ES2324031T3 - Composicion de reactivos para discriminar beta-lactamasas, kit y metodo asociados. - Google Patents
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Abstract
Una composición de reactivo para discriminar la clase de Beta-lactamasa para uso con un método cromogénico con cefalosporina, que comprende un sustrato para detección de Beta-lactamasa y un inhibidor de Beta-lactamasa, en donde el inhibidor de beta-lactamasa está seleccionado del grupo consistente en una combinación de aztreonam y ácido etilendiaminotetraacético; una combinación de ácido clavulánico y ácido etilendiaminotetraacético; una combinación de aztreonam y ácido clavulánico.
Description
Composición de reactivos para discriminar
\beta-lactamasas, kit y método asociados.
La presente invención se refiere a una
composición de reactivos para discriminar
\beta-lactamasa, a un equipo o "kit" para
detectar \beta-lactamasa, y a un método para
discriminar \beta-lactamasa.
Las \beta-lactamasas, que son
una familia de enzimas que hidrolizan el anillo de
\beta-lactama contenido en una molécula de agente
antibacteriano basado en \beta-lactama, se
clasifican en las clases A, B, C y D en función de la homología de
la secuencia aminoacídica de las proteínas de enzima. La
\beta-lactamasa de espectro extendido (siglas
inglesas ESBL) es una enzima que tiene un conjunto más amplio de
sustratos (es decir, agentes antibacterianos basados en
\beta-lactama) que la enzima puede descomponer, en
comparación con la clase A convencional de
\beta-lactamasa. Estas
\beta-lactamasas desactivan la acción
antibacteriana de los agentes antibacterianos basados en
\beta-lactama. En particular, se ha reconocido a
la ESBL como causa de infecciones nosocomiales, y es considerada un
grave problema. La administración de agentes antibacterianos basados
en \beta-lactamas contra bacterias que han
desarrollado resistencia a agentes antibacterianos basados en
\beta-lactamas no sólo constituye una cura
infructuosa, sino que podría conducir también a la diseminación de
nuevas bacterias resistentes. Por tanto, es necesario detectar las
\beta-lactamasas de manera rápida y precisa para
establecer dicha cura.
Los métodos que se emplean actualmente para
detectar las \beta-lactamasas se dividen a grandes
rasgos en los cuatro métodos siguientes: (1) método cromogénico de
cefalosporina, (2) método acidimétrico, (3) método yodimétrico, y
(4) método UV. Además, se puede utilizar un método de cultivo para
comparar las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC). Para los
productos comercialmente disponibles destinados a la detección de
\beta-lactamasas son fundamentales: un producto
capaz de indicar si está presente o ausente
\beta-lactamasa mediante el método cromogénico con
cefalosporina, un producto capaz de detectar las
\beta-lactamasas pertenecientes a la clase A y a
la clase C empleando el método acidi-
métrico; un producto capaz de detectar \beta-lactamasa de la clase B o ESBL empleando el método de cultivo; y similar.
métrico; un producto capaz de detectar \beta-lactamasa de la clase B o ESBL empleando el método de cultivo; y similar.
El método cromogénico con cefalosporina utiliza
cefalosporina, que produce un cambio de color cuando su anillo
\beta-lactámico es escindido por la aplicación de
una \beta-lactamasa a la misma. Este método
presenta la ventaja de que la sensibilidad de detección es excelente
ya que el mismo reactivo da lugar al cambio de color. Sin embargo,
los productos convencionales comercialmente disponibles que utilizan
el método cromogénico con cefalosporina emplean como sustrato para
la detección la nitrocefina (es decir, el ácido
3-[2,4-dinitroestiril]-7-(2-tienilacetamido)-3-cefem-4-carboxílico
de la publicación de Patente Japonesa no examinada (JP Kokai) Sho
48-50787). Este producto no puede reaccionar con
todas las clases de \beta-lactamasas, y no puede
distinguir las clases entre sí, aunque la detección se puede
realizar en un breve período de tiempo, es decir aproximadamente 30
minutos. Además, entre los productos basados en el método
cromogénico con cefalosporina, no se conoce convencionalmente ningún
producto que se caracterice por el empleo de nitrocefina en
combinación con un inhibidor de
\beta-lactamasa.
