ES2323761T3 - Metodo para la produccion de proteinas dependientes de la vitamina k. - Google Patents
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Abstract
Célula huésped eucariótica transfectada con un primer polinucleótido que codifica un primer propéptido y una proteína dependiente de la vitamina K en una primera unidad de expresión y transfectada con un segundo polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre en una segunda unidad de expresión; donde dicho primer propéptido y segundo propéptido comprenden una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
Description
Método para la producción de proteínas
dependientes de la vitamina K.
La presente invención se refiere a un método
nuevo para preparar proteínas dependientes de vitamina K y en
particular del factor de coagulación VII (FVII). Además la presente
invención se refiere a nuevas células huéspedes eucarióticas
cotransfectadas y vectores recombinantes para ser usados en este
método mejorado para preparar proteínas dependientes de vitamina
K.
La biosíntesis de las proteínas dependientes de
vitamina K incluye diferentes fases de tratamiento
post-traduccional antes de que se obtenga una
proteína funcional madura.
La vitamina K es un cofactor necesario para la
gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico
en estas proteínas dependientes de vitamina K, incluidos los
factores procoagulantes de la trombina, factor VII, IX, y X; la
proteína C anticoagulante y proteína S; y otras proteínas tales como
osteocalcina (Proteína Gla ósea), Proteína Gla matricial, y
proteína 1 Gla rica en prolina. Esta carboxilación es requerida
para una hemostasis normal, porque habilita la unión de calcio y la
fijación de los procoagulantes y anticoagulantes a los
fosfolípidos.
La gamma-glutamil carboxilasa es
una enzima microsómica integral de la membrana localizada en el
retículo endoplásmico rugoso. Carboxila los residuos de glutamato
localizados en el dominio Gla de las proteínas dependientes de
vitamina K. El ADNc de la gamma-glutamil carboxilasa
humana ha sido recientemente aislado y secuenciado (Wu SM et
al. Science 254:1634, 1991). Estudios de la biosíntesis de
proteínas dependientes de vitamina K en células BHK y CHO, muestran
que la carboxilasa está presente en el retículo endoplasmático (ER)
y en el complejo de Golgi, y que el propéptido, que contiene el
sitio de reconocimiento de carboxilasa, se divide después de la
finalización de la gamma-carboxilación.
Se ha especulado si el propéptido puede
estimular la actividad de carboxilasa (Sigiura, I. et al.
(1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 9, 9069-9074,
Knobloch y Suttie (1987) J. Biol. Chem. 262,
15334-15337, Furie et al (1999) Blood, 93,
1798-1808).
La coagulación sanguínea es un proceso que
consiste en una interacción compleja de varios componentes
sanguíneos, o factores, que finalmente da origen a un coágulo de
fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en
lo que ha sido referido como la "cascada" de coagulación son
pro-enzimas o zimógenos, proteínas enzimáticamente
inactivas que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción
de un activador; él mismo es un factor de coagulación activado. Los
factores de coagulación que han sufrido tal conversión y a los que
generalmente se hace referencia como "factores activos", y son
designados por la adición de un sufijo "a" en minúsculas (p.
ej., factor VII activado (FVIIa)).
El factor X activado (FXa) es requerido para
convertir la protrombina en trombina, que luego convierte el
fibrinógeno en fibrina como una fase final en la formación de un
coágulo de fibrina. Hay dos sistemas, o vías, que promueven la
activación de FX. La "vía intrínseca" se refiere a las
reacciones que llevan a la formación de trombina a través de la
utilización de factores presentes sólo en el plasma. Una serie de
activaciones mediadas por proteasa en última instancia generan
factor IXa que, conjuntamente con el factor VIIIa, divide FX en FXa.
Una proteólisis similar es efectuada por FVIIa y su cofactor,
factor tisular, en la "vía extrínseca" de coagulación
sanguínea. El factor tisular es una proteína de la membrana ósea y
normalmente no circula por el plasma. No obstante, en la ruptura
del vaso, puede hacer un complejo con FVIIa para catalizar la
activación de FX o la activación del factor IX en presencia de Ca++
y fosfolípido. Mientras que la importancia relativa de las dos vías
de coagulación en hemostasis no está clara, en los últimos años se
ha descubierto que FVII y el factor tisular desempeñan un papel
esencial en la regulación de la coagulación sanguínea.
FVII es una glicoproteína de plasma traza que
circula por la sangre como un zimógeno monocatenario. El zimógeno
es un coágulo inactivo. El FVII monocatenario puede ser convertido
en FVIIa bicatenario por FXa, factor XIIa, factor IXa o trombina
in vitro. Se considera que FXa es el activador fisiológico
de FVII más importante. Como otras proteínas plasmáticas implicadas
en la hemostasis, FVII depende de la vitamina K para su
biosíntesis, que es requerida para la
gamma-carboxilación de 10 residuos de ácido
glutámico en el amino terminal de la proteína. El tratamiento
intracelular post-traduccional de FVII se
desarrolla en el retículo endoplasmático (ER) y el complejo Golgi.
Además de la gamma-carboxilación dependiente de la
vitamina K, FVII es sometido a la proteólisis limitada para
eliminar el propéptido N-terminal, y la
glicosilación de asparagina-145 y -322, y
serina-52 y -60 (Fig 1).
Los residuos del ácido glutámico (Gla)
gamma-carboxilado son requeridos para la
interacción asociada con metal de FVII con fosfolípidos.
En presencia del factor tisular, fosfolípidos y
iones de calcio, el FVIIa bicatenario rápidamente activa el factor
FX o IX por proteólisis limitada.
La proteína C es una serina proteasa y
anticoagulante de origen natural que desempeña un papel en la
regulación de la homeóstasis inactivando los factores Va y VIIIa en
la cascada de coagulación. La proteína humana C se hace in
vivo principalmente en el hígado como un único polipéptido de
461 aminoácidos. Esta molécula monocatenaria precursora sufre
múltiples modificaciones post-traduccionales
incluida la carboxilación de nueve residuos de ácido glutámico,
dando como resultado nueve residuos Gla.
La proteína S también muestra/presenta una
actividad anticoagulante en ensayos de coagulación in vitro.
La proteína S muestra/presenta una actividad de cofactor
anticoagulante para la proteína C activada. También se ha mostrado
que la proteína S es un factor anticoagulante en la ausencia de
proteína C activada, puesto que puede inhibir la actividad
protrombinasa en ensayos libres de proteína C activada y se enlaza
al factor Va o al factor Xa y funciona como un anticoagulante sin
proteína C activada.
La proteína S es fisiológicamente un factor
antitrombótico muy importante puesto que las deficiencias
hereditarias o adquiridas de la proteína S están asociadas a una
enfermedad venal y trombótica arterial. Una deficiencia de la
proteína S libre con un nivel normal de la proteína total S ha sido
descrita en algunos pacientes con enfermedad trombótica.
Con frecuencia es necesario bloquear
selectivamente la cascada de coagulación en un paciente. Los
anticoagulantes tales como la proteína C o la proteína S pueden ser
usados, por ejemplo, durante la diálisis de riñón, o para tratar
trombosis venosa profunda, coagulación intravascular diseminada
(CID), un paciente en riesgo de trombosis aguda, deficiencia de
proteína S, sepsis, inflamación, cáncer, pacientes que experimentan
cirugía y otros trastornos
médicos.
médicos.
La osteocalcina se compone de 49 residuos de
aminoácidos que incluyen tres residuos Gla. La función de esta
proteína está pensada para suprimir la mineralización excesiva. La
osteocalcina es una proteína específica para los huesos que es
segregada por osteoblastos. Una fracción de la osteocalcina recién
sintetizada es liberada en el flujo sanguíneo, donde su
concentración se correlaciona con los índices de la actividad
osteoblástica y el nivel de formación de hueso. En los seres
humanos, los cambios en los niveles de la osteocalcina circulante
han sido asociados a enfermedades óseas metabólicas tales como
osteoporosis e hiperparatiroidismo.
La proteína matricial Gla (MGP) se compone de 79
aminoácidos incluidos 5 residuos Gla. Esta proteína se encuentra
normalmente en la matriz desmineralizada y se cree que tiene una
función determinada en la iniciación de la formación del hueso.
Hay además una necesidad en la técnica de
sistemas mejorados para la producción de proteínas recombinantes
dependientes de vitamina K y particularmente de factores de
coagulación recombinante. La presente invención satisface esta
necesidad suministrando un método que da una producción más eficaz,
más rápida y/o un mayor rendimiento de proteínas recombinantes
dependientes de vitamina K, en particular FVII.
La presente invención se refiere a un método
nuevo para preparar proteínas dependientes de vitamina K y en
particular un factor de coagulación VII (FVII).
Se ha demostrado que las fases del tratamiento
N-terminal y en particular la
gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico
de proteínas dependientes de vitamina K son las fases de limitación
en la biosíntesis de estas proteínas, como se ejemplifica con FVII
por los inventores presentes. Un método para aumentar la
gamma-carboxilación ha sido demostrado que aumenta
la expresión de proteínas recombinantes dependientes de vitamina K.
