiento con Sr^{2+} activó los oocitos, mientras que la citocalasina B previno subsiguientes formaciones de cuerpo polares y por tanto, la expulsión del cromosoma, asegurando así que todos los cromosomas del núcleo de la célula somática adulta permanecieran en el citoplasma del oocito activado. El examen de los oocitos enucleados inyectados con núcleos de células cúmulos revelaron que la condensación del cromosoma había ocurrido dentro de la hora siguiente a la inyección (véase la Figura 1C). Cuando, subsiguiente a 1 a 6 horas de la incubación en el medio libre de Sr^{2+}, los oocitos fueron activados en un medio de cultivo que contenía Sr^{2+} y citocalasina B, sus cromosomas derivados del cúmulo se segregaron (véase la Figura 1D) para formar estructuras que se parecen al pronúcleo formado después de la fertilización normal (referido aquí como pseudopronúcleos). El examen de 47 de tales oocitos después de la fijación y tinción mostró que el 64% tenía dos pseudopronúcleos (véanse las Figuras 1E y 1E') y que el 36% tenía tres o más. Los oocitos con al menos un pseudopronúcleo distinto fueron considerados normalmente activados. El análisis del cromosoma de 13 de tales oocitos fijados antes del primer corte (datos no mostrados) reveló que el 85% tenía un número de cromosomas diploides normal (2n=40).

Los oocitos activados fueron lavados y cultivados en Sr^{2+} y en el medio CZB libre de citocalasina B hasta que alcanzaron de 2 a 8 células o un estadío mórula/blastocisto a 37,5ºC a 5% (v/v) de CO_{2} en aire.

La Figura 1 ilustra los blastocistos vivos a continuación de la inyección de los oocitos enucleados con núcleos de célula de cúmulos:

Ejemplo 5 Transferencia embrionaria

Embriones de dos a ocho células (24 horas ó 48 horas después del inicio de la activación) fueron transferidos en oviductos o úteros de madres de adopción (CD-1, albino) que habían sido unidos con machos CD-1 vasectomizados 1 día antes. Las mórulas/blastocistos (72 horas después de la activación) fueron transferidas a los úteros de madres de adopción emparejadas con machos vasectomizados 3 días antes. Las hembras receptoras fueron eutanasiadas a 19,5 dpc (días postcoito) y sus úteros fueron examinados en busca de la presencia de fetos y sitios de implantación. Los fetos vivos, si había alguno, fueron criados por otras madres de adopción lactantes (CD-1).

Ejemplo 6 Genotipado del ADN

El ADN de las siguientes cepas testigo e híbridas fue obtenido a partir del tejido del bazo: C57BL/6J(B6), C3H/HeJ(C3), DBA/2j(D2), B6C3F1 y B6D2F1. El ADN de las tres hembras donantes de célula cúmulos (B6C3F1), de las tres hembras receptoras de oocitos (B6D2F1), y las tres hembras de adopción (CD-1) fue preparado a partir de la biopsia de la punta de la cola. El ADN total de seis crías clonadas derivadas de B6C3F1, fue preparado a partir de sus placentas asociadas.

Para los marcadores microsatélites D1Mit46, DS2Mit102 y D3Mit49, los pares cebadores (MapPairs) fueron adquiridos a Research Genetics (Huntsville, AL) y su rendimiento para tipaje como se describe anteriormente en Dietrich, W. y otros, Genetics 131, 423-447 (1992) excepto que las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo durante 30 ciclos y los productos fueron separados por geles de agarosa al 3% (Metaphor) y visualizados por tinción de bromuro de etidio.

La identificación de secuencias de ADN de provirus de leucemia murina ecotropica endógena (loci Emv) fue hecha tras la hibridación del ADN genómico digerido por PvuII con la sonda diagnóstico, pEc-B4, según el método descrito en Taylor, B.A. y L.Rowe, Genomics 5, 221-232 (1989). El marcaje de la sonda, transferencia Southern, y los procedimientos de hibridación fueron como se describen previamente en Johnson, K.R. y otros, Genomics, 12, 503-509 (1992).

