ES2324298T3 - Polipeptido conjugado fisiologicamente activo que posee una vida media in vivo prolongada. - Google Patents
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Abstract
Conjugado de proteína que comprende: i) un polipéptido fisiológicamente activo excluyendo una inmunoglobulina y un fragmento de la misma; ii) un poli(etilen glicol); y iii) una inmunoglobulina, que están enlazados covalentemente entre sí en este orden y teniendo una prolongada vida media in vivo del polipéptido fisiológicamente activo.
Description
Polipéptido conjugado fisiológicamente activo
que posee una vida media in vivo prolongada.
La presente invención hace referencia a una
proteína de acción prolongada que posee una vida media in
vivo prolongada y a una preparación de la misma.
Los polipéptidos son susceptibles a la
desnaturalización o degradación enzimática en sangre, hígado o
riñón. Dada la baja estabilidad de los polipéptidos, en la
administración de fármacos polipeptídicos a pacientes ha sido
necesaria la utilización de una frecuencia sostenida de
administración para mantener una concentración plasmática efectiva
de la sustancia activa. Además, dado que los fármacos polipeptídicos
se administran habitualmente mediante infusión, las inyecciones
frecuentes de fármacos polipeptídicos provocan molestias
considerables a los pacientes. Por ello, se han realizado diversos
estudios para desarrollar un fármaco polipeptídico que posea una
vida media circulante en sangre más prolongada, manteniendo una
eficacia farmacológica elevada del mismo. Dichos fármacos
polipeptídicos deseables deben también cumplir los requisitos de
estabilidad aumentada en suero, actividad elevada, aplicabilidad a
diversos polipéptidos y baja probabilidad de inducir una respuesta
inmune no deseada al ser inyectados en un paciente.
Uno de los métodos más ampliamente utilizados
para mejorar la estabilidad de las proteínas es la modificación
química de un polipéptido con macromoléculas de solubilidad elevada
tales como el polietilenglicol ("PEG"), el cual evita que los
polipéptidos entren en contacto con proteasas. También es bien
conocido que, cuando se une a fármacos polipeptídicos de forma
específica o no específica, el PEG aumenta la solubilidad del
fármaco polipeptídico y evita la hidrólisis del mismo,
incrementando de este modo la estabilidad en suero del fármaco
polipeptídico sin provocar respuesta inmune alguna debido a su baja
antigenicidad (Sada y otros, J. Fermentation Bioengineering,
1991, 71: 137-139). Sin embargo, dichos polipéptidos
pegilados poseen la desventaja de disminuir tanto la actividad como
el rendimiento productivo de sustancia activa a medida que aumenta
el peso molecular del PEG. En la patente U.S. nº 5.738.846 y en la
Publicación de patente internacional nº WO92/16221, se dan a
conocer, respectivamente, un interferón conjugado a dos PEG
activados y un separador de PEG que está unido a dos polipéptidos
que poseen actividades diferentes; sin embargo, no muestran ningún
efecto distintivo en términos de actividad prolongada de los
polipéptidos fisiológicamente activos in vivo.
También se ha dado a conocer que puede
prolongarse la vida media circulante de un factor estimulador de
colonias de granulocitos ("G-CSF") humano
recombinante uniéndolo covalentemente a albúmina mediante un PEG
hetero-bifuncional (Kinstler y otros,
Pharmaceutical Research, 1995, 12(12):
1883-1888). Sin embargo, la estabilidad del
G-CSF-PEG-albúmina
modificado es solamente 4 veces superior a la del
G-CSF auténtico y, por ello, todavía no se ha
introducido en la práctica.
En otro enfoque para incrementar la estabilidad
in vivo de polipéptidos fisiológicamente activos, se produce
un polipéptido activo fusionado con una proteína estable en un
transformante utilizando técnicas recombinantes. Por ejemplo, se
sabe que la albúmina es una de las proteínas más efectivas para
incrementar la estabilidad de polipéptidos fusionados a la misma y
se han dado a conocer diversas proteínas fusionadas de este tipo
(Publicaciones de patente internacional números WO93/15199 y
WO93/15200, y Publicación de patente europea nº 413.622). Sin
embargo, una proteína de fusión unida a la albúmina todavía presenta
el problema de una actividad reducida.
La Patente U.S nº 5.045.312 da a conocer un
método para conjugar hormona de crecimiento con albúmina sérica
bovina o inmunoglobulina de ratón utilizando un agente reticulante
tal como carbodiimida, glutaraldehído, ácido clorhídrico etc., para
incrementar la actividad de la hormona de crecimiento. Sin embargo,
este método está dirigido exclusivamente a incrementar la actividad
de una hormona de crecimiento diana. Además, la utilización de
compuestos químicos tales como la carbodiimida, glutaraldehído,
ácido clorhídrico etc. como agentes reticulantes es desventajosa
debido a su potencial toxicidad e inespecificidad de reacción.
Se ha dado a conocer que las inmunoglobulinas
son capaces de actuar como anticuerpos mostrando citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad
dependiente de complemento (CDC), y que las cadenas de azúcares
juegan un papel importante en la ADCC y la CDC (Burton D., Molec.
Immun. 22, 161-206, 1985). A pesar de la
ausencia de cadenas de azúcares, las inmunoglobulinas aglicosiladas
poseen una vida media similar a la de las inmunoglobulinas
glicosiladas, sin embargo, su afinidad para un complemento o
receptor disminuye entre 10 y 1000 veces debido a la deglicosilación
(Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411,
1993; Morrison S., J. Immunol. 143,
2595-2601, 1989).
Aunque ha habido diversos intentos de combinar
un polipéptido fisiológicamente activo con diversas macromoléculas,
todos han fracasado en cuanto a aumentar simultáneamente la
estabilidad y la actividad.
Como método mejorado para incrementar la
estabilidad de un polipéptido activo manteniendo simultáneamente la
actividad in vivo del mismo, la presente invención da a
conocer un conjugado de proteína que comprende un
poli-
péptido fisiológicamente activo, polietilenglicol e inmunoglobulina, los cuales se entrelazan covalentemente entre sí.
péptido fisiológicamente activo, polietilenglicol e inmunoglobulina, los cuales se entrelazan covalentemente entre sí.
Por consiguiente, un objetivo principal de la
presente invención es dar a conocer un conjugado de proteína que
posee una vida media in vivo prolongada, de un polipéptido
fisiológicamente activo, sin inducir respuesta inmune en un
paciente, a la vez que se minimiza la reducción de la actividad del
polipéptido.
Otro objetivo de la presente invención es dar a
conocer un método para preparar un conjugado de proteína que
comprende un polipéptido fisiológicamente activo, un
polietilenglicol y una inmunoglobulina, los cuales se entrelazan
covalentemente.
Un objetivo adicional de la presente invención
es dar a conocer una composición farmacéutica que comprende dichos
polipéptidos fisiológicamente activos que poseen una vida media
in vivo prolongada.
Otro objetivo adicional de la presente invención
es dar a conocer un método para aumentar la estabilidad in
vivo y prolongar la vida media circulante de un polipéptido
fisiológicamente activo, sin sacrificar la actividad del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anteriores y otros objetivos y
características de la presente invención serán más evidentes a
partir de la descripción siguiente de la presente invención, en
conjunción con los dibujos acompañantes, que muestran
respectivamente:
Figura 1: Cromatograma de conjugados
hGH-PEG-IgG;
Figura 2: Resultados de la
SDS-PAGE ("electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato sódico") de los conjugados
hGH-PEG-IgG;
Figura 3: Resultados de la
SDS-PAGE de los conjugados
Interferón-PEG-IgG;
Figura 4: Resultados de la
SDS-PAGE de los conjugados
hGH-PEG-IgG antes y después del
tratamiento con DDT;
Figura 5: Cromatograma HPLC ("cromatografía
líquida de alta eficacia") de fase inversa de un conjugado IFN
\alpha-PEG-IgG;
Figura 6: Espectro de masas de conjugados
hGH-PEG-IgG;
Figura 7: Gráfico farmacocinético que muestra
que los conjugados hGH-PEG-IgG
poseen estabilidades en suero superiores al complejo
PEG-hGH;
Figura 8: Gráfico farmacocinético que muestra
que los conjugados
eritropoyetina-PEG-IgG poseen una
vida media circulante aumentada en comparación con la
eritropoyetina libre o la eritropoyetina estabilizada mediante
hiper-glicosilación;
Figura 9: Espectro de masas de la IgG
aglicosilada (AG IgG);
Figura 10: Gráfico farmacocinético que muestra
que el conjugado IFN \alpha-PEG-AG
IgG posee una estabilidad en sangre aumentada en comparación con el
IFN \alpha natural y mantiene su actividad a pesar de la ausencia
de la cadena de azúcar;
Figura 11: Gráfico farmacocinético que muestra
que el conjugado EPO-PEG-AG IgG
posee una estabilidad en sangre aumentada en comparación con la EPO
natural o de tipo salvaje y mantiene su actividad a pesar de la
ausencia de la cadena de azúcar;
Figura 12: Gráfico farmacocinético que muestra
que los conjugados
Fab'-S-PEG-N-IgG
y
Fab'-N-PEG-N-IgG
poseen una vida media circulante aumentada en comparación con el
Fab' natural y el complejo
Fab'-S-PEG40K;
Figura 13: Gráfico que muestra las actividades
in vivo de Fab', del complejo
Fab'-S-PEG 40K, del conjugado
Fab'-S-PEG-N-IgG
y del conjugado
Fab'-N-PEG-N-IgG;
Figura 14: Actividad in vivo de los
conjugados hGH-PEG-IgG basada en el
cambio de peso dependiente del tiempo de ratas tras la inyección de
vehículo solo (30 \mug/día; grupo 1), hGH natural (30 \mug/día;
grupo 2), hGH-PEG (30 \mug/día; grupo 3),
conjugado hGH-PEG-IgG (30
\mug/día; grupo 4), y conjugado
hGH-PEG-IgG (10 \mug/día;
grupo
5);
5);
Figura 15: Actividad in vivo de los
conjugados
G-CSF-PEG-IgG basada
en el cambio dependiente del tiempo en el número de neutrófilos: no
tratamiento (grupo 1), inyección de vehículo solo (grupo 2),
G-CSF natural (grupo 3), PEG
20kDa-G-CSF (grupo 4) y tratamiento
con conjugado
^{17}S-G-CSF-PEG-IgG
(grupo 5); y
Figura 16: Actividad in vivo de los
conjugados EPO-PEG-IgG, basada en el
cambio dependiente del tiempo, en el valor de hematocrito:
inyección de disolvente solo (grupo 1), EPO natural (grupo 2), EPO
altamente glicosilada (grupo 3) y tratamiento con conjugado
EPO-PEG-IgG (grupo 4).
El término "polipéptido fisiológicamente
activo" tal como se utiliza en la presente invención hace
referencia a cualquier polipéptido o proteína que posee una
actividad biológica útil cuando se administra a un mamífero
incluyendo el hombre, siendo intercambiable con el térmico
"proteína activa fisiológicamente", "proteína activa",
"polipéptido activo" o "fármaco peptídico".
El término "conjugado de proteína" o
"conjugado" hace referencia a un compuesto que comprende un
polipéptido fisiológicamente activo, un polímero no peptídico y una
inmunoglobulina los cuales están entrelazados covalentemente entre
sí de acuerdo con la presente invención.
El término "complejo", a diferencia del
término "conjugado", se utiliza en la presente invención para
referirse a aquellos compuestos que comprenden solo dos componentes
seleccionados entre polipéptido fisiológicamente activo,
inmunoglobulina y polímero no peptídico.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se da a conocer un conjugado de proteína que comprende
i) un polipéptido fisiológicamente activo, ii) un polietilenglicol,
y iii) una inmunoglobulina, los cuales se enlazan covalentemente
entre sí, y que posee una vida media in vivo prolongada del
polipéptido fisiológicamente activo.
Por ejemplo, el conjugado de proteína de la
presente invención puede comprender al menos una unidad estructural
de [polipéptido activo/polietilenglicol/inmunoglobulina], en la cual
todos los componentes están entrelazados covalentemente entre sí de
forma lineal. El polietilenglicol puede poseer dos grupos reactivos
en ambos extremos, a través de los cuales el polímero se enlaza
covalentemente al polipéptido fisiológicamente activo y a la
inmunoglobulina, respectivamente. En una realización preferente,
pueden enlazarse covalentemente dos complejos del polipéptido
fisiológicamente activo y polietilenglicol a una
inmunoglobulina.
La relación molar entre polipéptido
fisiológicamente activo e inmunoglobulina puede oscilar entre 1:1 y
10:1, preferentemente entre 1:1 y 4:1.
Como polietilenglicol puede utilizarse un solo
tipo de polímero así como una combinación de diferentes tipos de
polímeros.
En el conjugado de proteína de la presente
invención, los lugares de unión adecuados de la inmunoglobulina
pueden incluir un grupo funcional libre de un residuo de aminoácido
en la región variable o la región constante de la inmunoglobulina.
Los lugares adecuados de la inmunoglobulina para la unión covalente
con el polietilenglicol o el polipéptido activo pueden incluir un
grupo aminoterminal dentro de la región variable, grupo amino de un
residuo lisina o de un residuo histidina, y un grupo SH libre de
cisteína, y el lugar adecuado del polietilenglicol es un grupo
reactivo terminal.
La inmunoglobulina puede ser seleccionada del
grupo formado por IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, una combinación de las
mismas y todos los subtipos de IgG tales como IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4. Para no inducir respuesta inmune en un paciente, la
inmunoglobulina es preferentemente una inmunoglobulina humana.