En el documento WO 02/24707 se describe un nuevo
compuesto capaz de detectar la ESBL, basado en el método cromogénico
con cefalosporina. Sin embargo, este documento no describe el uso
combinado de un compuesto y un inhibidor de
\beta-lactamasa particular, ni sugiere la
posibilidad de detectar otras clases de
\beta-lactamasas además de la ESBL.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una composición de reactivo para discriminar
\beta-lactamasa, un kit para detectar
\beta-lactamasa, y un método para discriminar
\beta-lactamasa, que permitan la rápida
discriminación de las \beta-lactamasas.
Los inventores de la presente invención han
hallado que el objeto antes mencionado se puede lograr mediante el
uso combinado de un sustrato particular para detección de
\beta-lactamasa y un inhibidor de
\beta-lactamasa, en donde el inhibidor de
\beta-lactamasa está seleccionado del grupo
consistente en una combinación de aztreonam y ácido
etilendiaminotetraacético; una combinación de ácido clavulánico y
ácido etilendiaminotetraacético; una combinación de aztreonam y
ácido clavulánico.
En concreto, la presente invención proporciona
una composición de reactivo para discriminar
\beta-lactamasa, para uso con un método
cromogénico con cefalosporina, que comprende un sustrato para
detección de \beta-lactamasa y un inhibidor de
\beta-lactamasa.
La presente invención proporciona también un kit
para discriminar \beta-lactamasa que comprende una
o más composiciones de reactivo para detección, seleccionadas del
grupo consistente en (a) hasta (d) que se indica a continuación:
(a) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1) o
sal fisiológicamente aceptable del mismo como un sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y
una combinación de aztreonam y ácido
etilendiaminotetraacético como un inhibidor de
\beta-lactamasa;
(b) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
o sal fisiológicamente aceptable del mismo como un sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y
una combinación de ácido clavulánico y ácido
etilendiaminotetraacético como un inhibidor de
\beta-lactamasa;
(c) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
o sal fisiológicamente aceptable del mismo como un sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y
una combinación de aztreonam y ácido clavulánico
como un inhibidor de \beta-lactamasa;
(d) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (2)
o derivado de carboxilato del mismo como un sustrato para detección
de \beta-lactamasa, y
una combinación de aztreonam y ácido
etilendiaminotetraacético como un inhibidor de
\beta-lactamasa.
La presente invención proporciona también un kit
para discriminar \beta-lactamasa que comprende una
o más composiciones de reactivo para detección seleccionadas del
grupo consistente en (f), (g), (h) e (i) que se indican a
continuación:
(f) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
o sal fisiológicamente aceptable del mismo como un sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y
aztreonam como un inhibidor de
\beta-lactamasa;
(g) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
o sal fisiológicamente aceptable del mismo como un sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y
ácido clavulánico como un inhibidor de
\beta-lactamasa;
(h) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (2)
o derivado de carboxilato del mismo como un sustrato para detección
de \beta-lactamasa, y
aztreonam como un inhibidor de
\beta-lactamasa; e
(i) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (2)
o derivado de carboxilato del mismo como un sustrato para detección
de \beta-lactamasa, y
una combinación de aztreonam y ácido clavulánico
como un inhibidor de \beta-lactamasa;
Además, la presente invención proporciona un
método para detección de \beta-lactamasa que
comprende el paso de poner en contacto una muestra líquida que
contiene una sustancia diana que se ha de analizar, con la
composición de reactivo para detectar
\beta-lactamasa antes mencionada.
Además, la presente invención proporciona un
método de discriminación de \beta-lactamasa que
comprende el paso de poner en contacto una muestra líquida que
contiene una sustancia diana que se ha de analizar, con la
composición de reactivo para detectar
\beta-lactamasa antes mencionada, contenida en una
porción porta-muestras de un kit para detectar
\beta-lactamasa.