Ejemplo 7 Examen de la placenta

Cuando fetos completos (19,5 dpc) fueron encontrados en los úteros, las placentas fuero aisladas, pesadas y fijadas con una solución de Bouin para un examen posterior de los detalles histológicos. En general, sólo una o dos de las crías de ratón clonados implantadas alcanzaron el final en cada una de las madres de adopción hospedantes. Durante el curso del presente estudio, se observó que la placenta de los fetos clonados es significativamente más grande que la de los fetos normales (véase la Tabla 4). Para investigar la posibilidad que la placenta grande pueda ser debida al número pequeño de fetos en cada útero (durante un embarazo normal, cada útero de ratón lleva varios o como mucho diez fetos), el tamaño grande de los embarazos normales fue reducido a propósito, como sigue: ratones hembra C57BL/6 unidas con los machos C3H/He. Al día siguiente, los óvulos que contenían pronúcleos fueron recogidos del oviducto, y 2 ó 3 huevos fueron transferidos a los oviductos de cada madre de adopción pseudo embarazada (CD-1) para permitir la implantación de solamente 1 a 2 embriones. Los embriones y las placentas fueron medidos a 19,5 dpc.

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Resultados Clonación con núcleos de células cúmulos

El desarrollo de preimplantación de los oocitos enucleados hospedantes inyectados con los núcleos de las células cúmulos se ilustra en la Tabla 1. Más de 182 oocitos fueron sujetos a un estímulo de activación inmediatamente después de la inyección. 153 (84,1%) fueron activados con éxito y sobrevivieron. De estos 153 oocitos, 61 se desarrollaron en mórula/blastocistos in vitro. Sin embargo, 474 (93,3%) de los 508 oocitos inyectados activados 1-3 horas después de la inyección, y 151 (83,0%) de los 182 oocitos inyectados activados 3-6 horas después de la inyección, fueron activados con éxito y sobrevivieron. De estos, 277 (58,4%) y 101 (66,9%), respectivamente, se desarrollaron en mórula/blastocistos in vitro. Por tanto, proporciones significativamente mayores de los oocitos se desarrollaron en mórula/blastocistos in vitro cuando fueron activados 1-6 horas después de la inyección del núcleo, comparado con los oocitos activados inmediatamente después de la inyección (p<0,005), y el intervalo de tiempo entre la inyección del núcleo y la activación del oocito en estos experimentos, parece afectar la velocidad del desarrollo del oocito.

El desarrollo de los oocitos enucleados hospedantes inyectados con los núcleos de las células cúmulos está ilustrado en la Tabla 2. En las series primeras de los experimentos (Series A), un total de 142 embriones en desarrollo (en estadío de 2 células con mórula/blastocistos) fueron transferidos a 16 hembras receptoras. Cuando estas hembras fueron examinadas a día 8,5 y 11,5 después del coito (dpc), se observaron 5 fetos vivos y 5 fetos muertos in uteri. En la segunda serie de experimentos (Series B), un total de 800 embriones fueron transferidos en 54 madres de adopción. Cuando se realizaron cortes de cesárea a 18,5-19-5 dpc, se encontraron 17 fetos vivos. De estos, 6 murieron pronto después del parto, 1 murió aproximadamente 7 días después del parto, pero las 10 hembras restantes sobrevivieron y eran aparentemente sanas. Todos estos, incluyendo el primer nacido (llamado "Cumulina", en primer plano de la fotografía, Figura 2A, con su madre de adopción albina) han sido emparejados y parieron y criaron crías normales. La Figura 2b es una fotografía de Cumulina con 2,5 meses con las crías que ella produjo a continuación de la unión con un macho CD-1 (albino). Varias de estas crías, a su vez, se han desarrolladas ahora en adultos fértiles.