Como componente que constituye el conjugado de
proteína de la presente invención, la inmunoglobulina puede ser una
inmunoglobulina natural aislada a partir de la sangre o una
inmunoglobulina recombinante preparada mediante ingeniería
genética. También puede utilizarse en la presente invención
cualquier inmunoglobulina modificada con sustitución, deleción o
adición de residuos de aminoácido en diversos lugares de la misma,
así como cualquier derivado hiperglicosilado, hipoglicosilado o
aglicosilado de la misma, en tanto en cuanto dicha inmunoglobulina
o derivado sea substancialmente equivalente a una inmunoglobulina
natural en términos de función, estructura y estabilidad de la
misma. El incremento o disminución del grado de glicosilación o
deglicosilación puede realizarse mediante cualquiera de los métodos
convencionales tales como métodos químicos, enzimáticos o
biotecnológicos. Los residuos de aminoácido números 214 a 238, 297 a
299, 318 a 322 y 327 a 331 de una inmunoglobulina G, que son
conocidos como lugares importantes para la unión, pueden utilizarse
como lugares adecuados para la modificación.
Un polietilenglicol adecuado posee un grupo
reactivo seleccionado del grupo formado por derivados aldehído,
aldehído propiónico, butil aldehído, maleimida y succinimida. El
derivado succinimida puede seleccionarse del grupo formado por
succinimidil propionato, succinimidil carboximetilo,
hidroxisuccinimidilo y succinimidil carbonato. Un polietilenglicol
que posea grupos aldehído en ambos extremos es efectivo para
minimizar la unión no específica, de tal modo que se une el
polietilenglicol con un polipéptido fisiológicamente activo y una
inmunoglobulina en cada uno de los extremos del polímero,
respectivamente. Un conjugado de proteína producido mediante la
alquilación reductiva de un grupo aldehído es más estable que el
unido a través de un enlace amida.
Los grupos reactivos en ambos extremos del
polietilenglicol pueden se idénticos o diferentes entre sí. Por
ejemplo, un polietilenglicol puede poseer un grupo maleimida en un
extremo y un grupo maleimida, un grupo aldehído o un grupo aldehído
propiónico en el otro extremo. Para preparar el conjugado de
proteína de la presente invención pueden utilizarse productos
disponibles comercialmente o pueden convertirse adicionalmente los
grupos hidroxilo terminales del PEG comercial a otros grupos
reactivos antes de la reacción de enlace.
El polietilenglicol puede servir como separador
que enlaza covalentemente terminal amino, el residuo lisina,
residuo histidina o residuo cisteina respectivamente de la
inmunoglobulina y uno de los grupos reactivos del polipéptido
fisiológicamente activo.
Agentes reticulantes previamente dados a conocer
para combinar dos polipéptidos mediante clonación genética, tales
como los oligopéptidos, incrementan la posibilidad de una respuesta
inmune no deseada y limitan el lugar de unión al extremo
N-terminal o C-terminal de los
polipéptidos. Por tanto, una ventaja de la utilización de un
polietilenglicol sobre los oligopéptidos reside en la reducción de
la toxicidad y la inmunogenicidad. Otra ventaja es su amplia
aplicabilidad debida a la diversidad de lugares de unión.
Cuando se utilizan como agente reticulante,
compuestos químicos pequeños tales como la carbodiimida y el
glutaraldehído pueden dar lugar a la desnaturalización de los
polipéptidos unidos a través de ellos, o pueden obstruir una unión
y purificación controladas del compuesto resultante. Contrariamente
a dichos compuestos químicos, el conjugado de proteína de la
presente invención, que comprende un polietilenglicol, es ventajoso
en términos de facilidad de control de la unión, purificación de
los conjugados resultantes y minimización de la reacción de enlace
inespecífica.
El conjugado de proteína de la presente
invención muestra una vida media in vivo prolongada y una
actividad remarcablemente superior a la de un complejo
polipéptido-PEG o un conjugado
polipéptido-PEG-albúmina. De acuerdo
con el análisis farmacocinético, la vida media de un conjugado
hGH-PEG-IgG de la presente invención
fue aproximadamente trece veces superior a la de la hGH natural,
mientras que el complejo hGH-PEG y el conjugado
hGH-PEG-albúmina muestran vidas
medias siete y cinco veces superiores a la proteína natural,
respectivamente (ver Ejemplo de prueba 2, Tabla 3). Se obtuvieron
resultados similares en pruebas utilizando G-CSF,
^{17}S-G-CSF, interferones o EPO
en lugar de hGH. En comparación con complejos polipeptídicos activos
modificados sólo con PEG o con complejos
PEG-albúmina, el conjugado de proteína de la
presente invención muestra un incremento considerable tanto en el
tiempo medio de retención ("MRT") como en la vida media sérica,
los cuales multiplican por un factor de 2\sim70 a los de los
complejos convencionales (ver Ejemplo de prueba 2, Tablas 4 a 7).
Además, los conjugados
Fab'-PEG-IgG de la presente
invención, es decir los conjugados
Fab'-S-PEG-N-IgG
y
Fab'-N-PEG-N-IgG
en los que se enlaza un complejo IgG-PEG a un
grupo-SH adyacente al extremo
C-terminal de Fab' o al extremo
N-terminal de Fab', respectivamente, muestran vidas
medias de dos a tres veces superiores a la del complejo
Fab'-S-PEG 40K (ver Ejemplo de
prueba 3 y Figura 12).
Además, los conjugados de proteínas preparados
empleando una inmunoglobulina aglicosilada muestran vidas medias en
sangre y actividades in vitro similares a las de los
conjugados de proteínas correspondientes que comprenden
inmunoglobulinas glicosiladas (ver Tablas 4, 7 y 9 y Figuras 10 y
11).
Los resultados de los análisis farmacocinéticos
muestran que los conjugados de proteínas de la presente invención
aplicados a diversos polipéptidos incluyendo hGH, interferón, EPO,
G-CSF o su derivado, y un fragmento de antígeno
muestran unas características de comportamiento excelentes en
términos de vida media en sangre y MRT y, por tanto, pueden
utilizarse ventajosamente en la preparación de una formulación de
fármaco polipeptídico que posee una vida media in vivo
prolongada.
Además, de acuerdo con los pruebas in
vivo utilizando modelos animales, el conjugado
hGH-PEG-IgG de la presente
invención muestra una excelente actividad in vivo.
Específicamente, el efecto generado administrando el conjugado
hGH-PEG-IgG una vez cada 6 días en
una cantidad correspondiente a una tercera parte de la dosis de
péptido natural es igual o mejor que la administración diaria del
péptido natural, lo cual significa que la actividad in vivo
del conjugado hGH-PEG-IgG es más de
3 veces superior a la del péptido natural (ver Figura 14).
El conjugado derivado de
^{17}S-G-CSF-PEG-IgG
de la presente invención muestra una actividad in vivo 3
veces superior a la del complejo
G-CSF-PEG 20kDa, y, cuando se
administra una vez cada 5 días, genera un efecto 2 veces superior
en la recuperación de neutrófilos que la misma cantidad de
G-CSF natural administrado diariamente (figura 15).
Además, el conjugado EPO-PEG-IgG de
la presente invención induce un incremento mayor y más rápido del
nivel de hematocrito que la EPO natural y la EPO altamente
glicosilada, y mantiene dicha actividad in vivo elevada
durante un largo período de tiempo (Figura 16).
Estos resultados muestran que el conjugado de
proteína de la presente invención incrementa significativamente la
vida media en sangre y la actividad in vivo de un polipéptido
fisiológicamente activo a la vez que supera el problema de los
péptidos naturales que requieren una administración frecuente.
Como clases, a título de ejemplo, de
polipéptidos fisiológicamente activos se incluyen los siguientes
polipéptidos, muteínas y otros análogos de los mismos: hormona,
citoquina, enzima, anticuerpo, factor de crecimiento, factor
regulador de la trascripción, factor sanguíneo, vacuna, proteína
estructural, proteína ligando y receptor.
Como ejemplos específicos de polipéptidos
fisiológicamente activos adecuados para preparar el conjugado de
proteína de la presente invención se incluyen hormona de crecimiento
humana, hormona liberadora de hormona de crecimiento, péptido
liberador de hormona de crecimiento, interferones (por ejemplo
interferones \alpha, \beta, y \gamma), factor estimulador de
colonias, interleuquinas (por ejemplo
interleuquina-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9,
-10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22,
-23, -24, -25, -26, -27, -28, -29 y -30), glucocerebrosidasa,
factor activador de macrófagos, péptido macrofágico, factor celular
B, factor celular T, proteína A, factor supresor de alergia,
glicoproteína de necrosis celular, inmunotoxina, linfotoxina,
factor de necrosis tumoral, factor inhibidor tumoral, factor
transformador del crecimiento, alfa-1 antitripsina,
albúmina, apolipoproteína E, eritropoyetina, eritropoyetina
hiperglicosilada, factor VII, factor VIII, factor IX, activador del
plasminógeno, uroquinasa, estreptoquinasa, proteína C, proteína C
reactiva, inhibidor de la renina, inhibidor de la colagenasa,
superóxido dismutasa, leptina, factor de crecimiento derivado de
plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento
osteogénico, proteína estimuladora de la osteogénesis, calcitonina,
insulina, atriopeptina, factor inductor de cartílago, proteína
activadora del tejido conectivo, hormona foliculoestimulante,
hormona luteinizante, hormona liberadora de FSH, factor de
crecimiento nervioso, hormona paratiroidea, relaxina, secretina,
somatomedina, factor de crecimiento insulinoide, hormona
adrenocorticotrófica, glucagón, colecistoquinina, polipéptido
pancreático, péptido liberador de gastrina, factor liberador de
corticotropina, hormona estimuladora de la tiroides (tirotropina),
receptor (por ejemplo TNFR(P75) y TNFR(P55)),
antagonista de receptor (por ejemplo IL1-Ra),
antígeno de superficie celular (por ejemplo CD2, 3, 4, 5, 7, 11a,
11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45 y 69), anticuerpo
monoclonal, anticuerpo policlonal, fragmento de anticuerpo y
antígeno de vacuna derivada de virus.
El fragmento de anticuerpo hace referencia a un
fragmento de un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno específico,
por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fd y scFv, de los cuales es
preferente Fab'. El fragmento Fab está formado por el dominio
variable y el primer dominio constante (dominio C_{H}1) de las
cadenas corta y larga de un anticuerpo; el fragmento Fab' es un
fragmento Fab más varios residuos de aminoácido que contienen uno o
más residuos cisteína a partir de la región bisagra, unidos al
extremo C del dominio C_{H}1; el fragmento F(ab')2, son
dos fragmentos Fab' unidos entre sí mediante un puente disulfuro o
por una reacción química; y el fragmento Fd es la región variable y
el primer dominio constante (C_{H}1) de una cadena larga. El
fragmento scFv es una cadena polipeptídica simple formada por las
regiones variables de una cadena larga y una cadena corta unidas
entre sí mediante un enlazador peptídico.
Un polipéptido particularmente preferente es uno
seleccionado del grupo formado por hormona de crecimiento humana,
interferones (por ejemplo interferón \alpha, \beta y \gamma),
factor estimulador de colonias de granulocitos y eritropoyetina
dado que estos polipéptidos requieren una administración más
frecuente que otros para tratar o prevenir enfermedades
relevantes.
El listado de polipéptidos fisiológicamente
activos, a los cuales puede aplicarse la presente invención, no se
limita a los citados en los párrafos anteriores sino que incluye
cualquier muteína o derivado de los mismos en tanto en cuanto pueda
reconocerse la función, estructura, actividad y estabilidad de la
muteína o derivado como equivalente o superior a la de los
polipéptidos naturales.
Otro aspecto de la presente invención es dar a
conocer un método para preparar dicho conjugado de proteína, el
cual comprende las etapas de:
(a) unir covalentemente al menos un polipéptido
fisiológicamente activo a al menos una inmunoglobulina con al menos
un polietilenglicol que posee grupos reactivos en ambos extremos;
y
(b) aislar un conjugado de proteína que
comprende esencialmente el polipéptido fisiológicamente activo, la
inmunoglobulina y el polietilenglicol, que están entrelazados
covalentemente.
En la etapa (a) del método anterior, los
polipéptidos, inmunoglobulinas y polietilenglicoles puede unirse
covalentemente mediante una reacción en dos etapas o mediante una
reacción simultánea. La reacción en dos etapas (por ejemplo se une
covalentemente un polietilenglicol a un polipéptido activo o a una
inmunoglobulina y, a continuación, el complejo resultante se une
covalentemente a un polipéptido activo o a una inmunoglobulina
dando lugar a un conjugado de los mismos, en el cual el polipéptido
activo y la inmunoglobulina está unidos entre sí a través del
polietilenglicol) es ventajosa al reducir la producción de
subproductos no deseados.
Por consiguiente, la etapa (a) del método
anterior puede comprender:
(a1) unir covalentemente un extremo del
polietilenglicol con una inmunoglobulina o con un polipéptido
fisiológicamente activo;
(a2) aislar de la mezcla de reacción un complejo
que comprende el polietilenglicol unido con la inmunoglobulina o el
polipéptido fisiológicamente activo; y
(a3) unir covalentemente el extremo libre del
polietilenglicol del complejo con la inmunoglobulina o el
polipéptido fisiológicamente activo, para producir un conjugado de
proteína en el cual el polietilenglicol entrelaza covalentemente el
polipéptido fisiológicamente activo y la inmunoglobulina.
La relación molar de polipéptido
fisiológicamente activo respecto a polietilenglicol en la etapa (a1)
puede oscilar preferentemente entre 1:2,5 y 1:5 y la relación molar
de la inmunoglobulina respecto al polietilenglicol en la etapa (a1)
preferentemente entre 1:5 y 1:10: La relación molar del complejo
obtenido en la etapa (a2) respecto al polipéptido fisiológicamente
activo o la inmunoglobulina en la etapa (a3) puede oscilar entre
1:0,5 y 1:20, preferentemente entre 1:1 y 1:5.