La presente invención proporciona también un
método de discriminación de \beta-lactamasa que
comprende el paso de poner en contacto una muestra líquida que
contiene una sustancia diana que se ha de analizar, con una
composición de reactivo para detectar
\beta-lactamasa contenida en una porción
porta-muestras del kit para detectar
\beta-lactamasa antes mencionado.
La Figura 1 es una vista esquemática en
perspectiva que muestra una realización del kit para discriminar
\beta-lactamasa de acuerdo con la presente
invención.
La presente invención se basa en el método
cromogénico con cefalosporina.
Un compuesto representado por la siguiente
fórmula general (1) o sales fisiológicamente aceptables del mismo,
descrito en el documento JP Kokai Sho 48-50787, o un
compuesto representado por la siguiente fórmula general (2) o
derivados de carboxilato del mismo, descrito en el documento WO
02/24707, documentos de patente que quedan incorporados por
completo en el presente por referencia, se puede utilizar como
sustrato para detectar las \beta-lactamasas para
uso en la presente invención.
En la fórmula general (1), R es un grupo
formamida o un grupo representado por la fórmula
R^{u}CH_{2}CONH, R^{u}OCH_{2}CONH, R^{u}CONH,
R^{u}CH_{2}(NH_{2})CONH ó
R^{u}C(=NOH)CONH, en donde R^{u} es grupo tienilo, grupo
fenilo o grupo naftilo; Ar es un grupo fenilo que tiene una
sustitución con grupo ciano o grupo nitro en la posición 2-, 4-, ó
2,4-; y -X_{1}- es -S- ó -SO-.
En la fórmula general (2), R_{1} y R_{2},
que pueden ser iguales o diferentes, son cada uno átomo de
hidrógeno, grupo nitro o grupo ciano; R_{3} es un grupo alquilo
que tiene 1 a 6 átomos de carbono que puede tener un sustituyente de
grupo carboxilo; R_{4} es átomo de hidrógeno o grupo amino; y
-X_{2}- es -S- ó -SO-, siempre que R_{1} y R_{2} no
representen átomo de hidrógeno al mismo tiempo.
El compuesto representado por la fórmula general
(1), que sirve como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa puede ser preferiblemente ácido
3-[2,4-dinitroestiril]-7-(2-tienilacetamido)-3-cefem-4-carboxílico
o sales fisiológicamente aceptables del mismo.
Los compuestos preferibles representados por la
fórmula general (2) incluyen un compuesto en el cual -X_{2}- es
-S-; un compuesto en donde R_{3} es grupo metilo que puede estar
sustituido con grupo carboxilo o grupo propilo sustituido con grupo
carboxilo; un compuesto en donde R_{4} es grupo amino; y un
compuesto en el cual -X_{2}- es -S-, R_{3} es grupo metilo que
puede estar sustituido con grupo carboxilo o grupo propilo
sustituido con grupo carboxilo, y R_{4} es grupo amino.
Los siguientes compuestos y derivados de
carboxilato de los mismos son preferibles:
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,6-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(4-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dicianoestiril)-3-cefem-4-car-
boxílico,
boxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(4-cianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2-cianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)-2-(tiazol-4-il)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-car-
boxílico-1-óxido,
boxílico-1-óxido,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-metoxiiminoacetamido]-3-(4-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-metoxiiminoacetamido]-3-(2,4-dicianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-metoxiiminoacetamido]-3-(2,6-dicianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-metoxiiminoacetamido]-3-(2-cianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2,6-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(4-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2,4-dicianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-4-(4-cianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-4-(2-cianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-carboximetoxiimino-2-(tiazol-4-il)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
y
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico-1-
óxido.
óxido.
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, los siguientes compuestos y
derivados de carboxilato de los mismos son preferibles:
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(4-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(4-cianoestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-metoxiiminoacetamido]-3-(4-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
y
ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(4-nitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico.
En particular, es preferible ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico
ó ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-carboximetoxiiminoacetamido]-3-(2,4-dinitro-
estiril)-3-cefem-4-carboxílico.
estiril)-3-cefem-4-carboxílico.
Se puede emplear como un inhibidor de
\beta-lactamasa al menos uno seleccionado del
grupo consistente en ácido clavulánico o aztreonam. El agente
quelante - que es capaz de quelar ión zinc - es ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA).