El propéptido de las proteínas dependientes de vitamina K es
esencial para unirse a la carboxilasa, y tiene que estar fijado de
manera covalente a la proteína dependiente de la vitamina K en orden
para los residuos Glu, en lo que se convertirá en el
N-terminal de la última proteína más madura, para
ser carboxilada. Suponemos que el propéptido libre funciona como
una molécula reguladora alostérica en el sentido de que cuando la
concentración de propéptido libre aumenta la actividad del proceso
de gamma-carboxilación también aumenta.
Un aumento directo en la concentración de
propéptidos libres puede obtenerse por coexpresión de
propéptido(s) libre(s) per se. Esto puede
hacerse mediante la transfección con el polinucleótido codificando
propéptido(s) libre(s) con o sin mutaciones y
truncamientos, en una o más copias, y la coexpresión junto con un
polinucleótido codificando la proteína dependiente de la vitamina
K. Éste puede contener otra secuencia de propéptidos, que la que
normalmente se asocia a la proteína dependiente de la vitamina K. La
expresión de un polinucleótido codificando la proteína dependiente
de la vitamina K puede obtenerse bien haciendo una transfección del
gen de interés en una célula o activando (es decir, conectando) un
gen endógeno que codifica la proteína dependiente de la vitamina K
ya presente en células primarias, secundarias, o inmortalizadas de
origen vertebrado, que normalmente no es expresado en las células o
no es expresado a niveles fisiológicamente significativos en las
células tal y como se obtienen. Para activar los genes de interés,
se puede utilizar una recombinación homóloga para reemplazar o
deshabilitar la región reguladora normalmente asociada al gen en
células tal y como se obtiene con una secuencia reguladora que
provoca que el gen sea expresado a niveles superiores a los
evidentes en la correspondiente célula no transfectada, o para
exponer un modelo de regulación o inducción que es diferente al
evidente en la correspondiente célula no transfectada.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
una célula huésped eucariótica transfectada con un primer
polinucleótido codificando un primer propéptido y una proteína
dependiente de la vitamina K en una primera unidad de expresión y
transfectada con un segundo polinucleótido codificando un segundo
propéptido libre en una segunda unidad de expresión; donde los
mencionados primer propéptido y segundo propéptido comprenden cada
uno una secuencia de aminoácidos independientemente seleccionada
del grupo que consiste en SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Debe entenderse que el primer
polinucleótido está localizado en una primera unidad de expresión y
que el segundo polinucleótido está localizado en una segunda unidad
de expresión, donde las primera y segunda unidades de expresión son
diferentes. El orden real de transfección es por supuesto trivial y
así, la célula huésped puede ser transfectada, el primero con el
segundo polinucleótido o viceversa. El uso de los términos
"primer propéptido" y "segundo propéptido" no son muy
convenientes, puesto que el primer y el segundo propéptido pueden
ser iguales o diferentes.
El término "una célula huésped
eucariótica", como se utiliza en este caso, representa cualquier
célula, incluidas las células híbridas, donde el ADN heterólogo
puede ser expresado. Las células huéspedes típicas se incluyen,
pero no se limitan a células de insecto, células de levadura,
células mamíferas, incluyendo células humanas, tales como células
BHK, CHO, HEK, y COS. En la práctica de la presente invención, las
células huéspedes que son cultivadas son preferiblemente células
mamíferas, más preferiblemente una línea celular mamífera
establecida, incluyendo, sin limitación, líneas celulares CHO (p.
ej., ATCC CCL 61), COS-1 (p. ej., ATCC CRL 1650),
de riñón de cría de hámster (BHK) y HEK293 (p. ej., ATCC CRL 1573;
Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72,
1977).
Una línea celular BHK preferida es la línea
celular tk^{-} ts13 BHK (Waechter y Baserga, Proc. Natl. Acad.
Sci. EEUU 79, 1106-1110, 1982), de ahora en
adelante referida como células BHK 570. La línea celular BHK 570
está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301
Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de acceso CRL
10314. Una línea celular tk^{-} ts13 BHK está también disponible
en la ATCC bajo número de acceso CRL 1632.
Otras líneas celulares adecuadas incluyen, sin
limitación, Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II
de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139),
pulmón humano (Hb de aTCC 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y células
DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU
77:4216-4220, 1980). También son útiles las células
3T3, células de Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras
células.
El término "un polinucleótido" denota un
polímero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleótidas o
ribonucleótidas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos
incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales,
sintetizadas in vitro, o preparados a partir de una
combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una
molécula polinucleótida se prevé aquí en términos de nucleótidos
(abreviados "nt") o pares de bases (abreviados "bp"). El
término "nucleótidos" se usa tanto para moléculas
monocatenarias como para moléculas bicatenarias si el contexto lo
permite. Cuando el término es aplicado a moléculas bicatenarias se
usa para denotar la longitud total y se entenderá como equivalente
al término "pares de bases". Será reconocido por expertos en
la técnica que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario
pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las
mismas pueden ser empalmados como resultado de una ruptura
enzimática; de este modo todos los nucleótidos dentro de una
molécula de polinucleótido bicatenario no pueden ser emparejados.
Dichos extremos desemparejados no excederán en general los 20 nt en
longitud.
El término "un propéptido", como se utiliza
en este caso, representa cualquier secuencia de aminoácidos, que
puede enlazar una gamma-glutamil carboxilasa. Los
propéptidos típicos que dirigen una
gamma-carboxilación de proteínas dependientes de
vitamina K, son encontrados en el N-terminal de una
proteína dependiente de la vitamina K y sirven como un sitio de
ensamblaje o secuencia de reconocimiento para la interacción con la
gamma-glutamil carboxilasa, que carboxila los
residuos de glutamato normalmente localizados en el dominio Gla de
las proteínas dependientes de la vitamina K. Allí puede haber más
de un sitio de enlace para la gamma-glutamil
carboxilasa, es decir, secuencia de reconocimiento de
gamma-glutamil carboxilasa, en un propéptido. Un
ejemplo de un propéptido dentro de esta definición es la secuencia
del propéptido natural de FVII. Otro ejemplo dentro de esta
definición es la secuencia del propéptido natural de FVII conectada
a la secuencia del propéptido natural del factor IX dentro de la
misma secuencia de aminoácidos.
El término "propéptido libre", como se
utiliza en este caso, pretende significar un propéptido que no está
conectado a una proteína dependiente de la vitamina K para ser
gamma-carboxilado. Un ejemplo de un propéptido libre
es así pues el propéptido de FVII sin estar conectado a la
secuencia de aminoácidos de FVII.
Los términos "factor VII", o factor
"FVII" como se usan en este caso se refieren a un producto que
consiste en la forma inactivada (factor VII). El término
"VIIa", o "FVIIa" como se utiliza en este caso significa
un producto que consiste en la forma activada (factor VIIa). éste
incluye proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos
1-406 de factor FVII o FVIIa humano nativo. También
incluye proteínas con una secuencia de aminoácidos ligeramente
modificada, por ejemplo, un extremo N-terminal
modificado incluyendo las deleciones o adiciones de aminoácidos
N-terminales siempre que estas proteínas
sustancialmente retengan la actividad de FVIIa. "FVII" o
"FVIIa" dentro de la definición anterior también incluye
variaciones alélicas naturales que pueden existir y ocurrir de un
individuo a otro. También, el grado y la ubicación de glicosilación
u otras modificaciones de post-traducción pueden
variar dependiendo de las células huéspedes elegidas y la naturaleza
del entorno de las células huéspedes.
El término "variantes", como se utiliza en
este caso, se destina a designar FVII donde uno o más residuos de
aminoácidos de la proteína progenitora han sido sustituidos por
otro residuo de aminoácido y/o donde uno o más residuos de
aminoácidos de la proteína progenitora han sido eliminados y/o
donde uno o más residuos de aminoácidos han sido añadidos a la
proteína progenitora. Este tipo de adición puede tener lugar bien
en el extremo N-terminal o en el extremo
C-terminal de la proteína progenitora o en
ambos.
El término "una unidad de expresión", como
se utiliza en este caso, significa un polinucleótido que comprende
los elementos siguientes operativamente enlazados: (a) un promotor
de la transcripción; (b) una secuencia de polinucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos; y (c) un terminador de la
transcripción. Un ejemplo de una unidad de expresión es así pues un
vector de ADN que comprende los siguientes elementos enlazados: (a)
un promotor de la transcripción, (b) una secuencia de ADN que
codifica un propéptido libre; y (c) un terminador de la
transcrip-
ción.
ción.
El término "un vector", como se utiliza en
este caso, significa cualquier entidad de ácido nucleico capaz de
amplificación en una célula huésped. Así, el vector puede ser un
vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como
una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de
la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma
alternativa, el vector puede ser de una forma que, cuando se
introduce en una célula huésped, es integrado en el genoma de la
célula huésped y replicado junto con el(los)
cromosoma(s) en el que ha sido integrado. La elección del
vector frecuentemente depende de la célula huésped en la que va a
ser introducido. Vectores incluyen, pero no se limitan a vectores
plásmidos, vectores fágicos, vectores virus o cósmidos. Los
vectores normalmente contienen un origen de replicación y al menos
un gen seleccionable, es decir, un gen que codifica un producto que
es fácilmente detectable o cuya presencia es esencial para el
crecimiento celular.