Las etapas (a1) y (a3) pueden preferentemente
realizarse en presencia de un agente reductor, que puede
seleccionarse del grupo formado por cianoborohidruro de sodio,
borohidruro de sodio, borato de dimetilamina y borato de
piridina.
Los procedimientos para llevar a cabo las etapas
(a2) y (b) pueden basarse en métodos convencionales utilizados para
purificar proteínas, tales como cromatografía de exclusión
dimensional, cromatografía de intercambio iónico, etc. y una
combinación de los mismos, de acuerdo con el grado de pureza
requerido y las propiedades del conjugado resultante incluyendo su
peso molecular y carga eléctrica.
Aún otro aspecto de la presente invención es dar
a conocer una composición farmacéutica de un polipéptido
fisiológicamente activo que posee una vida media in vivo
prolongada en comparación con los polipéptidos no modificados, la
cual comprende el conjugado de proteína de la presente invención y
un vehículo farmacéuticamente aceptable (excipiente).
La composición farmacéutica de la presente
invención puede administrarse por diferentes vías incluyendo la
introducción oral, transdérmica, subcutánea, intravenosa e
intramuscular, siendo más preferida la inyección. La composición de
la presente invención puede formularse de manera que proporcione una
liberación rápida, mantenida o retrasada del principio activo tras
ser administrado a los pacientes, empleando cualquiera de los
procedimientos bien conocidos en la técnica. La formulación puede
ser en forma de comprimido, píldora, polvo, sobre, elixir,
suspensión, emulsión, solución, jarabe, aerosol, cápsula de gelatina
blanda y dura, solución inyectable estéril, polvo envasado estéril
y similares. Son ejemplos de vehículos, excipientes y disolventes
adecuados: lactosa, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones,
goma arábiga, alginatos, gelatina, fosfato cálcico, silicato
cálcico, polivinilpirrolidona, celulosa, metilcelulosa, celulosa
microcristalina, agua, metilhidroxibenzoatos,
propilhidroxibenzoatos, talco, estearato magnésico y aceite mineral.
La formulación puede incluir adicionalmente, cargas, agentes
antiaglutinantes, agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes
aromatizantes, emulsificadores, conservantes y similares.
La cantidad de principio activo a administrar
debe determinarse teniendo en cuenta varios factores relevantes
incluyendo el trastorno a tratar, la vía de administración escogida,
la edad, sexo y peso corporal del paciente en concreto, y la
gravedad de los síntomas del paciente, y especialmente el tipo de
principio activo. Debido a la estabilidad aumentada de un conjugado
de proteína de la presente invención, el número total y la
frecuencia de administración de la formulación de fármaco
polipeptídico que comprende el conjugado de proteína pueden
reducirse considerablemente.
La presente invención se define de forma
adicional en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos
Ejemplos, que ilustran las realizaciones preferentes de la presente
invención, se proporcionan solamente a modo ilustrativo y no están
pensados para limitar el ámbito de la invención.
Etapa
1
Se disolvió hormona de crecimiento humana (hGH,
peso molecular 22 kDa) en solución de tampón fosfato 100 mM a una
concentración de 5 mg/mL y se añadió a la solución tampón resultante
polietilenglicol conteniendo grupos aldehído en ambos extremos
(ALD-PEG-ALD, Shearwater Inc.,
EE.UU.) que posee un peso molecular de 3,4 kDa, en una cantidad
correspondiente a una relación molar hGH:PEG de 1:1, 1:2,5, 1:5,
1:10 o 1:20. Se añadió a la mezcla cianoborohidruro sódico
(NaCNBH_{3}, Sigma) a una concentración final de 20 mM como agente
reductor y se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 3 horas.
Para separar el complejo hGH-PEG en el cual el PEG
está selectivamente unido al residuo amino terminal de la hGH en una
relación molar 1:1, se sometió la mezcla de reacción a
cromatografía de exclusión dimensional Superdex^{R} (Pharmacia,
EE.UU.). El complejo hGH-PEG se eluyó y purificó de
la columna con tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) para
eliminar contaminantes tales como hGH no modificada, PEG no
reaccionado y subproductos diméricos que poseen dos moléculas de hGH
unidas a ambos extremos del PEG. El complejo
hGH-PEG purificado se concentró a 5 mg/mL. Se ha
hallado que la relación molar de hGH:PEG óptima para obtener el
mejor resultado se encuentra entre 1:2,5 y 1:5.
Etapa
2
Se disolvió inmunoglobulina G (IgG, Green Cross,
Corea) con un peso molecular de 150 kDa en solución tampón fosfato
100 mM. Para conjugar la IgG con el grupo aldehído del complejo
hGH-PEG purificado en el Ejemplo 1, se añadió el
complejo hGH-PEG a una solución tampón conteniendo
IgG en una cantidad correspondiente a una relación molar complejo
hGH-PEG:IgG de 1:1, 1:2, 1:4 o 1:8. Se añadió
NaCNBH_{3} a la mezcla a una concentración final de 20 mM como
agente reductor, y se agitó suavemente la mezcla a 4ºC durante 20
horas. Para purificar el conjugado
hGH-PEG-IgG de contaminantes tras la
reacción de conjugación, se sometió la mezcla de reacción a
cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna DEAE
(Pharmacia, EE.UU.) equilibrada con solución tampón Tris 20 mM (pH
7,5). La fase móvil se cambió de Tampón A (tampón Tris 20 mM, pH
7,5) a Tampón B (tampón Tris 20 mM con NaCl 1,0 M, pH 7,5) con un
gradiente de concentración lineal (concentración de NaCl: 0 M
\rightarrow 0,5 M). Para eliminar cantidades pequeñas de IgG no
reaccionada y hGH no modificada del conjugado
hGH-PEG-IgG eluido, se sometió la
solución de elución a cromatografía de intercambio catiónico
utilizando una columna polyCAT (PolyLC, EE.UU.) equilibrada con
acetato sódico 10 mM (pH 4,5). La fase móvil se cambió de Tampón A
(acetato sódico 10 mM, pH 4,5) a Tampón B (acetato sódico 10 mM con
NaCl 1,0 M, pH 7,5) de forma lineal (concentración de NaCl: 0 M
\rightarrow 0,5 M), lo cual dio lugar a la purificación del
conjugado hGH-PEG-IgG (Figura
1).
Se ha hallado que la relación molar óptima
complejo hGH-PEG:IgG para obtener el mejor resultado
es 1:4.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Se disolvió IgG (Green Cross, Corea) en tampón
fosfato 100 mM a una concentración de 15 mg/mL y se añadió a la
solución tampón resultante
ALD-PEG-ALD 3,4 kDa (Shearwater
Inc., EE.UU.) en una cantidad correspondiente a una relación molar
IgG:PEG de 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 o 1:20. Se añadió a la mezcla
NaCNBH_{3} a una concentración final de 20 mM como agente
reductor y se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 3 horas.
Para separar el complejo IgG-PEG en el cual el PEG
está selectivamente unido al residuo amino terminal de la IgG en una
relación molar 1:1, se sometió la mezcla de reacción a
cromatografía de exclusión dimensional Superdex^{R} (Pharmacia,
EE.UU.). El complejo IgG-PEG se eluyó y purificó de
la columna con tampón de fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) para
eliminar contaminantes tales como IgG no modificada, PEG no
reaccionado y subproductos diméricos que poseen dos moléculas de
IgG unidas a ambos extremos del PEG. El complejo
IgG-PEG purificado se concentró a 15 mg/mL. Se ha
hallado que la relación molar IgG:PEG óptima para obtener el mejor
resultado se encuentra entre 1:5 y 1:10.
Etapa
2
Para conjugar hGH (peso molecular 22 kDa) al
complejo IgG-PEG purificado en el Ejemplo 2, se hizo
reaccionar hGH disuelta en tampón fosfato 100 mM con el complejo
IgG-PEG en una relación molar de 1:1, 1:1,5, 1:3 o
1:6. Se añadió a la mezcla NaCNBH_{3} a una concentración final
de 20 mM como agente reductor y se agitó la mezcla de reacción a
4ºC durante 20 horas. La mezcla de reacción se sometió a
purificación según el mismo método descrito en la etapa 2 del
Ejemplo 1 para eliminar sustancias no reaccionadas y subproductos, y
se purificó el conjugado
IgG-PEG-hGH a partir de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó y purificó un conjugado IFN
\alpha-PEG-IgG según el mismo
método descrito en el ejemplo 1, a excepción de que se utilizó
interferón alfa 2b (IFN \alpha 2b, peso molecular 20 kDa) en lugar
de hGH y que la relación molar IFN \alpha
2b:ALD-PEG-ALD (peso molecular 3,4
kDa) fue de 1:5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó y purificó un conjugado
G-CSF-PEG-IgG según
el mismo método descrito en el Ejemplo 1, a excepción de que se
utilizó factor estimulador de colonias de granulocitos humano
(G-CSF, peso molecular 18,7 kDa) en lugar de hGH y
que la relación molar
G-CSF:ALD-PEG-ALD
(peso molecular 3,4 kDa) fue de 1:5.
Además se preparó y purificó un conjugado
derivado de
G-CSF-PEG-IgG según
el mismo método descrito anteriormente utilizando un derivado de
G-CSF
(^{17}S-G-CSF) que se obtuvo
sustituyendo el aminoácido nº 17 del G-CSF natural
por serina.
Se preparó y purificó un conjugado
EPO-PEG-IgG según el mismo método
descrito en el Ejemplo 1, a excepción de que se utilizó
eritropoyetina humana (EPO, peso molecular 35 kDa) en lugar de hGH y
que la relación molar
EPO:ALD-PEG-ALD (peso molecular 3,4
kDa) fue de 1:5.
Los conjugados
hGH-PEG-IgG se prepararon del modo
siguiente, utilizando un PEG con grupos funcionales diferentes a
los grupos aldehído en ambos extremos del mismo. Se hicieron
reaccionar 10 mg de hGH disuelta en tampón fosfato 100 mM con una
PEG con grupos succinimidil propionato (SPA) en ambos extremos
(SPA-PEG-SPA, Shearwater Inc,
EE.UU., peso molecular 3,4 kDA) en una cantidad correspondiente a
una relación molar hGH:PEG de 1:1, 1:2,5, 1:5, 1:10 o 1:20. La
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas.
Para obtener el complejo hGH-PEG, en el cual PEG
está unido selectivamente al residuo lisina de hGH con una relación
molar 1:1, se sometió la mezcla de reacción a cromatografía de
exclusión dimensional con Superdex^{R} (Pharmacia, EE.UU.). Se
eluyó y purificó el complejo hGH-PEG de la columna
con tampón fosfato potásico 10 mM (pH 6,0) para eliminar
contaminantes tales como hGH no modificada, PEG no reaccionado y
subproductos diméricos que poseen dos moléculas de hGH unidas a
ambos extremos de PEG. Se concentró el complejo
hGH-PEG purificado a una concentración de 5 mg/mL.
Se preparó un complejo hGH-PEG-IgG
utilizando el complejo hGH-PEG concentrado según el
mismo método descrito en el Ejemplo 1. Se ha hallado que la relación
molar hGH-PEG óptima para obtener el mejor resultado
se encuentra entre 1:2,5 y 1:5.
Se preparó y purificó otro conjugado
hGH-PEG-IgG según el mismo método
descrito anteriormente, a excepción de que se utilizó PEG con
grupos N-hidroxisuccinimidilo (NHS) en ambos
extremos (NHS-PEG-NHS, Shearwater
Inc., EE.UU.) en lugar de
SPA-PEG-SPA.
Se preparó y purificó un complejo
hGH-PEG según el mismo método descrito en la etapa 1
del Ejemplo 1, a excepción de que se utilizó PEG con grupos aldehído
en ambos extremos con un peso molecular de 10.000 dalton
(ALD-PEG-ALD, Shearwater Inc.,
EE.UU.). En esta ocasión, se ha hallado que la relación molar óptima
de hGH:PEG para obtener el mejor resultado se encuentra entre 1:2,5
y 1:5. El complejo hGH-PEG purificado se concentró a
una concentración de 5 mg/mL. Se preparó un conjugado
hGH-PEG-IgG utilizando el complejo
hGH-PEG concentrado según el mismo método descrito
en la etapa 2 del Ejemplo 1.
Etapa
1
Se inoculó Escherichia coli BL21/poDLHF
(nº de depósito: KCCM 10511) que expresa Fab'
anti-TNF\alpha en 100 mL de medio LB y se cultivó
durante la noche con agitación. El caldo de cultivo LB cultivado se
transfirió a un fermentador de 5L (Marubishi) y se cultivó bajo
condiciones de temperatura de 30ºC, índice de aireación 20 vvm,
velocidad de agitación 500 rpm. A medida que progresaba la
fermentación, se añadieron cantidades adecuadas de glucosa y
extracto de levadura al cultivo para suplementar la escasez de
fuentes de energía provocada por el crecimiento de los
microorganismos. Cuando la absorbancia a 600 nm del caldo de cultivo
cultivado alcanzó el valor de 80, se añadió IPTG al cultivo para
inducir la expresión proteica. Se continuó el cultivo durante 40 a
45 horas adicionales hasta que la absorbancia a 600 nm del caldo de
cultivo cultivado alcanzó un valor entre 120 y 140. El caldo de
cultivo cultivado resultante se centrifugó a 20.000 x g durante 30
minutos para obtener el sobrenadante.