En particular, es preferible que el inhibidor de
\beta-lactamasa esté seleccionado del grupo
consistente en ácido clavulánico; aztreonam; una combinación de
aztreonam y ácido etilendiaminotetraacético; una combinación de
ácido clavulánico y ácido etilendiaminotetraacético; una combinación
de aztreonam y ácido clavulánico.
Son ejemplos del uso combinado del sustrato para
detección de \beta-lactamasa y el inhibidor de
\beta-lactamasa, preferiblemente empleado en la
presente invención los siguientes:
una composición de reactivo para detección que
comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
antes mencionada o sal fisiológicamente aceptable del mismo en
calidad de sustrato para detección de
\beta-lactamasa, y al menos un inhibidor de
\beta-lactamasa seleccionado del grupo consistente
en ácido clavulánico, aztreonam, y ácido etilendiaminotetraacético;
y
una composición de reactivo para detección que
comprende un compuesto representado por la fórmula general (2)
antes mencionada o derivado de carboxilato del mismo en calidad de
sustrato para detección de \beta-lactamasa, y al
menos un inhibidor de \beta-lactamasa seleccionado
del grupo consistente en ácido clavulánico, aztreonam, y ácido
etilendiaminotetraacético.
Además, también es preferible una composición de
reactivo para detección que incluye la composición (c) antes
mencionada y además una o más composiciones seleccionadas del grupo
consistente en (f) hasta (i) que se indican a continuación:
(f) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
o sal fisiológicamente aceptable del mismo como el sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y aztreonam como el
inhibidor de \beta-actamasa;
(g) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (1)
o sal fisiológicamente aceptable del mismo como el sustrato para
detección de \beta-lactamasa, y ácido clavulánico
como el inhibidor de \beta-actamasa;
(h) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (2)
o derivado de carboxilato del mismo como el sustrato para detección
de \beta-lactamasa, y aztreonam como el inhibidor
de \beta-lactamasa; e
(i) una composición de reactivo para detección
que comprende un compuesto representado por la fórmula general (2)
o derivado de carboxilato del mismo como el sustrato para detección
de \beta-lactamasa, y una combinación de aztreonam
y ácido clavulánico como el inhibidor de
\beta-lactamasa.
\vskip1.000000\baselineskip
En la composición de reactivo para detección de
la presente invención, la proporción en masa del sustrato para
detección de \beta-lactamasa respecto al inhibidor
de \beta-actamasa puede situarse preferiblemente
en el intervalo de (1:10) a (100:1), más preferiblemente en el
intervalo de (1:1) a (50:1), y más preferiblemente en el intervalo
de (1:1) a (1:10).
La composición de reactivo para detección de la
presente invención se puede preparar en forma de una disolución,
disolviendo el sustrato para detección de
\beta-actamasa y el inhibidor de
\beta-lactamasa en un disolvente, por ejemplo
agua, disolución tampón de fosfato, dimetilsulfóxido, o una mezcla
de los mismos. De estos disolventes, es especialmente
preferiblemente una mezcla de dimetilsulfóxido y disolución tampón
de fosfato, y en este caso la proporción de mezcla no está
particularmente limitada. Para ser más específico, se pueden
disolver el sustrato para detección de
\beta-lactamasa y el inhibidor de
\beta-lactamasa en un disolvente de manera tal
que la concentración del sustrato para detección de
\beta-lactamasa puede situarse preferiblemente en
el intervalo de 0,025 a 62,5 mg/mL, más preferiblemente 1,25 a 12,5
mg/mL, y que la concentración del inhibidor de
\beta-lactamasa puede situarse preferiblemente en
el intervalo de 0,0125 a 12,5 mg/mL, más preferiblemente 1,25 a
12,5 mg/mL, obteniendo así una disolución que contiene una
composición de reactivo para detectar
\beta-lactamasa.