En una tercera serie de experimentos (Series C en la Tabla 2), núcleos de célula cúmulos B6C3F1 fueron inyectadas en los oocitos B6D2F1 enucleados. Mientras que los ratones B6D2F1 son negros, los ratones B6C3F1 llevan una copia del gen agutí A, y son consecuentemente agutí. Las crías de este experimento deberían, por tanto, tener un color de piel agutí, más que el negro de los donantes de oocitos B6D2F1. Un total de 298 embriones derivados de los núcleos de célula cúmulos B6C3F1 fueron transferidos a 18 madres de adopción. Los cortes de cesárea realizados 19,5 dpc revelaron 6 fetos vivos cuyas placentas fueron usadas en el análisis de genotipado de ADN (véase el Ejemplo 6 anterior). Aunque 1 murió un día después de nacer, las 5 hembras existentes son sanas y tienen un fenotipo de piel agutí. La Figura 2C muestra 2 tales crías agutí clonadas con sus madres de adopción albina (CD-1) en el centro de la fotografía. A la izquierda de la fotografía está el donante de cúmulos B6C3F1 agutí correspondiente. Los crías clonadas (centro) son como las hermanas "gemelas" idénticas (es decir, son clones) del donante de cúmulos. El donante de oocitos B6D2F1 (negro) se muestra a la derecha de la fotografía. Los experimentos adicionales (Series D en la Tabla 2) fueron realizados para investigar si los clones podían ser clonados con eficacia en rondas subsiguientes de la reclonación. En este experimento, las células de cúmulos fueron recogidas de los clones (agutí) B6C3F1 generados en las Series C, y sus núcleos fueron inyectados en los oocitos B6D2F1 enucleados para generar embriones que fueron transferidos como se describe en las Series A-C. Un total de 287 embriones derivados de los núcleos de célula cúmulos fueron transferidos a 18 madres de adopción. Cuando los cortes de cesárea fueron realizados 19,5 dpc, 8 fetos vivos fueron recuperados. Aunque 1 murió pronto después del nacimiento, las 7 hembras sobrevivientes son sanas y tiene el fenotipo de piel agutí esperado. Estos resultados sugieren que los clones (Series B y C) y los clones clonados (Series D) son producidos con una eficacia similar. Subsiguientemente, ha sido posible repetir el proceso usando animales de la Serie D (datos no mostrados) como donantes de cromosoma de cúmulos, que resultan en el nacimiento de los clones clonados (clones de tercera generación). Por tanto, parece que las generaciones sucesivas de los clones no sufren cambios (ni positivos ni negativos) que influyan en el resultado del proceso de clonación.

Confirmación de la identidad genética de los clones con respecto a los donantes de célula de cúmulos

Como se ilustra en las Figuras 3A, 3B y 3C, el genotipado del ADN de los donantes y las crías en las Series C corrobora la identidad genética de la cría clonada con respecto a los donantes de célula cúmulos y la no identidad con respecto a los donantes de oocito y a las hembras de adopción hospedantes. Se utilizó el genotipado de ADN por PCR, usando diagnostico mediante alelos altamente variables (marcadores específicos de cepa) de las cepas de ratón C57BL/6, C3H, DBA/2 y CD-1. Estas cepas, o sus híbridos F1, fueron usados en este trabajo y representan por tanto, colectivamente todos los genotipo presentes. En todas las Figuras, el ADN de placenta de las seis crías de la Serie C clonadas (carriles 10-15) fue comparada con el ADN de las tres hembras donantes de célula cúmulos (B6C3F1, carriles 1-3), las tres hembras de donante oocito (B6D2F1, carriles 4-6), y las tres hembras hospedantes (CD-1, carriles 7-9). El ADN testigo fue de las C57BL/6 (carril 16), C3H (carril 17), DBA/2 (carril 18), B6C3F1 (carril 19) y B6D2F1 (carril 20). Las Figuras 3A y 3B ilustran los resultados del genotipado de ADN que emplea geles de agarosa y los marcadores específicos de cepa D1Mi146 y D2Mit102, y la Figura 3C ilustra los resultados del genotipado de ADN que emplea el análisis de transferencia Southern y los marcadores de cepa especifica Emv loci (Emv1, Emv2
y Emv3).

Los datos presentados en estas Figuras muestran la sobreposición entre los donantes de núcleo de cúmulos y los clones putativos y la no identidad genética con, o bien, los donantes de oocito o las madres de adopción. Por tanto, el genoma de cada uno de los seis ratones clonados fue derivado del núcleo de una célula cúmulo.