Se sometió el sobrenadante al siguiente proceso
de purificación cromatográfica en tres etapas para purificar el
Fab' anti-TNF\alpha. Se cargó el sobrenadante en
una columna HiTrap Protein G (5 mL, Pharmacia, Alemania)
equilibrada con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0), y se eluyó con tampón
glicina 100 mM (pH 3,0). La fracción Fab' eluida se cargó en una
columna Superdex 200 (Pharmacia, Alemania) equilibrada con solución
salina tampón fosfato 10 mM (PBS, pH 7,3), y se eluyó con el mismo
tampón. La fracción Fab' eluida se cargó en una columna polyCAT
21x250 (PolyLC Inc. EE.UU.) y se eluyó con tampón acetato 10 mM (pH
4,5) bajo una gradiente de concentración lineal de NaCl (0,15 M
\rightarrow 0,4 M) obteniendo una fracción Fab'
anti-TNF\alpha pura.
\newpage
Etapa
2
Se disolvieron 150 mg de inmunoglobulina G (IgG,
peso molecular 150 kDa, Green Cross Inc., Corea) en 100 mM de PBS
(pH 6,0) a una concentración de 5 mg/mL y se añadió a la solución
resultante NHS-PEG-MAL (peso
molecular 3400 Da, Shearwater Inc., EE.UU.) en una cantidad
correspondiente a una relación molar IgG:PEG de 1:10. Se agitó
suavemente la mezcla de reacción a 4ºC durante 12 horas.
Tras completarse la reacción, se cambió el
tampón de reacción a PBS 20 mM (pH 6,0) para eliminar el
NHS-PEG-MAL no reaccionado. A
continuación se cargó la mezcla de reacción en una columna polyCAT
21x250 (PolyLC Inc. EE.UU.) y se eluyó con PBS 20 mM (pH 6,0)
utilizando un método de gradiente de concentración lineal
(concentración de NaCl 0,15 M \rightarrow 0,5 M) obteniendo un
complejo IgG-PEG. La IgG no reaccionada se eluyó más
tarde que el complejo IgG-PEG y se desechó.
Etapa
3
Se disolvió el Fab' purificado obtenido en la
etapa 1 en PBS 100 mM (pH 7,3) a una concentración de 2 mg/mL, y se
añadió el complejo IgG-PEG preparado en la etapa 2 a
la solución resultante en una cantidad correspondiente a una
relación molar Fab':complejo de 1:5. La mezcla de reacción se
concentró hasta una concentración de proteína de 50 mg/mL y se agitó
suavemente el concentrado a 4ºC durante 24 horas.
Tras completarse la reacción de enlazado, se
cargó la mezcla de reacción en una columna Superdex 200 (Pharmacia,
EE.UU.) equilibrada con PBS 10 mM (pH 7,3) y se eluyó con el mismo
tampón a una velocidad de flujo de 1 mL/min, obteniendo una
fracción de conjugado
Fab'-S-PEG-N-IgG.
El conjugado
Fab'-S-PEG-N-IgG
con un peso molecular elevado se eluyó tempranamente y el complejo
IgG-PEG y el Fab' no reaccionados se eluyeron más
tarde que el conjugado y se desecharon. Con el objeto de eliminar
el complejo IgG-PEG no reaccionado remanente, se
cargó la fracción de conjugado
Fab'-S-PEG-N-IgG
en una columna polyCAT 21x250 (PolyLC Inc., EE.UU.) y se eluyó con
PBS 20 mM (pH 6,0) utilizando un método de gradiente de
concentración lineal (concentración de NaCl 0,15 M \rightarrow
0,5 M). Consiguientemente, se obtuvo una fracción que contenía
conjugado
Fab'-S-PEG-N-IgG
puro, en el que el complejo IgG-PEG estaba unido al
grupo -SH adyacente al extremo C-terminal de
Fab'.
Etapa
1
Se disolvieron 40 mg del Fab' purificado
obtenido en la etapa 1 del Ejemplo 8 en PBS 100 mM (pH 6,0) a una
concentración de 5 mg/mL, y se añadió, a la solución resultante,
ButilALD-PEG-ButilALD (peso
molecular 3400 Da, Shearwater Inc., EE.UU.) en una cantidad
correspondiente a una relación molar Fab':PEG de 1:5. Se añadió a
la solución NaCNBH_{3} a una concentración final de 20 mM como
agente reductor y se agitó suavemente la mezcla de reacción a 4ºC
durante 2 horas.
Tras finalizar la reacción, se cambió el tampón
a PBS 20 mM (pH 6,0). Tras cambiar el tampón, se cargó la mezcla en
una columna polyCAT 21x250 (PolyLC Inc., EE.UU.) y se eluyó con PBS
20 mM (pH 4,5) utilizando un método de gradiente de concentración
lineal (concentración de NaCl 0,15 M \rightarrow 0,4 M) obteniendo
una fracción que contenía el complejo Fab'-PEG. El
Fab' no reaccionado se eluyó más tarde que el complejo y se
desechó.
Etapa
2
Se disolvió el complejo Fab'-PEG
purificado en la etapa 1 en PBS 100 mM (pH 6,0) a una concentración
de 10 mg/mL, y se añadió IgG (peso molecular 150 kDa, Green Cross
Inc. Corea) a la solución resultante en una cantidad
correspondiente a una relación molar complejo:IgG de 1:5. La mezcla
de reacción se concentró hasta una concentración de proteína de 50
mg/mL. Se añadió a la solución NaCNBH_{3} hasta una concentración
final de 20 mM como agente reductor y se agitó suavemente la mezcla
de reacción a 4ºC durante 24 horas.
Tras completarse la reacción de enlazado, se
cargó la mezcla de reacción en una columna Superdex 200 (Pharmacia,
EE.UU.) equilibrada con PBS 10 mM (pH 7,3) y se eluyó con el mismo
tampón a una velocidad de flujo de 1 mL/min obteniendo una fracción
que contenía el conjugado
Fab'-N-PEG-N-IgG.
El conjugado
Fab'-N-PEG-N-IgG
con un peso molecular elevado se eluyó tempranamente y la
inmunoglobulina y el complejo Fab'-PEG no
reaccionados se eluyeron más tarde que el conjugado y se
desecharon. Con el objeto de eliminar la inmunoglobulina no
reaccionada remanente, se cargó la fracción de conjugado
Fab'-N-PEG-N-IgG
en una columna polyCAT 21x250 (PolyLC Inc., EE.UU.) y se eluyó con
PBS 20 mM (pH 6,0) utilizando un método de gradiente de
concentración lineal (concentración de NaCl: 0,15 M \rightarrow
0,5 M). Consiguientemente, se obtuvo una fracción que contenía
conjugado
Fab'-N-PEG-N-IgG
puro, en el que el complejo IgG-PEG estaba unido al
extremo N-terminal de Fab'.
Se disolvieron 200 mg de inmunoglobulina G
(Green Cross Inc., Corea) en tampón fosfato 100 mM (pH 7,5) a una
concentración de 2 mg/mL, y se añadieron a la misma 300 U/mg de una
aglicosilasa, PNGasa F (NEB Inc., Reino Unido). Se hizo reaccionar
la mezcla a 37ºC durante 24 horas con agitación suave. Al finalizar
la reacción, se cargó la mezcla de reacción en una columna SP
sefarosa FF (Pharmacia, Alemania) y se eluyó con tampón acetato 10
mM (pH 4,5) utilizando un método de gradiente de concentración
lineal de NaCl 1M (concentración de NaCl: 0,1 M \rightarrow 0,6
M) obteniendo una fracción de IgG aglicosilada que se eluyó más
tarde que la IgG natural.
El conjugado IFN
\alpha-PEG-AG IgG se preparó del
modo siguiente, conjugando la IgG aglicosilada (AG IgG) preparada
en el Ejemplo 10 con un complejo IFN \alpha-PEG
preparado en el Ejemplo 3.
Se disolvió AG IgG (peso molecular
aproximadamente 147 kDa) en tampón fosfato 10 mM. Se añadió el
complejo IFN \alpha-PEG al tampón con AG IgG en
una cantidad correspondiente a una relación molar complejo IFN
\alpha-PEG:AG IgG de 1:1, 1:2, 1:4 o 1:8. La
mezcla resultante se ajustó con tampón fosfato 100 mM y se añadió a
la solución NaCNBH_{3} hasta una concentración final de 20 mM
como agente reductor. Se agitó suavemente la mezcla de reacción a
4ºC durante 20 horas. Se ha hallado que la relación molar complejo
IFN \alpha-PEG:AG IgG óptima para obtener el
mejor resultado es 1:2.
Para purificar el conjugado IFN
\alpha-PEG-AG IgG de contaminantes
tras la reacción de conjugación, la mezcla de reacción se sometió a
cromatografía de exclusión dimensional. Se cargó la mezcla de
reacción en una columna Superdex^{R} (Pharmacia, EE.UU.) y se
eluyó con PBS 10 mM (pH 7,3) a una velocidad de flujo de 2,5 mL/min
obteniendo una fracción de conjugado IFN
\alpha-PEG-AG IgG y eliminando
también contaminantes tales como AG IgG y complejo IFN
\alpha-PEG no reaccionados. La fracción de
conjugado IFN \alpha-PEG-AG IgG
obtenida de este modo se sometió adicionalmente a cromatografía de
intercambio catiónico para eliminar pequeñas cantidades de AG IgG y
complejo IFN \alpha-PEG no reaccionados. Se cargó
la fracción en una columna PolyCAT LP (PolyLC, EE.UU.) equilibrada
con tampón acetato sódico 10 mM (pH 4,5) y se eluyó con tampón
acetato sódico 10 mM (pH 4,5) con NaCl 1,0 M utilizando un método
de gradiente de concentración lineal (concentración de NaCl: 0 M
\rightarrow 0,6 M) obteniendo una fracción de conjugado IFN
\alpha-PEG-AG IgG. La fracción así
obtenida se sometió adicionalmente a una cromatografía de
intercambio aniónico. Se cargó la fracción en una columna PolyWax
LP (PolyLC Inc., EE.UU.) equilibrada con tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y se eluyó con tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) conteniendo NaCl 1,0 M
mediante un método de gradiente de concentración lineal
(concentración de NaCl: 0 M \rightarrow 0,3 M) obteniendo un
conjugado IFN \alpha-PEG-AG IgG
puro.
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 11
empleando el complejo EPO-PEG preparado en el
Ejemplo 5 y la IgG aglicosilada preparada en el ejemplo 10
obteniendo un conjugado EPO-PEG-AG
IgG.
Ejemplo comparativo
1
Se disolvieron 5 mg de hGH en tampón fosfato
potásico 100 mM (pH 6,0) obteniendo 5 ml de solución y se añadió a
la solución un metoxi-PEG-ALD
activado que posee un peso molecular de PEG de 40 kDa en una
cantidad correspondiente a una relación molar hGH:PEG de 1:4. Se
añadió a la mezcla NaCNBH_{3} a una concentración final de 20 mM
como agente reductor y se agitó gradualmente la mezcla de reacción a
4ºC durante 18 horas. A continuación se añadió a la misma
etanolamina a una concentración final de 50 mM para inactivar el PEG
no reaccionado.
Para eliminar adicionalmente el PEG no
reaccionado, se sometió la mezcla de reacción a cromatografía en
columna Sephadex^{R} G-25 (Pharmacia, EEUU). La
columna se equilibró con 2 volúmenes de columna (VC) de tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) antes de cargar la mezcla
de reacción. Se analizaron las fracciones de elución según su
absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV. La hGH
modificada con PEG que posee un peso molecular elevado se eluyó
primero, antes que el PEG no reaccionado.
La hGH modificada con PEG se purificó
adicionalmente a partir de la fracción de elución del modo
siguiente. Se equilibró una columna empaquetada con 3 mL de PolyWAX
LP (Polywax Inc., EEUU) con tampón Tris-HCl 10 mM
(pH 7,5). Se cargó en la columna la fracción de elución que contenía
la hGH modificada con PEG a una velocidad de flujo de 1 mL/min, y
se lavó la columna con 15 mL del tampón de equilibrado. Se
fraccionaron las tri- di- y mono-hGHs unidas a PEG
por orden mediante un método de gradiente de concentración salina
(concentración de NaCl: 0% \rightarrow 100%) utilizando tampón
NaCl 1M durante 30 minutos.
Para purificar adicionalmente el complejo
mono-hGH unida a PEG de la mezcla, se sometió el
efluyente de la columna a cromatografía de exclusión dimensional.
Se cargó el efluyente concentrado en una columna Superdex 200
(Pharmacia, EEUU) equilibrada con tampón fosfato sódico 10 mM y se
eluyó con la misma solución tampón a una velocidad de flujo de 1
mL/min. Se eliminaron los complejos tri-y
di-hGH unidas a PEG, que se eluyeron más
tempranamente que el complejo mono-hGH unida a PEG,
obteniéndose un complejo mono-hGH unida a PEG
purificado.
Se prepararon y purificaron según el mismo
método descrito anteriormente PEG-IFN,
PEG-derivado
^{17}S-G-CSF y
PEG-G-CSF en los cuales PEG 40 kDa
se une a los residuos amino terminales de IFN \alpha y
G-CSF respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
2
Para conjugar albúmina con el complejo
hGH-PEG obtenido en el Ejemplo 1, se hizo reaccionar
albúmina sérica humana (HSA, peso molecular aproximadamente 67 kDa)
(Green Cross, Corea) disuelta en solución tampón fosfato 10 mM con
complejo hGH-PEG en una cantidad correspondiente a
una relación molar complejo hGH-PEG:HSA de 1:1,
1:2, 1:4 o 1:8. Se concentró la mezcla de reacción a 100 mM en
tampón fosfato y se añadió a la solución NaCNBH_{3} hasta una
concentración final de 20 mM como agente reductor. Se agitó la
mezcla de reacción a 4ºC durante 20 horas. Se ha hallado que una
relación molar complejo hGH-PEG:albúmina óptima para
obtener el mejor resultado
es 1:2.
es 1:2.