Es preferible usar la composición de reactivo
para detección de la presente invención ajustada para tener pH de
6,0 a 8,0. Preferiblemente se puede ajustar la composición de
reactivo para detección a pH aproximadamente 5,5 a 8,5 en caso de
que se utilice como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (1) antes mencionada. Cuando se utiliza como el
sustrato para detección de \beta-lactamasa el
compuesto representado por la fórmula general (2) antes mencionada,
la composición de reactivo para detección puede estar
preferiblemente ajustada a pH aproximadamente 6,0 a 8,0.
La disolución que contiene composición de
reactivo para detección, así preparada, puede contener además
polímeros o similares, tales como polivinilpirrolidona,
hidroximetilcelulosa, poli(cloruro de vinilo) y copolímero de
ácido metacrílico) en una cantidad tal que no puedan perturbar los
efectos de la presente invención. La adición de tales polímeros o
similares es ventajosa porque la disolución que contiene la
composición de reactivo para detección de la presente invención se
hace más estable. De estos polímeros es particularmente preferible
el copolímero de ácido metacrílico.
La muestra empleada en la presente invención se
puede tomar, por ejemplo, de la faringe o de la cavidad nasal de
los pacientes con una torunda de algodón y, además, de la orina,
esputo, pus y similares. La muestra se puede preparar en forma
líquida disolviendo la muestra en un disolvente tal como el agua,
disolución tampón de fosfato, disolución salina fisiológica, y
similares. Preferiblemente, se puede preparar la muestra líquida
para que tenga una concentración de bacterias de 10^{4} a
10^{10} UFC/mL.
La muestra líquida así preparada puede contener
también oligosacárido, tensioactivo, dextrinas, y similares, en
cantidades tales que no perturben los efectos de la presente
invención.
El kit para discriminar
\beta-lactamasa de la presente invención puede
encontrarse en cualquier forma, siempre que la composición de
reactivo para detección antes mencionada esté contenida en el mismo,
por ejemplo en forma de un disco, combinación de un disco y una
plancha, una placa, una tira, o similares. La forma preferiblemente
usada es la de disco.
Cuando sea necesario, el kit de la presente
invención puede incluir un líquido testigo positivo compuesto por
una disolución que contiene \beta-lactamasa y la
composición de reactivo para detección de la presente invención, y
un líquido testigo negativo compuesto por una disolución que
contiene el sustrato para detección de
\beta-lactamasa.
La Figura 1 es una vista en perspectiva
esquemática que muestra un kit para discriminar
\beta-lactamasas de acuerdo con la presente
invención, pero la presente invención no está limitada a ello.
Haciendo referencia a la Figura 1, un kit de discriminación de
acuerdo con la presente invención incluye un recipiente para
muestras 1, y un elemento base 3 que se aloja en el recipiente y
contiene diversas porciones portamuestras 2. La porción
portamuestras 2 tiene una abertura sobre la cual se añade por goteo
una muestra preparada (una muestra líquida o líquido testigo). Los
materiales para el recipiente de muestras, elemento base, y las
porciones portamuestras, que constituyen el kit de detección de la
presente invención, no están particularmente limitados. No hay
limitación para el tamaño y forma de dichas piezas.
Uno de los kits de acuerdo con la presente
invención, preferibles, es el que contiene como una composición
esencial la composición de reactivo para detección (c) antes
mencionada, y contiene además una o más composiciones de reactivo
para detección seleccionadas del grupo consistente en las
composiciones (a), (b) y (d).
También se prefiere el kit para detectar
\beta-lactamasa que contiene como una composición
esencial la composición de reactivo para detección (d), y contiene
además una o más composiciones de reactivo para detección
seleccionadas del grupo consistente en las composiciones (a), (b) y
(c).
En particular, es preferible el kit para
detectar \beta-lactamasa que contiene todas las
composiciones de reactivo para detección (a) hasta (d).
Además, se emplea preferiblemente el kit de
acuerdo con la presente invención que contiene una o más
composiciones de reactivo para detección seleccionadas del grupo
consistente en las composiciones (c) y (f) hasta (i).
Se emplea más preferiblemente el kit de acuerdo
con la presente invención que contiene como composición esencial la
composición de reactivo para detección (c), y contiene además una o
más composiciones de reactivo para detección seleccionadas del
grupo consistente en las composiciones (f), (g), (h) e (i).