Que todas las crías vivas documentadas aquí en las Series B-D representan clones derivados exclusivamente de los cromosomas de las células cúmulos se confirma de diversas maneras. (1) Los oocitos/óvulos no fueron expuestos a espermatozoides in vitro. (2) Las madres e adopción (CD-1, albino) fueron emparejadas con los machos vasectomizados (CD-1, albino) de infertilidad demostrada. En el caso improbable de fertilización por dicho macho vasectomizado, la cría seria albina. (3) Los embriones de 2-8 células o los blastocistos fueron transferidos al oviducto/útero de las madres de adopción. Está bien establecido que los embriones/blastocistos de ratón de 2-8 células son refractarios totalmente a la fertilización por espermatozoides. (4) Todos los animales llevados a término nacieron con ojos negros. Los 10 sobrevivientes de la Serie B tienen pieles negras y los 5 sobrevivientes de la Serie C tienen pieles agutí. Este patrón de la herencia de color de la piel encaja exactamente con lo predicho por el genotipo del donante del núcleo en cada caso. Puesto que los ratones B6D2F1 carecen de los genes agutí A, los ratones agutí en la Serie C pueden haber heredado su color de piel agutí de un núcleo no B6D2F1. (5) El genotipado de ADN de diagnostico de alelos altamente variables de las cepas B6, C3, D2 y CD-1 usados aquí (Figura 3) muestra dudas mas allá de lo razonable, de que las seis crías clonadas en la Serie C (que incluye una que murió poco después de su nacimiento) son isogénicas con las tres hembras donantes de célula cúmulos usadas (B6C3F1) y que no contienen ADN derivado de, o bien, los oocitos donantes (B6D2F1) o de las madres de adopción hospedante (CD-1). (6) Siguiendo la enucleación, la extrusión de los cromosomas en los cuerpos polares fue suprimida por el uso de citocalasina B. Así pues, si la enucleación de los oocitos hubiera sido totalmente infructuosa o sólo parcialmente fructífera, todos los embriones deberían haber sido hiperploides y no se habrían desarrollado en crías normales. (7) En los experimentos testigo, en los que 204 oocitos fueron enucleados y examinados después de la fijación y la tinción, ningún cromosoma fue aparente, sugiriendo que la eficacia de la eliminación de los cromosomas excede el 99,99%.

En el Ejemplo 1, el tipo de célula usado fue identificado como célula cúmulos, con un alto grado de certidumbre. Las células no fueron cultivadas in vitro. Se dio un tiempo amplio para los núcleos de cúmulos para transformar en cromosomas condensados dentro del citoplasma de los oocitos Met II enucleados. La velocidad del desarrollo del embrión en mórula/blastocistos y la implantación fue muy alta. La prolongación del tiempo entre la inyección nuclear y la activación del oocito fue beneficiosa para tanto el desarrollo preimplantación y postimplantación (véase las Tablas 1 y 2) y puede haber mejorado la oportunidad de los genes de célula cúmulos de ser sometidos a la reprogramación para el desarrollo embrionario.

Se cree que el uso de un micro manipulador piezo eléctrico contribuye también a una velocidad mayor en el desarrollo embrionario. Este aparato permite la manipulación de las células de oocitos y donantes (por ejemplo, perforando la zona pelúcida para enuclear el oocito, y la inyección de los núcleos de células donantes) para ser realizado muy rápido y eficazmente. La introducción de los núcleos donantes en los oocitos usando una pipeta conducida por un dispositivo piezoeléctrico parece ser menos traumática para los oocitos que el uso de un pulso eléctrico, el virus Sendai o polietilénglicol, y permite la introducción del núcleo de células somáticas directamente en el citoplasma del oocito. También, la cantidad de citoplasma de célula somática introducida en los oocitos enucleados fue minimizada mediante micro inyecciones. Esto puede haber contribuido también al elevado desarrollo preimplantación de los embriones en el presente invento.