Tras la reacción de conjugación, se sometió la
mezcla de reacción a cromatografía de exclusión dimensional
Superdex para eliminar los materiales de partida no reaccionados y
los subproductos. Se concentró y cargó la mezcla de reacción en la
columna a una velocidad de flujo de 2,5 mL/min utilizando acetato
sódico 10 mM (pH 4,5) obteniendo conjugado
hGH-PEG-albúmina purificado. Dado
que el conjugado hGH-PEG-albúmina
purificado aún estaba contaminado con pequeñas cantidades de
albúmina no reaccionada y dímero de hGH, se realizó adicionalmente
una cromatografía de intercambio catiónico para eliminar dichos
contaminantes. Se cargó el efluente de
hGH-PEG-albúmina en una columna
SP5PW (Waters, EE.UU.) equilibrada con acetato sódico 10 mM (pH 4,5)
y se fraccionó con acetato sódico 10 mM (pH 4,5) conteniendo NaCl
1,0M con un gradiente de concentración lineal (concentración de
NaCl: 0M \rightarrow 0,5M) recuperando
hGH-PEG-albúmina puro.
Se prepararon y purificaron según el mismo
método descrito anteriormente IFN
\alpha-PEG-albúmina,
G-CSF-PEG-albúmina
y derivado
^{17}S-G-CSF-PEG-albúmina
en los cuales la albúmina se une a IFN \alpha,
^{17}S-G-CSF y
G-CSF respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
3
El Fab' purificado obtenido en la etapa 1 del
ejemplo 8 fue colocado en un tampón de activación (20 mM PBS (pH
4,0) y 0,2 mM DTT) durante una hora para activar los grupos libres
-SH del mismo. El tampón fue cambiado a un tampón de PEGilación
(fosfato potásico 50 mM (pH 6,5)). Se añadió
Maleimida-PEG (peso molecular 40 kDa, Shearwater
Inc., USA) a la solución resultante en una cantidad que corresponde
a la proporción molar Fab': PEG de 1:10. La mezcla de reacción fue
agitada suavemente a 4ºC durante 24 horas.
Después de terminar la reacción, la mezcla de
reacción fue dispuesta en una columna Superdex 200 (Pharmacia, USA)
equilibrada con 10 mM PBS (pH 7,3), y eluida con el mismo tampón con
un caudal de 1 ml/minuto para obtener una fracción que contiene un
complejo Fab'-S-PEG 40K. El Fab' sin
reaccionar fue eluido más tarde que el complejo y descartado. A
efectos de eliminar el Fab' sin reaccionar, la fracción de complejo
Fab'-S-PEG 40K fue dispuesta en una
columna polyCAT 21x250 (PolyLC Inc., USA), y eluida con 20 mM PBS
(pH 4,5) utilizando un método de gradiente de concentración lineal
(concentración de NaCl: 0,15 M -> 0,5 M). Como consecuencia, se
obtuvo una fracción que contenía complejo
Fab'-S-PEG 40K puro en el que 40 kDa
PEG estaba enlazado al grupo -SH adyacente al
C-terminal de Fab'.
\newpage
Ejemplo de Prueba
1
Los conjugados de proteína preparados en los
ejemplos anteriores fueron analizados en cuanto a su estado de
modificación mediante SDS-PAGE utilizando un gel que
tenía un gradiente de concentración de 4 a 20% y ELISA (R & D
System, USA).
Se desarrollaron cada uno de hGH,
hGH-PEG, IFN e IFN-PEG sobre
SDS-PAGE y una mezcla con 50 mM DTT (ditiotreitol),
mientras que IgG, hGH-PEG-IgG e
IFN-PEG-IgG lo fueron sin DTT.
Las figuras 2 y 3 muestran los resultados
SDS-PAGE obtenidos para los conjugados
hGH-PEG-IgG e
IFN-PEG-IgG, respectivamente. Los
numerales indicados en el margen izquierdo son marcadores de peso
molecular (kDa).
Tal como se ha mostrado en la figura 2, el peso
molecular aparente del conjugado
hGH-PEG-IgG es aproximadamente de
170 kDa. No obstante, dado que es difícil discriminar la diferencia
en peso molecular entre los conjugados de la proteína IgG e IgG de
tipo salvaje en SDS-PAGE, el conjugado
hGH-PEG-IgG e IgG fueron reducidos
por tratamiento DTT, separados en cadenas largas y cortas y
confirmado en su estado conjugado por SDS-PAGE,
respectivamente (Figura 4).
Cuando IgG fue tratado con DTT, la cadena corta
de IgG fue separada, en primer lugar, y la cadena larga de IgG más
adelante con su peso molecular. Aparecieron bandas de conjugado
hGH-PEG-IgG tratadas con DTT en
posiciones correspondientes a pesos moleculares calculados por
añadidura del peso molecular de hGH-PEG (3,4 kDa) al
peso molecular de los fragmentos de cadena corta y cadena larga
respectivamente. El conjugado de cadena corta de
hGH-PEG-IgG formó una banda en una
posición más baja (peso molecular más reducido) que la cadena larga
del conjugado hGH-PEG-IgG cuya
banda se encontró en una posición correspondiente, a
aproximadamente, 80 kDa. De los resultados anteriores, se ha
descubierto que hGH se acopló con cadenas cortas y largas con igual
probabilidad y que IgG reacciona con hGH en una proporción molar de
1:1.
La cantidad de cada conjugado de proteína
preparado en los ejemplos anteriores fue determinada calculando el
área pico del conjugado observada en cromatografía de exclusión
dimensional (columna: Superdex, solución de elución: fosfato
potásico tampón 10 mM (pH 6,0)) y comparándola con la del control.
Después de realizar cromatografía de exclusión dimensional
utilizando hGH, IFN, G-CSF,
^{17}S-G-CSF, EPO e IgG,
precuantificados, respectivamente, se determinaron los factores de
respuesta relativa de las áreas pico. La cromatografía de exclusión
dimensional fue llevada a cabo utilizando una cantidad constante de
cada conjugado de proteína con igual situación y se determinó el
valor cuantitativo de la proteína biológicamente activa existente en
cada conjugado de proteína al restar el área pico correspondiente a
IgG del área pico de cada conjugado de proteína obtenida, tal como
se ha indicado en lo anterior.
Se llevó a cabo también análisis ELISA (R &
D System, USA) además de cromatografía. Si una parte de IgG es
conjugada de un sitio biológicamente activo de un polipéptido, el
valor obtenido por ELISA utilizando un anticuerpo específico para
el lugar biológicamente activo sería más bajo que el valor calculado
por cromatografía. En el caso del conjugado
hGH-PEG-IgG, se ha descubierto que
el valor medido por ELISA era solamente aproximadamente 30% del
valor determinado por cromatografía.
A efectos de examinar la pureza del complejo INF
\alpha-PEG-IgG obtenido en el
ejemplo 3, se llevó a cabo un HPLC de fase inversa utilizando una
columna de fase inversa (columna 259 VHP54, Vydac Inc., USA). El
complejo fue eluido con acetonitrilo mediante un método de
gradiente de concentración lineal (concentración de acetonitrilo:
40% \rightarrow 100%) bajo la presencia de 0,5% TFA y detectado en
280 nm. Tal como se puede apreciar en la figura 5, la pureza del
complejo es superior a 95%.
El conjugado de proteína obtenido en cada
ejemplo fue analizado en cuanto a su valor de absorbancia a 280 nm
durante la cromatografía de exclusión dimensional y se encontró que
cada uno de los hGH-PEG-IgG,
IFN-PEG-IgG, G-CSF y
^{17}S-G-CSF-PEG-IgG
mostraban un pico único correspondiente a un peso molecular de
170.000 a 180.000 daltons. El pico de
EPO-PEG-IgG fue observado en una
posición correspondiente a un peso molecular de 200.000 daltons.
Para determinar el peso molecular exacto de cada
conjugado de proteína, las muestras purificadas fueron analizadas
utilizando espectrometría de masas de gran velocidad
MALDI-TOF (Voyager DE-STR, Applied
Biosystems, USA). Se utilizó como matriz ácido sinapínico. Se
extendieron 0,5, \mul de cada muestra sobre una placa de cristal
y se secó en el aire. Después de verter un volumen igual de la
matriz sobre la placa de vidrio, ésta fue secada en el aire y
montada en una fuente de iones. La detección fue llevada a cabo
mediante un equipo TOF de modalidad lineal utilizando un método
positivo y se efectuó la aceleración de los iones por diferencia de
potencial total de unos 2,5 kV en una fuente de suministro de
extracción dividida utilizando un extractor retardado de iones con
un tiempo de extracción retardado de 750 nseg/1500 nseg. Los
resultados de los análisis de espectrometría de masas del conjugado
hGH-PEG-IgG se muestran en la tabla
1 y en la figura 6.
Los resultados han mostrado que la pureza del
conjugado hGH-PEG-IgG era de 90% o
superior y que el peso molecular medido era casi igual al valor
teórico. Además, el conjugado
hGH-PEG-IgG se encontraba en forma
de IgG unido al complejo hGH-PEG en una proporción
molar de 1:1.
Además, el peso molecular del AG IgG preparado
en el ejemplo 10 medido por el método MALDI-TOF era
de 147 kDa, que es inferior en 3.000 Da al de IgG de tipo salvaje
(Figura 9). Este reducido peso molecular de 3.000 Da corresponde a
la dimensión teórica de la cadena de azúcar y, de acuerdo con ello,
se llegó a la conclusión de que se había eliminado de IgG la cadena
de azúcar por completo.
La tabla 2 muestra los pesos moleculares de los
conjugados IFN \alpha-PEG-AG IgG y
EPO-PEG-AG IgG preparados en los
ejemplos 11 y 12.
Ejemplo de prueba
2
Se compararon las estabilidades in vivo y
los coeficientes farmacocinéticos de los conjugados de la proteína
IgG, proteína PEG y complejos albúmina-proteína
(grupo de pruebas) preparados en los ejemplos y los ejemplos
comparativos con los de la proteína biológicamente activa de tipo
salvaje (grupo de control). Se utilizaron 5 ratas
Sprague-Dawley (SD) para cada grupo en los
experimentos siguientes. Los ratones recibieron inyecciones
subcutáneas de 100 \mul/kg del control, complejo PEG, conjugado
albúmina-proteína y conjugado
IgG-proteína, respectivamente. Se tomaron muestras
de sangre del grupo de control a las 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 30,
48, 72 y 96 horas después de la inyección y las muestras de los
grupos de prueba a las 1, 6, 12, 24, 30, 48, 72, 96, 120, 240 y 320
horas después de la inyección. Se recogieron muestras de sangre en
un tubo dotado de recubrimiento de heparina para impedir la
coagulación de la sangre y se sometió a
micro-centrifugación de alta velocidad a 4ºC, 3.000
x g durante 30 minutos para retirar las células. La concentración de
proteína en los sueros fue medida por el método ELISA utilizando el
anticuerpo respectivo específico para cada proteína biológicamente
activa.
Los valores farmacocinéticos de hGH de tipo
salvaje, IFN, G-CSF y EPO, y conjugados de
proteínas, así como sus complejos, se muestran en las tablas 2 a 6,
en las que T_{max} significa el tiempo para alcanzar la
concentración máxima del fármaco, T_{1/2} la vida media del
fármaco en sangre y MRT (tiempo medio de permanencia), el tiempo de
retención promedio en el cuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Tal como se puede apreciar en la tabla 3 y en la
figura 7, la vida media del conjugado
hGH-PEG-IgG era de 13,9 horas lo
cual significa 13 veces superior a la de hGH de tipo salvaje y
aproximadamente el doble que la del complejo
hGH-PEG 40K (7,7 horas) preparado en el ejemplo
comparativo 1. La vida media del conjugado
hGH-PEG-albúmina en el que la
albúmina está enlazada a un extremo de PEG, no directamente a hGH,
era de 5,9 horas. Este resultado confirma que el conjugado de la
proteína de la invención muestra una duración muy superior in
vivo.
Además, en la tabla 4 y en la figura 10 los
resultados para IFN \alpha fueron similares a los de hGH, pero el
efecto de incrementar la vida media de la sangre observado en el
conjugado de proteína de la invención era mucho más elevado. Si
bien la vida media de IFN \alpha de tipo salvaje era de 1,7 horas,
la vida media del complejo 40 kDa PEG-IFN \alpha
aumentó hasta 35,8 horas y la vida media de un conjugado de IFN
\alpha-PEG-albúmina aumento a 17,1
horas. En comparación con estos valores, la vida media del conjugado
IFN \alpha-PEG-IgG aumentó
notablemente hasta 76,7 horas. Además, la vida media del conjugado
IFN \alpha-PEG-AG IgG era de 59,7
horas que es casi igual a la del conjugado IFN
\alpha-PEG-IgG. De este resultado,
se puede apreciar que la ausencia de la cadena de azúcar no afecta
la estabilidad in vivo del conju-
gado.
gado.
Tal como se ha mostrado en las tablas 5 y 6, la
duración in vivo de G-CSF y sus derivados
mostró una tendencia similar a la de hGH e IFN. La vida
media de los complejos de proteína modificada 40 kDa PEG y
conjugados de albúmina fueron más largas que las de
G-CSF de tipo salvaje y sus derivados. No obstante,
el conjugado de proteína IgG de la invención mostró una vida media
mucho más larga. Esta capacidad de IgG conjugado en incrementar la
estabilidad del medicamento en la sangre se observó también para
derivados modificados de aminoácidos. De estos resultados se puede
anticipar que el conjugado de proteína de la invención aplicado a
otras proteínas ejercería también el efecto deseado que se ha
descrito en lo anterior.
La tabla 7 y las figuras 8 y 11 muestran que el
efecto de incrementar la vida media en sangre del conjugado de
proteína de la invención es evidente para EPO que tiene una fracción
glicosilada. Es decir, la vida media en sangre de EPO de tipo
salvaje era de 9,4 horas y la de EPO altamente glicosilada con una
elevada estabilidad en sangre, es decir,
Darbepoetin-\alpha (Aranesp, Amgen, USA), era de
14,9 horas. En el caso del conjugado
EPO-PEG-IgG, la vida media en sangre
aumentó notablemente hasta 67,5 horas y la del conjugado
EPO-PEG-AG IgG aumento también
hasta 47,8 horas.