También se emplea preferiblemente el kit para
detectar \beta-lactamasa de acuerdo con la
presente invención que contiene como composición esencial la
composición de reactivo para detección (h) antes mencionada, y
contiene además una o más composiciones de reactivo para detección
seleccionadas del grupo consistente en las composiciones (c), (f),
(g) e (i).
En particular, es más preferible el kit para
detectar \beta-lactamasa que contiene todas las
composiciones de reactivo para detección (c) y (f) hasta (d) antes
mencionadas.
En el kit de discriminación de la presente
invención es muy preferible que en las composiciones de reactivo
para detección (a) hasta (d) y (f) hasta (i) antes mencionadas esté
contenido como sustrato para detectar las
\beta-lactamasas ácido
3-[2,4-dinitroestiril]-7-(2-tienilacetamido)-3-cefem-4-carboxílico
o ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico
(denominado en lo sucesivo "compuesto HMRZ").
Empleando el kit de acuerdo con la presente
invención se pueden discriminar rápidamente en una operación las
\beta-lactamasas de clase A, B, C y D, y ESBL. Por
tanto, el uso del kit de acuerdo con la presente invención conducirá
a la elección de un agente antibacteriano apropiado, lo que puede
incrementar adicionalmente los efectos de la cura.
La presente invención se refiere también a un
método de discriminación de \beta-lactamasas que
comprende el paso de añadir una muestra líquida que contiene una
sustancia diana que ha de ser analizada, a una disolución que
contiene cualquiera de las composiciones de reactivo para
discriminar \beta-lactamasas, antes
mencionadas.
El método de la presente invención incluye el
paso de añadir una muestra líquida que contiene una sustancia diana
que ha de ser analizada, a la disolución que contiene la composición
de reactivo para detectar \beta-lactamasas,
preparada de la manera antes descrita. Es posible discriminar entre
positivo y negativo observando si el tono de color ha cambiado de
amarillo a rojo, o no, tras haber transcurrido un tiempo
determinado, por ejemplo aproximadamente 30 minutos, a una
temperatura predeterminada, por ejemplo a temperatura ambiente.
Además, el ensayo de actividad se puede levar a cabo también
midiendo un cambio en el tono de color a una longitud de onda
particular.
Empleando el método de la presente invención, es
posible detectar rápidamente \beta-actamasas en la
orina y esputo de pacientes con enfermedades causadas, por ejemplo,
por bacterias productoras de \beta-lactamasas, por
ejemplo infección uretral y neumonía, e infecciones nosocomiales
derivadas de Klebsiella pneumoniae y Escherichia
coli.
Se disolvieron 1,25 mg de sustrato para
detección de \beta-lactamasa y 1,25 mg de un
inhibidor de \beta-lactamasa, mostrados ambos en
la siguiente Tabla 1, en un disolvente mezcla de 0,1 mL de
dimetilsulfóxido y 0,9 mL de una disolución tampón de fosfato, con
el fin de preparar una disolución que contiene composición de
reactivo para detectar \beta-lactamasa.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla precedente,
nitrocefina indica ácido
3-[2,4-dinitroestiril]-7-(2-tienilacetamido)-3-cefem-4-carboxílico,
compuesto HMRZ indica ácido
7-[2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(1-carboxi-1-metiletoxiimino)acetamido]-3-(2,4-dinitroestiril)-3-cefem-4-carboxílico,
AZT significa aztreonam, EDTA significa ácido
etilendiaminotetraacético, y CVA significa ácido clavulánico.
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución obtenida que contiene la
composición de reactivo para detectar
\beta-lactamasa se aplicó a una microplaca de
manera que las cantidades de sustrato para detección de
\beta-lactamasa y de inhibidor de
\beta-lactamasa pudieran ser individualmente 12,5
\mug por pocillo.