El término "un promotor" denota una parte
de un gen que contiene secuencias de ADN que proveen la unión de
ARN polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las secuencias
del promotor son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las
regiones 5' no codificantes de genes.
El término "una proteína dependiente de la
vitamina K", como se utiliza en este caso, significa cualquier
proteína, que es gamma-carboxilada en residuos de
ácido glutámico. Las proteínas dependientes de la vitamina K
típicas incluyen, pero no sólo se limitan a, factores procoagulantes
trombina, factor VII, IX, y X; los anticoagulantes proteína C y
proteína S; y otras proteínas tales como la osteocalcina (proteína
Gla ósea), proteína matricial Gla, y proteína 1 Gla rica en
prolina.
En otro aspecto la invención se refiere a un
método para la producción de una proteína dependiente de la
vitamina K comprendiendo a) transfección de una célula huésped
eucariótica con un primer polinucleótido que codifica un primer
propéptido y una proteína dependiente de la vitamina K en una
primera unidad de expresión y transfección con un segundo
polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre en una
segunda unidad de expresión para producir una célula huésped
eucariótica cotransfectada; b) cultivo en un medio de cultivo
adecuado de la célula huésped eucariótica cotransfectada bajo
condiciones que permiten al primer polinucleótido y al segundo
polinucleótido que se expresen; y c) aislamiento de la proteína
dependiente de la vitamina K del medio; donde dichos primer
propéptido y segundo propéptido comprenden cada uno una secuencia
de aminoácidos seleccionada independientemente del grupo que
consiste en SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17 y 18.
En otro aspecto la invención se refiere a un
vector recombinante, donde dicho vector comprende un primer
polinucleótido que codifica un primer propéptido y una proteína
dependiente de la vitamina K en una primera unidad de expresión y
un segundo polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre
en una segunda unidad de expresión; donde dichos primer propéptido y
segundo propéptido comprenden una secuencia de aminoácidos
seleccionada independientemente del grupo que consiste en SEC ID
NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17 y 18.
17 y 18.
Una célula huésped eucariótica que produce FVII
puede también ser producida por un método comprendiendo a) gen que
activa en una célula huésped eucariótica un primer polinucleótido
que codifica la secuencia de aminoácidos -18 a 406 de FVII y su
propéptido en una primera unidad de expresión y b) transfección con
un segundo polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre
en una segunda unidad de expresión. En este aspecto, la secuencia
de aminoácidos -18 a -1 es idéntica al propéptido de FVII
identificado como SEC ID NO:7.
En otro aspecto la invención se refiere a un
método para preparar una célula huésped eucariótica que produce
FVII o variantes de la misma comprendiendo a) transfección de una
célula huésped eucariótica con un primer polinucleótido que
codifica un primer propéptido y FVII o variantes de las mismas en
una primera unidad de expresión y b) transfección con un segundo
polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre en una
segunda unidad de expresión; donde dichos primer propéptido y
segundo propéptido comprenden una secuencia de aminoácidos
seleccionada independientemente del grupo que consiste en SEC ID
NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17 y 18.
17 y 18.
El primer propéptido puede ser aquel propéptido
normalmente asociado a la proteína dependiente de la vitamina K o
puede ser cualquier otro propéptido, tal como un propéptido
normalmente asociado a una proteína diferente dependiente de la
vitamina K.
En una forma de realización el primer propéptido
comprende una secuencia de unión para la
gamma-glutamil carboxilasa. En otra forma de
realización el primer propéptido comprende dos o más secuencias de
unión para la gamma-glutamil carboxilasa. Un
ejemplo del primer propéptido es, por lo tanto, el propéptido
normalmente asociado a FVII y protrombina unida de manera covalente
en la misma unidad de expresión.
En otra forma de realización el segundo
propéptido libre comprende una secuencia de unión para la
gamma-glutamil carboxilasa. En otra forma de
realización el segundo propéptido libre comprende dos o más
secuencias de unión para la gamma-glutamil
carboxilasa. Un ejemplo del segundo propéptido libre es por tanto
el propéptido normalmente asociado a FVII y protrombina unida de
manera covalente en la misma unidad de expresión.
En otra forma de realización de la invención, la
célula huésped eucariótica está expresando un primer polinucleótido
que codifica un primer propéptido y FVII en una primera unidad de
expresión y expresando un segundo polinucleótido que codifica un
segundo propéptido libre en una segunda unidad de expresión. En una
forma de realización particular el FVII es FVII humano.
En otra forma de realización de la invención, la
célula huésped eucariótica es transfectada con un primer
polinucleótido que codifica un primer propéptido y FVII en una
primera unidad de expresión y transfectada con un segundo
polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre en una
segunda unidad de expresión. En una forma de realización particular
el FVII es FVII humano.
En otra forma de realización de la invención, la
proteína dependiente de la vitamina K es seleccionada
independientemente de protrombina, factor IX, FVII, factor X,
proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína 1 Gla rica en
prolina 1 o proteína matricial Gla. Debe ser entendido que
cualquiera de estas proteínas constituye una forma de realización
alternativa de la invención.
En otra forma de realización de la invención la
célula huésped eucariótica es posteriormente transfectada con un
polinucleótido que codifica una gamma-glutamil
carboxilasa en una unidad de expresión. Esta unidad de expresión
puede ser una unidad de expresión diferente a la primera o segunda
unidad de expresión o el polinucleótido que codifica la
gamma-glutamil carboxilasa puede estar localizado
en la primera o segunda unidad de expresión. Los ejemplos de
gamma-glutamil carboxilasa son seleccionados de
gamma-glutamil carboxilasa recombinante humana, de
rata, de drosophila, de mus musculus o de hámster.
En la presente descripción, los residuos de
aminoácidos se representan usando abreviaturas, como se indica en
la tabla 1, aprobadas por Comisión de Nomenclatura Bioquímica
IUPAC-IUB (CBN). Respecto a los aminoácidos y
similares que tienen isómeros, los que están representados por las
abreviaturas siguientes están en forma de L natural. Además, los
extremos de izquierda y derecha de una secuencia de aminoácidos de
un péptido son, respectivamente, N- y Terminales a menos que se
especifique de otra manera.
En otra forma de realización de la invención el
segundo propéptido libre comprende una secuencia de aminoácidos
específica seleccionada independientemente del grupo que consiste
en SEC ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16,17y18.
En otra forma de realización de la invención la
célula huésped eucariótica es una célula de levadura.
En otra forma de realización de la invención la
célula huésped eucariótica es una célula de insecto.
En otra forma de realización de la invención la
célula huésped eucariótica es una célula de mamífero.
En otra forma de realización de la invención la
célula huésped eucariótica es una célula humana.
En otra forma de realización de la invención la
célula huésped eucariótica es seleccionada independientemente de
las células BHK, células HEK, células COS o células CHO.
En otra forma de realización de la invención el
primer polinucleótido es ADN.
En otra forma de realización de la invención el
segundo polinucleótido es ADN.
En otra forma de realización de la invención el
primer polinucleótido es ARN.
En otra forma de realización de la invención el
segundo polinucleótido es ARN.
En otra forma de realización de la invención la
primera unidad de expresión está presente en un primer vector y la
segunda unidad de expresión está presente en un segundo vector
separado.
En otra forma de realización de la invención la
primera unidad de expresión y la segunda unidad de expresión están
presentes en el mismo vector.
En otra forma de realización de la invención el
primer vector es un vector plásmido.
En otra forma de realización de la invención el
segundo vector es un vector plásmido.
En otra forma de realización de la invención el
primer vector es un vector fágico.
En otra forma de realización de la invención el
segundo vector es un vector fágico.
En otra forma de realización de la invención el
medio de cultivo es un medio libre de suero.
En otra forma de realización de la invención el
primer polinucleótido es ADN plásmido.
En otra forma de realización de la invención el
segundo polinucleótido es ADN plásmido.
El término "secuencias de unión para una
gamma-glutamil carboxilasa" como se utiliza en
este caso significa los residuos de aminoácidos necesarios dentro
de una secuencia (es decir, secuencia de reconocimiento) para la
unión o ensamblaje o interacción con una
gamma-glutamil carboxilasa.