Tal como se puede apreciar por los resultados
anteriores, los conjugados de proteínas de la invención, en los que
un polipéptido fisiológico es unido de forma covalente a un polímero
no peptídico e inmunoglobulina, tiene una vida media en sangre que
es doce veces superior a la de la proteína de tipo salvaje. Además,
el efecto de incremento de la vida media en sangre del conjugado de
la proteína se mantiene todavía a un nivel similar incluso en el
caso de utilizar una inmunoglobulina aglicosilada.
Especialmente, en comparación con el complejo de
proteína modificada 40 kDa PEG que tiene la mayor duración en
sangre entre las formulaciones PEG anteriormente indicada, el
conjugado de proteína IgG de la invención muestra una duración
mucho mejor. Además, con respecto al conjugado de la proteína
acoplado con albúmina en vez de IgG, el conjugado de proteína de la
invención mostró una duración notablemente más elevada. Estos
resultados sugieren que el conjugado de proteína de la invención
puede ser utilizado de manera efectiva para preparar una
formulación mantenida de un medicamento de proteína. Los presentes
descubrimientos de que los conjugados de proteínas de la invención
muestran una estabilidad notablemente más elevada en sangre y mayor
MRT que los anteriormente conocidos proteína con capacidad de unión
PEG o conjugado de proteína de albúmina para una amplia gama de
proteínas incluyendo el derivado G-CSF con un punto
bajo de mutación, sugieren claramente que dicho efecto de
incrementar la estabilidad en sangre y la duración observado para el
conjugado de la proteína de la invención también se conseguiría
para cualesquiera otros péptidos biológicamente activos.
La vida media del conjugado
hGH-PEG-IgG (ejemplo 7) preparado
utilizando 10 kDa de PEG como polímero no péptido se midió por el
mismo método descrito en 9,5 horas, que es ligeramente menor que la
del conjugado hGH-PEG-IgG
utilizando 3,4 kDa PEG (13,9 horas). Los pesos moleculares aparentes
y medias vidas en sangre observados para estos preparados
utilizando PEG con diferentes grupos funcionales, por ejemplo
propionato de succinimidilo, N-hidroxisuccinimidilo
y grupos butil aldehído, eran similares a los preparados utilizando
PEG con grupos aldehído.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de prueba
3
A efectos de medir las medias vidas en sangre de
los conjugados
Fab'-S-PEG-N-IgG
y
Fab'-N-PEG-N-IgG
preparados en los ejemplos 8 y 9, respectivamente, y del complejo
Fab'-S-PEG 40K preparado en el
ejemplo comparativo 3, se llevó a cabo un análisis farmacocinético
de acuerdo con el método del ejemplo de pruebas 2 utilizando los
conjugados, el complejo y Fab' como control. El resultado se muestra
en la Figura 12.
Tal como se puede apreciar en la figura 12, los
conjugados
Fab'-S-PEG-N-IgG
y
Fab'-N-PEG-N-IgG
mostraron medias vidas en sangre prolongadas que eran de dos a tres
veces más largas que las del complejo Fab' y
Fab'-S-PEG 40K.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de prueba
4
Las actividades in vitro del conjugado
hGH-PEG-IgG (ejemplo 1), complejo 40
kD PEG-hGH (ejemplo comparativo 1) y conjugado
hGH-PEG-albúmina (ejemplo
comparativo 2) fueron medidas utilizando la línea celular del
linfoma de nodo de rata Nb2 (European Collection of Cell Cultures,
ECCC #97041101) que sufre mitosis dependiente de hGH tal como se
indica a continuación.
Las células Nb2 fueron cultivadas en medio de
Fisher's suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 0,075%
NaCO_{3}, 0,05 mM 2-mercaptoetanol y 2 mM de
glutamina. Las células fueron incubadas durante otras 24 horas en
el mismo medio sin 10% FBS. Después se añadieron aproximadamente 2X
10^{4} células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, varias
diluciones de hGH-PEG-IgG, 40 kDa
PEG-hGH,
hGH-PEG-albúmina y un control
(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) y
las placas fueron incubadas durante 48 horas a 37ºC en un incubador
de CO_{2}. Para medir la extensión de crecimiento celular (números
de células existentes en cada pocillo) se añadieron 25 \mul de
titulación celular 96 Aqueous One Solution (Promega, USA) a cada
pocillo y se incubó durante 4 horas a 37ºC. Se midió la absorbancia
a 490 nm para calcular el título de cada muestra y los títulos
calculados se muestran en la Tabla 8.
Tal como se puede apreciar en la tabla 8, todas
las muestras utilizadas en los experimentos tienen actividad in
vitro. Además, la actividad in vitro de hGH modificado
por PEG era menor que la de hGH no modificado. En el caso de
interferón, se informó que conjugados 12 kDa PEG y 40 kDa PEG con
IFN mostraron actividades que eran solamente 25% y 7%
aproximadamente del tipo salvaje, respectivamente, (P. Bailon y
otros, Bioconjugate Chem. 12 : 196-202, 2001).
Cuanto mayor es el incremento de peso molecular de PEG, menor es la
disminución de la actividad in vitro del complejo PEG. La
actividad in vitro del complejo hGH modificado por 40 kDa
PEG era solamente de 7,6% aproximadamente de hGH de tipo salvaje y
el conjugado de hGH-PEG-albúmina
también mostró una actividad in vitro muy baja de 5,2% del
tipo salvaje aproximadamente. No obstante, en el caso de conjugar
IgG con el complejo hGH-PEG, su actividad relativa
quedaba incrementada significativamente a 30% o más del tipo
salvaje. Estos resultados sugieren que los conjugados de proteína de
la invención tienen una actividad in vivo más elevada y
también una vida media en sangre prolongada. En el caso de
conjugados de proteína IgG de la presente invención, la actividad
incrementada de la proteína se cree que es debida a la estabilidad
en sangre incrementada provocada por conjugación con IgG que juega
el papel de conservar la afinidad de unión a un receptor y el
polímero no peptídico que proporciona espacio. Este efecto se espera
que tenga lugar para conjugados de proteína IgG de cualesquiera
otras proteínas biológicamente activas.
Para comparar la actividad in vitro de
conjugados de proteína IFN \alpha, se midieron la actividad
antivírica del complejo IFN
\alpha-PEG-IgG (ejemplo 3),
conjugado 40 kDa PEG-IFN \alpha (ejemplo
comparativo 1) y el conjugado IFN
\alpha-PEG-albúmina (ejemplo
comparativo 2) por un método de biopsia de cultivo celular
utilizando células de riñón bovino Madin-Darby
(células MDBK; ATCC CCL-22) saturadas con virus de
estomatitis vesicular (VSV). Se utilizó como control IFN \alpha
2b que no tenía modificación PEG (NIBSC IFN).
Las células MDBK fueron cultivadas en medio MEM
(medio mínimo esencial, JBI) suplementado con 10% de FBS y 1% de
penicilina-estreptomicina a 37ºC en un incubador al
5% de CO_{2}. Las muestras y un control (NIBSC IFN) fueron
diluidos con el mismo medio de cultivo a una concentración constante
y se añadieron a una placa de 96 pocillos 100 \mul de cada
dilución. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de la solución
celular cultivada y las células fueron incubadas a 37ºC durante 1
hora aproximadamente en un incubador al 5% de CO_{2}. Después de
una hora se añadieron a cada pocillo 50 \mul de VSV con una
concentración vírica de 5-7X10 PFU y se incubó
adicionalmente durante 16 a 20 horas a 37ºC en una atmósfera al 5%
de CO_{2}. Los pocillos que contenían solamente células y virus
sin muestras o el control fueron utilizados como control negativo y
los pocillos que contenían solamente células sin virus añadidos,
como control positivo.
Para eliminar el medio de cultivo y efectuar
tinción de células vivas se añadieron a cada pocillo 100 \mul de
una solución roja neutra y se incubo adicionalmente a 37ºC durante 2
horas en un incubador con 5% de CO_{2}. Después de retirar el
sobrenadante por aspiración, la solución de extracción (100 \mul
de una mezcla de 100% de etanol y 1% de acetato (1: 1)) fue añadida
a cada pocillo. Las células con tinción fueron resuspendidas en la
solución de extracción con agitación y se midió la absorbancia a 540
nm. Se calculo ED_{50} representando 50% del crecimiento celular
máximo considerando el crecimiento celular del control positivo como
100% con respecto al crecimiento celular del control negativo.
Tal como se ha mostrado en la tabla 9, la
actividad de IFN \alpha modificada por PEG era más baja que la de
IFN \alpha no modificada. En especial la estabilidad de la sangre
aumentó al incrementarse el peso molecular de la fracción de PEG,
pero la actividad relativa disminuyo gradualmente. Un complejo de
IFN \alpha modificado por 40 kDa PEG mostró una actividad in
vitro muy baja correspondiente aproximadamente a 4,8% de la
actividad del tipo salvaje. Tal como se ha mencionado en lo
anterior, se conoce un informe anterior según el cual las IFN
conjugadas con 12 kDa PEG y 40 kDa PEG mostraron aproximadamente 25%
y 7% de actividad in vitro del tipo salvaje respectivamente
(P. Bailon y otros, Bioconjugate Chem.
12:196-202,2001). Es decir, dado que si aumenta el
peso molecular de PEG, aumenta la vida media en sangre pero su
efecto farmacéutico disminuye bruscamente, se ha producido la
necesidad de desarrollar una sustancia con actividad farmacéutica
mejorada y vida media prolongada. El conjugado IFN
\alpha-PEG-albúmina mostró también
una actividad in vitro muy baja correspondiente solamente a
5,2% del tipo salvaje aproximadamente. No obstante, en el caso de
modificar IFN \alpha con IgG (conjugado IFN
\alpha-PEG-IgG), la actividad
relativa aumentó hasta 11,2% del tipo salvaje. Además, el conjugado
IFN \alpha-PEG-AG IgG mostró
actividad in vitro correspondiente a 10,2% del tipo salvaje y
de acuerdo con ello, se llegó a la conclusión de que la ausencia de
la cadena de azúcar no tenía efecto significativo en la actividad de
un conjugado de la proteína.
Estos resultados muestran que el conjugado de la
proteína IgG de la invención muestra elevada actividad in
vivo junto con una prolongada vida media.
Se midieron la actividades in vitro de
G-CSF (Filgrastim) tipo salvaje, derivado
^{l7}Ser-G-CSF, complejo 20 kDa
PEG-G-CSF (Neulasta, USA), complejo
derivado 40 kDa
PEG-^{17}S-G-CSF,
conjugado de derivado
^{17}Ser-G-CSF-PEG-albúmina
y conjugado de derivado
^{17}S-G-CSF-PEG-IgG.
En primer lugar, células de origen mielógeno
humano, células HL-60 (ATCC CCL-240,
paciente de 36 años, hembra, de raza blanca, con leucemia
promielocitica) fueron cultivadas en medio RPMI 1640 suplementado
con 10% FBS, y se ajustó el número de células aproximadamente a 2,2
x 10^{5} células/ml. Se añadió DMSO (dimetilsulfóxido, calidad de
cultivo/SIGMA), a las células con una concentración de 1,25% (v/v).
Se añadieron 90 \mul de la solución de cultivo tratada con DMSO
con unas 2x10^{4} células suspendidas por pocillo a una placa de
96 pocillos (placa Corning/baja evaporación de 96 pocillos) y se
incubó a 37ºC durante 72 horas en un incubador a 5% de CO_{2}.
La concentración de cada muestra fue determinada
utilizando un equipo G-CSF ELISA (R & D Systems,
USA), y cada muestra fue diluida con medio RPMI 1640 a la
proporción apropiada hasta una concentración de 10 \mul/ml. La
solución resultante fue sometida a 19 ciclos de dilución media
secuencial con medio RPMI 1640.
Se añadieron 10 \mul de cada una de las
muestras preparadas según lo anterior a cada uno de los pocillos
con células HL-60 en cultivo y la concentración fue
reducida a la mitad desde 1.000 ng/ml. Las microplacas tratadas con
muestras de proteínas fueron incubadas adicionalmente a 37ºC durante
72 horas.
Para examinar la extensión de crecimiento
celular después de la incubación, el número de células fue
determinado por medición de la absorbancia a 670 nm utilizando
CellTiter96^{TM} (Promega, USA).
Tal como se puede apreciar de la tabla 10, el
conjugado de la proteína IgG del derivado de
^{17}Ser-G-CSF que tiene una
modificación del amino ácido mostró un efecto similar al observado
para el conjugado de proteína de tipo salvaje. Se ha confirmado que
el derivado de ^{l7}Ser-G-CSF
modificado con PEG muestra una vida media más larga pero una menor
actividad que el derivado sin modificar (Solicitud de Patente de
Corea No. 2003-17867). En especial, si bien la
estabilidad en sangre del derivado de
^{17}Ser-G-CSF modificado con PEG
incrementó al aumentar el peso molecular de la fracción PEG, su
actividad relativa disminuyó gradualmente. 40 kDa de complejo
derivado de ^{17}Ser-G-CSF
modificado por PEG mostró una actividad in vitro muy baja
correspondiente aproximadamente a 10% del tipo salvaje. Es decir, al
aumentar el peso molecular de PEG, la vida media en sangre aumenta
pero su efecto farmacéutico disminuye de forma repentina, por lo que
se ha presentado la necesidad de desarrollar una sustancia que
tiene actividad farmacéutica mejorada y vida media prolongada.