\vskip1.000000\baselineskip
Empleando bacterias que no producen
\beta-lactamasa, bacterias que producen
\beta-lactamasa de clase A, bacterias que
producen \beta-lactamasa de clase B, bacterias que
producen \beta-lactamasa de clase C, y bacterias
que producen ESBLE, indicadas en la Tabla 2, se preparó cada una de
las muestras líquidas inoculando cada tipo de bacteria en una
disolución tampón de fosfato para conseguir una concentración de
10^{8} UFC/mL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó la muestra líquida en la microplaca
anteriormente preparada, en una cantidad de 50 \muL/pocillo. Las
reactividades hacia las \beta-lactamasas se
examinaron observando el cambio en el tono de color 30 minutos
después de la inoculación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, se pueden
detectar \beta-lactamasas rápida y fácilmente, con
alta sensibilidad. Además, el uso combinado de una composición de
reactivo para detección particular y un inhibidor particular puede
posibilitar incluso la detección de la clase de
\beta-lactamasa, con un ligero error de detección
en la presente invención. La rápida discriminación de la clase puede
conducir a la elección de un agente antibacteriano apropiado, lo
que proporciona una cura muy eficaz.
Claims (15)
1. Una composición de reactivo para discriminar
la clase de \beta-lactamasa para uso con un método
cromogénico con cefalosporina, que comprende un sustrato para
detección de \beta-lactamasa y un inhibidor de
\beta-lactamasa, en donde el inhibidor de
\beta-lactamasa está seleccionado del grupo
consistente en una combinación de aztreonam y ácido
etilendiaminotetraacético; una combinación de ácido clavulánico y
ácido etilendiaminotetraacético; una combinación de aztreonam y
ácido clavulánico.
2. La composición de reactivo para discriminar
la clase de \beta-lactamasa según la
reivindicación 1, en donde el sustrato para detección de
\beta-lactamasa es un compuesto representado por
la fórmula general (1) o sal fisiológicamente aceptable del mismo,
o un compuesto representado por la fórmula general (2) o derivado de
carboxilato del mismo:
en donde R es un grupo formamida o
un grupo representado por la fórmula R^{u}CH_{2}CONH,
R^{u}OCH_{2}CONH, R^{u}CONH,
R^{u}CH_{2}(NH_{2})CONH ó
R^{u}C(=NOH)CONH, en donde R^{u} es un grupo tienilo,
grupo fenilo o grupo naftilo; Ar es un grupo fenilo que tiene una
sustitución con grupo ciano o grupo nitro en la posición 2-, 4-, ó
2,4-; y -X_{1}- es -S- ó
-SO-;
en donde R_{1} y R_{2}, que
pueden ser iguales o diferentes, son cada uno átomo de hidrógeno,
grupo nitro o grupo ciano; R_{3} es un grupo alquilo que tiene 1
a 6 átomos de carbono que puede tener un sustituyente de grupo
carboxilo; R_{4} es átomo de hidrógeno o grupo amino; y -X_{2}-
es -S- ó -SO-, siempre que R_{1} y R_{2} no representen átomo
de hidrógeno al mismo
tiempo.
3. Un kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa que comprende una o más
composiciones de reactivo para detección, seleccionadas del grupo
consistente en:
(a) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (1) o sal fisiológicamente aceptable del mismo según
la reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa una combinación de aztreonam y
ácido etilendiaminotetra-acético;
(b) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (1) o sal fisiológicamente aceptable del mismo según
la reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa una combinación de ácido
clavulánico y ácido etilendiaminotetraacético;
(c) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (1) o sal fisiológicamente aceptable del mismo según
la reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa una combinación de aztreonam y
ácido clavulánico;
(d) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (2) o derivado de carboxilato del mismo según la
reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa una combinación de aztreonam y
ácido etilendiaminotetraacético.
4. El kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 3, que
comprende como una composición esencial la composición de reactivo
para detección (c) según la reivindicación 3, y comprende además
una o más composiciones de reactivo para detección seleccionadas del
grupo consistente en las composiciones de reactivo para detección
(a), (b) y (d) según la reivindicación 3.
5. El kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 3, que
comprende como una composición esencial la composición de reactivo
para detección (d) según la reivindicación 3, y comprende además
una o más composiciones de reactivo para detección seleccionadas del
grupo consistente en las composiciones de reactivo para detección
(a), (b) y (c) según la reivindicación 3.