En otra forma de realización de la invención el
primer propéptido tiene una afinidad más alta (tal y como se ha
medido por la constante de inhibición (K_{i})) para la
carboxilasa que el segundo propéptido libre. Se proporcionan dos
funciones separables de los propéptidos de proteínas dependientes de
la vitamina K en la carboxilasa, unión de sustrato y regulación de
la actividad, afinidades diferentes y concentraciones del
propéptido unido de manera covalente y del propéptido libre pueden
influir la capacidad global de una célula productora para
carboxilar la proteína dependiente de la vitamina K recombinante,
la coexpresión del propéptido libre y del propéptido unido de
manera covalente, y combinaciones de los mismos pueden aumentar la
producción de FVII funcional recombinante (rFVII). Para no inhibir
la carboxilación de la proteína dependiente de la vitamina K recién
sintetizada que contiene Glu se prefiere que el segundo propéptido
libre tenga una afinidad inferior que el propéptido fijado de manera
covalente a la proteína dependiente de la vitamina K para ser
gamma-carboxilada.
Las K_{i} para propéptidos libres se
determinan según Stanley et al (Biochemistry, 38,
15681-15687(1999) y J. Biol. Chem. 274,
16940-16944.)
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El propéptido libre para ser coexpresado con la
proteína dependiente de la vitamina K puede ser seleccionado de las
listas como se resume en la tabla 2 y 3:
Las proteínas dependientes de la vitamina K son
preferiblemente producidas por técnicas de ADN recombinante. Con
este fin, las secuencias ADN que codifican proteínas dependientes
de la vitamina K pueden ser aisladas preparando una biblioteca
genómica o de ADNc y seleccionando para las secuencias de ADN que
codifican para toda la proteína o parte de ella mediante
hibridación usando sondas de oligonucleótidos sintéticas conforme a
técnicas estándar (véase Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York, 1989). Para el presente objetivo, la secuencia de
ADN que codifica la proteína es preferiblemente de origen humano,
es decir, derivada de una biblioteca de ADN genómico o de ADNc
humano.
La activación de genes endógenos mediante la
conexión o activación de un gen endógeno que codifica la proteína
dependiente de la vitamina K en células transfectadas primarias,
secundarias, o inmortalizadas puede ser realizada como se describe
en US 5,968,502. Las secuencias de ADN que codifican proteínas
dependientes de vitamina K pueden también ser preparadas
sintéticamente mediante métodos establecidos estándares, p. ej. el
método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruters, Tetrahedron
Letters 22 (1981), 1859 - 1869, o el método descrito por Mattes
et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. Según el método de
fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un
sintetizador de ADN automático, purificados, recocidos, ligados y
clonados en vectores adecuados.
Las secuencias de ADN pueden también ser
preparadas por reacción en la cadena de la polimerasa utilizando
cebadores específicos, por ejemplo como se describe en US
4,683,202, Saiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491, o
Sambrook et al., supra.
Las secuencias de ADN que codifican las
proteínas dependientes de la vitamina K son normalmente insertadas
en un vector recombinante que puede ser cualquier vector, que puede
estar sujeto convenientemente a procedimientos de ADN recombinante,
y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula
huésped en la cual se ha de introducir. Así, el vector puede ser un
vector de replicación autónoma, es decir, un vector, que existe
como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente
de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma
alternativa, el vector puede ser de tal forma que, cuando se
introduzca en una célula huésped, se integre en el genoma de la
célula huésped y sea replicado junto con el (los)
cromosoma(s) en que ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión donde la secuencia de ADN que codifica las proteínas
dependientes de la vitamina K es operativamente enlazado a
segmentos adicionales requeridos para la transcripción del ADN. En
general, el vector de expresión se deriva del ADN plásmido o
vírico, o puede contener elementos de ambos. El término,
"operativamente enlazado" indica que los segmentos están
dispuestos de modo que funcionan conjuntamente para sus objetivos
destinados, p. ej. la transcripción se inicia en un promotor y
procede a través de la secuencia de ADN que codifica para el
polipéptido.
El promotor puede ser cualquier secuencia de
ADN, que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de
elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas bien
homólogas o heterólogas a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de ADN codificando la proteína dependiente de la
vitamina K en células mamíferas son el promotor SV40 (Subramani
et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864), el promotor de
MT-1 (gen de metalotioneína) (Palmiter et
al., Science 222 (1983), 809 - 814), el Promotor de CMV (Boshart
et al., Cell 41:521-530, 1985) o el promotor
tardío principal del adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol,
2:1304-1319, 1982).
Un ejemplo de un promotor adecuado para el uso
en células de insecto es el promotor de polihedrina (US 4,745,051;
Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), el promotor
P10 (J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, págs. 765
776), el promotor proteína básica del virus de la polihedrosis de
Autographa califomica (EP 397 485), el promotor gen temprano
inmediato 1 de baculovirus (US 5,155,037; US 5,162,222), o el
promotor gen temprano retardado 39K de baculovirus (US 5,155,037;
US 5,162,222).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de levadura incluyen promotores de genes
glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem.
255 (1980), 12073 -12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1
(1982), 419 - 434) o genes de alcohol-deshidrogenasa
(Young et al., en Genetic Engineering of Microorganisms for
Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York,
1982), o los promotores TPI1 (US 4,599,311) o
ADH2-4c (Russell et al., Nature 304
(1983), 652 – 654).
Ejemplos de promotores adecuados para el uso en
células huéspedes de hongos filamentosos son, por ejemplo, el
promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985),
2093 - 2099) o el promotor tpiA. Ejemplos de otros
promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica TAKA
amilasa de A. oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, \alpha-amilasa neutra de A.
niger, \alpha-amilasa estable ácido de A.
niger, glucoamilasa (gluA) de A. niger o A.
awamori, lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina
de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o
acetamidasa de A. nidulans. Preferidos son los promotores de
TAKA amilasa y de gluA. Los promotores adecuados son mencionados
en, p. ej. EP 238 023 y EP 383 779.
Las secuencias de ADN que codifican las
proteínas dependientes de la vitamina K pueden también, si es
necesario, ser operativamente conectadas a un terminador adecuado,
tal como el terminador de la hormona del crecimiento humana
(Palmiter et al., Science 222, 1983, págs.
809-814) o los terminadores TPI1 (Alber y
Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, págs. 419-434)
o ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4, 1985, págs.
2093-2099). El vector puede también contener un
conjunto de sitios de empalme de ARN localizados corriente abajo
del promotor y corriente arriba del sitio de inserción para la
secuencia FVII misma. Los sitios de empalme de ARN preferidos pueden
ser obtenidos de adenovirus y/o de genes de inmunoglobulina.
También está contenida en los vectores de expresión una señal de
poliadenilación localizada corriente abajo del sitio de inserción.
Las señales de poliadenilación particularmente preferidas incluyen
la señal de poliadenilación temprana o tardía de SV40 (Kaufman y
Sharp, ibid.), la señal de poliadenilación de la región Elb
del adenovirus 5, el terminador del gen de la hormona del
crecimiento humana (DeNoto et al. Nuc. Acids Res.
9:3719-3730, 1981) o la señal de poliadenilación
del gen de FVII humano o del gen de FVII bovino. Los vectores de
expresión pueden también incluir una secuencia líder vírica no
codificante, tal como el líder tripartito del adenovirus 2,
localizado entre el promotor y los sitios de empalme del ARN; y
secuencias potenciadoras, tales como el potenciador de SV40.
El vector recombinante puede además comprender
una secuencia de ADN permitiendo al vector replicarse en la célula
huésped en cuestión. Un ejemplo de tal secuencia (cuando la célula
huésped es una célula mamífera) es el origen de replicación
SV40.
Cuando la célula huésped es una célula de
levadura, las secuencias adecuadas que permiten al vector
replicarse son los genes de replicación REP 1-3 del
plásmido de levadura de 2p y el origen de replicación.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto implementa un defecto en
la célula huésped, tal como el gen que codifica para dihidrofolato
reductasa (DHFR) o el gen TPI de Schizosacaromyces Pombe
(descrito por P. R. Russell, Gene 40, 1985, págs.
125-130), o uno que confiere resistencia a un
fármaco, p. ej. ampicilina, canamicina, tetraciclina,
cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato. Para hongos
filamentosos, marcadores seleccionables incluyen amdS,
pyrG, argB, niaD o Sc.
Para dirigir las proteínas dependientes de la
vitamina K de la presente invención a la vía secretora de las
células huéspedes, una secuencia señal secretora (también conocida
como una secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) puede
ser provista en el vector recombinante. La secuencia señal secretora
es unida a las secuencias de ADN que codifican las proteínas
dependientes de la vitamina K en el marco de lectura correcto. Las
secuencias señal secretoras están normalmente situadas en 5' en la
secuencia de ADN que codifica el péptido. La secuencia señal
secretora puede ser aquella normalmente asociada a la proteína o
puede provenir de un gen que codifica otra proteína segregada.
Para la secreción a partir de células de
levadura, la secuencia señal secretora puede codificar cualquier
péptido señal, lo que asegura la dirección eficaz de las proteínas
dependientes de vitamina K expresadas en la vía secretora de la
célula. El péptido señal puede ser un péptido señal producido de
forma natural, o una parte funcional del mismo, o puede ser un
péptido sintético. Se ha descubierto que los péptidos señal
adecuados son el péptido señal del a-factor (véase
US 4,870,008), el péptido señal de amilasa salival de ratón (véase
O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, págs.