Mientras tanto, el derivado de
^{17}Ser-G-CSF modificado con
albúmina mostró una actividad in vitro relativamente baja
correspondiente aproximadamente a 23% solamente del tipo salvaje. No
obstante, en el caso de modificar el derivado de
^{l7}Ser-G-CSF con IgG (conjugado
de
^{17}Ser-G-CSF-PEG-IgG),
su actividad relativa aumentó en un nivel de 69% o más del tipo
salvaje. Estos resultados muestran que el conjugado de proteína IgG
de la invención muestra elevada actividad in vivo junto con
una prolongada vida media.
Se midieron las actividades in vitro de
EPO (BRP, UK), EPO (Aranesp, USA) altamente glicosilado y conjugado
EPO-PEG-IgG, de tipo salvaje.
En primer lugar, células originadas en tuétano
de hueso humano, células TF-1 (ATCC
CRL-2003, eritroleucemia), fueron cultivadas en
medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS y 12 ng/ml de
GM-CSF, y, a continuación, del mismo medio RPMI
1640 sin GM-CSF durante un día. Se añadieron 50
\mul de la solución de cultivo con unas 2x10^{4} células a cada
pocillo de una placa de 96 pocillos (placa de 96 pocillos
Corning/baja evaporación) y se incubó a 37ºC durante 72 horas en un
incubador con 5% de CO_{2}.
Se determinó la concentración de cada una de las
muestras utilizando un equipo EPO ELISA (R & D Systems, USA), y
cada una de las muestras fue diluida con medio RPMI 1640 a una
proporción apropiada hasta una concentración de 10 \mug/m. La
solución resultante fue sometida a 19 ciclos de doble dilución en
serie con medio RPMI 1640.
Se añadieron 50 \mul de cada una de las
muestras preparadas tal como se ha indicado a cada uno de los
pocillos con células TF-1 en cultivo y la
concentración fue reducida a la mitad de 5 \mug/ml. Las
microplacas tratadas con muestra de proteína fueron incubadas
adicionalmente a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 72 horas.
Para examinar la extensión del crecimiento
celular después de la incubación, el número de células fue
determinado midiendo la absorbancia a 490 nm utilizando
CellTiter96^{TM} AQueous One (Cat. No. G3581, Promega, USA).
Tal como se puede apreciar en la tabla 11, todas
las muestras utilizadas en los experimentos tienen actividad in
vitro tal como se prueba por su promoción del crecimiento de las
células originadas de tuétano de hueso humano. Además, en las
actividades in vitro de EPO altamente glicosilada y EPO
modificada por el complejo PEG-IgG eran más bajas
que las de la EPO no modificada. No obstante, el conjugado de
proteína EPO según la invención se espera que tenga una actividad
in vivo superior al EPO sin modificar debido a su
significativamente prolongada vida media en sangre. En el caso de
conjugados de proteína EPO según la presente invención, la
actividad incrementada de la proteína se cree que es debida a la
incrementada estabilidad en sangre provocada por la conjugación con
IgG que desempeña el papel de conservación de la afinidad de unión a
un receptor, proporcionando espacio el polímero no peptídico.
Se examinaron las actividades in vitro de
los conjugados
Fab'-S-PEG-N-IgG
y
Fab'-N-PEG-N-IgG
preparados en los ejemplos 8 y 9, respectivamente, y complejo
Fab'-S-PEG 40K preparado en el
ejemplo comparativo 3, por medición de su capacidad de
neutralización de la citotoxicidad de TNF-\alpha
en la línea celular de fibroblastos de ratón L929 (ATCC
CRL-2148), del modo siguiente.
Cada uno de los conjugados Fab' y el complejo
fueron sometidos a diluciones dobles en serie y cada una de las
partes alícuotas de 100 \mul de las diluciones fue añadida a un
pocillo de una placa de 96 pocillos. Se añadieron a los pocillos,
respectivamente, hasta concentraciones de 10 ng/ml y 1 \mug/ml,
RhTNF-\alpha (R & D Systems) y actinomicina D
(Sigma), un inhibidor de la síntesis de ARN. A continuación, la
mezcla se hizo reaccionar a 37ºC con 5% de CO_{2} durante 30
minutos y se transfirieron a una microplaca de análisis. Se
añadieron a cada pocillo 50 \mul de cada uno de los cultivos de la
línea celular L929 hasta una concentración de 5 x 10^{4}
células/pocillo. Las células fueron incubadas a 37ºC con 5% de
CO_{2} durante 24 horas. La solución de cultivo en el pocillo fue
retirada y se añadieron 50 \mul de cada uno de 5 mg/ml MTT (sigma)
en PBS. Las células fueron incubadas a 37ºC con 5% de CO_{2}
durante 4 horas. Se añadieron 150 \mul de DMSO a cada pocillo y se
disolvieron. Se midió la absorbancia a 540 nm para determinar la
extensión de neutralización de la citotoxicidad de
rhTNF-\alpha por la prueba de los conjugados Fab'
y complejo. Se utilizó como control el Fab' purificado obtenido en
la etapa 1 del ejemplo 8.
Tal como se puede apreciar de los resultados de
la figura 13, todos los conjugados de proteína y complejo mostraron
absorbancias similares a las del Fab'. Este resultado muestra que
los conjugados Fab'-PEG-IgG en los
que la inmunoglobulina está enlazada al terminal-N o
al grupo libre-SH adyacente al
terminal-C de Fab' con intermedio de un separador
PEG, mantiene la actividad biológica de Fab'.
Ejemplo de Prueba
5
10 ratas macho Sprague Dawley hipsectomizadas
(5-semanas de edad, SLC, USA) fueron utilizadas para
cada grupo en una prueba de aumento de peso corporal para medir las
actividades in vivo del conjugado
hGH-PEG-IgG, complejo
hGH-PEG 40K y hGH de tipo salvaje. Un disolvente de
control, hGH de tipo salvaje, conjugado
hGH-PEG-IgG y complejo
hGH-PEG 40K fueron inyectados por vía subcutánea en
la espalda de la rata utilizando una jeringa 26G (1 ml, Korea
Vaccine Co., Ltd.) de acuerdo con el programa de administración y
dosis descrita en la tabla 12. Se midieron los pesos de las ratas
antes de la inyección y 16 horas después de la inyección. Las ratas
fueron sacrificadas con éter 24 horas después de la inyección final
y se examinó la presencia de glándula pituitaria a ojo desnudo para
excluir del resultado las ratas que tenían glándula pituitaria
residual observable.
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestra en la figura 14 el cambio de peso
después de la administración de cada muestra. Dado que el hGH de
tipo salvaje utilizado como normal (control) debe ser administrado
todos los días para mantener su actividad in vivo, fue
administrado una vez al día durante 12 días y, de acuerdo con ello,
las ratas del grupo 2 ganaron peso durante la administración. En
ratas del grupo 3 administradas con complejo hGH-40
kDa PEG una vez cada 6 días, la ganancia de peso fue continua hasta
3 días después de la administración y la proporción de incremento
disminuyó posteriormente. Estos resultados coincidieron con las
expectativas basadas en los resultados de los ejemplos de prueba 1
y 2 de que el complejo hGH-PEG mostró una vida media
más larga y mayor actividad in vivo que hGH de tipo salvaje.
Especialmente, los efectos generados por la administración de
conjugado hGH-PEG-IgG una vez cada
6 días en una cantidad correspondiente a un tercio de la dosis de
tipo salvaje fue igual o menor que la administración diaria del
tipo salvaje. Eso significa que la actividad in vivo del
conjugado hGH-PEG-IgG es más de 3
veces superior a la del tipo salvaje.
Con el objetivo de examinar el efecto de los
conjugados de proteína según la invención con
^{l7}Ser-G-CSF con sustitución
del 17º aminoácido por serina, se compararon las actividades in
vivo de G-CSF de tipo salvaje, un complejo de
tipo comercial PEG-G-CSF de 20 kDa y
conjugado
^{17}Ser-G-CSF-PEG-IgG.
El conjugado
^{l7}Ser-G-CSF-PEG-IgG
de la presente invención fue disuelto en un disolvente que
comprendía 20 mM de fosfato sódico, 1% de glicina y 0,25% de
mannitol (pH 7,0). El complejo de metionilo G-CSF de
tipo salvaje (Filgrastim, Amgen, USA) y 20 kDa PEG
G-CSF (Neulasta, Amgen, USA) modificado por PEG 20
kDa disuelto en el mismo disolvente se utilizaron como grupo
comparativo. Se adquirieron ratones ICR de 7 semanas de edad de
Samtaco Bio (Korea) y se sometieron a un periodo de aclimatación
durante una semana antes del experimento. Al inicio del experimento,
los pesos de ratones ICR se encontraban dentro de una gama de
valores de 30-35 g. Se les permitió la ingestión
libre de alimento (Samyang Corporation, Korea) y agua durante la
aclimatación y experimento y se mantuvieron en una jaula en
condiciones de 22 \pm 3ºC, 55 \pm 5% de humedad relativa,
ventilación 10-12 veces/hora, intensidad de
iluminación 150-200 lux y ciclo de iluminación
diario de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Cada uno de los
grupos experimentales consistía en 5 ratones y se administró un
agente anticanceroso complejo y cada una de las muestras a los
ratones de acuerdo con el programa de administración y dosis
indicado en la tabla 13. Se preparó un modelo animal de neutropenia
por inyección en una sola vez de una mezcla de 130 mg/kg de
ciclohexamida (CPA; Sigma, USA), 4,5 mg/kg de doxorubicina (DXR;
Sigma, USA) y 1 mg/kg de vincristina (VCR, Sigma, USA) en la
cavidad abdominal de ratones ICR. El grupo de tratamiento no recibió
administración de agente anticáncer y no mostró reducción de
neutrófilo. El control de disolvente es el grupo que recibió la
administración del agente anticanceroso para reducir el número de
neutrófilos y con coadyuvante solamente en vez de una muestra de
fármaco. El G-CSF de tipo salvaje fue inyectado por
vía subcutánea a una dosis de 100 \mug/kg/por día alrededor de
las 10 de la mañana todos los días desde el primer día hasta el
quinto día después de la administración del agente anticanceroso.
Los complejos
^{l7}S-G-CSF-IgG y
20 kDa PEG-G-CSF (Neulasta, Amgen,
USA) fueron inyectados una vez en el primer día después de la
administración del agente anticanceroso a una dosis de 1.000,
\mug/kg que corresponde a una dosis para cinco días cuando se
consideró una cantidad doble de la dosis de tipo salvaje como dosis
diaria (200, (\mug/kg/por día). Se extrajeron
0,3-0,5 ml de sangre de la vena orbital de los
ratones en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 8 después de la
administración del agente anticanceroso. Se llevó a cabo la
recogida de la sangre alrededor de las 4 de la tarde, 6 horas
después de la inyección de una muestra de fármaco. Los números de
células blancas en sangre (WBC), células rojas en sangre (RBC) y
plaquetas se midieron utilizando un contador de hematocitos
automático. Además, una muestra con aplicación de sangre fue
preparada y sometida a tinción Giemsa. Cada uno de los hematocitos
fue calculado de forma diferencial para obtener la proporción de
neutrófilos y, a continuación, el número de neutrófilos fue
calculado mediante la formula 1 basada en la proporción de
neutrófilos.
Número de
neutrófilos (células/mm^{2}) = número total de WBC (células/mm') X
proporción de los neutrófilos (%) X
1/100.
Para examinar la significación estadística de
los valores observados para los grupos sin, tratamiento el grupo de
control de disolvente y el grupo PEG-IgG derivado de
^{17}S-G-CSF se llevó a cabo
análisis estadístico con respecto al número de hematocitos y peso
de cada grupo utilizando la prueba de Student.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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La recuperación de neutrófilos después de la
administración de cada muestra se ha mostrado en la figura 15.
Cuando se inyectó G-CSF de tipo salvaje como norma
cada día durante 5 días, el número de neutrófilos aumentó
gradualmente durante la administración y alcanzó finalmente un
máximo en el día 5. Mientras que el complejo
PEG-G-CSF 20 kDa administrado una
vez con una cantidad doble de la dosis diaria mostró solamente dos
tercios de la actividad in vivo observada para la
administración diaria de G-CSF de tipo salvaje, el
conjugado PEG-IgG derivado de
^{17}S-G-CSF mostró una actividad
3 veces superior a la de la actividad in vivo del complejo
PEG-G-CSF 20 kDa. Además, el
conjugado de proteína de la invención generó efecto dos veces
superior para recuperar neutrófilos que la administración diaria de
G-CSF, lo que coincidió con la expectativa basada en
el resultado de que el conjugado derivado
^{17}S-G-CSF-PEG-IgG
tenía vida media en sangre significativamente más larga y actividad
in vivo superior que el tipo salvaje. Estos resultados
muestran que se puede esperar el mismo efecto del conjugado de
proteína de la invención, provocado por la unión covalente de IgG a
PEG, de un derivado de proteína que tenga una modificación de
aminoácido como en el caso del tipo salvaje. De acuerdo con ello,
el conjugado de proteína de la presente invención puede ser
utilizado de manera efectiva como formulación de largo periodo de
acción que satisface los objetivos de incrementar significativamente
la vida media en sangre y la actividad in vivo de
G-CSF superando simultáneamente el problema de que
G-CSF de tipo salvaje requiere administraciones
demasiados frecuentes.
Para comparar las actividades in vivo de
EPO de tipo salvaje, EPO altamente glicosilado (Aranesp, USA) y
conjugado EPO-PEG-IgG se examinaron
cambios en los componentes de la sangre de ratas a las que se
administraron las muestras de pruebas anteriormente indicadas. El
experimento fue llevado a cabo del modo siguiente con ligera
modificación del método descrito por J. C. Egrie y Browne (British
Journal of Cancer (2001) B4 (Suplemento 1),
3-10).