6. El kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 3, que
comprende todas las composiciones de reactivo para detección (a)
hasta (d) según la reivindicación 3.
7. Un kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa que comprende una o más
composiciones de reactivo para detección, seleccionadas del grupo
consistente en:
(h) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (2) o derivado de carboxilato del mismo según la
reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa aztreonam; e
(i) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (2) o derivado de carboxilato del mismo según la
reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa una combinación de aztreonam y
ácido clavulánico.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 7, que
comprende además la composición de reactivo para detección (c)
según la reivindicación 3.
9. El kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 7, que
comprende como una composición esencial la composición de reactivo
para detección (h) según la reivindicación 7, y comprende además
una o más composiciones de reactivo para detección seleccionadas del
grupo consistente en:
(f) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (1) o sal fisiológicamente aceptable del mismo según
la reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa aztreonam; y
(g) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (1) o sal fisiológicamente aceptable del mismo según
la reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa ácido clavulánico; e
(i) una composición de reactivo para detección
que comprende como un sustrato para detección de
\beta-lactamasa el compuesto representado por la
fórmula general (2) o derivado de carboxilato del mismo según la
reivindicación 2, y como un inhibidor de
\beta-lactamasa una combinación de aztreonam y
ácido clavulánico;
\vskip1.000000\baselineskip
10. El kit para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 7, que
comprende todas las composiciones de reactivo para detección (h)
hasta (i) según la reivindicación 7 y las composiciones de reactivo
para detección (f) y (g) según la reivindicación 9.
11. Un método para discriminar la clase de
\beta-lactamasa, que comprende poner una muestra
líquida que contiene una sustancia diana cuya clase se ha de
discriminar, en contacto con la composición de reactivo para
detectar \beta-lactamasa según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2.
12. Un método para discriminar la clase de
\beta-lactamasa según la reivindicación 11, en
donde la composición de reactivo está contenida en una porción
porta-muestras de un kit para detectar
\beta-lactamasa.
13. Un método para discriminar la clase de
\beta-lactamasa, que comprende poner una muestra
líquida que contiene una sustancia diana que se ha de discriminar,
en contacto con una composición de reactivo para detectar
\beta-lactamasa contenida en una porción
porta-muestras del kit para detectar
\beta-lactamasa según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 10.
14. Uso de un sustrato para detección de
\beta-lactamasa en combinación con un inhibidor de
\beta-lactamasa seleccionado del grupo
consistente en: una combinación de aztreonam y ácido
etilendiaminotetraacético; una combinación de ácido clavulánico y
ácido etilendiaminotetraacético; una combinación de aztreonam y
ácido clavulánico para producir una composición de reactivo para
discriminar la clase de \beta-lactamasa, para uso
con un método cromogénico con cefalosporina.
\newpage
15. Uso según la reivindicación 14, en donde el
sustrato para detección de \beta-lactamasa es un
compuesto representado por la fórmula general (1) o sal
fisiológicamente aceptable del mismo, o un compuesto representado
por la fórmula general (2) o derivado de carboxilato del mismo:
en donde R es un grupo formamida o
un grupo representado por la fórmula R^{u}CH_{2}CONH,
R^{u}OCH_{2}CONH, R^{u}CONH,
R^{u}CH_{2}(NH_{2})CONH ó
R^{u}C(=NOH)CONH, en donde R^{u} es un grupo tienilo,
grupo fenilo o grupo naftilo; Ar es un grupo fenilo que tiene una
sustitución con grupo ciano o grupo nitro en la posición 2-, 4-, ó
2,4-; y -X_{1}- es -S- ó
-SO-;
en donde R_{1} y R_{2}, que
pueden ser iguales o diferentes, son cada uno átomo de hidrógeno,
grupo nitro o grupo ciano; R_{3} es un grupo alquilo que tiene 1
a 6 átomos de carbono que puede tener un sustituyente de grupo
carboxilo; R_{4} es átomo de hidrógeno o grupo amino; y -X_{2}-
es -S- ó -SO-, siempre que R_{1} y R_{2} no representen átomo
de hidrógeno al mismo
tiempo.
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