643-646), un péptido señal de carboxipeptidasa
modificada (véase L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, págs.
887-897), el péptido señal de levadura BAR1
(véase WO 87/02670), o el péptido señal de proteasa 3 de levadura
aspártica (YAP3) (véase M. Egel-Mitani et
al., Yeast 6, 1990, págs. 127-137).
Para una secreción eficaz en la levadura, una
secuencia que codifica un péptido líder puede también ser insertada
corriente abajo de la secuencia señal y corriente arriba de la
secuencia de ADN que codifica las proteínas dependientes de la
vitamina K. La función del péptido líder es permitir al péptido
expresado ser dirigido del retículo endoplásmico al aparato de Golgi
y además a una vesícula secretora para la secreción en el medio de
cultivo (es decir, exportación de las proteínas dependientes de la
vitamina K a través de la pared celular o al menos a través de la
membrana celular en el espacio periplásmico de la célula de
levadura). El péptido líder puede ser el líder del a- factor de
levadura (cuyo uso está descrito en p. ej. US 4,546,082, 4,870,008,
EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 y EP 163 529). De forma
alternativa, el péptido líder puede ser un péptido líder sintético,
que hay que decir que es un péptido líder que no se encuentra en la
naturaleza. Los péptidos líder sintéticos pueden, por ejemplo, ser
construidos como se describe en WO 89/02463 o WO 92/11378.
Para el uso en hongos filamentosos, el péptido
señal puede derivar convenientemente de un gen que codifica una
amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp., un gen que
codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una
lipasa de Humicola lanuginosa. El péptido señal es
preferiblemente derivado de un gen que codifica TAKA amilasa de
A. oryzae, \alpha-amilasa neutra de A.
niger, amilasa estable en ácido A. niger, o glucoamilasa
de A. niger. Los péptidos señal adecuados están descritos en,
p. ej. EP 238 023 y EP 215 594.
Para el uso en células de insecto, el péptido
señal puede convenientemente derivar de un gen de insecto (véase WO
90/05783), tal como el péptido señal precursor de la hormona
adipocinética Manduca sexta de lepidóptero (véase US
5,023,328).
Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican para las proteínas dependientes de
la vitamina K, el promotor y opcionalmente el terminador y/o
secuencia señal secretora, respectivamente, y para insertarlos en
los vectores adecuados que contienen la información necesaria para
la replicación, son conocidos por los expertos en la técnica
(véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Los métodos de transfección de células mamíferas
y secuencias de ADN de expresión introducidas en las células son
descritas en p. ej. Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601
- 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341;
Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 -
426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro y Pearson,
Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham y van der Eb, Virology
52 (1973), 456; y Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 -
845.
Los marcadores seleccionables pueden ser
introducidos en la célula en un plásmido separado a la vez que el
gen de interés, o pueden ser introducidos en el mismo plásmido. Si
en el mismo plásmido, el marcador seleccionable y el gen de interés
pueden estar bajo el control de diferentes promotores o del mismo
promotor, la última disposición producirá un mensaje bicistrónico.
Los constructos de este tipo son conocidos en la técnica (por
ejemplo, Levinson y Simonsen, Pat. U.S. Nº. 4,713,339). Puede
también ser ventajoso añadir ADN adicional, conocido como "ADN
portador", a la mezcla que se introduce en las células.
Después de que las células hayan tomado el ADN,
crecen en un medio de crecimiento apropiado, normalmente
1-2 días, para empezar la expresión del gen de
interés. Como se utiliza en este caso el término "medio de
crecimiento apropiado" significa un medio que contiene nutrientes
y otros componentes requeridos para el crecimiento de células y la
expresión de la proteína dependiente de la vitamina K de interés.
Los medios incluyen generalmente una fuente de carbono, una fuente
de nitrógeno, aminoácidos esenciales, azúcares esenciales,
vitaminas, sales, fosfolípidos, proteína y factores de crecimiento.
Para la producción de proteínas gamma-carboxiladas,
el medio contendrá vitamina K, preferiblemente a una concentración
de aproximadamente 0,1 \mug/ml a 5 \mug/ml. La selección del
fármaco se aplica entonces para seleccionar para el crecimiento de
células que están expresando el marcador seleccionable en una forma
estable. Para las células que han sido transfectadas con un
marcador seleccionable amplificable la concentración de fármaco
puede ser aumentada para seleccionar un mayor número de copias de
las secuencias clonadas, aumentando de ese modo los niveles de
expresión. Los clones de células estables transfectadas son luego
cribados para la expresión de la proteína dependiente de la
vitamina K de interés.
La célula huésped en la que las secuencias de
ADN codifican las proteínas dependientes de la vitamina K son
introducidas puede ser cualquier célula, que sea capaz de producir
las proteínas dependientes de la vitamina K modificadas
post-traduccionales e incluye células de levadura,
hongos y eucarióticas mayores.
Ejemplos de líneas celulares mamíferas para el
uso en la presente invención son las líneas celulares
COS-1 (ATCC CRL 1650), de riñón de cría de hámster
(BHK) y 293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es
la línea celular tk.sup.- ts13 BHK (Waechter y Baserga, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, incorporada aquí
por referencia), de ahora en adelante referida como células BHK
570. La línea celular BHK 570 ha sido depositada con la Colección
Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md.
20852, bajo el número de acceso ATCC CRL 10314. Una línea celular
tk.sup.- ts13 BHK está también disponible del ATCC bajo el número de
acceso CRL 1632. Además, varias otras líneas celulares pueden ser
usadas dentro de la presente invención, incluyendo células de Hep I
de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), de Hep II de rata
(hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón
humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61)
y de DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU
77:4216-4220, 1980).
Ejemplos de células de levaduras adecuadas
incluyen células de Saccharomyces spp. o
Schizosacaromyces spp., en particular cepas de
Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. Los
métodos para transformar las células de levadura con ADN heterólogo
y producir polipéptidos heterólogos de las mismas están descritos,
p. ej. en US 4,599,311, 4,931,373, 4,870,008, 5,037,743, y US
4,845,075, todos los cuales son incorporados por la presente como
referencia. Las células transformadas son seleccionadas por un
fenotipo determinado por un marcador seleccionable, comúnmente
resistencia a los fármacos o la capacidad para crecer en la
ausencia de un nutriente particular, p. ej. leucina. Un vector
preferido para el uso en levadura es el vector POT1 descrito en US
4,931,373. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas
dependientes de la vitamina K pueden ser precedidas por una
secuencia señal y opcionalmente una secuencia líder, p. ej. como se
ha descrito anteriormente. Otros ejemplos de células de levadura
adecuadas son cepas de Kluyveromices, tales como K.
lactis, Hansenula, p. ej. H. poymorpha, o Pichia,
p. ej. P. pastoris (véase Gleeson et al., J. Gen.
Microbiol. 132, 1986, págs. 3459-3465; US
4,882,279).
Ejemplos de otras células micóticas son las
células de hongos filamentosos, p. ej. Aspergillus spp.,
Neurospora spp., Fusarium spp. o Trichoderma spp., en
particular cepas de A. oryzae, A. nidulans o A. niger.
El uso de Aspergillus spp. para la expresión de proteínas se
describe en, p. ej., EP 272 277, EP 238 023, EP 184 438: La
transformación de F. oxisporum puede, por ejemplo,
efectuarse como se describe por Malardier et al., 1989, Gene
78: 147-156. La transformación de Trichoderma
spp. puede ser realizada por ejemplo como se describe en EP 244
234.
Cuando un hongo filamentoso se usa como la
célula huésped, puede ser transformada con el constructo de ADN de
la invención, convenientemente integrando el constructo de ADN en el
cromosoma huésped para obtener una célula huésped recombinante.
Generalmente se considera que esta integración es una ventaja
puesto que la secuencia de ADN es más probable que se mantenga
estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el
cromosoma huésped puede ser realizada según métodos convencionales,
p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga.
La transformación de células de insecto y la
producción de polipéptidos heterólogos en las mismas puede ser
realizada como se describe en US 4,745,051; US 4,879,236; US
5,155,037, 5,162,222; EP 397,485) todo lo cual se incorpora aquí
por referencia. La línea celular de insecto usada como el huésped
puede ser de manera adecuada una línea celular de
Lepidoptera, tales como células de Spodoptera
frugiperda o células de Trichoplusia ni (véase US
5,077,214). Las condiciones de cultivo pueden ser de manera
adecuada como se describe en, por ejemplo, WO 89/01029 o WO
89/01028, o cualquiera de las referencias mencionadas.