El conjugado
EPO-PEG-IgG de la presente invención
fue disuelto en un disolvente que comprendía 20 mM de fosfato
sódico, 1% de glicina y 0,25% de manitol (pH 7,0). Se utilizaron
como grupos de comparación EPO de tipo salvaje y EPO altamente
glicosilado disuelto en el mismo disolvente. Se adquirieron ratas
machos de 7 semanas de edad de Daehan Biolink Inc. (Korea) y se
sometieron a aclimatación durante una semana antes del experimento.
Al inicio del experimento, los pesos de los ratones ICR se
encontraban en una gama de 200-250 g. Se les
permitió ingesta libre de un alimento formulado (Cheiljedang Co.,
Korea) y agua durante la aclimatación y el experimento y se
mantuvieron en una jaula en condiciones de 22 \pm 3ºC, 55 \pm 5%
de humedad relativa; ventilación 10-12 veces/hora,
iluminación con una intensidad de 150-200 lux y
ciclo de iluminación diaria de 12 horas de luz/12 horas de
oscuridad. Cada uno de los grupos experimentales consistió en 5
ratas y cada muestra de prueba preparada tal como se ha indicado
fue inyectada por vía subcutánea en la parte posterior del hombro
de la rata utilizando una jeringa 26G (1 ml, Korea Vaccine Co.,
Ltd.) de acuerdo con el programa de administración y dosis que se
describen en la tabla 14.
Después de la administración, se tomaron
muestras de sangre entera de la vena de la cola de la rata en un
tubo que contenía un agente anticoagulante (EDTA), cada 3 días
durante un mes. Se midió el hematocrito de las muestras de sangre
con un contador de hematocrito automático (Vet ABC).
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La recuperación de hematocrito después de la
administración de cada muestra se ha indicado en la figura 16.
Cuando la EPO de tipo salvaje utilizada como normal fue inyectada
cada día durante 5 días, el hematocrito aumentó gradualmente
durante la administración y finalmente alcanzó un máximo en el día
9. En las ratas del grupo 3 administradas con la EPO altamente
glicosilada el hematocrito incrementó rápidamente durante 6 días
después de la inyección, a continuación disminuyó con rapidez. Como
contraste, el conjugado de la invención
EPO-PEG-IgG mostró una velocidad
mayor y más rápida de incremento inicial de hematocrito que la EPO
altamente glicosilada y mantuvo una actividad in vivo más
elevada que las otras proteínas de prueba durante más de dos
semanas. Estos resultados coincidieron con la expectación basada en
los resultados del ejemplo de prueba 2 de que el conjugado
EPO-PEG-IgG mostró una vida media en
sangre más larga que la EPO de tipo salvaje y que la EPO altamente
glicosilada. De acuerdo con ello, el conjugado de proteína de la
presente invención puede ser utilizado de manera efectiva como
formulación de largo periodo de acción que satisface objetivos de
incrementar significativamente la vida media en sangre y la
actividad in vivo de la EPO superando al mismo tiempo el
problema de la EPO de tipo salvaje que requiere una administración
demasiado frecuente.
Claims (33)
1. Conjugado de proteína que comprende: i) un
polipéptido fisiológicamente activo excluyendo una inmunoglobulina y
un fragmento de la misma; ii) un poli(etilen glicol); y iii)
una inmunoglobulina, que están enlazados covalentemente entre sí en
este orden y teniendo una prolongada vida media in vivo del
polipéptido fisiológicamente activo.
2. Conjugado de proteína según la reivindicación
1, en el que el poli(etilen glicol) tiene dos grupos
reactivos en ambos extremos a través de los cuales el polímero está
enlazado de forma covalente al polipéptido fisiológicamente activo y
a la inmunoglobulina.
3. Conjugado de proteína según la reivindicación
2, en el que la inmunoglobulina está unida covalentemente como
mínimo a dos complejos del polipéptido fisiológicamente activo y el
poli(etilen glicol).
4. Conjugado de proteína según la reivindicación
1, en el que la inmunoglobulina es seleccionada entre el grupo que
consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
5. Conjugado de proteína según la reivindicación
4, en el que la inmunoglobulina es seleccionada entre el grupo que
consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
6. Conjugado de proteína según la reivindicación
4, en el que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana.
7. Conjugado de proteína según la reivindicación
1, en el que la inmunoglobulina es seleccionada entre el grupo que
consiste en una inmunoglobulina que tiene glicosilación de tipo
salvaje, una inmunoglobulina que tiene un grado de glicosilación
aumentado o disminuido y una inmunoglobulina aglicosilada.
8. Conjugado de proteína según la reivindicación
7, en el que el incremento o disminución del grado de glicosilación
o aglicosilación de una inmunoglobulina es llevado a cabo por un
método seleccionado del grupo que consiste en un método químico,
método enzimático y método biotecnológico.
9. Conjugado de proteína según la reivindicación
2, en el que el grupo reactivo de poli(etilen glicol) es
seleccionado del grupo que consiste en aldehído, propion aldehído,
butil aldehído, maleimida y derivado de succinimida.
10. Conjugado de proteína según la
reivindicación 9, en el que el derivado de succinimida es
succinimidil propionato, succinimidil carboximetilo, hidroxil
succinimidilo o succinimidil carbonato.
11. Conjugado de proteína según la
reivindicación 9, en el que el poli(etilen glicol) tiene
grupos aldehído en ambos extremos.
12. Conjugado de proteína según la
reivindicación 1, en el que el poli(etilen glicol) está
enlazado covalentemente en sus extremos al terminal amino, residuo
de lisina, residuo de histidina o residuo de cisteína de la
inmunoglobulina y el terminal amino, residuo de lisina, residuo de
histidina o residuo de cisteína del polipéptido fisiológicamente
activo, respectivamente.
13. Conjugado de proteína según la
reivindicación 1, en el que el polipéptido fisiológicamente activo
es seleccionado entre el grupo que consiste en hormonas,
citoquinas, enzimas, factor de crecimiento, factor regulador de
transcripción, factor sanguíneo, vacunas, proteínas estructurales,
proteínas ligandos y receptores.
14. Conjugado de proteína según la
reivindicación 13, en el que el polipéptido fisiológicamente activo
es seleccionado del grupo que consiste en hormona de crecimiento
humano, hormona de crecimiento, hormona liberadora, péptido
liberador de hormona de crecimiento, interferones, factores
estimulantes de colonias, interleuquinas, glucocerebrosidasa,
factor activador de macrófagos, péptidos macrófagos, factor de
células B, factor de células T, proteína A, factor de supresión de
alergia, glicoproteína de necrosis celular, immunotoxina,
linfotoxina, factor de necrosis tumoral, factor inhibidor tumoral,
factor de crecimiento de transformación, antitripsina
alfa-1, albúmina, apolipoproteína-E,
eritropoyetina, eritropoyetina hiperglicosilada, factor VII, factor
VIII, factor IX, activador plasminógeno, uroquinasa,
estreptoquinasa, proteína C, proteína C-reactiva,
inhibidor de renina, inhibidor de colagenaza, dismutasa superoxido,
factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento
epidérmico, factor de crecimiento osteogénico, proteína estimuladora
de osteogénesis, calcitonina, insulina, atriopeptina, factor
inductor de cartílagos, proteína activadora de tejidos conjuntivos,
hormona estimuladora de folículos, hormona luteinizante, hormona
liberadora de FSH, factor de crecimiento nervioso, hormona
paratiroides, relaxina, secretina, somatomedina, factor de
crecimiento insulinoide, hormona adrenocorticotrófica, glucagon,
colecistoquinina, polipéptido pancreático, péptidos liberador de
gastrina, factor liberador de corticotropina, tirotropina, receptor,
antagonista receptor, antígeno de superficie celular y antígeno de
vacuna derivado de virus.
15. Conjugado de proteína según la
reivindicación 14, en el que polipéptido fisiológicamente activo es
hormona de crecimiento humano, interferón alfa, interferón beta,
factor estimulador de colonias de granulocitos o eritropoyetina.
16. Método para la preparación del conjugado de
la reivindicación 1, que comprende (a) unir covalentemente, como
mínimo, un polipéptido fisiológicamente activo, como mínimo una
inmunoglobulina con, como mínimo, un poli(etilen glicol) que
tiene grupos reactivos en ambos extremos; y (b) aislar un conjugado
de proteína que comprende esencialmente el polipéptido activo, la
inmunoglobulina y el poli(etilen glicol) que están
entrelazados covalentemente.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
la etapa (a) comprende además: (a1) acoplar covalentemente un
extremo del poli(etilen glicol) con una inmunoglobulina o un
polipéptido fisiológicamente activo; (a2) aislar de la mezcla de
reacción resultante un complejo que comprende el poli(etilen
glicol) acoplado con la inmunoglobulina o el polipéptido
fisiológicamente activo; y (a3) acoplar covalentemente el extremo
libre del poli(etilen glicol) del complejo con la
inmunoglobulina o polipéptido fisiológicamente activo para producir
un conjugado de proteína que comprende el polipéptido
fisiológicamente activo, el poli(etilen glicol) y la
inmunoglobulina que están entrelazadas covalentemente.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
la proporción molar del polipéptido fisiológicamente activo con
respecto al poli(etilen glicol) en la etapa (a1) está
comprendida entre 1:2,5 y 1:5.
19. Método según la reivindicación 17, en el que
la relación molar de la inmunoglobulina con respecto a
poli(etilen glicol) de la etapa (a1) está comprendida entre
1:5 y 1:10.
20. Método según la reivindicación 17, en el que
la relación molar del complejo obtenido en la etapa (a2) con
respecto al polipéptido fisiológicamente activo o la inmunoglobulina
de la etapa (a3) está comprendida entre 1:1 y 1:3.
21. Método según la reivindicación 17, en el que
las etapas (a1) y (a3) son realizadas en presencia de un agente
reductor.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
el agente reductor es cianoborohidruro sódico, borohidruro sódico,
borato de dimetilamina o borato de piridina.
23. Compuesto farmacéutico que tiene una
prolongada vida media de un polipéptido fisiológicamente activo que
comprende un conjugado de proteína de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 y un portador farmacéuticamente
aceptable.
24. Método para prolongar la vida media in
vivo de un polipéptido fisiológicamente activo que comprende la
etapa de unir covalentemente poli(etilen glicol) que tiene
grupo reactivos en ambos extremos con un polipéptido
fisiológicamente activo y una inmunoglobulina; de manera que el
polipéptido fisiológicamente activo no es una inmunoglobulina ni un
fragmento de la misma.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
la inmunoglobulina está unida covalentemente, como mínimo, a dos
complejos del polipéptido fisiológicamente activo y el
poli(etilen glicol).
26. Método según la reivindicación 24, en el que
la inmunoglobulina es seleccionada entre el grupo que consiste en
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE e IgM.
27. Método según la reivindicación 26, en el que
la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana.
28. Método según la reivindicación 24, en el que
la inmunoglobulina es seleccionada entre el grupo que consiste en
una inmunoglobulina que tiene glicosilación de tipo salvaje, una
inmunoglobulina que tiene un grado incrementado o disminuido de
glicosilación y una inmunoglobulina aglicosilada.
29. Método según la reivindicación 28, en el que
el incremento o disminución del grado de glicosilación o
aglicosilación de una inmunoglobulina es llevado a cabo por un
método seleccionado entre el grupo que consiste en un método
químico, método enzimático y método biotecnológico.
30. Método según la reivindicación 25, en el que
el grupo reactivo del poli(etilen glicol) es seleccionado
entre el grupo que consiste en aldehído, propion aldehído, maleimida
y derivado de succinimida.
31. Método según la reivindicación 24, en el que
el polipéptido fisiológicamente activo es seleccionado entre el
grupo que consiste en hormonas, citoquinas, enzimas, factor de
crecimiento, factor regulador de transcripción, factor sanguíneo,
vacunas, proteínas estructurales, proteínas ligando y
receptores.
32. Método según la reivindicación 31, en el que
el polipéptido fisiológicamente activo es seleccionado del grupo
que consiste en hormona de crecimiento humano, hormona de
crecimiento, hormona liberadora, péptido liberador de hormona de
crecimiento, interferones, factores estimulantes de colonias,
interleuquinas, glucocerebrosidasa, factor activador de macrófagos,
péptidos macrófagos, factor de células B, factor de células T,
proteína A, factor de supresión de alergia, glicoproteína de
necrosis celular, immunotoxina, linfotoxina, factor de necrosis
tumoral, factor inhibidor tumoral, factor de crecimiento de
transformación, antitripsina alfa-1, albúmina,
apolipoproteína-E, eritropoyetina, eritropoyetina
hiperglicosilada, factor VII, factor VIII, factor IX, activador
plasminógeno, uroquinasa, estreptoquinasa, proteína C, proteína
C-reactiva, inhibidor de renina, inhibidor de
colagenaza, dismutasa superoxido, leptina, factor de crecimiento
derivado de plaquetas, factor de crecimiento epidérmico, factor de
crecimiento osteógenico, proteína estimuladora de osteogénesis,
calcitonina, insulina, atriopeptina, factor inductor de cartílagos,
proteína activadora de tejidos conjuntivos, hormona estimuladora de
folículos, hormona luteinizante, hormona liberadora de FSH, factor
de crecimiento nervioso, hormona paratiroides, relaxina, secretina,
somatomedina, factor de crecimiento insulinoide, hormona
adrenocorticotrofica, glucagon, colecistoquinina, polipéptido
pancreático, péptidos liberador de gastrina, factor liberador de
corticotropina, tirotropina, receptor, antagonista receptor,
antígeno de superficie celular y antígeno de vacuna derivado de
virus.
33. Método según la reivindicación 32, en el que
el polipéptido fisiológicamente activo es hormona de crecimiento
humano, interferón alfa, interferón beta, factor estimulante de
colonias de granulocitos o eritropoyetina.
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