Clonación con núcleos de células cúmulos de las cepas híbridas y consanguíneas de ratón

Se realizaron experimentos en los que se inyectaron los núcleos de células cúmulos de las tres cepas consanguíneas diferentes y dos cepas híbridas del ratón en los oocitos enucleados. Los resultados están ilustrados en la Tabla 3. Cuando las células cúmulos de los ratones consanguíneos (C57BL/6, C3H/He y DBA/2) fueron inyectados en los oocitos híbridos (B6D2F1), algunos oocitos se desarrollaron en blastocistos de apariencia normal, y uno (DBA/2 x B6D2F1) se desarrolló completamente como una cría viva. En contraste, un total de 41 crías vivas (2%-4% de los embriones transferidos) fueron obtenidos cuando los núcleos de célula cúmulos de los ratones híbridos B6D2F1 y B6C3F1 fueron inyectados en los oocitos enucleados de los mismos ratones híbridos, respectivamente. Estas crías fueron todas hembras. Tenían los ojos negros y el mismo color de piel que los donantes de los núcleos de célula cúmulos.

Diferencias en el peso de la placenta de los embarazos de ratones clonados frente al de los normales

Durante el curso de nuestro estudio, se observó una marcada diferencia entre los embarazos de ratones clonados y el de lo ratones normales, con respecto al peso de la placenta. Como se ilustra en la Tabla 4, el peso promedio de la placenta de los ratones clonados fue de 0,25 a 0,33 gramos, mientras que la placenta testigo (normal) que tenía el mismo número de fetos fue alrededor de 0,12 a 0,15 gramos, que es alrededor de la mitad del peso de la placenta de los ratones clonados.

Los autores creen que todas las crías vivas enunciadas aquí representan clones derivados de núcleos de células somáticas adultas, particularmente células cúmulo y fibroblastos, en ausencia de contaminación genética por las siguientes razones: (1) Los oocitos/óvulos no fueron nunca expuestos a los espermatozoides in vitro durante el curso de los experimentos. En los mamíferos, los oocitos intactos no se pueden desarrollar a término sin espermatozoides. (2) Las madres de adopción (CD-1) fueron emparejadas con los machos vasectomizados (CD-1, albino) de infertilidad demostrada. Incluso si los machos vasectomizados eyacularon espermatozoides y fertilizaron oocitos CD-1, todas sus crías serían albinas. Embriones de 2 a 8 células reconstruidas o los blastocistos fueron transferidos a los oviductos/úteros de las madres de adopción. Dichos embriones desarrollados nunca serán fertilizados por espermatozoides incluso si los machos vasectomizados eyacularan espermatozoides. (3) Todos los animales finales nacieron con ojos negros (no albinos) y el patrón de la herencia del color de la piel encaja exactamente con lo predicho por el genotipo del donante del núcleo en cada caso. Los ratones B6D2F1 carecen de los genes agutí que fue usado por los receptores de oocitos. Por tanto, el único modo de obtener crías agutí es por medio del núcleo de células donante (por ejemplo, los fibroblastos de la cola y algunas células cumulus) de los ratones B6C3F1. (4) El sexo de los ratones clonados fue consecuente con el sexo de los ratones donantes. Los clones derivados de las células cúmulos de hembras fueron todos hembras. Los clones derivados de los fibroblastos de cola de macho fueron todos machos. (5) La extrusión de los cromosomas en los cuerpos polares fue suprimida por el uso del citocalasina B. Así pues, incluso si la enucleación de los oocitos ha sido totalmente infructuosa o sólo parcialmente fructífera, todos los zigotos deberían haber sido hiperploides: dichos embriones no se pueden desarrollar hasta crías normales.

Se ha demostrado aquí que el método del invento puede ser usando para obtener crías de ratón vivas, clonadas de células cúmulos adultas y de núcleos de célula de fibroblasto adulto. La tasa de éxito ha sido de más del 3%. Hasta la fecha, el método ha sido el más exitoso con los núcleos de células cúmulos. Las razones para esto no están claras. Cada oocito de ratón está rodeado por alrededor de cinco mil células cúmulos (datos no mostrados). Es sabido que las células cúmulos se comunican entre sí a través de las uniones "gap junctions" a lo largo del desarrollo folicular. Las que están más cercanas a los oocitos (células radiata corona) están en contacto con el oocitos vía las uniones gap junctions. Sin estar unidos por teoría, se piensa que es concebible, que intercambios significativos de iones y moléculas pequeñas (<2.000 Mr) tiene lugar entre los oocitos y las células cúmulos circundantes. Esto puede afectar los genes de célula cúmulos, de modo que el genoma se hace más fácilmente "reprogramable" dentro del citoplasma de un oocito enucleado.