La célula huésped transformada o transferida
anteriormente descrita es luego cultivada en un medio nutritivo
adecuado bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína
dependiente de la vitamina K después de lo cual todo o parte del
péptido resultante puede ser recuperada del cultivo. El medio usado
para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional
adecuado para crecer las células huéspedes, tal como medios mínimos
o complejos que contienen suplementos apropiados. Los medios
adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden
ser preparados según recetas publicadas (p. ej. en catálogos de la
Colección Americana de Cultivos Tipo). La proteína dependiente de
la vitamina K producida por las células puede luego ser recuperada
del medio de cultivo por procedimientos convencionales incluyendo
la separación de las células huéspedes del medio por centrifugación
o filtración, la precipitación de los componentes proteináceos del
sobrenadante o filtro mediante una sal, p. ej. sulfato de amonio,
purificación por una variedad de procedimientos cromatográficos, p.
ej. cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
gelfiltración, cromatografía de afinidad, o similar, dependiente en
el tipo de polipéptido en cuestión.
Para la preparación de FVII recombinante humano
o variantes de los mismos, se usa una secuencia de ADN de FVII de
tipo salvaje clonada. Esta secuencia puede ser modificada para
codificar la proteína FVII deseada o variantes de la misma. La
secuencia es entonces insertada en un vector de expresión, que es
sucesivamente transformado o transfectado en células huéspedes. Las
células eucarióticas mayores, en particular las células mamíferas
cultivadas, son preferidas como células huéspedes. Son conocidas
las secuencias completas de nucleótidos y de aminoácidos para FVII
humano. Veáse U.S. Pat. Nº. 4,784,950, que está incorporada aquí
como referencia, donde se describe la clonación y expresión de FVII
recombinante humano. La secuencia de FVII bovina está descrita en
Takeya et al., J. Biol. Chem,
263:14868-14872 (1988), que está incorporada aquí
como referencia.
Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos
pueden ser realizadas por una variedad de técnicas. La modificación
de la secuencia de ADN puede hacerse por mutagénesis sitio
específica. Las técnicas para mutagénesis sitio específica se
conocen bien en la técnica y están descritas por, por ejemplo,
Zoller y Smith (ADN 3:479-488: 1984). Así, usando
las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de FVII, uno puede
introducir las alteraciones a elección.
Las secuencias de ADN para el uso en la presente
invención normalmente codifican un péptido prepro en el terminal
amino de la proteína FVII para obtener un procesamiento apropiado
postraduccional (p. ej. gamma- carboxilación de residuos de ácido
glutámico) y secreción de la célula huésped. El péptido prepro
puede ser aquel de FVII u otra proteína plasmática dependiente de
la vitamina K, tal como factor IX, factor X, protrombina, proteína
C o proteína S. Como habrán apreciado expertos en la técnica, las
modificaciones adicionales pueden ser hechas en la secuencia de
aminoácidos de FVII donde estas modificaciones no perjudican
significativamente la capacidad de la proteína de actuar como un
factor de coagulación. Por ejemplo, FVII en la tríada catalítica
puede también ser modificada en el sitio de ruptura de activación
para inhibir la conversión de FVII zimógeno en su forma bicatenaria
activada, como se describe generalmente en la Pat. U.S. Nº.
5,288,629, incorporada aquí como referencia.
Dentro de la presente invención, la tecnología
de animales transgénicos puede ser empleada para producir la
proteína dependiente de la vitamina K. Se prefiere producir las
proteínas dentro de las glándulas mamarias de un mamífero femenino
huésped. La expresión en la glándula mamaria y la secreción
posterior de la proteína de interés en la leche supera muchas
dificultades encontradas en el aislamiento de proteínas de otras
fuentes. La leche se recoge fácilmente, está disponible en grandes
cantidades, y está bien caracterizada bioquímicamente. Además, las
principales proteínas de la leche están presentes en la leche a
concentraciones altas (normalmente de aproximadamente 1 a 15 g/l).
Desde un punto de vista comercial, es claramente preferible usar
como huésped una especie que tenga un gran rendimiento de leche.
Mientras que pueden usarse animales más pequeños tales como ratones
y ratas (y son preferidos en la comprobación de la fase de
principio), dentro de la presente invención se prefiere usar
mamíferos de ganado incluyendo, pero no sólo, cerdos, cabras,
ovejas y reses. Las ovejas son particularmente preferidas debido a
factores como la historia precedente de transgénesis en estas
especies, el rendimiento de la leche, el coste y la rápida
disponibilidad de equipamiento para recolectar la leche de oveja.
Véase la Publicación de la OMPI WO 88/00239 para una comparación de
factores que influyen en la elección de especies huéspedes.
Generalmente se desea seleccionar una clase de animal huésped que
haya sido criado para el uso en lechería, tal como la oveja de
Frisia del Este, o para introducir una reserva de lechería
cultivando la línea transgénica en una fecha posterior. De cualquier
manera, se sabe que se deben usar los animales con buen estado de
salud.
Para obtener una expresión en la glándula
mamaria, se utiliza un promotor de transcripción de un gen de la
proteína de la leche. Los genes de la proteína de la leche incluyen
estos genes que codifican caseínas (véase Pat. U.S. Nº. 5,304,489,
incorporada aquí como referencia),
beta-lactoglobulina,
\alpha-lactalbumina, y proteína ácida del
lactosuero. Se prefiere el promotor
beta-lactoglobulina (BLG). En el caso del gen de la
beta-lactoglobulina ovina, una región de al menos
406 bp proximales de secuencia flanqueadora 5' del gen generalmente
será usada, aunque partes más grandes de la secuencia flanqueadora
5', hasta aproximadamente 5 kbp, son preferidas, tal como el
segmento de ADN de aproximadamente 4.25 kbp que contiene el promotor
flanqueante 5' y la parte no codificante del gen de la
beta-lactoglobulina. Véase Whitelaw et al.,
Biochem J. 286, 31-39 (1992). También son adecuados
fragmentos similares de ADN del promotor de otras especies.
Otras regiones del gen de
beta-lactoglobulina pueden también ser incorporadas
en constructos, como pueden las regiones genómicas del gen que se
ha de expresar. Está generalmente aceptado en la técnica que los
constructos carentes de intrones, por ejemplo, expresan mal en
comparación con estos que contienen tales secuencias de ADN (véase
Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 85,
836-840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EEUU 88, 478-482 (1991); Whitelaw et
al., Transgenic Res. 1, 3-13 (1991); WO
89/01343; y WO 91/02318, cada uno de los cuales es incorporado aquí
por referencia). A este respecto, es generalmente preferido, donde
sea posible, usar secuencias genómicas que contienen todos o
algunos intrones nativos de un gen que codifica la proteína o
polipéptido de interés, por tanto se prefiere la inclusión
adicional de al menos algunos intrones de, p. ej, el gen de beta
lactoglobulina. Una región tal es un segmento de ADN que proporciona
para el empalme de intrones y poliadenilación de ARN de la región
3' no codificante del gen de beta-lactoglobulina
ovina. Cuando se sustituye por las secuencias 3' no codificantes
naturales de un gen, este segmento de
beta-lactoglobulina ovina puede intensificar y
estabilizar niveles de expresión de la proteína o el polipéptido de
interés. Dentro de otras formas de realización, la región que
comprende el ATG de iniciación de la secuencia que codifica la
proteína dependiente de la vitamina K es sustituida con las
secuencias correspondientes de un gen de proteína de leche
específico. Dicha sustitución proporciona un entorno de iniciación
tejido específica putativa para intensificar la expresión. Es
conveniente reemplazar la secuencia prepro entera de la proteína
dependiente de la vitamina K y secuencias 5' no codificantes con
aquellas de, por ejemplo, el gen BLG, aunque se pueden sustituir
las regiones más pequeñas.
Para la expresión de una proteína dependiente de
la vitamina K en animales transgénicos, un segmento de ADN que
codifica la proteína dependiente de la vitamina K está
operativamente enlazado a segmentos de ADN adicionales requeridos
para su expresión para producir unidades de expresión. Tales
segmentos adicionales incluyen el promotor mencionado arriba, al
igual que las secuencias que proveen a terminación de transcripción
y poliadenilación de ARNm. Las unidades de expresión incluirán
además un segmento de ADN que codifica una secuencia señal
secretora operativamente enlazada al segmento que codifica la
proteína dependiente de la vitamina K. La secuencia señal secretora
puede ser una secuencia señal secretora nativa de la proteína
dependiente de la vitamina K o puede ser de otra proteína, tal como
una proteína de la leche. Véase, por ejemplo, von Heinje, Nuc. Acids
Res. 14, 4683-4690 (1986); y Meade et al.,
Pat. U.S. Nº. 4,873,316, que son incorporados aquí por
referencia.
La construcción de unidades de expresión para el
uso en animales transgénicos es convenientemente realizada mediante
la inserción de una secuencia que codifica la proteína dependiente
de la vitamina K en un plásmido o vector fágico que contiene los
segmentos de ADN adicionales, aunque la unidad de expresión puede
ser construida esencialmente por cualquier secuencia de ligaduras.
Es particularmente conveniente proporcionar un vector que contiene
un segmento de ADN que contiene una proteína de la leche y
reemplazar la secuencia codificante para la proteína de la leche por
aquella de la proteína dependiente de la vitamina K, de ese modo
creando una fusión de gen que incluye las secuencias de control de
expresión del gen de la proteína de la leche. De cualquier manera,
la clonación de las unidades de expresión en plásmidos u otros
vectores facilita la amplificación de la proteína dependiente de la
vitamina K. La amplificación es convenientemente realizada en
células huéspedes bacterianas (p. ej. E. coli), así los
vectores normalmente incluyen un origen de replicación y un
marcador seleccionable funcional en células huéspedes
bacterianas.