Se encontró que los mejores resultados de clonación fueron obtenidos por el método del invento cuando los núcleos de célula cúmulos de los ratones híbridos fueron inyectados en los oocitos enucleados de los ratones híbridos correspondientes. La única excepción fue el caso en el que los núcleos de célula cúmulos dBA/2 fueron inyectados en los oocitos híbridos (B6D2F1). El porqué los núcleos de célula cúmulos de los ratones consanguíneos normalmente fallaron a la hora de mantener el desarrollo postimplantación de los embriones no se conoce en este momento. Mann y Stewart (Development 113, 1325-1333 (1991)) informaron que el potencial de desarrollo de las quimeras de agregación androgénetica es en cierta medida dependiente de la cepa del ratón. Asimismo, es bien sabido que los embriones de los ratones híbridos son más fáciles de cultivar in vitro que los de los ratones consanguíneos. (Suzuki, y otros (1996) Reprod. Fertil. Dev 8, 975-980). Parece que la heterosis facilita el desarrollo de los embriones clonados hasta su término.

Tres ratones clonados vivos fueron producidos por el método del presente invento usando fibroblastos de machos adultos. Se ha reivindicado anteriormente que la llave del éxito para clonar ovejas fue el de llevar una célula donante a la fase G0 del ciclo celular. Por ejemplo, Wilmut y otros hicieron esto cultivando células en un medio libre de suero para "privarlas de alimento". En los experimentos presentes, no pareció haber un efecto beneficioso marcado por el cultivo de fibroblastos adultos en un medio libre de suero para aumentar la velocidad de éxito de la clonación. También se ha informado que los becerros clonados fueron obtenidos de las células de los fetos cultivados con suero (Cibelli y otros, Science 280, 1256-1258 (1998). Parece que una población que se divide activamente de células puede soportar el desarrollo hasta término después de la transferencia nuclear y que la privación de suero no es un tratamiento necesario, al menos en el modelo del ratón.

En estos experimentos, se observó que todos los fetos clonados tenían placentas grandes, casi dos veces más grandes que las placentas normales. Ocasionalmente, fue encontrada una placenta grande sin un feto discernible (datos no mostrados). Las placentas grandes fueron también observadas por Kono y otros (Nature Genet. 13, 91-94 (1996)) en embriones partenogenéticos diploides desarrollados de un oocito maduro fusionado con un oocito muy joven, pequeño. A día 13,5 de la gestación, estos embriones partenogenéticos tenían placentas excesivamente grandes. Kono y otros sugirieron que la ausencia de expresión de los genes de los alelos maternos podía explicar el aumento del desarrollo embrionario y de la placenta comparado con los ratones normales. Algunos otros genes podían ser específicamente importantes para el desarrollo de la placenta, tal como el Mash 2 expresado maternalmente (Guillemot y otros, (1995), Nature Genet. 9, 235-242), y los genes expresados paternalmente (reprimidos maternalmente) necesarios para la proliferación de las células del trofectodermo polar (Barton y otros, (1985). J. Embryol. Exp. Morphol. 90, 267-285). Además, algunos ratones clonados que murieron justo después de su nacimiento tenían un peso mayor que los otros. Además, como informa Kato y otros (Science 282, 2095-2098 (1998)), los becerros clonados muertos derivados de las células somáticas tendieron a ser más grandes que los vivos. Esto sugeriría que durante la reprogramación nuclear de las células somáticas después de la transferencia nuclear, algunos genes no fueron completamente terminados o reprogramados para funcionar normalmente. Sin estar unidos por teoría, estos hallazgos estarían en concordancia con cambios posibles en la expresión de los genes "imprinted" (cuya expresión es solo de uno de los progenitores).

Mientras que el invento ha sido descrito aquí con referencia a las realizaciones preferidas, se entiende que no se pretende limitar el invento a las formas específicas descritas. Por el contrario, se pretende cubrir todas las modificaciones múltiples y las formas alternativas que caen dentro del espíritu y el ámbito del invento.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

3

4

5

6

Claims (53)

1. Un método para clonar un mamífero no humano que comprende las etapas de:

(a)

recogida de un núcleo de una célula cúmulo de un mamífero no humano adulto;

(b)

inserción de al menos una porción del núcleo que incluye los cromosomas en un oocito enucleado para formar un oocito renucleado;

(c)

permitir al oocito renucleado desarrollarse en un embrión; y

(d)

permitir al embrión desarrollarse en una cría viva.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el núcleo es recogido de una célula cúmulo que tiene 2n cromosomas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el núcleo es recogido de una célula cúmulo que es 2C a 4C.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el núcleo es insertado en el citoplasma del oocito enucleado.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la etapa de inserción es llevada a cabo mediante microinyección.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la micro inyección es microinyección accionada por un dispositivo piezoeléctrico.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el oocito enucleado es detenido en la metafase de la segunda división meiótica.

8. El método de la reivindicación 1, que además comprende la etapa de la activación del oocito antes de, o durante, o después de la inserción del núcleo.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la etapa de activación tiene lugar desde cero hasta alrededor de seis horas después de la inserción del núcleo.

10. El método de la reivindicación 8, en el que la etapa de activación tiene lugar antes de la inserción del núcleo.

11. El método de la reivindicación 8, en el que la etapa de activación comprende una electro-activación, o una exposición a un agente químico de activación.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el agente de activación químico es seleccionado del grupo que consiste en alcohol etílico, factores de esperma citoplasmático, peptidomiméticos del ligando del receptor de oocito, estimuladores farmacológicos de liberación de Ca^{2+}, ionoforos de Ca^{2+}, iones de estroncio, moduladores de la señalización de fosfoproteínas, inhibidores de síntesis de proteína, y combinaciones de los mismos.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el agente de activación químico es seleccionado del grupo que consiste en cafeína, ionóforo de Ca^{2+} A 23187, etanol, 2-aminopurina, estaurosporina, esfingosina, cicloheximida, ionomicina, 6-dimetilaminopurina, y combinaciones de las mismas.

14. El método de la reivindicación 12, en el que el agente de activación comprende Sr^{2+}.

15. El método de la reivindicación 1, comprende además la etapa de interrupción de formación de microtúbulos en el oocito por un intervalo de tiempo antes de o después de la inserción del núcleo.

16. El método de la reivindicación 15, en el que el intervalo de tiempo es de cero a alrededor de 6 horas.

17. El método de la reivindicación 15, en el que la formación microtubular es interrumpida por una selección del grupo que consiste en citocalasina B, nocodazol, colchicina, y las combinaciones de los mismos.

18. El método de la reivindicación 17, en el que la formación microtubular es interrumpida por la citocalasina B.

19. El método de la reivindicación 1, comprende además la etapa de interrupción de los filamentos de actina en el oocito por un intervalo de tiempo antes de o después de la inserción del núcleo.

20. El método de la reivindicación 19, en el que el intervalo de tiempo es de cero a alrededor de 6 horas.

21. El método de la reivindicación 20, en el que los filamentos de actina son interrumpidos por la citocalasina D, jasplaquinolida, latrunculina A, o las combinaciones de las mismas.

22. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa que permite al embrión desarrollarse en una cría viva comprende además la subetapa de transferencia del embrión a una hembra receptora suplente, en el que el embrión se desarrolla en un feto viable.

23. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de inserción comprende además la inserción de un reactivo en el citoplasma de dicho oocito.

24. El método de la reivindicación 23, en el que el reactivo es seleccionado del grupo que consiste de una proteína exógena, un derivado de una proteína exógena, un anticuerpo, un agente farmacológico, y las combinaciones de los mismos.

25. El método de la reivindicación 23, en el que la etapa de inserción comprende además la inserción de un ácido nucleico exógeno o un derivado de un ácido nucleico exógeno en el citoplasma de dicho oocito.

26. El método de la reivindicación 1, en el que el mamífero no humano es seleccionado del grupo que consiste de primates, ovinos, bovinos, porcinos, ursinos, felinos, caninos, equinos y roedores.

27. El método de la reivindicación 26, en el que el mamífero no humano es un ratón.

28. Un método para obtener embrión de mamífero no humano que comprende las etapas de:

(a)

recogida de un núcleo de una célula cúmulo de un mamífero no humano adulto;

(b)

inserción de al menos una porción del núcleo que incluye los cromosomas en un oocito enucleado para formar un oocito renucleado; y

(c)

permitir al oocito renucleado desarrollarse en un embrión.