La unidad de expresión es entonces introducida
en óvulos fertilizados (incluidos los embriones de fase temprana)
de las especies huésped elegidas. La introducción de ADN heterólogo
puede ser realizado por una de diferentes vías, incluida la
microinyección (p. ej. Pat. U.S. Nº. 4,873,191), infección
retrovírica (Jaenisch, Science 240, 1468-1474
(1988)) o integración dirigida usando células madre embrionarias
(ES) (revisado por Bradley et al., Bio/Technology 10,
534-539 (1992)). Los óvulos son entonces implantados
en los oviductos o úteros de hembras pseudopreñadas y dejados
desarrollarse a término. Los descendientes portadores del ADN
introducido en su línea germinal pueden pasar el ADN en su progenie
en la forma mendeliana normal, permitiendo el desarrollo de manadas
transgénicas.
Los procedimientos generales para producir
animales transgénicos son conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons
et al., Bio/Technology 6: 179-183 (1988);
Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651
(1985); Buhler et al., Bio/Technology 8:
140-143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology
9: 835-838 (1991); Krimpenfort et al.,
Bio/Technology 9: 844-847 (1991); Wall et
al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120 (1992); Pat.
U.S. Nos. 4,873,191 y 4,873,316; publicaciones de la OMPI WO
88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; y GB 87/00458, que son
incorporadas aquí por referencia. Las técnicas para introducir
secuencias de ADN extranjeras en mamíferos y sus células germinales
fueron originalmente desarrolladas en el ratón. Véase, p. ej.,
Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 77,
7380-7384 (1980); Gordon y Ruddle, Science 214,
1244-1246 (1981); Palmiter y, Brinster, Cell 41,
343-345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EEUU 82, 4438-4442 (1985); y Hogan et
al. (ibid.). Estas técnicas fueron posteriormente
adaptadas para el uso con animales más grandes, inclusivo especies
ganadas (véase p. ej., Publicaciones de la OMPI WO 88/00239, WO
90/05188, y WO 92/11757; y Simons et al., Bio/Technology 6,
179-183 (1988). Para resumir, en la vía más eficaz
usada hasta la fecha en la generación de ratones o ganado
transgénicos, varios cientos de moléculas lineales diversas del ADN
de interés son inyectados en uno de los pro-núcleos
de un ovario fertilizado según las técnicas establecidas. La
inyección de ADN en el citoplasma de un cigoto puede también ser
empleada. La producción en plantas transgénicas puede también ser
empleada. La expresión puede ser generalizada o dirigida a un
órgano particular, tal como un tubérculo. Véase, Hiatt, Nature
344:469-479 (1990); Edelbaum et al., J.
Interferon Res. 12:449-453 (1992); Sijmons et
al., Bio/Technology 8:217-221 (1990); y la
Publicación de la Oficina Europea de Patentes EP 255,378.
El FVII producido según la presente invención
puede ser purificado por cromatografía de afinidad en una columna
de anticuerpos anti-FVII. Se prefiere que la
columna de inmunoabsorción comprenda un anticuerpo monoclonal de
especificidad alta. El uso de anticuerpos
calcio-dependientes monoclonales, como se describe
por Wakabaiashi et al., J. Biol. Chem,
261:11097-11108; (1986) y Thim et al.,
Biochem. 27, 7785-7793; (1988), incorporado por
referencia aquí, es particularmente preferido. Una purificación
adicional puede ser conseguida por medios de purificación química
convencionales, tal como cromatografía en fase líquida de alto
rendimiento. Otros métodos de purificación, inclusivo la
precipitación de citrato de bario, son conocidas en la técnica, y
pueden ser aplicadas a la purificación del FVII descrito aquí
(véase, generalmente, Scopes, R., Protein Purification,
Springer-Verlag, N.Y., 1982). Se prefiere FVII
sustancialmente puro con una homogeneidad de al menos
aproximadamente el 90 al 95%, y una homogeneidad del 98 al 99% o más
es la más preferida, para usos farmacéuticos. Una vez purificado,
parcialmente o hasta homogeneidad según se desee, el FVII puede
luego ser usado terapéuticamente.
La conversión de FVII monocatenario para activar
el FVIIa bicatenario puede ser conseguida usando el factor XIIa
como se describe por Hedner y Kisiel (1983, J. Clin. Invest. 71,
1836-1841), o con otras proteasas que tienen la
especificidad de tipo tripsina (Kisiel y Fujikawa, Behring Inst.
Mitt. 73, 29-42, 1983). De forma alternativa el
FVII puede ser activado pasándolo a través de una columna de
cromatografía de intercambio iónico, tal como mono Q.RTM.
(Pharmacia Fire Chemicals) o similares (Bjoern et al., 1986,
Research Disclosures 269:564-565). Las moléculas de
FVII de la presente invención y composiciones farmacéuticas de las
mismas son particularmente útiles para la administración a seres
humanos para tratar una variedad de condiciones que implican la
coagulación intravascular.
Las proteínas dependientes de vitamina K de la
presente invención pueden utilizarse para tratar determinados tipos
de hemofilia. La hemofilia A se caracteriza por la ausencia de
factor activo VIII, factor VIIIa, o la presencia de inhibidores
para el factor VIII. La hemofilia B se caracteriza por la ausencia
de factor activo IX, factor IXa. La deficiencia de FVII, aunque
poco frecuente, responde bien a la administración de factor VII
(Bauer K. A., 1996, Haemostasis, 26:155-158, suppl.
1). La terapia de sustitución del Factor VIII es limitada debido al
desarrollo de anticuerpos inhibitorios del factor VIII de alta
titulación en algunos pacientes. De forma alternativa, el
FVIIa puede ser usado en el tratamiento de hemofilia A y B. El
factor IXa y el factor VIIIa activan el factor X. El factor VIIa
elimina la necesidad de factores IX y VIII activando el factor X
directamente, y pueden superar los problemas de deficiencias del
factor IX y VIII con pocas consecuencias inmunológicas.
La presente invención se describe con más
detalle en los ejemplos con referencia a los dibujos anexos
donde
Fig. 1 La estructura de FVII de coagulación
humana procesado correctamente, aminoácidos 1 a 406, con residuos
de Glu gamma-carboxilados (\gamma) y
glicosilación (*). La flecha en el residuo de aminoácido 152 muestra
el sitio donde el FVII monocatenario es dividido para convertirse
en el FVII bicatenario activado (FVIIa).
Fig. 2 Construcción de plásmidos para la
expresión de propéptidos libres y para la expresión de FVII humano
recombinante con propéptido conectado. Los plásmidos pLN171 y
pLN174 expresan el FVII humano con el propéptido conectado
naturalmente asociado a FVII. El plásmido pLN329 tiene un codón de
parada insertado en el ADNc codificando FVII después del propéptido
naturalmente asociado a FVII para expresar sólo el propéptido
libre.
Fig. 3 Comparación de células
CHO-K1 que expresan FVII (control) y de células que
coexpresan FVII y un propéptido de FVII libre
(pro-péptido de FVII). Los resultados son mostrados
en la expresión de FVII pg por célula al día.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle en los ejemplos siguientes que, no obstante, no debe ser
interpretados como limitación del objetivo de protección. Las
características descritas en la descripción precedente y en los
ejemplos siguientes pueden, separadamente y en cualquier
combinación de las mismas, ser esencial para realizar la invención
en diversas formas de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Un vector plásmido pLN174 para la expresión de
FVII humano ha sido descrito (Persson y Nielsen. 1996. FEBS Left.
385, 241-243). Brevemente, lleva la secuencia de
nucleótidos de ADNc que codifica el FVII humano bajo el control de
un promotor de metalotioneína de ratón para la transcripción del
ADNc insertado, y ADNc la dihidrofolato-reductasa de
ratón bajo el control de un promotor temprano SV40 para el uso como
un marcador seleccionable.
Para la construcción de un vector plásmido que
codifica una secuencia de reconocimiento de
gamma-carboxilación, se usó un vector de clonación
PBluescript II KS+ (Stratagene) que contiene ADNc que codifica el
FVII incluido su propéptido (pLN171). (Persson et al. 1997.
J. Biol. Chem. 272, 19919-19924). Una secuencia de
nucleótidos que codifica un codón de parada fue insertado en el
ADNc que codifica FVII después del propéptido de FVII por
mutagénesis mediada por PCR inversa en este vector de clonación. El
plásmido de molde fue desnaturalizado por tratamiento con NaOH
seguido de PCR con polimerasas Pwo
(Boehringer-Mannheim) y Taq
(Perkin-Elmer) con los cebadores siguientes:
La mezcla resultante fue digerida con DpnI para
digerir el ADN molde residual y Escherichia coli fueron
transformados con el producto de la PCR. Los clones fueron
seleccionados para la presencia de la mutación por secuenciación.
El ADNc de un clon correcto fue transferido como un fragmento
BamHI-EcoRI al plásmido de expresión pcDNA3
(Invitrogen). El plásmido resultante fue denominado pLN329.
Las células CHO K1 (ATCC CCI61) fueron
transfectadas con iguales cantidades de pLN174 y pLN329 con el
método Fugene6 (Boehriner-Mannheim). Los
transfectantes fueron seleccionados por la adición de metotrexato a
1 \muM y G-418 a 0,45 mg/ml. La agrupación de
transfectantes fue clonada limitando la dilución y la expresión de
FVII de los clones fue medida.
Un clon de producción alta fue subclonado de
nuevo y un clon E11 con una expresión específica de FVII de 2,4
pg/célula/día en medio de Eagle modificado con Dulbecco con el 10%
de suero fetal de ternera fue seleccionado. El clon fue adaptado
para el cultivo en suspensión libre de suero en un medio de CHO
disponible comercialmente (JRH Bioscience).
Las células adaptadas fueron propagadas
consecutivamente en cultivos de agitación continua y cuando el
número de células aumentó, el volumen aumentó gradualmente mediante
la adición de un medio nuevo.
Después de 25 días, 6 l de cultivo de agitación
continua fueron inoculados en un biorreactor de 50 litros. Las
células fueron propagadas en el biorreactor y cuando el número de
células aumentó, el volumen aumentó gradualmente mediante la
adición de un nuevo medio.
Finalmente, 50 l de cultivo de semilla fueron
inoculados en un biorreactor de producción de 500 litros que
contiene portadores Cytopore macroporosos 1 (Pharmacia), después de
lo cual las células de suspensión se volvieron inmovilizadas en los
portadores. El cultivo fue mantenido a 36ºC a un pH de
7.0-7.1 y una cepa de oxígeno disuelto (DOT) del 50%
de saturación. El volumen en el biorreactor aumentó gradualmente
por la adición de un medio nuevo cuando el número de células
aumentó. Cuando la densidad celular alcanzó aproximadamente
10-12 x 105 células/ml, la fase de producción se
inició y un cambio de medio fue realizado cada 24 horas: la
agitación fue detenida para permitir la sedimentación de los
portadores conteniendo células, y el 80% del sobrenadante del
cultivo fue luego cosechado y sustituido con un medio nuevo. El
sobrenadante del cultivo cosechado fue filtrado para eliminar
células no retenidas (es decir, células que no fueron inmovilizadas
en portadores) y detritos celulares y fue luego transferido para un
tratamiento adicional.
Durante la fase de producción las células
alcanzaron 2-3 x 10^{7} células/ml y una
graduación de 8 mg de factor VII/litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Las células CHO-K1 fueron
transfectadas con pLN174 y 1) vector pcDNA3.1+ vacío o 2)
propéptido de FVII en pcDNA3.1+, como se describe en el Ejemplo 1.
Las agrupaciones de transfectantes fueron analizadas para la
expresión de FVII y números de células. Los rendimientos de FVII por
célula por 24 horas están perfilados en la figura 3. Los resultados
muestran que la coexpresión del propéptido de FVII aumenta los
rendimientos de FVII por célula de aproximadamente 1 pg/célula/día
a 4 pg/célula/día. Los resultados se muestran en la figura 3.
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 18
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211>18
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
Claims (27)
1. Célula huésped eucariótica transfectada con
un primer polinucleótido que codifica un primer propéptido y una
proteína dependiente de la vitamina K en una primera unidad de
expresión y transfectada con un segundo polinucleótido que codifica
un segundo propéptido libre en una segunda unidad de expresión;
donde dicho primer propéptido y segundo
propéptido comprenden una secuencia de aminoácidos
independientemente seleccionada del grupo que consiste en SEC ID
NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y
18.
2. Célula huésped eucariótica según la
reivindicación 1, donde dicho primer polinucleótido codifica una
proteína dependiente de la vitamina K independientemente
seleccionada de protrombina, factor IX, FVII, factor X, proteína C,
proteína S, osteocalcina, proteína Gla 1 rica en prolina, o
proteína matricial Gla.
3. Célula huésped eucariótica según la
reivindicación 2, donde dicha proteína dependiente de la vitamina K
es FVII o una variante del mismo.
4. Célula huésped eucariótica según cualquiera
de las reivindicaciones 1-3, donde dicha célula
huésped es transfectada con otro polinucleótido que codifica una
gamma-glutamil carboxilasa en una unidad de
expresión.
5. Célula huésped eucariótica según cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, donde dicha célula
huésped es una célula mamífera.
6. Célula huésped eucariótica según la
reivindicación 5, donde dicha célula mamífera es una célula
humana.
7. Célula huésped eucariótica según la
reivindicación 5, donde dicha célula mamífera es independientemente
seleccionada de células BHK, células HEK, células COS, o células
CHO.
8. Célula huésped eucariótica según cualquiera
de las reivindicaciones 1-7, donde dichos primer y
segundo polinucleótidos son ADN.
9. Célula huésped eucariótica según cualquiera
de las reivindicaciones 1-7, donde dichos primer y
segundo polinucleótidos son ARN.
10. Método para la producción de una proteína
dependiente de la vitamina K comprendiendo a) transfección de una
célula huésped eucariótica con un primer polinucleótido que codifica
un primer propéptido y una proteína dependiente de la vitamina K en
una primera unidad de expresión y transfección con un segundo
polinucleótido que codifica un segundo propéptido libre en una
segunda unidad de expresión para producir una célula huésped
eucariótica cotransfectada; b) cultivo en un medio de cultivo
adecuado de la célula huésped eucariótica cotransfectada bajo
condiciones que permiten expresar el primer polinucleótido y el
segundo polinucleótido; y c) aislamiento de la proteína dependiente
de la vitamina K del medio;
donde dicho primer propéptido y segundo
propéptido comprenden una secuencia de aminoácidos
independientemente seleccionada del grupo que consiste en SEC ID
NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
\hbox{17 y 18.} 11. Método según la reivindicación 10, donde
dicho primer polinucleótido codifica un primer propéptido y una
proteína dependiente de la vitamina K independientemente
seleccionada de protrombina, factor IX, FVII, factor X, proteína C,
proteína S, osteocalcina, proteína Gla 1 rica en prolina, o
proteína matricial Gla.
12. Método según la reivindicación 11, donde
dicha proteína dependiente de la vitamina K es FVII o una variante
de la misma.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, donde dicha primera unidad
de expresión está presente en un primer vector y dicha segunda
unidad de expresión está presente en un segundo vector
separado.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, donde dicha primera unidad
de expresión y dicha segunda unidad de expresión están presentes en
el mismo vector.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-14, donde dicho medio de
cultivo es un medio libre de suero.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-15, donde dicha célula huésped
es una célula mamífera.
17. Método según la reivindicación 16, donde
dicha célula mamífera es una célula humana.
18. Método según la reivindicación 16, donde
dicha célula mamífera es independientemente seleccionada de células
BHK, células HEK, células COS, o células CHO.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-18, donde dicho primer y
segundo polinucleótidos son ADN.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-18, donde dicho primer y
segundo polinucleótidos son ARN.
21. Vector recombinante, donde dicho vector
comprende un primer polinucleótido que codifica un primer
propéptido y una proteína dependiente de la vitamina K en una
primera unidad de expresión y un segundo polinucleótido que
codifica un segundo propéptido libre en una segunda unidad de
expresión; donde dicho primer propéptido y segundo propéptido
comprenden una secuencia de aminoácidos independientemente
seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
22. Vector recombinante según la reivindicación
22, donde dicho primer polinucleótido codifica un primer propéptido
y una proteína dependiente de la vitamina K independientemente
seleccionada de protrombina, factor IX, FVII, factor X, proteína C,
proteína S, osteocalcina, proteína Gla 1 rica en prolina, o
proteína matricial Gla.
23. Vector recombinante según la reivindicación
23, donde dicha proteína dependiente de la vitamina K es FVII o una
variante del mismo.
24. Vector recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 22-24, donde dicho primer y
segundo polinucleótidos son ADN.
25. Vector recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 22-24, donde dichos primer y
segundo polinucleótidos son ARN.
26. Método para preparar una célula huésped
eucariótica que produce FVII o variantes del mismo comprendiendo a)
transfección de una célula huésped eucariótica con un primer
polinucleótido codificando un primer propéptido y FVII o variantes
de los mismos en una primera unidad de expresión y b) transfección
con un segundo polinucleótido que codifica un segundo propéptido
libre en una segunda unidad de expresión;
donde dicho primer propéptido y segundo
propéptido comprenden una secuencia de aminoácidos específica
independientemente seleccionada del grupo que consiste en SEC ID
NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y
18.
27. Método según la reivindicación 27, donde
dicha célula huésped es posteriormente transfectada con un
polinucleótido que codifica una gamma-glutamil
carboxilasa.
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