29. El método de la reivindicación 28, en el que el núcleo es recogido de una célula cúmulo que tiene 2n cromosomas.

30. El método de la reivindicación 28, en el que el núcleo es recogido de una célula cúmulo que es 2C a 4C.

31. El método de la reivindicación 28, en el que el núcleo es insertado en el citoplasma del oocito enucleado.

32. El método de la reivindicación 31, en el que la etapa de inserción es llevada a cabo mediante micro inyección.

33. El método de la reivindicación 32, en el que la micro inyección es micro inyección accionada por un dispositivo piezoeléctrico.

34. El método de la reivindicación 28, en el que el oocito enucleado es detenido en la metafase de la segunda división meiótica.

35. El método de la reivindicación 28, que además comprende la etapa de la activación del oocito antes de, o durante, o después de la inserción del núcleo.

36. El método de la reivindicación 35, en el que la etapa de activación tiene lugar desde cero hasta alrededor de seis horas después de la inserción del núcleo.

37. El método de la reivindicación 35, en el que la etapa de activación tiene lugar antes de la inserción del núcleo.

38. El método de la reivindicación 35, en el que la etapa de activación comprende una electro-activación, o exposición a un agente químico de activación.

39. El método de la reivindicación 38, en el que el agente de activación químico es seleccionado del grupo que consiste en alcohol etílico, factores de esperma citoplasmático, peptidomiméticos del ligando del receptor de oocito, estimuladores farmacológicos de liberación de Ca^{2+}, ionóforos de Ca^{2+}, iones de estroncio, moduladores de señalización de fosfoproteínas, inhibidores de la síntesis de proteína, y combinaciones de los mismos.

40. El método de la reivindicación 39, en el que el agente de activación químico es seleccionado del grupo que consiste en cafeína, ionóforo de Ca^{2+} A 23187, etanol, 2-aminopurina, estaurosporina, esfingosina, cicloheximida, ionomicina, 6-dimetilaminopurina, y combinaciones de las mismas.

41. El método de la reivindicación 39, en el que el agente de activación comprende Sr^{2+}.

42. El método de la reivindicación 28, que comprende además la etapa de interrupción de formación de microtúbulos en el oocito por un intervalo de tiempo antes de o después de la inserción del núcleo.

43. El método de la reivindicación 42, en el que el intervalo de tiempo es de cero a alrededor de 6 horas.

44. El método de la reivindicación 42, en el que la formación microtubular es interrumpida por una selección de entre el grupo que consiste en citocalasina B, nocodazol, colchicina, y las combinaciones de los mismos.

45. El método de la reivindicación 44, en el que la formación microtubular es interrumpida por la citocalasina B.

46. El método de la reivindicación 28, comprende además la etapa de interrupción de los filamentos de actina en el oocito por un intervalo de tiempo antes de o después de la inserción del núcleo.

47. El método de la reivindicación 46, en el que el intervalo de tiempo es de cero a alrededor de 6 horas.

48. El método de la reivindicación 47, en el que los filamentos de actina son interrumpidos por la citocalasina D, jasplaquinolida, latrunculina A, o las combinaciones de las mismas.

49. El método de la reivindicación 28, en el que la etapa de inserción comprende además la inserción de un reactivo en el citoplasma de dicho oocito.

50. El método de la reivindicación 49, en el que el reactivo es seleccionado del grupo que consiste en una proteína exógena, un derivado de una proteína exógena, un anticuerpo, un agente farmacológico, y las combinaciones de los mismos.

51. El método de la reivindicación 49, en el que la etapa de inserción comprende además la inserción de un ácido nucleico exógeno o un derivado de un ácido nucleico exógeno en el citoplasma de dicho oocito.

52. El método de la reivindicación 28, en el que el mamífero no humano es seleccionado del grupo que consiste en primates, ovinos, bovinos, porcinos, ursinos, felinos, caninos, equinos y roedores.

53. El método de la reivindicación 52, en el que el mamífero no humano es un ratón.